ES2730941T3 - Efectos sinérgicos entre los conjugados de conjugados anticuerpo-fármaco a base de auristatina e inhibidores de la ruta PI3K-AKT-mTOR - Google Patents

Efectos sinérgicos entre los conjugados de conjugados anticuerpo-fármaco a base de auristatina e inhibidores de la ruta PI3K-AKT-mTOR Download PDF

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Abstract

Un conjugado anticuerpo-fármaco a base de auristatina para uso en el tratamiento del cáncer, en donde el conjugado anticuerpo-fármaco se administra en terapia de combinación con un inhibidor de la ruta PI3K-AKT-mTOR, que es un inhibidor del sitio no activo, que es un rapalog y en donde el anticuerpo se une específicamente a un antígeno de células cancerosas que se encuentra en la superficie de una célula cancerosa que demuestra una regulación positiva de la ruta PI3K-AKT-mTOR, en donde el anticuerpo es un anticuerpo anti-CD30 o anti-CD19 y el cáncer es un cáncer hematológico maligno o el anticuerpo es un anticuerpo anti-CD70 y el cáncer es un carcinoma de células renales; y en donde el anticuerpo está conjugado con vcMMAE o mcMMAF.

Description

DESCRIPCIÓN
Efectos sinérgicos entre los conjugados de conjugados anticuerpo-fármaco a base de auristatina e inhibidores de la ruta PI3K-AKT-mTOR
Campo técnico
En el presente documento se proporcionan conjugados fármaco-anticuerpo a base de auristatina para su uso en el tratamiento de cánceres. En particular, los usos médicos de la invención descritos en el presente documento se basan, en parte, en el descubrimiento de conjugados fármaco-anticuerpo a base de auristatina e inhibidores de la ruta PI3K-AKT-mTOR actúan sinérgicamente para destruir células tumorales y/o inhibir la proliferación de células tumorales.
Antecedentes
El documento WO 2009/048967 describe métodos para el tratamiento del linfoma Hodgkin que comprenden administrar tanto un tratamiento quimioterapéutico como un compuesto conjugado anticuerpo-fármaco a un sujeto que lo necesite.
El documento WO 2009/117531 describe compuestos ligadores de fármacos y conjugados de ligando ligadores de fármacos que tienen auristatinas unidas a través del extremo C-terminal.
Cheson B D:Current Opinion In Hematology, Rapid Science Publishers, Filadelfia, PA, EE. UU., Vol. 16, no. 4, 1 de julio de 2009, páginas 299-305, describe nuevas terapias para los linfomas no Hodgkin de células T periféricas.
Johnston et al:Am J Hematot., Vol. 85, no. 5, mayo de 2010, páginas 320-324, describe un ensayo de Fase II del inhibidor mTOR oral everolimus en el linfoma Hodgkin en recaída.
Younes et al:Blood, vol. 112, 2008, página 1006, describe múltiples respuestas completas en un estudio de escalamiento de dosis de fase 1 del conjugado anticuerpo-fármaco s GN-35 en pacientes con linfomas CD30 positivos en recaída o refractarios.
Jona, A & Younges, A:Blood Rev., vol. 24, no. 6, 15 de septiembre de 2010, páginas 233-238, describe nuevas estrategias de tratamiento para pacientes con linfoma Hodgkin clásico en recaída.
Introducción general
La presente invención proporciona un conjugado anticuerpo-fármaco a base de auristatina para uso en el tratamiento del cáncer, en donde el conjugado anticuerpo-fármaco se administra en terapia de combinación con un inhibidor de la ruta PI3K-AKT-mTOR, el cual es un inhibidor de mTor de sitio no activo, el cual es un rapalog, y en el que el anticuerpo se une específicamente a un antígeno de células cancerosas que se encuentra en la superficie de una célula cancerosa que demuestra una regulación positiva de la ruta PI3K-AKT-mTOR, en donde el anticuerpo es un anticuerpo anti-CD30 o anti-CD 19 y el cáncer es un cáncer maligno hematológico o el anticuerpo es un anticuerpo anti-CD70 y el cáncer es un carcinoma de células renales; y en donde el anticuerpo está conjugado con vcMMAE o mcMMAF.
La presente invención encuentra utilidad en métodos para tratar cánceres y, en particular, cánceres que demuestran una regulación positiva de la ruta PI3K-AKT-mTOR. En un ejemplo, los métodos comprenden la etapa de administrar a un sujeto que lo necesite un conjugado anticuerpo-fármaco a base de auristatina y un inhibidor de la ruta PI3K-AKT-mTOR, en cantidades terapéuticamente eficaces. En algunos ejemplos, la administración del conjugado anticuerpofármaco a base de auristatina y el inhibidor de la ruta PI3K-AKT-mTOR proporcionan un efecto sinérgico en el tratamiento del cáncer. En algunos ejemplos, la administración del conjugado anticuerpo-fármaco a base de auristatina y el inhibidor de la ruta PI3K-AKT-mTOR proporcionan un efecto sinérgico en la destrucción de células tumorales y/o la inhibición de la proliferación de células tumorales.
Breve descripción de los dibujos
Las figuras 1 y 1A muestran los niveles de fosfo-AKT, AKT, fosfo-S6, S6, fosfo-4E-BP1, 4E-BP1, PTEN y B-actina en líneas celulares de cáncer seleccionadas.
La Figura 2 muestra los índices de combinación (ICs) calculados a dosis eficaz 50, a dosis eficaz 75 y a dosis eficaz 90 para h1F6-mcF temsirolimus, h1F6-mcF sirolimus, MMAE y temsirolimus y MMAE sirolimus en la línea celular 786-O (RCC).
La Figura 3 muestra Las ICs calculados a dosis eficaz 50, a dosis eficaz 75 y a dosis eficaz 90 para h1F6-mcF temsirolimus, h1F6-mcF sirolimus, MMAE temsirolimus y MMAE sirolimus en la línea celular Caki-1 (RCC).
La Figura 4 muestra Las ICs calculados a dosis eficaz 50, a dosis eficaz 75 y a dosis eficaz 90 para cAC10-vcMMAE temsirolimus en la línea celular L540cy (T-cell like HL) y para cAC10-vcMMAE temsirolimus y cAC10-vcMMAE sirolimus en la línea celular Karpas-299 (ALCL).
La Figura 5 muestra que cAC10-vcMMAE es sinérgico con temsirolimus en trasar el crecimiento tumoral in vivo en un modelo de xenoinjerto murino de HL tipo B.
La Figura 6 muestra que cAC10-vcMMAE es sinérgico con everolimus en retrasar el crecimiento del tumor in vivo en un modelo de xenoinjerto de murino de HL tipo B.
La Figura 7 muestra Las ICs calculados a dosis eficaz 50, a dosis eficaz 75 y a dosis eficaz 90 para hBU12-mcF temsirolimus y hBU12-mcF sirolimus en la línea celular HT (NHL).
La Figura 8 muestra Las ICs calculados a dosis eficaz 50, a dosis eficaz 75 y a dosis eficaz 90 para h1F6-mcF BEZ235 en la línea celular 786-O (RCC), h1F6-mcF BEZ235 en la línea celular Caki-1 (RCC) cAC10-vcMMAE BEZ235 en la línea celular L540cy (HL), y hBU12-mcF BEZ235 en la línea celular HT (NHL).
Definiciones y abreviaturas
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica pertinente a los usos de la invención descritos. Como se usa en este documento, los siguientes términos y frases tienen los significados que se les asigna, a menos que se especifique lo contrario.
A menos que se indique lo contrario, el término "alquilo" se refiere a un hidrocarburo lineal o ramificado saturado que tiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 átomos de carbono (y todas las combinaciones y subcombinaciones de intervalos y números específicos de átomos de carbono en el mismo), prefiriéndose los átomos de carbon de aproximadamente 1 a aproximadamente 8. Los ejemplos de grupos alquilo son metilo, etilo, n-propilo, iso-propilo, n-butilo, iso-butilo, sec- butilo, ferc-butilo, n-pentilo, 2-pentilo, 3-pentilo, 2-metil-2-butilo, n-hexilo, n-heptilo, n-octilo, n -nonilo, n-decilo, 3-metil-2-butilo, 3-metiM-butilo, 2-metil-1 -butilo, 1-hexilo, 2-hexilo, 3-hexilo, 2-metil-2-pentilo, 3-metil-2-pentilo, 4-metil-2-pentilo, 3-metil-3-pentilo, 2-metil-3-pentilo, 2,3-dimetil-2-butilo, y 3,3-dime-til-2-butilo.
Los grupos alquilo, ya sea solos o como parte de otro grupo, pueden denominarse "sustituidos". Un grupo alquilo sustituido es un grupo alquilo que está sustituido con uno o más grupos, preferiblemente de 1 a 3 grupos (y cualquier sustituyente adicional seleccionado de halógeno), incluidos, entre otros, halógeno, -O-(alquilo Ci-Cs), -O-(alquenilo C2-Cb), -O-(alquinilo C2.Cs), -arilo, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2 , -NHC(O)R, -SR'-SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, =O, -N3, -NH2, -n H(R'), -N(R')2 y -c N, donde cada R' se selecciona independientemente de -H, -alquilo Ci-Cs, alquenilo C2-C8, alquinilo C2-C8, o -arilo, y en donde dichos grupos -O-(alquilo Ci-Cs), -O-(alquenilo C2-Cs), -O-(alquinilo C2-Cs), -arilo, alquilo Ci-Cs, alquenilo -C2-C8, y alquinilo -C2-C8 pueden estar opcionalmente sustituidos adicionalmente con uno o más grupos que incluyen, pero no se limitan a, alquilo -Ci-Cs, alquenilo -C2-Cs, alquinilo -C2-Cs, -halógeno, -O-(alquilo Ci-Cs), -O-(alquenilo C2-Cs), -O-(alquinilo C2-Cs), -arilo, -C(O)R", -OC(O)R", -C(O)OR", -C(O)NH2, -C(O)NHR", -C(O)N(R")2 , -NHC(O)R", -SR", -SO3R", -S(O)2R", -S(O)R", -OH, -N3 , -NH2, -NH(R"), -N(R")2 y -CN, donde cada R" se selecciona independientemente entre -H, alquilo -Ci-Cs, alquenilo -C2-Cs, alquinilo -C2-Cs, o arilo.
A menos que se indique lo contrario, los términos "alquenilo" y "alquinilo" se refieren a cadenas de carbono lineales y ramificadas que tienen de aproximadamente 2 a aproximadamente 20 átomos de carbono (y todas las combinaciones y subcombinaciones de intervalos y números específicos de átomos de carbono en ellos), prefiriéndose de aproximadamente 2 a aproximadamente 8 átomos de carbono. Una cadena de alquenilo tiene al menos un doble enlace en la cadena y una cadena de alquinilo tiene al menos un triple enlace en la cadena. Los ejemplos de grupos alquenilo incluyen, pero no se limitan a, etileno o vinilo, alilo, -i-butenilo, -2-butenilo, -isobutilenilo, -i-pentenilo, -2-pentenilo, -3-metil-i-butenilo, -2-metil-2-butenilo, y -2,3-dimetil-2-butenilo. Los ejemplos de grupos alquinilo incluyen, pero no se limitan a, acetilénico, propargilo, acetilenilo, propinilo, -i-butinilo, -2-butinilo, -i-pentinilo, -2-pentinilo y -3-metil-i butinilo.
Al igual que con los grupos alquilo, los grupos alquenilo y alquinilo pueden estar sustituidos. Un grupo alquenilo o alquinilo "sustituido" es uno que está sustituido con uno o más grupos, preferiblemente de i a 3 grupos (y cualquier sustituyente adicional seleccionado de halógeno), incluidos, entre otros, halógeno, O-(alquilo Ci-Cs), -O-(alquenilo C2-Cs), -O-(alquinilo C2-C8), -arilo, -C(O)R”, -OC(O)R', -C(O)OR'-C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -SR', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, =O, -N3, -NH2, -n H(R'), -N(R')2 y -Cn , donde cada R' se selecciona independientemente de -H, alquilo Ci-Cs, alquenilo C2-Cs, alquinilo C2-Cs, o -arilo, y en donde dichos grupos -O-(alquilo Ci-Cs), -O-(alquenilo C2-Cs), -O-(alquinilo C2-Cs), -arilo, grupos alquilo Ci-Cs, alquenilo -C2-Cs, y alquinilo -C2-Cs pueden estar opcionalmente sustituidos además con uno o más sustituyentes que incluyen, pero no se limitan a, -O-(alquilo Ci-Cs), -O-(alquenilo C2-Cs), -O-(alquinilo C2-Cs), -arilo, -C(O)R", -OC(O)R"-C(O)OR", -C(O)NH2 , -C(O)NHR", -C(O)N(R")2 , -NHC(O)R", -SR", -SO3R", -S(O)2R", -S(O)R", -OH, -N3, -NH2, -NH(R"), -N(R")2 y -CN, donde cada R" se selecciona independientemente de -H, alquilo Ci-Cs, alquenilo C2-C8, alquinilo C2-C8 , o arilo.
A menos que se indique lo contrario, el término "alquileno" se refiere a un radical hidrocarbonado de cadena lineal o ramificada saturada que tiene de aproximadamente i a aproximadamente 20 átomos de carbono (y todas las combinaciones y subcombinaciones de intervalos y números específicos de átomos de carbono en el mismo), siendo preferidos de aproximadamente i a aproximadamente 8 átomos de carbono y que tienen dos centros radicales monovalentes derivados de la eliminación de dos átomos de hidrógeno del mismo o dos átomos de carbono diferentes de un alcano parental. Los alquílenos típicos incluyen, pero no se limitan a, metileno, etileno, propileno, butileno, pentileno, hexileno, heptileno, ocileno, nonileno, decaleno, 1,4-ciclohexileno, y similares. Los grupos alquileno, ya sea solos o como parte de otro grupo, pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más grupos, preferiblemente de 1 a 3 grupos (y cualquier sustituyente adicional seleccionado de halógeno), incluidos, entre otros, halógeno, O-(alquilo C1-C8), -O-(alquenilo C2AO, -O-(alquinilo C2-C8), -arilo, -C(O)R”, -OC(O)R', -C(O)OR'-C(O)NH2 , -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -SR', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, =O, -N3 , -NH2 , -NH(R'), -N(R')2 y -CN, en donde cada R' se selecciona independientemente de -H, alquilo C1-C8 , alquenilo C2-C8 , alquinilo C2-C8 , o -arilo, y en donde dichos grupos -O-(alquilo C1-C8), -O-(alquenilo C2-C8), -O-(alquinilo C2-C8), -arilo, grupos alquilo C1-C8, alquenilo -C2-C8, y alquinilo -C2-C8 o pueden estar además opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes incluyendo, pero no limitados a, -O-(alquilo C1-C8), -O-(alquenilo C2-C8), -O-(alquinilo C2-C8), -arilo, -C(O)R", -OC(O)R"-C(O)OR", -C(O)NH2 , -C(O)NHR", -C(O)N(R")2 , -NHC(O)R", -SR", -SO3R", -S(O)2R", -S(O)R", -OH, -N3 , -NH2 , -NH(R"), -N(R")2 y -CN, donde cada R" se selecciona independientemente de -H, alquilo C1-C8 , alquenilo C2-C8, alquinilo C2-C8 , o arilo.
A menos que se indique lo contrario, el término "alquenileno" se refiere a un grupo alquileno opcionalmente sustituido que contiene al menos un doble enlace carbono-carbono. Grupos alquenileno ilustrativos incluyen, por ejemplo, etenileno (-CH=CH-) y propenileno (-CH=CHCH2-).
A menos que se indique lo contrario, el término "alquinileno" se refiere a un grupo alquileno opcionalmente sustituido que contiene al menos un triple enlace carbono-carbono. Los grupos alquinileno ilustrativos incluyen, por ejemplo, acetileno (-C=C-), propargilo (-CH2CEC-), y 4-pentinilo (-CH2CH2CH2CECH-).
A menos que se indique lo contrario, el término "arilo" se refiere a un radical hidrocarbonado aromático monovalente de 6-20 átomos de carbono (y todas las combinaciones y subcombinaciones de intervalos y números específicos de átomos de carbono en el mismo) derivados de la eliminación de un átomo de hidrógeno de un solo átomo decarbono de un sistema de anillo aromático parental. Algunos grupos arilo están representados en las estructuras ilustrativos como "Ar". Los grupos arilo típicos incluyen, pero no se limitan a, radicales derivados de benceno, benceno sustituido, fenilo, naftaleno, antraceno, bifenilo y similares.
Un grupo arilo, ya sea solo o como parte de otro grupo, puede estar opcionalmente sustituido con uno o más, preferiblemente de 1 a 5, o incluso de 1 a 2 grupos que incluyen, entre otros, halógeno, alquilo -C1-C8, alquenilo -C2-C8, alquinilo -C2-C8, O-(alquilo C1-C8), -O-(alquenilo C2-C8), -O-(alquinilo C2-C8), -arilo, -C(O)R”, -OC(O)R', -C(O)OR'-C(O)NH2 , -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -SR', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, =O, -N3 , -NH2, -NH(R'), -N(R')2 y -CN, en donde cada R' se selecciona independientemente de -H, alquilo C1-C8, alquenilo C2-C8, alquinilo C2-C8, o -arilo, y en donde dichos grupos alquilo -C1-C8, alquenilo -C2-C8, alquinilo -C2-C8, -O-(alquilo C1-C8), -O-(alquenilo C2-C8), -O-(alquinilo C2-C8), o -arilo, pueden estar además opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes incluyendo, pero no limitados a, alquilo -C1-C8, alquenilo -C2-C8, alquinilo -C2-C8, -O-(alquilo C1-C8), -O-(alquenilo C2-C8), -O-(alquinilo C2-C8), -arilo, -C(O)R", -OC(O)R"-C(O)OR", -C(O)NH2, -C(O)NHR", -C(O)N(R")2 , -NHC(O)R", -SR", -SO3R", -S(O)2R", -S(O)R", -OH, -N3 , -NH2 , -NH(R"), -N(R")2 y -CN, donde cada R" se selecciona independientemente de -H, alquilo C1-C8 , alquenilo C2-C8 , alquinilo C2-C8 , o arilo.
A menos que se indique lo contrario, el término "arileno" se refiere a un grupo arilo opcionalmente sustituido que es divalente (es decir, derivado de la eliminación de dos átomos de hidrógeno del mismo o dos átomos de carbono diferentes de un sistema de anillo aromático parental) y puede estar en las configuraciones orto, meta o para, como se muestra en las siguientes estructuras con fenilo como grupo arilo ilustrativo:
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Los grupos "arilo de -(alquileno C1-C8)", "arilo de -(alquenileno C2-C8)", "y arilo de -(alquinileno C2-C8)" típicos incluyen, pero no se limitan a, bencilo, 2-feniletan-1-ilo, 2-fenileten-1-ilo, naftilmetilo, 2-naftiletan-1-ilo, 2-naftileten-1-ilo, naftobencilo, 2-naftofeniletano-1-ilo y similares.
A menos que se indique lo contrario, el término "heterociclo" se refiere a un sistema de anillo monocíclico, bicíclico o policíclico que tiene de 3 a 14 átomos en el anillo (también llamados miembros del anillo) en donde al menos un átomo del anillo en al menos un anillo es un heteroátomo seleccionado de N, O, P, o S (y todas las combinaciones y subcombinaciones de intervalos y números específicos de átomos de carbono y heteroátomos en el mismo). El heterociclo puede tener de 1 a 4 heteroátomos del anillo seleccionados independientemente de N, O, P, o S. Uno o más átomos de N, C, o S en un heterociclo pueden oxidarse. Un heterociclo monocíclico tiene preferiblemente de 3 a 7 miembros de anillo (por ejemplo, de 2 a 6 átomos de carbono y de 1 a 3 heteroátomos seleccionados independientemente de N, O, P, o S), y un heterociclo bicíclico tiene preferiblemente de 5 a 10 miembros de anillo (por ejemplo, 4 a 9 átomos de carbono y 1 a 3 heteroátomos seleccionados independientemente de N, O, P, o S). El anillo que incluye el heteroátomo puede ser aromático o no aromático. A menos que se indique lo contrario, el heterociclo está unido a su grupo colgante en cualquier heteroátomo o átomo de carbono que da como resultado una estructura estable.
Los heterociclos se describen en Paquette, "Principies of Modern Heterocyclic Chemistry" (WA Benjamín, Nueva York, 1968), particularmente los capítulos 1, 3, 4, 6, 7 y 9; "The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs" (John Wiley & Sons, Nueva York, 1950 hasta la actualidad), en particular, los volúmenes 13, 14, 16, 19 y 28; y J. Am. Chem. Soc. 82:5566 (1960).
A menos que se indique lo contrario, el término "heterociclo" se refiere a un grupo heterociclo opcionalmente sustituido como se definió anteriormente que es divalente (es decir, derivado de la eliminación de dos átomos de hidrógeno del mismo o dos átomos de carbono diferentes de un sistema de anillo heterocíclico parental).
Los ejemplos de grupos "heterociclo" incluyen a modo de ejemplo y sin limitación piridilo, dihidropiridilo, tetrahidropiridilo (piperidilo), tiazolilo, pirimidinilo, furanilo, tienilo, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, tetrazolilo, benzofuranilo, tian-aftalenilo, indolilo, indolenilo, quinolinilo, isoquinolinilo, benzimidazolilo, piperidinilo, 4-piperidonilo, pirrolidinilo, 2-pirro-lidonilo, pirrolinilo, tetrahidrofuranilo, bis-tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo, bis-tetrahidropiranilo, tetrahidroquinolinilo, tetrahidroisoquinolinilo, decahidroquinolinilo, octahidroisoquinolinilo, azocinilo, triazinilo, 6H-1,2,5-tiadiazinilo, 2H,6H-1,5,2-ditiazinilo, tienilo, tiantrenilo, piranilo, isobenzofuranilo, cromenilo, xantenilo, fenoxatinilo, 2H-pirrolilo, isotiazolilo, isoxazolilo, pirazinilo, piridazinilo, indolizinilo, isoindolilo, 3H-indolilo, 1H-indazolilo, purinilo, 4H-quinolizinilo, ftalazinilo, naftiridinilo, quinoxalinilo, quinazolinilo, cinnolinilo, pteridinilo, 4H-carbazolilo, carbazolilo, pcarbolinilo, fen-antridinilo, acridinilo, pirimidinilo, fenantrolinilo, fenazinilo, fenotiazinilo, furazanilo, fenoxazinilo, isocromanilo, cromanilo, imidazolidinilo, imidazolinilo, pirazolidinilo, pirazolinilo, piperazinilo, indolinilo, isoindolinilo, quinuclidinilo, mor-folinilo, oxazolidinilo, benzotriazolilo, benzisoxazolilo, oxindolilo, benzoxazolinilo, and isatinoilo. Los grupos "heterociclo" preferidos incluyen, pero no se limitan a, benzofuranilo, benzotipenofenilo, indolilo, benzopirazolilo, cumarilo, isoquinolinilo, pirrolilo, tiofenilo, furanilo, tiazolilo, imidazolilo, pirazolilo, triazolilo, quinolinilo, pirimidinilo, piridinilo, piridonilo, pirazinilo, piridazinilo, isotiazolilo, isoxazolilo and tetrazolilo.
Un grupo heterociclo, ya sea solo o como parte de otro grupo, puede estar opcionalmente sustituido con uno o más grupos, preferiblemente de 1 a 2 grupos, que incluye pero no se limita a, alquilo -C-i-Ca, alquenilo -C2-C8, alquinilo -C2-Ca, -halógeno, O-(alquilo C1-C8), -O-(alquenilo C2-C8), -O-(alquinilo C2-C8), o -arilo, - y en donde dichos grupos -O-(alquilo C1-C8), -O-(alquenilo C2-C8), -O-(alquinilo C2-C8), -arilo, grupos alquilo C1-C8 , alquenilo -C2-C8 , y alquinilo -C2-C8 o pueden estar además opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes incluyendo, pero no limitados a, -O-(alquilo C1-C8), -O-(alquenilo C2-C8), -O-(alquinilo C2-C8), -arilo, -C(O)R", -OC(O)R"-C(O)OR", -C(O)NH2, -C(O)NHR", -C(O)N(R")2 , -NHC(O)R", -SR", -SO3R", -S(O)2R", -S(O)R", -OH, -N3, -NH2, -NH(R"), -N(R")2 y -CN, donde cada R" se selecciona independientemente de -H, alquilo C1-C8 , alquenilo C2-C8, alquinilo C2-C8, o arilo.
A modo de ejemplo y sin limitación, los heterociclos unidos a carbono pueden unirse en las siguientes posiciones:posición 2, 3, 4, 5 o 6 de una piridina; posición 3, 4, 5 o 6 de una piridazina; posición 2, 4, 5 o 6 de una pirimidina; posición 2, 3, 5 o 6 de una pirazina; posición 2, 3, 4 o 5 de un furano, tetrahidrofurano, tiofurano, tiofeno, pirrol o tetrahidropirrol; posición 2, 4 o 5 de un oxazol, imidazol o tiazol; posición 3, 4 o 5 de un isoxazol, pirazol o isotiazol; posición 2 o 3 de una aziridina; posición 2, 3 o 4 de una azetidina; posición 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 de una quinolina; o la posición 1, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 de una isoquinolina. Aún más normalmente, los heterociclos unidos a carbono incluyen 2-piridilo, 3-piridilo, 4-piridilo, 5-piridilo, 6-piridilo, 3-piridazinilo, 4-piridazinilo, 5-piridazinilo, 6-piridazinilo, 2-pirimidinilo, 4- Pirimidinilo, 5-pirimidinilo, 6-pirimidinilo, 2-pirazinilo, 3-pirazinilo, 5-pirazinilo, 6-pirazinilo, 2-tiazolilo, 4-tiazolilo o 5-tiazolilo.
A modo de ejemplo y sin limitación, los heterociclos unidos a nitrógeno pueden unirse en la posición 1 de una aziridina, azetidina, pirrol, pirrolidina, 2-pirrolina, 3-pirrolina, imidazol, imidazolidina, 2-imidazolina, 3-imidazolina, pirazol, pirazolina, 2-pirazolina, 3-pirazolina, piperidina, piperazina, indol, indolina o 1H-indazol; posición 2 de un isoindol, o isoindolina; posición 4 de una morfolina; y la posición 9 de un carbazol, o p-carbolina. Aún más normalmente, los heterociclos unidos a nitrógeno incluyen 1 -aziridilo, 1-azetedilo, 1 -pirrolilo, 1 -imidazolilo, 1 -pirazolilo y 1 -piperidinilo.
A menos que se indique lo contrario, el término "carbociclo" se refiere a un sistema de anillo monocíclico, bicíclico o policíclico no aromático saturado o insaturado que tiene de 3 a 14 átomos de anillo (y todas las combinaciones y subcombinaciones de intervalos y números específicos de átomos de carbono que contiene) en donde todos los átomos del anillo son átomos de carbono. Los carbociclos monocíclicos tienen preferiblemente de 3 a 6 átomos en el anillo, aún más preferiblemente de 5 o 6 átomos en el anillo. Los carbociclos bicíclicos tienen preferiblemente de 7 a 12 átomos en el anillo, por ejemplo, dispuestos como un sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6] o [6,6], o 9 o 10 átomos en el anillo dispuestos como un sistema biciclo [5,6] o [6,6]. El término "carbociclo" incluye, por ejemplo, un anillo de carbociclo monocíclico fusionado con un anillo de arilo (por ejemplo, un anillo de carbociclo monocíclico fusionado con un anillo de benceno). Los carbocilos tienen preferiblemente de 3 a 8 átomos de anillo de carbono.
Los grupos carbociclo, ya sea solos o como parte de otro grupo, pueden estar opcionalmente sustituidos con, por ejemplo, uno o más grupos, preferiblemente 1 o 2 grupos (y cualquier sustituyente adicional seleccionado de halógeno), que incluye, entre otros, halógeno, alquilo -C1-C8, alquenilo-C2-C8 alquinilo -C2-C8 , O-(alquilo C1-C8), -O-(alquenilo C2-C8), -O-(alquinilo C2-C8), -arilo, -C(O)R”, -OC(O)R', -C(O)OR'-C(O)NH2 , -C(O)NHR', -C(O)N(R')2 -NHC(O)R', -SR', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, =O, -N3, -NH2 , -NH(R'), -N(R')2 y -CN, en donde cada R' se selecciona independientemente de -H, alquilo C1-C8 , alquenilo C2-C8, alquinilo C2-C8, o -arilo, y en donde dichos grupos alquilo C1-C8 , alquenilo-C2-C8, alquinilo -C2-C8 , -O-(alquilo C1-C8), -O-(alquenilo C2-C8), -O-(alquinilo C2-C8), -arilo alquilo C1-C8, alquenilo -C2-C8, y alquinilo -C2-C8 o pueden estar además opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes incluyendo, pero no limitados a, alquilo -C1-C8 , alquenilo-C2-C8 alquinilo -C2-C8, -O-(alquilo C1-C8), -O-(alquenilo C2-C8), -O-(alquinilo C2-C8), -arilo, -C(O)R", -OC(O)R"-C(O)OR",’ -C(O)NH2, -C(O)NHR", -C(O)N(R")2 , -NHC(O)R", -SR", -SO3R", -S(O)2R", -S(O)R", -OH, -N3, -NH2, -NH(R"), -N(R" )2 y -CN, donde cada R" se selecciona independientemente de -H, alquilo C1-C8, alquenilo C2-C8 , alquinilo C2-C8, o arilo. Los ejemplos de sustituyentes carbocíclicos monocíclicos incluyen -ciclopropil, -ciclobutil, -ciclopentil, - 1 -ciclopent-1 enil, - 1 -ciclopent-2 -enil, - 1 -ciclopent-3-enil, ciclohexilo, -1 ciclohex-1-enil, -1-ciclohex-2-enil, -1-ciclohex-3-enil, -cicloheptil, -ciclooctil, -1,3-ciclohexadienil, -1,4-ciclohexadienil, -1,3-cicloheptadienil, -1,3,5-cicloheptatrienil, y -ciclooctadienil.
Un "carbociclo", ya sea usado solo o como parte de otro grupo, se refiere a un grupo carbociclo opcionalmente sustituido como se definió anteriormente que es divalente (es decir, derivado de la eliminación de dos átomos de hidrógeno de la misma o dos átomos de carbono diferentes de un sistema de anillo carbocíclico parental).
A menos que se indique lo contrario por el contexto, un guión (-) designa el punto de unión a la molécula colgante. En consecuencia, el término "arilo de (alquileno C1-C8) o "alquileno(arilo) -C1-C8" se refiere a un radical alquileno C1-C8 como se define en el presente documento en donde el radical alquileno está unido a la la molécula colgante en cualquiera de los átomos de carbono del radical alquileno y uno de los átomos de hidrógeno unido a un átomo de carbono del radical alquileno se reemplaza por un radical arilo como se define en el presente documento.
Cuando un grupo particular está "sustituido", ese grupo puede tener uno o más sustituyentes, preferiblemente de uno a cinco sustituyentes, más preferiblemente de uno a tres sustituyentes, lo más preferiblemente de uno a dos sustituyentes, seleccionados independientemente de la lista de sustituyentes. Sin embargo, el grupo puede tener generalmente cualquier número de sustituyentes seleccionados de halógeno. Los grupos que están sustituidos están así indicados.
Se pretende que la definición de cualquier sustituyente o variable en una localización particular en una molécula sea independiente de sus definiciones en otra parte de esa molécula. Se entiende que los sustituyentes y los patrones de sustitución en los compuestos descritos en el presente documento pueden ser seleccionados por un experto en la técnica para proporcionar compuestos que sean químicamente estables y que puedan sintetizarse fácilmente mediante técnicas conocidas en la técnica, así como los métodos expuestos en el presente documento.
Los grupos protectores como se usan en este documento se refieren a grupos que bloquean de forma selectiva, ya sea temporal o permanentemente, un sitio reactivo en un compuesto multifuncional. Los grupos protectores de hidroxi adecuados para uso en los compuestos descritos en el presente documento son farmacéuticamente aceptables y pueden o no necesitar ser escindidos del compuesto parental después de la administración a un sujeto para que el compuesto sea activo. La escisión es a través de procesos metabólicos normales dentro del cuerpo. Los grupos protectores de hidroxi son bien conocidos en la técnica, véanse, PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS
by T. W. Greene and P. G. M. Wuts (John Wiley & sons, 3rd Edition) e incluyen, por ejemplo, éter (por ejemplo, éteres de alquilo y éteres de sililo que incluyen, por ejemplo, por ejemplo, dialquilsililéter, trialquilsililéter, dialquilalcoxisililéter), éster, carbonato, carbamatos, sulfonato y grupos protectores de fosfato. Los ejemplos de grupos protectores de hidroxi incluyen, pero no se limitan a, metil éter; metoximetil éter, metiltiometil éter, (fenildimetilsilil) metoximetil éter, benciloximetil éter, p-metoxibenciloximetil éter, p-nitrobenciloximetil éter, o-nitrobenciloximetil éter, (4-metoxi-fenoxi) éter, guaiacolmetil éter, T-butoximetil éter, 4-penteniloximetil éter, siloximetil éter, 2-metoxietoximetil éter, 2,2,2-tricloroetoximetil éter, bis (2-cloroetoxi) metil éter, 2- (trimetilsililo) etoximetil éter, mentoximetil éter, tetrahidropiranil éter, 1-metoxicilcohexil éter, 4-metoxitetrahidrotropiopiranílic éter, 4-metoxitetrahidrotiopiranil éter, S,S, dióxido, 1-[(2-coro-4-metil)fenil] -4-metoxipipe-ridin-4-il éter, 1- (2-fluoropeyey) 4-metoxipiperidin-4-il éter, 1,4-dioxan-2-il éter, tetrahidrofuranil éter, tetrahidrotiofuranil éter; éteres etílicos sustituidos tales como 1-etoxietil éter, 1-(2-cloroetoxi) etil éter, 1-[2-(trimetilsilil) etoxi] etil éter, 1-metil-1-metoxietil éter, 1 -metil-1- Benciloxietil éter, 1-metil-1-benciloxi-2-fluoroetil éter, 1-metil-1fenoxietil éter, 2-trimetilsilil éter, t-butil éter, alil éter, propargil éteres, p-clorofenil éter, p- éter metoxifenílico, éter bencílico, éter p-metoxibencílico, éter 3,4-dimetoxibencílico, éter de trimetilsililo, éter de trietilsililo, éter de tripropilsililo, éter de petróleo y de origen, consumo de luz y de origen, éter de éter de silicio, éter de dimetilo, éter de dimetilo, éter de éter, éter de dimetil-éter, éter de éter de dimetilo, éster de dicloroacetato, éster de tricloroacetato, éster de trifluoroacetato, éster de metoxiacetato, éster de trifenilmetoxiacetato, éster de fenilacetato, éster de benzoato, carbonato de alquilmetilo, carbonato de alquil 9-fluorenilmetilo, carbonato de alquiletilo, alquil 2,2,2, -tricloroetilo, 1,1,-moneda de diez centavos carbonato de til-2,2,2-tricloroetilo, alquilsulfonato, metanosulfonato, bencilsulfonato, tosilato, metileno acetal, etilideno acetal y t-butilmetilideno cetal. Los grupos protectores preferidos están representados por las fórmulas -R, -Si(R)(R)(R), -C(O)R, -C(O)OR, -C(O)NH(R), -S(O)2R, -S(O)2OH, P(O)(OH)2, y -P(O)(OH)OR, donde R es alquilo C1-C20, alquenilo C2-C20, alquinilo C2-C20, (carbociclo) de alquileno -C1-C20, (carbociclo) de alquenileno -C2-C20, (carbociclo) de alquinileno -C2-C20, arilo C6-C10, (arilo) de alquileno -C1-C20, (arilo) de alquenileno -C1-C20, (arilo) de alquinileno -C2-C20, (heterociclo) de alquileno C1-C20, (heterociclo) de alquileno -C2-C20, o (heterociclo) de alquinileno -C2-C20 en donde dichos radicales alquilo, alquenilo, alquinilo, alquileno, alquenileno, alquinileno, arilo, carbociclo, y heterociclo sea solo o como parte de otro grupo están opcionalmente sustituidos.
La abreviatura "MMAE" se refiere a monometil auristatina E.
La abreviatura "MMAF" se refiere a dovalina-valina-dolaisoleuina-dolaproina-fenilalanina.
La abreviatura "cAC10-vcE", como se usa en el presente documento, se refiere a un conjugado anticuero-fármaco vc-MMAE (también conocido como mc-vc-MMAE) en donde el anticuerpo es un anticuerpo AC10 quimérico. En una realización ilustrativa, el anticuerpo AC10 quimérico tiene una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO:1, una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO:2, un humano región constante gamma I que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO:11 y una región constante kappa humana que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO:12. Las composiciones de cAC10-vcE ilustrativos tienen un promedio de aproximadamente 3 a aproximadamente 5 fármacos por anticuerpo y los fármacos se unen al anticuerpo a través de enlaces tioéter. Brentuximab vedotin es el nombre de USAN para un conjugado cAC10-vcE que se encuentra en ensayos clínicos (Seattle Genetics).
La abreviatura "h1F6-mcF" se refiere a un conjugado anticuerpo-fármaco mc-MMAF en donde el anticuerpo es un anticuerpo 1F6 humanizado. En una realización ilustrativa, el anticuerpo h1F6 tiene una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO:5, una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO:6, una región constante gamma humana que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO:11 y una región constante kappa humana que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO:12. Las composiciones de h1F6-mcF ilustrativas tienen un promedio de aproximadamente 3 a aproximadamente 5 fármacos por anticuerpo y los fármacos se unen al anticuerpo a través de enlaces tioéter. SGN-75 es un conjugado h1F6-mcF que se encuentra en ensayos clínicos (Seattle Genetics).
La abreviatura "hBU12-mcF" se refiere a un conjugado anticuerpo-fármaco mc-MMAF en donde el anticuerpo es un anticuerpo BU12 humanizado. En una realización ilustrativa, el anticuerpo hBU12 tiene una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO:9, una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO:10, una región constante gamma humana que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO:11 y una región constante kappa humana que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO:12. Las composiciones de hBU12-mcF ilustrativas tienen un promedio de aproximadamente 3 a aproximadamente 5 fármacos por anticuerpo y los fármacos se unen al anticuerpo a través de enlaces tioéter. SGN-19A es un conjugado hBU12-mcF que se encuentra en programas preclínicos (Seattle Genetics).
El término "se une específicamente" significa que el agente de unión, por ejemplo, el anticuerpo reaccionará, de manera altamente selectiva, con su antígeno correspondiente y no con la multitud de otros antígenos.
El término "inhibidor" como se usa en el presente documento se refiere a una molécula que tiene la capacidad de inhibir una función biológica de un poléptido diana. El término "inhibición selectiva" o "inhibición selectivamente" se refiere a la capacidad del agente para reducir preferentemente la actividad de señalización del objetivo en comparación con la actividad de señalización fuera del objetivo, a través de la interacción directa o indirecta con la diana.
El término "anticuerpo" se refiere a (a) polipéptidos de inmunoglobulinas y partes inmunológicamente activas de polipéptidos de inmunoglobulinas, es decir, polipéptidos de la familia de inmunoglobulinas, o fragmentos de los mismos, que contienen un sitio de unión al antígeno que se une inmunoespecíficamente a un antígeno específico, o (b) derivados sustituidos de manera conservativa de tales polipéptidos de inmunoglobulinas o fragmentos que se unen inmunoespecíficamente al antígeno. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no están limitados a, un fragmento Fab, Fab ', F(ab') 2, Fd, Fv, scFv y scFv-Fc, dicuerpo, tricuerpo, tetracuerpo, anticuerpo lineal, anticuerpo monocatenario y otros anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. (Véase Holliger and Hudson, 2005, Nat. Biotechnol. 23:1126-1136.) Las moléculas de inmunoglobulinas pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY) o clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase de molécula de inmunoglobulina. En el término inmunoglobulina se incluyen aquellas moléculas de inmunoglobulina que tienen modificaciones en la región constante, incluida la modificación (por ejemplo, sustituciones, deleciones o adiciones) en los residuos de aminoácidos que interactúan con los receptores Fcy. Los anticuerpos se describen generalmente, por ejemplo, en Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988). A menos que sea evidente a partir del contexto, la referencia a un anticuerpo también incluye derivados.
Un "derivado de anticuerpo" significa un anticuerpo, como se definió anteriormente, que se modifica por la unión covalente de una molécula heteróloga como, por ejemplo, mediante la unión de un polipéptido heterólogo, o mediante glicosilación, desglicosilación, acetilación o fosforilación normalmente no asociada al anticuerpo, y similares.
Los anticuerpos empleados en los usos médicos de la invención descritos en el presente documento son preferiblemente monoclonales, y pueden ser anticuerpos multiespecíficos, humanos, humanizados o quiméricos, anticuerpos de cadena única, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), fragmentos producidos por una biblioteca de expresión de Fab, y fragmentos de unión de cualquiera de los anteriores, siempre que puedan conjugarse con un fármaco auristatina directa o indirectamente a través de un ligador.
El término "anticuerpo monoclonal" (mAb) se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos; que son, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por mutaciones naturales que pueden estar presentes en pequeñas cantidades. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos y se dirigen contra un único determinante antigénico, también denominado epítopo. El modificador "monoclonal" es indicativo de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos dirigidos al epítope idéntico y no debe interpretarse como que requiere la producción del anticuerpo por ningún método en particular. Los anticuerpos monoclonales pueden producirse mediante cualquier técnica o metodología conocida en la técnica; por ejemplo, el método de hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., 1975, Nature 256:495, o los métodos de ADN recombinante conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 4.816.567). En otro ejemplo, los anticuerpos monoclonales también pueden aislarse de bibliotecas de anticuerpos de fagos, usando las técnicas descritas en Clackson et al., 1991, Nature 352:624-628, y Marks et al., 1991, J. Mol. Biol.
222:581-597. En contraste, los anticuerpos en una preparación de anticuerpos policlonales son normalmente una población heterogénea de isotipos y/o clases de inmunoglobulinas y también muestran una variedad de especificidad de epítopo.
"Efecto citotóxico", en referencia al efecto de un agente en una célula, significa la muerte de la célula. "Efecto citostático" significa una inhibición de la proliferación celular. Un "agente citotóxico" significa un agente que tiene un efecto citotóxico en una célula, agotando o inhibiendo así el crecimiento, respectivamente, de las células en una población celular.
El término "sujeto" o "paciente" para fines de tratamiento se refiere a cualquier animal, en particular un animal clasificado como mamífero, incluidos los humanos, los animales domésticos y de granja, y los animales del zoológico, deportivos o mascotas, como perros, caballos, gatos, vacas, y similares. Preferiblemente, el sujeto es humano.
Los términos "tratamiento" y "terapia", y similares, como se usan en este documento, se refieren a ralentizar, detener o revertir la progresión del cáncer en un sujeto. El tratamiento se puede evidenciar por la inhibición del crecimiento tumoral, la detención del crecimiento tumoral, la regresión de tumores ya existentes o el aumento de la supervivencia.
El término "cantidad terapéuticamente eficaz" o "cantidad eficaz" se refiere a la cantidad de uno o más agentes o composiciones como se describe en el presente documento que es suficiente para retardar, detener o revertir la progresión del cáncer en un sujeto o aumentar la supervivencia del paciente. La cantidad terapéuticamente eficaz puede referirse a una concentración de suero diana que se ha demostrado que es eficaz, por ejemplo, en la disminución de la progresión de la enfermedad. Cuando el término "cantidad terapéuticamente eficaz" se usa para referirse a la terapia de combinación, se refiere a la cantidad de la combinación de agentes tomados en conjunto para que el efecto combinado provoque la respuesta biológica o medicinal deseada. La eficacia se puede medir de manera convencional, dependiendo de la afección a tratar. Por ejemplo, en enfermedades neoplásicas, la eficacia puede medirse evaluando el tiempo hasta la progresión de la enfermedad (TTP), o determinando las tasas de respuesta (RR).
El término "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o listado en la Farmacopea de los EE. UU., u otra farmacopea generalmente reconocida para el uso en animales, y más particularmente en humanos. El término "ingrediente farmacéuticamente compatible" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable con el que se administra un agente o composición.
Conjugado anticuerpo-fármaco
La presente invención abarca conjugados anticuerpo-fármaco para uso en terapia de combinación para la destrucción de células tumorales y/o inhibición de la proliferación de células tumorales. En particular, la presente invención proporciona un conjugado anticuerpo-fármaco de auristatina para uso en el tratamiento del cáncer, en el que el conjugado anticuerpo-fármaco se administra en terapia de combinación con un inhibidor de la ruta PI3K-AKT-mTOR, el cual es un inhibidor de sitio no activo, el cual es un rapalog, y en donde el anticuerpo se une específicamente a un antígeno de células cancerosas que se encuentra en la superficie de una célula cancerosa que demuestra una regulación positiva de la ruta PI3K-AKT-mTOR, en donde el anticuerpo es un anticuerpo anti-CD3o o anti-CD 19 y el cáncer es un cáncer hematológico maligno o el anticuerpo es un anticuerpo anti-CD70 y el cáncer es un carcinoma de células renales; y en donde el anticuerpo está conjugado con vcMMAE o mcMMAF.
Los conjugados anticuerpo-fármaco comprenden un anticuerpo como unidad de ligando y una auristatina como unidad de fármaco. Los conjugados anticuerpo-fármaco tienen una potente actividad citotóxica y/o citostática contra las células que expresan el antígeno de las células cancerosas a las que se une específicamente el anticuerpo. Las unidades de fármaco están unidas covalentemente al anticuerpo a través de una unidad ligadora (-LU-).
En algunas realizaciones, el conjugado anticuerpo-fármaco tiene la siguiente fórmula:
L — (LU — D)p (I)
una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos; en donde
L es la unidad de ligando y es un anticuerpo,
(LU-D) es un resto unidad unidad de fármaco ligador, en donde:
LU- es una unidad ligadora, y
-D es un fármaco auristatina que tiene actividad citostática o citotóxica contra una célula diana; y p es de 1 a 20.
En algunas realizaciones, p varía de 1 a 10, de 1 a 9, de 1 a 8, de 1 a 7, de 1 a 6, de 1 a 5, de 1 a 4, de 1 a 3 o de 1 a 2. En algunas realizaciones, p varía de 2 a 10, 2 a 9, 2 a 8, 2 a 7, 2 a 6, 2 a 5, 2 a 4 o 2 a 3. En otras realizaciones, p es 1, 2, 3, 4, 5 o 6.
En algunas realizaciones, el conjugado anticuerpo-fármaco tiene la siguiente fórmula:
L -( A a - W w - Y y - D p (II)
una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos
en donde:
L es la unidad de ligando y es un anticuerpo,
-A a-Ww-Yy- es una unidad ligadora (LU), en donde:
-A- es una unidad tensora,
a es 0 o 1,
cada -W- es independientemente una unidad de aminoácido,
w es un número entero que oscila entre 0 y 12,
-Y- es una unidad espaciadora (por ejemplo, una unidad espaciadora autoinmolativa),
y es 0, 1 o 2;
-D es una unidad de fármaco auristatina que tiene actividad citostática o citotóxica contra la célula diana; y p es de 1 a 20.
En algunas realizaciones, a es 0 o 1, w es 0 o 1, e y es 0, 1 o 2. En algunas realizaciones, a es 0 o 1, w es 0 o 1, e y es 0 o 1. En algunas realizaciones, p varía de 1 a 10, de 1 a 9, de 1 a 8, de 1 a 7, de 1 a 6, de 1 a 5, de 1 a 4, de 1 a 3 o de 1 a 2. En algunas realizaciones, p varía de 2 a 10, 2 a 9, 2 a 8, 2 a 7, 2 a 6, 2 a 5, 2 a 4 o 2 a 3. En otras realizaciones, p es 1, 2, 3, 4, 5 o 6. En algunas realizaciones, cuando w no es cero, y es 1 o 2. En algunas realizaciones, cuando w es 1 a 12, y es 1 o 2. En algunas realizaciones, w es 2 a 12 e y es 1 o 2. En algunas realizaciones, a es 1 y w y son 0.
En composiciones que comprenden una pluralidad de conjugados anticuerpo-fármaco, p es el número promedio de moléculas de fármaco por ligando, también denominado carga promedio de fármaco. La carga promedio de medicamentos puede variar de 1 a aproximadamente 20 medicamentos (D) por ligando. En algunas realizaciones, cuando p representa la carga promedio de fármaco, p es aproximadamente 1, aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente, 4, aproximadamente 5 o aproximadamente 6. En realizaciones preferidas, cuando p representa la carga promedio de fármaco, p es de aproximadamente 2 a aproximadamente 6, o de aproximadamente 3 a aproximadamente 5. El número promedio de fármacos por ligando en la preparación de las reacciones de conjugación puede caracterizarse por medios convencionales, como espectroscopia de masas, ensayo ELISA y HPLC. También se puede determinar la distribución cuantitativa de los conjugados anticuerpo-fármaco en términos de p. En algunos casos, la separación, purificación y caracterización de conjugados anticuerpo-fármaco homogéneos donde p es un cierto valor de los conjugados farmacológicos de anticuerpo con otras cargas de fármaco se pueden lograr por medio de HPLC de fase inversa o electroforesis. En realizaciones ilustrativas, p es de 2 a aproximadamente 8.
La generación de conjugados anticuerpo-fármaco se puede lograr mediante cualquier técnica conocida por los expertos en la técnica. Brevemente, los conjugados anticuerpo-fármaco comprenden un anticuerpo como la unidad de ligando, un fármaco y, opcionalmente, un ligador que se une al fármaco y al agente de unión. Se encuentran disponibles varias reacciones diferentes para la unión covalente de medicamentos y/ligadores a anticuerpos. Esto se logra a menudo mediante la reacción de los residuos de aminoácidos de la molécula de anticuerpo, que incluyen los grupos amina de la lisina, los grupos ácido carboxílico libres del ácido glutámico y ácido aspártico, los grupos sulfhidrilo de la cisteína y los diversos restos de los aminoácidos aromáticos. Uno de los métodos no específicos más utilizados de unión covalente es la reacción de carbodiimida para unir un grupo carboxi (o amino) de un compuesto a grupos amino (o carboxi) del anticuerpo. Además, se han utilizado agentes bifuncionales tales como dialdehídos o imidoésteres para unir el grupo amino de un compuesto a grupos amino de una molécula de anticuerpo. También disponible para la unión de fármacos a agentes aglutinantes es la reacción de base de Schiff. Este método implica la oxidación periódica de un fármaco que contiene grupos glicol o hidroxi, formando así un aldehído que luego reacciona con el agente de unión. La unión se produce a través de la formación de una base de Schiff con grupos amino del agente de unión. Los isotiocianatos también se pueden usar como agentes de acoplamiento para unir covalentemente fármacos a agentes aglutinantes. Otras técnicas son conocidas por los expertos en la técnica.
En ciertas realizaciones, un intermedio, que es el precursor del ligador, se hace reaccionar con el fármaco en condiciones apropiadas. En ciertas realizaciones, los grupos reactivos se utilizan en el fármaco y/o el intermedio. El producto de la reacción entre el fármaco y el intermediario, o el fármaco derivado, se hace reaccionar posteriormente con el anticuerpo bajo condiciones apropiadas.
Unidades ligadoras
Normalmente, los conjugados anticuerpo-fármaco comprenden una región ligadora entre la unidad de fármaco y la unidad de ligando. En algunas realizaciones, el ligador es escindible en condiciones intracelulares, de modo que la escisión del ligador libera la unidad de fármaco del ligando en el entorno intracelular. En otras realizaciones más, la unidad ligadora no es escindible y el fármaco se libera, por ejemplo, por degradación de anticuerpos.
En algunas realizaciones, el ligador es escindible por un agente de escisión que está presente en el entorno intracelular (por ejemplo, dentro de un lisosoma o endosoma o caveola). El ligador puede ser, por ejemplo, un ligador de peptidilo que se escinde por una peptidasa intracelular o enzima proteasa, que incluye, pero no se limita a, una proteasa lisosomal o endosomal. En algunas realizaciones, el ligador de peptidilo es al menos dos aminoácidos de largo o al menos tres aminoácidos de largo. Los agentes de escisión pueden incluir catepsinas B y D y plasmina, todos los cuales se sabe que escinden derivados de fármacos dipéptidos que dan como resultado la liberación de un fármaco activo dentro de las células diana (véase, por ejemplo, Dubowchik y Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123). Los más típicos son los ligadores de peptidilo que son escindibles por las enzimas que están presentes en las células cancerosas diana. Por ejemplo, se puede usar un ligador de peptidilo que se puede escindir por la proteasa dependiente de tiol catepsina-B, que se expresa altamente en tejido canceroso (por ejemplo, un ligador Phe-Leu o Gly-Phe-Leu-Gly). Otros ejemplos de dichos ligadores se describen, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos N° 6.214.345 o Patente de Estados Unidos N° 7.659.241. En una realización específica, el ligador peptidilo escindible por una proteasa intracelular es un ligador Val-Cit o un ligador Phe-Lys (véase, por ejemplo, la patente estadounidense 6.214.345, que describe la síntesis de doxorubicina con el ligador val-cit). Una ventaja de usar la liberación proteolítica intracelular del agente terapéutico es que el agente se atenúa normalmente cuando está conjugado y las estabilidades en suero de los conjugados son normalmente altas.
En aún otras realizaciones, el ligador es escindible bajo condiciones reductoras (por ejemplo, un ligador disulfuro). Una variedad de ligadores disulfuro son conocidos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, aquellos que pueden formarse usando SATA (N-succinimidil-S-acetiltioacetato), SPDP (N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato), SPDB (N-succinimidil-3-(2-piridilditio) butirato) y SMPT (N-succinimidil-oxicarbonil-alfa-metil-alfa-(2-piridil-ditio)tolueno), SPDB y SMPT (Véase, por ejemplo, Thorpe et al., 1987, Cancer Res. 47:5924-5931; Wawrzynczak et al., In Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (CW Vogel ed., Oxford U. Press, 1987. Véase también la Patente de Estados Unidos N° 4.880.935.)
En otras realizaciones específicas, el ligador es un ligador de malonato (Johnson et al., 1995, Anticancer Res. 15:1387-93), un ligador de maleimidobenzoilo (Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1299-1304), o un análogo de 3'-N-amida (Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1305-12).
En otras realizaciones más, la unidad ligadora no es escindible y el fármaco se libera por degradación del anticuerpo. (Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. n° 7.498.298).
En un aspecto, el ligador no es sustancialmente sensible al entorno extracelular. Como se usa en el presente documento, "no sustancialmente sensible al ambiente extracelular", en el contexto de un ligador, significa que no más de aproximadamente el 20%, normalmente no más de aproximadamente el 15%, más normalmente no más de aproximadamente el 10%, e incluso más por lo general, no más de aproximadamente el 5%, no más de aproximadamente el 3%, o no más de aproximadamente el 1% de los ligadores, en una muestra de conjugado anticuerpo-fármaco, se escinden cuando el conjugado anticuerpo-fármaco se presenta en un entorno extracelular (por ejemplo, en plasma). Si un ligador no es sustancialmente sensible al ambiente extracelular se puede determinar, por ejemplo, incubando con plasma el conjugado anticuerpo-fármaco durante un período de tiempo predeterminado (por ejemplo, 2, 4, 8, 16, o 24 horas) y después cuantificando la cantidad de fármaco libre presente en el plasma.
En otras realizaciones no excluyentes entre sí, el ligador promueve la internalización celular. En ciertas realizaciones, el ligador promueve la internalización celular cuando se conjuga con el agente terapéutico ( es decir, en el medio del agente enlazante-agente terapéutico del conjugado de fármaco de anticuerpo como se describe en el presente documento). En otras realizaciones más, el ligador promueve la internalización celular cuando se conjuga tanto con el compuesto de auristatina como con el anticuerpo.
La síntesis y la estructura de unidades ligadoras, unidades de estiramiento, unidades de aminoácidos, unidades espaciadoras autoinmolativas y unidades de fármacos que se pueden usar con las presentes composiciones y métodos se describen en el documento WO 2004010957, Publicación de EE. UU. No. 20060074008, Publicación de EE. UU. 20050238649, Publicación de EE. UU. No. 20060024317, y Publicación de EE. UU. No. 20090010945.
Una "unidad ligadora" (LU) es un compuesto bifuncional que se puede usar para vincular una unidad de medicamento y una unidad de ligando para formar un conjugado de fármaco de anticuerpo. En algunas realizaciones, la unidad ligadora tiene la fórmula:
- A a - W w - Y y -
en donde: -A- es una unidad extensora,
a es 0 o 1,
cada -W- es independientemente una unidad de aminoácido,
w es un número entero que oscila entre 0 y 12,
-Y- es una unidad espaciadora (por ejemplo, una unidad espaciadora autoinmolativa), y
y es 0, 1 o 2.
En algunas realizaciones, a es 0 o 1, w es 0 o 1, e y es 0, 1 o 2. En algunas realizaciones, a es 0 o 1, w es 0 o 1, e y es 0 o 1. En algunas realizaciones, cuando w es 1 a 12, y es 1 o 2. En algunas realizaciones, w es 2 a 12 e y es 1 o 2. En algunas realizaciones, a es 1 y w y son 0.
La unidad extensora
La unidad extensora (A), cuando está presente, es capaz de unir una unidad de ligando (por ejemplo, un anticuerpo) a una unidad de aminoácido (-W-), si está presente, a una unidad espaciadora (-Y-), si está presente; o a una unidad de fármaco (-D). Los grupos funcionales útiles que pueden estar presentes en un anticuerpo tanto de forma natural como mediante manipulación química incluyen, pero no se limitan a, sulfhidrilo, amino, hidroxilo, el grupo hidroxilo anomérico de un carbohidrato, y carboxilo. Los grupos funcionales adecuados son sulfhidrilo y amino. En un ejemplo, los grupos sulfhidrilo pueden generarse por reducción de los enlaces disulfuro intramoleculares de un anticuerpo. En otra realización, los grupos sulfhidrilo pueden generarse por reacción de un grupo amino de un resto de lisina de un anticuerpo con 2-iminotiolano (reactivo de Traut) u otros reactivos generadores de sulfhidrilo. En ciertas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo recombinante y está diseñado para transportar una o más lisinas. En ciertas otras realizaciones, el anticuerpo recombinante está diseñado para llevar grupos sulfhidrilo adicionales, por ejemplo, cisteínas adicionales.
En una realización, la unidad extensora forma un enlace con un átomo de azufre de la unidad de ligando. El átomo de azufre se puede derivar de un grupo sulfhidrilo de un ligando. Las unidades extensoras representativas de esta realización se representan dentro de los corchetes de las fórmulas Illa y IIIb, en donde L-, -W-, -Y-, -D, w e y son como se definieron anteriormente, y Ra se selecciona de alquileno -C1-C10-, alquenileno -C2-C10, alquinileno -C2-C10-, -carbociclo-, -O-(alquileno C1-C8)-, O-(alquenileno C2-C8)-, -O-(alquinileno C2-C8)-, -arileno-, alquileno-arileno -C1-C10, alquenileno-arileno -C2-C10, alquinileno-arileno -C2-C10, alquenileno arileno-C1-C10, alquenileno arileno-C2-C10 alquenileno, alquinileno arileno-C2-C10 alquinileno, alquileno-(carbociclo) -C1-C10, alquileno-(carbociclo) -C2-C10, alquileno-(carbociclo)- -C2-C10, alquileno de -(carbociclo)-C1-C10, alquileno de -(carbociclo)-C2-C10, alquinileno de -(carbociclo)-C2-C10, heterociclo-, alquileno-(heterociclo)--C1-C10, alkenylene-(
heterociclo)- -C2-C10, alquinileno-(heterociclo)- -C2-C10, alquileno- de -(heterociclo)-C1-C10, alkenylene- de-(heterociclo)-C2-C10,
alquinileno- de -(heterociclo)-C2-C10, -(CH 2 CH 2 O) r-, o -(CH 2 CH 2 O) r-CH 2 -, y r es un número entero de 1-10, en el que dicho alquilo, alquenilo, alquinilo, alquileno Los radicales alquenileno, alquinileno, arilo, carbociclo, carbociclo, heterociclo y arileno, ya sean solos o como parte de otro grupo, están opcionalmente sustituidos. En algunas realizaciones, dichos radicales alquilo, alquenilo, alquinilo, alquileno, alquenileno, alquinileno, arilo, carbociclo, carbociclo, heterociclo y arileno, ya sean solos o como parte de otro grupo, no están sustituidos. En algunas realizaciones, Ra se selecciona de alquileno -C1-C10-, carbociclo-, -O-(alquileno C1-C8)-, -arileno-, alquileno-arileno -C1-C10, alquileno- de arileno-C1-C10, alquileno-(carbociclo) -C1-C10, alquileno- de -(carbociclo) C1-C10, heterociclo -C3-C8, alquileno-(heterociclo) -C1-C10, alquileno- de -(heterociclo)-C1-C10, -(CH2CH2O)r-, y -(CH2CH2O)r-CH2-; y r es un número entero que oscila entre 1 y 10, en donde dichos grupos alquileno no están sustituidos y el resto de los grupos están opcionalmente sustituidos.
Debe entenderse a partir de todas las realizaciones ilustrativas que, incluso cuando no se denotan expresamente, de 1 a 20 restos de fármaco o restos de ligador de fármaco pueden unirse a un ligando (p = 1-20).
Figure imgf000012_0001
Una unidad extensora ilustrativa es la de Fórmula Illa en donde Ra es -(CH2)5-:
Figure imgf000012_0002
Otra unidad extensora ilustrativa es la de Fórmula IIIa en donde Ra es -(CH2CH2O)-CH2-; y r es 2:
Figure imgf000012_0003
Una unidad extensora ilustrativa es la de Fórmula IIIa en donde Ra -arileno- o alquileno- de arileno- C1-C10. En algunas realizaciones, el grupo arilo es un grupo fenilo no sustituido.
Otra unidad extensora ilustrativa es la de la fórmula IIIb en donde Ra es -(CH2)5-:
Figure imgf000012_0004
En ciertas realizaciones, la unidad extensora está unida a la unidad de ligando a través de un enlace disulfuro entre un átomo de azufre de la unidad de ligando y un átomo de azufre de la unidad extensora. Una unidad extensora representativa de esta realización se representa dentro de los corchetes de la Fórmula IV, en donde Ra, L-, -W-, -Y-, -D, w e y son como se han definido anteriormente.
Figure imgf000012_0005
Debe observarse que a lo largo de esta solicitud, el resto S en la fórmula a continuación se refiere a un átomo de azufre de la unidad de ligando, a menos que el contexto indique lo contrario.
Figure imgf000012_0006
En otras realizaciones más, el extensor, antes de unirse a L, contiene un sitio reactivo que puede formar un enlace con un grupo amino primario o secundario del ligando. Los ejemplos de estos sitios reactivos incluyen, pero no se limitan a, ésteres activados tales como ésteres de succinimida, ésteres de 4 nitrofenilo, ésteres de pentafluorofenilo, ésteres de tetrafluorofenilo, anhídridos, cloruros de ácido, cloruros de sulfonilo, isocianatos e isotiocianatos. Las unidades extensoras representativas de esta realización se representan entre los corchetes de las Fórmulas Va y Vb, en el que -Ra -, L-, -W-, -Y-, -D, w e y son como se definen anteriormente;
Figure imgf000012_0007
Figure imgf000013_0001
En algunas realizaciones, el extensor contiene un sitio reactivo que es reactivo a un grupo de carbohidratos modificados (-CHO) que puede estar presente en un ligando. Por ejemplo, un carbohidrato se puede oxidar ligeramente usando un reactivo como el peryodato de sodio y la unidad resultante (-CHO) del carbohidrato oxidado se puede condensar con un extensor que contiene una funcionalidad tales como una hidrazida, una oxima, una amina primaria o secundaria, una hidrazina, una tiosemicarbazona, un carboxilato de hidrazina y una arilhidracida tales como las descritas por Kaneko et al., 1991, Bioconjugate Chem. 2:133-41. Las unidades extensoras representativas de esta realización se representan entre los corchetes de las Fórmulas VIa, VIb, y VIc, en el que -Ra -, L-, -W-, -Y-, -D, w e y son como se definen como anteriormente.
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La Unidad de aminoácidos
La unidad de aminoácido (-W-), cuando está presente, une la unidad extensora a la unidad espaciadora si la unidad espaciadora está presente, une la unidad extensora al grupo de fármaco si la unidad espaciadora está ausente, y une la unidad del ligando a la unidad del fármaco si la unidad extensora y la unidad espaciadora están ausentes.
Ww- puede ser, por ejemplo, un monopéptido, dipéptido, tripéptido, tetrapéptido, pentapéptido, hexapéptido, heptapéptido, octapéptido, nonapéptido, decapéptido, undecapéptido o dodecapéptido. Cada unidad -W- tiene la fórmula que se indica a continuación entre corchetes, y w es un número entero que oscila entre 0 y 12:
Figure imgf000013_0003
en donde Rb es hidrógeno, metilo, isopropilo, isobutilo, sec-butilo, bencilo, p-hidroxibencilo, -C2HOH, -CH(OH)CH3, -CH2-CH2SCH3 -CH2-CONH2 -CH2COOH, -CH2CH2CONH2, -CH2CH2COOH, -(CH2)3NHC(=NH)NH2, -(CH2))3NH2,’ -(CH2)3NHCOCH3, -(CH2)2NHCHO, -(CH2)4NHC(=NH)NH2, -(CH2)4NH2, -(CH2)4NHCOCH3, -(CH)4NHCHO, -(CH2)3NHCONH2 , -(CH2)4NHCONH2, -CH2CH2CH(OH)CH2NH2 , 2-piridilmetil-, 3-piridilmetil-, 4-piridilmetil-, fenilo, ciclohexilo,
Figure imgf000014_0001
En algunas realizaciones, la unidad de aminoácidos puede ser enzimáticamente escindida por una o más enzimas, inluyendo una proteasa asociada al cáncer o al tumor, para liberar la unidad de fármaco (-D), la cual en una realización está protonada in vivo tras la liberación para proporcionar un fármaco (D).
En ciertas realizaciones, la unidad de aminoácidos puede comprender aminoácidos naturales. En otras realizaciones, la unidad de aminoácidos puede comprender aminoácidos no naturales. Las unidades ilustrativas de Ww están representadas por las fórmulas (VII)-(IX):
Figure imgf000014_0002
en donde Rc y Rd son como sigue:
R c R d
Bencilo (CH2)4NH2;
metilo (CH2)4NH2;
isopropilo (CH2)4NH2;
isopropilo (CH2)3NHCONH2;
bencilo (CH2)3NHCONH2;
isobutilo (CH2)3NHCONH2;
sec-butilo (CH2)3NHCONH2;
(CH2)3NHCONH2;
>-cHrH O
bencilo metilo;
bencilo (CH2)3NHC(=NH)NH2í
Figure imgf000014_0003
en donde Rc, Rd y Re son como sigue:
Rc Rd Re
bencilo Bencilo (CH2)4NH2;
isopropilo Bencilo (CH2)4NH2; y
H Bencilo (CH2)4NH2;
Figure imgf000015_0001
en donde Rc, Rd, Re y Rf son como sigue:
Rc Rd Re Rf
H bencilo isobutilo H; y
metilo isobutilo metilo isobutilo
Las unidades de aminoácidos ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, unidades de fórmula VII donde: Rc es bencilo y Rd es -(CH2)4NH2 ; Rc es isopropilo y Rd es -(Ch 2)4NH2; o Rc es isopropilo y Rd es -(CH2)3NHCONH2. Otra unidad de aminoácido ilustrativa es una unidad de fórmula VIII en donde Rc es bencilo, Rd es bencilo y Re es -(CH2)4NH2.
Las unidades -Ww- útiles se pueden diseñar y optimizar en su selectividad para la escisión enzimática por una enzima en particular, por ejemplo, una proteasa asociada a un tumor. En una realización, una unidad -Ww- es esa cuya escisión se cataliza por la catepsina B, C y D, o una proteasa plasmina.
En una realización, -Ww- es un dipéptido, tripéptido, tetrapéptido o pentapéptido. Cuando Rb, Rc, Rd, Re o Rf es distinto de hidrógeno, el átomo de carbono al que Rb, Rc, Rd, Re o Rf está unido es quiral.
Cada átomo de carbono al que Rb, Rc, Rd, Re o Rf está unido está independientemente en la configuración (S) o (R).
En un aspecto de la unidad de aminoácidos, la unidad de aminoácidos es la valina-citrulina (vc o val-cit). En otro aspecto, la unidad de aminoácidos es fenilalanina-lisina (es decir, fk). En otro aspecto más de la unidad de aminoácidos, la unidad de aminoácidos es N-metilvalina-citrulina. En otro aspecto más, la unidad de aminoácidos es ácido 5-aminovalérico, homo fenilalanina lisina, tetraisoquinolincarboxilato lisina, ciclohexilalanina lisina, ácido isonepecótico lisina, beta-alanina lisina, glicina serina valina glutamina y ácido isopicótico.
La unidad espaciadora
La unidad espaciadora (-Y-), cuando está presente, une una unidad de aminoácido a la unidad de fármaco cuando una unidad de aminoácido está presente. Alternativamente, la unidad espaciadora une la unidad extensora a la unidad de fármaco cuando la unidad de aminoácidos está ausente. La unidad espaciadora también une la unidad de fármaco a la unidad de ligando cuando tanto la unidad de aminoácidos como la unidad extensora están ausentes.
Las unidades espaciadoras son de dos tipos generales:no autoinmolativas o autoinmolativas. Una unidad espaciadora no autoinmolativa es una en la que parte o la totalidad de la unidad espaciadora permanece unida al resto de fármaco después de la escisión, particularmente enzimática, de una unidad de aminoácido del conjugado anticuerpo-fármaco. Los ejemplos de una unidad espaciadora no autoinmolativa incluyen, pero no se limitan a una unidad espaciadora (glicina-glicina) y una unidad espaciadora de glicina (ambas representadas en el Esquema 1) (infra). Cuando un conjugado que contiene una unidad espaciadora de glicina-glicina o una unidad espaciadora de glicina experimenta una escisión enzimática a través de una enzima (por ejemplo, una proteasa asociada a células tumorales, una proteasa asociada a células cancerosas o una proteasa asociada a linfocitos), un resto glicina-glicina-fármaco o un resto de glicina-fármaco se escinden de L-Aa-Ww-. En una realización, tiene lugar una reacción de hidrólisis independiente dentro de la célula diana, escindiendo el enlace del resto glicina-fármaco y liberando el fármaco.
Esquema 1
Figure imgf000016_0001
fc"j~ Aa~Ww Gly Glyj-D
(enzimático (enzimático
(escisión 'escisión
Figure imgf000016_0002
Gly-D Gly-Gly-D
hidrólisis Ihidrólisis
♦
Fárma ]Fárma
En algunas realizaciones, una unidad espadadora no autoinmolativa (-Y-) es -Gly-. En algunas realizaciones, una unidad espadadora no autoinmolativa (-Y-) es -Gly-Gly-.
En una realización, se proporciona un conjugado de fármaco-espaciador el que la unidad espadadora está ausente (y=0), o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma.
Alternativamente, un conjugado que contiene una unidad espaciadora autoinmolativa puede liberar -D. Como se usa en el presente documento, el término "espaciador autoinmolativo" se refiere a un resto químico bifuncional que es capaz de unir covalentemente dos restos químicos separados en una molécula tripartita estable. Se separará espontáneamente del segundo resto químico si su enlace con el primer resto se escinde.
En algunas realizaciones, -Yy- es una unidad de alcohol p-aminobencil (PAB) (ver Esquemas 2 y 3 ) cuya porción de fenileno está sustituida con Qm en la que Q es alquilo C1-C8 , alquenilo -C2-C8, alquinilo -C2-C8 , -O-(alquilo C1-C8), -O-(alquenilo C2-C8), -O-(alquinilo C2-C8), -halógeno, - nitro o -ciano; y m es un número entero que oscila entre 0 y 4. Los grupos alquilo, alquenilo y alquinilo, ya sean solos o como parte de otro grupo, pueden estar opcionalmente sustituidos.
En algunas realizaciones, -Y- es un grupo PAB que está unido a -Ww- a través del átomo de nitrógeno amino del grupo PAB, y está conectado directamente a -D a través de un grupo carbonato, carbamato o éter. Sin estar vinculado por ninguna teoría o mecanismo en particular, el Esquema 2 representa un posible mecanismo de liberación de fármaco de un grupo PAB que se une directamente a -D a través de un grupo carbamato o carbonato como lo describe Toki et al., 2002, J. Org. Chem. 67:1866-1872.
Esquema 2
Figure imgf000017_0001
r F » rá \rmaig
En el Esquema 2, Q es -alquilo C1-C8, alquenilo -C2-C8, alquinilo -C2-C8 , -O- (alquilo C1-C8), -O-(alquenilo C2-C8), -O-(alquinilo C2-C8), -halógeno, nitro o ciano; m es un número entero que oscila entre 0-4; y p oscila entre 1 hasta aproximadamente 20. Los grupos alquilo, alquenilo y alquinilo, ya sean solos o como parte de otro grupo, pueden estar opcionalmente sustituidos.
Sin estar vinculado por ninguna teoría o mecanismo en particular, el Esquema 3 representa un posible mecanismo de liberación del fármaco de un grupo PAB que está unido directamente a -D a través de un enlace éter o amina, en donde D incluye el grupo oxígeno o nitrógeno que es parte de la unidad del fármaco.
Esquema 3
Figure imgf000018_0001
En el Esquema 3, Q es -alquilo C1-C8, alquenilo -C2-C8, alquinilo -C2-C8, -O-(alquilo C1-C8), -O-(alquenilo C2-C8), -O-(alquinilo C2-C8), -halógeno, nitro o ciano; m es un número entero que oscila entre 0-4; y p oscila entre 1 hasta aproximadamente 20. Los grupos alquilo, alquenilo y alquinilo, ya sean solos o como parte de otro grupo, puedenestar opcionalmente sustituidos.
Otros ejemplos de espaciadores autoinmolativos incluyen, pero no se limitan a, compuestos aromáticos que son electrónicamente similares al grupo PAB como los derivados de 2-aminoimidazol-5-metanol (Hay et al., 1999, Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237) y orto o para-aminobencilacetales. Se pueden usar espaciadores que se someten a una ciclación con la hidrólisis del enlace amida, como las amidas de ácido 4-aminobutírico sustituidas y no sustituidas (Rodrigues et al., 1995, Chemistry Biology 2:223), biciclo [2.2.1] y biciclo[2.2. 2] sistemas de anillo (Storm et al., 1972, J. Amer. Chem. Soc. 94:5815) y amidas de ácido 2-aminofenilpropiónico (Amsberry et al., 1990, J. Org. Chem.
55:5867. La eliminación de los fármacos que contienen amina que están sustituidos en la posición a de la glicina (Kingsbury et al., 1984, J. Med. Chem. 27:1447) también son ejemplos de espaciadores autoinmolativos.
En algunas realizaciones, los restos -D son los mismos. En otra realización más, los restos -D son diferentes.
En un aspecto, las unidades espaciadoras (-Yy-) están representadas por las fórmulas (X)-(XII):
Figure imgf000018_0002
en donde Q es -alquilo C1-C8, alquenilo -C2-C8, alquinilo -C2-C8 , -O-(alquilo C1-C8), -O-(alquenilo C2-C8), -O-(alquinilo C2-C8), -halógeno, nitro o ciano; m es un número entero que oscila entre 0-4. Los grupos alquilo, alquenilo y alquinilo, ya sean solos o como parte de otro grupo, pueden estar opcionalmente sustituidos.
Figure imgf000019_0001
En un grupo de realizaciones seleccionadas, los conjugados de Fórmula I y II son:
Figure imgf000019_0002
Figure imgf000020_0002
en donde Aa , Ww , Yy, D y L tienen los significados proporcionados en el presente documento. En ciertas realizaciones, w e y son cada uno 0, 1 o 2, (preferiblemente cuando w es 1 o 2, y es 1 o 2).
La unidad de fármaco
La unidad de fármaco del conjugado anticuerpo-fármaco descrito en el presente documento es una auristatina, tal como auristatina E (también conocida en la técnica como un derivado de dolastatina-10) o un derivado de la misma. La auristatina puede ser, por ejemplo, un éster formado entre la auristatina E y un cetoácido. Por ejemplo, la auristatina E se puede hacer reaccionar con ácido paraacetilbenzoico o ácido benzoilvalérico para producir AEB y AEVB, respectivamente. Otras auristatinas típicas incluyen AFP, MMAF y MMAE. La síntesis y la estructura de auristatinas ilustrativas se describen en las publicaciones de solicitud de patente de EE. UU. Números 2003-0083263, 2005­ 0238649 y 2005-0009751; Publicación de Patente Internacional No. WO 04/010957, Publicación de Patente Internacional No. WO 02/088172, y Patentes de EE.UU. Nos. 6,323,315; 6,239,104; 6,034,065; 5,780,588; 5,665,860; 5,663,149; 5,635,483; 5,599,902; 5,554,725; 5,530,097; 5,521,284; 5,504,191; 5,410,024; 5,138,036; 5,076,973; 4,986,988; 4,978,744; 4,879,278; 4,816,444; y 4,486,414.
Las auristatinas se ha demostrado que interfieren con la dinámica de los microtúbulos y la división nuclear y celular y tienen actividad anticancerígena. Las auristatinas de la presente invención se unen a la tubulina y pueden ejercer un efecto citotóxico o citostático en una línea celular deseada. Existen varios ensayos diferentes, conocidos en la técnica, que pueden usarse para determinar si una auristatina o un conjugado anticuerpo-fármaco resultante ejerce un efecto citostático o citotóxico en una línea celular deseada.
Los métodos para determinar si un compuesto se une a la tubulina son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Muller et al., Anal. Chem 2006, 78, 4390-4397; Hamel et al., Molecular Pharmacology, 199547:965-976; y Hamel et al., The Journal of Biological Chemistry, 1990265:28, 17141-17149. Para los fines de la presente invención, se puede determinar la afinidad relativa de un compuesto a tubulina. Algunas auristatinas preferidas de la presente invención se unen a la tubulina con una afinidad que varía de 10 veces menor (afinidad más débil) que la afinidad de unión de MMAE a la tubulina de 10 veces, 20 veces o incluso 100 veces mayor (afinidad más alta) que la afinidad de unión de MMAE a la tubulina.
En algunas realizaciones, -D es una auristatina de la fórmula De o Df:
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Figure imgf000021_0001
una forma de sal farmacéuticamente aceptable del mismo; en donde, independientemente en cada ubicación: la línea ondulada indica un enlace;
R2 es alquilo C1-C20, alquenilo -C2-C20, o alquinilo -C2-C20;
R3 es -H, alquilo -C1-C20, alquenilo -C2-C20, o alquinilo -C2-C20, carbociclo, (carbociclo) de alquileno -C1-C20, (carbociclo) de alquenileno -C2-C20, (carbociclo) de alquinileno -C2-C20, -arilo, (arilo) de alquileno -C1-C20, (arilo) de alquenileno -C2-C20, (arilo) de alquinileno -C2-C20, -heterociclo, (heterociclo) de alquileno-C1-C20, (heterociclo) de alquenilenoC2-C20 o (heterociclo) de alquenilenoC2-C20;
R4 es -H, alquilo -C1-C20, alquenilo -C2-C20, o alquinilo -C2-C20, carbociclo, (carbociclo) de alquileno -C1-C20, (carbociclo) de alquenileno -C2-C20, (carbociclo) alquinileno -C2-C20, -arilo, (arilo) de alquileno -C1-C20, (arilo) de alquenileno -C2-C20, (arilo) de alquinileno -C2-C20, -heterociclo, (heterociclo) de alquileno-C1-C20, (heterociclo) de alquenilenoC2-C20 o (heterociclo) de alquenilenoC2-C20;
R5 es -H o -alquilo C1-C8 ;
R4 y R5 forman conjuntamente un anillo carbocíclico y tienen la fórmula -(CRaRb)s - en el que Ra y Rb son independientemente -H, -alquilo -C1-C20, alquenilo -C2-C20, alquinilo -C2-C20, o -carbociclo y s es 2, 3, 4, 5 o 6, R6 es -H, alquilo C1-C20, alquenilo -C2-C20, o alquinilo -C2-C20;
R7 es -H, alquilo -C1-C20, alquenilo -C2-C20, o alquinilo -C2-C20, carbociclo, (carbociclo) de alquileno -C1-C20, (carbociclo) de alquenileno C2-C20, (carbociclo) de alquinileno -C2-C20, -arilo, (arilo) de alquileno -C1-C20, (arilo) de alquenileno -C2-C20, (arilo) de alquinileno -C2-C20, -heterociclo, (heterociclo) de alquileno -C1-C20, (heterociclo) de alquenileno C2-C20 o (heterociclo) de alquinileno C2-C20;
cada R8 es independientemente -H, -OH, alquilo C1-C20, alquenilo -C2-C20, o alquinilo -C2-C20, -O-(alquilo C1-C20), -O-(alquenilo C2-C20), -O-(alquinilo C1-C20), o -carbociclo;
R 9 es -H, alquilo C1-C20, alquenilo -C2-C20, o alquinilo -C2-C20;
R19 es arilo, heterociclo, o -carbociclo;
R20 es -H, alquilo C1-C20, alquenilo -C2-C20, o alquinilo -C2-C20, -carbociclo, -O-(alquilo C1-C20), -O-(alquenilo C2-C2 0 ), -O-(alquinilo C2-C2 0 ), o O R18 en donde R18 es -H, un grupo protector de hidroxilo, o un enlace directo donde O R18 representa =O;
R21 es -H, alquilo C1-C20, alquenilo -C2-C20, o alquinilo -C2-C20, arilo, heterociclo, o -carbociclo; R10 es arilo o heterociclo; Z es -O-, -S-, -NH-, o -NR12-, en donde R12 es - alquilo C1-C20, alquenilo -C2-C20, o alquinilo -C2-C20;
R 11 es -H, - alquilo C1-C20, alquenilo -C2-C20, o alquinilo -C2-C20, arilo, heterociclo, -(13OR)m' 14, o -(R13O)m-CH(R15)2 ; m es un número entero que oscila entre 0-1000;
R 13 es alquileno -C2-C20, alquenileno -C2-C20, o alquinileno -C2-C20;
R 14 es s -H, alquilo C1-C20, alquenilo -C2-C20, o alquinilo -C2-C20;
cada aparición de R15 es independientemente -H, -COOH, -(CH2)n-N(R16)2, -(CH2)n-SO3H, alquilo -(CH2)n-SO3-C1-C20, alquenilo -(CH2)n-SO3-C2-C20, alquinilo o -(CH2 V SO3-C2-C20;
cada aparición de R16 es independientemente -H,alquilo C1-C20, alquenilo -C2-C20, alquinilo -C2-C20 o -(CH2)n-COOH; y
n es un número entero que oscila entre 0 y 6; en donde dichos radicales alquilo, alquenilo, alquinilo, alquileno, alquenileno, alquinileno, arilo, carbociclo y heterociclo, ya sea solos o como parte de otro grupo, están opcionalmente sustituidos.
Las auristatinas de la fórmula De incluyen aquellas en las que dichos radicales alquilo, alquenilo, alquinilo, alquileno, alquenileno, alquinileno, arilo, carbocilo y heterociclo no están sustituidos.
Auristatinas de la fórmula D e incluyen aquellas en las que los grupos de R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 y R9 no están sustituidos y los grupos de R19, R20 y R21 están opcionalmente sustituidos como se describe en el presente documento.
Las auristatinas de fórmula De incluyen aquellas en donde
R2 es -alquilo C1-C8 ;
R3, R4 y R7 se seleccionan independientemente entre -H, -alquilo -C1-C20, alquenilo -C2-C20, alquinilo -C2-C20, carbociclo de C3-C6 monocíclico, alquileno -C1-C20 (carbociclo de C3-C6 monocíclico), alquenileno -C2-20 de (monocíclico C3-C6 carbociclo), alquenileno -C2-C20 (carbociclo de C3-C6 monocíclico), arilo -C6-C10, alquileno -C1-C20 de (arilo C6-C10), alquenileno C2 -C20 de (arilo C6 -C10 ), alquinileno C2 -C20 de (C6-C10 arilo), heterociclo, (heterociclo) de alquileno -C1-C20, (heterociclo) de alquenileno -C2-C20, o (heterociclo) de alquinileno -C2-C20; en el que dichos radicales alquilo, alquenilo, alquinilo, alquileno, alquenileno, alquinileno, carbociclo, arilo y heterociclo están opcionalmente sustituidos;
R5 es hidrógeno;
R6 es alquilo -C1-C8 ;
cada R8 se selecciona independientemente de -OH, -O-(alquilo C1-C20), -O-(alquenilo C2-C20), o -O-(alquinilo C2-C20) en donde dichos radicales alquilo, alquenilo y alquinilo están opcionalmente sustituidos;
R9 es hidrógeno o alquilo C1-C8 ;
R19 es fenilo opcionalmente sustituido;
R20 es OR18; en donde R18 es H, un grupo protector hidroxilo, o un enlace directo donde OR18 representa =O;
R21 se selecciona entre -H, alquilo -C1-C20, alquenilo -C2-C20, alquinilo -C2-C20, o -carbociclo; en donde dichos radicales alquilo, alquenilo, alquinilo y carbociclo están opcionalmente sustituidos; o una forma de sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
Las auristatinas de fórmula De incluyen aquellas en donde
R2 es metilo;
R3 es -H, alquilo -C1-C8, alquenilo -C2-C8 , o alquinilo -C2-C8 , en el que dicho alquilo, alquenilo y alquinilo están opcionalmente sustituidos opcionalmente;
R4 es -H, alquilo -C1-C8, alquenilo -C2-C8, o alquinilo -C2-C8 , carbociclo C3-C6 monocíclico, alquileno C1-C8 de (arilo C6-C10), alquenileno C2-C8 de (arilo C6-C10), alquinileno C2-C8 de (arilo C6-C10), alquileno -C1-C8(carbociclo C3-C6 monocíclico), alquenileno -C2-C8(carbociclo C3-C6 monocíclico), alquinileno -C2-C8(carbociclo C3-C6 monocíclico); en donde dichos radicales alquilo, alquenilo, alquinilo, alquileno, alquenileno, alquinileno, arilo y carbociclo, ya sea solos o como parte de otro grupo, están opcionalmente sustituidos;
R5 es H; R6 es metilo;
R7 es alquilo -C1-C8 , alquenilo -C2-C8 , o alquinilo -C2-C8 ;
cada R8 es metoxi;
R9 es hidrógeno o alquilo C1-C8 ;
R19 es fenilo;
R20 es OR18; en donde R18 es -H, un grupo protector hidroxilo, o un enlace directo donde OR18 representa =O;
R21 es metilo; o una forma de sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Las auristatinas de fórmula De incluyen aquellas en donde
R2 es metilo; R3 es H o alquilo C1-C3; R4 es alquilo C1-C5 ; R5 es H; R6 es metilo; R7 es is metoxi; R9 es hidrógeno o alquilo C1-C8 ; R19 es fenilo; R20 es OR18; en donde R18 es H, un grupo protector hidroxilo, o un enlace directo donde OR18 representa =O; y R21 es metilo; o una forma de sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
Las auristatinas de la fórmula De incluyen aquellos en los que R2 es metilo o alquilo C1-C3 ; R3 es H o alquilo C1-C3; R4 es C1-5 alquilo;R5 es H; R6 es alquilo C1-C3 ; R7 es alquilo C1-C5 ; R8 es C1-C3 alcoxi; R9 es hidrógeno o alquilo C1-C8 ; R19 es fenilo; R20 es OR18; en donde R18 es H, un grupo protector hidroxilo, o un enlace directo donde o 18 representa =O; y R21 es alquilo C1-C3; o una forma de sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
Las auristatinas de fórmula Df incluyen aquellas en donde
R2 es metilo;
R3, R4’ y R7 se seleccionan independientemente entre -H, -alquilo C1-C20, alquenilo -C2 -C20, alquinilo -C2 -C20, carbociclo C3-C6 monocíclico, alquileno -Ci -C20 (carbociclo C3-C6 monocíclico ), alquenileno -C2-C20 (carbociclo C3-C6 monocíclico ), alquinileno -C2-C20 (carbociclo C3-C6 monocíclico ), - arilo C6-C10, alquileno -C1-C20 de (arilo C6-C1 0 ), alquileno C2-C20 de (arilo C6-C10), alquinileno C2-C20 de (arilo C6-C10), -heterociclo, (heterociclo) de alquileno -C1-C20, (heterociclo) de alquenileno -C2-C20, o (heterociclo) de alquinileno -C2-C20; en donde dichos radicales alquilo, alquenilo, alquinilo, alquileno, alquenileno, alquinileno, carbociclo, arilo y heteociclo, ya sea solos o como parte de otro grupo, están opcionalmente sustituidos;
R5 es -H;
R6 es metilo;
cada R8 es metoxi;
R9 es -H, alquilo -C1-C20, alquenilo -C2-C20, o alquinilo -C2-C20; en donde dichos radicales alquilo, alquenilo y alquinilo están opcionalmente sustituidos;
R10 es arilo opcionalmente sustituido o heterociclo opcionalmente sustituido;
Z es -O-, -S-, -NH-, o -NR12 -, en donde R12 es alquilo -C1-C20, alquenilo -C2-C20, o alquinilo -C2-C20, cada de los cuales está opcionalmente sustituido;
R11 es -H, alquilo -C1-C20, alquenilo -C2-C20, alquinilo -C2-C20, -arilo, -heterociclo, -(R13O)m-R14, o - (R13O)m-CH(R15)2, en donde dichos radicales alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo y heterociclo están opcionalmente sustituidos;
m es un número entero que oscila entre 0-1000;
R13 es alquileno -C2-C20, alquenileno -C2-C20, o alquinileno -C2-C20, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido;
R14 es -H, alquilo -C1-C20, alquenilo -C2-C20, alquinilo -C2-C20 en donde dichos alquilo, alquenilo y alquinilo están opcionalmente sustituidos;
cada aparición de R15 es independientemente -H, -COOH, -(CH2)n-N(R16)2, -(CH2V S O 3H, alquilo -(CH2)n-SO3-C1-C20, alquenilo -(CH2)n-SO3-C2-C20, o alquinilo -(CH2)n-SO3-C2-C20 en donde dichos alquilo, alquenilo y alquinilo están opcionalmente sustituidos;
cada aparición de R 16 es independientemente -H,alquilo -C1-C20, alquenilo -C2-C20 o alquinilo -C2-C20 o -(CH2)n-COOH en donde dicho alquilo, alquenilo y alquinilo están opcionalmente sustituidos;
n es un número entero que oscila entre 0 y 6; o una forma de sal farmacéuticamente aceptable de los mismos. En ciertas de estas realizaciones, R10 es fenilo opcionalmente sustituido;
Las auristatinas de fórmula Df incluyen aquellas en las que los grupos de R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 y R9 no están sustituidos y los grupos de R10 y R11 son como se describen en el presente documento.
Las auristatinas de fórmula Df incluyen aquellas en donde dichos radicales alquilo, alquenilo, alquinilo, alquileno, alquenileno, alquinileno, arilo, carbociclo y heterociclo no están sustituidos.
Las auristatinas de fórmula Df incluyen aquellas en donde
R2 es alquilo C1-C3 ; R3 es H o alquilo C1-C3 ; R4 es alquilo C1-C5 ; R5 es H; R6 es alquilo C1-C3 ; R7 es alquilo C1-C5; R8 es alcoxi C1-C3 ; R9 es hidrógeno o alquilo C1-C8 ; R10 es fenilo opcionalmente sustituido; Z es O, S o NH; y R11 es como se define en el presente documento; o una forma de sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
Las auristatinas de fórmula Df incluyen aquellas en donde
R2 es metilo; R3 es H o alquilo C1-C3 ; R4 es alquilo C1-C5; R5 es H; R6 es metilo; R7 es isopropilo o sec-butilo; R8 es metoxi; R9 es hidrógeno o alquilo C1-C8 ;
R10 es fenilo opcionalmente sustituido; Z es O, S o NH; y R11 es como se define en el presente documento; o una formde sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
Las auristatinas de fórmula Df incluyen aquellas en donde
R2 es metilo; R3 es H o alquilo C1-C3 ; R4 es alquilo C1-C5; R5 es H; R6 es metilo; R7 es isopropilo o sec-butilo; R8 es metoxi; R9 es hidrógeno o alquilo C1-C8; R10 es fenilo; y Z es O o NH y R11 es como se define en el presente documento, preferiblemente hidrógeno; o una forma de sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
Las auristatinas de fórmula Df incluyen aquellas en donde
R2 es alquilo C1-C3 ; R3 es H o alquilo C1-C3 ; R4 es alquilo C1-C5 ; R5 es H; R6 es alquilo C1-C3 ; R7 es alquilo C1-C5; R8 es alcoxi C1-C3; R9 es hidrógeno o alquilo C1-C8 ; R10 es fenilo; y Z es O o NH y R11 es como se define en el presente documento, preferiblemente hidrógeno; o una forma de sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
Las auristatas de la fórmula D e o D f incluyen aquellas en las que R3, R4y R7 son independientemente isopropilo o secbutilo y R5 es -H. En una realización ilustrativa, R3 y R4 son cada uno isopropilo, R5 es H, y R7 es sec-butilo. El resto de los sustituyentes son como se definen en el presente documento.
Las auristatinas de la fórmula De o Df incluyen aquellos en donde R2 y R6 son cada uno metilo, y R9 es H. El resto de los sustituyentes son como se definen en el presente documento.
Las auristatas de la fórmula De o Df incluyen aquellas en donde cada aparición de R8 es -OCH3. El resto de los sustituyentes son como se definen en el presente documento.
Las auristatas de la fórmula De o Df incluyen aquellas en las que R3 y R4 son cada uno isopropilo, R2 y R6 son cada uno metilo, R5 es H, R7 es sec-butilo, cada vez que aparece R8 es -OCH3, y R9 es H. Los sustituyentes restantes son como se definen en el presente documento.
Las auristatinas de la fórmula Df incluyen aquellas en las que Z es -O- o -NH-. Los sustituyentes restantes son como se definen en el presente documento.
Las auristatinas de la fórmula Df incluyen aquellos en donde R10 es arilo. Los sustituyentes restantes son como se definen en el presente documento.
Las auristatinas de fórmula Df incluyen aquellas en las que R10 es -fenilo. Los sustituyentes restantes son como se definen en el presente documento.
Las auristatinas de la fórmula Df incluyen aquellos en donde Z es -O-, y R11 es H, metilo o t-butilo. Los sustituyentes restantes son como se definen en el presente documento.
Las auristatinas de la fórmula Df incluyen aquellas en las que, cuando Z es -NH, R11 es -(R13O)m-CH(R15)2 , en donde R15 es -(CH2)n-N(R16)2 , y R16 es alquilo C1-C8 o -(CH2VCOOH. Los sustituyentes restantes son como se definen en el presente documento.
Las auristatinas de la fórmula Df incluyen aquellos en donde cuando Z es -NH, R11 es -(R13O)m-CH(R15)2, en donde R15 es H o -(CH2)n-SO3H. Los sustituyentes restantes son como se definen en el presente documento.
En realizaciones preferidas, cuando D es una auristatina de fórmula De , w es un número entero que oscila entre 1 y 12, preferiblemente 2 y 12, y es 1 o 2, y a es 1 o 2, preferiblemente 1.
En algunas realizaciones, en donde D es una auristatina de fórmula Df , a es 1 y w e y son 0.
Las unidades de fármacos ilustrativas (-D) incluyen las unidades de fármacos que tienen las siguientes estructuras:
Figure imgf000025_0001
sales o solvatos farmacéuticamente aceptables de las mismas.
En un aspecto, los grupos hidrófilos, tales como pero no limitado a ésteres de trietilenglicol (TEG) se pueden unir a la unidad de fármaco en R11. Sin estar limitados por la teoría, los grupos hidrofílicos ayudan en la internalización y la no aglomeración de la unidad de fármacos.
Los conjugados anticuerpo-fármaco ilustrativos tienen las siguientes estructuras en donde "mAb" representa un anticuerpo monoclonal y S es un átomo de azufre del anticuerpo. En un aspecto, el átomo de azufre es un átomo de azufre de un residuo de cisteína. En una realización, el residuo de cisteína es un residuo de cisteína de un tiol de cadena reducida. En otro aspecto, el residuo de cistieno es un residuo de cisteína introducido en el anticuerpo. El subíndice p es un número entero de entre 1 a aproximadamente 20 y es preferiblemente de 1 a aproximadamente 5. En realizaciones, en donde p representa el número promedio de moléculas de fármaco por ligando en una composición que comprende una pluralidad de conjugados anticuerpo-fármaco, p es preferiblemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 6, o de aproximadamente 3 a aproximadamente 5.
Figure imgf000025_0002
formas de sal farmacéuticamente aceptables de los mismos.
Unidad de ligando
En la presente invención, la unidad de ligando (p. ej., anticuerpo) en el conjugado anticuerpo-fármaco se une específicamente a un antígeno de células cancerosas que se encuentra en la superficie de una célula cancerosa que demuestra una regulación positiva de la ruta PI3K-AKT-mTOR, incluyendo la activación constitutiva de la ruta PI3K-AKT-mTOR. En un aspecto, el conjugado de fármaco de anticuerpo muestra actividad citotóxica a través de la internalización.
La unidad de ligando (L) tiene al menos un grupo funcional que puede formar un enlace con un grupo funcional de una unidad ligadora. Los grupos funcionales útiles que pueden estar presentes en una unidad de ligando, ya sea de forma natural, mediante manipulación química o mediante ingeniería, incluyen, entre otros, sulfhidrilo (-SH), amino, hidroxilo, carboxi, el grupo hidroxilo anomérico de un carbohidrato, y carboxilo. En algunas realizaciones, un grupo funcional de unidad de ligando es un grupo sulfhidrilo. El grupo sulfhidrilo es normalmente un grupo sulfhidrilo accesible al disolvente, tal como un grupo sulfhidrilo accesible al disolvente sobre un residuo de cisteína. Los grupos sulfhidrilo se pueden generar mediante la reducción de un enlace disulfuro intramolecular o intermolecular de un ligando. Los grupos sulfhidrilo también pueden generarse por reacción de un grupo amino de un resto de lisina de un ligando usando 2-iminotiolano (reactivo de Traut) u otro reactivo generador de sulfhidrilo.
En algunas realizaciones, uno o más grupos sulfhidrilo se diseñan en una unidad de ligando, tal como mediante sustitución de aminoácidos. Por ejemplo, un grupo sulfhidrilo puede introducirse en una unidad de ligando. En algunas realizaciones, un grupo sulfhidrilo se introduce mediante una sustitución de aminoácido de serina o treonina en un residuo de cisteína, y/o mediante la adición de un residuo de cisteína en una unidad de ligando (un residuo de cisteína diseñado). En algunas realizaciones, el residuo de cisteína es un residuo de cisteína interno, es decir, que no se encuentra en el extremo N o en el extremo C del resto de ligando.
Para controlar el número de unidades de fármaco o de ligadores de unidades de fármaco unidas a una unidad de ligando, se pueden eliminar uno o más residuos de cisteína mediante sustitución de aminoácidos. Por ejemplo, el número de residuos de cisteína accesibles al disolvente en una región bisagra de inmunoglobulina se puede reducir mediante la sustitución de aminoácidos de cisteína a residuos de serina.
En algunas realizaciones, una unidad de ligando contiene 1, 2, 3, 4, 5, 6 7 u 8 residuos de cisteína accesibles al disolvente. En algunas realizaciones, una unidad de ligando contiene 2 ó 4 residuos de cisteína accesibles al disolvente.
Los anticuerpos empleados en los usos médicos de la invención descritos en el presente documento son preferiblemente monoclonales, y pueden ser anticuerpos multiespecíficos, humanos, humanizados o quiméricos, anticuerpos de cadena única, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), fragmentos producidos por una biblioteca de expresión de Fab, y fragmentos de unión de cualquiera de los anteriores, siempre que puedan conjugarse con un fármaco auristatina directa o indirectamente a través de un ligador. Normalmente, los anticuerpos son anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados o anticuerpos quiméricos que tienen una región variable derivada de un anticuerpo monoclonal murino y una región constante de inmunoglobulina humana. En algunas realizaciones, los anticuerpos pueden ser roedores (por ejemplo, ratones y ratas), burros, ovejas, conejos, cabras, cobayas, camélidos, caballos o pollos.
Los anticuerpos pueden ser monoespecíficos, biespecíficos, triespecíficos o de especificidad múltiple mayor. Los anticuerpos multiespecíficos pueden ser específicos para diferentes epítopos de diferentes antígenos diana o pueden ser específicos para diferentes epítopos en el mismo antígeno diana. (Véanse, por ejemplo, los documentos WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69; las patentes de EE.UU. Nos 4,474,893; 4,714,681; 4,925,648; 5,573,920; and 5,601,819 y US2010/22920; Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553.)
Los anticuerpos también se pueden describir en términos de su afinidad de unión por un antígeno diana de 10 ’7 M, 5 x 10 -8 M, 10 -8 M, 5 x 10 -9 M, 10 '9 M, 5 x 10 '10 M, 10 '10 M, 5 x 10 '11 M, 10 '11 M, 5 x 10 -12 M, 10 -12 M, 5 x 10 -13 M, 10 -13 M, 5 x 10 -14 M, 10 -14 M, 5 x 10 -15 M, o 10 -15 M.
En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico. Un anticuerpo quimérico es una molécula en la que diferentes partes del anticuerpo derivan de diferentes especies animales, tales como anticuerpos que tienen una región variable derivada de un anticuerpo monoclonal murino y una región constante de una inmunoglobulina humana. Los métodos para producir anticuerpos quiméricos son conocidos en la técnica. (Véase, por ejemplo, Morrison, Science, 1985, 229:1202; Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214; Gillies et al., 1989, J. Immunol. Methods 125:191-202; Patentes de EE.UU. Nos 5,807,715; 4,816,567; y4,816,397.)
En algunas realizaciones, el anticuerpo puede ser un anticuerpo humanizado, que incluye un anticuerpo chapado. Los anticuerpos humanizados son moléculas de anticuerpos que se unen al antígeno deseado y tienen una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de una especie no humana, y regiones estructurales y constantes de una molécula de inmunoglobulina humana. A menudo, los residuos estructurales de las regiones estructurales humanas se sustituirán con el resto correspondiente del anticuerpo donante de CDR para alterar, o preferiblemente mejorar, la unión al antígeno. Estas sustituciones estructurales se identifican mediante métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante el modelado de las interacciones de la CDR y los residuos estructurales para identificar los residuos estructurales importantes para la unión al antígeno y la comparación de secuencias para identificar residuos estructurales inusuales en posiciones particulares. (Véase, por ejemplo, Queen et al., Patente de Estados Unidos N° 5,585,089; Riecbmann y otros, 1988, Nature 332:323).
Un anticuerpo también puede ser un anticuerpo humano. Los anticuerpos humanos se pueden producir mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica, tales como los métodos de expresión en fagos (véase anteriormente) utilizando bibliotecas de anticuerpos derivadas de secuencias de inmunoglobulinas humanas. Véase también, por ejemplo, las patentes de EE.UU. Nos 4.444.887 y 4.716.111; los documentos WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, y WO 91/10741.
Los ejemplos de anticuerpos incluyen aquellos que se unen específicamente a los antígenos expresados por los cánceres que demuestran la regulación positiva de la ruta PI3K-AKT-mTOR, incluida la activación constitutiva de la ruta PI3K/AKT mTOR. En los usos médicos de la invención, el anticuerpo se une al antígeno CD19, CD30 o CD70.
Los anticuerpos ilustrativos incluyen, por ejemplo, formas quiméricas o humanizadas de los anticuerpos murinos AC10 (anti-CD30), 1F6 murino (anti-CD70) y BU12 murino (anti-CD 19). El anticuerpo AC 10 murino tiene una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEC ID NO:1 y una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEC ID NO:2 El anticuerpo 1F6 murino tiene una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO:3 y una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO:4. El anticuerpo BU12 murino tiene una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la s Ec ID NO:7 y una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO:8. Estos anticuerpos se describen con más detalle en la patente de EE.UU. n° 7,090,843; y las publicaciones de EE.UU. número 20090148942 y 20090136526.
En una realización ilustrativa, el anticuerpo es una versión quimérica o humanizada de un anticuerpo de ratón que tiene (i) una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO:1 y una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos establecido en la SEC ID NO:2; (ii) una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO:3 y una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO:4; o (iii) una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO:7 y una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO:8. En una realización ilustrativa, dicho anticuerpo comprende además la secuencia de aminoácidos de la región constante gamma I humana expuesta en la SEC ID NO:11 o los aminoácidos 1 a 329 de la SEC ID NO:11 y la secuencia de aminoácidos de la región constante kappa humana establecida en la SEC ID NO:12.
En una realización ilustrativa, el anticuerpo es un anticuerpo AC10 quimérico que tiene una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO:1 y una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO:2. En una realización ilustrativa, dicho anticuerpo comprende además la secuencia de aminoácidos de la región constante gamma I humana expuesta en la SEC ID NO:11 o los aminoácidos 1 a 329 de la SEC ID NO:11 y la secuencia de aminoácidos de la región constante kappa humana establecida en la SEC ID NO:12.
En una realización ilustrativa, el anticuerpo es un anticuerpo h1F6 humanizado que tiene una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO:5 y una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO:6. En una realización ilustrativa, dicho anticuerpo comprende además la secuencia de aminoácidos de la región constante gamma I humana expuesta en la SEC ID NO:11 o los aminoácidos 1 a 329 de la SEC ID NO:11 y la secuencia de aminoácidos de la región constante kappa humana establecida en la SEC ID NO:12.
En una realización ilustrativa, el anticuerpo es un anticuerpo hBU12 humanizado que tiene una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO:9 y una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEC ID NO:10. En una realización ilustrativa, dicho anticuerpo comprende además la secuencia de aminoácidos de la región constante gamma I humana expuesta en la SEC ID NO:11 o los aminoácidos 1 a 329 de la SEC ID NO:11 y la secuencia de aminoácidos de la región constante kappa humana establecida en la SEC ID NO:12.
Los anticuerpos pueden analizarse para determinar la unión específica mediante métodos conocidos, como por ejemplo, sistemas de inmunoensayos competitivos y no competitivos que utilizan técnicas tales como transferencias de Western, radioinmunoensayos, ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas), inmunoensayos de tipo "sándwich", ensayos de inmunoprecipitación, ensayos inmunorradiométricos, inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos con proteína A y citometría de flijo. (Véase, por ejemplo, Ausubel et al., Eds., Short Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, 4a ed. 1999); Harlow & Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Ny , 1999.)
Además, la afinidad de unión de un anticuerpo a un antígeno diana y la tasa de desunión de una interacción anticuerpoantígeno pueden determinarse por resonancia de plasmón de superficie, FACS de competencia usando anticuerpos marcados u otros ensayos de unión competitiva.
Los anticuerpos pueden prepararse utilizando fragmentos de la proteína CD30 que contienen antígenos mediante procedimientos habituales según el tipo de anticuerpo (véase, por ejemplo, Kohler, et al., Nature, 256:495, (1975); Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (Cs Hp , NY, 1988); Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989) y el documento WO 90/07861; Dower et al., documento WO 91/17271 y McCafferty et al., documento WO 92/01047.
Ensayos de citotoxicidad para conjugados anticuerpo-fármaco
Se conocen métodos para determinar si un conjugado danticuerpo-fármaco ejerce un efecto citostático y/o citotóxico en una célula. En general, la actividad citotóxica o citostática de un conjugado anticuerpo-fármaco puede medirse: exponiendo células que expresan una proteína diana del conjugado anticuerpo-fármaco en un medio de cultivo celular; cultivando las células durante un período de aproximadamente 6 horas a aproximadamente 5 días; y midiendo la viabilidad celular. Los ensayos in vitro a base de células se pueden usar para medir la viabilidad (proliferación), la citotoxicidad y la inducción de la apoptosis (activación de caspasa) del conjugado anticuerpo-fármaco.
Para determinar si un conjugado de fármaco de anticuerpo ejerce un efecto citostático, se puede usar un ensayo de incorporación de timidina. Por ejemplo, las células cancerosas que expresan un antígeno diana a una densidad de 5.000 células/pocillo de una placa de 96 pocillos puede ser cultivadas durante un período de 72 horas y se expusieron a 0,5 |jC¡ de 3H-timidina durante las 8 horas finales del período de las 72 horas del período. La incorporación de 3H-timidina en las células del cultivo se mide en presencia y ausencia del conjugado anticuerpo-fármaco.
Para determinar la citotoxicidad, se puede medir la necrosis o la apoptosis (muerte celular programada). La necrosis normalmente va acompañada de un aumento de la permeabilidad de la membrana plasmática; e hinchazón de la célula y rotura de la membrana plasmática. La apoptosis se caracteriza normalmente por la formación de ampollas en la membrana, la condensación del citoplasma y la activación de endonucleasas endógenas. La determinación de cualquiera de estos efectos en las células cancerosas indica que un conjugado anticuerpo-fármaco es útil en el tratamiento de cánceres.
La viabilidad celular puede medirse determinando en una célula la captación de un colorante como el rojo neutro, el azul tripán o el azul ALAMAR™ (véase, por ejemplo, Page et al., 1993, Intl. J. Oncology 3:473-476). En dicho ensayo, las células se incuban en medios que contienen el colorante, las células se lavan y el colorante restante, que refleja la captación celular del colorante, se mide espectrofotométricamente. El colorante de unión a proteínas sulforodamina B (SRB) también se puede usar para medir la citotoxicidad (Skehan et al., 1990, J. Natl. Cancer Inst. 82:1107-12).
Alternativamente, se usa una sal de tetrazolio, como MTT, en un ensayo colorimétrico cuantitativo para la supervivencia y proliferación de células de mamíferos al detectar células vivas, pero no muertas (véase, por ejemplo, Mosmann, 1983, J. Immunol. Métodos 65:55-63).
La apoptosis se puede cuantificar midiendo, por ejemplo, la fragmentación del ADN. Se dispone de métodos fotométricos comerciales para la determinación cuantitativa in vitro de la fragmentación del ADN. Los ejemplos de tales ensayos, incluyendo TUNEL (que detecta la incorporación de nucleótidos marcados en ADN fragmentado) y ensayos a base de ELISA, se describen en Biochemica, 1999, no. 2, pp. 34-37 (Roche Molecular Biochemicals).
La apoptosis también se puede determinar midiendo los cambios morfológicos en una célula. Por ejemplo, al igual que con la necrosis, la pérdida de integridad de la membrana plasmática se puede determinar midiendo la captación de ciertos colorantes (por ejemplo, un colorante fluorescente como, por ejemplo, naranja de acridina o bromuro de etidio). Un método para medir el número de células apoptóticas ha sido descrito por Duke y Cohen, Current Protocols in Immunology (Coligan et al. Eds., 1992, pp. 3.17.1-3.17.16). Las células también pueden marcarse con un colorante de ADN (por ejemplo, acridina naranja, bromuro de etidio o yoduro de propidio) y puede observarse la condensación y la marginación de la cromatina a lo largo de la membrana nuclear interna. Otros cambios morfológicos que pueden medirse para determinar la apoptosis incluyen, por ejmplo, condensación citoplásmica, aumento de la formación de ampollas en la membrana y contracción celular.
La presencia de células apoptóticas se puede medir tanto en los compartimentos unidos como en los "flotantes" de los cultivos. Por ejemplo, ambos compartimentos pueden recogerse eliminando el sobrenadante, tripsinizando las células unidas, combinando las preparaciones después de una etapa de lavado por centrifugación (por ejemplo, 10 minutos a 2000 rpm) y detectando la apoptosis (por ejemplo, midiendo fragmentación del ADN). (Véase, por ejemplo, Piazza et al., 1995, Cancer Research 55:3110-16).
Los efectos de los conjugados anticuerpo-fármaco pueden probarse o validarse en modelos animales. El experto en la técnica conoce una serie de modelos animales de cáncer establecidos, cualquiera de los cuales puede usarse para evaluar la eficacia de un conjugado anticuerpo-fármaco. Los ejemplos no limitativos de tales modelos se describen a continuación. Además, se pueden crear pequeños modelos animales para examinar las eficacias in vivo de los conjugados anticuerpo-fármaco implantando líneas de células tumorales humanas en cepas de roedores inmunodeficientes apropiadas, por ejemplo, ratones atímicos desnudos o ratones SCID.
Inhibidores de la ruta PI3K-AKT-mTOR
mTOR existe en dos tipos de complejos, mTORC1 que contiene la subunidad del raptor y mTORC2 que contiene el rictor. Como se conoce en la técnica, "rictor" se refiere a una proteína reguladora del crecimiento celular que tiene el locus génico humano 5pl3.1. Estos complejos están regulados de manera diferente y tienen un espectro diferente de sustratos.
mTORC2 es generalmente insensible a la rapamicina y a los inhibidores selectivos. Se cree que mTORC2 modula la señalización del factor de crecimiento mediante la fosforilación del motivo hidrófobo C-terminal de algunas quinasas AGC, tal como la Akt. En muchos contextos celulares, se requiere mTORC2 para la fosforilación del sitio S473 de Akt. Así, la actividad de mTORC1 está parcialmente controlada por Akt, mientras que la propia Akt está parcialmente controlada por mTORC2.
La estimulación del factor de crecimiento de la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) provoca la activación de Akt por fosforilación en los dos sitios clave, S473 y T308. Se ha informado que la activación completa de Akt requiere la fosforilación de S473 y T308Active. Akt promueve la supervivencia y la proliferación celular de muchas maneras, incluyendo la supresión de la apoptosis, la promoción de la captación de glucosa y la modificación del metabolismo celular. De los dos sitios de fosforilación en Akt, se cree que la fosforilación en bucle de activación en T308, mediada por PDKl, es indispensable para la actividad de la quinasa, mientras que la fosforilación del motivo hidrofóbico en S473 potencia la actividad de la quinasa Akt. La fosforilación de AKT en S473 se puede usar como un marcador para la activación constitutiva de la ruta mT PI3K/AKT. En algunos aspectos, la fosforilación de AKT tanto en S473 como en T308 se usa como un fabricante para la activación constitutiva de la ruta mTA de PI3K/AKT.
Inhibidores mTOR
Los inhibidores de mTOR usados en la presente invención pueden proporcionar un efecto sinérgico cuando se usan en terapia de combinación con conjugados anticuerpo-fármaco a base de auristatina para el tratamiento del cáncer, para la destrucción de células tumorales y/o para inhibir la proliferación de células tumorales.
Como se usa en el presente documento, el término "inhibidor de mTOR" se refiere a un compuesto o un ligando que inhibe al menos una actividad de una proteína mTOR, tal como, por ejemplo, la actividad de la proteína quinasa serina/treonina en al menos uno de sus sustratos (por ejemplo, p70S6 quinasa 1 ,4E-BP1, AKT/PKB y eEF2).
Los inhibidores de mTOR de la presente invención pueden unirse directamente e inhibir mTORC1, mTORC2 o tanto mTORC1 como mTORC2 mediante la unión a mTORC1 y/o mTORC1.
Una clase de inhibidores de mTOR descritos en este documento son los inhibidores de sitios activos. Estos son inhibidores de mTOR que se unen al sitio de unión de ATP (también conocido como bolsillo de unión de ATP) de mTOR e inhiben la actividad catalítica tanto de mTORC1 como de mTORC2. Por consiguiente, en un ejemplo, un inhibidor de mTOR compite con el ATP por unirse al sitio de unión de ATP en mTORC1 y/o mTORC2. Los ensayos ilustrativos para determinar si un compuesto compite con ATP son conocidos en la técnica. Un ensayo de este tipo se proporciona en el ejemplo 12.
Una clase de inhibidores de sitios activos descritos en este documento son inhibidores de especificidad dual ya que se dirigen e inhiben directamente tanto a PI3K como a mTOR. Los inhibidores de especificidad dual se unen tanto al sitio de unión de ATP de mTOR como a PI3K. Los ejemplos de dichos inhibidores incluyen wortmannin, LY294002, PI-103 (Cayman chemical), SF1126 (Semafore), BGT226 (Novartis), XL765 (Exelixis) y NVP-BEZ235 (Novartis). (Liu et al., Nature Review, 8, 627-644, 2009). En algunos ejemplos, el inhibidor de especificidad dual será una imidazoquinazolina (por ejemplo, un derivado de imidazo[4,5-c ]quinolina). Se conocen en la técnica ensayos ilustrativos para determinar si un compuesto se une a y/o inhibe PI3K y/o mTOR. Un ensayo de este tipo se proporciona en el ejemplo 12.
Otra clase de inhibidores de sitios activos descritos en el presente documento son los inhibidores selectivos de mTOR. Esta clase de inhibidores de mTOR inhibe selectivamente la actividad de mTORC1 y mTORC2 en relación con una o más quinasas de tipo I de fosfatilinositol tipo I. El tipo de 3 quinasas de fosfatilinositol de tipo I se puede seleccionar de, por ejemplo, Pl3 kinasa a, PI3 quinasa p, o PI3 quinasa 8. Estos inhibidores de sitios activos se unen al sitio activo de mTOR pero no a PI3K. Los ejemplos de tales inhibidores incluyen Torinl (Guertin y Sabatini), PP242 (2- (4-Amino-1 -isopropil-IH-pirazolo [3,4-d] pirimidin-3-il) -1H-indol-5-ol), PP30, Ku-0063794, WAY-600 (Wyeth), WAY-687 (Wyeth), WAY-354 (Wyeth) y AZD8055 (Sparks y Guertin, Oncogene, 29, 2733-2744, 2010, Liu et al., Nature Review, 8, 627­ 644, 2009). En algunos ejemplos, el inhibidor de mTor será una pirazolopirimidina. Los métodos para determinar la selectividad de los inhibidores de mTOR son conocidos en la técnica. Un ensayo de este tipo se proporciona en el ejemplo 12.
En un ejemplo, un inhibidor selectivo de mTOR puede entenderse alternativamente como un agente que muestra una concentración inhibitoria del 50% (IC50) con respecto a mTORC1 y/o mTORC2, que es al menos 10 veces, al menos 20 veces al menos 50 veces, al menos 100 veces, al menos 1000 veces o más, más bajo que la IC50 del inhibidor con respecto a una, dos, tres o más PI3-quinasas de tipo I.
En algunos ejemplos, un inhibidor selectivo de mTOR puede entenderse alternativamente como un agente que muestra una concentración inhibitoria del 50% (IC50) con respecto a mTORC1 y/o mTORC2, que es al menos 10 veces, al menos 20 veces al menos 50 veces, al menos 100 veces, al menos 1000 veces o más, más bajo que la IC50 del inhibidor con respecto a todas las PI3-quinasas tipo I.
En otro ejemplo más, se puede entender que un inhibidor selectivo de mTOR se refiere a un compuesto que exhibe una concentración inhibitoria del 50% (IC50) con respecto a mTOR, que es al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 50 doble, al menos 100 veces, al menos 1000 veces, o más, más bajo que la IC50 del inhibidor con respecto a una o más proteína quinasas.
Una clase de inhibidores de mTOR para uso en la presente invención se denominan en el presente documento "rapalogs". Como se usa en el presente documento, el término "rapalogs" se refiere a compuestos que se unen específicamente al dominio FRB de mTOR (dominio de unión a la rapamicina FKBP), están relacionados estructuralmente con la rapamicina y retienen las propiedades inhibidoras de mTOR. El término rapalogs excluye rapamicina. Los rapalogs incluyen ésteres, éteres, oximas, hidrazonas e hidroxilaminas de rapamicina, así como compuestos en los que los grupos funcionales en la estructura del núcleo de rapamicina se han modificado, por ejemplo, por reducción u oxidación. Las sales farmacéuticamente aceptables de tales compuestos también se consideran derivados de rapamicina. En algunas realizaciones, los rapalogs, como la rapamicina, inhiben selectivamente a mTORC1 en relación con mTORC2. Los rapalogs ilustrativos para uso en la presente invención incluyen, por ejemplo, temsirolimus (CC1779), everolimus (RAD001), deforolimus (AP23573), AZD8055 (AstraZeneca) y OSI-027 (OSI). Los ensayos ilustrativos para identificar si un compuesto se une al dominio mTOR FRB son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Chen et al. (1995) PNAS vol 92 pp. 4947-4951.
Otro inhibidor de mTOR para uso en la presente invención es la rapamicina (sirolimus).
En algunas realizaciones, el inhibidor de mTOR usado en la presente invención no es rapamicina (sirolimus).
En un aspecto, los inhibidores de mTOR ilustrativos para uso en la presente invención inhiben mTORC1, mTORC2 o tanto mTORC1 como mTORC2 con una IC50 (concentración que inhibe el 50% de la actividad) de aproximadamente 200 nM o menos, preferiblemente de aproximadamente 100 nm o menos incluso más preferiblemente aproximadamente 60 nM o menos, aproximadamente 25 nM, aproximadamente 10 nM, aproximadamente 5 nM, aproximadamente 1 nM, 100 pM, 50 pM, 25 pM, 10 pM, 1 pM, o menos. En un aspecto, un inhibidor de mTOR para uso en la presente invención inhibe mTORC1, mTORC2 o tanto mTORC1 como mTORC2 con una IC50 de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 100 nm, más preferiblemente de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 50 nM, incluso más preferiblemente de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 15 nM.
En un aspecto, los inhibidores de mTOR ilustrativos para uso en la presente invención inhiben P13K y mTORC1 o mTORC2 o tanto mTORC1 como mTORC2 y P13K con una IC50 (concentración que inhibe el 50% de la actividad) de aproximadamente 200 nM o menos, preferiblemente de aproximadamente 100 nM nm o menos, incluso más preferiblemente aproximadamente 60 nM o menos, aproximadamente 25 nM, aproximadamente 10 nM, aproximadamente 5 nM, aproximadamente 1 nM, 100 pM, 50 pM, 25 pM, 10 pM, 1 pM o menos. En un aspecto, un inhibidor de mTOR para uso en la presente invención inhibe P13K y mTORC1 o mTORC2 o tanto mTORC1 como mTORC2 y P13K con una IC50 de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 100 nm, más preferiblemente de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 50 nM, incluso más preferiblemente de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 15 nM.
Las determinaciones de IC50 pueden realizarse usando cualquier técnica convencional conocida en la técnica. Por ejemplo, una IC50 puede determinarse midiendo la actividad de una enzima dada en presencia de un intervalo de concentraciones del inhibidor en estudio. Los valores obtenidos experimentalmente de la actividad de la enzima se representan luego en función de las concentraciones de inhibidor utilizadas. La concentración del inhibidor que muestra actividad enzimática al 50% (en comparación con la actividad en ausencia de cualquier inhibidor) se toma como el valor "IC50". Análogamente, otras concentraciones inhibitorias pueden definirse a través de determinaciones apropiadas de actividad.
Se ha demostrado que mTOR demuestra una actividad catalítica robusta y específica hacia las proteínas del sustrato fisiológico, la proteína cinasa I ribosomal p70 S6 (p70S6K1) y la proteína de unión 1 a e1F4E (4EBP1) según se mide por anticuerpos fosforescentes en Transferencia de Western. En un aspecto, las determinaciones de IC50 se pueden realizar midiendo el nivel de fosforilación de las proteínas del sustrato, como p70S6K1 y 4EBP1. Las células, por ejemplo, pueden ponerse en contacto con el inhibidor en estudio en condiciones que normalmente producirían la fosforilación de los sustratos mTOR p70S6K1 y 4EBP1. Las células pueden entonces prepararse mediante diversos métodos conocidos en la técnica, incluyendo la fijación o lisis, y analizar los niveles de fosforilación de los sustratos de mTOR. Los niveles de fosforilación se pueden analizar utilizando cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, entre otros, el uso de anticuerpos específicos para las formas fosforiladas de los sustratos que se analizarán mediante inmunotransferencia o citometría de flujo.
La inhibición de la actividad de mTORC1 y/o mTORC2 se puede determinar mediante una reducción en la transducción de señales de la ruta PI3K/Akt/mTOR. Se puede utilizar una amplia variedad de lecturas para establecer una reducción de la salida de dicha ruta de señalización. Algunas lecturas ilustrativas no limitativas incluyen (1) una disminución en la fosforilación de Akt en los residuos, incluidos, entre otros, S473 y T308; (2) una disminución en la activación de Akt como se evidencia, por ejemplo, por una reducción de la fosforilación de sustratos de Akt, que incluye pero no se limita a Fox01/O3a T24/32, GSK3a/p; S21/9, y TSC2 T1462; (3) una disminución en la fosforilación de las moléculas de señalización aguas abajo de mTOR, que incluyen pero no se limitan a S6 S240/244 ribosomal, 70S6K T389 y 4EBP1 T37/46; y (4) inhibición de la proliferación de células cancerosas.
Los ensayos basados en células para establecer la inhibición selectiva de mTORC1 y/o mTORC2 pueden tomar una variedad de formatos. Esto generalmente dependerá de la actividad biológica y/o la lectura de transducción de señal que se esté investigando. Por ejemplo, la capacidad del agente para inhibir mTORC1 y/o mTORC2 para fosforilar el (los) sustrato (s) aguas abajo puede determinarse mediante varios tipos de ensayos de quinasa conocidos en la técnica. Los ensayos representativos incluyen, entre otros, inmunotransferencia e inmunoprecipitación con anticuerpos como los anticuerpos antifosfotirosina, antifosfoserina o antifosfotreonina que reconocen proteínas fosforiladas.
Alternativamente, pueden usarse anticuerpos que reconocen específicamente una forma fosforilada particular de un sustrato de quinasa (por ejemplo, anti-fosfo a Kt S473 o anti-fosfo AKT T308). Además, la actividad de la quinasa puede detectarse mediante ensayos quimioluminiscentes de alto rendimiento. En otro aspecto, se pueden usar ensayos de células individuales, como la citometría de flujo, como se describe en el experimento de flujo de fósforo, para medir la fosforilación de múltiples sustratos de mTOR corriente abajo en poblaciones celulares mixtas.
El efecto de la inhibición de mTORC1 y/o mTORC2 y/o P13K se puede establecer mediante el ensayo de formación de colonias celulares u otras formas de ensayo de proliferación celular. Una amplia gama de ensayos de proliferación celular está disponible en la técnica, y muchos de los cuales están disponibles como kits. Los ejemplos no limitantes de ensayos de proliferación celular incluyen pruebas para ensayos de captación de timidina tritiada, captación de BrdU (5'-bromo-2'-desoxiuridina) (kit comercializado por Calibochem), captación de MTS (kit comercializado por Promega), captación de MTT (comercializado por kit) por Cayman Chemical), captación de tinte CyQUANT® (comercializado por Invitrogen).
El análisis de la apoptosis y la detención del ciclo celular se puede realizar con cualquier método ejemplificado aquí, así como con otros métodos conocidos en la técnica. Se han ideado muchos métodos diferentes para detectar la apoptosis.
El inmunoensayo de fluorescencia de lantánidos con disociación y los ensayos descritos en Toral-Barz et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 332 (2005), 304-310, se pueden usar para determinar si un compuesto es un inhibidor mTOR.
Inhibidores de PI3K
Los inhibidores de PI3K descritos en el presente documento pueden proporcionar un efecto sinérgico cuando se usan en terapia de combinación con conjugados de anticuerpo-fármaco a base de auristatina.
Como se usa en el presente documento, el término "inhibidor de PI3K" se refiere a un compuesto o un ligando que se une e inhibe al menos una actividad de PI3K. Las proteínas PI3K se pueden dividir en tres clases, P13Ks de clase 1, P13Ks de clase 2 y P13K de clase 3. Las P13K de clase 1 existen como heterodímeros que consisten en una de las cuatro subunidades catalíticas p110 (p110a, p110p, p1108 y p110Y) y una de las dos familias de subunidades reguladoras. Un inhibidor de PI3K se dirige preferentemente a los inhibidores de PI3K de clase 1. En un ejemplo, un inhibidor de PI3K mostrará selectividad para una o más isoformas de los inhibidores de PI3K de clase 1 (es decir, selectividad para p110a, p110p, p1105 y p110Y o uno o más de p110a, p110p, p1108 y p110Y). En otro ejemplo, un inhibidor de PI3K no mostrará selectividad de isoforma. En un ejemplo, un inhibidor de Pl3K competirá por la unión con ATP al dominio catalítico P13K.
Un inhibidor de PI3K puede, por ejemplo, dirigir a PI3K así como a proteínas adicionales en la ruta PI3K-AKT-mTOR. Un inhibidor de PI3K que se dirige tanto a mTOR como a PI3K puede denominarse inhibidor de mTOR o inhibidor de PI3K. Un inhibidor de PI3K que solo se dirige a PI3K puede denominarse como un inhibidor de PI3K selectivo. En un ejemplo, se puede entender que un inhibidor selectivo de PI3K se refiere a un agente que exhibe una concentración inhibitoria del 50% con respecto a PI3K que es al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 30 veces, al menos 50 -fold, al menos 100 veces, al menos 1000 veces, o más, más bajo que la IC50 del inhibidor con respecto a mTOR y/u otras proteínas en la ruta.
En un ejemplo, los inhibidores de PI3K ilustrativos para uso en la presente invención inhiben PI3K con una IC50 (concentración que inhibe el 50% de la actividad) de aproximadamente 200 nM o menos, preferiblemente de aproximadamente 100 nm o menos, incluso más preferiblemente de aproximadamente 60 nM o menos, aproximadamente 25 nM, aproximadamente 10 nM, aproximadamente 5 nM, aproximadamente 1 nM, 100 pM, 50 pM, 25 pM, 10 pM, 1 pM, o menos. En un ejemplo, un inhibidor de PI3K descrito en el presente documento inhibe PI3K con una IC50 de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 100 nm, más preferiblemente de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 50 nM, incluso más preferiblemente de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 15 nM.
Los ejemplos de inhibidores de PI3K para uso en combinación con conjugados anticuerpo-fármaco a base de auristatina incluyen, por ejemplo, BKM120 (inhibidor de clase 1 P13K, Novartis), XL147 (inhibidor de clase 1 P13K, Exelixis), inhibidor de GDC0941 (clase 1, P13K, Genentech), GSK1059615 (inhibidor de pan-P13K, GlaxoSmithKline), PX-866 (inhibidor de clase 1 P13K; p110a, p110p, y p110y, Oncothyreon), y CAL-101 (inhibidor de clase 1 P13K; p1105 isoforma, Calistoga).
Inhibidores de AKT
Los inhibidores de AKT descritos en el presente documento pueden proporcionar un efecto sinérgico cuando se usan en terapia de combinación con conjugados anticuerpo-fármaco a base de auristatina.
Como se usa en el presente documento, el término "inhibidor de AKT" se refiere a un compuesto o un ligando que se une e inhibe al menos una actividad de AKT. Los inhibidores de AKT se pueden agrupar en varias clases, incluyendo los inhibidores a base de lípidos (por ejemplo, los inhibidores que se dirigen al dominio de homología de pleckstrina de la AKT que evita que la AKT se localice en las membranas plasmáticas), los inhibidores de la ATP competitiva y los inhibidores alostéricos. En un aspecto, los inhibidores de AKT actúan uniéndose al sitio catalítico de AKT. En un ejemplo, los inhibidores de Akt actúan inhibiendo la fosforilación de AKT dianas posteriores como mTOR.
Los inhibidores de AKT pueden dirigirse a las tres isoformas de AKT, AKT1, AKT2, AKT3 o pueden ser selectivas a las isoformas y apuntar solo a una o dos de las isoformas de AKT. Un inhibidor de la AKT puede, por ejemplo, dirigir a AKT así como a proteínas adicionales en la ruta PI3K-AKT-mTOR. Un inhibidor de AKT que solo ataca a AKT puede denominarse un inhibidor selectivo de AKT. En un ejemplo, se puede entender que un inhibidor selectivo de AKT se refiere a un agente que exhibe una concentración inhibitoria del 50% con respecto a AKT que es al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 30 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces, al menos 1000 veces, o más bajo que la IC50 del inhibidor con respecto a otras proteínas en la ruta.
En un ejemplo, los inhibidores de AKT ilustrativos descritos en el presente documento inhiben AKT con una IC50 (concentración que inhibe el 50% de la actividad) de aproximadamente 200 nM o menos, preferiblemente de aproximadamente 100 nm o menos, incluso más preferiblemente de aproximadamente 60 nM o menos, aproximadamente 25 nM, aproximadamente 10 nM, aproximadamente 5 nM, aproximadamente 1 nM, 100 pM, 50 pM, 25 pM, 10 pM, 1 pM, o menos. En un ejemplo, un inhibidor de AKT descrito aquí inhibe AKT con una IC50 de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 100 nm, más preferiblemente de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 50 nM, incluso más preferiblemente de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 15 nM.
Los ejemplos de inhibidores de AKT para usar en combinación con conjugados anticuerpo-fármaco a base de auristatina incluyen, por ejemplo, perifosina (Keryx), MK2206 (Merck), VQD-002 (VioQuest), x L418 (Exelixis) y PX316 (PROLX Pharmaceuticals).
Cánceres
La presente invención encuentra utilidad en los métodos que abarcan la administración de terapia de combinación a un sujeto para el tratamiento del cáncer. En realizaciones ilustrativas, el cáncer a tratar por la presente invención demuestra una regulación positiva de la ruta PI3K-AKT-mTOR.
Los métodos descritos en el presente documento abarcan la administración de terapia de combinación a un sujeto para el tratamiento del cáncer. En realizaciones ilustrativas, el cáncer a tratar por la presente invención demuestra una regulación positiva de la ruta PI3K-AKT-mTOR.
La regulación positiva de la ruta PI3K-AKT-mTOR puede determinarse por un aumento en la transducción de la señal de la ruta PI3K/Akt/mTOR. Se puede utilizar una amplia variedad de lecturas para establecer un aumento en la salida de dicha ruta de señalización. Algunas lecturas ilustrativos no limitativas incluyen (1) un aumento en la fosforilación de Akt en los residuos, incluidos, entre otros, S473 y T308; (2) un aumento en la activación de Akt como lo demuestra la reducción de la fosforilación de los sustratos de Akt, que incluye pero no se limita a Fox01/O3a T24/32, GSK3a/p; S21/9, y TSC2 T1462; y (3) un aumento en la fosforilación de las moléculas de señalización aguas abajo de mTOR, que incluyen pero no se limita a ribosomal S6 S240/244, 70S6K T389 y 4EBP1 T37/46.
Por consiguiente, en un ejemplo, un cáncer que se va a tratar con los métodos descritos es uno en el que la ruta mTOR de PI3K/AKT se activa constitutivamente, como lo demuestra la presencia de AKT fosforilado (pAKT) y, en particular, la fosforilación de AKT al menos uno de los dos sitios clave, S473 y T308, y, preferiblemente, en ambos sitios. En un aspecto, el tejido canceroso tendrá niveles elevados de pAKT en comparación con el tejido no canceroso.
En otro aspecto, un cáncer que se va a tratar con los métodos descritos es uno en el que la ruta m3 de PI3K/AKT está regulada positivamente, como lo demuestra la presencia de la proteína quinasa I ribosomal p70 fosforilada (p70S6K1), la proteína ribosomal S6 fosforilada y/o e1F4E proteína de unión 1. En un aspecto, el tejido canceroso tendrá niveles elevados de p70S6K1 y/proteína de unión a fosfo-e1F4E en comparación con el tejido no canceroso.
La presencia de pAKT se ha informado previamente en muchos tipos de cáncer. Tales cánceres incluyen neoplasias hematológicas. Por consiguiente, en algunas realizaciones, los métodos descritos en este documento son para tratar tumores malignos hematológicos. En un aspecto, las neoplasias hematológicas son los linfomas. En un aspecto, las neoplasias malignas hematológicas son los linfomas de células B. En otra realización, las neoplasias malignas hematológicas son linfomas de células T. Los ejemplos de linfomas particulares incluyen el linfoma Hodgkin y el linfoma no Hodgkin (LNH). Los ejemplos de NHL incluyen, por ejemplo, linfoma de células del manto, linfoma anaplásico de células grandes, linfoma cutáneo de células T, linfoma periférico de células T, linfoma difuso de células B grandes, linfoma de Burkitt y linfoma folicular. En otra realización, las neoplasias malignas hematológicas son una leucemia, tal como, por ejemplo, la leucemia linfoblástica aguda o la leucemia linfocítica crónica.
La presencia de pAKT ha sido reportada previamente en muchos tumores sólidos, incluyendo, por ejemplo, cáncer colorrectal, renal, gástrico, de próstata, tiroides, endometrial, de pulmón, de cerebro y de mama. Por consiguiente, en algunas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento son para tratar tumores sólidos. Los ejemplos de tumores sólidos tratables mediante los métodos incluyen, por ejemplo, cáncer colorrectal, renal, gástrico, de próstata, tiroides, endometrial, de pulmón, de cerebro y de mama. En un aspecto, el cáncer es el carcinoma de células renales.
Los métodos descritos abarcan la terapia de combinación para el tratamiento de los cánceres caracterizados por la presencia de pAKT. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la neoplasia maligna hematológica, el linfoma, el linfoma Hogkin, la NHL o la leucemia tratable por la presente invención expresarán AKT fosforilado. De manera similar, en algunas realizaciones, el cáncer de tumor sólido, colorrectal, renal, gástrico, próstata, tiroides, endometrio, pulmón, cerebro o mama expresará AKT fosforilado. La expresión puede ser citoplásmica o nuclear. En un aspecto, la expresión es sustancialmente citoplásmica. En otro aspecto, la expresión es sustancialmente nuclear. En otro aspecto, la expresión es citoplásmica y nuclear.
Los métodos descritos abarcan la terapia de combinación para el tratamiento de los cánceres caracterizados por la presencia de la proteína quinasa I ribosomal p70 fosforilada (p70S6K1) y/o la proteína 1 de unión a e1F4E. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el tumor maligno hematológico, el linfoma, el linfoma Hogkin o el NHL tratable por la presente invención expresarán la proteína quinasa I ribosomal p70 fosforilada (p70S6K1) y/o la proteína 1 de unión a e4F4E. De manera similar, en algunas realizaciones, el cáncer sólido, colorrectal, renal, gástrico, próstata, tiroides, endometrio, pulmón, cerebro o mama expresará la proteína cinasa I ribosomal p70 S6 fosforilada (p70S6K1) y/o e1F4E (proteína 1 de unión phopho- e1F4E).
En algunas realizaciones, el cáncer tendrá una alta expresión de pAKT. En realizaciones ilustrativas, alta expresión de pAKT se refiere a un número mediano de células p-AKT+/mm2 de área de tumor mayor que aproximadamente 25 células/mm2, mayor que 50 células/mm2, o incluso mayor que 100 células/mm2 La determinación de la cantidad de células pAKT+ se realiza generalmente utilizando técnicas de inmunohistoquímica.
Cualquiera de los cánceres descritos en el presente documento puede tratarse utilizando una terapia de combinación con un conjugado anticuerpo-fármaco a base de auristatina y un inhibidor de mTOR, incluyendo cualquiera de las clases de inhibidores de mTOR descritos en el presente documento, y cualquiera de los conjugados anticuerpofármaco a base de auristatina descrito en este documento. El componente de anticuerpo del conjugado anticuerpofármaco a base de auristatina se unirá específicamente a un antígeno de células cancerosas que se expresa en la superficie de la célula cancerosa a tratar.
En algunas realizaciones, el cáncer será uno que exprese un antígeno CD30 y el conjugado anticuerpo-fármaco a base de auristatina será uno que se una específicamente al antígeno CD30 (por ejemplo, el componente del anticuerpo es un anticuerpo anti-CD30, preferiblemente un anticuerpo monoclonal anti-CD30). El conjugado anticuerpo-fármaco a base de auristatina después de unirse al antígeno se internalizará en las células cancerosas, donde ejerce su efecto. En un aspecto, el cáncer que expresa el antígeno CD30 expresa pAKT (AKT fosforilado en S473 y T308). En un aspecto, el cáncer tendrá una alta expresión de pAKT. El cáncer puede ser, por ejemplo, un tumor maligno hematológico, que incluye, por ejemplo, linfoma de células B o linfocitos T o leucemia. En algunas realizaciones, el cáncer es linfoma Hodgkin, linfoma de células del manto, linfoma difuso de células B grandes, leucemia linfocítica crónica, leucemia linfoblástica aguda, linfoma cutáneo de células T, linfoma periférico de células T, o cualquiera de los otros cánceres que expresan CD30 descritos en el presente documento, incluyendo tumores sólidos. Por consiguiente, la terapia de combinación de acuerdo con los métodos descritos puede incluir la administración del conjugado anticuerpo-fármaco a base de auristatina anti-CD30 con un inhibidor de la ruta PI3K-AKT-mTOR para el tratamiento de un cáncer que expresa CD30 (por ejemplo, linfoma de células B o linfocitos T, linfoma Hodgkin, LNH, leucemia o tumor sólido). En algunos aspectos, el inhibidor será un inhibidor de mTOR, un inhibidor de PI3K o un inhibidor de AKT. En un aspecto, el inhibidor de mTOR será un inhibidor del sitio activo, que incluye, por ejemplo, un inhibidor de especificidad dual, como wortmannin, LY294002, PI-103, BGT226, SF1126, XL765 y NVP-BEZ235 (Liu et al., Nature Review, 8, 627-644, 2009) o un inhibidor selectivo de mTOR, que incluye, por ejemplo, Torin1, PP242, PP30, Ku-0063794, WAY-600, WAY-687, WAY-354 y AZD8055. En otros aspectos, el inhibidor de mTOR será un rapalog, incluido, por ejemplo, temsirolimus (CC1779), everolimus (RAD001) y deforolimus (AP23573). En un aspecto, el inhibidor será un inhibidor de AKT que incluye, por ejemplo, perifosina, MK2206, VQD-002, XL418 y PX316. En otro aspecto, el inhibidor será un inhibidor de P i3k , que incluye, por ejemplo, BKM120, XL147, GDC0941, GSK1059615, PX-866 o CAL-101.
En algunas realizaciones, el cáncer será uno que exprese un antígeno CD70 y el conjugado anticuerpo-fármaco a base de auristatina será uno que se una específicamente al antígeno CD70 (por ejemplo, el componente del anticuerpo es un anticuerpo anti-CD70, preferiblemente un anticuerpo monoclonal anti-CD70). El conjugado anticuerpo-fármaco a base de auristatina después de unirse al antígeno se internalizará en las células cancerosas, donde ejerce su efecto. En un aspecto, el cáncer que expresa el antígeno CD70 expresa pAKT (AKT fosforilado en S473 y T308). En un aspecto, el cáncer tendrá una alta expresión de pAKT. El cáncer puede ser, por ejemplo, un tumor maligno hematológico, que incluye, por ejemplo, linfoma de células B o linfocitos T o leucemia. En algunas realizaciones, el cáncer es un linfoma no Hodgkin, que incluye cualquiera de los LNH descritos en este documento (por ejemplo, linfoma de células del manto y linfoma difuso de células grandes B). En algunas realizaciones, el cáncer es un tumor sólido, que incluye, por ejemplo, el carcinoma de células renales. En algunas realizaciones, el cáncer es una leucemia, que incluye, por ejemplo, la leucemia linfocítica crónica o la leucemia linfoblástica aguda. Por consiguiente, la terapia de combinación de acuerdo con los métodos descritos puede incluir la administración del conjugado anticuerpo-fármaco a base de auristatina anti-CD70 con un inhibidor de la ruta PI3K-AKT-mTOR para el tratamiento de un cáncer que expresa CD70 (por ejemplo, linfoma de células B o linfocitos T, leucemia, NHL o tumor sólido, incluido el carcinoma de células renales). En algunos aspectos, el inhibidor será un inhibidor de mTOR, un inhibidor de PI3K o un inhibidor de AKT. En algunos aspectos, el inhibidor de mTOR será un inhibidor de sitio activo, incluido, por ejemplo, un inhibidor de especificidad dual, como wortmannin, LY294002, PI-103, BGT226, SF1126, XL765 y NVP-BEZ235 (Liu et al., Nature Review, 8, 627-644, 2009) o un inhibidor selectivo de mTOR, que incluye, por ejemplo, Torin1, PP242, PP30, Ku-0063794, WAY-600, WAY-687, WAY-354 y AZD8055. En otros aspectos, el inhibidor de mTOR será un rapalog, incluido, por ejemplo, temsirolimus (CC1779), everolimus (RAD001) y deforolimus (AP23573). En un aspecto, el inhibidor será un inhibidor de AKT que incluye, por ejemplo, perifosina, MK2206, VQD-002, XL418 y PX316. En otro aspecto, el inhibidor será un inhibidor de P i3k , que incluye, por ejemplo, BKM120, XL147, GDC0941, GSK1059615, PX-866 o CAL-101.
En algunas realizaciones, el cáncer será uno que exprese un antígeno CD19 y el conjugado anticuerpo-fármaco a base de auristatina será uno que se una específicamente al antígeno CD19 (por ejemplo, el componente del anticuerpo es un anticuerpo anti-CD19, preferiblemente un anticuerpo monoclonal anti-CD19). El conjugado anticuerpo-fármaco a base de auristatina después de unirse al antígeno se internalizará en las células cancerosas, donde ejerce su efecto. En un aspecto, el cáncer que expresa el antígeno CD19 expresa pAKT (AKT fosforilado en S473 y T308). En un aspecto, el cáncer tendrá una alta expresión de pAKT. El cáncer puede ser, por ejemplo, un tumor maligno hematológico, que incluye, por ejemplo, un linfoma de células B o leucemia. En algunas realizaciones, el cáncer es un linfoma no Hodgkin, incluido cualquiera de los LNH descritos en este documento (por ejemplo, linfoma de células del manto y linfoma difuso de células grandes B). En algunas realizaciones, el cáncer es una leucemia, que incluye, por ejemplo, la leucemia linfocítica crónica o la leucemia linfoblástica aguda. Por consiguiente, la terapia de combinación de acuerdo con los métodos descritos puede incluir la administración del conjugado anticuerpo-fármaco a base de auristatina anti-CD19 con un inhibidor de la ruta PI3K-AKT-mTOR para el tratamiento de un cáncer que expresa CD19 (por ejemplo, linfoma de células B, leucemia, o NHL). En algunos aspectos, el inhibidor será un inhibidor de mTOR, un inhibidor de PI3K o un inhibidor de AKT. En algunos aspectos, el inhibidor de mTOR será un inhibidor de sitio activo, que incluye, por ejemplo, un inhibidor de especificidad dual, como wormannin, LY294002, PI-103, BGT226, SF1126, XL765 y Nv P-BeZ235 (Liu et al., Nature Review, 8, 627-644, 2009) o un inhibidor selectivo de mTOR, que incluye, por ejemplo, Torin1, PP242, PP30, Ku-0063794, WAY-600, WAY-687, WAY-354 y AZD8055. En otros aspectos, el inhibidor de mTOR será un rapalog, incluido, por ejemplo, temsirolimus (CC1779), everolimus (RAD001) y deforolimus (AP23573). En un aspecto, el inhibidor será un inhibidor de AKT que incluye, por ejemplo, perifosina, MK2206, VQD-002, XL418 y PX316. En otro aspecto, el inhibidor será un inhibidor de PI3K, que incluye, por ejemplo, BKM120, XL147, GDC0941, GSK1059615, PX-866 o CAL-101.
El conjugado anticuerpo-fármaco a base de auristatina anti-CD30, anti-CD19 o anti-CD70 para uso en terapia de combinación con un inhibidor mTOR puede tener cualquiera de las estructuras proporcionadas aquí para los conjugados anticuerpo-fármaco a base de auristatina. En un aspecto, el conjugado anticuerpo-fármaco a base de auristatina anti-CD30, anti-CD 19 o anti-CD70 se conjuga mediante un ligador a las auristatinas MMAE o MMAF. El conjugado anticuerpo-fármaco a base de auristatina anti-CD30, anti-CD 19 o anti-CD70 puede ser, por ejemplo, un conjugado anticuerpo-fármaco vcMMAE o mcF anti-CD30, anti-CD 19 o anti-CD70 (por ejemplo, cAC10-vcE, h1F6-mcF, o hBU12-mcF). En un aspecto, una composición que comprende conjugados anticuerpo-fármaco vcMMAE o mcF anti-CD30, anti-CD 19, o anti-CD70 tiene un promedio de aproximadamente 2 a aproximadamente 6, o de aproximadamente 3 a aproximadamente 5 fármacos por anticuerpo. En un aspecto, cada fármaco está unido al anticuerpo a través de un átomo de azufre de un residuo de cisteína de un enlace disulfuro entre cadenas reducido. En otro aspecto, cada fármaco está unido al anticuerpo a través de un átomo de azufre de un residuo de cisteína introducido. El residuo de cisteína se introduce preferiblemente en la región CH2 del anticuerpo.
Terapia de combinación
Se ha encontrado que la terapia de combinación con un conjugado anticuerpo-fármaco a base de auristatina y un inhibidor de la ruta PI3K-AKT-mTOR puede proporcionar un efecto sinérgico.
Como se usa en este documento, el término "sinergia" o "efecto sinérgico" cuando se usa en relación con una descripción de la eficacia de una combinación de agentes, significa cualquier efecto medido de la combinación que sea mayor que el efecto predicho a partir de una suma de los efectos de los agentes individuales.
La sinergia de dos compuestos puede determinarse mediante el uso de un método in vitro. Por ejemplo, el sinergismo, la aditividad o el antagonismo para cada combinación de medicamentos puede determinarse utilizando la ecuación de efecto medio de Chou-Talalay:
D = Dm[fa/(1-fa)]1/m Ecuación de efecto mediana
(D) es la dosis del fármaco. (Dm) es la dosis de efecto mediana que significa la potencia. Esto se determina por la intersección con x de la gráfica de efecto mediana. (fa) es la fracción afectada por la dosis. (fu) es la fracción no afectada, (1-fa). (m) es un exponente que significa la sigmoidicidad (forma) de la curva dosis-efecto. Está determinada por la pendiente de la gráfica de efecto mediana. El coeficiente de correlación lineal "r" debe ser mayor o igual a 0,90. Las unidades de concentración de fármacos son arbitrarias. Los valores del índice de combinación (IC) <0,9 indican sinergismo, los valores de IC 0,9-1,1 indican aditividad y los valores de IC> 1,1 indican antagonismo.
En un ejemplo para determinar la sinergia in vivo, los tumores se recogen de animales donantes, se desagregan, se cuentan y se vuelven a inyectar en ratones huéspedes. Las combinaciones de anticancerígenos generalmente se inyectan en algún momento posterior, ya sea por ruta intraperitoneal, intravenosa o administrada por vía oral, y se determinan las tasas de crecimiento del tumor y/la supervivencia, en comparación con los controles no tratados y los controles expuestos solo a uno de los terapias Las tasas de crecimiento normalmente se miden para los tumores que crecen en el flanco frontal del animal, en donde los diámetros perpendiculares del ancho del tumor se traducen en una estimación de la masa o volumen total del tumor. El tiempo para alcanzar una masa predeterminada (por ejemplo, el tiempo para que el tumor se triplique) se compara con el tiempo requerido para un crecimiento tumoral igual en los animales de control. Si el tiempo para alcanzar la masa predeterminada para el animal tratado con la terapia de combinación es mayor que el valor obtenido al añadir el tiempo para alcanzar la masa predeterminada para el animal tratado con la terapia "A" y el animal tratado con la terapia "B" (es decir, cada terapia por sola), se puede decir que la terapia de combinación proporciona un efecto sinérgico. En otro ejemplo, el tiempo para alcanzar la masa predeterminada para el animal tratado con la terapia de combinación podría no ser mayor que el valor obtenido al añadir el tiempo para alcanzar la masa predeterminada para el animal tratado con la terapia "A" y el animal tratado con terapia "B"; sin embargo, otro efecto medido de la combinación que es mayor que el predicho a partir de la suma de los efectos de los agentes individuales es suficiente para identificar/determinar la terapia de combinación como sinérgica. Por ejemplo, si el número de respuestas duraderas o completas para los animales tratados con la terapia de combinación es mayor que la suma del número de respuestas duraderas o completas en cada brazo de tratamiento solo, la terapia combinada proporciona un efecto sinérgico. Una respuesta duradera (DR) se define como la ausencia de tumor palpable en el animal.
En general, la cantidad de conjugado a base de auristatina e inhibidor de la ruta PI3K-AKT-mTOR que es eficaz en el tratamiento del cáncer puede determinarse mediante técnicas clínicas estándar. Además, los ensayos in vitro pueden emplearse opcionalmente para ayudar a identificar los intervalos de dosis óptimos. La dosis precisa que se debe emplear en la formulación también depende de la ruta de administración y el estadio del cáncer, y debe decidirse de acuerdo con el criterio del médico y las circunstancias de cada paciente. Las dosis eficaces pueden extrapolarse a partir de curvas dosis-respuesta derivadas de sistemas de ensayo in vitro o de modelos animales.
Por ejemplo, al determinar una interacción sinérgica entre dos o más componentes, el intervalo óptimo para el efecto y el intervalo de dosis absoluta de cada componente se puede medir mediante la administración de los componentes en diferentes intervalos de relación p/p pacientes en necesidad de tratamiento. La observación de la sinergia en una especie puede ser predictiva del efecto en otras especies y existen modelos animales para medir un efecto sinérgico y los resultados de dichos estudios pueden usarse para predecir los intervalos de dosis eficaces y de concentración plasmática, y las dosis absolutas y las concentraciones plasmáticas requeridas en otras especies mediante la aplicación de métodos farmacocinéticos y farmacodinámicos.
En algunas realizaciones, los dos fármacos, el inhibidor de la ruta PI3K-AKT-mTOR y el conjugado anticuerpo-fármaco a base de auristatina se administrarán a un sujeto en sus respectivas dosis máximas tolerables (MTD). La MTD corresponde a la dosis más alta de un medicamento que se puede administrar sin efectos secundarios inaceptables. Está dentro de la técnica para determinar MTD. En algunos aspectos, el conjugado anticuerpo-fármaco a base de auristatina se proporcionará en su MTD y el inhibidor de mTOR se administrará en dosis del 50% al 100%, preferiblemente del 50% al 90% de la MTD. Alternativamente, el inhibidor de mTOR se dosificará en un 50% -100%, preferiblemente en un 50% a un 90% de la MTD y el conjugado anticuerpo-fármaco a base de auristatina se administrará en un 50% -100%, preferiblemente en un 50% a un 90% de la MTD. En algunos aspectos, tanto el conjugado anticuerpo-fármaco a base de auristatina como el inhibidor de mTOR se administrarán al 60% a 90% de la MTD. En ciertos aspectos, al administrar el inhibidor de mTOR a una dosis reducida en comparación con la MTD en combinación con el conjugado anticuerpo-fármaco a base de auristatina, se puede reducir la toxicidad asociada con el tratamiento (es decir, los efectos adversos). En un ejemplo, en los métodos para tratar un cáncer que exprese CD70, se proporcionará el conjugado anticuerpo-fármaco a base de auristatina en su MTD y el inhibidor de la ruta PI3K-AKT-mTOR se administrará al 50% a 90% de la MTD o incluso del 30% al 75% de la MTD. En un aspecto, el inhibidor de la ruta PI3K-AKT-mTOR se administrará en dosis de 50% a 90% de la MTD o incluso de 30% a 75% de la MTD y el conjugado anticuerpo-fármaco a base de auristatina CD70 (por ejemplo, h1F6- mcF) se administrará a 0,5 mg/kg, 0,8 mg/kg, 1 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3 mg/kg, 4,5 mg/kg o 6 mg/kg por dosis (por ejemplo, 1 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2 mg/kg, 2,5 mg/kg 3 mg/kg, 4,5 mg/kg o 6 mg/kg cada 3 semanas).
Los inhibidores de mTOR, los inhibidores de PI3K y los inhibidores de AKT se proporcionan actualmente tanto en forma de dosis oral como en forma iv. En una realización ilustrativa, basándose en los resultados obtenidos con temsirolimus, el inhibidor de mTOR se proporcionará en una dosis de infusión iv. En un aspecto, la dosis será de entre, por ejemplo, aproximadamente 0,1 y 100 mg/m2, siendo preferido entre aproximadamente 2,5 y 70 mg/m2. Actualmente, el inhibidor de mTOR temsirolimus se administra a una dosis de 25 a 50 mg en una infusión semanal (generalmente 25 mg) para el tratamiento del carcinoma de células renales. En otra realización ilustrativa, basándose en los resultados obtenidos con el everolimus, el inhibidor de mTOR se proporcionará en forma oral. En un aspecto, la dosis será de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 50 mg al día, prefiriéndose de aproximadamente 2,5 mg a 20 mg al día. Actualmente, el inhibidor de mTOR everolimus se administra por vía oral en una dosis diaria de aproximadamente 2,5 mg a 20 mg al día (generalmente 10 mg) para el tratamiento del carcinoma de células renales.
La dosis del conjugado anticuerpo-fármaco a base de auristatina estará normalmente entre aproximadamente 0,5 mg/kg y aproximadamente 15 mg/kg del peso corporal del sujeto por dosis. En algunas realizaciones, la dosis estará entre aproximadamente 0,5 mg/ y aproximadamente 10 mg/kg por dosis o entre aproximadamente 1 mg/kg y aproximadamente 7 mg/kg por dosis. En realizaciones particulares, la dosis será de aproximadamente 0,8 mg/kg, aproximadamente 1,0 mg/kg, aproximadamente 1,2 mg/kg, aproximadamente 1,8 mg/kg, aproximadamente 2,0 mg/kg, aproximadamente 2,7 mg/kg, aproximadamente 3 mg/kg, aproximadamente 3,6 mg/kg, aproximadamente 4,5 mg/kg o aproximadamente 6 mg/kg del peso corporal del sujeto.
Tal como se utiliza en esta invención, el régimen de combinación puede administrarse simultáneamente o puede administrarse en un régimen secuencial, con el inhibidor de la ruta PI3K-AKT-mTOR administrado en un momento diferente durante el curso de la terapia que el conjugado anticuerpo-fármaco a base de auristatina. En un aspecto, el inhibidor de la ruta PI3K-AKT-mTOR se proporciona antes del conjugado de fármaco. En otro aspecto, el inhibidor de la ruta PI3K-AKT-mTOR se proporciona siguiendo el conjugado de fármaco. Esta diferencia de tiempo puede variar desde varios minutos, horas, días o semanas, entre la administración de los dos agentes. Por lo tanto, el término combinación no significa necesariamente administrado al mismo tiempo o como una dosis unitaria, sino que cada uno de los componentes se administra durante un período de tratamiento deseado. En algunos métodos, los agentes respectivos se administran con una proximidad suficiente como para que durante algún tiempo los agentes estén presentes simultáneamente en niveles detectables en el paciente que se está tratando, por ejemplo, tanto el inhibidor de mTOR como el conjugado anticuerpo-fármaco a base de auristatina son detectables en la sangre (por ejemplo, suero o plasma). Los agentes pueden ser administrados por diferentes rutas. Como es típico de los regímenes quimioterapéuticos, un ciclo de quimioterapia puede repetirse varias semanas después, y puede seguir el mismo período de tiempo para la administración de los dos agentes, o puede modificarse según la respuesta del paciente. Como es típico en la quimioterapia, los regímenes de dosis son controlados de cerca por el médico tratante, basándose en numerosos factores que incluyen la gravedad de la enfermedad, la respuesta a la enfermedad, cualquier toxicidad relacionada con el tratamiento, la edad, la salud del paciente y otros trastornos o tratamientos concomitantes.
La presente invención abarca programas de tratamiento en los que el compuesto conjugado anticuerpo-fármaco se administra una vez durante un ciclo de tratamiento. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el conjugado anticuerpofármaco se administrará el día 1 de un ciclo de tratamiento de 21 días. En algunas de estas realizaciones, la dosis del compuesto conjugado anticuerpo-fármaco administrado a un paciente será normalmente, por ejemplo, de 0,8 mg/kg a 8 mg/kg del peso corporal del sujeto durante el ciclo de tratamiento, preferiblemente de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 7 mg/kg, de aproximadamente 1,5 mg/kg a aproximadamente 6 mg/kg, de aproximadamente 1,5 mg/kg a aproximadamente 2,2 mg/kg, o de 1 mg/kg a aproximadamente 3 mg/kg durante el ciclo de tratamiento.
La presente invención abarca programas de tratamiento en los que el compuesto conjugado anticuerpo-fármaco se administrará más de una vez durante un ciclo de tratamiento. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el compuesto conjugado anticuerpo-fármaco se administrará semanalmente durante tres semanas consecutivas en un ciclo de 28 días. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el compuesto conjugado anticuerpo-fármaco se administrará los días 1, 8 y 15 de cada ciclo de tratamiento de 28 días. En algunas de estas realizaciones, la dosis del compuesto conjugado anticuerpo-fármaco administrado a un paciente será de 0,8 mg/kg a 8 mg/kg del peso corporal del sujeto durante el ciclo de tratamiento, preferiblemente de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 7 mg/kg de aproximadamente 1,5 mg/kg a aproximadamente 6 mg/kg, de aproximadamente 1,5 mg/kg a aproximadamente 2,2 mg/kg, o de 1 mg/kg a aproximadamente 3 mg/kg durante el ciclo de tratamiento.
En un aspecto, para el tratamiento de un cáncer hematopoyético que expresa CD30, como el linfoma Hodgkin o la ALCL, el conjugado anticuerpo-fármaco a abse de auristatina se administra semanalmente a una dosis de aproximadamente 1 mg/kg o cada tres semanas a una dosis de aproximadamente 1,8 mg/kg.
En un aspecto, para el tratamiento de un cáncer que expresa CD70 (por ejemplo, NHL o carcinoma de células renales), el conjugado anticuerpo-fármaco a base de auristatina se administra cada tres semanas a una dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 1,5 mg/kg, 1,8 mg/kg, 2 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3 mg/kg, 4,5 mg/kg, 6 mg/kg o 8 mg/kg.
En ciertas realizaciones ilustrativas, la administración tanto del conjugado anticuerpo-fármaco a base de auristatina como del inhibidor de la ruta PI3K-AKT-mTOR es por infusión. En un aspecto, la administración del inhibidor de la ruta PI3K-AKT-mTOR es por vía iv (por ejemplo, infusión) o administración oral.
El conjugado anticuerpo-fármaco a base de auristatina e inhibidor de la ruta PI3K-AKT-mTOR se puede administrar como composiciones que incluyen composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más ingredientes farmacéuticamente compatibles. Por ejemplo, la composición farmacéutica incluye normalmente uno o más vehículos farmacéuticos (por ejemplo, líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluidos los derivados del petróleo, de origen animal, vegetal o sintético, como el aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo, y similares). El agua es un vehículo más típico cuando la composición farmacéutica se administra por ruta intravenosa. Las disoluciones salinas y las disoluciones acuosas de dextrosa y glicerol también pueden emplearse como vehículos líquidos, particularmente para disoluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos adecuados son conocidos en la técnica. La composición, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes de tamponamiento del pH. Ejemplos de portadores farmacéuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por EW Martin. Las formulaciones corresponden al modo de administración.
En realizaciones típicas, la composición farmacéutica se formula de acuerdo con procedimientos de rutina como una composición farmacéutica adaptada para la administración intravenosa a seres humanos. Normalmente, las composiciones para administración intravenosa son disoluciones en tampón acuoso isotónico estéril. Dónde sea necesario, el producto farmacéutico también puede incluir un agente solubilizante y un anestésico local como la lidocaína para aliviar el dolor en el lugar de la inyección. En general, los ingredientes se suministran por separado o mezclados en forma de dosis unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o un concentrado en un recipiente herméticamente sellado, como una ampolla o sobre que indica la cantidad de agente activo. Cuando el producto farmacéutico se administra mediante infusión, se puede dispensar con una botella de infusión que contiene agua o solución salina de grado farmacéutico estéril. Cuando el producto farmacéutico se administra mediante inyección, se puede proporcionar una ampolla de agua estéril para inyección o disolución salina para que los ingredientes puedan mezclarse antes de la administración.
En ciertas realizaciones, el inhibidor de la ruta PI3K-AKT-mTOR puede estar en una forma adecuada para administración oral, tal como en forma de píldora, cápsula, disolución o suspensión. Dichas formulaciones pueden prepararse de acuerdo con cualquier método conocido en la técnica para producir formulaciones orales y pueden contener uno o más agentes que incluyen agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes colorantes y agentes conservantes. Si en forma de comprimido, las composiciones pueden comprender excipientes de comprimido, como un relleno o diluyente (por ejemplo, carbonato de calcio o sodio, fosfato de calcio o sodio), un desintegrante (almidón de maíz o ácido algínico), un aglutinante (por ejemplo, almidón, gelatina o acacia), un deslizante, un lubricante (por ejemplo, estearato de magnesio, ácido esteárico o talco), un antiadherente, un sabor o un colorante.
La invención se describe adicionalmente en los siguientes ejemplos:
Ejemplos
Se proporcionan ejemplos para ayudar a una comprensión adicional de la invención.
Ejemplo 1
Cultivo de linea celular
Las células 786-O se cultivaron en medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suero bovino fetal al 10% (FBS). Las células Caki-1 se cultivaron en medio 5A de McCoy FBS al 10%. Las células Caki-2 se cultivaron en medio 5A de McCoy FBS al 2%. 786-O, Caki-1, y Caki-2 células (líneas celulares de carcinoma de células renales) fueron cultivadas a 37 °C con 5% de CO2. Las células L540cy se cultivaron en RPMI 1640 FBS al 20%. Las células L428 se cultivaron en RPMI 1640 FBS al 10%. Las líneas celulares L540ce y L428 son líneas celulares de linfoma Hodgkin. Las células Karpas-299 se cultivaron en RPMI 1640 FBS al 10%. La línea celular Karpas-299 es una línea celular anaplásica de linfoma de células grandes (ALCL). Las células HT se cultivaron en RPMI 1640 FBS al 10%. Las células Raji 4RH (clon-11) fueron un regalo de Francisco J. Hernandez-Ilizaliturri y se cultivaron en RPMI 1640 10% de FBS. Las líneas celulares HT y Raji 4RH son líneas celulares de linfoma no Hodgkin. Las células Jeko-1 se cultivaron en RPMI-1640 FBS al 10%. Las líneas celulares Jeko-1 son líneas celulares de linfoma de células del manto.
Ejemplo 2
Métodos in vitro de prueba de auristatina ADC o auristatina libre y combinaciones de inhibidores de la ruta de mTOR
Las células se sembraron en placas de cultivo de 100 ml de volumen por pocillo en placas de 96 pocillos de fondo transparente de pared negra. A continuación, se prepararon reservas de trabajo de concentración 4X de inhibidor de molécula pequeña y conjugado anticuerpo-fármaco, y luego se valoraron como diluciones en serie 2 veces produciendo curvas de dosis de 10 puntos. Para las condiciones de un solo fármaco, se agregaron 50 ml de inhibidor de molécula pequeña o ADC o auristatina libre a cada pocillo por cuadruplicado con 50 ml de medio, produciendo un volumen final de 200 ml por pocillo. Para las condiciones de combinación, 50 ml inhibidor molécula pequeña y 50 ml ADC o dilución auristatina libre se añadieron a las células (que recubre la titulación de dosis de cada fármaco: alto a bajo) por cuadruplicado producir un volumen final de 200 ml por pocillo. Las células tratadas se incubaron 96 horas a 37 °C, 5% de CO2. La citotoxicidad se midió mediante incubación con 100 ml de disolución de Glo Titer Cell (Promega) durante 1 hora y luego se midió la luminiscencia en un lector de placas Fusion HT (Perkin Elmer). Los datos se procesaron con Excel (Microsoft) y GraphPad (Prism) para producir curvas de respuesta a la dosis y calcular la fracción afectada (fa) en cada concentración de dosis. Luego se usó el software CalcuSyn (Biosoft) para determinar el sinergismo, la aditividad o el antagonismo para cada combinación de medicamentos utilizando la ecuación de efecto mediana de Chou-Talalay:
D = Dm[fa/(1-fa)]1/m
La ecuación de efecto mediana (D) es la dosis del medicamento. (D m) es la dosis de efecto mediana que significa la potencia. Esto se determina por la intersección con x de la gráfica de efecto mediana. (fa) es la fracción afectada por la dosis. (fu) es la fracción no afectada, (1-fa). (m) es un exponente que significa la sigmoidicidad (forma) de la curva dosis-efecto. Está determinada por la pendiente de la gráfica de efecto mediana. El coeficiente de correlación lineal "r" debe ser mayor o igual a 0,90. Las unidades de concentración de fármacos son arbitrarias.
Los valores del índice de combinación (IC) <0,9 indican sinergismo, los valores de IC 0,9-1,1 indican aditividad y los valores de IC> 1,1 indican antagonismo. La Tabla 4 muestra los valores de IC que corresponden a sinergismo, aditividad y antagonismo.
Tabla 4
Figure imgf000038_0001
Cada estudio de combinación se repitió en días separados un total de n=3 veces, a menos que se indique lo contrario, y el valor del índice de combinación promedio se informó con un error estándar de la media (sem).
Ejemplo 3
Ensayos ELISA para probar la potencia del fármaco
Las células se colocaron en placas de 6 pocillos por línea celular a 2,5x105 células/pocillo en 4,5 ml de medio de crecimiento. Las existencias de trabajo de temsirolimus (Wyeth, Madison, Nueva Jersey) se prepararon a una concentración 10X, y luego se valoraron como diluciones en 2 series produciendo curvas de dosis de 10 puntos. Se añadió temsirolimus (0,5 ml) a las células, con concentraciones finales equivalentes a las utilizadas en los estudios de combinación in vitro anteriores. Las células tratadas se incubaron 24 horas a 37 °C, 5% de CO2. Se recogieron los sedimentos celulares y se prepararon los lisados con el tampón de lisis proporcionado en la proteína ribosomal PathScan Phospho-S6 (Ser235/236) Sandwich ELISA Kit (Cell Signaling, Beverly, Massachusetts), más inhibidor completo de la proteasa sin EDTA (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania). Se determinaron las concentraciones de proteína y se cargaron 10 |jg de extracto de proteína total por muestra en la placa ELISA y se procesaron de acuerdo con las instrucciones. Las placas se leyeron usando el HT Fusion (Perkin Elmer). Los ELISA se realizaron para detectar la cantidad de fosforilación de fosfo-S6 en presencia de temsirolimus en las concentraciones utilizadas en los siguientes estudios de combinación.
Ejemplo 4
Transferencia de Western de los componentes de la ruta de señalización PI3K-AKT-mTOR
Los anticuerpos primarios utilizados para medir la señalización de PI3K-AKT-mTOR fueron anti-fosfo-AKT humano (Ser 473) (clon:193H12), AKT antihumano, fosfo-4E-BP1 humano (Thr37/46), anti-humano 4E-BP1, proteína ribosomal fosfo S6 humana (Ser235/236) (clon:2F9) y proteína ribosomal S6 humana anti (clon:54D2) (Cell Signaling; Beverly, Massachusetts). Los anticuerpos secundarios utilizados eran peroxidasa AffiniPure F(ab')2 fragmento cabra anti-IgG de conejo, F(ab')2 fragmento específico, y con peroxidasa AffiniPure F(ab')2 fragmento cabra anti-ratón IgG, Fc fragmento específico (Jackson ImmunoResearch, West Grove, Pennsylvania). Las transferencias Western se desarrollaron utilizando el sustrato quimioluminiscente SuperSignal West Pico Luminol Enhancer Solution (Thermo Scientific; Rockford, Illinois) y se visualizaron luego de la exposición a la película.
Ejemplo 5
Tratamiento combinado con rapalogs en el carcinoma de células renales
Se generaron curvas de respuesta a la dosis para ADC h1F6-mcF, temsirolimus sirolimus, everolimus, h1F6-mcF temsirolimus, h1F6-mcF sirolimus y h1F6-mcF everolimus en líneas celulares RCC. En las líneas celulares de RCC 786-O y Caki-2, temsirolimus y sirolimus solos no son fármacos citotóxicos potentes, excepto en la línea celular Caki-2 que se cultiva en medios con bajo FBS. Sin embargo, tanto temsirolimus como sirolimus potencian la citotoxicidad de h1F6-mcF.
Las Ics se calcularon para h1F6-mcF temsirolimus, h1F6-mcF temsirolimus y h1F6-mcF everolimus en la línea celular 786-O como se describió anteriormente. La Figura 2 demuestra que hlF6-mcF y MMAE solo son sinérgicos con los rapalogs temsirolimus, sirolimus y everolimus en la línea celular 786-O.
Las Ics también se calcularon para h1F6-mcF temsirolimus y h1F6-mcF temsirolimus en la línea celular Caki-1 como se describió anteriormente. La Figura 3 demuestra que h1F6-mcF y MMAE solo son sinérgicos con los rapalogs temsirolimus y sirolimus en la línea celular Caki-1.
Los resultados que muestran que h1F6-mcF es sinérgico con sirolimus, temsirolimus y everolimus se resumen en la Tabla 5.
Tabla 5
Figure imgf000039_0001
Ejemplo 6
Tratamiento combinado con rapalogs en el linfoma Hodgkin y ALCL
Las ICs se calcularon para cAC10-vcE temsirolimus, MMAE temsirolimus y cAC10-vcE everolimus en la línea celular L540cy como se describió anteriormente. Las ICs se calcularon para cAC10-vcE temsirolimus, MMAE temsirolimus y cAC10-vcE sirolimus en las líneas celulares Karpas 299 como se describió anteriormente. La Figura 4 demuestra que cAC10-vcE y MMAE son sinérgicos con los rapalogs temsirolimus y sirolimus.
Los resultados que muestran que cAC10-vcE es sinérgico con sirolimus, everolimus y temsirolimus se resumen en la Tabla 6.
Tabla 6.
Figure imgf000039_0002
Ejemplo 7
Tratamiento combinado in vivo de cAC10-vcE y temsirolimus en linfoma Hodgkin tipo B
Para probar los tratamientos de combinación en el linfoma Hodgkin tipo B in vivo, se utilizó un modelo de xenoinjerto murino. Las células L428 se implantaron en ratones NOD-SCID-gamma (The Jackson Laboratory) para generar tumores. Los tumores se dejaron crecer hasta un promedio de 90 mm3, después ordenados en grupos de 7 ratones. Los ratones no fueron tratados, tratados con temsirolimus (20 mg/kg), tratados con cAC10-vcE (1,0 mg/kg), o tratados con cAC10-vcE y temsirolimus. El cAC10-vcE se administró q4dx4 ip. El temsirolimus se administró q4dx4 ip o q3dx6 ip. En el tratamiento de combinación, el cAC10-vcE se administró 2 días antes del temsirolimus. El volumen del tumor se midió periódicamente durante 120 días después de la dosis inicial. Los datos se representaron como una gráfica de Kaplan-Meier que muestra la tasa de triplicado del tumor. Los valores de p se calcularon utilizando la prueba de log-rank para confirmar la significación estadística. Como se puede ver en la Figura 5, cAC10-vcE más temsirolimus tiene una actividad antitumoral significativamente mejor que cualquiera de los tratamientos solos (valor de P = 0,0011 según la prueba Log-Rank).
Tabla 7
Figure imgf000040_0001
Ejemplo 8
Tratamiento combinado in vivo de cAC10-vcE y everolimus en linfoma Hodgkin tipo B
Para probar los tratamientos de combinación en el linfoma Hodgkin tipo B in vivo, se utilizó un modelo de xenoinjerto murino. Las células L428 se implantaron en ratones NOD-SCID-gamma (The Jackson Laboratory) para generar tumores. Los tumores se dejaron crecer hasta un promedio de 90 mm3, después ordenados en grupos de 10 ratones. Los ratones no se trataron, se trataron con everolimus (15 mg/kg), se trataron con cAC10 (1 mg/kg), se trataron con cAC10-vcE (1,0 mg/kg), se trataron con cAC10 y everolimus, o tratados con cAC10-vcE y everolimus. El cAC10-vcE y cAC10 se administraron q4dx4 ip. El everolimus se administró q1dx14 po. En el día 61, el brazo de tratamiento combinado de cAC10-vcE y everolimus tiene 10/10 respuestas completas y los brazos de tratamiento único de cAC10-vcE y everolimus no tuvieron respuestas completas.
Ejemplo 9
Tratamiento combinado con rapalogs en el linfoma no Hodgkin
Las Ics se calcularon para hBU12-mcF temsirolimus y hBU12-mcF sirolimus en la línea celular HT como se describió anteriormente. La Figura 6 demuestra que hBU12-mcF es sinérgica con los rapalogs temsirolimus y sirolimus en la línea celular HT.
Los resultados que muestran que hBU12-mcF es sinérgico con sirolimus, temsirolimus y everolimus se resumen en la Tabla 8.
Tabla 8
Figure imgf000040_0002
Ejemplo 10
Tratamiento combinado con inhibidores de PI3K-mTOR de doble especificidad e inhibidores selectivos de mTor
Las Ics se calcularon para h1F6-mcF BEZ235 en células 786-O, células Caki-1, células Jeko-1 y células Raji-4RH-11; cAC10-vcE BEZ235 y cAC10-vcE PP242 en células L540cy (HL); cAC10-vcE BEZ235 en células Karpas 299; hBU12-mcF BEZ235 en células HT, y h1F6-mcF PP242 en células Jeko-1 como se describió anteriormente. La Figura 8 demuestra que NVP-BEZ235 es sinérgico con los ADC de auristatina (como los rapalogs temsirolimus y sirolimus) en múltiples líneas celulares. Se demostraron valores de CI más bajos en las líneas celulares de RCC y NHL (especialmente en EDgo), lo que sugiere una mayor sinergia.
Los resultados que muestran que NVP-BEZ235 y PP242 son sinérgicos con los ADC de auristatina se resumen en la Tabla 9.
Tabla 9
Figure imgf000041_0001
Ejemplo 11
Tratamiento combinado con inhibidores de P13K y AKT
Las Ics se calcularon para h1F6-mcF MK-2206 en células Jeko-1 y hBU12-mcF y XL147 en células HT.
Los resultados que muestran que los inhibidores de P13K y AKT son sinérgicos con los ADC de auristatina se resumen en la Tabla 10.
Tabla 10
Figure imgf000041_0002
Ejemplo 12
Ensayos ilustrativos
Un ensayo ilustrativo para determinar si un compuesto inhibe PI3K se proporciona en Knight et al (2006) Cell vol. 125 pp. 733-747. Brevemente, los valores de IC50 se miden utilizando un ensayo de TLC estándar para la actividad de la lipido quinasa o un ensayo de captura de membrana de alto rendimiento. Las reacciones de quinasa se realizan preparando una mezcla de reacción que contiene quinasa, inhibidor (concentración final de DMSo al 2%), tampón (HEPES 25 mM, pH 7,4, MgC12 10 mM) y fosfatidilinositol recién sonicado (100 pg/ml). Las reacciones se inician mediante la adición de ATP que contiene 10 pCi de Y-32P-ATP hasta una concentración final de 10 o 100 pM. Las reacciones se dejan proceder durante 20 minutos a temperatura ambiente. Para el análisis de TLC, las reacciones se terminan mediante la adición de 105 pl de HCl 1N seguido de 160 pl de CHCl3:MeOH (1:1). La mezcla bifásica se agita en vórtex, se centrifuga brevemente y la fase orgánica se transfiere a un nuevo tubo utilizando una punta de pipeta de carga de gel previamente recubierta con CHCh. Este extracto se mancha en placas de TLC y se desarrolla durante 3 a 4 horas en una disolución 65:35 de n-propanol:ácido acético 1M. Las placas de TLC se secan, se exponen a una pantalla de phosphorimager (Storm, Amersham) y se cuantifican. Para cada compuesto, la actividad de la quinasa se mide normalmente a 10-12 concentraciones de inhibidor que representan diluciones dobles de la concentración más alta probada (100 mM).

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Un conjugado anticuerpo-fármaco a base de auristatina para uso en el tratamiento del cáncer, en donde el conjugado anticuerpo-fármaco se administra en terapia de combinación con un inhibidor de la ruta PI3K-AKT-mTOR, que es un inhibidor del sitio no activo, que es un rapalog y en donde el anticuerpo se une específicamente a un antígeno de células cancerosas que se encuentra en la superficie de una célula cancerosa que demuestra una regulación positiva de la ruta PI3K-AKT-mTOR, en donde el anticuerpo es un anticuerpo anti-CD30 o anti-CD19 y el cáncer es un cáncer hematológico maligno o el anticuerpo es un anticuerpo anti-CD70 y el cáncer es un carcinoma de células renales; y en donde el anticuerpo está conjugado con vcMMAE o mcMMAF.
2. El conjugado anticuerpo-fármaco para su uso en el tratamiento del cáncer de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el cáncer es un tumor maligno hematológico, opcionalmente linfoma Hodgkin, linfoma no Hodgkin o linfoma anaplásico de células grandes.
3. El conjugado anticuerpo-fármaco para uso en el tratamiento del cáncer de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el cáncer es un carcinoma de células renales.
4. El conjugado anticuerpo-fármaco para uso en el tratamiento del cáncer de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el rapalog es everolimus, sirolimus, temsirolimus o deforolimus (AP23573).
5. El conjugado anticuerpo-fármaco para uso en el tratamiento del cáncer de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el conjugado anticuerpo-fármaco a base de auristatina tiene la siguiente fórmula:
L -(LU-D)p (I)
una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos
en donde:
L es el anticuerpo; y
(LU-D) es un resto unidad unidad de fármaco ligador, en donde:
LU- es una unidad ligadora, y
-D es la auristatina que tiene actividad citostática o citotóxica contra las células diana; y
p es de 1 a 20.
6. El conjugado anticuerpo-fármaco para uso en el tratamiento del cáncer de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el conjugado anticuerpo-fármaco a base de auristatina tiene la fórmula:
Figure imgf000051_0001
una forma de la sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde mAb es un anticuerpo monoclonal, S es un átomo de azufre del anticuerpo, y p es de 1 a 8.
7. El conjugado anticuerpo-fármaco para uso en el tratamiento del cáncer de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el conjugado anticuerpo-fármaco a base de auristatina tiene la fórmula:
Figure imgf000052_0001
una forma de sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que mAb es un anticuerpo monoclonal, S es un átomo de azufre del anticuerpo y p es de 1 a 8
8. El conjugado anticuerpo-fármaco para uso en el tratamiento del cáncer de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde una composición que comprende los conjugados anticuerpo-fármaco al sujeto y el número promedio de moléculas de fármaco por anticuerpo en la composición es de 2 a 6.
9. El conjugado anticuerpo-fármaco para uso en el tratamiento del cáncer de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en dond el cáncer expresa el antígeno CD70 y el conjugado anticuerpo-fármaco a base de auristatina es un conjugado anticuerpo-fármaco a base de auristatina anti-CD70, opcionalmente en donde el conjugado anticuerpo-fármaco a base de auristatina es 1F6 humanizado conjugado con un ligador de fármaco mcMMAF (h1F6-mcMMAF), preferiblemente en donde el conjugado de fármaco anticuerpo h1F6-mcF es SGN-75.
10. El conjugado anticuerpo-fármaco para uso en el tratamiento del cáncer de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde el cáncer expresa el antígeno CD30 y el conjugado anticuerpo-fármaco a base de auristatina es un conjugado anticuerpo-fármaco a abase de auristatina anti CD30, opcionalmente en donde el conjugado anticuerpo-fármaco a base de auristatina es un conjugadoconjugado anticuerpo-fármaco cAC10-vcMMAE.
11. El conjugado para uso de la reivindicación 10, en donde el conjugado conjugado anticuerpo-fármaco es brentuximab vedotina.
12. El conjugado para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el cáncer que expresa el antígeno CD 19 y el conjugado conjugado anticuerpo-fármaco a base de auristatina es un conjugado conjugado anticuerpofármaco a base de auristatina anti CD19, opcionalmente en donde el conjugado conjugado anticuerpo-fármaco a base de auristatina es BU12 humanizado conjugado con un conector de fármaco mcMMAF (hBU12-mc-MMAF), preferiblemente SGN-19A.
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