ES2745702T3 - Compuestos de polisacárido multifuncionalizados y su uso para dirigirse al receptor de manosa 6-fosfato independiente de catión - Google Patents
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Abstract
Compuesto caracterizado por que presenta la fórmula general (I):**Fórmula** en donde: - n es un número entero que varía de 1 a 3, - ------ representa un enlace sencillo o un enlace doble, - cada uno de P1 representa independientemente entre si H, un grupo protector elegido particularmente entre (CH3)3Si-; tBuMe2Si-; C6H5CH2-; 4-CH3OC6H5CH2-; o-NO2C6H5CH2-; CH3CO-; C6H5CO- o CF3CO-; - X representa: - cuando ------ es un enlace sencillo: - grupo fosfonato:**Fórmula** - grupo fluoro fosfonato**Fórmula** - grupo bifluoro fosfonato**Fórmula** - grupo carboxilato**Fórmula** - grupo malonato**Fórmula** - cuando ------ es un doble enlace: - el grupo fosfonato:**Fórmula** - el grupo carboxilato:**Fórmula** con Z representando independientemente entre sí H; un alquilo C1-C5; CF3CH2-; C6H5CH2- C6H5-; (CH3)3Si-; un metal alcalino elegido entre Na, Li o K; un amonio NH4, - A representa un radical divalente elegido entre -O-, -S-, -NH-, -CH2- - L representa: - -H; -NH2; -(CH2)n1-CH=CH2 o -(CH2)n1-C≡CH con n1 representando un número entero de 0 a 4, entonces en cada uno de estos casos L1 está ausente, - un radical hidrocarburo divalente saturado, lineal o ramificado, sustituido o no sustituido, que tiene de 1 a átomos de carbono, un radical hidrocarburo divalente insaturado, lineal o ramificado, sustituido o no sustituido, que tiene de 2 a 30 átomos de carbono, - un radical hidrocarburo divalente saturado o insaturado como se definió anteriormente de los cuales uno o más grupos -CH2-, -CH=CH- y/o -C=C- del radical hidrocarburo saturado o insaturado se reemplaza(n) independientemente entre sí por un grupo -O-; -NH-; -NR1- con R1 representando un alquilo C1-C5; -S-; -CONH-; -NH-CO-O-; -O-N=CH-; -CO-NH-N=CH-; un sistema cíclico o heterocíclico, saturado o insaturado, sustituido o no; - L1 representa: -(CH2)n1-CH=CH2; -(CH2)n1-C≡CH; -(CH2)n1-N3; -(CH2)n1-SH; -(CH2)n1-NH2; -(CH2)n1-N=C=O; -(CH2)n1-N=C=S; -(CH2)n1-NHR1; -(CH2)n1-NR1R2; -(CH2)n1-A1-NH2; -(CH2)n1-A1-NHR1; -(CH2)n1-A1-NR1R2; -(CH2)n1-NHCOCH2Hal; -(CH2)n1-COZ1; -(CH2)n1-A1COZ1; -(CH2)n1-O-N=CH2; -(CH2)n1-CO-NH-N=CH2; -(CH2)n1-H; un sistema cíclico o heterocíclico, saturado o insaturado, sustituido o no; un halógeno seleccionado entre F, Cl, Br o I; con n1 como se definió anteriormente, R1 y R2 representando independientemente entre sí un alquilo C1-C5, A1 representando -O-, -NH-, Hal representando Cl, Br o I; Z1 representando -OH, -OR1, -NHR1, -NH-NH2, -NH-NHR1,
Description
DESCRIPCIÓN
Compuestos de polisacárido multifuncionalizados y su uso para dirigirse al receptor de mañosa 6-fosfato independiente de catión
Sector de la técnica
La presente invención se refiere a nuevos compuestos polisacáridos multifuncionalizados, y más particularmente a compuestos di-, tri- o tetra-manosídicos multifuncionalizados. La invención también se refiere al método de preparación de dichos compuestos, y su uso para dirigirse al receptor de manosa 6-fosfato independiente de catión (RM6P-CI).
Estado de la técnica
El receptor de manosa 6-fosfato independiente de catión (RM6P-CI) es un receptor ubicuo que está presente tanto en el citoplasma como en la membrana celular. Su función principal es transportar enzimas lisosómicas recién sintetizadas desde la red trans-Golgi hasta los lisosomas donde están activas. También participa en la endocitosis de enzimas lisosómicas secretadas por las células. Esta endocitosis por RM6P-CI permite la internalización de compuestos que transportan restos de manosa 6-fosfato (M6P) dentro de la célula y su direccionamiento hacia los lisosomas.
RM6P-CI, por lo tanto, desempeña un papel crucial en el tratamiento de las enfermedades de almacenamiento lisosómico (enfermedad rara), y más particularmente para la terapia de reemplazo enzimático. La enzimoterapia sustitutiva es una terapia exitosa para tratar estas enfermedades raras que se caracterizan por una deficiencia de una enzima lisosómica específica. Consiste en la administración de enzimas lisosómicas recombinantes que se dirigirán hacia los lisosomas mediante RM6P-CI gracias a los restos M6P presentes en el extremo de sus cadenas glicosiladas.
Además, RM6P-CI se sobreexpresa en algunos tipos de cáncer1, lo que lo convierte en una diana atractiva para el desarrollo de tratamientos específicos, limitando así la toxicidad en las células sanas.
Dichas terapias se pueden obtener por funcionalización, por ejemplo, de nanopartículas que encapsulan un principio activo y se injertan en la superficie con restos de manosa 6-fosfato (M6P).
Sin embargo, la principal desventaja de la manosa 6-fosfato (M6P) es la sensibilidad de su función fosfato a la hidrólisis por fosfatasas presentes en todos los órganos y en el suero. M6P luego se desfosforila y RM6P-CI ya no lo reconoce. La estabilidad de este marcador de reconocimiento es, por lo tanto, un factor determinante para su uso en el transporte de moléculas bioactivas.
Los análogos isostéricos de M6P no tienen el inconveniente de degradación por fosfatasas2'3'4. El ligamiento de estos análogos isostéricos de M6P a la parte oligosacárida de las enzimas lisosómicas mejora la eficacia de estas enzimas para aplicaciones en la terapia enzimática sustitutiva5. El uso de estos análogos isostéricos también permite una focalización muy eficaz de las células cancerosas de los tumores de próstata que sobreexpresan el RM6P-CI, así como su tratamiento1.
Para mejorar la afinidad por RM6P-CI, estos mismos análogos se sintetizaron en series de dimanosídica con un enlace glicosídico de tipo a(1,2). El disacárido 6-P-Man-a(1,2)-Man tiene una afinidad por RM6P-CI mayor que la del monosacárido M6P6. El enlace alfa 1,2 entre los dos restos manosa es muy importante para obtener una buena afinidad frente a RM6P-CI. Los enlaces alfa 1,3 o alfa 1,4 o alfa 1,6 conducen a una menor afinidad.
Sin embargo, el disacárido 6-P-Man-a(1,2)-Man tiene la desventaja de no ser estable en la sangre. En efecto, la función fosfato del disacárido 6-P-Man-a(1,2)-Man sufre hidrólisis por las fosfatasas presentes en el suero. Después de la desfosforilación por hidrolasas séricas, el disacárido formado Man-a(1,2)-Man no es reconocido por RM6P-CI, que es la diana biológica.
Hasta la fecha subsiste la necesidad de encontrar nuevos análogos isostéricos de M6P con afinidad mejorada hacia RM6P-CI, y que también sean estables en fluidos fisiológicos.
Objeto de la invención
Por lo tanto, uno de los objetos de la presente invención es proponer nuevos análogos isostéricos de M6P que tengan una afinidad muy alta hacia RM6P-Cl.
Por análogo isostérico de M6P se entiende, un compuesto químico sintético que tiene la misma actividad biológica que M6P, pero mejor estabilidad.
Otro objeto de la invención es proponer nuevos análogos isostéricos de M6P que sean estables en fluidos fisiológicos.
Otro objeto de la invención es proponer nuevos análogos isostéricos M6P que tengan una afinidad mejorada hacia RM6P-Cl en relación con los análogos isostéricos de M6P descritos en la solicitud PCT/EP2010/059505.
Por tanto los inventores han concebido nuevos compuestos di-, tri- o tetra-manosídicos multifuncionalizadtodos, es decir, que tienen diferentes grupos funcionales, siendo dichos grupos funcionales capaces respectivamente de formar uno (o más) enlace(s) con RM6P-CI y uno (o más) enlace(s) con un compuesto de interés Y.
La dificultad encontrada con los compuestos propuestos en la invención es encontrar una forma ventajosa de sintetizarlos, es decir, particularmente, una manera que sea sencilla de realizar, eficaz (buen rendimiento) y económica.
Por tanto, otro objeto de la invención es encontrar un método para la preparación de compuestos di-, tri- o tetramanosídicos multifuncionalizados que sea ventajoso, es decir, que sea sencillo de realizar, eficaz y no costoso. En efecto, la síntesis de compuestos di-, tri- o tetra-sacáridos es más complejo de realizar que el de los compuestos monosacáridos.
La presente invención se refiere a un compuesto caracterizado por que tiene la fórmula general (I):
en donde:
◦ n es un número entero que varía de 1 a 3,
◦ ---representa un enlace sencillo o un enlace doble,
◦ cada uno de P1 representa independientemente entre si H, un grupo protector elegido particularmente entre trimetilsililo (TMS: (CH3)3Si-), tercbutildimetilsililo (TBDMS: tBuMe2Si-), bencilo (Bn: C6H5CH2-), parametoxibencilo (PMB: 4 -CH3OC6H5CH2-), orto-nitrobencilo (o-NO2C6H5CH2-), acetilo (Ac: CH3CO-), benzoílo (Bz: C6H5CO-) o CF3CO-(trifluoroacetilo),
◦ X representa:
◦◦ cuando------ es un enlace sencillo:
◦◦◦ grupo fosfonato:
◦◦◦ grupo fluorofosfonato:
◦◦◦ grupo bi-fluorofosfonato:
◦◦◦ grupo carboxilato:
◦◦◦ elgrupo malonato:
◦◦ cuando----- es un doble enlace:
◦◦◦ grupo fosfonato:
◦◦◦ grupo carboxilato:
con Z representando independientemente entre si H; un alquilo C1-C5 , elegido particularmente entre metilo (Me: CH3-), etilo (Et: C2H5) o isopropilo (iPr: (CHa)aC-); 2,2,2-trifluoroetilo (CF3CH2-); C6H5CH2-; fenilo (Ph: C6H5-); (CH3)3Si-; un metal alcalino elegido entre Na, Li o K; un amonio NH4 ;
A representa un radical divalente elegido entre -O-, -S-, -NH-, -CH2-L representa:
◦◦ -H; -NH2 ; -(CH2)ni-CH=CH2 o -(CH2)ni-CECH con ni representando un número entero de 0 a 4, entonces en cada uno de estos casos Li está ausente,
◦◦ un radical hidrocarburo divalente saturado, lineal o ramificado, sustituido o no sustituido, que tiene de 1 a 30 átomos de carbono, un radical hidrocarburo divalente insaturado, lineal o ramificado, sustituido o no sustituido, que tiene de 2 a 30 átomos de carbono,
◦◦ un radical hidrocarburo divalente saturado o insaturado como se definió anteriormente de los cuales uno o más grupos -CH2-, -CH=CH- y/o -C=C- del radical hidrocarburosaturado o insaturado se reemplaza(n) independientemente entre sí por un grupo éter (-O-); amino (-NH-); alquilamino (-NR1-) con R1 representando un alquilo C1-C5 ; tioéter (-S-); amido (-CO-NH-); carbamato (-NH-CO-O-); oxima -O-N=CH-; acilhidrazona -CO-NH-N=CH-; un sistema cíclico o heterocíclico, saturado o insaturado, sustituido o no;
L1 representa:
-(CH2)n1-CH=CH2; -(CH2)n1-C=CH; -(CH2)n1-N3; -(CH2)mSH; -(CH2)n1-NH2; -(CH2)n1-N=C=O; -(CH2)n1-N=C=S; -(CH2)n1-NHR1; -(CH2)n1-NR1R2; -(CH2)n1-A1-NH2; -(CH2)n1-A1NHR1; -(CH2)n1-A1-NR1R2; -(CH2)n1-NHCO-CH2Ha1; -(CH2)n1-COZ1; -(CH2)n1-A1COZ1; -(CH2)n1-O-N=CH2 ; -(CH2)n1-CO-NH-N=CH2 ; -(CH2)n1-H; un sistema cíclico o heterocíclico, saturado o insaturado, sustituido o no; un halógeno seleccionado entre F, Cl, Br o I; con m como se definió anteriormente,
R1 y R2 representando independientemente entre sí un alquilo C1-C5 ,
A1 representando -O-, -NH-,
Hal representando Cl, Br o I;
Z1 representando -OH, -OR1, -NHR1, -NH-NH2 , -NH-NHR1, -NH-NR1R2 con R1 y R2 como se definió anteriormente, un halógeno seleccionado entre F, Cl, Br o I.
Como ejemplos de un radical hidrocarburo divalente saturado, lineal o ramificado, que tiene de 1 a 30 átomos de carbono, se puede citar particularmente:
-CH2-; -CH2CH2-; -CH2-(CH2)m-; -(CH2)m-CH(C1-Cy)-(CH2)m-; (CH2)m-CH(C1-C7)-(CH2)m-CH(C1-Cy)-(CH2)m-; -(CH2)m-C(C1-C7)2-(CH2)m; -(CH2)m-C(C1-C7)2-(CH2)m-CH(C1-C7)-CH2)m-;
-(CH2)m-C(C1-C7)2-(CH2)m-C(C1-C7)2-(CH2)m-;
con m representando independientemente entre sí un número entero de 0 a 30 con la condición de que la longitud de la cadena principal de hidrocarburo no supere los 30 átomos de carbono, y C1-C7 representando un alquilo que tiene de 1 a 7 átomos de carbono. Como un ejemplo de alquilo C1-C7 , puede mencionarse particularmente metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, pentilo, hexilo, heptilo.
Un radical hidrocarburo divalente insaturado, lineal o ramificado, que tiene de 2 a 30 átomos de carbono, representa un radical hidrocarburo que comprende uno o más dobles enlaces carbono-carbono y/o uno o más triples enlaces carbono-carbono. Como ejemplos de un radical hidrocarburo insaturado divalente se podrá mencionar particularmente:
- CH=CH-; -(CH2)m-CH=CH-(CH2)m-;
- (CH2)m-CH=CH-(CH2)m-CH=CH-(CH2)m-;
- (CH2)m-CH=CH-CH(C1-C7)-(CH2)m-;
- (CH2)m-CH(C1-C7)-(CH2)m-CH=CH-CH(C1-C7)-(CH2)m-;
- (CH2)m-CH(C1-C7)-CH=CH-(CH2)m-;
- (CH2)m-CH(C1-C7)-CH=CH-(CH2)m-CH=CH-(CH2)m-;
- (CH2)m-CH=CH-C(C1-C7)2-(CH2)m-;
- (CH2)m-CH=CH-C(C1-C7)2-(CH2)m-C(C1-C7)2-(CH2)m-CH=CH;
- (CH2)m-CH=CH-C(C1-C7)2-(CH2)m-CH(C1-C7)-(CH2)m-CH=CH;
- CEC-; -(CH2)m-CEC-(CH2)m-; -(CH2)m-C=C-(CH2)m-C=C-(CH2)m-;
- (CH2)m-CH=CH-CH(C1-C7)-(CH2)m-CEC-(CH2)m-CH(C1-C7)-;
- (CH2)m-CH=CH-C(C1-C7)2-(CH2)m-CEC-(CH2)m-C(C1-C7)2-(CH2)m-;
- (CH2)m-C=C-CH(C1-C7)-(CH2)m-CEC-(CH2)m-CH(C1-C7)-(CH2)m;
- (CH2)m-CEC-C(C1-C7)2-(CH2)m-CH=CH-(CH2)m-CH(C1-C7)-;
- (CH2)m-CH=CH-C(C1-C7)2-(CH2)m-CH(C1-C7)-(CH2)m-CEC-CH=CH-(CH2)m-;
con m como se definió anteriormente.
Según la invención, el término "sistema" cíclico o heterocíclico significa, según el caso, el radical monovalente o divalente que proviene de un compuesto cíclico o heterocíclico, saturado o insaturado, como tal.
Entonces cuando L1 representa un sistema cíclico o heterocíclico, será más precisamente un radical monovalente derivado de un compuesto cíclico o heterocíclico, saturado o insaturado.
Cuando L representa un radical hidrocarburo saturado o insaturado que incluye uno o más grupos -CH2-, -CH=CH-y/o -C=C- es (son) reemplazado(s) independientemente entre sí por un sistema cíclico o heterocíclico, saturado o insaturado, entonces dicho sistema cíclico o heterocíclico es un radical divalente derivado de un compuesto cíclico o heterocíclico, saturado o insaturado.
A modo de ejemplo de un compuesto cíclico o heterocíclico, saturado o insaturado, será posible mencionar particularmente azetidina, oxetano, tietano, pirrol, piranosa, furanosa, furano, pirrolina, tetrahidrofurano, tiofeno, tetrahidrotiofeno, pirazol, imidazol, oxazol, isoxazol, pirazolina, imidazolina, pirazolidina, imidazolidina, dioxolano, tiazol, isotiazol, tiazolidina, isoxazolidina, triazol, oxadiazol, tiadiazol, tiosuccinimida, tetrazol, piridina, naftiridina, ftalimida, pirano, dihidropirano, piperidina, piridazina, piridinio, pirimidina, purina, pirazina, pteridina, oxazina, dioxina, piperazina, maleimida, morfolina, dioxano, tiazina, tiomorfolina, oxatiano, ditiano, triazina, trioxano, tiadiazina, ditiazina, tritiano, 3-ciclobuteno-1,2-diona, ciclobutano, ciclobuteno, ciclopentano, ciclopenteno, ciclohexano, ciclohexeno, cicloheptano, ciclohepteno, benceno, tolueno, naftaleno, indeno, indano, indolizina, indol, benzofurano, indolina, benzotiofeno, indazol, bencimidazol, benztiazol, tetralina, quinolina, cromeno, cromano, cinolina, quinazolina, quinoxalina, ftalazina.
Según la invención, y como se indicó anteriormente, dicho radical hidrocarburo divalente saturado o insaturado, lineal o ramificado, y dicho sistema cíclico o heterocíclico, saturado o insaturado, también pueden estar sustituidos con uno o más sustituyentes seleccionados entre alquilo C1-C7, alquenilo C2-C7 , alquinilo C2-C7, arilo, o por grupos funcionales.
Los ejemplos de grupos funcionales que pueden mencionarse incluyen funciones alcohol, amina, amida, cetona, éster, éter, tioéter o ácido carboxílico.
El término alquenilo C2-C7 designa un radical hidrocarburo, lineal o ramificado, que tiene de 2 a 7 átomos de carbono y que tiene uno o más dobles enlaces carbono-carbono.
El término alquinilo C2-C7 designa un radical hidrocarburo, lineal o ramificado, que tiene de 2 a 7 átomos de carbono y que tiene uno o más enlaces triples carbono-carbono.
El término arilo designa un sistema de hidrocarburo aromático mono-, bi- o tricíclico, que tiene de 6 a 18 átomos de carbono. A modo de ejemplo, se puede mencionar fenilo (C6H5), bencilo (C6H5CH2), fenetilo (C6H5CH2CH2), tolilo (C6H4CH3), xililo (C6H3(CH3)2), bencilideno (C6H5CH=CH), benzoílo (C6H5CO), bifenilo (o difenilo) (C12H9 ), naftilo (C10H7).
De acuerdo con una realización de la invención, en el compuesto de fórmula (1) como se definió anteriormente:
L representa:
◦-NH2, -(CH2)ni-CH=CH2 o -(CH2)ni-CECH, con ni como se definió anteriormente (número entero que varía de 0 a 4), entonces en cada uno de estos casos Li está ausente,
◦ un radical hidrocarburo divalente saturado, lineal o ramificado, sustituido o no sustituido, que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, un radical hidrocarburo divalente insaturado, lineal o ramificado, sustituido o no sustituido, que tiene de 2 a 10 átomos de carbono,
◦ un radical hidrocarburo divalente saturado o insaturado como se definió anteriormente, en que uno o más grupos -CH2-, -CH=CH- y/o -C=C- del radical hidrocarburo saturado o insaturado es(son) reemplazado(s) independientemente entre sí por:
◦◦ un grupo -O-; -NH-; -S-; -CO-NH-; -NH-CO-O-; y/o
◦◦ un sistema cíclico o heterocíclico elegido entre:
L1 representa:
-(CH2)n1-CH=CH2; -(CH2)n1-CECH; -(CH2)n1-N3; -(CH2)n1-SH; -(CH2)n1-NH2; -(CH2)n1-N=C=O; -(CH2)n1-N=C=S; -(CH2)n1-O-NH2 ; -(CH2)n1-NHCO-CH2Hal; -(CH2)n1-COOH; -(CH2)rnCOOR1; -(CH2)n1-CO-NH-NH2 ; -(CH2)n1-H; un halógeno seleccionado entre F, Cl, Br o I;
◦ un sistema cíclico o heterocíclico elegido entre:
con ni, Ri y Hal como se definió anteriormente.
A modo de ejemplos de compuestos de fórmula (I) como se definió anteriormente, se pueden mencionar aquellos para los que:
◦ el sustituyente L se elige entre:
"" -CH=CH2 , -CeCH o -NH2 entonces en cada uno de estos casos Li está ausente,
◦◦ -CH2-; -CH2-CH2-; -(CH2)3-; -(CH2)4-; -(CH2)5-; -CH2-CH2-O-CH2CH2-; -(CH2-CH2-O)2-CH2-CH2-; -CH2-CH2-S-CH2-CH2-; -CH2-CH2-S-CH2-CH2-O-CH2-CH2-;
y
◦ el sustituyente Li se elige entre:
◦◦ -CH=CH2 ; -C=CH; -N3 ; -SH; -NH2 ; -N=C=O; -N=C=S; -O-NH2; -NHCO-CH2Cl; -COOH; -COORi ; -CO-NH-NH2 , un halógeno seleccionado entre F, Cl, Br o I,
◦◦ un sistema cíclico o heterocíclico elegido entre:
con Ri como se definió anteriormente.
Un compuesto de fórmula (I) en donde n es igual a i es un disacárido, y más particularmente un di-manósido multifuncionalizado que corresponde a la fórmula:
Un compuesto de fórmula (I) en donde n es igual a 2 es un trisacárido, y más particularmente un tri-manósido multifuncionalizado que corresponde a la fórmula:
Un compuesto de fórmula (I) en donde n es igual a 3 es un compuesto de tetrasacárido, y más particularmente un tetra-manósido multifuncionalizado que corresponde a la fórmula:
La invención también se refiere a un método para preparar un compuesto de fórmula (I) como se definió anteriormente, caracterizado por que el compuesto de partida utilizado es un compuesto de fórmula (II):
en donde P1, n, A, L y Li, son como se definieron anteriormente.
Estos compuestos son muy ventajosos porque permiten particularmente preparar compuestos de fórmula (I) en un número limitado de etapas y con un buen rendimiento.
El objeto de la invención es, por lo tanto, también un compuesto correspondiente a la fórmula general (II):
en donde P1, n, A, L y Li son como se definieron anteriormente.
La preparación del compuesto de fórmula (II) se realiza por reacción entre un aceptor de glucósido (IV) o (IVbis) con un donante de glucósido (V), según uno de los esquemas de reacción a continuación:
Los compuestos de la invención de fórmula (I) son particularmente ventajosos porque permiten, por un lado, dirigirse a RM6P-CI con una afinidad muy alta y, por otro lado, porque son capaces de formar enlaces covalentes a nivel del grupo LLi con una gran cantidad de compuestos de interés ®.
La presente invención también se refiere a un conjugado formado entre un compuesto de interés © y el compuesto de fórmula (I).
La invención, por lo tanto, también se refiere a un conjugado caracterizado por que corresponde a la fórmula general (III):
en donde X, P1, n, A y L son como se definieron anteriormente,
Li' representa el sustituyente Li como se definió anteriormente implicado en un enlace covalente con un grupo funcional llevado por un compuesto de interés ©, dicho compuesto de interés © siendo seleccionado entre enzimas, nanopartículas, proteínas, anticuerpos o agentes citotóxicos.
De acuerdo con una realización de la invención, el conjugado de fórmula (III) como se definió anteriormente tiene un
valor CI50 para el receptor de mañosa 6-fosfato independiente de catión (RM6P-CI) de al menos 10-5 M, y preferentemente de 10-6 a 10-9 M.
Por valor de CI50 se entiende la concentración de compuestos capaces de inhibir la unión de RM6P-CI a su ligando, pentamanosa 6-fosfato (PMP), previamente adsorbido.
Como ejemplos más específicos del compuesto de interés ®, se puede mencionar una enzima lisosómica como una nanopartícula, especialmente una nanopartícula de sílice.
De acuerdo con una realización de la invención, la nanopartícula puede incorporar un fotosensibilizador neutro de tipo porfirina.
Como ejemplos de enzimas lisosómicas, se podrán mencionar las elegidas entre alfa glucosidasa ácida, betagalactosidasa-1 ácida, esfingomielinasa ácida, alfa-D-manosidasa, alfa-fucosidasa, alfa-galactosidasa A, alfaglucosaminida acetiltransferasa, alfa-glucosidasa, alfa-L-iduronidasa, alfa-N-acetilgalactosaminidasa, alfaacetilglucosaminidasa, alfa-D-neuraminidasa, arilsulfatasa A, arilsulfatasa B, beta-galactosidasa, betaglucuronidasa, beta-manosidasa, catepsina D, catepsina K, ceramidasa, cistinosina, factor de activación del gangliósido GM2, galactocerebrosidasa, glucocerebrosidasa, heparán sulfatasa, hexosaminidasa A, hexosaminidasa B, hialuronidasa, iduronato-2-sulfatasa, LAMP2, lipasa de ácido lisosómico, N-acetilglucosamina-1-fosfotransferasa, N-acetilgalactosamina 6-sulfatasa, N-acetilglucosamina-1-fosfotransferasa, N-acetilglucosamina-6-sulfato sulfatasa, N-aspartilbeta-glucosaminidasa, palmitoil-tioesterasa-1, fosfatasa ácida, proteína protectora/catepsina A (PPCA), sialina, tripeptidil peptidasa 1.
Dichas enzimas se obtienen por ingeniería genética en sistemas de producción que permiten obtener proteínas recombinantes biológicamente activas y funcionales. Por ejemplo, para la producción de glucoproteínas lisosómicas, se utiliza el sistema de baculovirus/células de insecto sf9.
La invención también se refiere al uso de al menos un compuesto de fórmula (I) como se definió anteriormente, para formar al menos un enlace covalente con al menos un grupo funcional portado por un compuesto de interés ®, dicho compuesto de interés ® siendo seleccionado entre enzimas, nanopartículas, proteínas, anticuerpos o agentes citotóxicos.
Según una realización ventajosa de la invención, los compuestos de fórmula (I) pueden reaccionar con uno o varios grupo(s) funcional(es) portado(s) por dicho compuesto de interés Y, siendo n' un número entero que varía de 1 a 1000, y preferentemente de 1 a 100, para formar enlaces covalentes.
Por lo tanto, la invención también se refiere al uso de uno o varios compuestos de fórmula (I) para formar un enlace o enlaces covalentes con un grupo o grupos funcionales del compuesto de interés, con n 'como se definió anteriormente.
El objeto de la invención es también el uso de uno o más compuestos de fórmula (I) como se definió anteriormente para formar el conjugado de fórmula general (IIIbis):
en donde P1, X, n, n', A, L, L' 1 y ® son como se definieron anteriormente.
Cuando n' es un número entero igual a 1, entonces el conjugado de fórmula general (III) y el conjugado de fórmula general (IIIbis) son idénticos.
El término conjugado de fórmula general (III) se refiere a un polisacárido de fórmula (I) unido covalentemente a nivel de su grupo L-, con un grupo funcional del compuesto de interés ®.
El término "conjugado de fórmula general (IlIbis)" se refiere, cuando n' no es igual a 1, a al menos dos polisacáridos de fórmula (I) unidos covalentemente con al menos dos grupos funcionales del compuesto de interés ®.
Por ejemplo, cuando el compuesto de interés ® es una nanopartícula, el conjugado (IIIbis) puede comprender 100 polisacáridos de fórmula (I) que forman respectivamente 100 enlaces covalentes con 100 grupos funcionales portados por la nanopartícula.
El grupo LL1 de los compuestos (I) de la invención son como se definieron anteriormente y son capaces de unirse mediante un enlace covalente, directamente o después de la activación, a al menos una de las funciones presentes naturalmente o introducidas artificial en el compuesto de interés ®.
Como se mencionó anteriormente en la definición de los sustituyentes L y L1, el sustituyente LL1 de los compuestos (I) de la invención puede comprender particularmente un grupo reactivo elegido entre ácido carboxílico y sus sales, cloruro de ácido, éster (éster de alquilo, éster de p-nitrofenilo, éster de succinimidilo, éster de sulfosuccinimidilo, etc.), azido (acil azida, azidonitrofenilo, etc.), hidrazida, 3-acil-1,3-tiazolidina-2-tiona, amina sustituida o no, O-alquiloxiamina, amonio cuaternario, isocianato, isotiocianato, hidracina, ftalimido, maleimida, haloacetamida, monoclorotriazina, diclorotriazina, piridina mono- o dihalogenada, tiol, cloruro de sulfonilo, sulfona, disulfuro, hidroxilo, epóxido o imidazolilo.
En una realización particular, el sustituyente LL1 comprende un grupo carbonilo reactivo seleccionado entre acil hidrazida, hidrazina u O-alquiloxiamina. La reacción entre dicha acilhidrazida, hidrazina u O-alquiloxiamina con un grupo carbonilo del compuesto de interés ® conduce respectivamente a un enlace acilhidrazona, hidrazona o un enlace de oxima. Este tipo de grupos químicos generalmente es útil para unir glicoproteínas (compuesto de interés ®): los grupos carbonilo (ya sea de naturalmente presentes o inducidos por la oxidación de las funciones hidroxilo de las cadenas de glicosilo de la glicoproteína) disponibles en los fragmentos de oligosacáridos de la glicoproteína se hacen reaccionar con los grupos carbonilo reactivos de los compuestos (I) de la invención.
Como ejemplos más particulares:
- funciones carbonilo del compuesto de interés ® pueden reaccionar con las funciones O-alquilamina o acilhidrazida del compuesto (I) (es decir, Li= -O-NH2 o-CO-NH-NH2) para conducir a la formación de oxima o enlaces de acilhidrazona;
- funciones de amina del compuesto de interés ® pueden reaccionar con funciones de escuarato de etilo o éster activado del compuesto (I) (es decir, por ejemplo L1 =
o -COOH activado con N-hidroxisuccinimida (NHS) o con hidroxibenzotriazol (HOBt)) para conducir a la formación de enlaces escuarato o enlaces amida;
- funciones tiol del compuesto de interés ® pueden reaccionar con las funciones tiol, disulfuro, maleimida del compuesto (I) (es decir, Li= -SH, -S-S-R1 con R1 alquilo C1-C5),
para conducir a la formación de enlaces disulfuro o tioleno;
- funciones alquino o azida del compuesto de interés ® pueden reaccionar respectivamente con una función azida del compuesto (I) (es decir, Li= N3) o alquino (es decir, Li= -C=CH) para conducir a la formación de un triazol (que implica una reacción de cicloadición entre la azida y el alquino).
Según la invención, la elección del sustituyente LL1, del compuesto (I) dependerá de la naturaleza del compuesto de interés ® y los grupos funcionales portados por este último.
En efecto, los expertos en la materia entienden fácilmente que la longitud del sustituyente LL1 aumentará con el impedimento estérico asociado al compuesto de interés ® que debe unirse.
Por ejemplo, si el compuesto de interés © es una proteína o glicoproteína, entonces un sustituyente LLi que no tiene más de 2 o 3 átomos consecutivos será suficiente para asegurar una afinidad satisfactoria entre el compuesto (I) y RM6P-CI.
Por el contrario, si el compuesto de interés © es una proteína o nanopartícula que provoca un impedimento estérico significativo en la proximidad de los sitios de enlace M6P del RM6P-CI, entonces un sustituyente LLi que comprende más de 2 o 3 átomos consecutivos será necesario para asegurar una afinidad satisfactoria entre el compuesto (I) y RM6P-CI.
La presente invención también se refiere a un método para preparar un conjugado de fórmula (III) como se definió anteriormente o un conjugado de fórmula (IIIbis) como se definió anteriormente, caracterizado por que se hacen reaccionar:
- al menos un grupo funcional portado por un compuesto de interés ©, dicho compuesto de interés siendo como se definió anteriormente, con
- al menos un compuesto correspondiente a la fórmula (I):
en donde P1, X, n, A, L y Li, son como se definieron anteriormente.
De acuerdo con una realización de la invención, se hará reaccionar por ejemplo un compuesto de fórmula (I) como se definió anteriormente, en donde P1 representa un hidrógeno, y X, n, A, L, Li son como se definieron anteriormente, con al menos un grupo funcional portado por el compuesto de interés © como se definió anteriormente.
Otro objeto de la invención se refiere a un conjugado de fórmula (III) como se definió anteriormente o un conjugado de fórmula (IIIbis) como se definió anteriormente:
- para su uso en un método de tratamiento terapéutico del cuerpo humano o animal, particularmente elegido entre enzimoterapia sustitutiva, terapia fotodinámica o tratamiento del cáncer, y/o
- para su uso en un método de diagnóstico, particularmente de diagnóstico de enfermedades o afecciones asociadas a un aumento o disminución de la expresión de RM6P-CI.
En efecto, debido a su alta afinidad por RM6P-CI, los conjugados (III) y (IIIbis) de la invención son particularmente útiles para el diagnóstico de enfermedades relacionadas con la expresión de RM6P-CI.
Cuando el compuesto de interés © es una nanopartícula que incorpora un fotosensibilizador de tipo porfirina, entonces el conjugado de la invención de fórmula (III) o (IIIbis) será particularmente adecuado para la terapia fotodinámica.
Como ejemplos de enfermedades que pueden tratarse con el conjugado (III) o (IIIbis) de la invención, se pueden mencionar las enfermedades causadas por una deficiencia del compuesto de interés © en el lisosoma. Esta deficiencia puede compensarse mediante la administración del conjugado de la invención, que es capaz de administrar específicamente al lisosoma el compuesto de interés © deficiente.
Descripción de las figuras
La invención se entenderá mejor a la luz de los siguientes ejemplos no limitantes y puramente ilustrativos, y las Figuras 1 y 2 siguientes.
La figura 1 es una comparación de la citotoxicidad de los disacáridos de fosfonato 18, 19 (es decir, M6Pn-a(1,2)-Man-Etil-NH2 y M6Pn-a(1,2)-Man-EtilSq) y carboxilatos 24 y 25 (es decir, M6C-a(1,2)-Man-Etil-NH y M6C-a
(1,2)-Man-EtilSq) de fórmula (I) de la invención en células LNCaP y sus respectivos homólogos de monosacáridos.
La figura 2 representa los efectos fototóxicos, en células LNCaP, nanopartículas de sílice solas (MSN) y nanopartículas de sílice (MSN) injertadas en análogos carboxilatos monosacárido (M6C-EtilSq) y disacárido 25 (M6C-a(1,2)-Man-EtilSq) en diferentes tiempos de incubación. Las nanopartículas injertadas en el análogo carboxilato monosacárido y en el análogo carboxilato disacárido están representadas respectivamente por "MSN-M6C-EtilSq" y "MSN-M6C-a(1,2)-Man-EtilSq".
La figura 3 indica el ensayo de la actividad catalítica de GAA en mioblastos de pacientes con la forma adulta de la enfermedad de Pompe después de incubación durante 48 h en presencia de rhGAA 50 nM o el conjugado de fórmula (III) de la invención, es decir, el conjugado rhGAA-M6pn-a(1,2)-Man-Etiloxiamino (28) (denominado rhGAA-M6pn28 en la fig. 3).
La figura 4 presenta el análisis de las cantidades de GAA maduro por transferencia de Western con un anticuerpo anti-GAA humano (anti-LYAG, Genetex) o anti-actina humana (Invitrogen) después de incubación de mioblastos durante 48 h en presencia de rhGAA 50 nM o el conjugado de fórmula (III) de la invención, es decir, el conjugado rhGAA-M6Pn-a(1,2)-Man-Etiloxiamino (28) (denominado rhGAA-M6Pn28 en la fig. 4).
Descripción detallada de la invención
Ejemplo 1:
Síntesis de compuestos de fórmula (I)
Este ejemplo describe la preparación de disacáridos multifuncionalizados correspondientes a la fórmula (I) en donde n es un número entero igual a 1; P1 representa independientemente entre sí H, (CH3)3Si- o C6H5CH2-; -------representa un enlace sencillo o doble; X representa el grupo fosfonato o el grupo carboxilato con Z representando independientemente entre sí H, etilo, Na; A representa oxígeno; L representa -CH2CH2-; Li representa -Br, -NH2 , -N3,
1) Preparación de disacáridos. 9, 10, 11 y 12 que responden a la fórmula (II)
a) Preparación de un aceptor de sacárido 6: 3,4,6-tri-O- bencil-a-D-manopiranósido de 2-bromoetilo
El método para preparar un compuesto aceptor de sacárido 6 según la fórmula general (IVbis), en donde P1 representa Bn, A representa O, L representa CH2-CH2 y Li representa Br, se ilustra a continuación:
El compuesto de partida es a-D-manosa pentaacetilada sobre la que se introduce un bromo anomérico usando ácido bromhídrico al 33 % en ácido acético para formar el compuesto. 1. el intermedio 1 luego se hace reaccionar con 2-bromoetanol y 2,6-lutidina para formar el ortoéster 2 con un rendimiento del 63 % en dos etapas. Los acetatos presentes en las posiciones 3, 4 y 6 del ortoéster 2 luego se saponifican para conducir al intermedio 3 con un rendimiento del 82 %. Esta etapa de desprotección es total y no requiere purificación. Estas mismas posiciones 3, 4 y 6 luego se bencilan por la acción del bromuro de bencilo para formar el compuesto 4 con un rendimiento del 56 %. El ortoéster 4 luego se abre en presencia de BF3.Et2O y 2-bromoetanol para formar el intermedio clave 5 con un rendimiento del 75 %. El compuesto 5 se funcionaliza así en la posición anomérica y lleva un grupo protector en la posición 2 ortogonal a los grupos de las posiciones 3, 4 y 6. Por tanto es posible desproteger selectivamente esta posición 2 con la ayuda de una solución de sosa para obtener el intermedio 6 con un rendimiento del 82 %.
El aceptor sacárido 6 está funcionalizado en posición anomérica: el sintón 6 por lo tanto, será común independientemente del disacárido de fórmula (II) deseado.
Condiciones y reactivos: (i) HBr 33 %, AcOH, TA, 1h; (ii) 2-bromoetanol, 2-6-lutidina, DCM, 40 °C, 3h; (Ni) NaOH 1 N, THF, TA, 16h; (iv) BnBr, NaH, DMF, TA, 21h; (v) 2-bromoetanol, BFa.Et2O, TA, 1h30; (vi) NaOH 1 N, THF, TA 21 h.
Parte experimental
Preparación de 1-bromo-2.3.4.6-tetra-Q-acet¡l-a-D-manop¡ranosa 1:
Se disuelven 10 g de a-D-manosa pentaacetato en 20 ml de una solución de ácido bromhídrico al 33 % en ácido acético. La solución amarilla se agita durante 1 h a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se enfría a 0 °C, se diluye con 30 ml de CH2Cl2 y se neutraliza con solución saturada de NaHCO3. La fase acuosa se extrae con CH2Cl2 (5x100 ml). Las fases orgánicas se combinan, se secan en MgSO4 y se concentran para conducir al compuesto 1 (11,9 g) que se usa para la siguiente etapa sin purificación.
Fórmula química 1: C-MH-igBrOg
Masa exacta: 410,02 g.moM
Rf: 0,76 [AcOEt/Ciclo (1:1)]
Preparación de 1,2-Q-(1-(2-bromoetox¡)et¡l¡den)-3.4.6-tr¡-Q-acet¡l-a-D-manop¡ranosa 2:
Se añaden 11,08 g (1 eq; 26,9 mmol) del compuesto 1 se disuelven en 9,5 ml de CH2Cl2 y 9,4 ml (3 eq; 80,7 mmol) 2,6-lutidina. 4,8 ml (2,5 eq; 67,25 mmol) de 2-bromoetanol. El medio de reacción naranja se calienta a 40 °C y se agita durante 4 horas. Se forma un precipitado blanco. La solución se enfría a temperatura ambiente y se añaden 12 ml de Et2O. El precipitado se filtra. El filtrado se diluye con 30 ml de CH2Cl2 y se lava sucesivamente con 30 ml de agua, 30 ml de solución saturada de NaHCO3 y 30 ml de salmuera. Las fases acuosas combinadas se extraen con 50 ml de CH2Cl2. Las fases orgánicas se combinan y luego se secan sobre MgSO4 y se concentran. El residuo obtenido se disuelve en 20 ml de CH2Cl2 y se añaden 25 ml de etanol. La solución se enfría a -30 °C para producir el compuesto 2 en forma de cristales blancos con un rendimiento del 51 % (6,268 g, 13,8 mmol) en dos etapas.
Fórmula química 2: C16H23BrO10
Masa exacta: 454,05 g.moM
Rf: 0,49 [Ciclo/AcOEt (1:1)]
SM, ESI+ m/z: 477 [M+Na]+
Preparación de 1.2-Q-(1-(2-bromoetox¡)et¡l¡den-a-D-manop¡ranosa 3:
4,79 g (1 eq; 10,6 mmol) del compuesto 2 se disuelven en 22 ml de THF. Se añaden 43 ml de una solución acuosa de NaOH 1 N. La solución se vuelve turbia. Se añaden 2 ml de metanol y la solución se vuelve transparente. La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante 16 h. Se añaden 250 ml de acetato de etilo y la fase acuosa se extrae con 3x200 ml de acetato de etilo. Las fases orgánicas se combinan y luego se secan sobre MgSO4 y se concentran. El residuo obtenido se purifica por cromatografía ultrarrápida automatizada sobre gel de sílice (CH2Cl2/MeOH: de 0 a 5 % en 15 min; 5 % durante 10 min; de 5 a 10 % durante 15 minutos) para producir el compuesto 3 como un aceite incoloro con un rendimiento del 82 % (2,86 g, 8,69 mmol).
Fórmula química 3: C10H17BrO7
Masa exacta: 328,02 g.mol-1
Rf: 0,36 [CH2Cl2/MeOH (9:1)]
SM, ESI- m/z: 373 [M-H+HCOOH]-
Preparación de 1.2-0-(1-(2-bromoetox¡)et¡l¡den-3.4.6-tri-0-benc¡l-a-D-manop¡ranosa 4
2,86 g (1 eq; 8,69 mmol) del compuesto 3 se d¡suelven en 40 ml de DMF. Se añaden 4,2 ml (4 eq; 34,76 mmol) de bromuro de benc¡lo. La mezcla de reacc¡ón se enfría a 0 °C y se añaden 874 mg (3 eq; 26 mmol) de d¡spers¡ón de NaH al 60 % en ace¡te. Después de 17h30 de ag¡tac¡ón a temperatura amb¡ente, queda algo de producto parc¡almente benc¡lado. La ad¡c¡ón de un equ¡valente de bromuro de benc¡lo y NaH no hacer evoluc¡onar la reacc¡ón. Se añaden 50 ml de Et2O y 40 ml de agua. La fase acuosa se extrae con 2x100 ml de Et2O. Las fases orgán¡cas se comb¡nan, se lavan con 5x80 ml de agua y luego se secan sobre MgSO4 y se concentran. El res¡duo obten¡do se pur¡f¡ca por cromatografía ultrarráp¡da automat¡zada sobre gel de síl¡ce (c¡clohexano/Et2O: de 0 a 10 % en 15 m¡n; 10 % durante 10 m¡n; del 10 al 20 % en 15 m¡n; 20 % durante 50 m¡n; 20 a 40 % en 30 m¡n) para conduc¡r al compuesto 4 como un sól¡do blanco con un rend¡m¡ento del 56 % (2,92 g, 4,87 mmol).
Fórmula quím¡ca 4: C31H35BrO7
Masa exacta: 598,16 g.mol'1
Rf: 0,43 [C¡clo/Et2O (1: 1)]
SM, ESI+ m/z: 621 [M+Na]+
Preparac¡ón de 2-0-(3-acet¡l-3.4.6-tr¡-0-(3-benc¡l-a-D-manop¡ranós¡do de 2-bromoet¡lo 5
1 g (1 eq; 1,67 mmol) del compuesto 4 se d¡suelve en 20 ml de CH2Cl2. Se añaden 236 pl (2 eq; 3,34 mmol) de 2-bromoetanol y la mezcla de reacc¡ón se ag¡ta a temperatura amb¡ente durante 10 m¡n. 211 pl (1 eq; 1,67 mmol) de BF3.Et2O. La mezcla de reacc¡ón se ag¡ta a temperatura amb¡ente durante 16 h. La soluc¡ón se vuelve de color amar¡llo pál¡do. La reacc¡ón se d¡luye con 50 ml de soluc¡ón saturada de NaHCO3. La fase acuosa se extrae con 3x50 ml de CH2Cl2. Las fases orgán¡cas se comb¡nan, se lavan con 100 ml de salmuera y luego se secan sobre MgSO4 y se concentran. El res¡duo obten¡do se pur¡f¡ca por cromatografía ultrarráp¡da automat¡zada sobre gel de síl¡ce (c¡clohexano/Et2O: 0 a 30 % en 30 m¡n; 30 % durante 20 m¡n) para conduc¡r al compuesto 5 como un ace¡te ¡ncoloro con un rend¡m¡ento del 75 % (750 mg; 1,25 mmol).
Fórmula quím¡ca 5:C31H35BrO7
Masa exacta: 598,16 g.mol-1
Rf: 0,45 [C¡clo/Et2O (1: 1)]
SM, ESI+ m/z: 621 [M+Na]+
Preparac¡ón de 3.4.6-tr¡-0-benc¡l-a-D-manop¡ranós¡do de 2-bromoet¡lo 6:
750 mg (1 eq; 1,25 mmol) del compuesto 5 se d¡suelven en 1,6 ml de THF. Se añaden 2,5 ml (2 eq; 2,5 mmol) de una soluc¡ón de NaOH 1 N. La soluc¡ón se vuelve turb¡a. La soluc¡ón se ag¡ta a temperatura amb¡ente durante 21 h. La soluc¡ón se neutral¡za con soluc¡ón de HCl 1 N. Se añaden 40 ml de CH2Cl2. La fase acuosa se extrae con 3x40 ml de CH2Cl2. Las fases orgán¡cas se comb¡nan y luego se secan sobre MgSO4 y se concentran. El res¡duo obten¡do se pur¡f¡ca por cromatografía ultrarráp¡da automat¡zada sobre gel de síl¡ce (c¡clohexano/Et2O: de 0 a 20 % en 15 m¡n; 20 % durante 10 m¡n; del 20 al 30 % en 15 m¡n; 30 % durante 15 m¡n) para conduc¡r al compuesto 6 como un ace¡te
incoloro con un rendimiento del 82 % (575 mg; 1,03 mmol).
Fórmula química 6:C29H33BrO6
Masa exacta: 556,16 g.mol-1
Rf: 0,29 [Ciclo/Et2O (7:3)]
SM, ESI+ m/z: 579 [M+Na]+
b) Preparación de un dador de sacárido 8: tricloroacetimidato de 2.3.4.6-tetra-O-acetil-a-D-manopiranosa
El método para preparar un compuesto dador de sacárido 8 que responde a la fórmula general (V), en donde P1 representa Ac, se ilustra a continuación:
El compuesto de partida es a-D-manosa pentaacetilada que se desprotege en la posición anomérica usando morfolina para dar el compuesto 7 sin purificación. El tricloroacetimidato 8 luego se forma por reacción del compuesto 7 con tricloroacetonitrilo en presencia de DBU.
Condiciones y reactivos: (i) morfolina, DCM, reflujo, 3h30; (ii) CbCCN, DBU, DCM, TA, 4 h.
Parte experimental
Preparación de 2.3.4.6-tetra-O-acet¡l-D-manosa 7:
3 g (1 eq; 7,69 mmol) de a-D-manosa pentaacetato se disuelven en 18 ml de CH2Cl2. Se añaden 2,7 ml (4 eq; 30,76 mmol) de morfolina. La mezcla de reacción se calienta a reflujo durante 3h30 y luego se enfría a temperatura ambiente. La solución se neutraliza con una solución de HCl 1 N. La fase orgánica se lava con 3x10 ml de agua, se seca sobre MgSO4 y se concentra para producir el producto 7 como un aceite amarillo usado directamente para la siguiente etapa.
Fórmula química 7: C14H20O10
Masa exacta: 348,30 g.mol'1
Rf: 0,38 [Ciclo/AcOEt (1:1)]
SM, ESI- m/z: 393 [M-H+HCOOH]-Preparación de tricloroacetimidato de 2.3.4.6-tetra-O-acet¡l-a-D-manop¡ranosa 8:
1,34 g (1 eq; 3,85 mmol) del compuesto 7 se disuelven en 8 , 6 ml de CH2Cl2. La solución amarilla se enfría a 0 °C. Se añaden 2,7 ml (7 eq; 26,95 mmol) de tricloroacetonitrilo y 575 pl de DBU (1,8-diazabiciclo[5.5.0]undec-7-eno). La solución se vuelve marrón. El medio de reacción se agita durante 4 h a temperatura ambiente y luego se concentra. El residuo obtenido se purifica por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice (ciclohexano/Et2O: 50 % durante 25 min) para conducir al producto 8 como un aceite amarillo pálido con un rendimiento del 45 % (860 mg; 1,75 mmol). El producto relativamente inestable se usa rápidamente.
Fórmula química 8: C16H20CI3NO10
Masa exacta: 492,69 g.mol-1
Rf: 0,4 [Ciclo/Et2O (3:7)]
c) Preparación de los disacáridos 9, 10, 11 y 12
El método para preparar los disacáridos 9, 10, 11 y 12 que responden a la fórmula (II) se ilustra a continuación:
La reacción de glicosilación entre el aceptor de fórmula IV o IVbis, especialmente el sacárido 6, y el dador de fórmula V, especialmente el sacárido 8, permite obtener el compuesto de fórmula (II), especialmente el disacárido 12, queocupa una posición central en la estrategia de síntesis de la invención. En efecto, el compuesto de fórmula (II) permite divergir hacia todos los compuestos de fórmula (I) de la invención. Los análogos isostéricos de M6P de la invención (I) son de hecho accesibles desde el compuesto de fórmula (II).
El método de síntesis de la invención confiere flexibilidad en la producción de los análogos disacáridos de fórmula (I) de la invención, pero también a los análogos tri- o tetra-sacáridos de fórmula (I) de la invención.
Los respectivos compuestos "aceptor sacárido" 6 y "dador sacárido" 8 como se prepararon anteriormente, se hacen reaccionar en presencia de triflato de trimetilsililo para formar el disacárido 9 con un rendimiento del 60 %. Los grupos acetato se saponifican luego para producir el compuesto 10 con un rendimiento del 74 %. Los alcoholes desprotegidos así se trimetilsililan por la acción del cloruro de trimetilsililo para formar el intermedio 11. La posición 6 luego se desilila selectivamente en presencia de carbonato potásico en metanol para dar el disacárido 12 con un rendimiento del 81 % en dos etapas.
Condiciones y reactivos: (i) TMSOTf, DCM, -30 °C, 30 min; (ii) NaOH 1 N, THF, TA, 18h; (iii) TMSCl, NEt3, DCM, TA, 18h; (iv) K2CO3, MeOH, TA, 1h45.
Parte experimental
Preparación de 2.3.4.6-tetra-0-acetil-a-D-manopiranosil-(1^2)-3.4.6-tri-0-bencil-a-D-manopiranósido bromoetilo 9:
430 mg (1 eq; 0.77 mmol) del compuesto 6 y 860 mg (2.27 eq; 1.75 mmol) del compuesto 8 se disuelven en 15 ml de CH2Cl2 en presencia de 7 g de tamiz molecular 4Á previamente activado. El medio de reacción se agita durante 30 min a temperatura ambiente y luego se enfría a -30 °C. 167 pl (1.2 eq; 0.924 mmol) de TMSOTf se añaden gota a gota. La mezcla de reacción se agita a -30 °C durante 1h15. El medio de reacción se neutraliza a continuación con 3.5 ml de piridina. Después de filtración sobre Celite. el filtrado se concentra y luego se coevapora con tolueno. El residuo (sólido amarillo pálido) obtenido se purifica por cromatografía ultrarrápida automatizada sobre gel de sílice (ciclohexano/Et2O: 30 % durante 110 min) para conducir al producto 9 como un aceite incoloro con un rendimiento del 64 % (441 mg; 0.497 mmol).
Fórmula química 9: C43H5iBrOi5
Masa exacta: 886,24 g.mol-1
Rf: 0,56 [Ciclo/Et2O (2:8)]
SM, ESI+ m/z: 909 [M+Na]+
Preparación de a-D-manopiranosil-(1^2)-3,4,6-tri-0-bencil-a-D-manopiranósido de bromoetilo 10:
5,84 g (1 eq, 6,58 mmol) del compuesto 9 se disuelven en 16 ml de THF. Se añaden 33 ml (5 eq, 32,9 mmol) de una solución de sosa 1 M. La solución se vuelve turbia. Se añaden 1,5 ml de metanol. La solución se agita a temperatura ambiente durante 18h y luego se neutraliza con una solución de HCl 1 M y se concentra. El residuo obtenido se purifica por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice (DCM/MeOH: 0 % (500 ml); 5 % (500 ml); 7 % (500 ml); 10 % (1 l)) para conducir al compuesto 10 en forma de espuma blanca con un rendimiento del 74 % (3,5 g, 4,86 mmol).
Fórmula química 10: C35H43B1O 11
Masa molar: 718,2 g.mol'1
Rf: 0,41 [DCM/MeOH (9:1)]
Preparación de 2,3,4,6-tetra-0-trimetilsilil-a-D-manopiranosil-(1^2) -3,4,6-tri-O-bencil-a-D-manopiranósido de bromoetilo 11:
3,4 g (1 eq, 4,72 mmol) del compuesto 10 se disuelven en 24 ml de DCM recién destilado y 19 ml (30 eq; 141,6 mmol) de trietilamina. La solución se enfría a 0 °C y 4,8 ml (8 eq; 37,8 mmol) de cloruro de trimetilsililo se añaden gota a gota. Después de agitar durante 18 h a temperatura ambiente, aún queda un poco de producto de partida. Se añaden 1,2 ml (2 eq; 9,44 mmol) de cloruro de trimetilsililo se añaden gota a gota. Después de 1h30 de agitación a temperatura ambiente, no hay evolución. La solución se concentra. El residuo rosa se disuelve en ciclohexano y se filtra sobre Celite. El filtrado se concentra para obtener el compuesto 11 en forma de un aceite marrón claro usado directamente para la siguiente etapa.
Fórmula química 11: C47H75BrOnS¡4
Masa molar: 1008,34 g.mol-1
Rf: 0,78 [Ciclo/Et2O (7:3)]
Preparación de 2,3,4-tri-0-trimetilsilil-a-D-manopiranosil-(1^2)-3,4,6-tri-0-bencil-a-D-manopiranósido de bromoetilo 12:
4,58 g (4,72 mmol; 1 eq) del compuesto 11 se disuelven en 65 ml de metanol recién destilado. Una solución de 6,5 mg (0,01 eq; 0,0472 mmol) de K2CO3 (concentración final = 0,63 mM) en 10 ml de metanol se añade gota a gota. La mezcla de reacción se agita durante 1 h45 a temperatura ambiente y luego se diluye con 200 ml de CH2Cl2 y se lava con 125 ml de salmuera. La fase acuosa se extrae con 260 ml de CH2Ch. Las fases orgánicas se combinan, se secan sobre MgSO4 y se concentran. El residuo obtenido (aceite marrón claro) se purifica por cromatografía sobre gel de sílice (ciclohexano/Et2O: 30 % (700 ml); 40 % (500 ml); 50 % (500 ml); 70 % (500 ml)) para producir el compuesto 12 (3,58 g, 3,82 mmol) como un líquido incoloro con un rendimiento del 81 % en 2 etapas. Fórmula química 12: C44H67BrOns¡3 Masa molar: 936,16 g.mol-1 Rf: 0,45 [Ciclo/Et2O (1: 1)] SM, ESI+ m/z: 959 [M+Na]+ 2) Preparación de disacáridos 14, 15, 16, 17, 18 y 19 que responden a la fórmula (I) en donde X representa el grupo fosfonato
El método para preparar disacáridos 14, 15, 16, 17, 18 y 19 que responden a la fórmula (I) en donde X representa el grupo fosfonato se ilustra a continuación:
El alcohol 12 obtenido como se describió anteriormente se oxida a aldehído usando peryodinano Dess-Martin para formar el compuesto 13. Este intermedio clave permitirá el acceso a diferentes disacáridos de fórmula (I).
Para sintetizar los disacáridos "fosfonato" de fórmula (I), el aldehído 13 se hace reaccionar con metilendifosfonato de tetraetilo, previamente desprotonado con hidruro sódico, para formar el compuesto 14 con un rendimiento del 75 % en dos etapas. Durante una etapa de hidrogenación catalítica, en presencia de paladio sobre carbono y para la cual el hidrógeno se genera in situ mediante la adición progresiva de trietilsilano, se reducen tanto el doble enlace como los tres bencilos y los grupos trimetilsililo se hidrolizan. Así se obtiene el compuesto 15, sin purificación, con un rendimiento cuantitativo. El átomo de bromo se sustituye luego con ftalimida potásica para formar el intermedio 16 con un rendimiento del 75 %. Las funciones alcohol se protegen con cloruro de trimetilsililo para dar el compuesto 17 con un rendimiento del 88 %. El intermediario 17 obtenido así, sin purificación se hace reaccionar con cloruro de trimetilsililo y yoduro sódico para formar fosfonato bis(trimetilsililado) mediante una reacción de tipo Rabinowitz. Este intermedio se convierte luego en ácido fosfónico por la acción de la hidrazina monohidratada en metanol que también desplazará los grupos trimetilsililo presentes en los alcoholes secundarios del azúcar y reaccionará con ftalimida para desproteger la función amina. Así se obtiene, en una sola etapa, el compuesto 18 desprotegido en la parte fosfonato, en los alcoholes de los dos azúcares y que portan la función amina en la posición anomérica con un rendimiento del 76 % en dos etapas. El compuesto 18 luego se hace reaccionar con escuarato de dietilo para formar el producto 19 con un rendimiento del 59 %.
Condiciones y reactivos: (i) peryodinano de Dess-Martin, DCM, TA, 4h (ii) metilendifosfonato de tetraetilo, NaH, THF, TA, 45min; (iii) Pd/C, EtsSiH, MeOH; (iv) ftalimida potásica, DMF, 60 °C, 40h; (v) TMSCl, NEta, DCM, DMF, TA, 24h; (vi)-a TMSCl, Nal, ACN, 35 °C, 1h; (vi)-b N2H4.H2O, MeOH, TA, 1h30; (vii) escuarato de dietilo, EtOH/H2O, NEfe. Parte experimental
Preparación de 2,3,4-0-trimetilsilil-a-D-mano-hexodialdopiranosil.(1^-2)-3,4,6-tri-0-bencil-a-D-manopiranósido de bromoetilo 13:
1 g (1 eq; 1,07 mmol) del compuesto 12 se disuelve en 24 ml de DCM en tamiz molecular. Se añaden 5,4 ml (1,5 eq; 1,6 mmol) gota a gota de una solución de peryodinano Dess-Martin 0,3 M en diclorometano. El medio de reacción se agita a temperatura ambiente durante 4 h y luego se diluye con 120 ml de Et2O. Se añaden 25 ml de solución saturada de NaHCO3 y 3,9 g de Na2S2O3. La solución se agita a temperatura ambiente durante 5 min. La fase acuosa se extrae con 3x125 ml de Et2O. Las fases orgánicas se combinan, se secan sobre MgSO4 y se concentran para conducir al compuesto 13 usado directamente para la siguiente etapa.
Fórmula química 13: C44H65BrOnSi3
Masa molar: 934,14 g.mol-1
Rr: 0,77 [DCM/Et2O (95:5)]
Preparación de 2,3,4-tri-0-trimetilsilil-6,7-didesoxi-7-dietoxifosfinil-aD-mano-hept-6-enopiranosil-(1^2)-3,4,6-tri-0-bencil-a-D-manopiranósido de bromoetilo 14:
90 mg (2,5 eq; 2,67 mmol) de dispersión de NaH al 60 % en aceite se disuelven en 16 ml de THF. Se añaden 530 ^l (2 eq; 2,14 mmoles) gota a gota de metilendifosfonato de tetraetilo. La mezcla de reacción se agita durante 45 min a temperatura ambiente y luego se añade a 998 mg (1 eq; 1,07 mmol) del compuesto 13 disuelto en 8 ml de THF. La solución se vuelve amarilla y luego se vuelve marrón. El medio de reacción se agita a temperatura ambiente durante 45 min y luego se diluye con 200 ml de CH2Cl2 y se lava con 2x40 ml de salmuera. La fase acuosa se extrae con 3x130 ml de CH2Cl2. Las fases orgánicas se combinan, se secan sobre MgSO4 y se concentran. El residuo obtenido (aceite marrón) se purifica por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice (DCM/Et2O: 0 % a 5 % en 15 min; 5 % durante 10 min; de 5 % a 10 % en 15 min; 10 % durante 10 min; 10 a 13 % en 15 min) para conducir al compuesto 14 como un aceite amarillo claro con un rendimiento del 76 % (864 mg; 0,81 mmol) en dos etapas.
Fórmula química 14: C49H76BrO13S13
Masa molar: 1068,25 g.mol-1
Rf: 0,26 [DCM/Et2O (95:5)]
Preparación de 6-desoxi-6-dietoxifosfinilmetilen-a-D-manopiranosil-(1^2)-a-D-manopiranósido de bromoetilo 15:
864 mg (0,81 mmol) del compuesto 14 se disuelven en 8,2 ml de metanol. Se añaden 130 mg (15 % másico) de paladio sobre carbono. 1,3 ml (8,1 mmol; 10 eq) de trietilsilano se añaden gota a gota durante 1h20. La suspensión se agita a temperatura ambiente durante 30 min y luego se filtra sobre Celite. El filtrado se evapora para producir el compuesto 15 con un rendimiento del 99 % (468 mg; 8,0 mmol).
Fórmula química 15: C-i9H36BrO-i3P
Masa exacta: 582,2 g.mol-1
Rf: 0,23 [DCM/MeOH (85:15)]
SM, ESI+ m/z: 583,1 [M+H]+
Preparación de 6-desoxi-6-dietoxifosfinilmetilen-a-D-manopiranosil-(1^2)-a-D-manopiranósido de ftalimidoetilo 16:
220 mg (0,38 mmol) del compuesto 15 se disuelven en 1,8 ml de DMF en tamiz molecular. Se añaden 119 mg (0,64 mmol; 1,7 eq) de ftalimida potásica. La suspensión se agita durante 40 h a 60 °C y luego se enfría a temperatura ambiente y se concentra. El residuo obtenido se purifica por cromatografía sobre gel de sílice (AcOEt/MeOH: 75/25) para conducir al compuesto 16 como un sólido incoloro con un rendimiento del 75 % (184 mg; 0,28 mmol).
Fórmula química 16: C27H40NO15P
Masa molar: 649,58 g.mol'1
Rf: 0,31 [AcOEt/MeOH (75:25)]
SM, ESI+ m/z: 650,3 [M+H]+
Preparación de 2,3,4-tri-0-trimetilsilil-6-desoxi-6-dietoxifosfinilmetilen-a-D-manopiranosil-(1^2)-3,4,6-tri-0-trimetilsilila-D-manopiranósido de ftalimidoetilo 17:
184 mg (0,28 mmol) del compuesto 16 se disuelven en 817 pl de DCM recién destilada y 1,15 ml (8,5 mmol; 30 eq) de trietilamina. El material de partida no es completamente soluble. 431 pl (3,4 mmol; 12 eq) de cloruro de trimetilsililo se añaden gota a gota. La solución se agita a temperatura ambiente durante 15 h. El producto de partida
todavía no está completamente solubilizado y la solución es blanca. Se añaden 0,5 ml de DMF en tamiz molecular, el producto de partida entonces es soluble. La solución se agita a temperatura ambiente durante 24 h y luego se evapora. Durante la reacción, la solución se vuelve marrón. El residuo marrón se disuelve en ciclohexano y luego se filtra sobre Celite. El filtrado se concentra para conducir al compuesto 17 con un rendimiento del 88 % (268 mg; 0,25 mmol) usado directamente para la siguiente etapa.
Fórmula química 17: C45H88NO15PSi6
Masa molar: 1082,66 g.mol-1
Rf: 0,49 [DCM/Et2O (9:1)]
Preparación de 6-desoxi-6-dihidroxifosfinilmetilen-a-D-manopiranosil-(1^2)-D-manopiranósido de aminoetilo (M6Pnaí1.2)-Man-Et¡l-NH?) 18:
269 mg (0,25 mmol) del compuesto 17 y 260 mg (1,73 mmol; 7 eq) de yoduro sódico se disuelven en 7,3 ml de acetonitrilo recién destilado. 219 pl (1,73 mmol; 7 eq) de cloruro de trimetilsililo se añaden gota a gota. La solución se agita a 35 °C durante 1h15. Durante la reacción se forma un precipitado. El sobrenadante se canula en un globo y se evapora a sequedad. 132 pl (2,72 mmol; 11 eq) de monohidrato de hidrazina se diluyen en 3,4 ml de metanol en tamiz molecular y se añaden al residuo obtenido previamente. Se forma un precipitado blanco. La suspensión se agita a temperatura ambiente durante 1h30. El precipitado se disuelve en agua y se evapora. El residuo obtenido se purifica por cromatografía sobre gel de sílice (isopropanol/amoniaco acuoso: 5/3/2) para conducir al compuesto 18 como un sólido blanco con un rendimiento del 76 % (67 mg; 0,14 mmol).
Fórmula química 18: C15H30NO13P
Masa molar: 463,37 g.mol'1
Rf: 0,49 [DCM/Et2O (9:1)]
SMHR: masa calculada: 464,1533; masa encontradados. 464,1530
Preparación de 6,7-didesoxi-7-dihidroxifosfinil-a-D-mano-heptopiranosil-(1^2)-a-D-manopiranósido de (4-etoxi-2,3-dioxociclobut-1-enil) aminoetilo (M6Pn-a(1,2)-Man-Et¡lSq) 19:
El compuesto 18 (32 mg; 1 eq; 0,07 mmol) se disuelve en etanol/agua (1:1) (620 pl). El escuarato de dietilo (10,3 pl; 1 eq; 0,07 mmol) y trietilamina (9,7 pl; 1 eq; 0,07 mmol) se añaden. La reacción se agita a temperatura ambiente durante 20h y luego se evapora el disolvente. El residuo se precipita en una mezcla de AcOEt/MeOH (7:3). Tras la centrifugación, el precipitado se enjuaga 5 veces con acetato de etilo para dar el compuesto 19 con un rendimiento del 59 % (24 mg; 0,041 mmol).
Fórmula química 19: C21H34NO16P
Masa molar: 587,47 g.mol-1
Rf: 0,67 [MeOH/H2O (9:1)]
SM, ESI- m/z: 586 [MH]-3) Preparación de disacáridos 20, 21, 22, 23, 24, y 25 que responden a la fórmula (I) en donde X representa el grupo carboxilato
El método para preparar disacáridos 20, 21, 22, 23, 24 y 25 que corresponden a la fórmula (I) en donde X representa el grupo carboxilato se ilustra a continuación:
El comienzo de la síntesis de disacáridos "carboxilato" de fórmula (I) es idéntico al de disacáridos "fosfonato", es decir, el aldehido 13 se obtiene a partir del alcohol 12 de la misma manera que se describió anteriormente.
El aldehido 13 luego se hace reaccionar con fosfonoacetato de trietilo previamente desprotonado con hidruro sódico para formar el compuesto 20 con un rendimiento del 75 % en dos etapas. En una sola etapa de hidrogenación, se reducen tanto el doble enlace como los 3 grupos bencilo. Durante esta reacción, los grupos trimetilsililo también se hidrolizan. Esta reacción se realiza utilizando paladio sobre carbono al 10 % y el hidrógeno se genera in situ mediante la adición gradual de trietilsilano para formar el compuesto 21 con un rendimiento del 95 %. Esta etapa de hidrogenación está completay no requiere purificación para obtener el compuesto 21 puro. El átomo de bromo se sustituye luego con azida sódica para producir el compuesto 22 con un rendimiento del 99 %. La función éster se saponifica para formar el compuesto 23 con un rendimiento del 86 %. Finalmente la función azida se reduce durante una reacción de hidrogenación catalítica usando paladio sobre carbono y trietilsilano para formar el compuesto 24 con un rendimiento del 97 %. Finalmente, el compuesto 24 reacciona con escuarato de dietilo para conducir al compuesto 25 con un rendimiento del 73 %.
Condiciones y reactivos: (i) peryodinano de Dess-Martin, DCM, TA, 4h; (ii) fosfonoacetato de trietilo, NaH, THF, TA, 14h; (iii) Pd/C, EtaSiH, MeOH, TA; (iv) NaNa, DMF, TA, 5j; (v) NaOH 1 N, TA, 20h; (vi) Pd/C, EtaSiH, MeOH/H2O (vii) escuarato de dietilo, EtOH/H2O, NEta, TA, 2h30.
Parte experimental
Preparación de 2,3,4-tri-0-trimetilsilil-6,7-didesoxi-7-etoxicarbonil-a-D-manohept-6-enopiranosil-(1^2)-3,4,6-tri-0-bencil-a-D-manopiranósido de bromoetilo 20:
144 mg (4 eq; 4,28 mmol) de dispersión de NaH al 60 % en aceite se disuelven en 10 ml de THF. Se añaden gota a gota 637 |jl (3 eq; 3,21 mmol) de fosfonoacetato de trietilo. La mezcla de reacción se agita durante 45 minutos a temperatura ambiente y luego se añade a 1,065 g (1 eq; 1,07 mmol) del compuesto 13 disuelto en 20 ml de THF. La solución es de color naranja. La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante 14h30 y luego se diluye con 175 ml de CH2Ch y se lava con 4x50 ml de salmuera. La fase acuosa se extrae con 125 ml de CH2Cl2. Las fases orgánicas se combinan, se secan sobre MgSO4 y se concentran. El residuo obtenido (aceite naranja) se purifica por cromatografía ultrarrápida automatizada sobre gel de sílice (ciclohexano/Et2O: 20 % (900 ml)) para producir el compuesto 20 en forma de un aceite incoloro con un rendimiento del 75 % (802 mg; 0,80 mmol) en dos etapas.
Fórmula química 20: C4sH71BrO12S¡3
Masa molar: 1004,23 g.mol-1
Rf: 0,39 [Ciclo/Et2O (8:2)]
Preparación de 6,7-didesoxi-7-etoxicarbonil-a-D-mano-heptopiranosil-(1^2)-a-D-manopiranósido de bromoetilo 21:
795 mg (1 eq; 0,79 mmol) del compuesto 20 se disuelven en 8 ml de metanol. Se añaden 160 mg (20 % en peso) de paladio sobre carbono al 10 %. Se añaden 1,3 ml (10 eq; 7,9 mmol) de trietilsilano gota a gota durante 1 h. El medio de reacción se agita a temperatura ambiente durante 20 minutos y luego se filtra a través de Celite (enjuagado con metanol caliente). El filtrado se concentra para conducir al compuesto 21 como un aceite incoloro con un rendimiento del 95 % (390 mg; 0,75 mmol).
Fórmula química 21: C1sH31BrO12
Masa molar: 519,34 g.mol'1
Rf: 0,40 [DCM/MeOH (85:15)]
Preparación de 6,7-didesoxi-7-etoxicarbonil-a-D-mano-heptopiranosil-(1^2)-a-D-manopiranósido de azidoetilo 22:
440 mg (1 eq; 0,85 mmol) del compuesto 21 se disuelven en 3,5 ml de DMF recién destilada. 66 mg (1,2 eq; 1,02 mmol) de azida sódica se añaden. La solución se agita a temperatura ambiente durante 5 días y luego se evapora. El residuo obtenido se purifica por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice (AcOEt/MeOH: 10 % (210 ml); 20 %) para conducir al compuesto 22 como un sólido blanco con un rendimiento del 99 % (407 mg; 0,85 mmol).
Fórmula química 22: C18H31N3O12
Masa molar: 481,45 g.mol-1
Rf: 0,43 [AcOEt/MeOH (8:2)]
SM, ESI+ m/z: 482 [M+H]+
Preparación de 6,7-didesoxi-7-hidroxicarbonil-a-D-mano-heptopiranosil-(1^2)-a-D-manopiranósido de azidoetilo 23:
377 mg (1 eq; 0,78 mmol) del compuesto 22 se disuelven en 932 pl (1,2 eq; 0,932 mmol) de una solución de hidróxido sódico 1 N. La solución se agita a temperatura ambiente durante 20 h y luego se concentra. El residuo obtenido se purifica por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice (isopropanol/amoniaco al 35 %/agua: 6/3/1) para conducir al compuesto 23 como un sólido blanco con un rendimiento del 86 % (316 mg; 0,67 mmol).
Fórmula química 23: C16H27N3O12
Masa molar: 453,40 g.mol'1
Rf: 0,38 [isopropanol/NH4OH/agua (6:3:1)]
SM, ESI+ m/z: 454 [M+H]+
Preparación de 6,7-didesoxi-7-hidroxicarbonil-a-D-mano-heptopiranosil-(1^2)-a-D-manopiranósido de aminoetilo (M6C-a(1,2)-Man-Etil-NH2) 24:
316 mg (1 eq; 0,67 mmol) del compuesto 23 se disuelven en 15 ml de una mezcla de metanol/agua a 2:1,32 mg (10 % en peso) de paladio sobre carbono al 10 % se añaden. Se añaden gota a gota 536 pl (5 eq; 3,36 mmol) de trietilsilano durante 40 min. Después de agitar durante 45 minutos a temperatura ambiente, queda producto de partida. Se añaden gota a gota 536 pl (5 eq; 3,36 mmol) de trietilsilano durante 30 minutos. El medio de reacción se agita a temperatura ambiente durante 10 min (sin evolución) y luego se filtra sobre Celite (enjuagado con metanol caliente). El filtrado se concentra y luego se disuelve en 3 ml de una mezcla de metanol/agua a 2:1,60 mg (20 % en peso) de paladio sobre carbono al 10 % se añaden. Se añaden 1,07 ml (10 eq; 6,72 mmol) de trietilsilano gota a gota durante 20 min. La suspensión se agita a temperatura ambiente durante 30 minutos y luego se filtra sobre Celite (enjuagado con metanol caliente). El filtrado se concentra para conducir al compuesto 24 como un aceite incoloro con un rendimiento del 97 % (280 mg; 0,66 mmol).
Fórmula química 24: C16H29NO12
Masa molar: 427,40 g.mol-1
Rf: 0,51 [isopropanol/NH4OH/agua (5:4:1)]
SM, ESI+ m/z: 428 [M+H]+
Preparación de 6,7-didesoxi-7-hidroxicarbonil-a-D-mano--heptopiranosil-(1^2)-a-D-manopiranósido de (4-etoxi-2,3-dioxociclobut-1-enil)aminoetilo (M6C-a(1,2)-Man-EtilSq) 25:
45 pl (1 eq; 0,307 mmol) de escuarato de dietilo se diluyen en 300 pl de una mezcla de etanol/agua a 2:1. El pH de la solución es 5,20 pl (0,5 eq; 0,154 mmol) de trietilamina se añaden para alcanzar un pH de 8-9. 131 mg (1 eq; 0,307 mmol) del compuesto 24 disuelto en 1,7 ml de una mezcla de etanol/agua a 2:1 se añaden gota a gota. La solución se agita a temperatura ambiente durante 2h30, manteniendo el pH a 8-9 añadiendo trietilamina, luego concentrado. El residuo obtenido se purifica por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice (AcOEt/MeOH: deposición a 3:7; elución: 30 % (20 ml); 40 % (10 ml); 50 % (20 ml); 70 % (30 ml) para conducir al compuesto 25 como un sólido incoloro con un rendimiento del 73 % (123 mg; 0,223 mmol).
Fórmula química 25: C22H33NO15
Masa molar: 551,50 g.mol-1
Rf: 0,36 [AcOEt/MeOH (1:1)]
SM, ESI+ m/z: 552 [M+H]+
Ejemplo 2:
Estudio de los análogos disacáridos 18, 19, 24 y 25 de la invención, que responden a la fórmula general (I)
1) Unión de los análogos M6 P de la invención con RM6 P-CI
Las placas de 96 pocillos (Maxisorp Nunc) se incuban durante la noche a 4 °C con 200 pl de PMP (penta manosa 6 -fosfato) a la concentración de 200 ug.ml1, en tampón carbonato (NaHCO3/Na2CO3 a 0,1 M, pH 9,6). Al día siguiente, la solución que contiene el PMP residual se descarta y los pocillos se saturan, durante 1 h a temperatura ambiente, con 360 pl de gelatina al 1 % (Tipo A de piel porcina) diluido en PBS (NaH2PO41,9 mM, Na2PO48,1 mM y NaCl 154 mM, pH 7,4). Los pocillos se enjuagan 5 veces con PBS suplementado con gelatina al 0,2 %. Todos los lavados, así como las diluciones, se realizan en la solución de PBS suplementada con 0,2 % de gelatina. Los análogos de M6 P que se probarán a diferentes concentraciones (de 10-2 a 10-7 M) se preincuban en presencia del RM6 P-CI previamente biotinilado (RM6 Pb) (2,5 pg.ml-1) durante 20 minutos, luego se incuban 200 pl de la mezcla en los pocillos durante 2 h, a temperatura ambiente. Después de 3 lavados, los pocillos se incuban durante 1 h con una solución de estreptavidina-peroxidasa (250 pl por pocillo; 3.10-8 M). Después de otros 3 lavados, 200 pl de una solución de OPD (o-fenilendiamina 1 mg.ml-1 en tampón citrato pH 5,0 y 1 pl de 30 % de H2O2.ml-1; Sigma Aldrich) se añade. Después de 20 minutos de incubación a temperatura ambiente, las densidades ópticas se miden a la longitud de onda de 450 nm.
Las afinidades de los disacáridos de fosfonato 18 y carboxilato 24 de fórmula (I) de la invención se midieron y compararon con las de sus equivalentes de monosacáridos respectivos.
La afinidad se refiere a la capacidad de unión (en este caso a través de un enlace covalente) de los análogos de M6 P para RM6 P-CI.
La afinidad relativa permite comparar la afinidad de las moléculas conM6C-Etil-NH2 tomado como referencia y para el cual se le atribuye un valor igual a 1.
Los resultados obtenidos se resumen en la tabla 1 a continuación.
La afinidad del disacárido fosfonato 18 (línea 1 de la tabla. 1), 6 -desoxi-6 -dihidroxifosfinilmetilen-a-D-manopiranosaa-(1,2)-D-manopiranosa de aminoetilo, representada por M6 Pn-a(1 ,2 )-Man-Etil-NH2, por lo tanto, se compara con la del monosacárido fosfonato (línea 2), representado M6 Pn-Etil-NH2.
La afinidad del disacárido carboxilato 24 (línea 3), 6,7-didesoxi-7-hidroxicarbonil-a-D-mano-hept-6-anopiranosa-a-(1,2)-a-D-manopiranosa de aminoetilo, representada por M6 C-a(1 ,2 )-Man-Etil-NH2, por lo tanto, se compara con la del monosacárido carboxilato (línea 4), representado M6 C-Etil-NH2.
Tabla 1
Conclusión:
Una mejor afinidad de los análogos disacáridos 18 y 24 de la invención se observa para RM6 P-CI que la de los mismos análogos monosacáridos. Además, un aumento de afinidad del análogo de fosfonato 18 se observa con respecto al análogo de carboxilato 24, tanto en la serie de disacáridos como la de monosacáridos.
2) Evaluación de la citotoxicidad de los análogos de M6 P de la invención con RM6 P-CI
La citotoxicidad de análogos disacáridos fosfonatos 18, 19 y carboxilatos 24, 25 de la invención se evaluó en células de cáncer de próstata LNCaP, y se comparó con la de sus equivalentes de monosacáridos respectivos.
Los análogos disacáridos 18, 19, 24 y 25 de fórmula (I) de la invención, así como los análogos monosacáridos de los análogos disacáridos 19, 24 y 25, se prueban:
M6 Pn-a(1 ,2 )-Man-Etil-NH2 (compuesto 18);
M6Pn-a(1,2)-Man-EtilSq (compuesto 19);
M6 Pn-EtilSq (descrito a continuación);
M6 C-a(1 ,2 )-Man-Etil-NH2 (compuesto 24);
M6 C-Etil-NH2 (descrito en la tabla 1);
M6C-a(1,2)-Man-EtilSq (compuesto25);
M6 C-EtilSq (descrito a continuación).
Protocolo experimental
Las células de cáncer de próstata humano LNCaP se incuban con soluciones de los análogos como se describió anteriormente con concentraciones que varíande 10-3 M a 10-7 M.
La supervivencia celular se mide después de 4 días de incubación usando un ensayo MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio). Este último se reduce por una enzima mitocondrial y formará un compuesto amarillo-naranja que es soluble en medio acuoso. La medición de las densidades ópticas indica la cantidad de células vivas. Los resultados del crecimiento celular se determinaron con respecto a un control tratado solo con el vehículo (solución en donde se diluyen los análogos).
Los resultados obtenidos se representan en la figura 1.
Conclusión:
Ninguno de los compuestos probados mostró una citotoxicidad significativa en las células humanas LNCaP, incluso a concentraciones muy altas (hasta 10'3 M).
Por lo tanto, los análogos de M6P probados no exhiben toxicidad intrínseca para las células que expresan el RM6P-CI, como las células LNCaP.
3) Funcionalización de nanopartículas para terapia fotodinámica de monofotónica
Un compuesto de interés ®, es decir, nanopartículas de sílice mesoporosa que incorporan un fotosensibilizador de tipo porfirina neutra, luego se funcionaliza en la superficie con los análogos:
- disacáridos fosfonatos M6Pn-a(1,2)-Man-EtilSq (19) y carboxilatos M6C-a(1,2)-Man-EtilSq (25);
- monosacáridtodos fosfonato M6Pn-EtilSq y carboxilato M6C-EtilSq.
La estructura de la porfirina neutra utilizada para la terapia fotodinámica se muestra a continuación:
Preparación de nanopartículas de sílice que incorporan porfirina
La porfirina debe llevar un grupo trialcoxisilano que permita su incorporación a la red de silicio durante el método solgel descrito a continuación. Para ello, la porfirina se hace reaccionar con 3-mercaptopropiltrimetoxisilano en metanol a temperatura ambiente durante 12 h.
El CTAB (bromuro de cetiltrimetilamonio) se disuelve en una solución de hidróxido sódico 0,2 M. Por lo tanto, se forman micelas en la solución. Se añaden la porfirina sililada y luego el TEOS (ortosilicato de tetraetilo). Rápidamente, el medio de reacción se diluye con un gran volumen de agua para bajar el pH a 8-8,5 e iniciar la condensación. Después de 6 min, el medio de reacción se neutraliza con una solución de HCl 0,2 M. Las nanopartículas se obtienen después de las etapas de lavado con nitrato de amonio para eliminar el CTAB contenido en los poros.
Durante la síntesis de nanopartículas, los tiempos de reacción y el pH deben controlarse cuidadosamente para
controlar el tamaño de las nanopartículas formadas. Las nanopartículas obtenidas así tienen un diámetro hidrodinámico de aproximadamente 2 0 0 nm y contienen 11 |jg de porfirina por gramo de nanopartícula.
Funcionalización de la superficie de las nanopartículas
Estas nanopartículas se funcionalizan en la superficie con los análogos de monosacárido de carboxilato de carboxilato M6 CEtilSq y M6 PnEtilSq y los análogos de disacáridos carboxilato M6C-a(1,2)-Man-EtilSq (25) y fosfonato M6Pn-a(1,2)-Man-EtilSq (19).
La funcionalización se realiza en dos etapas: la primera etapa es introducir funciones de amina en la superficie de las nanopartículas que, en la segunda etapa, sustituirán al grupo etoxi presente en el escuarato del brazo del análogo. Las nanopartículas se hacen reaccionar con aminopropiltrietoxisilano (APTS) en una mezcla de agua/etanol (2:1). El pH del medio de reacción se ajusta a 6 añadiendo una solución de HCl 0,2 M y luego se agita a temperatura ambiente durante 20 h. Las nanopartículas se obtienen después de varias etapas de lavado con etanol seguido de centrifugaciones.
Para el acoplamiento de los análogos de carboxilato (M6 CEtilSq y M6C-a(1,2)-Man-EtilSq (25)), el análogo se disolvió en una mezcla de etanol/agua (1:1) en presencia de nanopartículas y la suspensión se calentó a 50 °C durante 1 2 h.
Cabe señalar que se puede añadir trietilamina para mantener el pH a 8-9 y promover el acoplamiento de análogos a nanopartículas.
Después de lavar los pasos con agua y etanol, se obtienen las nanopartículas funcionalizadas con los análogos de carboxilato.
El acoplamiento (injerto) del análogo disacárido carboxilato M6C-a(1,2)-Man-EtilSq (25) con nanopartículas de sílice que incorporan porfirina (representada por una estrella) se muestra a continuación:
Se obtiene así un conjugado de fórmula (III).
El grupo escuarato es observable en UV, la dosificación de la cantidad de monosacáridos y disacáridos se determinó por espectroscopía UV/visible.
La tabla 2 a continuación representa la cantidad de porfirina incorporada (en jg/g) y la cantidad de monosacárido o disacárido (en (jmol/g) injertado en las nanopartículas.
La abreviatura "MSN" representa las nanopartículas de sílice mesoporosas solas, sin injerto con el monosacárido o el disacárido.
Los análogos de M6 CEtilSq, M6C-a(1,2)-Man-EtilSq (25) y M6Pn-a(1,2)-Man-EtilSq (19) injertados con las nanopartículas de sílice mesoporosa están representados por MSN-M6 C-EtilSq; MSN-M6C-a(1,2)-Man-EtilSq y MSN-M6Pn-a(1,2)-Man-EtilSq. Estos compuestos son conjugados correspondientes a la fórmula general (III).
T l 2
Valoración in vitro en terapia fotodinámica
Los conjugados de carboxilato de fórmula (III) MSN-M6 C-EtilSq y MSN-M6C-a(1,2)-Man-EtilSq se usaron en
experimentos PDT in vitro en células de cáncer de próstata LNCaP que sobreexpresan RM6P-CI.
Las células LNCaP se incubaron con 80 jg.mM de nanopartículas solas (MSN) o con 80 jg.mM nanopartículas funcionalizadas con mono- o disacárido (es decir, con 80 jg.m l'1 de conjugados MSN-M6C-EtilSq y MSN-M6C-a(1,2)-Man-EtilSq) durante 3, 6, 9 o 18 h y luego se irradiaron durante 20 min con un láser a 650 nm (3 mW, 11,25 J.cm-2).
El ensayo de supervivencia celular MTS se realizó 48 h después de la irradiación.
Después de 3 horas de incubación, se observa un ligero aumento del efecto fototóxico de las nanopartículas funcionalizadas con mono- o disacáridos.
Cuando el tiempo de incubación se incrementa a 6 h, se observa que la funcionalización con un disacárido carboxilato proporciona una fuerte mejora del efecto fototóxico, con 73 % de muerte celular contra 35 % para el monosacárido carboxilato. Esto está relacionado con la mejora del reconocimiento de RM6P-CI que conduce a una internalización más rápida de las nanopartículas (funcionalizadas con un disacárido) en las células.
Estos resultados destacan la ventaja de la funcionalización de nanopartículas con análogos disacáridos, tanto para reducir el tiempo de incubación como para aumentar significativamente el efecto fototóxico de las nanopartículas. Al aumentar el tiempo de incubación a 9 h, la muerte celular obtenida para las células tratadas con las nanopartículas funcionalizadas con el disacárido alcanza el 81 % frente al 55 % con las nanopartículas funcionalizadas con el monosacárido.
En el caso de una incubación durante 18h, se observa una mejora del efecto fototóxico para las nanopartículas funcionalizadas con los análogos de monosacárido carboxilato con respecto al efecto de estas mismas nanopartículas después de una incubación de 9 h.
Por otro lado, el efecto de las nanopartículas de disacárido no aumenta a 18h porque este efecto ya es máximo después de 9h de incubación.
Los efectos fototóxicos de las nanopartículas solas (MSN) y funcionalizadas con el monosacárido carboxilato (MSN-M6C-EtilSq) y disacárido carboxilato (MSN-M6C-a(1,2)-Man-EtilSq) en los diferentes tiempos de incubación se resumen en la figura 2.
Conclusión
La funcionalización de nanopartículas con dimanósidos análogos de M6P permite aumentar de manera muy significativa la eficiencia fototóxica con respecto a las nanopartículas injertadas con los análogos de monosacáridos al tiempo que reduce el tiempo de incubación. Este aumento de la eficacia asociada a la afinidad para RM6P-CI puede ser decisivo para la aplicación diagnóstica o terapéutica de los compuestos de interés © (nanopartículas, glicoproteínas, moléculas pequeñas, ...) cuya eliminación metabólica en seres humanos puede ser rápida.
Ejemplo 3:
Síntesis de compuestos de fórmula (I)
Preparación de disacáridos 26, 27 y 28 que responden a la fórmula (I) en donde X representa el grupo fosfonato El método para preparar disacáridos 26, 27 y 28 que responden a la fórmula (I) en donde X representa el grupo fosfonato se ilustra a continuación:
El comienzo de la síntesis del disacárido fosfonato 28 de fórmula (I) es idéntico al del disacárido fosfonato 19, es decir, el fosfonato 15 se obtiene a partir del alcohol 12 de la misma manera como se describió anteriormente.
Para sintetizar el disacárido fosfonato 28 de fórmula (I), el aldehído 13 se hace reaccionar con metilendifosfonato de tetraetilo, previamente desprotonado con hidruro sódico, para formar el compuesto 14 con un rendimiento del 75 % en dos etapas. Durante una etapa de hidrogenación catalítica, en presencia de paladio sobre carbono y para la cual el hidrógeno se genera in situ mediante la adición progresiva de trietilsilano, se reducen tanto el doble enlace como los tres bencilos y los grupos trimetilsililo se hidrolizan. Así se obtiene el compuesto 15, sin purificación, con un rendimiento cuantitativo. El átomo de bromo se sustituye entonces con /V-hidroxiftalimida para formar el intermedio 26 con un rendimiento del 68 %. Las funciones alcohol se protegen con cloruro de trimetilsililo para dar el compuesto 27 con un rendimiento del 88 %. el intermedio 27 obtenido así, sin purificación se hace reaccionar con cloruro de trimetilsililo y yoduro sódico para formar fosfonato bis(trimetilsililado) mediante una reacción de tipo Rabinowitz. Este intermedio se convierte luego en ácido fosfónico por la acción del monohidrato de hidrazina en metanol que también desplazará los grupos trimetilsililo presentes en los alcoholes secundarios del azúcar y reaccionará con la hidroxiftalimida para desproteger la función de oxiamina. Así se obtiene, en una sola etapa, el compuesto 28 desprotegido en la parte de fosfonato, en los alcoholes de los dos azúcares y que porta en posición anomérica la función oxiamina, necesario para el acoplamiento con la enzima, con un rendimiento del 64 % en dos etapas.
Condiciones y reactivos: (i) peryodinano de Dess-Martin, DCM, TA, 4h (ii) metilendifosfonato de tetraetilo, NaH, THF, TA, 45 min; (iii) Pd/C, EtaSiH, MeOH; (IV) V-hidroxiftalimida, NaH, DMF, 65 °C, 20 h; (v) TMSC1, NEta, DCM, DMF, TA, 24h; (vi)-a TMSCl, Nal, EtaN, ACN, 35 °C, 4 h; (vi)-b N2H4.H2O, MeOH, TA, una noche.
Parte experimental
Preparación de 6-desoxi-6-dietoxifosfinilmetilen-a-D-manopiranosil-(1^2)-a-D-manopiranósido 2-V-oxiftalimidoetilo 26:
177 mg (2,2 eq, 5,3 mmol) de NaH se suspenden en 80 ml de DMF. 783 mg (2 eq, 4,8 mmol) de V-hidroxiftalimida
se añaden (solución roja). Después de agitar durante una hora a 65 °C (solución roja oscura), 1,4 g (1 eq, 2,4 mmol) del compuesto 15 disuelto en 20 ml de DMF se añaden. Después de 20 horas a 65 °C, la solución se enfría y la DMF se evapora a presión reducida. El producto en bruto resultante se purifica en una columna de gel de sílice con un gradiente de AcOEt/MeOH (95:5 ^-80:20) para dar el compuesto 26 con un rendimiento del 68 % (1,08, 1,62 mmol).
Fórmula química 26: C27H40NO16P
Masa molar: 665,58 g.mol-1
Rf: 0,6 [AcOEt/MeOH (70:30)]
Preparación de 2,3,4-tri-0-trimetilsilil-6-desoxi-6-dietoxifosfinilmetilen-a-D-manopiranosil-(1^2)-3,4,6-tri-0-trimetilsilila-D-manopiranósido de 2-N-oxyphtalimidoetilo27:
1,05 g (1 eq, 1,6 mmol) del compuesto 26 se disuelven en 10 ml de DCM recién destilada y 6,6 ml (47,3 mmol, 30 eq) de trietilamina. El material de partida no es completamente soluble. 2,4 ml (18,9 mmol, 12 eq) de cloruro de trimetilsililo se añaden gota a gota. La solución se agita a temperatura ambiente durante 25 h y luego se evapora. Durante la reacción, la solución se vuelve marrón. El residuo marrón se disuelve en ciclohexano y luego se filtra sobre Celite. El filtrado se concentra para producir el compuesto 27 con un rendimiento del 88 % (1,52 g, 1,38 mmol) utilizado directamente para la siguiente etapa.
Fórmula química 27: C45H88NO-i6S¡6
Masa molar: 1098,67 g.mol'1
Rf: 0,57 [DCM/Et2O (90:10)]
Preparación de 6-desoxi-6-dihidroxifosfinilmetilen-a-D-manopiranosil-(1^2)-D-manopiranósido de aminooxietilo 28:
A una solución del compuesto 27 (1 eq, 367 mg, 0,33 mmol) en 11 ml de CH3CN anhidro se añaden Et3N (7,2 eq, 0,34 ml, 2,4 mmol), Tm Sc I (7 eq, 0,296 ml, 2,34 mmol) y Nal (7 eq, 350 mg, 2,34 mmol) en atmósfera de nitrógeno. Después de 4 h a temperatura ambiente, se detiene la agitación. El sobrenadante se canula y la sal residual se enjuaga con CH3CN anhidro (2x3 ml) luego el disolvente se canula. El disolvente se evapora y el residuo obtenido se recoge en 7,5 ml de metanol anhidro que contiene hidrazina (12 eq, 4,01 mmol, 0,194 ml). La reacción se deja durante una noche con agitación. Se forma un precipitado blanco. El residuo obtenido después de la evaporación se purifica por cromatografía en una columna de gel de sílice (eluyente: isopropanol/NH4OH/H2O a 5:4:1) para conducir al compuesto 28 con un rendimiento del 64 % (103 mg, 0,22 mmol).
Fórmula química 28: C15H30NO14P
Masa exacta: 479,37 g.mol-1
Rf: 0,33 [isopropanol/NH4OH/H2O (5:4:1)]
SM, ESI+ m/z: 480,3 [M+H]+
Ejemplo 4:
Estudio del análogo disacárido 28 de la invención, que responde a la fórmula general (I)
1) Funcionalización de una enzima lisosómica, alfa glucosidasa ácida (GAA) por el análogo disacárido (28) Un compuesto de interés ®, es decir, una enzima lisosómica, alfa glucosidasa ácida (GAA) que se puede usar para el tratamiento de la enfermedad de Pompe o glucogenosis de tipo II7-8 se funcionaliza en las cadenas de oligosacáridos con el análogo disacárido fosfonato M6Pn-a(1,2)-Man-Etiloxiamino (28). La enfermedad de Pompe es representativa de la mayoría de las 53 enfermedades lisosómicas diferentes cuya eficacia de tratamiento por enzimoterapia de sustitución depende de RM6P-CI7-9. En efecto, este receptor desempeña un papel clave en la internalización celular de las enzimas recombinantes inyectadas por vía intravenosa y para su direccionamiento intracelular a los lisosomas.
Protocolo experimental:
La GAA humana recombinante (rhGAA) se produce en el sistema de células eucariotas CHO capaces de producir M6P al final de las cadenas glicosiladas y se purifica a partir del medio de cultivo. El peso molecular de la enzima es de aproximadamente 110 000 Da y es reconocida por un anticuerpo específico anti-GAA humano (anti-LYAG, Genetex). La GAA humana recombinante también se puede producir en el sistema celular de baculovirus/insecto Sf9 que no produce restos M6P y que produce cadenas de oligosacáridos manosilados.
La rhGAA luego se funcionaliza en las cadenas de oligosacáridos con los análogos disacáriddos fosfonato M6Pna(1,2)-Man-Etiloxiamino (28). La funcionalización se desarrolla en dos etapas: la primera etapa consiste en generar funciones aldehído mediante la oxidación de las manosas que, en la segunda etapa, reaccionarán con las funciones oxiamina presentes en el brazo de etiloxiamino del análogo (28). Las enzimas se oxidan con NaIO41 mM durante 30 min a 4 °C y luego reaccionan con los análogos disacáridos (100 equivalentes para 1 enzima) durante 2 h a 25 °C. Las enzimas funcionalizadas se obtienen después de diálisis para eliminar los análogos sin reaccionar.
El acoplamiento (injerto) del análogo disacárido fosfonato M6Pn-a(1,2)-Man-Etiloxiamino (28) con las enzimas se muestra a continuación:
La oxidación del ácido siálico se realiza con peryodato sódico.
La oxidación de la mañosa se realiza con peryodato sódico.
2) Afinidad para RM6P-CI de rhGAA funcionalizada con M6Pn-a(1,2)-Man-Etiloxiamino (28)
El conjugado de fórmula (NI). es decir. la rhGAA funcionalizada con el análogo disacárido fosfonato M6Pn-a(1,2)-Man-Etiloxiamino (28) se denomina en lo sucesivo rhGAA-M6Pn-a(1,2)-Man-Etiloxiamino (28).
El conjugado de fórmula (III) se evalúa por su afinidad con RM6P-CI. La afinidad de unión de rhGAA y del conjugado rhGAA-M6Pn-a(1,2)-Man-Etiloxiamino (28) se evaluó mediante una técnica de competición de unión competitiva con el RM6P-CI descrita en el ejemplo 2 y se comparó con la afinidad de M6P.
Los datos indican una alta afinidad por rhGAA-M6Pn-a(1,2)-Man-Etiloxiamino (28) (conjugado de fórmula (III)) correspondiente a una concentración inhibitoria del 50 % (CI50) de 0,55 10'7 M mientras que la afinidad de rhGAA era 3 10'7 M es decir 5,5 veces menor. En comparación la afinidad de M6P es de 3 M 10'5 en estos mismos experimentos. Este resultado indica el acoplamiento eficaz de varios dimanósidos análogos de M6P a las cadenas glicosiladas de la enzima.
3) Internalización del conjugado rhGAA-M6Pn-a(1.2)-Man-Et¡Iox¡am¡no (28) (conjugado de fórmula (III)) en los mioblastos de pacientes con la forma adulta de la enfermedad de Pompe (figura 3)
Protocolo experimental:
Las células similares a mioblastos de un paciente adulto con enfermedad de Pompe se mantienen en cultivo primario.
La actividad catalítica de GAA se mide en extractos celulares mediante el sustrato sintético 4-metilumbelliferil-a-D-glucopiranósido (4-MUG). Este sustrato y los patrones de peso molecular se obtienen en Sigma. La actividad de GAA en los extractos celulares (20 jl) se mide en un volumen de reacción de 75 |jl que contiene ácido cítrico 50 mM, K2HPO4115 mM, KCl 110 mM, NaCl 10 mM, pH 5,0, con 4-MUG 6 mM durante 10 min a temperatura ambiente. La reacción se detiene con 75 |jl de Tris HCl 0,1 M pH 8. La fluorescencia se lee con filtros de excitación a 355 nm y emisión a 460 nm en placas de 96 pocillos y se compara con una curva patrón obtenida con 4-metilumbeliferona. La actividad catalítica se expresa por mg de proteína. Media ± desviación estándar.
A partir de la figura 3 parece que el injerto de los disacáridos aumenta significativamente la penetración celular de GAA, cuya concentración se mide por su actividad catalítica en el sustrato 4-MUG.
Conclusión:
El producto de interés rhGAA funcionalizado mediante la adición de disacáridos (28) es más eficaz en el tratamiento de un déficit enzimático relacionado con la enfermedad de Pompe.
4) Estudio del método de maduración celular en los mioblastos de un paciente adulto con enfermedad de Pompe del conjugado rhGAA-M6Pn-a(1.2)-Man-Et¡Iox¡am¡no (28) (conjugado de fórmula (III)) (figura 4)
La maduración celular de GAA10 se realizan en endosomas y lisosomas mediante varias divisiones enzimáticas
específicas que transforman sucesivamente el precursor inactivo de 110 kDa en formas intermedias de 95 kDa y 76 kDa y luego en una forma madura y activa de 60-70 kDa en lisosomas10.
Los mioblastos se incuban durante 48 h en presencia de 50 nM rhGAA o conjugado rhGAA-M6Pn-a(1,2)-Man-Etiloxiamino (28) (conjugado de fórmula (III)), luego se lisan y se extraen las proteínas. La maduración celular de la enzima GAA internalizada en los mioblastos de pacientes con enfermedad de Pompe se estudia mediante la técnica de separación en gel de poliacrilamida SDS seguida de inmunodetección de GAA mediante transferencia de Western con un anticuerpo anti-GAA humano (anti-LYAG, Genetex) o anti-actina humana (Invitrogen). La actina se revela como una proteína de control que indica que se depositan cantidades equivalentes de proteína en el gel. Este experimento es representativo de 2 experimentos. La flecha gruesa de la figura 4 indica la forma intermedia de la GAA. La flecha negra indica la forma madura de GAA (60-70 kDa).
La cuantificación de la forma madura de 60 kDa se realiza considerando como 100 % la banda presente en los mioblastos de sujetos sanos. La expresión de GAA 60 kDa en mioblastos de pacientes corresponde al 1 % de GAA de sujetos sanos y no aumenta en mioblastos tratados con rhGAA. A la inversa, el tratamiento con el conjugado rhGAA-M6Pn-a(1,2)-Man-Etiloxiamino (28) aumenta la banda 60-70 kDa al 47 % del GAA de un sujeto sano. Estos resultados indican que el injerto de los análogos de disacárido favorece fuertemente el método de maduración intracelular de rhGAA que conduce a su forma activa de 60-70 kDa. Esta actividad es importante para una aplicación en el tratamiento por enzimoterapia de la enfermedad de Pompe, pero también se puede aplicar a todas las enfermedades lisosómicas.
Conclusión
La funcionalización de una enzima lisosómica con dimanósidos modificados permite aumentar de manera muy significativa la entrada celular de esta enzima en relación con la enzima no injertada en células de pacientes que padecen la enfermedad de Pompe. La funcionalización con dimanósidos análogos a M6P facilita la maduración de la enzima dentro de los endosomas y lisosomas en comparación con la enzima no funcionalizada. Este aumento de la eficacia asociado a la afinidad por RM6P-CI puede ser decisivo para la aplicación diagnóstica o terapéutica de las glucoproteínas, particularmente para la terapia de enzimática de sustitución utilizada para los trastornos de almacenamiento lisosómico 7'9.
Referencias bibliográficas
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10. Moreland RJ et al., Gene, 491,25, (2012).
Claims (13)
1. Compuesto caracterizado por que presenta la fórmula general (I):
en donde:
◦ n es un número entero que varía de 1 a 3,
◦ --- representa un enlace sencillo o un enlace doble,
◦ cada uno de P1 representa independientemente entre si H, un grupo protector elegido particularmente entre (CHa)3Si-; tBuMe2Si-; C6H5CH2-; 4 -CH3OC6H5CH2-; o-NO2CaH5CH2-; CH3CO-; CaHsCO- o CF3CO-;
◦ X representa:
◦◦ cuando----- es un enlace sencillo:
◦◦◦ grupo fosfonato:
◦◦◦ grupo fluoro fosfonato
◦◦◦ grupo bifluoro fosfonato
◦◦◦ grupo carboxilato
◦◦◦ grupo malonato
"" cuando----- es un doble enlace:
°°° el grupo fosfonato:
°°° el grupo carboxilato:
con Z representando independientemente entre sí H; un alquilo C1-C5 ; CF3CH2-; C6H5CH2- C6H5-; (CH3)3Si-; un metal alcalino elegido entre Na, Li o K; un amonio NH4 ,
◦ A representa un radical divalente elegido entre -O-, -S-, -NH-, -CH2-◦ L representa:
◦◦ -H; -NH2 ; -(CH2)ni-CH=CH2 o -(CH2)ni-CECH con ni representando un número entero de 0 a 4, entonces en cada uno de estos casos Li está ausente,
◦◦ un radical hidrocarburo divalente saturado, lineal o ramificado, sustituido o no sustituido, que tiene de 1 a 30 átomos de carbono, un radical hidrocarburo divalente insaturado, lineal o ramificado, sustituido o no sustituido, que tiene de 2 a 30 átomos de carbono,
◦◦ un radical hidrocarburo divalente saturado o insaturado como se definió anteriormente de los cuales uno o más grupos -CH2-, -CH=CH- y/o -C=C- del radical hidrocarburo saturado o insaturado se reemplaza(n) independientemente entre sí por un grupo -O-; -NH-; -NRi- con Ri representando un alquilo C1-C5 ; -S-; -CO-NH-; -NH-CO-O-; -O-N=CH-; -CO-NH-N=CH-; un sistema cíclico o heterocíclico, saturado o insaturado, sustituido o no;
◦ Li representa:
-(CH2)ni-CH=CH2; -(CH2)ni-CECH; -(CH2)ni-N3; -(CH2)ni-SH; -(CH2)ni-NH2; -(CH2)ni-N=C=O; -(CH2)ni-N=C=S; -(CH2)ni-NHRi; -(CH2)ni-NRiR2; -(CH2)ni-Ai-NH2; -(CH2)ni-Ai-NHRi; -(CH2)ni-Ai-NRiR2; -(CH2)ni-NHCO-CH2Hal; -(CH2)ni-COZi; -(CH2)ni-AiCOZi; -(CH2)ni-O-N=CH2; -(CH2)ni-CO-NH-N=CH2; -(CH2)ni-H; un sistema cíclico o heterocíclico, saturado o insaturado, sustituido o no; un halógeno seleccionado entre F, Cl, Br o I; con
ni como se definió anteriormente,
Ri y R2 representando independientemente entre sí un alquilo Ci-C5,
Ai representando -O-, -NH-,
Hal representando Cl, Br o I;
Zi representando -OH, -ORi, -NHRi, -NH-NH2 , -NH-NHRi, -NH-NRiR2 con Ri y R2 como se definió anteriormente, un halógeno seleccionado entre F, Cl, Br o I.
2. Compuesto según la reivindicación i caracterizado por que:
L representa:
◦ -NH2 , -(CH2)ni-CH=CH2 o -(CH2)ni-C=CH, con ni como se define en la reivindicación i, entonces en cada uno de estos casos Li está ausente,
◦ un radical hidrocarburo divalente saturado, lineal o ramificado, sustituido o no sustituido, que tiene de i a i0 átomos de carbono, un radical hidrocarburo divalente insaturado, lineal o ramificado, sustituido o no sustituido, que tiene de 2 a i0 átomos de carbono,
◦ un radical hidrocarburo divalente saturado o insaturado como se definió anteriormente, en que uno o más grupos -CH2-, -CH=CH- y/o -C=C- del radical hidrocarburo saturado o insaturado es(son) reemplazado(s) independientemente entre sí por:
◦◦ un grupo -O-; -NH-; -S-; -CO-NH-; -NH-CO-O-; y/o
◦◦ un sistema cíclico o heterocíclico elegido entre:
con n1 , R1 y Hal como se definen en la reivindicación 1.
3. Compuesto según la reivindicación 1 o 2, caracterizado por que:
◦ el sustituyente L se elige entre:
◦◦ -CH=CH2 , -C=CH o -NH2 entonces en cada uno de estos casos L1 está ausente,
◦◦ -CH2-; -CH2-CH2-; -(CH2)3-; -(CH2)4-; -(CH2)5-; -CH2-CH2-O-CH2CH2-; -(CH2-CH2-O)2-CH2-CH2-; -CH2-CH2-S-CH2-CH2-; -CH2-CH2-S-CH2-CH2-O-CH2-CH2-;
y
◦ el sustituyente Li se elige entre:
◦◦ -CH=CH2 ; -C=CH; -Na; -SH; -NH2 ; -N=C=O; -N=C=S; -O-NH2; -NHCO-CH2CI; -COOH; -COORi; -CO-NH-NH2, un halógeno seleccionado entre F, Cl, Br o I,
◦◦ un sistema cíclico o heterocíclico elegido entre:
con R1 como se define en la reivindicación 1 o 2.
4. Método de preparación de un compuesto de fórmula (I) según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 caracterizado por que el compuesto de partida utilizado es un compuesto correspondiente a la fórmula (II):
en donde P1, A, L, L1 y n son como se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
5. Conjugado caracterizado por que corresponde a la fórmula general (III):
en donde P1, X, n, A y L son como se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3,
L1' representa el sustituyente L1 como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 implicado en un enlace covalente con un grupo funcional portado por un compuesto de interés ®, dicho compuesto de interés ® siendo seleccionado entre enzimas, nanopartículas, proteínas, anticuerpos o agentes citotóxicos.
6. Conjugado según la reivindicación 5, caracterizado por que dicho conjugado tiene una afinidad CI50 para el
receptor catiónico de mañosa 6-fosfato independiente de catión (RM6P-CI) de al menos 10-5 M, y preferentemente que varía de 10-6 a 10-9 M.
7. Conjugado según la reivindicación 5 o 6, caracterizado por que el compuesto de interés ® es una enzima lisosómica o una nanopartícula.
8. Conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, para su uso en un método de tratamiento terapéutico del cuerpo humano o animal, particularmente elegido entre enzimoterapia sustitutiva, terapia fotodinámica o tratamiento del cáncer.
9. Conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, para su uso en un método de diagnóstico, particularmente de enfermedades o afecciones asociadas con un aumento o disminución de la expresión de RM6P-CI.
10. Uso de al menos un compuesto de fórmula (I) como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 3, para formar al menos un enlace covalente con al menos un grupo funcional portado por un compuesto de interés ®, dicho compuesto de interés ® siendo seleccionado entre enzimas, nanopartículas, proteínas, anticuerpos o agentes citotóxicos.
11. Uso según la reivindicación 10 de n' compuestos de fórmula (I) para formar un n' enlace(s) covalente(s) con n' grupo(s) funcionale(s) del compuesto de interés ®, siendo n' un número entero que varía de 1 a 1000, y preferentemente de 1 a 100.
12. Uso según la reivindicación 10 u 11 para formar el conjugado de fórmula general (IIIbis):
en donde P1, X, n, A, L, L'1 y ® son como se definen en la reivindicación 5,
n' es como se define en la reivindicación 11.
13. Método de preparación de un conjugado de fórmula (III) como se define en la reivindicación 5 o un conjugado de fórmula (IIIbis) como se define en la reivindicación 12, caracterizado por que se hace reaccionar:
- al menos un grupo funcional portado por un compuesto de interés ®, dicho compuesto de interés siendo seleccionado entre enzimas, nanopartículas, proteínas, anticuerpos o agentes citotóxicos, con
- al menos un compuesto correspondiente a la fórmula (I):
en donde
P1, X, A y n son como se definen en la reivindicación 1, L y Li son como se definen en la reivindicación 2 o 3.
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