ES2751579T3 - Variantes de lacasa con propiedades mejoradas - Google Patents

Abstract

Un polipéptido con actividad de lacasa que consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 1, en el que el polipéptido comprende un resto de aminoácido pequeño seleccionado de entre el grupo que consiste en treonina, prolina, alanina, glicina, serina, cisteína, ácido aspártico, asparagina y valina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición 149 de la SEQ ID NO: 1.

Description

DESCRIPCIÓN

Variantes de lacasa con propiedades mejoradas

Campo de la invención

La presente invención se refiere a variantes de lacasa y los usos de las mismas como biocatalizadores respetuosos con el medio ambiente en distintos procedimientos industriales.

Antecedentes de la invención

Las lacasas (EC 1.10.3.2) son enzimas que tienen una distribución taxonómica amplia y pertenecen al grupo de las multicobre oxidasas. Las lacasas son catalizadores respetuosos con el medio ambiente, que utilizan el oxígeno molecular del aire para oxidar distintos compuestos fenólicos y no fenólicos relacionados con la lignina, así como contaminantes ambientales altamente recalcitrantes y producen agua como único producto residual. Estos catalizadores "verdes" naturales se utilizan en diversas aplicaciones industriales incluyendo la detoxificación de diversos residuos industriales principalmente de las industrias de papel y pasta, textil y petroquímica, su uso como un agente de biorrehabilitación para limpiar el suelo de herbicidas y plaguicidas y de ciertos explosivos. Las lacasas también se utilizan como agentes limpiadores en ciertos sistemas de purificación del agua. Además, su capacidad para retirar sustancias xenobióticas y producir productos poliméricos hace que sean una herramienta útil con fines de biorrehabilitación. Otra área de aplicación muy propuesta de las lacasas es el pretratamiento de la biomasa en la industria del biocombustible y pasta y papel.

Las moléculas de lacasa habitualmente son monómeros que consisten en tres dominios tipo cupredoxina conectados consecutivamente retorcidos en un glóbulo apretado. El sitio activo de las lacasas contiene cuatro iones de cobre: un ion de cobre "azul" mononuclear (sitio T1) y un agrupamiento de tres núcleos de cobre (sitio T2/T3) que consiste en un ion de cobre T2 y dos iones de cobre T3.

Las lacasas se pueden aislar a partir de diferentes fuentes tales como plantas, hongos o bacterias y son muy diversas en sus secuencias primarias. Sin embargo, tienen regiones conservadas en las secuencias y ciertas características comunes en sus estructuras tridimensionales. Una comparación de secuencias de más de 100 lacasas ha revelado cuatro regiones conservadas cortas (no mayores de 10 aa cada una) que son específicas de todas las lacasas [7, 8]. Una cisteína y diez restos de histidina forman un entorno de ligando de iones de cobre del sitio activo de la lacasa presente en estas cuatro secuencias de aminoácidos conservadas.

La lacasa bacteriana mejor estudiada es la lacasa CotA. La CotA es un componente de las capas de revestimiento externo de la endospora de bacilos. Es una proteína de 65 kDa codificada por el gen cotA [1].

La CotA pertenece a un grupo diverso de oxidasas "azules" multicobre que incluye las lacasas. Esta proteína presenta una alta termoestabilidad, y resistencia a distintos elementos perjudiciales de acuerdo con las capacidades de supervivencia de la endospora.

La expresión de proteínas recombinantes en huéspedes de fácil cultivo puede permitir una mayor productividad en menor tiempo y reduce los costes de producción. La versatilidad y posibilidades de aumentar la escala de la producción de proteínas recombinantes abre nuevas oportunidades comerciales para sus usos industriales. Además, tiene la ventaja de que la producción de proteínas de especies patógenas o productoras de toxinas puede ser en huéspedes microbianos más seguros o incluso GRAS (generalmente reconocidos como seguros). Además, se puede emplear la modificación proteica para mejorar la estabilidad, actividad y/o especificidad de una enzima, así se pueden producir enzimas a medida para ajustarse a las necesidades de los usuarios o del procedimiento.

La productividad enzimática puede aumentarse utilizando múltiples copias de genes, promotores fuertes y secuencias de señal eficaces, diseñados apropiadamente para dirigir las proteínas al medio extracelular simplificando así el procesamiento corriente abajo.

La producción de proteínas recombinantes en huéspedes bacterianos a menudo está limitada por la incapacidad de la proteína para plegarse en la correcta estructura 3D en la biosíntesis de la cadena polipeptídica. Esto puede causar la exposición de parches hidrófobos de la superficie del glóbulo proteico y dar como resultado la agregación proteica. Los mecanismos de plegamiento de proteína heteróloga in vivo se conocen poco y la capacidad de plegamiento de las diferentes proteínas en las bacterias es impredecible.

La producción de proteína activa soluble puede mejorarse a veces cambiando las condiciones de cultivo. Además, hay ejemplos en los que el rendimiento proteico se mejoraba introduciendo mutaciones puntuales únicas en la secuencia proteica. Sin embargo, no se ha identificado nada razonable de fondo para el hallazgo de mutaciones adecuadas.

La expresión heteróloga de lacasa en Escherichia coli a menudo se ha utilizado como estrategia para atajar el problema de la obtención de lacasas que no son fácilmente producibles en huéspedes naturales. La expresión recombinante de CotA de Bacillus subtilis en E. coli ha permitido su profunda caracterización, la resolución de la estructura, y la evolución funcional [1,2,3]. Sin embargo, muy a menudo el rendimiento es bajo, debido a una fuerte tendencia de esta enzima a formar agregados que da lugar a una proteína irreversiblemente inactiva [4]. Esta tendencia se ha atribuido al hecho de que en la naturaleza de lacasa COTA está integrada en una estructura de revestimiento de la espora mediante la interacción con otros componentes proteicos, y es probable que el plegamiento correcto de lacasa aumente por la interacción con otras proteínas. Cuando esta lacasa se expresa recombinantemente como polipéptidos individuales, estas interacciones de soporte se pierden y muchas proteínas mal plegadas forman agregados en las células bacterianas. Cuando se expresa en microorganismos superiores tales como levaduras, las moléculas de lacasa mal plegadas se degradan en gran parte.

Existe una necesidad en la técnica de medios y procedimientos para mejorar el rendimiento de lacasas en sistemas de expresión heterólogos. Esto es particularmente cierto en lacasas bacterianas tales como lacasas CotA.

Sumario de la invención

La presente invención afronta esta necesidad proporcionando variantes de lacasas con propiedades mejoradas. Más en particular, la invención se refiere a un polipéptido con actividad de lacasa que consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 1, en la que el polipéptido comprende un resto de aminoácido pequeño seleccionado de entre el grupo que consiste en treonina, prolina, alanina, glicina, serina, cisteína, ácido aspártico, asparagina y valina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición 149 de la SEQ ID NO: 1.

Se prefiere un resto de treonina en una posición correspondiente con la posición de aminoácido 149 de la SEQ ID NO: 1.

También se describe en el presente documento, ácidos nucleicos, vectores y composiciones mejorados que codifican las variantes enzimáticas de lacasas.

También se proporcionan en el presente documento sistemas de expresión heteróloga recombinante tal como células huésped que comprenden un ácido nucleico, un vector o una composición como se describe en el presente documento.

También se proporcionan en el presente documento procedimientos para la producción de un polipéptido como se describe en el presente documento que comprende las etapas de:

a. el cultivo de una célula huésped recombinante que comprende un polinucleótido como se describe en el presente documento en condiciones adecuadas para la producción del polipéptido, y

b. la recuperación del polipéptido obtenido, y

c. opcionalmente la purificación de dicho polipéptido.

También se desvela en el presente documento, el uso de un polipéptido como se describe en el presente documento en una aplicación seleccionada de entre el grupo que consiste en la delignificación de la pasta, degradación o disminución de la integridad estructural de material lignocelulósico, blanqueamiento de colorantes textiles, detoxificación de aguas residuales, detoxificación xenobiótica, producción de azúcares a partir de material lignocelulósico y recuperación de celulosa a partir de una biomasa.

También se desvela en el presente documento un procedimiento para la mejora del rendimiento de un polipéptido con actividad de lacasa en un sistema de expresión heterólogo que comprende la etapa del cambio del aminoácido de ese polipéptido en la posición correspondiente a la posición 149 de la SEQ ID NO: 1 por un resto de aminoácido pequeño.

Las realizaciones preferidas de estos aspectos se describirán con más detalle posteriormente. Con fines de claridad y precisión de la descripción, las características se describen en el presente documento como parte de la misma o diferentes realizaciones, sin embargo, se apreciará que la descripción puede incluir realizaciones que tengan combinaciones de todas o algunas de las características descritas.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se basa en la observación de los inventores de que la sustitución de un único aminoácido en diferentes lacasas mejora el rendimiento de esa lacasa en al menos un 50 % cuando se expresa en procariotas, así como en eucariotas. Los inventores también descubrieron que la variante de lacasa se mantiene activa.

La expresión "sustitución de aminoácido" se utiliza en el presente documento de la misma manera que se utiliza comúnmente, es decir, la expresión se refiere a una sustitución de uno o más aminoácidos en una proteína por otro aminoácido. También se hace referencia a las sustituciones de aminoácidos artificiales como mutaciones.

La expresión "aminoácido pequeño" como se utiliza en el presente documento pretende cubrir un grupo de aminoácidos que se considera habitualmente como aminoácidos pequeños o diminutos. En una realización preferida, este grupo se limita a los aminoácidos treonina, prolina, alanina, glicina, serina, cisteína, ácido aspártico, asparagina y valina.

La SEQ ID NO: 1, es una lacasa CotA de Bacillus subtilis recién desvelada en el presente documento, mientras que la SEQ ID NO: 2 es una lacasa CotA que se había desvelado previamente en el documento WO 2013/038062. Los inventores descubrieron que las variantes de lacasa que tienen un resto de aminoácido pequeño seleccionado de entre el grupo que consiste en treonina, prolina, alanina, glicina, serina, cisteína, ácido aspártico, asparagina y valina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición 149 de la SEQ ID NO: 1 proporcionaban un mayor rendimiento cuando se expresa en un sistema de expresión heterólogo.

Las variantes de lacasa que tienen un resto de aminoácido seleccionado de entre el grupo que consiste en Treonina, Prolina, Asparagina y Ácido aspártico en la posición de aminoácido correspondiente a la posición 149 de la SEQ ID NO: 1 se prefieren en el contexto de la presente divulgación.

Las variantes que tienen un resto de treonina en una posición de aminoácido correspondiente con la posición 149 de la SEQ ID NO: 1 son las más preferidas ya que daban como resultado el mayor rendimiento de lacasa expresada recombinantemente.

La SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 4 desvela proteínas de revestimiento de la espora de B. subtilis con actividad lacasa (lacasa CotA), que tienen una mutación 149T. De hecho, la SEQ ID NO: 3 es una variante de la SEQ ID NO: 1 en la que se ha sustituido un resto de isoleucina en la posición 149 por un resto de treonina. La SEQ ID NO: 4 es una variante de la SEQ ID NO: 2 en la que se ha sustituido un resto de isoleucina en la posición 149 por un resto de treonina.

Los inventores llevaron a cabo una búsqueda de homología de proteínas homólogas a la SEQ ID NO: 1 utilizando la SEQ ID NO: 1 como secuencia de consulta con el software "BLAST de proteínas convencionales", disponible en http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LI NK_LOC=blasthome. Está disponible más información del softwares y versiones de la base de datos en el Centro Nacional de Información Biotecnológica en el sitio de internet de la biblioteca Nacional de Medicina del Instituto Nacional de Salud www.ncbi.nlm.nih.gov. En el mismo, se encuentran varias herramientas de biología molecular que incluyen el BLAST (Herramienta de Búsqueda de Alineamiento Lógico Básico). El BLAST utiliza las siguientes bases de datos: Todas las traducciones CDS no redundantes del GenBank+PDB+SwissProt+PIR+PRF excluyendo las muestras ambientales de los proyectos WGS. La búsqueda que se expone en el presente documento se llevó a cabo en línea el 19 de Feb de 2014 y se empleó la versión BLAs Tp 2.2.29+.

La búsqueda reveló 44 secuencias con al menos un 75 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 (tabla 1). Estas secuencias se proporcionan en el presente documento como las SEQ ID NO: 51 a 94.

Tabla 1 Secuencias obtenidas a partir de una búsqueda BLAST que desvela 44 secuencias con al menos un 75 % de identidad con la SEQ ID NO: 1

(continuación)

(continuación)

(continuación)

(continuación)

(continuación)

El análisis de las proteínas homólogas reveló que todas las proteínas con al menos un 75 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1, pertenecen a las especies de Bacillus. Todas las secuencias con al menos un 75 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 eran oxidasas dependientes del cobre (lacasas) y la mayoría de ellas se señalaban como proteínas de revestimiento de esporas. Por lo tanto, los inventores concluyeron que esas secuencias con esa extensión (de al menos un 75 %) de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 representan un grupo de proteínas altamente relacionado funcional y estructuralmente que es probable que tengan rasgos estructurales y rutas de plegamiento similares.

Los inventores llevaron a cabo varias sustituciones de aminoácidos en una variedad de lacasas en una posición correspondiente con la posición 149 de la SEQ ID NO: 1 y descubrieron que el rendimiento de una lacasa proteica recombinante soluble se podía mejorar cuando el aminoácido original (Ile o Leu) que existía en esa posición se remplazaba con un resto de aminoácido pequeño o diminuto seleccionado de entre el grupo que consiste en treonina, prolina, alanina, glicina, serina, cisteína, ácido aspártico, asparagina y valina.

En otras palabras, la divulgación se refiere a un polipéptido de revestimiento de esporas con actividad de lacasa en el que el polipéptido comprende un resto de aminoácido seleccionado de entre el grupo que consiste en treonina, prolina, alanina, glicina, serina, cisteína, ácido aspártico, asparagina y valina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición 149 de la SEQ ID NO: 1

Aunque se observaron diferencias marginales en el rendimiento entre las variantes que tenían los diferentes aminoácidos, las variantes que tenían un resto de treonina en la posición 149 presentaban el rendimiento más alto. La divulgación, por lo tanto, se refiere particularmente a una lacasa con un resto de treonina en una posición correspondiente con la posición de aminoácido 149 de la SEQ ID NO: 1.

También se desvela en el presente documento es un polipéptido mutado como se ha descrito anteriormente en el que la secuencia de tipo silvestre es codificada por el genoma de una especie de Bacillus, tal como el Bacillus subtilis.

Ninguna de las 45 de lacasas de la Tabla 1 (44 secuencias de la búsqueda más la SEQ ID NO: 1 que se utiliza como secuencia de consulta) tienen un aminoácido seleccionado de entre el grupo que consiste en treonina, prolina, alanina, glicina, serina, cisteína, ácido aspártico, asparagina y valina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición 149 de la SEQ ID NO: 1. Por lo tanto, se puede concluir que una lacasa con al menos un 75 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 que comprende un aminoácido seleccionado de entre el grupo que consiste en treonina, prolina, alanina, glicina, serina, cisteína, ácido aspártico, asparagina y valina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición 149 de la SEQ ID NO: 1 no se había descrito ya en la técnica anterior.

Es reseñable que el aminoácido correspondiente en la posición 149 de la SEQ ID NO: 1 está bastante bien conservada dentro del grupo de 44 secuencias de la Tabla 1. Existe un resto de leucina en esa posición en 31 de los 44 casos (un 70 %) mientras que trece secuencias parece que tienen un resto de leucina en esa posición (un 30 %).

Los inventores observaron adicionalmente que la búsqueda identificaba dos grupos de secuencias diferentes. El primer grupo comprende 26 secuencias con una identidad de entre un 94 y el 100% con la SEQ ID NO: 1. Las secuencias se señalaron casi todas como proteínas del revestimiento de esporas CotA de Bacillus subtilis, aparte de dos CotA de Bacillus vallismortis (SEQ ID No : 55 y la SEQ ID NO: 75).

Los inventores identificaron también un segundo grupo de 15 secuencias con una identidad de entre un 75 y un 81 % con la secuencia de la SEQ ID NO: 1.

Los inventores descubrieron que 41 de las 44 secuencias de la búsqueda (un 93 %) pertenecían a uno cualquiera de estos grupos.

La introducción de una mutación específica en un gen recombinante está entre las experiencias de rutina de un biólogo molecular. Se puede obtener una guía específica en Methods in Molecular Biology Vol 182, "In vitro mutagenesis protocols", Eds Jeff Braman, Humana Press 2002. Existen kits disponibles en el comercio que llevan a cabo mutagénesis dirigida al sitio (por ejemplo, kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange II XL de Agilent Technologies cat. N.° 200521).

Los inventores prepararon variantes de lacasas representativas a partir de los dos grupos descritos anteriormente. Esto incluye lacasas con una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2 como representantes del grupo 1 (un 94-100 % de identidad). Las secuencias de estas variantes se muestran en la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 4, respectivamente, en la que el resto de isoleucina en la posición 149 de la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2 estaba sustituido con treonina. Cuando se expresan en E. coli, ambas variantes que presentaban un aumento del rendimiento de enzima activa del 240 % y el 260 %, respectivamente (Figura 1). En otras palabras, la actividad volumétrica de ambas variantes aumentaba al menos un 240 %.

Como experimento de control, los inventores determinaron si esta actividad volumétrica mejorada podía atribuirse a un aumento de la actividad específica de la enzima. Esto no parece ser el caso. El aumento de cantidad de la enzima mutada (149T) en la fracción soluble del lisado celular era proporcional al aumento de actividad volumétrica, por lo que se concluye que se puede recuperar más variante de enzima, por lo que contribuye completamente en el aumento de la actividad volumétrica. Por lo tanto, el rendimiento de la enzima lacasa aumenta más que su actividad específica.

Los inventores también prepararon una variante 149T a partir de una representante de lacasas del segundo grupo (con un 75-81 % de identidad). La Leu de origen natural en la posición 149 de la SEQ ID NO: 5 (con un 77 % de identidad con la SEQ ID NO: 1) se remplazó con una treonina con el fin de obtener la variante de acuerdo con la SEQ ID NO: 6.

Cuando se expresaban en E. coli, la variante 149T presentaba un aumento del rendimiento de enzima activa del 250 %. En otras palabras, la variante 149T tenía un aumento de la actividad volumétrica de al menos un factor de 2,5 (Figura 2).

El aminoácido de origen natural en la posición 149 podría remplazarse también con otros aminoácidos. Los inventores prepararon variantes de lacasas representativas de cada uno de los dos grupos identificados anteriormente; SEQ ID NO: 5 y la SEQ ID NO: 15. Los inventores remplazaron la Leu de origen natural de la SEQ ID NO: 5, y la Ile de origen natural en la posición 149 de la SEQ ID NO: 15 con un resto de treonina, prolina, alanina, glicina, serina, cisteína, ácido aspártico, asparagina o valina. Las variantes de la SEQ ID NO: 5 están representadas por la SEQ ID NO: 6-14, respectivamente, mientras que las variantes de SEQ ID NO: 15 están representadas por la SEQ ID NO: 16 - 24(tabla 2 y 3).

Las secuencias de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 24 se muestran en la Tabla 5.

Cada una de estas variantes presentaban un rendimiento mejorado de al menos un 50 % cuando se expresan en un sistema de expresión heterólogo (Figuras 2 y 3).

Las variantes de acuerdo con la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 4 también se expresaron en Pichia pastoris. De acuerdo con los datos obtenidos en un sistema de expresión procariótica (de E. coli, véase anteriormente) la expresión eucariótica también presentaba un aumento de rendimiento. El rendimiento mejoraba hasta al menos un 200 % cuando la expresión de las secuencias de variantes se comparaba con su tipo silvestre, SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2 respectivamente (Figura 4).

También se describe en el presente documento un polipéptido con actividad de lacasa que consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 1, en la que el polipéptido comprende un resto de aminoácido pequeño seleccionado de entre el grupo que consiste en treonina, prolina, alanina, glicina, serina, cisteína, ácido aspártico, asparagina y valina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición 149 de la SEQ ID NO: 1.

También se describe en el presente documento un polipéptido con actividad de lacasa que consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 1 en la que el polipéptido comprende un resto de treonina en la posición correspondiente a la posición 149 de la SEQ ID NO: 1.

También se hace referencia a esta variante de lacasa en el presente documento como la variante de aminoácidos 149Thr o 149T. En una realización preferida adicional, el polipéptido está aislado.

El hallazgo anterior de que las proteínas del revestimiento de las esporas se producen en dos grupos distintos permite definir la invención de otra manera, tal como la relación estructural entre el polipéptido como se describe en el presente documento y los polipéptidos de referencia de acuerdo con las secuencias del presente documento. Por lo tanto, la descripción proporciona un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 94 % idéntica a la secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 51 - 75 como representativas del grupo 1 así como un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 94 % idéntica a la secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 80 -94 como representativas del grupo 2, en la que el polipéptido comprende un resto de aminoácido seleccionado de entre el grupo que consiste en treonina, prolina, alanina, glicina, serina, cisteína, ácido aspártico, asparagina y valina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición 149 de la SEQ ID NO: 1.

La expresión al menos un 94 % se utiliza en el presente documento para incluir al menos un 95 %, tal como un 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o incluso el 100 %.

La expresión "variante de aminoácido", "variante de lacasa" o "variante de secuencia" o equivalentes tiene un significado bien reconocido en la técnica y se utiliza en el presente documento en consecuencia para indicar una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una diferencia de un aminoácido en comparación con otra secuencia de aminoácidos, tal como la secuencia de aminoácidos de la que se deriva.

La expresión al menos un 75 % se utiliza en el presente documento para incluir al menos un 76 % tal como al menos un 77 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 % o más, tal como al menos un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 88 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 % o más, tal como un 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 99 %, 97 %, 98 %, 99 %, o incluso el 100 %.

La expresión "actividad de lacasa" se utiliza en el presente documento para significar la propiedad de un polipéptido para que actúe como una enzima lacasa, que se puede expresar como la tasa inicial máxima de la reacción de oxidación específica. La actividad de lacasa se puede determinar mediante ensayos de oxidación convencionales conocidos en la técnica que incluyen, tal como, por ejemplo, midiendo la oxidación de la siringaldacina, de acuerdo con el protocolo en línea de Sigma, o de acuerdo con Cantarella y col. 2003 [7].

Un ejemplo de la determinación de la actividad de lacasa relativa se presenta en el Ejemplo 4. Se puede utilizar cualquier sustrato adecuado para la enzima en cuestión en las mediciones de la actividad. Un ejemplo no limitante de un sustrato adecuado para su uso en la evaluación de la actividad enzimática de las variantes de lacasa es ABTS (ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico). Las lacasas son capaces de oxidar este sustrato.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "aumento (o mejora) de actividad específica de lacasa" se refiere a una actividad de lacasa mayor que la de la enzima lacasa no mutada correspondiente en las mismas condiciones.

La expresión "aumento de rendimiento" o equivalente significa que el rendimiento de la enzima activa del mismo volumen de cultivo obtenida en una purificación convencional o protocolo de recuperación está mejorada al menos un 50 % o un factor de 1,5. El aumento puedes ser incluso mayor, tal como un factor, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 910, 11, 12, 13, 14, 15 o más.

La recuperación de la variante de lacasa producida por una célula huésped puede llevarse a cabo por cualquier técnica conocida por los expertos en la técnica. Las técnicas posibles incluyen, pero no se limitan a la secreción de la proteína en el medio de expresión, y la purificación de la proteína de la biomasa celular. El procedimiento de producción puede comprender adicionalmente una etapa de purificación de la variante de lacasa obtenida. Para las lacasas termoestables, ejemplos no limitantes de dichos procedimientos incluyen el calentamiento de las células desintegradas y la retirada de las proteínas termolábiles coaguladas de la solución. Para las proteínas secretadas, los ejemplos no limitantes de dichos procedimientos incluyen la cromatografía de intercambio iónico, y la ultrafiltración del medio de expresión. Es importante que el procedimiento de purificación de elección sea tal que la proteína purificada mantenga su actividad, preferentemente su actividad de lacasa.

Las variantes de lacasa como se describen en el presente documento se pueden utilizar en un amplio intervalo de procedimientos y aplicaciones industriales diferentes, tales como la recuperación de celulosa a partir de biomasa lignocelulósica, disminución de la energía de refinado en refinería de madera y preparación de pasta, en la delignificación de pasta, blanqueamiento de colorante textil, detoxificación de aguas residuales, detoxificación xenobiótica, y fabricación de detergentes.

Las variaciones de aminoácidos como se describen en el presente documento se pueden introducir en cualquiera de las secuencias de aminoácidos desveladas en el presente documento, u otras secuencias homólogas, por procedimientos convencionales conocidos en la técnica, tal como mutagénesis dirigida al sitio. De esta manera, el rendimiento de las lacasa a partir de un sistema de expresión heterólogo se puede mejorar.

Los kits para llevar a cabo una mutagénesis dirigida al sitio están disponibles en el mercado en la técnica (por ejemplo, el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange® II XL de Agilent Technologies). Los procedimientos adicionalmente adecuados para la introducción de mutaciones anteriores en un gen recombinante se desvelan, por ejemplo, en Methods in Molecular Biology, 2002 [8].

Por lo tanto, en algunas realizaciones que se describen en el presente documento, se refieren a variantes de lacasa o mutantes que comprenden un resto de aminoácido pequeño, preferentemente un resto de treonina (Thr) en una posición que se corresponde con la posición 149 de la secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID NO: 1, y tiene un aumento de rendimiento en comparación con la de un control no mutado correspondiente cuando se expresa en un sistemas de expresión heterólogo.

La expresión "sistema de expresión heterólogo" o equivalente significa un sistema de expresión de una secuencia de ADN a partir de un organismo huésped en un organismo receptor de una especie o género diferente del organismo huésped. Los receptores más prevalentes, conocidos como sistemas de expresión heterólogos, se escogen habitualmente debido a que son fáciles de transferirles un ADN dentro o debido a que permiten una evaluación más simple de la función proteica. Los sistemas de expresión heteróloga también se utilizan preferentemente debido a a que permiten la subida de escala de la producción de una proteína codificada por la secuencia de ADN en un procedimiento industrial. Los organismos receptores preferidos para su uso como sistemas de expresión heterólogos incluyen organismos bacterianos, fúngicos y levaduras, tales como, por ejemplo, Escherichia coli, Bacillus, Corynebacterium, Pseudomonas, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, hongos filamentosos y muchos más sistemas bien conocidos en la técnica.

Como se utiliza en el presente documento, el grado de identidad entre dos o más secuencias de aminoácidos es equivalente a la función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, un % de identidad = al número de posiciones idénticas divididas por el número total de posiciones x 100), excluyendo huecos, que necesitan introducirse para el alineamiento óptimo de las dos secuencias, y protuberancias. La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos o más secuencias se puede conseguir utilizando procedimientos convencionales conocidos en la técnica. Por ejemplo, un freeware que se utiliza convencionalmente para este fin es la herramienta "Align" en el recurso NCBI http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch&BLAST_SPEC=blast2s eq&LINK_LOC=align2seq

En una realización preferida, el alineamiento de dos secuencias se lleva a cabo sobre la longitud completa de los polipéptidos.

Los presentes polipéptidos o proteínas de lacasa se pueden fusionar a secuencias adicionales, por unión o inserción, que incluyen, pero no se limitan a, marcadores de afinidad, que facilitan la purificación proteica (marcador S, dominio de unión a la maltosa, dominio de unión a quitina), dominios o secuencias que ayudan al plegamiento (tal como el dominio de tiorredoxina, proteína SUMO), secuencias que afectan la localización proteica (señales de localización periplásmica, etc.), proteínas que tienen una función adicional, tal como la proteína fluorescente verde (GFP), o secuencias que representan otra actividad enzimática. Otras parejas de fusión adecuadas para las presentes lacasas son conocidas por los expertos en la técnica.

La presente divulgación proporciona polinucleótidos que codifican cualquiera de las variantes de lacasa desveladas en el presente documento. Los medios y procedimientos para la clonación y aislamiento de dichos polinucleótido son bien conocidos en la técnica.

Se describe adicionalmente en el presente documento un vector que comprende un polinucleótido como se describe en el presente documento, unido operativamente de manera opcional a una o más secuencias de control. Las secuencias de control adecuadas están disponibles fácilmente en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, secuencias promotoras, líder, de poliadenilación, y de señal.

Las variantes de lacasa de acuerdo con distintas realizaciones como se describe en el presente documento se pueden obtener mediante procedimientos recombinantes convencionales conocidos en la técnica. En resumen, dicho procedimiento puede comprender las etapas de i) cultivar una célula huésped recombinante deseada en condiciones adecuadas para la producción de una variante polipeptídica de lacasa, y ii) recuperación de la variante polipeptídica obtenida. El polipéptido se puede entonces purificarse adicionalmente de manera opcional.

Se puede utilizar un gran número de sistemas vector-huésped conocidos en la técnica para la producción recombinante de variantes de lacasa. Los vectores posibles incluyen, pero no se limitan a, plásmidos o virus modificados que se mantienen en la célula huésped como una molécula de ADN autónomo o integrada en el ADN genómico. El sistema de vector debe ser compatible con la célula huésped utilizada como se conoce bien en la técnica. Ejemplos no limitantes de células huésped adecuadas incluyen bacterias (por ejemplo, E. coli, bacilos), levaduras (por ejemplo, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae), hongos (por ejemplo, hongos filamentosos), células se insecto (por ejemplo, Sf9).

Puede utilizarse ventajosamente un polipéptido como se describe en el presente documento en una aplicación seleccionada de entre el grupo que consiste en la delignificación de la pasta, degradación o disminución de la integridad estructural de material lignocelulósico, blanqueamiento de colorantes textiles, detoxificación de aguas residuales, detoxificación xenobiótica, producción de azúcares a partir de material lignocelulósico y recuperación de celulosa a partir de una biomasa.

En otros términos más, la divulgación se refiere a un procedimiento para la mejora del rendimiento de un polipéptido con actividad de lacasa en un sistema de expresión heterólogo que comprende la etapa del cambio del aminoácido en la posición correspondiente a la posición 149 de la SEQ ID NO: 1 por un resto de treonina.

Leyenda de las figuras

Figura 1: Aumento relativo de actividad volumétrica.

Un gráfico que muestra el aumento relativo de actividad volumétrica en cultivos paralelos en E. coli de tipo silvestre (no mutada) frente a las variantes de lacasas de acuerdo con la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2. La abreviatura SEQ seguido por un número se refiere a la SEQ ID NO: del número respetivo; SEQ 1 se refiere a SEQ ID NO: 1. SEQ 1 149T se refiere al polipéptido de acuerdo con la SEQ ID NO: 1 en la que el aminoácido correspondiente con la posición 149 se ha remplazado con una T (Thr o treonina).

Figura 2: Aumento relativo de actividad volumétrica.

Un gráfico que muestra el aumento relativo de actividad volumétrica en cultivos paralelos en E. coli de tipo silvestre (no mutada) frente a las variantes de lacasas de acuerdo con la SEQ ID NO: 5. La abreviatura SEQ seguido por un número se refiere a la SEQ ID NO: del número respetivo; SEQ 5 se refiere a SEQ ID NO: 5. SEQ 5149T se refiere al polipéptido de acuerdo con la SEQ ID NO: 5 en la que el aminoácido correspondiente con la posición 149 se ha remplazado con una T (Thr o treonina).

Figura 3: Aumento relativo de actividad volumétrica.

Un gráfico que muestra el aumento relativo de actividad volumétrica en cultivos paralelos en E. coli de tipo silvestre (no mutada) frente a las variantes de lacasas de acuerdo con la SEQ ID NO: 15. La abreviatura SEQ seguido por un número se refiere a la SEQ ID NO: del número respetivo; SEQ 15 se refiere a SEQ ID NO: 15. SEQ 15149T se refiere al polipéptido de acuerdo con la SEQ ID NO: 15 en la que el aminoácido correspondiente con la posición 149 se ha remplazado con una T (Thr o treonina).

Figura 4: Aumento relativo de actividad volumétrica.

Un gráfico que muestra el aumento relativo de actividad volumétrica en cultivos paralelos en Pichia pastoris de tipo silvestre (no mutada) frente a las variantes de lacasas de acuerdo con la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2. La abreviatura SEQ seguido por un número se refiere a la SEQ ID NO: del número respetivo; SEQ 1 se refiere a SEQ ID NO: 1. SEQ 1149T se refiere al polipéptido de acuerdo con la SEQ ID NO: 1 en la que el aminoácido correspondiente con la posición 149 se ha remplazado con un resto de treonina T (Thr o T).

Ejemplos

Ejemplo 1: Construcción de lacasas con propiedades mejoradas.

Se introdujeron las mutaciones como se ha descrito en el presente documento en distintos genes recombinantes mediante mutagénesis dirigida al sitio descrita esencialmente en el documento WO 2013/038062. Con más detalle: Para introducir una mutación 149T en el gen de la SEQ ID NO: 1, los inventores llevaron a cabo dos PCR separadas:

(1) con los cebadores Cebador1 GAAATTAATACGACTCACTATAGG (SEQ ID NO: 25) y Cebador2 (Seq1) AGCACCGCGTTGCTGATTCGGATAATGATA (SEQ ID NO: 26),

(2) con el Cebador3 (Seq1) CGAATCAGCAACGCGGTGCTAccTTGTGGTATC (SEQ ID NO: 27) y Cebador4 GGTTATGCTAGTTATTGCTCAGCGGTG (SEQ ID NO: 28).

En ambas reacciones, el gen recombinante sin la mutación se utilizó como matriz. Los Cebadores 1 y 4 se unen dentro de la secuencia del vector y no específica con el gen recombinante. Los Cebadores 2 y 3 se unen dentro del gen recombinante y sus sitios de unión se solapan. El sitio de unión del cebador 3 contiene el sitio de mutación. El Cebador 3 representa la secuencia mutada (deseada), que no es un 100 % coincidente con la matriz (la letra en minúsculas de la secuencia del cebador indica los nucleótidos no coincidentes), sin embargo, el cebador tiene una afinidad y especificidad suficientes para el sitio de unión para producir el producto de la PCR deseado. Los productos de PCR purificados de las reacciones (1) y (2) se combinaron y utilizaron como matriz para la reacción PCR con el Cebador 1 y Cebador 4. El producto de esta reacción, que contiene la secuencia mutante del gen, se clonó en un vector plasmídico para la expresión en E. coli.

De manera similar, para la introducción de una mutación 149T en otros genes (que se corresponden con las SEQ ID NO: 2, la SEQ ID n O: 5 y la SEQ ID NO: 15, los inventores utilizaron el mismo Cebador1 y Cebador4, mientras que el Cebador2 y Cebador3 eran específicos de cada gen.

En el polipéptido que consiste en la secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 2, hay una isoleucina en la posición 149, la posición correspondiente al aminoácido 149 de la SEQ ID NO: 1. Para la introducción de la mutación 149T en el polipéptido que comprende la secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 2, se utilizaron los siguientes cebadores 3 y 2:

Cebador3 CGAATCAGCAGCGCGGCGCTAccTTGTGGTATC (SEQ ID NO: 29)

Cebador2 AGCGCCGCGCTGCTGATTCGGATAATGATA (SEQ ID NO: 30).

En el polipéptido que consiste en la secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 5, hay una isoleucina en la posición 149, la posición correspondiente al aminoácido 149 de la SEQ ID NO: 1. Para la introducción de varias mutaciones en la posición 149 del polipéptido que comprende la secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 5, se utilizó el siguiente cebador 2 en combinación con los cebadores 3 enumerados en la Tabla 2.

Cebador2 GCCCCGCGCTGTTTGTTTGGATAA (SEQ ID NO: 31).

Tabla 2: Cebadores utilizados para introducir distintas sustituciones de aminoácidos en la SEQ ID NO: 5

En el polipéptido que consiste en la secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 15, hay una isoleucina en la posición 149, la posición correspondiente al aminoácido 149 de la SEQ ID NO: 1. Para la introducción de una mutación 149T en el polipéptido que comprende la secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 15, se utilizó el siguiente cebador2 en combinación con los distintos cebadores3 de la Tabla 3.

Cebador2: AGCACCGCGCTGCTGATTCGGATAATGATA (SEQ ID NO: 41).

Tabla 3: Cebadores utilizados para introducir distintas sustituciones de aminoácidos en la SEQ ID NO: 15

Ejemplo 2: Expresión heteróloga de variantes y lacasas no mutadas.

Las variantes de lacasa se expresaron en E. coli y Pichia pastoris.

Para la expresión en Pichia pastoris, los genes recombinantes se clonaron en un vector de expresión en Pichia pastoris comercial pPICZ-A disponible en Invitrogen (Life Technologies). Este vector proporciona la expresión de la proteína que se secreta bajo el control del promotor AOX1 inducible por metanol al integrarse la construcción en el ADN genómico de la célula de levadura.

El ADN plasmídico linealizado se introdujo en las células de levadura mediante electroporación, y los clones con el gen recombinante integrado se seleccionaron en placas de medio con agar con Zeocina (25 ug/ml). Se ensayaron diez colonias de cada construcción en pequeños cultivos de líquido (3 ml) con un cultivo de 72 horas en un agitador humidificado a 28 °C de acuerdo con el manual del fabricante del plásmido (http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/ppiczalpha_man.pdf). El medio recomendado por el fabricante se suplementó con 1 mM de CuCl, ya que la proteína de lacasa contiene cobre como cofactor. La actividad en el medio se midió por la oxidación del ABTS (véase el Ejemplo 4), y los 2 clones de mejor producción se seleccionaron para cada gen. Se cultivaron cultivos paralelos de los clones seleccionados en escala de matraz de acuerdo con el manual del fabricante del plásmido (véase anteriormente) a 28 grados C durante 105 h. Las células se retiraron por centrifugación, se recolectó el medio que contenía la proteína recombinante. Estas preparaciones se utilizaron para la comparación de las actividades volumétricas de la variante y los genes no mutados.

Para la expresión recombinante en E. coli, los genes recombinantes se clonaron en el vector de expresión comercial pET-28 bajo el control del promotor de bacteriófago T7. La producción de proteína se llevó a cabo en la cepa BL21 (DE3) de E. coli de acuerdo con el protocolo del fabricante del plásmido http://richsingiser.com/4402/Novagen %20pET %20system %20manual.pdf. El medio recomendado por el fabricante se suplementó con 1 mM de CuCl, ya que la proteína de lacasa contiene cobre como cofactor. La temperatura de incubación para la producción de proteínas era de 30 grados C, que se descubrió que era la óptima para el máximo rendimiento de la proteína activa. Las células se lisaron utilizando un tampón de lisis (50 mM de Tris-HCl pH 7,4, un 1 % de Triton X100, 1 mM de CuCl) y se calentaron a 70 grados C durante 20 min. Los desechos celulares coagulados se retiraron por centrifugación. La lacasa recombinante que era una proteína termoestable se mantenía en la fracción soluble. La actividad enzimática era detectable solo en la fracción soluble. El análisis de las fracciones soluble e insoluble por electroforesis en gel revela que más de un 90 % de la proteína recombinante está presente en forma inactiva insoluble como cuerpos de inclusión (de acuerdo con los datos de la bibliografía).

Ejemplo 3: Medición del rendimiento.

Los rendimientos relativos de las lacasas solubles mutadas y no mutadas se determinaron por densitometría de las bandas proteicas después de la desnaturalización en electroforesis en gel de poliacrilamida. En este extremo, las muestras de las proteínas solubles después del tratamiento térmico (Véase el Ejemplo 2) obtenido de los cultivos en paralelo de clones mutados y no mutados, se analizaron por electroforesis en gel en condiciones desnaturalizantes (un procedimiento convencional bien conocido en la técnica de la biología molecular). Después de la tinción del gel con Azul brillante de Coomasie, el gel se escaneó para obtener una imagen de mapa de bits, y la intensidad de la banda correspondiente a la lacasa recombinante se cuantificó con el software ImageJ (un freeware público desarrollado en el Instituto Nacional de Saludo y disponible en línea en http://imagej.nih.gov/ij/)

Ejemplo 4. Medición de la actividad relativa de lacasa.

Como se ha establecido anteriormente, la expresión "actividad de lacasa" se utiliza en el presente documento para significar la capacidad para que actuar como una enzima lacasa, que se puede expresar como la tasa inicial máxima de la reacción de oxidación específica. La actividad relativa se midió por la oxidación del ABTS (ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico). El curso de la reacción se monitorizó por cambio de absorbancia a 405 nm (desarrollo de color gris). El tiempo de reacción apropiada se determinó para proporcionar tasas de oxidación iniciales cuando el desarrollo del color es lineal con el tiempo. La concentración de sustrato (ABTS) era de 5 mM para proporcionar las tasas iniciales máximas (condiciones de saturación del sustrato).

Normalmente, las reacciones se llevaron a cabo en placas de 96 pocillos de fondo plano, cada pocillo contenía 2 ul de preparación de enzima en 200 ul de 100 mM de ácido succínico pH 5, la reacción se inició mediante la adición simultánea del sustrato (22 ul de 50 mM de ABTS) en cada pocillo. Después de pasar el tiempo de reacción, se determinó la absorbancia a 405 nm de las mezclas de reacción mediante un lector de placas (Multiscan Go, Thermo Scientific). Con el fin de determinar la actividad relativa de lacasa mutada, la absorbancia de la muestra de lacasa de referencia se tomó como el 100 %, y la actividad relativa se determinó como la fracción de esta absorbancia.

Ejemplo 5: Identificación de la posición de aminoácido correspondiente a la posición 149.

Con el fin de identificar la posición de aminoácido que se corresponde con la posición 149 de la SEQ ID NO: 1 en una determinada secuencia X, la secuencia X se alinea con la secuencia de SEQ ID NO: 1 utilizando un software convencional disponible en la técnica, en este caso la herramienta "Align" en el recurso NCBI http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch&BLAST_SPEC=blast2s eq&LINK_LOC=align2seq.

A modo de ejemplo, las secuencias 51 - 94 se alinearon con la SEQ ID NO: 1. Solo un fragmento de ese alineamiento se muestra en la Tabla 4, es decir, el fragmento correspondiente con los aminoácidos 125 - 152 de la SEQ ID NO: 1. Es inmediatamente evidente que esta región particular está altamente conservada o altamente homóloga entre las distintas secuencias proporcionada en la tabla, dando lugar a un alto grado de identidad en todas las secuencias examinadas. Por ejemplo, el resto de isoleucina (I) en la posición 149 de la SEQ ID NO: 1, se corresponde con un resto de isoleucina en la posición 149 de la SEQ ID NO: 51, con un resto de isoleucina en la posición 151 de la SEQ ID NO: 56, y con un resto de leucina (L) en la posición 149 de la SEQ ID NO: 85. La posición del primer y el último aminoácido de cada fragmento se muestra en la Tabla 4. El aminoácido correspondiente de la posición 149 de la SEQ ID NO: 1 en cada fragmento se indica en negrita.

Las secuencias de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 24 se muestran en la Tabla 5.

Tabla 4: Alineamiento de la SEQ ID NO: 1 con las SEQ ID NO: 51 - 94, se muestra el alineamiento de los fragmentos 125 - 152. El aminoácido de la posición correspondiente al aminoácido 149 de la SEQ ID NO: 1 se muestra en negrita.

(continuación)

(continuación)

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido con actividad de lacasa que consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 1, en el que el polipéptido comprende un resto de aminoácido pequeño seleccionado de entre el grupo que consiste en treonina, prolina, alanina, glicina, serina, cisteína, ácido aspártico, asparagina y valina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición 149 de la SEQ ID NO: 1.

2. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el resto de aminoácido pequeño es un resto de treonina.

3. Un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 94 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 51 - 75 y las SEQ ID NO: 80 - 94.

4. Un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, en el que el polipéptido es un polipéptido aislado.

5. Una composición que comprende un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4.

6. Un ácido nucleico que codifica un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 5.

7. Un vector que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 6.

8. Una composición que comprende un ácido nucleico o un vector de acuerdo con las reivindicaciones 6 o 7.

9. Una célula huésped recombinante que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 6, un vector de acuerdo con la reivindicación 7 o una composición de acuerdo con la reivindicación 8.

10. Una célula huésped recombinante de acuerdo con la reivindicación 9 seleccionada de entre el grupo que consiste en Escherichia coli, Bacillus, Corynebacterium, Pseudomonas, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, hongos filamentosos, levaduras y células de insecto.

11. El procedimiento de producción de un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 5, que comprende las etapas de:

a. el cultivo de una célula huésped recombinante de acuerdo con la reivindicación 9 o 10 en condiciones adecuadas para la producción del polipéptido, y

b. la recuperación del polipéptido obtenido, y

c. opcionalmente la purificación de dicho polipéptido.

12. El uso de un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4 o una composición de acuerdo con la reivindicación 5 en una aplicación seleccionada de entre el grupo que consiste en la delignificación de pasta, degradación o disminución de la integridad estructural de material lignocelulósico, blanqueamiento de colorantes textiles, detoxificación de aguas residuales, detoxificación xenobiótica, producción de un azúcar a partir de un material lignocelulósico y recuperación de celulosa a partir de una biomasa.

13. Un procedimiento para la mejora del rendimiento de un polipéptido con actividad de lacasa en un sistema de expresión heterólogo, en el que el polipéptido consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 75 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 1, comprendiendo el procedimiento la etapa de cambio de la secuencia de aminoácidos del polipéptido en una posición correspondiente a la posición 149 de la SEQ ID NO: 1 por un resto de aminoácido pequeño seleccionado de entre el grupo que consiste en treonina, prolina, alanina, glicina, serina, cisteína, ácido aspártico, asparagina y valina.

14. El procedimiento de la reivindicación 13 en el que el polipéptido con actividad de lacasa es una proteína de revestimiento de esporas, preferentemente codificada por una especie de Bacillus, más preferentemente el Bacillus subtilis.

15. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 o 14, en el que el aminoácido pequeño es un resto de treonina.