KR101203528B1 - 내열성 아릴설파타제 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 내열성 아릴설파타제(arylsulfatase) 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 자세하게는 고온균 중 하나인 피로코커스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus)로부터 분리된 아릴설파타제, 이를 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 플라스미드, 상기 플라스미드로 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체를 배양하여 배양물로부터 아릴설파타제를 분리하는 것을 특징으로 하는 아릴설파타제의 생산방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 아릴설파타제를 포함하는 융합 단백질, 상기 아릴설파타제 또는 상기 융합 단백질을 아가에 처리하여 아가를 탈황시키는 방법에 관한 것이다.

피로코커스 푸리오수스, 아릴설파타제, 아가, 아가로스

Description

내열성 아릴설파타제 및 이의 용도{Thermostable arylsulfatase and usage thereof}

본 발명은 내열성 아릴설파타제(arylsulfatase) 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 자세하게는 피로코커스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus)로부터 분리된 아릴설파타제, 이를 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 플라스미드, 상기 플라스미드로 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체를 배양하여 배양물로부터 아릴설파타제를 분리하는 것을 특징으로 하는 아릴설파타제의 생산방법, 상기 아릴설파타제를 포함하는 융합 단백질, 상기 아릴설파타제 또는 상기 융합 단백질을 아가에 처리하여 아가를 탈황시키는 방법에 관한 것이다.

우리나라의 한천(또는 아가) 생산량은 연간 600여 톤으로 전 세계 생산량의 12%를 차지하며, 이 중 60-70%는 외국으로 수출되고 나머지는 식품 가공용으로 국내에서 소비된다. 수출되는 한천의 전량이 단순가공 처리된 제품이고, 아가로스(agarose) 제조 기술의 미비로 고품질의 의약용 및 연구용 아가로스는 전량 수입에 의존하고 있다. 특히, 국내산 한천의 품질 우수성으로 아가로스의 주요 제조회 사인 미국의 FMC사, Invitrogen사 등이 국내산 한천을 수입하여 전기영동용 아가로스 및 의약용의 고가품을 제조하고 있다.

한천은 홍조류에 함유되어 있는 점질성의 다당류이며, 갈락토스(galactose) 중합체로 구성된 아가로스(약 70%)와 이들에 황산기가 부착된 상태의 아가로펙틴(agaropectin)(약 30%)으로 구성되어 있다. 아가로스는 이당류인 아가로비오스(agarobiose)가 연속적으로 결합된 형태이나, 아가로펙틴은 아가로스에 황산기, 피루브산(pyruvic acid) 및 우론산(uronic acid) 잔기를 함유하고 있다. 한천에 결합되어 있는 산성기는 실질적으로 음전하를 띄고 있으므로 전기장 하에서 물질의 이동에 영향을 줄 뿐만 아니라 겔 강도를 약화시킨다. 따라서, 전기영동용으로 사용되는 한천의 제조법은 여러 단계의 유기용매 분획을 통하여 한천중의 아가로펙틴을 제거함으로써 아가로스의 순도를 높여 의학과 생명공학 분야에 사용되고 있다.

아가로스 제조사들이 사용하고 있는 제조 방법들은 pyridine-무수초산법(Guiseley， K.B. 1970. Carbohydr Res 13: 247-256), dimethylsulfoxide 분리법(Araki， C. 1937. Chern. Soc. Japan 58: 1338-1350)， cetylpyridinium chloride 및 cetyltrimethyl ammonium 추출법(Fleminger， G. et al. 1990. J Chromatogr 510:271-279), polyethylene glycol 추출법(Izumi， K. 1970. Agr Bioi Chern 34: 1739-1740), sodium iodide 분리법(Duckworth， M. et al. 1971. Carbohyd Res 16: 189-197), NaI-acrinol 분리법(Guiseley， K.B. et al. 1993. Hydrobioiogia 260/261: 505-511), ethanol 침전법(Kertesz， M.A. 1999. FEMS Microbiol Rev 24: 135- 175) 및 양이온 계면활성제 분리법(Duckworth， M. et al. 1971. Carbohyd Res 16: 189-197) 등이 있고, 이중에서 2-3 가지의 정제 방법을 병용하여 아가로스를 정제하고 있다.

현재 전기영동용 또는 의약용 아가로스 생산의 주된 기술은 유기 용매 또는 양이온 계면활성제를 사용하여 아가로스를 선택적으로 분리 정제하거나, 아가로펙틴을 선택적으로 제거하기 위하여 여러 종류의 유기용매와 계면활성제를 사용하는 복잡한 공정이 수반됨으로써 제조시 과도한 유기용매의 사용으로 인한 제조공정 비용이 높다. 그리고 계면활성제 사용으로 인한 폐수처리 비용이 과다하므로 제품의 공정비용이 과중하다. 또한 유기용매를 회수하기 위한 증류장치의 설비, 작업환경의 악화, 공정에 대한 여러 가지 위험 요소들을 내포하며, 공정상의 복잡성으로 인해 최종 제품의 수율이 낮고, 산업폐기물이 다량 발생하므로 고수율의 환경 친화적인 아가로스 생산공정이 필요하다.

따라서 아가로펙틴에서 황산기를 제거할 수 있는 효소인 아릴설파타제(arylsulfatase)를 생물학적 공정에 도입하여 한천으로부터 고순도 아가로스를 직접 생산하는 생물생산공정을 적용할 경우 유기용매와 계면활성제의 사용을 감소시킴으로써 공정비용을 절약할 수 있다.

아릴설파타제는 페놀류의 아릴 설페이트 에스테르 결합을 가수분해하여 페놀기와 무기 황을 생산하는 효소이고, 무기 황에 의해 저해되지 않는 I형과 저해를 받는 II형이 있다. 아릴설파타제는 미생물에서 포유동물에 이르기까지 다양하게 분포하지만, 그들의 1차 구조는 유사성이 높은 것으로 알려져 있다. 지금까지 미생물 유래의 아릴설파타제에 관한 연구는 Klebsiella pneumoniae(Miech，C. et al. 1998. J. Biol. Chemis. 273: 4835-4837), Salmonella typhimurium(Henderson，M. J. et al. 1979. J. Bacteriol. 139: 80-87), Pseudomonas aeruginosa(Beil S. et al. (1995) Eur ] Biochem 229: 385-394), Escherichia coli(Jansen，H.J et al. 1999. J. Med. Microbial. 48: 551-557), 및 Alteromonαs oarrageenovora(Akagawa-Matsushita， M. et al. 1992. Int J Syst Bacteriol 42: 621-627)와 같은 중온성 미생물이 생산하는 효소에 국한된 실정이다. 그러나 아릴설파타제를 아가로스 생산공정에 이용하기 위해서는 한천의 용해도 증가를 위해서 내열성 효소의 사용이 반드시 필요하다.

일반적으로 고온균(thermophile)이 생산하는 효소는 보통 중온균 (mesophile)이 생산하는 효소와 동일한 기능을 갖고 있으면서 중온균 효소들이 변성을 일으키는 고온의 극한반응 조건에서 안정하게 효소반응을 수행하기 때문에 학문적으로나 산업적으로 모두 관심의 대상이 되고 있다. 특히, 이러한 관심은 주로 70℃ 이상의 극한환경에서 생육적온을 갖는 고온균 (extreme thermophile)과 초고온균(hyperthermophile)이 생산하는 효소들에 초점을 맞추고 있다. 중온성 미생물의 효소들은 고온에서 불가역적으로 활성을 잃어버리지만, 고온성 미생물로부터 분리된 효소들은 고온에 상당히 안정할 뿐만 아니라, 계면활성제, 유기용매 등의 일반적인 단백질 변성제의 존재 하에서도 상당히 안정된 활성을 보인다. 또한 소량의 효소로서 장기간 사용이 가능하며, 고온에서 반응시키므로 기질의 용해도가 낮은 물질의 용해도 증가, 물질 확산속도의 증가, 반응속도의 증가, 반응시간의 단축, 중온성 미생물에 대한 오염방지 등의 수많은 장점을 갖고 있다. 따라서 이러 한 고온성 미생물 효소들은 기존의 중온성 효소를 이용한 산업적인 단점을 극복할 수 있다.

이에, 본 발명자는 한천 제조공정에 유리한 내열성이 강한 효소 생산을 위해 70～105℃에서 생장하는 피로코커스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus) 유래의 게놈 서열(genome sequence) 정보로부터 아릴설파타제(arylsulfatase, ast)라고 추정되는 유전자를 클로닝(cloning)하여 대장균에 형질전환시켜 재조합 균주를 얻고, 이 균주를 이용하여 재조합 효소를 대량으로 생산하고, 이 재조합 효소를 이용하여 고순도 한천을 생산하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명의 한 목적은 서열번호: 2에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 피로코커스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus)로부터 분리된 아릴설파타제를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 아릴설파타제를 암호화하는 핵산 분자를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산 분자를 포함한 재조합 플라스미드를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 플라스미드로 형질전환된 형질전환체를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체를 배양하여 배양물로부터 아릴설파타제를 분리하는 것을 특징으로 하는 아릴설파타제의 생산방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 아릴설파타제를 포함하는 융합 단백질을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 아가 용액에 상기 아랄설파타제 또는 융합 단백질을 처리하여 아가를 탈황시키는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명자는 70～105℃에서 생장하는 피로코커스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus) 유래의 게놈 서열(genome sequence) 정보로부터 아릴설파타제(arylsulfatase, ast)라고 추정되는 유전자를 클로닝(cloning)하여 그 유전자의 염기서열(서열번호: 1)과 아미노산 서열(서열번호: 2)을 분석하였다.

따라서, 본 발명은 피로코커스 푸리오수스 유래의 아릴설파타제를 제공한다. 본 발명에 따른 효소의 범위는 서열번호: 2에 나타낸 아미노산 서열로 구성되는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 의미한다. '기능적 동등물'이란, 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과 상기 서열번호: 2에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호: 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. '실질적으로 동질의 생리활성'이란 아릴설파타제 효소 활성을 가지고 있음을 의미한다. 본 발명에 따른 단백질은 자연(예, 피로코커스 푸리오수스)으로부터 추출하거나 또는 본 발명의 단백질을 암호화하는 재조합 핵산의 발현에 의해 또는 화학적 합성에 의해 수득될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 아릴설파타제를 암호화하는 핵산분자를 제공한다. 바람직하게는 상기 핵산분자는 서열번호: 1에 나타낸 염기서열로 이루어진다.

본 발명에 따른 아릴설파타제를 암호화하는 핵산분자는 적합한 발현 플라스미드 내로 삽입되어 숙주세포를 형질전환할 수 있다. 본 발명의 유전자 서열은 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 플라스미드 내에 포함될 수 있다. '작동 가능하게 연결된다는(operably linked)' 것은 유전자 서열과 조절 서열이 유전자의 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 것을 의미한다. '발현 조절 서열(expression control sequence)'이란 유전자의 발현에 필수적이거나 이로운 핵산 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 프로모터, 업스트림(upstream) 활성화 서열 또는 인핸서(enhancer), 폴리아데닐화 서열 및 전사 종결인자 등을 예시할 수 있다. 당업자라면 본 발명에 따른 유전자의 서열을 도입시키는데 적합한 플라스미드를 선택할 수 있으며, 본 발명에서는 아릴설파타제 유전자 서열을 숙주세포 내로 도입시키는데 적합한 벡터라면 어떠한 벡터라도 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 pTYB2 벡터에 본 발명에서 분리한 아릴설파타제의 유전자를 클로닝하여 재조합 플라스미드 pTAST1을 제조하였다(도 1 참조).

본 발명에 따른 재조합 플라스미드는 당분야에 공지된 방법을 이용하여 숙주 세포내로 도입될 수 있다. 형질전환 (또는 형질감염)은 Davis et al. Basic Methods in Molecular Biology, 1986과 같은 기본적인 실험 지침서에 기술된 방법에 따라 수행될 수 있다. 바람직한 예로는 온도 충격, 전기천공(electroporation), 형질도입(transduction), 칼슘 포스페이트 형질전환(calcium phosphate transfection), 양이온 지질-매개 형질전환(cationic lipid-mediated transfection) 등이 포함된다.

또한, 본 발명은 본 발명의 재조합 플라스미드로 형질전환된 숙주세포를 제공한다. 상기 '숙주세포'로는 대장균, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들, 스포도프테라 프루기페르다와 같은 곤충 세포, CHO 및 마우스 세포와 같은 동물세포, 조직 배양된 인간 세포 및 식물 세포 등이 예시될 수 있다.

본 발명에서는 한 양태로서, 대장균 발현계를 이용하여 아릴설파타제를 제조할 수 있다. 상기 플라스미드 벡터로는 pTYB2, pBAD, pET, pGEX, pMal, pPro, pQE, pRSET, pTrcHis 벡터 및 이들의 유도체 등이 이용될 수 있다. 또한, 상기 대장균 숙주세포로는 Top10, LMG194, BL21, BL21(DE3), TB1, DH10B, M15 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 플라스미드 벡터로는 pTYB2를, 대장균 숙주세포로는 BL21(DE3) codon plus를 각각 이용하였다(실시예 1 및 2).

숙주세포들은 적절한 배지와 아릴설파타제의 발현 및/또는 분리되는 것을 허용하는 조건하에서, 배양될 수 있다. 예를 들어서, 숙주 세포들은 적당한 배지와 단백질이 발현 및/또는 분리되는 것을 허용하는 조건 하에, 실시된 실험실 또는 산 업용 발효기에서 소규모 혹은 대규모 발효, 셰이크 플라스크 배양에 의해 배양될 수 있다. 배양은 공지된 기술을 사용해서 탄소, 질소 공급원 및 무기염을 포함하는 적합한 영양배지에서 진행한다. 적합한 배지는 상업적으로 입수 가능하고, 예를 들면 American Type Culture Collection 카탈로그 등에 기재된 성분 및 이들의 조성비에 따라 제조할 수도 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 아릴설파타제의 과발현을 위해 pTAST1으로 형질전환된 E. coli BL21 (DE3) codon plus를 배양하였다. 보다 구체적으로, 대장균을 2xYTA 배지에서 30℃로 16시간 전배양 후 전배양액의 1%를 새로운 2xYTA 배지에 접종한 후, 흡광도(A₆₀₀)가 0.6이 되었을 때 IPTG를 첨가한 후 25℃로 온도를 내려 16시간 동안 유도배양하였다(실시예 2).

배양물로부터 본 발명의 아릴설파타제는 당업계에 공지된 방법에 의해 분리될 수 있다. 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니지만, 원심분리, 여과, 추출, 분무 건조, 증발 또는 침전을 포함하는 방법에 의해 배양물로부터 분리될 수 있다. 또한, 아릴설파타제는 크로마토그래피(예, 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기별 배제) 또는 전기영동(예, SDS-PAGE)을 포함하여 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해서 추가로 정제될 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에서는 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 아릴설파타제를 정제하였다. 배양된 균체는 원심분리를 통하여 집균하고 buffer A (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2 mM CaCl₂)에 녹인 다음 초음파로 파쇄하였다. 초음파 파쇄액은 원심분리 후 상등액을 60℃에서 20분간 열처리하고 원심분리 후 상등액을 회수하였다. 상등액은 AEKTAprime (GE Healthcare)을 이용하여 buffer A로 평형화시킨 Hitrap Q column (GE Healthcare)에 로딩하고 0~1.0 M의 NaCl로 농도구배를 주어 결합된 단백질을 용출하였다(실시예 2).

본 발명은 서열번호: 2에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 아릴설파타제를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다. Intein-CBD(chitin binding domain)와 융합된 것이 특히 바람직하다.

본 발명은 본 발명의 아릴설파타제 또는 이를 포함하는 융합 단백질을 아가 용액(또는 한천 용액)에 처리하여 아가를 탈황시키는 방법에 관한 것이다. 여기서, 아가를 탈황시키는 방법은 아가로스를 제조하는 방법과 상호 교환적으로 이용 가능하다.

본 발명의 아릴설파타제는 pH 9.0 내지 10.0, 바람직하게는 9.5에서 안정된 활성을 유지한다(도 4). 또한, 본 발명의 아릴설파타제는 37 내지 50℃의 온도에서, 바람직하게는 45℃에서 높은 활성을 유지한다(도 5). 또한, Ca²⁺의 존재 하에서 아릴설파타제의 내열성이 증가한다.

본 발명의 아릴설파타제 또는 융합 단백질은 아가 용액에 0.5 내지 5 Unit/ml의 농도로 처리되는 것이 바람직하다. 보다 높은 농도로 처리할수록 탈황 효율이 증가한다.

본 발명의 아릴설파타제를 한천의 황 제거 공정에 도입하여 고순도 아가로스를 직접 생산하는 생물생산공정을 적용할 경우 유기용매와 계면활성제의 사용을 감소시키고, 공정비용을 절약할 수 있다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1: 재료 및 방법>

실시예 1-1. 유전자 클로닝 및 염기서열 분석

Pyrococcus furiosus 균주의 염색체는 GeneAll^R GENEx Genomic kit(GeneAll Biotechnology, Seoul, Korea)를 이용하여 추출하였다. Genome sequence 정보로부터 아릴설파타제(arylsulfatase)라고 추정되는 ORF (open reading frame) 부분을 증폭하기 위하여 프라이머 쌍[forward: 5′-GAGGTGGACATATGATTGAGGTAATCTTCCTG-3 ′(서열번호: 3), reverse 5′-ACGTACCTTAAATATGACATT-3′(서열번호: 4)]를 사용하여 polymerase chain reaction (PCR)을 수행하였다. PCR은 Taq DNA polymerase를 사용하여 약 1.0 kb의 DNA 단편을 증폭하고, 제한효소 Nde I으로 절단한 후 Nde I과 Sma I으로 절단한 pTYB2 벡터에 연결하여 pTAST1라고 명명하였다. 클로닝된 DNA 단편의 염기서열은 ABI Prism 3700 genetic analyzer (Perkin-Elmer Applied Biosystems, USA)를 사용하여 분석하였다.

실시예 1-2. 효소 생산 및 정제

pTAST1을 E. coli BL21 (DE3) codon plus (Novagen, Merck, Germany)에 형질전환한 후 2xYTA 배지(tryptone 16g/L, yeast extract 10g/L, NaCl 5g/L, ampicillin 100μg/ml)에서 30℃로 16시간 전배양하였다. 전배양액의 1%를 새로운 2xYTA 배지에 접종한 후, 흡광도(A₆₀₀)가 0.6이 되었을 때 0.5 mM IPTG를 첨가한 후 25℃로 온도를 내려 16시간 동안 유도배양하였다. 배양된 균체는 원심분리를 통하여 집균하고 buffer A (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2 mM CaCl₂)에 녹인 다음 초음파로 파쇄하였다. 초음파 파쇄액은 원심분리 후 상등액을 60℃에서 20분간 열처리하고 원심분리 후 상등액을 회수하였다. 상등액은 AEKTAprime (GE Healthcare)을 이용하여 buffer A로 평형화시킨 Hitrap Q column (GE Healthcare)에 로딩하고 0~1.0 M의 NaCl로 농도구배를 주어 결합된 단백질을 용출하였다. 용출된 획분은 아릴설파타제 활성을 측정하였고, 용출된 단백질의 밴드는 SDS-PAGE (10% acrylamide gel) 를 통하여 전개하고 coomassie 염색으로 확인하였다.

실시예 1-3. 효소활성 측정

아릴설파타제 효소 활성은 p-nitrophenyl sulfate를 기질로 사용하여 p-nitrophenol (pNP)이 방출되는 양을 흡광도 410 nm에서 측정하였다. 효소활성의 1unit은 1 분간 1 μmole의 pNP가 방출되는 양으로 정의하였다. 발현된 재조합 아릴설파타제의 SDS-PAGE 상에서 위치를 파악하기 위하여 Zymogram을 통해 실시하였다. SDS가 없는 10% gel를 사용하여 전기영동 후 아크릴아미드 겔을 5 mM 4-methyllumbelliferyl sulfate가 함유된 0.8% 아가로스 겔 위에 올려놓고 10 분간 37℃ 항온기에서 반응시키고 자외선 (312nm)하에서 밴드의 위치를 확인하였다.

실시예 1-4. 탈황 조건에 따른 DNA 전기영동

본 연구는 아가(agar)로부터 전기영동용 아가로스(agarose) 생산에 있어서 유기용매법 대신에 새롭고 편리하고 간단한 방법을 개발하는데 목적을 두었다. 50 mM glycine-NaOH buffer (pH 9.5)에 0.6% 아가를 첨가하여 아가용액을 만들었다. 0.6% 아가용액에 0.5~5 Unit/ml의 효소로 50℃에서 2 시간 shacking incubator로 반응하고 acetone으로 침전시킨 후 2~3배 양의 증류수에 세척한 후 동결 건조하여 분말상태로 만들었다. 시료중의 황 함량 측정은 효소와 반응시킨 아가의 동결 건조한 분말 0.5g을 3.5 N 염산 20 ml에 20시간 동안 가수분해하고 13.3% BaCl₂2H₂O와 2.67% Tween 80 solution을 사용하여 1 시간 정도 실온에 방치한 후 황을 침전하여 무게를 측정 또는 흡광도 450 nm에서 측정하였다.

<실시예 2: 결과>

실시예 2-1. 아릴설파타제 유전자의 클로닝 및 생산

Pyrococcus furiosus 균주로부터 arylsulfatase (Pfast)의 유전자를 클로닝 하기 위하여 게놈 염기서열에서 arylsulfatase를 암호화하는 것으로 추정되는 유전자(Genebank accession No.: PF1345)의 염기서열을 바탕으로 프라이머를 설계하고, PCR 기법을 이용하여 PF1345 유전자를 증폭하였다. PF1345 유전자를 Intein-CBD (chitin binding domain)(55 kDa)과의 융합 단백질로 발현하기 위하여, 증폭된 PF1345 유전자를 pTYB2 vector에 클로닝하고 plasmid pTAST1을 구축하였다(도 1). 클로닝된 유전자의 open reading frame (ORF)는 924bp의 길이로 307 아미노산을 암호화하고 있었다(도 2). Plasmid pTAST1로 E. coli BL21 (DE3) codon plus를 형질전환하고 IPTG를 첨가하여 유도 배양하였다. IPTG로 유도 발현된 재조합 단백질은 Pfast-Intein-CBD로 연결된 융합 단백질로서 예상되는 분자량은 90 kDa이었다. Zymogram을 통하여 SDS-PAGE 상에서 밴드를 확인한 결과, 약 90 kDa 부위에서 밴드가 확인되어 예상된 분자량과 일치하였다(도 3). 초음파 파쇄액은 60℃에서 20분간 열처리한 후, 실시예 1에서 서술한 바와 같이 부분 정제하였다(도 3). 이렇게 부분 정제된 아릴설파타제는 효소의 특성 분석에 사용하였다.

실시예 2-2. 재조합 아릴설파타제의 생화학적 특징

본 효소의 최적 pH와 온도를 조사하였다. 효소반응의 최적 pH는 9.5이고, pH 9.0~10.0 범위에서 90% 이상의 안정된 활성을 유지하였다(도 4). 아릴설파타제 활성에 대한 본 효소의 최적온도는 45℃이고 37~50℃ 범위에서 95% 이상의 높은 활성을 유지하였다(도 5). 또한, 본 효소는 60℃에서의 활성 반감기(50% 활성을 나타냄)가 40분이었고, Ca²⁺의 존재 하에서는 효소의 활성 반감기가 50분을 나타내었다. 따라서 Ca²⁺의 존재 하에서는 본 효소의 내열성이 증가하였다(도 6). 본 유전자는 98℃에서 생육하는 초고온성 고세균인 Pyrococcus furiosus 유래의 단백질을 암호화하고 있음에도 불구하고 생육온도와 유사한 높은 내열성은 보이지 않았다. 그 이유로는 Pfast 단백질이 Intein-CBD과 융합 단백질로 발현되어 내열성이 감소한 것으로 추측된다. 또한, Intein과 함께 생산된 융합 단백질은 DTT와 같은 환원제를 처리하면 단백질 재접합(protein splicing)이 일어나야 하지만 본 융합 단백질(Pfast-Intein-CBD)의 경우 단백질 재접합이 일어나지 않았다.

본 재조합 단백질 활성의 금속이온에 대한 효과를 조사한 결과, Ca²⁺존재 하에서는 대조구에 비해 123%의 활성을 나타내어 활성이 향상되었고, Zn²⁺존재 하에서는 대조구의 약 52%를 나타내어 활성이 저해되었다(도 7). 또한, 2 mM의 Ca²⁺농도에서 최적 활성을 나타내어 대조구에 비해 30% 정도 활성이 증가하였다(데이터 미 도시).

실시예 2-3. 재조합 아릴설파타제 효소 반응 조건의 최적화

아가(Junsei, Japan)에 본 효소를 처리하여 탈황 반응 시 처리된 효소의 양에 따른 전기영동 상에서 DNA의 이동결과를 확인하기 위하여, 효소 양을 달리하여 아가로스를 제조하였다. 50 mM glycine-NaOH buffer (pH 9.5)에 0.6% 아가를 첨가하여 제조한 한천용액에 0.5, 2.5 및 5 Unit/ml의 효소를 첨가하여 50℃에서 2 시간동안 진탕 배양기(shacking incubator)에서 반응시키고, 아세톤으로 침전시킨 후 2~3배 양의 증류수에 세척한 후 동결 건조하여 분말 상태로 만들었다. 제조된 아가로스로 1.0% 겔을 만들어 1 Kb DNA marker로써 DNA 이동상을 분석한 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8에 나타난 바와 같이 0.6% 한천용액에 0.5와 2.5 Unit/ml의 효소를 처리한 아가의 경우, 효소를 처리하지 않은 아가와 비교하여 DNA의 이동성과 분리능이 더욱 향상되었고, 5 unit/ml의 효소를 첨가하여 제조된 아가의 경우, DNA의 이동성과 분리능에 있어 시판되는 전기영동용 아가로스 (Seakem LE agarose, Cambrex, USA)와 동일하게 나타났다. 이와 같이 아가용액에 처리하는 효소의 양이 증가할수록 DNA의 이동성과 분리능이 향상되는 것으로 나타나, 아릴설파타제에 의한 황의 제거가 고순도 아가로스 제조에 효과가 높은 것으로 나타났다.

실시예 2-4. 효소 처리된 아가의 황 함량

DNA 전기영동용 아가로스의 품질을 평가하기 위하여 황 함량이 중요한 기준 으로 사용된다. 따라서 효소 처리로 제조된 아가로스의 황 함량을 상업적으로 판매되는 아가로스와 비교하여 측정하였다. 그 결과, 본 실시예에 사용된 미생물 배양용 아가의 황 함량은 1.02%로 나타났고, 시판되는 전기영동용 아가로스(Seakem LE agarose, Cambrex, USA)는 0.1% 이하로 나타났다. 그리고 본 효소의 처리에 의해 제조된 아가로스의 경우 처리되는 효소량이 많을수록 황 잔존 비율이 감소하는 경향이 나타났다. 0.6%의 아가에 효소 0.5 Unit/ml로 처리하였을 경우 황 함량이 0.46%로 나타났고, 2.5 Unit/ml로 처리한 경우는 0.35%로 그리고 5 Unit/ml를 처리하였을 때는 0.12% 정도의 잔존 황 함량을 나타내었다. 따라서 본 효소를 5 Unit/ml으로 아가에 처리할 경우 시판중인 전기영동용 아가로스 수준(황함량 0.15% 이하)으로 황을 제거할 수 있었다. 또한, 본 효소는 50℃에서 2시간 동안 방치한 후에도 활성이 전혀 떨어지지 않기 때문에(데이터 미도시) 고온에서 고효율로 아가의 황 함량을 감소시킬 수 있다. 이와 같이 본 효소를 아가의 황 제거 공정에 도입하여 고순도 아가로스를 직접 생산하는 생물생산공정을 적용할 경우 유기용매와 계면활성제의 사용을 감소시킴으로써 공정비용을 절약할 수 있다.

도 1은 아릴설파타제 유전자의 발현을 위한 재조합 플라스미드 pTAST1의 구축과정을 나타낸 것이다.

도 2는 Pyrococcus furiosus 유래 아릴설퍼테이즈(arylsulfatase)의 DNA 염기서열과 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

도 3은 부분 정제된 아릴설파타제의 SDS-PAGE 분석을 나타낸 것이다(M은 표준시료; 레인 1은 Pfast 발현균주의 초음파 상등액; 레인 2는 60℃에서 열처리 상등액; 레인 3은 Hitrap Q 컬럼 정제 획분; 레인 4는 레인 3과 같은 샘플로 전기영동한 후 zymogram으로 분석한 사진).

도 4는 아릴설파타제의 활성에 대한 pH 효과를 나타낸 것이다(닫힌 원(●)은 50 mM Tris-HCl buffer를 사용, 열린 원(○)은 glycine-NaOH buffer를 사용).

도 5는 아릴설파타제의 활성에 대한 온도 효과를 나타낸 것이다.

도 6은 아릴설파타제를 60℃에서 각기 다른 시간동안 열처리 한 후 잔존활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다(열린 원(○)은 효소에 Ca²⁺을 첨가하고 열처리 한 것, 닫힌 원(●)은 Ca²⁺를 첨가하지 않고 열처리 한 것).

도 7은 아릴설파타제의 활성에서 각종 2가 양이온에 대한 효과를 나타낸 것이다.

도 8은 아가, 본 발명의 효소 처리한 아가 및 시판 아가로스의 DNA 전기영동 결과를 나타낸 것이다[1.0% 겔에서 1 kb DNA marker 사용, 레인 1: 아가 (Junsei, japan), 레인 2: 0.5 Unit/ml의 효소 처리한 아가, 레인 3: 2.5 unit/ml의 효소 처리한 아가; 레인 4: 5 unit/ml의 효소 처리한 아가, 레인 5: 시판 아가로스 (Seakem LE agarose, Cambrex, USA)].

<110> DONG-EUI EDUCATIONAL, FOUNDATION <120> Thermostable arylsulfatase and usage thereof <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1125 <212> DNA <213> Pyrococcus furiosus <400> 1 atggagcgaa gaaagcttgt cttaataagt ctagatggaa atggagtgta caactttaaa 60 tatatgccat ttttaagcga gttagcagaa aatggagaat attttatcgt ggattctata 120 tttccaactc tcacagatct tgttcatacc actgtaatga cgggggtaga gccaaggatc 180 cattgggttg tagagaatgg atattatgat aggataacag gagttaaagt gaagttttac 240 gactttaaag ttgctttcaa cccccatgag gtgataaagg cccctctaat tcaagatatt 300 ttgaggcaaa ggggtgtcag aatagcgagt gtctcgggct acaccatgcc tcctttcagc 360 aatgttgatg tgagaatata ccccccattc ttctcttccg acgagcttta tagaaagcat 420 gggagagatt ggaaaaagga tttgtgggtg ttgaattcgg caatttatct ttacgaggag 480 tgcaaaccag atcttctcct tgttcatttc gcgtcaatag acgggatgca acatgattat 540 gggcccgaaa gtaaagatgc tttaaaggct atagagactg tagattctgc ggtgaggagc 600 ttatgggaaa gattaaagga tgaatacgct ttcataatat ttgcggatca cgggcaagaa 660 gaagtccaca cctgggtaaa cctaagggaa tatttgaaaa ggcatgggat agaagtgctt 720 agagtatctt ctggtggagg cgttcacatc tatctaaaga atccagaaga gaaagaggag 780 gcttatcagc tcttaaggag agctccagga gtgaatgaga ttttctttag agaggatctt 840 ccttacctta atgttccggt gagtggcgac ttaatagtct ctgccaagaa gggttactgg 900 ttctgccacc atagggagtg tcagaaggta aagggaaaaa gctattgggt gaaaggaatg 960 catggttcta gaaattccca ggtcatgaag gttcctctta ttatttgggg gttagatgta 1020 aaaaaagaag aggcaacttt atatgacata gctcctacaa tcttggattt ctttggtgta 1080 ggaaagaaag gagaaatgaa ggggtcatcc cttcttaaat cctag 1125 <210> 2 <211> 374 <212> PRT <213> Pyrococcus furiosus <400> 2 Met Glu Arg Arg Lys Leu Val Leu Ile Ser Leu Asp Gly Asn Gly Val 1 5 10 15 Tyr Asn Phe Lys Tyr Met Pro Phe Leu Ser Glu Leu Ala Glu Asn Gly 20 25 30 Glu Tyr Phe Ile Val Asp Ser Ile Phe Pro Thr Leu Thr Asp Leu Val 35 40 45 His Thr Thr Val Met Thr Gly Val Glu Pro Arg Ile His Trp Val Val 50 55 60 Glu Asn Gly Tyr Tyr Asp Arg Ile Thr Gly Val Lys Val Lys Phe Tyr 65 70 75 80 Asp Phe Lys Val Ala Phe Asn Pro His Glu Val Ile Lys Ala Pro Leu 85 90 95 Ile Gln Asp Ile Leu Arg Gln Arg Gly Val Arg Ile Ala Ser Val Ser 100 105 110 Gly Tyr Thr Met Pro Pro Phe Ser Asn Val Asp Val Arg Ile Tyr Pro 115 120 125 Pro Phe Phe Ser Ser Asp Glu Leu Tyr Arg Lys His Gly Arg Asp Trp 130 135 140 Lys Lys Asp Leu Trp Val Leu Asn Ser Ala Ile Tyr Leu Tyr Glu Glu 145 150 155 160 Cys Lys Pro Asp Leu Leu Leu Val His Phe Ala Ser Ile Asp Gly Met 165 170 175 Gln His Asp Tyr Gly Pro Glu Ser Lys Asp Ala Leu Lys Ala Ile Glu 180 185 190 Thr Val Asp Ser Ala Val Arg Ser Leu Trp Glu Arg Leu Lys Asp Glu 195 200 205 Tyr Ala Phe Ile Ile Phe Ala Asp His Gly Gln Glu Glu Val His Thr 210 215 220 Trp Val Asn Leu Arg Glu Tyr Leu Lys Arg His Gly Ile Glu Val Leu 225 230 235 240 Arg Val Ser Ser Gly Gly Gly Val His Ile Tyr Leu Lys Asn Pro Glu 245 250 255 Glu Lys Glu Glu Ala Tyr Gln Leu Leu Arg Arg Ala Pro Gly Val Asn 260 265 270 Glu Ile Phe Phe Arg Glu Asp Leu Pro Tyr Leu Asn Val Pro Val Ser 275 280 285 Gly Asp Leu Ile Val Ser Ala Lys Lys Gly Tyr Trp Phe Cys His His 290 295 300 Arg Glu Cys Gln Lys Val Lys Gly Lys Ser Tyr Trp Val Lys Gly Met 305 310 315 320 His Gly Ser Arg Asn Ser Gln Val Met Lys Val Pro Leu Ile Ile Trp 325 330 335 Gly Leu Asp Val Lys Lys Glu Glu Ala Thr Leu Tyr Asp Ile Ala Pro 340 345 350 Thr Ile Leu Asp Phe Phe Gly Val Gly Lys Lys Gly Glu Met Lys Gly 355 360 365 Ser Ser Leu Leu Lys Ser 370 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gaggtggaca tatgattgag gtaatcttcc tg 32 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 acgtacctta aatatgacat t 21

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11. 서열번호2의 아미노산 서열로 이루어진, 피로코커스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus) 유래의 아릴설파타제 또는 상기 아릴설파타제와 intein-CBD를 융합한 단백질을 Ca²⁺ 존재 하에서 pH 9.0 내지 10.0, 37~50℃ 조건으로 아가 용액에 처리하여 아가를 탈황시키는 방법.
12. 삭제
13. 제11항에 있어서, 상기 Ca²⁺은 2mM 농도인 것을 특징으로 하는, 아가를 탈황시키는 방법.
14. 삭제
15. 제 11항에 있어서, 상기 아릴설파타제 또는 융합 단백질은 0.5 내지 5 Unit/ml의 농도로 처리하는 것을 특징으로 하는, 아가를 탈황시키는 방법.

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