ES2821648T3 - Pectinasas independientes del calcio con termoestabilidad mejorada - Google Patents

Pectinasas independientes del calcio con termoestabilidad mejorada Download PDF

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Abstract

Un polipéptido con actividad de pectato liasa que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 70 % idéntica a la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 1, en donde el polipéptido comprende un resto de leucina en una posición de aminoácido correspondiente a la posición 231 en SEQ ID NO: 1 y en donde la actividad de pectato liasa es independiente del calcio y/o en donde el polipéptido tiene una termoestabilidad mejorada, en comparación con un polipéptido con una secuencia de aminoácidos por lo demás idéntica, en donde el resto en una posición de aminoácido correspondiente a la posición 231 en SEQ ID NO: 1 no es un resto de leucina.

Description

DESCRIPCIÓN
Pectinasas independientes del calcio con termoestabilidad mejorada
Campo de la invención
La invención está en el campo de la química de las proteínas, en particular en el campo de la enzimología. Proporciona pectinasas, es decir, polipéptidos con propiedades de degradación de pectinas. En particular, la invención proporciona polipéptidos con actividad de pectato liasa (EC 4.2.2.2). Las enzimas según la invención tienen propiedades mejoradas, tales como termoestabilidad mejorada y reducida dependencia del calcio.
Antecedentes de la invención
Las enzimas de degradación de la pared celular de las plantas son enzimas activas para hidratos de carbono que se han clasificado en diferentes familias basándose en criterios de homología [http:// www.cazy.org/, Cantarel et al., 2009, Nucleic Acids Res 37: D233-D238].
Las pectato liasas (EC 4.2.2.2) son un grupo importante de enzimas de degradación de la pared celular de las plantas. Escinden pectina usando una escisión eliminativa de (1 ->4)-alfa-D-galacturonano dando oligosacáridos con grupos 4-desoxi-alfa-D-galact-4-enuronosilo en sus extremos no reductores. Se producen principalmente por patógenos de las plantas y organismos asociados a las plantas, y solo raramente por los animales. Las pectato liasas también se producen comúnmente en bacterias, ya sea por bacterias que viven en estrecha proximidad con las plantas o por bacterias intestinales que encuentran el material de planta en el tubo digestivo de sus hospedadores. [Hugouvieux-Cotte-Pattat et al., Environmental Microbiology reports (2014) doi 10, 1111/1758-2229, 12166].
Las pectato liasas favorecen el pectado, el anión, con respecto a la pectina, el éster metilado, que es el sustrato preferido de la pectina liasa EC 4.2.2.10. Las pectato liasas también se conocen con diferentes nombres, tales como ácido alfa-1,4-D-endopoligalacturónico liasa, ácido endo-alfa-1,4-poligalacturónico liasa, endogalacturonato transeliminasa, endopectina metiltranseliminasa, pectato transeliminasa, ácido péptico liasa, ácido péptico transeliminasa, liasa péctica, pectina trans-eliminasa, PGA liasa, poligalacturonato liasa, ácido poligalacturónico liasa, ácido poligalacturónico trans-eliminasa, transeliminasa poligalacturónica y PPasa-N.
Cuando las pectato liasas se usan en procesos industriales es frecuentemente ventajoso que sean estables a temperaturas más altas (termoestables) y resistentes a condiciones alcalinas. Las pectato liasas alcalinas termostables tienen, por ejemplo, posibles aplicaciones en la industria textil como alternativa a los procesos de desengomado de ramio basado en productos químicos. Dichas enzimas se han descrito, y han sido aisladas y caracterizadas, de fuentes bacterianas, principalmente Bacillus [Swarupa Rani Chiliveri et al., Carbohydrate Polymers (2014), 111: 264-272, Zhou et al., Appl Environ Microbiol (2015) 81: 5714-5723].
La escisión por pectato liasas requiere la presencia de cationes, tales como iones manganeso, níquel, hierro, cobalto o calcio [Celia Marin-Rodriguez et al., J. Exp. Bot. (2002) 53: 2115-2119, Hugouvieux-Cotte-Pattat et al., Environmental Microbiology reports (2014) doi 10, 1111/1758-2229, 12166], con solo raras excepciones [Kazemi-Pour et al., Proteomics (2004) 10: 3177-3186].
Recientemente, se aisló otra pectato liasa termostable dependiente del calcio de Bacillus, se clonó, se secuenció y se caracterizó [Takao et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. (2000) 64: 2360-2367, Takao et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. (2001) 65: 322-329].
Aunque estas enzimas son útiles en una amplia variedad de procesos industriales, pueden ser menos aptas para procesos multienzimáticos, debido a su dependencia del calcio, puesto que los iones calcio pueden interferir con el mecanismo de trabajo de otras enzimas. Lo más en particular, en un proceso en donde se degrada biomasa a glucosa mediante una variedad de enzimas hidrolíticas que incluyen pectato liasa, los iones calcio tendrían que ser completamente retirados antes de que la glucosa se pudiera convertir en fructosa por la glucosa isomerasa, puesto que esta última enzima se inhibe por el calcio [Food Biotechnology, Segunda Edición, Food Science and Technology, Ed. Anthony Pometto, Kalidas Shetty, Gopinadhan Paliyath, Robert E. Levin, ISBN 1420027972, 9781420027976].
Además, los iones calcio pueden formar sales insolubles con diversos aniones, que pueden provocar problemas con procesos industriales, tales como ultrafiltración y acumulación sobre herramientas.
Por tanto, existe una necesidad en la técnica de polipéptidos mejorados con actividad de pectato liasa.
Sumario de la invención
La presente invención trata esta necesidad proporcionando una pectato liasa independiente del calcio como se define en las reivindicaciones.
La invención también se refiere a una composición que comprende un polipéptido como se ha descrito anteriormente, un ácido nucleico que codifica un polipéptido como se ha descrito anteriormente, un vector que comprende dicho ácido nucleico y una composición que comprende dicho ácido nucleico o un vector.
La invención también proporciona una célula hospedadora recombinante que comprende un ácido nucleico, o un vector como se ha descrito anteriormente.
Además, la invención se refiere a un método de producción de un polipéptido como se ha descrito anteriormente, que comprende las etapas de: cultivar una célula hospedadora recombinante como se ha descrito anteriormente, en condiciones adecuadas para la producción del polipéptido, y recuperar el polipéptido obtenido, y opcionalmente purificar el polipéptido.
Además, la invención se refiere a un polipéptido como se ha descrito anteriormente en una aplicación seleccionada del grupo que consiste en deslignificación de pulpa, degradación o disminución de la integridad estructural de material lignocelulósico, blanqueo de colorantes textiles, desintoxicación de aguas residuales, desintoxicación xenobiótica, producción de un azúcar de un material lignocelulósico y recuperación de celulosa de una biomasa.
La invención también se refiere a un método de mejora de la termoestabilidad de un polipéptido con actividad de pectato liasa que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 70 % idéntica al aminoácido según SEQ ID NO: 1, comprendiendo el método la etapa de cambiar el aminoácido en una posición correspondiente a la posición 231 en SEQ ID NO: 1 a un resto de leucina.
La invención también se refiere a un método de disminución, supresión o retirada de la dependencia del calcio de un polipéptido con actividad de pectato liasa que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 70 % idéntica al aminoácido según SEQ ID NO: 1, comprendiendo el método la etapa de cambiar el aminoácido en una posición correspondiente a la posición 231 en SEQ ID NO: 1 a un resto de leucina.
Leyenda de las figuras
Figura 1: Diagrama que muestra la actividad relativa de la pectato liasa de polipéptidos según SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6. Se determinó la actividad de pectato liasa en presencia y ausencia de iones calcio según el método descrito en el Ejemplo 7. Mientras que la secuencia no mutante según SEQ ID NO: 1 era dependiente del calcio, los polipéptidos mutados que llevan la mutación A231L (SEQ ID NOs: 4 - 6) fueron independientes del calcio.
Figura 2: Termoestabilidad de polipéptidos según SEQ ID NO: 1 - 6. Diagrama que muestra la actividad relativa de la pectato liasa de los polipéptidos sin la mutación A231L (SEQ ID NO: 1, 2 y 3) y la actividad relativa de la pectato liasa de polipéptidos con la mutación A231L (SEQ ID NOs: 4, 5 y 6) después de una pre-incubación de 10 minutos a temperaturas elevadas. TA = Temperatura ambiente, 70 °C es 70 grados Celsius.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se basa en la observación de los presentes inventores de que una sustitución de un único aminoácido en una posición correspondiente a la posición de aminoácido 231 en SEQ ID NO: 1 (variante A231L) en diferentes pectato liasas disminuye o suprime la dependencia del calcio de la enzima. Los presentes inventores también encontraron que la variante A231L retuvo su actividad de pectato liasa.
Como se usa en el presente documento, el término "variante A231L" indica que el aminoácido correspondiente al resto de alanina en la posición 231 de SEQ ID NO: 1 está sustituido por un resto de leucina.
El término "sustitución de aminoácidos" se usa en el presente documento de la misma forma que se usa comúnmente, es decir, el término se refiere a una sustitución de uno o más aminoácidos en una proteína con uno o varios de otros aminoácidos. Dicha sustitución de aminoácidos también se puede denominar una mutación, una variante o una variación.
Los presentes inventores observaron el mismo fenómeno en pectato liasas que eran homólogas al polipéptido con una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 1. Cuando se introdujo una variación de aminoácido A231L en polipéptidos que eran 93 % y 89 % idénticos al polipéptido según SEQ ID NO: 1, esto también disminuyó o suprimió la dependencia del calcio de ambas de estas enzimas.
La descripción proporciona un polipéptido con actividad de pectato liasa que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 70 % idéntica al aminoácido según SEQ ID NO: 1, en donde el polipéptido comprende un resto de leucina en una posición de aminoácido correspondiente a la posición 231 en SEQ ID NO: 1. Esto se denomina en el presente documento una variante A231L de SEQ ID NO: 1.
La base de datos UniProt [en línea] con el número de acceso UNIPROT:A0A0C2RPE1 desvela una pectato liasa que tiene 62,8 % de identidad a lo largo de la longitud entera de SEQ ID NO: 1. Tiene un resto de leucina en la posición 231.
El documento de patente WO 2008/138109 A1 desvela una pectato liasa de Bacillus sp. TS-47, que es idéntica a lo largo de la longitud entera con SEQ ID NO: 1, sin embargo, esta secuencia no tiene un resto de leucina en la posición 235.
Los polipéptidos con actividad de pectato liasa también se denominan en el presente documento pectato liasas, o enzimas pectato liasa.
El término "actividad de pectato liasa" se usa en el presente documento para indicar la capacidad de un polipéptido para escindir pectina usando una escisión eliminativa de (1 ->4)-alfa-D-galacturonano dando oligosacáridos con grupos 4-desoxi-alfa-D-galact-4-enuronosilo en sus extremos no reductores. Los métodos de medición de esta actividad se conocen bien en la técnica.
El término "al menos 70 %" se usa en el presente documento para incluir al menos 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 88 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 % o más, tal como 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 99 %, 97 %, 98 %, 99 %, o incluso 100 %.
Como se usa en el presente documento, el grado de identidad entre dos o más secuencias de aminoácidos es equivalente a una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias; es decir, el % de identidad = número de posiciones idénticas dividido entre el número total de posiciones alineadas x 100, excluyendo huecos, que se necesitan introducir para el alineamiento óptimo de las dos secuencias, y nucleótidos protuberantes. El alineamiento de dos secuencias se va a realizar a lo largo de la longitud completa de los polipéptidos.
La comparación (alineamiento) de secuencias es una tarea rutinaria para el experto y se puede llevar a cabo usando métodos convencionales conocidos en la técnica. Por ejemplo, un software gratuito convencionalmente usado para este fin es la herramienta "Align" en el recurso de NCBI http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TIPO=BlastSearch&BLAST_SPEC=blast2 seq&LINK_LOC=align2seq, También son adecuados para este fin otro software comercial y abierto, tal como Vector NTI,
La introducción de una mutación específica en un gen recombinante también está entre las habilidades rutinarias de un biólogo molecular. Se puede obtener orientación específica de Methods in Molecular Biology Vol 182, "In vitro mutagenesis protocols", Eds Jeff Braman, Humana Press 2002. Están comercialmente disponibles kits para realizar mutagénesis dirigida al sitio (por ejemplo, el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange II XL de N° de catálogo de Agilent Technologies 200521).
SEQ ID NO: 1 proporciona la secuencia de aminoácidos de un polipéptido conocido [Takao et al, Biosci. Biotechnol. Biochem. (2000) 64: 2360-2367, Takao et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. (2001) 65: 322-329] con actividad de pectato liasa. Los presentes inventores sustituyeron el resto de alanina en la posición 231 de SEQ ID NO: 1 con un resto de leucina, obteniendo así un polipéptido según SEQ ID NO: 4. Los presentes inventores encontraron que así aumentaba, disminuía o se suprimía la dependencia del calcio de la actividad de pectato liasa. Esto se denomina adicionalmente en el presente documento "independencia del calcio".
La "independencia del calcio" de una enzima se puede medir según los procedimientos desvelados en los Ejemplos 5 y 7. En ellos se mide la actividad de la pectato liasa en presencia y ausencia de CaCl2.
Se considera que una pectato liasa es independiente del calcio si la actividad de la enzima en ausencia de CaCl2 no disminuye en más de 20 % en comparación con su actividad en presencia de CaCl2 0,5 mM, en las condiciones ejemplificadas en el Ejemplo 5. En una realización preferida, la actividad de la enzima no se reduce en ausencia de CaCl2. Se considera que la enzima es dependiente del calcio si no es independiente del calcio. Los presentes inventores también encontraron que la posición de aminoácido correspondiente a la posición 231 en SEQ ID NO: 1 se podría cambiar en polipéptidos con una secuencia de aminoácidos homóloga a la secuencia según SEQ ID NO: 1 con el mismo efecto. Los presentes inventores construyeron dos pectato liasas que fueron 93 % (SEQ ID NO: 2) y 89 % (SEQ ID NO: 3) idénticas con la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 1. También se encontró que estos péptidos homólogos eran dependientes del calcio porque su actividad de pectato liasa disminuyó hasta solo 60 % cuando el calcio se omitió del tampón de reacción (Figura 1).
Los presentes inventores observaron que estas dos pectato liasas homólogas se volvieron independientes del calcio cuando el aminoácido correspondiente a la posición 231 en SEQ ID NO: 1 se cambió a un resto de leucina para obtener polipéptidos que comprendían una secuencias de aminoácidos según SEQ ID NOs: 5 y 6, respectivamente.
La secuencia no mutada y los polipéptidos homólogos según SEQ ID NO: 2 y SQ ID NO: 3 solo presentaron 60 % de su actividad en ausencia de calcio, es decir, cuando el calcio se omitió del ensayo de actividad. Sin embargo, el polipéptido según SEQ ID NO: 4 y sus polipéptidos homólogos según SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 (los tres que llevan la mutación A231L) mostraron actividad de pectato liasa plena en ausencia de calcio (100, 105 y 102 %, respectivamente, Figura 1). Se llega a la conclusión de que la actividad de pectato liasa de la mutante depende del calcio, mientras que la actividad de la variante A231 Ls no depende del calcio.
La expresión "el aminoácido correspondientes a posición 231 en SEQ ID NO: 1" se debe entender del siguiente modo. Si se determina que dicha posición en una secuencia de aminoácidos dada es al menos 70 % idéntica con la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 1, entonces se deben alinear primero las dos secuencias. Esto se puede hacer por métodos rutinarios y software disponible en la técnica. El aminoácido en la secuencia de aminoácidos dada correspondiente al aminoácido 231 en SEQ ID NO: 1 es entonces el aminoácido que se alinea con el resto de alanina en la posición 231 en SEQ ID NO: 1.
Los presentes inventores realizaron una búsqueda de homología de proteínas homólogas a SEQ ID NO: 1 usando SEQ ID NO: 1 como la secuencia de búsqueda en el software "Standard protein BLAST", disponible en http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE-TYPE=BlastSearch&LI NK_LOC=blasthome. Más información sobre el software y las versiones de la base de datos está disponible en el Centro Nacional para Información Biotecnológica en la Biblioteca Nacional de Medicina en el sitio de internet del Instituto Nacional de Salud www.ncbi.nlm.nih.gov. Allí se pueden encontrar varias herramientas de biología molecular que incluyen BLAST (Basic Logical Alignment Search Tool). BLAST hace uso de las siguientes bases de datos: Todas las traducciones no redundantes de CDS de GenBank PDB SwissProt PIR PRF excluyendo muestras medioambientales de proyectos de WGS.
El término "variante de aminoácido", "variante", "mutante" o "variante de secuencia" o equivalente tiene una significado bien reconocido en la técnica y se usa, por consiguiente, en el presente documento para indicar una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una diferencia de aminoácidos en comparación con otra secuencia de aminoácidos, tal como la secuencia de aminoácidos de la que se obtuvo.
Sorprendentemente, los presentes inventores también encontraron que la mutación A231L provocó que los polipéptidos tuvieran una termoestabilidad mejorada.
El término "proteína mutante" o "mutación" también se usa en el presente documento para referirse a un polipéptido con actividad de pectato liasa como se describe en el presente documento, que comprende un resto de leucina en una posición de aminoácido correspondiente a la posición 231 en SEQ ID NO: 1.
El término "proteína natural" también se usa en el presente documento para indicar un polipéptido idéntico a la proteína mutante, con la excepción de que no comprende un resto de leucina en una posición de aminoácido correspondiente a la posición 231 en SEQ ID NO: 1.
El término "termoestabilidad mejorada" en referencia a un polipéptido mutante, como se usa en el presente documento, significa que el polipéptido mutante tiene una actividad residual de pectato liasa más alta que la proteína natural correspondiente, después de la incubación durante 10 minutos en Tris-HCl 50 mM a pH 8,0 a una temperatura adecuada.
El término "temperatura adecuada", como se usa en este contexto, se refiere a una temperatura a la que la proteína natural pierde parte de su actividad de pectato liasa después de 10 minutos de incubación en Tris-HCl 50 mM a pH 8,0. En otras palabras, el término "temperatura adecuada" se refiere a una temperatura elegida de un intervalo de temperatura entre las temperaturas X e Y, en donde X es la temperatura más baja a la que un polipéptido no mutante muestra una pérdida detectable de actividad después de 10 minutos de incubación en Tris-HCl 50 mM a pH 8,0 y en donde la temperatura Y es la temperatura más baja a la que un polipéptido no mutante pierde toda la actividad después de 10 minutos de incubación en Tris-HCl 50 mM a pH 8,0.
En un ejemplo más concreto, el término "termoestabilidad mejorada" se ejemplifica en que el polipéptido de variante A231L según SEQ ID NO: 4 presentó más actividad de pectato liasa después de la preincubación a temperaturas elevadas que el polipéptido no mutante (SEQ ID NO: 1). Lo mismo se encontró para el polipéptido homólogo según SEQ ID NO: 5 en comparación con el mismo polipéptido sin la variante A231L (SEQ ID NO: 2). Por tanto, el polipéptido de variante A231L según SEQ ID NO: 6 era más termostable que su homólogo no variante según SEQ ID NO: 3.
Con más detalle, los presentes inventores midieron la actividad relativa residual de pectato liasa después del tratamiento térmico de los polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 y compararon esta actividad con la de un polipéptido pretratado con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1,2 y 3, respectivamente. Más específicamente, los polipéptidos se calentaron hasta 70, 75 o 80 grados Celsius durante 10 minutos en Tris-HCl 50 mM a pH 8,0. La actividad residual se midió a 60 grados Celsius a pH 8,0 como se describe en el Ejemplo 5 y se comparó con la actividad residual de los mismos polipéptidos después de la preincubación a temperatura ambiente durante 10 minutos. Los resultados se muestran en la Tabla 1.
Tabla 1: Actividad relativa de la pectato liasa después de la preincubación a temperaturas elevadas.
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Los presentes inventores observaron que la actividad de pectato liasa del polipéptido no mutado según SEQ ID NO: 1 disminuyó al 60 % después de la preincubación a 70 grados Celsius durante 10 minutos. Lo mismo se encontró para los polipéptidos homólogos con una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 2 y 3 (70 y 50 %, respectivamente) A diferencia, no se afectó la actividad de las variantes A231L según SEQ ID NO: 4, SeQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, o fue incluso más que para los mismos polipéptidos preincubados a temperatura ambiente.
Los presentes inventores también observaron que, a diferencia de la secuencia no mutada (SEQ ID NO: 1) y sus homólogos según SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3, los polipéptidos de variante A231L (SEQ ID NOs: 4 - 6) mostraron todos actividad considerable de pectato liasa después de la preincubación a 75 °C, mientras que la enzima no mutante según SEQ ID NO: 1 y sus homólogos según SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3 no mostraron actividad significativa en estas condiciones (5 % o menos).
La enzima no mutante según SEQ ID NO: 1, ni sus homólogos según SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3, ni las variantes sobrevivieron al pretratamiento a 80 grados Celsius durante 10 minutos. Esto se representa gráficamente en la Figura 2.
Se ha descrito que las pectato liasas termoestables se producen por bacterias del género Bacillus [Takao et al, Biosci. Biotechnol. Biochem. (2000) 64: 2360-2367, Takao et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. (2001) 65: 322-329, Swarupa Rani Chiliveri et al., Carbohydrate Polymers (2014), 111: 264-272, Zhou et al., Appl Environ Microbiol (2015) 81: 5714­ 5723], por tanto, la descripción proporciona un polipéptido como se describe en el presente documento en donde el polipéptido es capaz de ser expresado en una especie de Bacillus, más preferentemente Bacillus subtilis.
Los presentes inventores han mostrado que se pueden producir varios polipéptidos que son homólogos a la secuencia no mutante según SEQ ID NO: 1 y todavía retener su actividad de pectato liasa. Una búsqueda de BLAST reveló que las pectato liasas están disponibles de origen bacteriano, en particular de especies de Bacillus, con una identidad de tan solo 52 % o menos en comparación con SEQ ID NO: 1. Por tanto, el experto no tendrá dificultad en construir un polipéptido con actividad de pectato liasa que sea al menos 70 % idéntico a la secuencia de SEQ ID NO: 1 siguiendo los procedimientos y la orientación proporcionada en el presente documento. También será capaz de preparar las variantes A231L como se describe en el presente documento, obteniendo así una pectato liasa independiente del calcio con una termoestabilidad mejorada.
En el presente documento se describe un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 75 % idéntica al aminoácido según SEQ ID NO: 1, tal como 80 %, 85 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o incluso 100 %.
La recuperación de un polipéptido como se produjo por una célula hospedadora como se describe en el presente documento se puede realizar por cualquier técnica conocida para los expertos en la técnica. Las posibles técnicas incluyen, pero no se limitan a, secreción de la proteína en el medio de expresión y purificación de la proteína de biomasa celular. El método de producción puede comprender además una etapa de purificar el polipéptido obtenido. Para polipéptidos termoestables, los ejemplos no limitantes de dichos métodos incluyen calentar las células disgregadas y retirar las proteínas termolábiles coaguladas de la disolución. Para proteínas secretadas, los ejemplos no limitantes de dichos métodos incluyen cromatografía de intercambio iónico y ultrafiltración del medio de expresión. Se prefiere que el método de purificación de elección sea tal que la proteína purificada retenga su actividad.
Por consiguiente, la descripción proporciona además un polipéptido en donde el polipéptido es un polipéptido aislado.
Los presentes inventores han mostrado en el presente documento que las variantes A231L como se describen son independientes del calcio y tienen una termoestabilidad mejorada.
Los polipéptidos como se describe en el presente documento se pueden usar en composiciones que contienen varios componentes adicionales, tales como estabilizadores, cargas, residuo celular, medio de cultivo, etcétera. Por tanto, la divulgación proporciona una composición que comprende un polipéptido como se describe en el presente documento.
Los polipéptidos como se describe en el presente documento se pueden obtener expresando un ADN recombinante en un sistema de expresión heterólogo. El término "sistema de expresión heterólogo" o equivalente significa un sistema para expresar una secuencia de ADN de un organismo hospedador en un organismo receptor de una especie diferente o género del organismo hospedador. Los receptores más predominantes, conocidos como sistemas de expresión heterólogos, se eligen normalmente debido a que es fácil transferir ADN dentro de ellos o debido a que permiten una evaluación más simple de la función de las proteínas. Los sistemas de expresión heterólogos también se usan preferentemente debido a que permiten el aumento de escala de la producción de una proteína codificada por la secuencia de ADN en un proceso industrial. Los organismos receptores preferidos para su uso como sistemas de expresión heterólogos incluyen organismos bacterianos, fúngicos y de levadura, tales como, por ejemplo, Escherichia coli, Bacillus, Corynebacterium, Pseudomonas, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, hongos filamentosos y muchos más sistemas bien conocidos en la técnica.
Los polipéptidos o proteínas presentemente desvelados se pueden fusionar con secuencias adicionales, por unión o inserción, que incluyen, pero no se limitan a, marcas de afinidad, que facilitan la purificación de proteínas (marca S, dominio de unión a maltosa, dominio de unión a quitina), dominios o secuencias que ayudan en el plegamiento (tales como dominio de tiorredoxina, proteína SUMO), secuencias que afectan la localización de proteínas (señales de localización periplásmica, etc.), proteínas que llevan función adicional, tales como proteína verde fluorescente (GFP), o secuencias que representan otra actividad enzimática. Los expertos en la técnica conocen otros componentes de fusión adecuados para los polipéptidos presentemente desvelados.
La presente descripción proporciona polinucleótidos que codifican cualquiera de las variantes de pectato liasa desveladas en el presente documento. Se conocen bien en la técnica los medios y métodos para la clonación y el aislamiento de dichos polinucleótidos.
Además, la presente divulgación se refiere a un vector que comprende un polinucleótido como se describe en el presente documento, opcionalmente operativamente unido a una o más secuencias de control. Las secuencias de control adecuadas están fácilmente disponibles en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, secuencias promotoras, conductoras, de poliadenilación y señal.
Las variantes de pectato liasa como se describen en el presente documento se pueden obtener por métodos recombinantes convencionales conocidos en la técnica. Brevemente, dicho método puede comprender las etapas de: cultivar una célula hospedadora recombinante como se ha descrito anteriormente en condiciones adecuadas para la producción del polipéptido, y recuperar el polipéptido obtenido. Opcionalmente, el polipéptido se puede purificar adicionalmente.
Se puede usar un gran número de sistemas vector-hospedador conocidos en la técnica para la producción recombinante de las pectato liasas que se describen en el presente documento. Los posibles vectores incluyen, pero no se limitan a, plásmidos o virus modificados que se mantienen en la célula hospedadora como molécula de ADN autónoma o integrada en ADN genómico. El sistema de vector debe ser compatible con la célula hospedadora usada como se conoce bien en la técnica. Los ejemplos no limitantes de células hospedadoras adecuadas incluyen bacterias (por ejemplo, E. coli, bacilos), levadura (por ejemplo, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae), hongos (por ejemplo, hongos filamentosos), células de insecto (por ejemplo, Sf9).
En aún otros términos, la descripción proporciona un método de mejora de la termoestabilidad de un polipéptido con actividad de pectato liasa que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 70 % idéntica al aminoácido según SEQ ID NO: 1, comprendiendo el método la etapa de cambiar el aminoácido en una posición correspondiente a la posición 231 en SEQ ID NO: 1 a un resto de leucina.
La descripción proporciona además un método de disminución, supresión o retirada de la dependencia del calcio de un polipéptido con actividad de pectato liasa que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 70 % idéntica al aminoácido según SEQ ID NO: 1, comprendiendo el método la etapa de cambiar el aminoácido en una posición correspondiente a la posición 231 en SEQ ID NO: 1 a un resto de leucina.
Los polipéptidos con actividad de pectato liasa como se describen en el presente documento se pueden usar en una amplia variedad de procesos y aplicaciones industrial diferentes, tales como recuperación de celulosa de biomasa lignocelulósica, disminución de la energía requerida para el refinado de la madera y la producción de un azúcar a partir de un material lignocelulósico. También se puede usar en la preparación de pulpa de madera, en la deslignificación de pulpa, el blanqueo de colorantes textiles, la desintoxicación de aguas residuales, la desintoxicación xenobiótica, la degradación o disminución de la integridad estructural del material lignocelulósico y la fabricación de detergentes.
Ejemplos
Ejemplo 1: Preparación de un polipéptido según SEQ ID NO: 1.
Se optimizó la construcción de ADN desvelada en Takao et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. (2001) 65: 322-329 que codifica el polipéptido según SEQ ID NO: 1 para la expresión en E. co liy se sintetizó comercialmente y se clonó en un vector plasmídico convencional pET28a+ bajo el control del promotor de la ARN-polimerasa T7 para la expresión en Escherichia coli BL21 (DE3). La secuencia de nucleótidos de la construcción se proporciona en el presente documento como SEQ ID NO: 7
Ejemplo 2: Preparación de variantes de un polipéptido según SEQ ID NO: 1 con actividad de pectato liasa.
Se generaron secuencias de proteínas homólogas (según SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3) por mutagénesis al azar de SEQ ID NOs: 7 y SEQ ID NO: 8 usando PCR propensa a error esencialmente como se describe (Curr Protoc Mol Biol. mayo de 2001; Capítulo 8: Unidad 8.3. doi: 10.1002/0471142727.mb0803s51, Random mutagenesis by PCR. Wilson DS1, Keefe AD) usando un kit de mutagénesis por PCR al azar comercial (kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange® II XL por Agilent Technologies). Más en particular, la secuencia de ADN de SEQ ID NO: 8 se obtuvo de SEQ ID NO: 7 que codifica el polipéptido según SEQ iD NO: 1. La secuencia de ADN de SEQ ID NO: 9 se obtuvo por mutagénesis al azar de SEQ ID NO: 8 que codifica el polipéptido según SEQ ID NO: 2. SEQ ID NO: 9 es la secuencia de ADN que codifica el polipéptido según SEQ ID NO: 3.
Se clonaron fragmentos de PCR resultantes de PCR propensa a error con el vector plasmídico pET28a+ bajo el control del promotor de la ARN-polimerasa T7 para la expresión en Escherichia coli BL21 (DE3), y se cribaron para la actividad de pectato liasa de las proteínas recombinantes.
Se sometieron clones activos a rondas de aleatorización adicionales usando el mismo protocolo. El polipéptido según SEQ ID NO: 2 presentó actividad de pectato liasa y se encontró que era 93 % idéntico a SEQ ID NO: 1. El polipéptido según SEQ ID NO: 3 también presentó actividad de pectato liasa y se encontró que era 89 % idéntico a SEQ ID NO: 1.
Ejemplo 3: Preparación de polipéptidos de variante A231L según SEQ ID NO: 4 - 6.
Para preparar un polipéptido según SEQ ID NO: 4, se introdujo una mutación en el polipéptido según SEQ ID NO: 1 en la posición 231. Se sustituyó el resto de alanina de esa posición en SEQ ID NO: 1 por un resto de leucina. Este cambio se denomina en el presente documento A231L.
Esto se logró por mutagénesis dirigida al sitio convencional esencialmente como se describe en el documento de patente WO 2013/038062. Con más detalle: Para introducir la mutación A231L en el gen que codifica SEQ ID NO: 1, los presentes inventores llevaron a cabo dos reacciones de PCR separadas:
(1) con cebadores Cebador 1 gaaattaatacgactcactatagg (SEQ ID NO: 13) y Cebador 2(A231L) GCCATCATGCTGCTGAAACGGACGACCAAAATAGGTG (SEQ ID NO: 14),
(2) con Cebador 3(A231L) GGTCGTCCGTTTCAGCAGCATGATGGCctgCTGGATATC (SEQ ID NO: 15) y Cebador 4 ggttatgctagttattgctcagcggtg (SEQ ID NO: 16).
En ambas reacciones, se usó como molde el gen recombinante sin la mutación. Los cebadores 1 y 4 se unen dentro de la secuencia del vector y no son específicos del gen recombinante. Los cebadores 2 y 3 se unen dentro del gen recombinante y superponen sus sitios de unión. El sitio de unión del cebador 3 contiene el sitio de mutación. El cebador 3 representa la secuencia mutada (deseada), que no se corresponde al 100 % con el molde (la letra minúscula en la primera secuencia indica los nucleótidos erróneamente apareados). Sin embargo, el cebador tiene afinidad y especificidad suficientes por el sitio de unión para producir el producto de PCR deseado. Se combinaron los productos de PCR purificados de las reacciones (1) y (2) y se usaron como molde para la reacción de PCR con el cebador 1 y el cebador 4. El producto de esta reacción, que contiene la secuencia de variante del gen que codifica el polipéptido según SEQ ID NO: 4, se clonó en un vector plasmídico para la expresión en E. coli.
Se usaron el mismo protocolo y los mismos cebadores para introducir la mutación A231L en los genes que codifican el polipéptido según SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3, dando así polipéptidos según SEQ ID NO: 5 y s Eq ID NO: 6, respectivamente.
Ejemplo 4: Expresión heteróloga de polipéptidos con actividad de pectato liasa.
Para la expresión recombinante en E. coli, se clonaron genes recombinantes en el vector de expresión pET-28 comercial bajo el control del promotor de bacteriófago T7.
Se llevó a cabo la producción de proteínas en la cepa de E. coli BL21(DE3) según el protocolo de plásmidos del fabricante disponible en http://richsingiser.com/4402/Novagen%20pET%20system%20manual.pdf. La temperatura de incubación para la producción de proteínas fue 30 °C, que se encontró óptima para el rendimiento máximo de la proteína activa. Las células se lisaron usando tampón de lisis (T ris-HCl 50 mM a pH 7,4, 1 % de T riton X100, CaCI 0,5 mM) y se calentaron a 60 °C durante 20 minutos. Se retiró el residuo celular coagulado por centrifugación. Se detectaron las pectato liasas recombinantes termoestables en la fracción soluble solo, de acuerdo con la noción de que eran enzimas termoestables.
Ejemplo 5: Ensayo de actividad de pectato liasa
Se llevó a cabo el ensayo de actividad de pectato liasa esencialmente como se describe en Takao M, Nakaniwa T, Yoshikawa K, Terashita T, Sakai T., "Purification and characterization of thermostable pectate lyase with protopectinase activity from thermophilic Bacillus sp. TS 47". Biosci Biotechnol Biochem. 2000 64:2360-7. Con más detalle, se ensayó la actividad de pectato liasa midiendo el aumento en la absorbancia a 235 nm de la mezcla de reacción. Se usó sal de sodio de ácido poligalacturónico (PGA) de la pectina cítrica desmetilada (comprada de MegaZyme) como sustrato. Se incubó una mezcla de reacción que contenía 1 mL de 0,1 % de PGA en tampón T ris-HCl 10 mM, pH 8,0 y CaCl20,5 mM, y una cantidad apropiada de disolución de enzima durante 30 minutos a 60 °C. La reacción se detuvo disponiendo la mezcla a 100 °C (baño de agua hirviendo) durante 5 min. Se calculó la actividad relativa de la pectato liasa a partir de la diferencia en la absorción de la mezcla de reacción a 235 nm al principio y al final de la reacción.
Ejemplo 6: Termoestabilidad de polipéptidos con actividad de pectato liasa.
Se determinó la termoestabilidad de los polipéptidos con actividad de pectato liasa por preincubación durante 10 minutos en Tris-HCl 50 mM a pH 8,0, ya fuera a temperatura ambiente (control) o a 70 °C, 75 °C y 80 °C antes de medir su actividad según el Ejemplo 5.
Después de la preincubación, las muestras se llevaron hasta 60 °C, se añadió sustrato (PGA) y las muestras se ensayaron para actividad como se describe en el Ejemplo 5 a 60 °C a pH 8,0. Se calcularon las actividades residuales para cada muestra como el % de la actividad de la muestra preincubada a temperatura ambiente (muestra de control).
Ejemplo 7: Dependencia del calcio de polipéptidos con actividad de pectato liasa.
Se determinó la dependencia del calcio de los polipéptidos con actividad de pectato liasa según el método descrito en el Ejemplo 5, excepto que se omitió el calcio de la mezcla de reacción, es decir, con y sin CaCl20,5 mM.
Ejemplo 8: Secuencias proporcionadas en el presente documento
Se proporcionan con el presente documento la secuencia de aminoácidos y las secuencias de nucleótidos en la norma WIPO ST_25. Por comodidad, las secuencias también se proporcionan en la Tabla 2.
SEQ ID NO: 1 deriva del estado de la técnica y se ha desvelado en Takao et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. (2000) 64: 2360-2367 y en Takao et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. (2001) 65: 322-329.
SEQ ID NO: 2 se obtuvo por mutagénesis al azar del ADN que codifica SEQ ID NO: 1 (mostrada en el presente documento como SEQ ID NO: 7) como se describe en Ejemplo 2, SEQ ID NO: 3 se obtuvo por mutagénesis al azar del ADN que codifica SEQ ID NO: 2 (mostrada en el presente documento como SEQ ID NO: 8). El ADN que codifica el polipéptido según SEQ ID NO: 3 se muestra en el presente documento como SEQ ID NO: 9. Los aminoácidos que se desvían de la secuencia no mutada de SEQ ID NO: 1 se muestran en letras mayúsculas.
El polipéptido con una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 2 es un homólogo del polipéptido según SEQ ID NO: 1. Estos dos polipéptidos tienen 385 de los 416 aminoácidos en común, en otras palabras, son 93 % idénticos.
El polipéptido según SEQ ID NO: 3 también es un homólogo del polipéptido según SEQ ID NO: 1. Estos dos polipéptidos tienen 369 de los 416 aminoácidos en común, en otras palabras son 89 % idénticos.
Los polipéptidos según SEQ ID NOs: 4, 5 y 6 se pueden obtener de los polipéptidos según SEQ ID NOs: 1, 2 y 3, respectivamente, cambiando el aminoácido correspondiente al aminoácido en la posición 231 en SEQ ID NO: 1 a un resto de leucina. El aminoácido correspondiente a la posición 231 en SEQ ID NO: 1 se indica en letra negrita y subrayada en la Tabla 2.
Las secuencias de nucleótidos según SEQ ID NOs: 10, 11 y 12 codifican los polipéptidos con la variante A231L según SEQ ID NOs: 4, 5 y 6, respectivamente.
Las secuencias de nucleótidos según SEQ ID NOs: 13 - 16 corresponden a los cebadores usados para producir las variantes A231L de los polipéptidos con una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 1 - 3, como se detalló en el Ejemplo 3.
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Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Un polipéptido con actividad de pectato liasa que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 70 % idéntica a la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 1, en donde el polipéptido comprende un resto de leucina en una posición de aminoácido correspondiente a la posición 231 en SEQ ID NO: 1 y en donde la actividad de pectato liasa es independiente del calcio y/o en donde el polipéptido tiene una termoestabilidad mejorada, en comparación con un polipéptido con una secuencia de aminoácidos por lo demás idéntica, en donde el resto en una posición de aminoácido correspondiente a la posición 231 en SEQ ID NO: 1 no es un resto de leucina.
2. Polipéptido según la reivindicación 1 que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 75 % idéntica a la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 1, tal como 80 %, 85 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o incluso 100 %.
3. Polipéptido según la reivindicación 1 o 2, en donde el polipéptido es un polipéptido aislado.
4. Ácido nucleico que codifica un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3.
5. Vector que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 4.
6. Composición que comprende un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3 o un ácido nucleico o un vector según la reivindicación 4 o 5.
7. Célula hospedadora recombinante que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 4 o un vector según la reivindicación 5.
8. Célula hospedadora recombinante según la reivindicación 7 seleccionada del grupo que consiste en Escherichia coli, Bacillus, Corynebacterium, Pseudomonas, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, hongos filamentosos, levadura y células de insecto.
9. Método de producción de un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3, que comprende las etapas de:
a. cultivar una célula hospedadora recombinante según la reivindicación 7 u 8 en condiciones adecuadas para la producción del polipéptido, y
b. recuperar el polipéptido obtenido, y
c. opcionalmente purificar dicho polipéptido.
10. Uso de un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3 en una aplicación seleccionada del grupo que consiste en deslignificación de pulpa, degradación o disminución de la integridad estructural de material lignocelulósico, blanqueo de colorantes textiles, desintoxicación de aguas residuales, desintoxicación xenobiótica, producción de un azúcar a partir de un material lignocelulósico y recuperación de celulosa de una biomasa.
11. Método de mejora de la termoestabilidad de un polipéptido con actividad de pectato liasa que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 70 % idéntica a la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 1, comprendiendo el método la etapa de cambiar el aminoácido en una posición correspondiente a la posición 231 en SEQ ID NO: 1 a un resto de leucina.
12. Método de disminución, supresión o retirada de la dependencia del calcio de un polipéptido con actividad de pectato liasa que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 70 % idéntica a la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 1, comprendiendo el método la etapa de cambiar el aminoácido en una posición correspondiente a la posición 231 en SEQ ID NO: 1 a un resto de leucina.
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