ES2750730T3 - Dímero de G-CSF humano recombinante y uso del mismo para el tratamiento de enfermedades neurológicas - Google Patents
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Abstract
Un polipéptido de G-CSF-Fc aislado que comprende: (i) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 o 6, o (ii) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5 o 7, en donde la secuencia ERKCC se elimina del fragmento Fc de IgG2 humana que está en dicho polipéptido de G-CSF-Fc aislado.
Description
DESCRIPCION
Dímero de G-CSF humano recombinante y uso del mismo para el tratamiento de enfermedades neurológicas CAMPO DE INVENCIÓN
Esta invención se refiere al área de tecnologías biológicas y médicas, en particular, esta invención se refiere a un nuevo dímero de G-CSF humano y su uso en el tratamiento de enfermedades asociadas con lesiones neuronales.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El factor estimulante de colonias de granulocitos humano (G-CSF) es una glucoproteína que tiene 204 aminoácidos con 30 péptidos señal de 30 aminoácidos. La proteína G-CSF madura, que tiene un peso molecular de 18-20 kDa, está compuesta de 174 aminoácidos sin péptidos señal y es secretada por las células. Las células humanas principalmente responsables de tal secreción son los monocitos, los fibroblastos y las células endoteliales.
Hay tres funciones biológicas principales para G-CSF, concretamente:
1. actuar sobre precursores mieloides y células madre para impulsar la diferenciación, desarrollo y maduración de neutrófilos;
2. activar neutrófilos maduros para participar en la respuesta inmune; y
3. actuar con otros factores de crecimiento hematopoyéticos como el factor de células madre, el ligando Flt-3 y el GM-CSF para movilizar células madre hematopoyéticas.
Se ha comprobado que el receptor de G-CSF (G-CSFR) existe en células madre hematopoyéticas de médula ósea Sca+Lin-Th1bajo, células precursoras CD34+, células precursoras de granulocitos comprometidos y neutrófilos maduros. El G-CSFR es un receptor específico que tiene una alta afinidad por G-CSF y 812 aminoácidos.
Tamada et al. obtuvieron la estructura cristalina del complejo G-CSF:G-CSFR y la estequiometría del complejo G-CSF:G-CSFR se mostró como una proporción 2:2 mediante el análisis de difracción de 2.8 angstrom (PnAs , 2008, Vol. 103: 3135-3140). En otras palabras, en cada complejo, cada G-CSF se une a una cadena de receptores para formar un complejo G-CSF-receptor cuando dos complejos G-CSF-receptor se acercan, como resultado de esta interacción se forma un dímero 2:2. Bajo esta circunstancia, el terminal carboxilo del receptor G-CSF es capaz de activar las moléculas señal en sentido descendente JAK (Janus tirosina quinasas, principalmente JAK2). En consecuencia, JAK2 activa STAT3 para activar los genes transcripcionales que son críticos para la diferenciación y proliferación y activación de neutrófilos.
En 2003, Schabitz WR et al. informaron que el G-CSF humano recombinante (rhG-CSF) mostró que tenía una funcionalidad protectora sobre las células nerviosas del estudio en el modelo animal isquémico (Storke, 2003, 34;745-751). Más tarde en 2006, Shyu et al. informaron que se demostró que rhG-CSF tiene eficacia clínica en el tratamiento de pacientes con apoplejía aguda en el que se administró a los pacientes rhG-CSF diariamente durante cinco días consecutivos (CMAJ, 2006, 174: 927-933). La vida media in vivo del G-CSF de rata tras la administración subcutánea es de aproximadamente 2 horas, mientras que la vida media del G-CSF humano tras la administración subcutánea es de solo 3,5 horas. Por lo tanto, se requiere administrar a los pacientes con necesidad de ello con el fármaco diariamente, o infusión intravenosa y esto afectará la calidad de vida de los pacientes. La US6797493 analiza las proteínas de fusión Fc de G-CSF humano con actividades biológicas aumentadas con respecto a rhG-CSF. La WO2002/036626 describe polipéptidos multiméricos de cadena sencilla, mientras que la US2008/300188 analiza proteínas de fusión de inmunoglobulina. Cox et al. (2004) Exp. Hematology, 32, 441-449 analiza la vida media circulante mejorada y las propiedades hematopoyéticas de una proteína de fusión factor de estimulación de colonias de granulocitos/inmunoglobulina humana. La WO2001/03737 describe métodos para elaborar proteínas de fusión que comprenden una citoquina o factor de crecimiento fusionado a un dominio de inmunoglobulina. La WO2003/076567 divulga proteínas de fusión heterólogas que comprenden un análogo de G-CSF hiperglucosilado fusionado a proteínas como la albúmina y la porción Fc de una inmunoglobulina que actúan para extender la vida media in vivo de la proteína en comparación con el G-CSF nativo. Xiao et al. (2007) J. cellular and molecular medicine 1272-1290 analiza la biología celular y la perspectiva clínica de G-CSF, incluyendo sus propiedades de inmunomodulación y neuroprotección. Solarogle et al. (2006) Stroke, 37, 4, 1123-1128 resume el papel de G-CSF y la vía de transducción de señales correspondiente regulada por G-CSF en la neuroprotección.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La invención proporciona un polipéptido de G-CSF-Fc aislado que comprende: (i) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 o 6, o (ii) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5 o 7, en donde la secuencia ERKCC se elimina del fragmento Fc de IgG2 humana que está en dicho polipéptido de G-CSF-Fc aislado.
A la luz de los antecedentes anteriores, es un objeto de la presente invención proporcionar un fármaco alternativo para el tratamiento de enfermedades asociadas con lesiones neuronales con eficacia mejorada y la fabricación del mismo.
Por consiguiente, la presente divulgación, en un aspecto, es un dímero de G-CSF de fórmula (I):
(I) M1-L-M2
en donde M1 es un primer monómero de G-CSF; M2 es un segundo monómero de G-CSF; y L es un conector que conecta dicho primer monómero y dicho segundo monómero y está dispuesto entre ellos.
Además, el dímero de G-CSF retiene la actividad biológica del monómero de G-CSF y tiene una vida media en suero de más de dos veces la de cualquiera del primer o dicho segundo monómero.
En una realización ejemplar de la presente divulgación, la L se selecciona del grupo que consiste de: a) . un conector orgánico;
b) . un péptido corto que comprende de 3 a 50 aminoácidos; y
c) . un polipéptido de fórmula (II):
(II) -Z-Y-Z
en donde Y es una proteína portadora; Z es un péptido(s) corto que comprende de 0 a 30 aminoácidos. En una realización ejemplar, el péptido corto sin ningún aminoácido se refiere a un enlace peptídico.
En otra realización ejemplar más, el conector tiene un impedimento estérico lo suficientemente pequeño para el dímero de G-CSF de tal manera que el pliegue y la conformación adecuados formados por la configuración del primer monómero y el segundo monómero no se ve afectada o significativamente afectada.
En una realización ejemplar, el conector orgánico se selecciona de un grupo que consiste de resina de oximetilfenilacetamidometilo (PAM), resina de 4-oximetil fenilacetamidometilo y resina de clorometil poliestireno.
En otra realización ejemplar, el primer monómero y el segundo monómero son de la misma entidad.
En una realización ejemplar, la actividad biológica de la proteína de fusión incluye:
a) . actuar sobre granulocitos de neutrófilos y células madre para impulsar la diferenciación, crecimiento y maduración de neutrófilos; y
b) . activar neutrófilos maduros para participar en la respuesta inmune.
En otra realización ejemplar, la proteína portadora es albúmina o fragmento Fc de IgG humana.
En una realización ejemplar, la vida media en suero del dímero de G-CSF es más de tres, cinco o diez veces la del primer y/o el segundo monómero.
En otra realización ejemplar, el dímero de G-CSF es producido por dos complejos G-CSF-Fc en los que cada complejo G-CSF-Fc comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de un grupo que consiste de las SEQ ID NO: 4-7, en donde la secuencia ERKCC se elimina del fragmento Fc de IgG2 humana que está en dicho polipéptido de G-CSF-Fc aislado.
En otro aspecto más de la presente divulgación, se proporciona una proteína de fusión hecha de un primer polipéptido y un segundo polipéptido en el que el primer y el segundo polipéptidos comprenden una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8, y los dos polipéptidos están enlazados entre sí sin impedimento estérico.
En una realización ejemplar, el primer y segundo polipéptidos son monómeros de G-CSF.
En otra realización ejemplar de la presente divulgación, el enlace sin impedimento entre dicho primer polipéptido y el segundo polipéptido se lleva a cabo mediante un conector. En esta realización, el conector es:
a) . un conector orgánico con un impedimento estérico lo suficientemente pequeño para no afectar o afectar significativamente el pliegue y la conformación adecuados formados por la configuración de dicho primer monómero y dicho segundo monómero;
b) . un péptido corto que comprende de 3 a 50 aminoácidos; y
c) . un polipéptido de fórmula (II):
(II) -Z-Y-Z
en donde Y es una proteína portadora; Z es un péptido(s) corto que comprende de 0 a 30 aminoácidos. En una realización ejemplar, el péptido corto sin ningún aminoácido se refiere a un enlace peptídico.
En una realización ejemplar, el conector orgánico es: resina de oximetilfenilacetamidometilo (PAM), resina de 4-oximetil fenilacetamidometilo y resina de clorometil poliestireno.
En otro aspecto de la presente divulgación, se proporciona una composición farmacéutica que comprende como su ingrediente activo, un dímero de G-CSF purificado producido por dos complejos G-CSF-Fc en el que cada complejo G-CSF-Fc comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de un grupo que consiste de las SEQ ID NO: 4-7, en donde la secuencia ERKCC se elimina del fragmento Fc de IgG2 humana que está en dicho polipéptido de G-CSF-Fc aislado. En una realización ejemplar, el dímero de G-CSF tiene una pureza del 90-100%; en otra realización ejemplar, el dímero de G-CSF tiene una pureza del 95-100%; en otra realización ejemplar más, el dímero de G-CSF tiene una pureza del 99-100%.
En una realización ejemplar en este aspecto específico, un método para tratar un trastorno neurológico que comprende administrar una cantidad eficaz de la composición farmacéutica mencionada anteriormente a un sujeto con necesidad del tratamiento. En una realización ejemplar, la cantidad eficaz varía de 0,001-1.000 mg del dímero por dosis. En otra realización ejemplar más, la enfermedad se selecciona de un grupo que consiste de: apoplejía, lesión medular y trastornos neurológicos acompañados de lesión de la barrera hematoencefálica.
En otra realización ejemplar en este aspecto específico, un método para activar STAT3 en células neuronales que comprende administrar una cantidad eficaz de la composición farmacéutica mencionada anteriormente a un sujeto con necesidad del tratamiento. En una realización ejemplar, la cantidad eficaz varía de 0,001-1.000 mg del dímero por dosis.
En otro aspecto más de esta invención, un polipéptido DE G-CSF-Fc aislado que comprende una secuencia de aminoácidos de LA SEQ ID NO: 4 o 6, o la secuencia de aminoácidos de LA SEQ ID NO: 5 o 7, en donde se elimina la secuencia ERKCC del fragmento Fc de IgG2 humana que está en dicho polipéptido de G-CSF-Fc aislado. En una realización, se proporciona una composición farmacéutica que comprende como su ingrediente activo, un polipéptido purificado que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 o 6, o la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5 o 7, en donde la secuencia ERKCC se elimina del fragmento Fc de IgG2 humana que está en dicho polipéptido de G-CSF-Fc aislado. En una realización ejemplar, el polipéptido tiene una pureza del 90-100%; en otra realización ejemplar, el polipéptido tiene una pureza del 95-100%; en otra realización ejemplar más, el polipéptido tiene una pureza del 99-100%.
En una realización ejemplar de la divulgación, un método para tratar un trastorno neurológico que comprende administrar una cantidad eficaz de la composición farmacéutica mencionada anteriormente a un sujeto con necesidad del tratamiento. En otra realización ejemplar más, la enfermedad se selecciona de un grupo que consiste de: apoplejía, lesión medular y trastornos neurológicos acompañados de lesión de la barrera hematoencefálica.
En otra realización ejemplar en este aspecto específico de la divulgación, un método para activar STAT3 en células neuronales que comprende administrar una cantidad eficaz de la composición farmacéutica mencionada anteriormente a un sujeto con necesidad del tratamiento.
Una realización de la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende como su ingrediente activo, un polipéptido de G-CSF-Fc purificado, en donde el polipéptido de G-CSF-Fc purificado comprende la SEQ ID NO: 4, 5 o 7, en donde se elimina la secuencia ERKCC del fragmento Fc de IgG2 humana que está en dicho polipéptido de G-CSF-Fc aislado. En ciertas realizaciones, la invención proporciona una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de un trastorno neurológico.
En una realización ejemplar en este aspecto específico, la enfermedad se selecciona de un grupo que consiste de: apoplejía, lesión de la columna vertebral y trastornos neurológicos acompañados de lesión de la barrera hematoencefálica.
En otro aspecto de esta divulgación, se proporciona un uso del dímero del factor estimulante de colonias de granulocitos humano (G-CSF) o el polipéptido aislado de la invención en la preparación de la composición para activar STAT3 en células neuronales.
En otro aspecto de esta divulgación, se proporciona un método para la fabricación de un dímero de G-CSF que comprende los pasos de:
a) . transformar células de mamífero con un vector de expresión que comprende una secuencia de ADN que codifica un complejo G-CSF-Fc que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de un grupo que consiste de la SEQ ID NO: 9-10;
b) . cultivar las células de mamífero transformadas bajo condiciones suficientes para expresar los complejos G-CSF-Fc y los dímeros de G-CSF; y
aislar y purificar el dímero de G-CSF obtenido del paso (b);
en donde el dímero de G-CSF comprende dos complejos G-CSF-Fc en los que cada complejo G-CSF-Fc comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de un grupo que consiste de las SEQ ID NO: 2-7. En otro aspecto más de esta invención, se proporciona un método para la fabricación de un polipéptido de G-CSF-Fc aislado que comprende los pasos de:
a) . transformar células de mamífero con un vector de expresión que comprende una secuencia de ADN que codifica el polipéptido de G-CSF-Fc que comprende una secuencia de nucleótidos que consiste de la SEQ ID NO: 10;
b) . cultivar las células de mamífero transformadas bajo condiciones suficientes para expresar el polipéptido de G-CSF-Fc; y
aislar y purificar el polipéptido de G-CSF-Fc obtenido del paso (b);
en donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Fig. 1 es una ilustración de la estructura de un dímero de G-CSF con la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 1. En la figura, "-" representa el conector y el objeto con forma ovalada marcado con "G-CSF" representa un monómero de G-CSF. En esta realización específica, el dímero de G-CSF tiene un monómero de G-CSF (residuos de aminoácidos 1-174) conectado a otro monómero de G-CSF (residuos de aminoácidos 191-364) por un conector (residuos de aminoácidos 175-190).
La Fig. 2a y 2b son una ilustración de la estructura de un dímero de G-CSF. En la figura, "-" representa el conector y el objeto con forma ovalada marcado con "G-CSF" representa un monómero de G-CSF. El objeto con forma ovalada marcado con "C" representa una proteína portadora en la cual está dispuesto el monómero de G-CSF en el extremo N-terminal de la proteína portadora. El objeto con forma ovalada marcado con "Fc" representa un fragmento Fc de IgG2 humana.
Las Figs. 3a y 3b son una ilustración de la estructura de un dímero de G-CSF con aminoácidos. En la figura, "-" representa el conector y el objeto con forma ovalada marcado con "G-CSF" representa un monómero de G-CSF. El objeto con forma ovalada marcado con "C" representa una proteína portadora en la cual está dispuesto el monómero de G-CSF en el extremo C-terminal de la proteína portadora. El objeto con forma ovalada marcado con "Fc" representa un fragmento Fc de la IgG2 humana.
Las Figs. 4, 6 muestran la eficacia clínica del dímero de G-CSF del estudio del modelo animal de isquemia cerebral focal.
La Fig. 5 muestra la eficacia para activar STAT3 in vitro por el dímero G-CSF.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS REALIZACIONES PREFERIDAS
Tras una extensa y exhaustiva investigación, los inventores han creado con éxito un nuevo dímero de G-CSF como se describe en la presente. Se muestra que este nuevo dímero de G-CSF prolonga la vida media in vivo del mismo, mejora las propiedades farmacocinéticas del mismo fármaco, reduce la frecuencia de administración del fármaco, mejora la actividad del fármaco in vivo y promueve la rehabilitación de la recuperación de la función neurológica. El dímero de G-CSF también muestra una activación de STAT3 significativa en comparación con el monómero de G-CSF en una proporción molar de G-CSF igual, por tanto, para mejorar la bioactividad del fármaco del mismo, mejorar el resultado terapéutico de las lesiones neuronales. Las características anteriormente mencionadas se describirán adicionalmente en los ejemplos siguientes.
Dímero de G-CSF
La primera realización de la presente divulgación es un dímero de G-CSF representado por la fórmula (I) mencionada anteriormente y la ilustración estructural del mismo se muestra en las Figs. 1-3. La proteína portadora comprende el fragmento Fc de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 y albúmina humana.
En una realización preferida, el G-CSF puede estar dispuesto en el extremo C-terminal o el extremo N-terminal de la proteína portadora como se muestra en las Figs. 2-3.
Como se usa en la presente y en las reivindicaciones, "conector" se refiere a una molécula que es capaz de conectar dos polipéptidos de monómeros entre sí de tal manera que el compuesto resultante retiene la actividad biológica o tiene una actividad biológica mejorada del polipéptido de monómeros.
Claims (13)
1. Un polipéptido de G-CSF-Fc aislado que comprende:
(i) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 o 6, o
(ii) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5 o 7, en donde la secuencia ERKCC se elimina del fragmento Fc de IgG2 humana que está en dicho polipéptido de G-CSF-Fc aislado.
2. El polipéptido de G-CSF-Fc aislado de la reivindicación 1, en donde el polipéptido de G-CSF-Fc aislado comprende la SEQ ID NO: 4.
3. El polipéptido de G-CSF-Fc aislado de la reivindicación 1, en donde el polipéptido de G-CSF-Fc aislado comprende la SEQ ID NO: 5.
4. El polipéptido de G-CSF-Fc aislado de la reivindicación 1, en donde el polipéptido de G-CSF-Fc aislado comprende la SEQ ID NO: 6.
5. El polipéptido de G-CSF-Fc aislado de la reivindicación 1, en donde el polipéptido G-CSF-Fc aislado comprende la SEQ ID NO: 7.
6. Una composición farmacéutica que comprende como ingrediente activo un polipéptido de G-CSF-Fc purificado según cualquiera de las reivindicaciones 2, 3 o 5.
7. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 6, en donde dicho polipéptido de G-CSF-Fc tiene una pureza del 90-100%.
8. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 6 o la reivindicación 7 para su uso en el tratamiento de un trastorno neurológico.
9. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el trastorno neurológico se selecciona de un grupo que consiste de: apoplejía, lesión de la columna vertebral y trastornos neurológicos acompañados de lesión de la barrera hematoencefálica.
10. La composición farmacéutica para el uso de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el trastorno neurológico es apoplejía.
11. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8-10, en donde la composición farmacéutica está formulada para administración en un intervalo de 0,001-1.000 mg de dicho polipéptido de G-CSF-Fc por dosis.
12. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8-11, en donde la composición farmacéutica está formulada para administración parenteral.
13. Un método para la fabricación del polipéptido de G-CSF-Fc aislado de acuerdo con la reivindicación 4, que comprende los pasos de:
a) transformar células de mamífero con un vector de expresión que comprende una secuencia de ADN que codifica dicho polipéptido de G-CSF-Fc que comprende una secuencia de nucleótidos que consiste de la SEQ ID NO: 10;
b) cultivar dichas células de mamífero transformadas bajo condiciones suficientes para expresar dicho polipéptido de G-CSF-Fc; y
c) aislar y purificar dicho polipéptido de G-CSF-Fc obtenido del paso b).
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