ES2710931T3

ES2710931T3 - Bacteriófagos terapéuticos

Info

Publication number: ES2710931T3
Application number: ES13759275T
Authority: ES
Inventors: Martha Clokie
Original assignee: University of Leicester
Current assignee: University of Leicester
Priority date: 2012-08-24
Filing date: 2013-08-27
Publication date: 2019-04-29
Anticipated expiration: 2033-08-27
Also published as: EP2887949B1; US20150290263A1; US10286019B2; EP2887949A1; WO2014030020A1; GB201215184D0

Abstract

Un panel de bacteriófagos, en donde el panel comprende uno cualquiera o más bacteriófagos seleccionados del grupo que consiste en:- NCTC 12081404, NCTC 12081405, NCTC 12081406, NCTC 12081407, NCTC 12081408, NCTC 12081409 y NCTC 12081410.

Description

DESCRIPCION

Bacteriofagos terapeuticos

La presente invencion se refiere a paneles de bacteriofagos y a composiciones farmaceuticas; en particular, aunque no de manera exclusiva, dichos paneles son para uso en el tratamiento de la infeccion por Clostridium difficile, o para el tratamiento profilactico, donde el sujeto que se ha de tratar no ha sido aun colonizado por C. difficile, o es un sujeto que ha sido colonizado por C. difficile pero la colonizacion no ha progresado a infeccion.

Clostridium difficile (al que tambien se hace referencia como C. diff o C. difficile) es una bacteria patogena anaerobia Gram-positiva formadora de esporas que causa diarrea y colitis y puede llevar a la muerte. Aunque esta bacteria puede estar presente en el intestino de individuos asintomaticos, en otros individuos la presencia de C. diff puede causar Diarrea Asociada a Clostridium difficile (DACD). Adicionalmente, los individuos asintomaticos pueden desarrollar DACD tras la administracion de antibioticos de amplio espectro. La DACD es una carga importante para la atencion sanitaria y financiera para el NHS y se conoce tambien como Infeccion por Clostridium difficile (ICD).

Rutinariamente, se usan dos antibioticos de molecula pequena para tratar las infecciones por C. difficile (metronidazol y vancomicina); se esta desarrollando resistencia a ambos. Por consiguiente, se necesitan desesperadamente nuevos antimicrobianos.

Las cepas de C. difficile se clasifican por "ribotipificacion". La ribotipificacion conlleva un analisis del tamano y el numero de copias de los genes de ARN ribosomal, que establece un perfil genetico para cada cepa (conocida como ribotipo). Actualmente, se reconocen aproximadamente 350 ribotipos. El protocolo estandar para la ribotipificacion utiliza tanto la ribotipificacion por PCR acoplada a electroforesis en gel de agarosa como el analisis capilar tras la incorporacion de un cebador fluorescente.

Los bacteriofagos (tambien llamados fagos) son virus que infectan espedficamente a bacterias. Se piensa que existen fagos para todas las bacterias y que infectan o bien a especies bacterianas unicas o bien a subgrupos de cepas dentro de una especie. Se han usado con exito para tratar infecciones bacterianas durante casi un siglo, pero su uso decayo en gran medida tras el desarrollo de antibioticos de molecula pequena en los anos 40. La causa de ello era que los antibioticos de molecula pequena son efectivos contra un mayor espectro de especies bacterianas y, por lo tanto, se pueden usar en ausencia de identificacion de la causa de la infeccion. El renovado interes en los fagos como herramienta terapeutica se ha visto motivado por problemas asociados a la resistencia a los antibioticos y a la falta de desarrollo de nuevos antibioticos de molecula pequena. Las terapias basadas en fagos ofrecen un arma dirigida espedfica para uso contra especies bacterianas problematicas; carecen de problemas asociados a disbiosis, y la resistencia a ellas es tfpicamente de desarrollo mas lento que a los antibioticos de molecula pequena convencionales.

Existen retos significativos a la hora de intentar identificar terapias basadas en fagos adecuadas. En particular, el aislamiento y la caracterizacion de fagos son diffciles. Incluso una vez se ha aislado e identificado un fago, el fago solo tendra valor terapeutico si posee caractensticas espedficas, p. ej., ser capaz de matar bacterias, pero tambien ser no toxico para el animal que este siendo tratado mediante la terapia.

El aislamiento y la propagacion de bacteriofagos de C. difficile (es decir, bacteriofagos que infectan a C. difficile) es un procedimiento particularmente diffcil, ya que el organismo es un anaerobio obligado que no produce facilmente cespedes adecuados para observar bacteriofagos. Hasta la investigacion objeto de esta memoria descriptiva, se habfan aislado un total de solo 5 fagos de C. difficile; esto a pesar de los esfuerzos de al menos cuatro grupos de investigacion independientes. Estos cinco fagos conocidos fueron todos aislados de muestras clmicas y no se ha caracterizado la especificidad de ribotipo de los fagos con ningun detalle. Por ejemplo, US 2010/0310522 describe nuevos polipeptidos que tienen actividad de endolisina de un bacteriofago y sus usos.

La escasez de fagos de C. difficile que se han identificado hasta la fecha ha significado que el trabajo realizado utilizando fagos para tratar las infecciones por C. difficile ha estado mas limitado que para otras especies bacterianas.

Los inventores han identificado, tras una amplia experimentacion, 7 nuevos bacteriofagos, cada uno de los cuales ha sido aislado de muestras de suelo medioambientales y cuya especificidad de ribotipo ha sido caracterizada. Los 7 nuevos bacteriofagos son todos ellos capaces de matar a Clostridium difficile.

Por consiguiente, en un primer aspecto de la presente invencion, se proporciona un panel de bacteriofagos, donde el panel comprende o consiste en uno cualquiera o mas de bacteriofagos seleccionados del grupo consistente en:- NCTC 12081404, NCTC 12081405, NCTC 12081406, NCTC 12081408, NCTC 12081409, NCTC 12081410 y NCTC 12081407.

Se deposito cada uno de los fagos antes citados el 14 de agosto de 2012 bajo el Tratado de Budapest en la National Collection of Type Cultures (NCTC, R.U.). Se han citado anteriormente los numeros de deposito emitidos por la NCTC para cada uno de los fagos.

Tambien se hace aqrn referencia a NCTC 12081404 como CD-HS1. Tambien se hace aqrn referencia a NCTC 12081405 como CD-HM6. Tambien se hace aqrn referencia a NCTC 12081406 como CD-HM5. Tambien se hace aqrn referencia a NCTC 12081407 como CD-HM4. Tambien se hace aqu referencia a NCTC 12081408 como CD-HM3. Tambien se hace aqu referencia a NCTC 12081409 como CD-HM2. Tambien se hace aqu referencia a NCTC 12081410 como CD-HM1.

El experto en la tecnica entendera el termino panel de bacteriofagos como sinonimo del termino preparacion de bacteriofagos aislados. El uso del termino aislados requiere que los fagos de la presente invencion hayan sido aislados y/o purificados a partir de su ambiente natural. Dichos paneles pueden incluir cualquiera, o cualquier combinacion, de los fagos aqu provistos. Cuando se incluye mas de un fago en el panel, se pueden preparar los fagos para administracion separada, secuencial o simultanea. Se contemplan individualmente todas las combinaciones de bacteriofagos que se pueden seleccionar del grupo antes citado para inclusion en los paneles de esta invencion. Por ejemplo, el panel puede comprender o consistir en todos de NCTC 12081404, NCt C 12081405, NCTC 12081406, NCTC 12081407, NCTC 12081408, NCTC 12081409 y NCTC 12081410. El panel puede comprender o consistir en NCTC 12081404 y NCTC 12081408, comprendiendo o consistiendo eventualmente ademas en NCTC 12081409 y/o NCTC 12081410. El panel puede comprender o consistir en NCTC 12081404.

De manera alternativa, o adicional, los paneles segun la presente invencion que comprenden o consisten en el fago antes mencionado pueden tener componentes adicionales, componentes que pueden no ser fagos. Por ejemplo, vetuculos, excipientes, agentes terapeuticos (p. ej., agentes no fagos, tales como antibioticos). El uso del termino "consiste" puede, por lo tanto, significar que los paneles incluyen el(los) fago(s) citado(s) como unico(s) fago(s) del panel, pero que pueden incluir componentes no fagos adicionales.

Se vio que cada fago era capaz de lisar a C. difficile y se ha caracterizado aun mas.

Los bacteriofagos para inclusion en los paneles de la presente invencion pueden incluir mutantes y variantes de los bacteriofagos depositados antes definidos. Por consiguiente, la referencia a cualquiera de NCTC 12081404, NCTC 12081405, NCTC 12081406, NCTC 12081408, NCTC 12081409, NCTC 12081410 y NCTC 12081407 incluye la referencia a sus mutantes o variantes. Dichos mutantes y variantes de los bacteriofagos depositados conservan la capacidad de matar a C. difficile. Los mutantes y variantes tienen al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia nucleotidica a traves de todo el genoma en comparacion con el genoma de al menos uno cualquiera de los bacteriofagos depositados de la presente invencion. Dichos mutantes y variantes pueden resultar de adiciones, deleciones o sustituciones de nucleotidos de las secuencias de acidos nucleicos de los bacteriofagos depositados (por ejemplo, la adicion, delecion o sustitucion de 1, 2, 3, 4 o 5 nucleotidos, eventualmente nucleotidos contiguos). Eventualmente, el mutante o variante no incluye un gen de integrasa y/o un gen de toxina. Ademas de conservar la capacidad de matar a C. difficile, el mutante y variante puede poseer cualquier otra caractenstica mencionada mas adelante para el bacteriofago depositado del que deriva (p. ej., morfologfa, especificidad de huesped, longitud del genoma).

Eventualmente, el panel puede comprender 2 o mas bacteriofagos diferentes, 3 o mas bacteriofagos diferentes, 4 o mas bacteriofagos diferentes, 5 o mas bacteriofagos diferentes, 6 o mas bacteriofagos diferentes o 7 bacteriofagos diferentes.

El panel puede ser capaz de matar a mas de 5, mas de 10, mas de 15, mas de 20, mas de 25, mas de 30 o 32 diferentes ribotipos de C. difficile. Eventualmente, al menos 1 de los ribotipos sera 027 y/o 014/020.

Como entendera el experto en la tecnica, la eleccion de fago o combinacion de fagos para inclusion en el panel de la presente invencion viene determinada por el(los) ribotipo(s) de C. difficile que se pretende(n) matar mediante el panel.

Por ejemplo, el panel segun la presente invencion puede comprender o consistir en NCTC 12081404. Dicho panel ha resultado ser util en el tratamiento de la infeccion por el ribotipo 001 (p. ej., en el R.U. y en Australia), el ribotipo 027 (p. ej., en los EE.UU.), el ribotipo 081 (p. ej., en el R.U.) y/o el ribotipo 107 (p. ej., en el R.U.) de C. difficile.

El panel segun la presente invencion puede comprender o consistir en NCTC12081410 y/o NCTC12081409. Dicho panel ha resultado ser util en el tratamiento de la infeccion por el ribotipo N° 002, (p. ej., en el R.U.) y/o el ribotipo 003 (p. ej., en el R.U.) de C. difficile.

El panel segun la presente invencion puede comprender o consistir en NCTC12081410, NCTC12081409 y/o NCTC12081408. Dichos paneles han resultado ser utiles en el tratamiento de la infeccion por el ribotipo N° 002 (p. ej., en Australia) y/o el ribotipo 018 (p. ej., en el R.U.) de C. difficile.

El panel segun la presente invencion puede comprender o consistir en NCTC12081408, NCTC12081405 y/o NCTC12081406. Dicho panel ha resultado ser util en el tratamiento de la infeccion por el ribotipo N° 013 (p. ej., en el R.U.) de C. difficile.

El panel segun la presente invencion puede comprender o consistir en NCTC12081410, NCTC12081409, NcTc 12081408, NcTc 12081405 y/o NcTc 12081406. Dicho panel ha resultado ser util en el tratamiento de la infeccion por el ribotipo N° 014/020 (p. ej., en el R.U.) de C. difficile.

El panel segun la presente invencion puede comprender o consistir en NCTC12081408 y/o NCTC12081405. Dicho panel ha resultado ser util en el tratamiento de la infeccion por el ribotipo N° 014/020 (p. ej., en el R.U.) de C. difficile. El panel segun la presente invencion puede comprender o consistir en NCTC12081408, NCTC12081404, NCTC12081406 y/o NCTC12081405. Dicho panel ha resultado ser util en el tratamiento de la infeccion por el ribotipo N° 015 (p. ej., en el R.U.) de C. difficile.

El panel segun la presente invencion puede comprender o consistir en NCTC12081410, NCTC12081408, NCTC12081406 y/o NCTC12081405. Dicho panel ha resultado ser util en el tratamiento de la infeccion por el ribotipo N° 023 (p. ej., en el R.U.) de C. difficile.

El panel segun la presente invencion puede comprender o consistir en NCTC12081406. Dicho panel ha resultado ser util en el tratamiento de la infeccion por el ribotipo N° 026 (p. ej., en el R.U.) de C. difficile.

El panel segun la presente invencion puede comprender o consistir en NCTC12081408 y NCTC12081404. Dicho panel ha resultado ser util en el tratamiento de la infeccion por el ribotipo N° 027 (p. ej., en el R.U.) de C. difficile.

El panel segun la presente invencion puede comprender o consistir en NCTC12081408, NCTC12081407 y/o NCTC12081404. Dicho panel ha resultado ser util en el tratamiento de la infeccion por el ribotipo N° 087 (p. ej., en el R.U.) de C. difficile.

El panel segun la presente invencion puede comprender o consistir en NCTC12081410, NCTC12081408, NCTC12081409 y/o NCTC12081405. Dicho panel ha resultado ser util en el tratamiento de la infeccion por el ribotipo N° 106 (p. ej., en el R.U.) de C. difficile.

Con objeto de proporcionar un panel que sea capaz de matar a ribotipos espedficos de C. difficile independientemente de su origen, puede ser ventajoso proporcionar paneles con las combinaciones de fagos mejor adecuadas para tratar infecciones por C. difficile independientemente de su origen.

Por ejemplo, con objeto de tratar la infeccion por el ribotipo 002 y/o 018 de C. difficile, el panel segun la presente invencion puede comprender o consistir en NCTC12081410, NCTC12081409 y/o NCTC12081408.

Con objeto de tratar la infeccion por el ribotipo 003, el panel de la presente invencion puede comprender o consistir en NCTC12081410 y/o NCTC12081409.

Con objeto de tratar la infeccion por el ribotipo 013, el panel de la presente invencion puede comprender o consistir en NCTC12081408, NCTC12081405 y/o NCTC12081406.

Con objeto de tratar la infeccion por el ribotipo 014/020, el panel de la presente invencion puede comprender o consistir en NCTC12081410, NCTC12081409, NCTC12081408, NCTC12081406 y/o NCTC12081405.

Con objeto de tratar la infeccion por el ribotipo 015, el panel de la presente invencion puede comprender o consistir en NCTC12081408, NCTC12081404, NCTC12081406 y/o NCTC12081405.

Con objeto de tratar la infeccion por el ribotipo 023, el panel de la presente invencion puede comprender o consistir en NCTC12081410, NCTC12081408, NCTC12081406 y/o NCTC12081405.

Con objeto de tratar la infeccion por el ribotipo 027, el panel de la presente invencion puede comprender o consistir en NCTC12081408 y/o NCTC12081404.

Con objeto de tratar la infeccion por el ribotipo 087, el panel de la presente invencion puede comprender o consistir en NCTC12081408, NCTC12081407 y/o NCTC12081404.

Con objeto de tratar la infeccion por el ribotipo 106, el panel de la presente invencion puede comprender o consistir en NCTC12081410, NCTC12081408, NCTC12081409, y/o NCTC12081405.

Por supuesto, en muchas situaciones no se conocera el ribotipo espedfico de la infeccion por C. difficile que se ha de tratar. Por ejemplo, puede ser importante tratar una infeccion por C. difficile en un hospital tan rapidamente como sea posible, sin esperar a los resultados del diagnostico para identificar con precision el ribotipo de la cepa de C. difficile predominante. En tal situacion, es importante disponer de una combinacion de bacteriofagos que proporcione una especificidad de huesped para C. difficile que cubra el espectro mas probable de ribotipos que sean prevalentes en esa situacion. Por ejemplo, el panel segun la presente invencion puede comprender o consistir en NCTC12081410, NCTC12081408, NCTC12081405 o NCTC12081404.

Teniendo en cuenta los ribotipos espedficos que son mas prevalentes en el R.U. y en Australia, una combinacion que puede ser la mas efectiva en el R.U. y en Australia y que forma parte de la presente invencion es un panel que comprende o consiste en NCTC12081410, NCTC12081408 y/o NCTC12081404.

Teniendo en cuenta los ribotipos espedficos que son mas prevalentes en los EE.UU., una combinacion que puede ser la mas efectiva en los EE.u U. y que forma parte de la presente invencion es un panel que comprende o consiste en NCTC12081408 y/o NCTC12081404.

Los fagos pueden asociarse a una cualquiera o mas de las siguientes caractensticas:-NCTC 12081404 (CD-HS1):-Morfolog^a correspondiente a las caractensticas de la Figura 1G; un miembro de Siphoviridae; capaz de infectar y lisar a uno cualquiera o mas ribotipos de C. difficile seleccionados del grupo consistente en: 010, 002, 005, 013, 014/020, 046, 001, 015, 026, 027, 050, 087, 106, 107, 031, 220, y/o; una longitud de genoma de aproximadamente 40 kpb (+/-10%).

NCTC 12081405 (CD-HM6):-Morfologfa correspondiente a las caractensticas de la Figura 1F; un miembro de Myoviridae; capaz de infectar y lisar a uno cualquiera o mas ribotipos de C. difficile seleccionados del grupo consistente en:- 010, 002, 014, 020, 026, 087, 220, 076, y/o; una longitud de genoma de aproximadamente 50 kpb (+/-10%).

NCTC 12081406 (CD-HM5):-Morfologfa correspondiente a las caractensticas de la Figura 1E; un miembro de Myoviridae; capaz de infectar y lisar a uno cualquiera o mas ribotipos de C. difficile seleccionados del grupo consistente en:- 010, 014/020, 015, 026, 027, 087, 220 y 076, y/o, una longitud de genoma de aproximadamente 50 kpb (+/-10%).

NCTC 12081407 (CD-HM4):-Morfologfa correspondiente a las caractensticas de la Figura 1D; un miembro de Myoviridae; capaz de infectar y lisar a uno cualquiera o mas ribotipos de C. difficile seleccionados del grupo consistente en:- 012 y 031, y/o; una longitud de genoma de aproximadamente 50 kpb (+/-10%).

NCTC 12081408 (CD-HM3):-Morfologfa correspondiente a las caractensticas de la Figura 1C; un miembro de Myoviridae; capaz de infectar y lisar a uno o mas ribotipos de C. difficile seleccionados del grupo consistente en: 002, 005, 013, 014/020, 015, 023, 026, 027, 078, 087, 031, 220 y 076, y/o; una longitud de genoma de aproximadamente 50 kpb (+/-10%).

NCTC 12081409 (CD-HM2):-Morfologfa correspondiente a las caractensticas de la Figura 1B; un miembro de Myoviridae; capaz de infectar y lisar a uno o mas ribotipos de C. difficile seleccionados del grupo consistente en:- 010, 002, 014/020, 015, 012, 220 y 076, y/o; una longitud de genoma de aproximadamente 50 kpb (+/-10%).

NCTC 12081410 (CD-HM1):-Morfologfa correspondiente a las caractensticas de la Figura 1A; un miembro de Myoviridae; capaz de infectar y lisar a uno o mas ribotipos de C. difficile seleccionados del grupo consistente en:- 010, 002, 013, 014/020, 026, 087, 220 y 076, y/o; una longitud de genoma de aproximadamente 50 kpb (+/-10%).

El experto en la tecnica sera consciente de la variedad de huespedes de C. difficile que se pueden usar para propagar el fago de la presente invencion. A modo de ejemplo, se puede seleccionar el huesped propagador para los fagos de la presente invencion de uno cualquiera o mas de HPA N° 12081401, HPA N° 12081402 o HPA N° 12081403. Eventualmente, se propagan NCTC 12081410, NCTC 12081409, NCTC 12081408, NCTC 12081406 y NCTC 12081405 todos ellos en HPA N° 12081401. Eventualmente, se propaga NCTC 12081407 en HPA N° 12081402. Eventualmente, se propaga NCTC 12081404 en HPA N° 12081402.

Optimizar un fago terapeutico para uso humano requiere un conjunto de fagos o panel de fagos bien caracterizado con un espectro apropiado de huespedes y la produccion de un producto estable consistente. Nunca se ha conseguido esto hasta la fecha para C. difficile. Sin embargo, los inventores han identificado, tras una exhaustiva experimentacion, que los paneles de los fagos discutidos anteriormente son capaces de matar a un amplio espectro de hospedadores de ribotipos de C. difficile.

Por consiguiente, en un segundo aspecto de la presente invencion, se proporciona un panel que comprende una pluralidad de bacteriofagos y que es capaz de matar a mas de 5 ribotipos independientes de C. difficile.

El panel puede ser capaz de matar a mas de 10, mas de 15, mas de 20, mas de 25, mas de 30 o 32 ribotipos diferentes de C. difficile. Eventualmente, al menos 1 de los ribotipos sera 027 y/o 014/020.

Los bacteriofagos pueden ser uno cualquiera o mas seleccionados del grupo descrito en el primer aspecto de la presente invencion.

Los mutantes y variantes de los bacteriofagos del primer y segundo aspectos de la presente invencion que son capaces de matar a C. difficile forman parte de la presente invencion. Por consiguiente, en un tercer aspecto de la presente invencion, se proporciona un panel que comprende o consiste en uno o mas mutantes o variantes de uno cualquiera o mas de los bacteriofagos antes citados. Dichos mutantes o variantes son capaces de lisar a C. difficile.

El panel de la presente invencion ha demostrado tener utilidad terapeutica tanto in vitro como in vivo. Por consiguiente, en un cuarto aspecto de la presente invencion, se proporciona una composicion farmaceutica que comprende cualquiera de los paneles del primer, segundo o tercer aspectos de la presente invencion. La composicion puede incluir excipientes y/o vehfculos farmaceuticamente aceptables. La composicion puede incluir un revestimiento enterico alrededor de los paneles con objeto de asegurar la liberacion de fagos al tracto gastrointestinal una vez pasado el estomago. Se puede preparar la composicion como una bebida de yogur y, por lo tanto, puede incluir adicionalmente yogur.

Se puede preparar la composicion para administracion oral o rectal.

En un quinto aspecto de la presente invencion, se proporciona una composicion que comprende o consiste en cualquiera de los paneles o composiciones de la presente invencion para uso en un metodo de tratamiento, en donde el metodo de tratamiento puede ser el tratamiento de una infeccion por C. difficile (es decir, el tratamiento de un sujeto en el que una colonizacion por C. difficile ha dado como resultado trastornos asociados a dicha infeccion, p. ej., incluyendo, aunque sin limitacion, diarrea, colitis, sepsis, megacolon toxico, hipotension o perforacion gastroenterica, enfermedad asociada a C. difficile) o el metodo de tratamiento puede ser un metodo profilactico, y ser, por lo tanto, utilizado para tratar a un sujeto que aun no ha sido colonizado por C. difficile, o donde el sujeto ha sido colonizado por C. difficile pero esa colonizacion aun no ha progresado a infeccion. Por consiguiente, las composiciones para uso en metodos de tratamiento segun las reivindicaciones pueden incluir metodos que conllevan la administracion de la composicion a un individuo ya infectado por C. difficile y/o metodos profilacticos (p. ej., cuando se administra la composicion a un individuo que no sufre de infeccion por C. difficile, o antes de la administracion de antibioticos).

Las composiciones para uso en un metodo de tratamiento pueden ser para el tratamiento de una infeccion por C. difficile, que podna ser una infeccion gastroenterica o diarreica. El tratamiento puede ser el tratamiento de la EACD (tambien conocida como ICD).

Tambien se describe un metodo de tratamiento de la infeccion por C. difficile que comprende las etapas de administrar una cantidad terapeuticamente efectiva de cualquiera de los paneles o composiciones de la presente invencion al sujeto que se ha de tratar. El sujeto puede ser cualquier mairnfero, por ejemplo un humano o un cerdo.

Los paneles de la presente invencion son tambien utiles en composiciones nutricionales, productos alimenticios para mascotas y/o suplementos para tratar o prevenir la infeccion por C. difficile en quienes ingieren dichos productos. Por consiguiente, en otro aspecto de la presente invencion, se proporciona una composicion nutricional, un producto alimenticio para mascotas y/o un suplemento que comprende un panel o composicion de la presente invencion.

Se describira ahora la presente invencion, a modo de ejemplo, haciendo referencia a las figuras acompanantes, en donde:-

La Figura 1 muestra imagenes de micrograffa electronica de transmision (MET) de los siete fagos de la presente invencion. La barra de escala proporcionada en cada imagen representa una longitud de 100 nm. La Figura 1A es una imagen del fago CD-HM1. La Figura 1B es una imagen del fago CD-HM2. La Figura 1C es una imagen del fago CD-HM3. La Figura 1D es una imagen del fago CD-HM4. La Figura 1E es una imagen del fago CD-HM5. La Figura 1F es una imagen del fago CD-HM6. La Figura 1G es una imagen del fago CD-HS1.

La Figura 2 muestra los resultados del recuento bacteriano y de esporas de C. difficile del lavado y del tejido intestinales asociados al lumen de 5 hamsteres (C1, C2, T1, T2, T3). De T1 a T3 recibieron tratamiento con fagos; C1 y C2 no recibieron tratamiento con fagos. Abreviaturas: Cie = Ciego, Col = Colon, AT = Asociado a tejidos, AL = Asociado al lumen.

La Figura 3 muestra los valores promedio para los resultados proporcionados en la Figura 2.

La Figura 4 muestra el numero de bacteriofagos recuperados de T1-T3 (de H3 a H5) despues del tratamiento con fagos.

La Figura 5 muestra el numero de fagos recuperados de las heces de T1 y T2 (H3 y H4) despues del tratamiento con fagos.

La Figura 6 muestra los resultados de un analisis del numero de C. diff. obtenido del lavado y tejido intestinales asociados al lumen de 5 hamsteres (C1, C2, T1, T2, T3). Todos los hamsteres habfan sido pretratados con clindamicina.

La Figura 7 muestra los resultados promedio de los mostrados en la Figura 6.

La Figura 8 muestra el numero correspondiente de fagos recuperados de los diferentes organos de los hamsteres T1 a T3 (H3 a H5) despues del tratamiento con fagos.

La Figura 9 muestra el impacto del fago y la prevencion de la enfermedad en un estudio de modelo severo cuando se administra fago a un hamster.

La Figura 10 muestra el efecto de un tratamiento con fagos que comprende el uso de dos fagos sobre la esporulacion y sobre el recuento total de UFC para el ribotipo 027 de C. difficile.

La Figura 11 muestra el numero de celulas viables de C. difficile tras el tratamiento con fagos de celulas HT29 infectadas con C. difficile.

La Figura 12 muestra el numero de fagos libres tras el tratamiento con fagos de celulas HT29 infectadas con C. difficile.

La Figura 13 muestra el efecto de citotoxicidad tras el tratamiento con fagos de celulas HT29 infectadas con C. difficile. Se representa la cantidad de LDH citosolica liberada al medio de cultivo por las celulas HT29 infectadas con C. difficile a lo largo del eje Y.

1. Purificacion y aislamiento de fagos de C. difficile

Se enriquecieron aproximadamente 2 cm³de muestras de suelo medioambientales del R.U. en cuanto a la presencia de bacteriofagos usando medio BHI (Brain Heart Infusion) (Oxoid, R.U.), y se suplemento con un 0,1% de Taurocolato de Sodio. Se incubo la mezcla durante 10 dfas a 37°C en condiciones anaerobicas. Se centrifugaron los cultivos enriquecidos a 3.398 x g durante 10 minutos y se filtraron los sobrenadantes a traves de membranas Millipore con un tamano de poro de 0,22 pm.

Se realizo el aislamiento de fagos atemperados tras el aislamiento de las cepas medioambientales de C. difficile en medio CCEY (Bioconnections, R.U.). Se indujeron entonces los C. difficile para la liberacion del profago. Para inducir el profago, se anadieron o bien mitomicina C (3 pg/ml) o bien norfloxacina (6 pg/ml) a cultivos en fase medio logantmica (0,6 DO^{550 nm}) de aislados de C. difficile cultivados en caldo BHI. Se incubaron luego los cultivos durante 24 horas a 37°C y en condiciones anaerobicas. Tras la incubacion, se centrifugaron los cultivos a 3.398 x g durante 10 minutos y se filtraron los lisados a traves de membranas Millipore con un tamano de poro de 0,22 pm. Se guardaron todas las muestras de fagos a 4°C en oscuridad.

Se aislaron fagos realizando ensayos de pruebas de puntos de las muestras de fagos en cespedes bacterianos de C. difficile usando el metodo de sobrecapa de agar blando. Para este metodo, se mezclaron 250 pl de cultivo de una noche de C. difficile con 3 ml de agar blando BHI al 0,4%, suplementado con MgC^h0,4 M y CaCl²0,01. Se vertio entonces la mezcla plaqueada sobre una placa de agar BHI al 1%. Se dejo que esta se secara y se depositaron en puntos las muestras de fagos sobre la capa blanda en alfcuotas de 10 pl. Se incubaron los ensayos durante 24 horas a 37°C en condiciones anaerobicas. Se recogieron las placas, o aclaramientos, resultantes en 500 pl de BHI y se incubaron durante la noche a 4°C. Se recogieron muestras de fagos de los aclaramientos o placas, se centrifugaron luego a 10.000 g durante 5 minutos y se retuvo el sobrenadante. Partiendo de estas muestras de fagos, se realizaron otras tres tandas de purificacion de placas.

2. Caracterizacion del panel de fagos

Tras la purificacion (vease la seccion 1 anterior), se propagaron fagos aislados hasta obtener stocks de tftulo elevado y se usaron para Electroforesis de Campo Pulsado (PFGE) y Microscopfa Electronica de Transmision (TEM), con objeto de caracterizar los fagos por el tamano del genoma y la morfologfa de las partfculas.

Se realizo Electroforesis en Gel de Campo Pulsado (PFGE) sobre el fago purificado. Se anadieron 40 pl de agarosa Seqplaque al 2% fundida en tampon TBE 0,5x a 40 pl de muestra de fago (>10⁸UFP/ml) por tapon y se dejo durante 30-120 minutos a 4°C. Se digirieron entonces los tapones individuales durante la noche en 1 ml de tampon de lisis (EDTA 100 mM, Tris.Cl 100 mM pH 9,0, SDS 1% y 0,5 mg/ml de proteinasa K) a 55°C. Se lavaron luego los tapones tres veces en tampon TE (Tris:EDTA pH 8,0). Se juntaron despues los tapones en gel de agarosa al 1% TBE 0,5x con marcador junto a un marcador de tamano apropiado y se sometieron a 6 voltios/cm durante 17 horas a 14°C (los tiempos de pulso en desnivel fueron: inicial 5 segundos; final 13 segundos). Se tineron los geles con bromuro de etidio (a una concentracion de 10 pg/ml) y se visualizaron bajo luz U.V. de onda larga.

El analisis PGFGE identifico los tamanos del genoma para cada uno de los 7 fagos identificados; en la tabla 1 se encuentran sus resultados.

Tabla 1: Tamanos del genoma determinados usando PGFGE

Fago -Tamano (kpb) (+/-10%)

CD-HM1 50

CD-HM2 50

CD-HM3 50

CD-HM4 50

CD-HM5 50

CD-HM6 50

CD-HS1 40

La revision inicial de los datos preliminares sobre la secuenciacion de todo el genoma ha confirmado que el tamano del genoma para CD-HM1 es ~ 54 kpb de longitud.

En la figura 1, se pueden encontrar los resultados de la caracterizacion morfologica de los fagos usando MET.

3. Determinacion del espectro de hospedadores

3.1 Primera determinacion

Con objeto de determinar el espectro de hospedadores para los siete fagos, se produjeron (propagaron) primeramente en la capa huesped de C. difficile que infectaban mas eficientemente y en la que se produdan altos tttulos de fagos consistentemente. Se hace referencia a estos hospedadores como 'hospedadores propagadores' u 'hospedadores fabricadores'. Los hospedadores fabricadores fueron todos ellos aislados por el solicitante, a partir de fuentes medioambientales (CD105HE1 y CD105HS1) y clmicas (CD105LC1), respectivamente, y se han depositado en la HPA como se muestra a continuacion. CDH-M1, c Dh-M2, c Dh -M3, CDH-M5 y CDH-M6 se propagan todos en CD105HE1 (ribotipo 076). CDH-M4 se propaga en CD105HS1 (ribotipo 012) y CD-HS1 se propaga en CD105LC1 (ribotipo 027). El resto de los estudios que se discuten a continuacion siguieron la misma relacion de hospedadores fabricadores con el fago.

Se deposito CD105HE1 bajo el N° HPA 12081401.

Se deposito CD105LC1 bajo el N° HPA 12081402.

Se deposito CD105HS1 bajo el N° HPA 12081403

Se uso un panel de cepas de C. difficile para determinar el espectro de hospedadores de los fagos aislados. Se obtuvieron cepas de C. difficile tanto de fuentes medioambientales (R.U.) como de muestras clmicas en el R.U.. Se recibieron las muestras clmicas de los Leicester Hospital Trusts, a quienes expresamos nuestra gratitud. Se obtuvo el ribotipo de todas las cepas por PCR y se les asignaron sus grupos, segun el sistema de denominacion universal, del siguiente modo.

Se extrajo ADN genomico de C. difficile resuspendiendo una unica colonia tomada de cultivos de una noche crecidos en una placa de agar BHI 15 suplementada con un 7% de Sangre de Caballo desfibrinada en 150 pl de UPH²O y un 5% de resina Chelex (Biorad, R.U.). Se calentaron las muestras hasta 100°C durante 12 minutos, se enfriaron durante 5 minutos y se centrifugaron despues a 16.000 g durante 10 minutos. Se guardaron entonces los sobrenadantes a 4°C para uso futuro.

Se realizo la ribotipificacion por PCR tras la extraccion de ADN de cada cepa usando el protocolo Chelex y usando cebadores de Bidet et al. (2000). Para la electroforesis capilar en gel, se anadieron 12 pl de Mezcla HotStarTaq (Qiagen, R.U.) a 9 pl de H²O ultrapura, 1 pl de cada cebador y 1 pl de plantilla de ADN Chelex. Se marco fluorescentemente el cebador directo utilizado con FAM (Invitrogen, R.U.). Se analizo despues el producto de la PCR por electroforesis capilar en gel, usando 1 pl de ADN plantilla con 9 pl de una mezcla maestra que contema 9 pl de formaldeddo y 1 pl de marcador de ADN GeneScan™ 1200 LIZ®. Se realizo el analisis de datos en PeakScanner v1.0 (Applied Biosystems) y se determinaron los ribotipos comparandolos con un panel conocido de ribotipos. Se busco clarificacion por el Prof. Mark Wilcox y el Dr. Warren Fawley (Leeds), quienes dirigfan el servicio en red de ribotipificacion de Clostridium difficile.

Se realizo el analisis del espectro de hospedadores mediante el ensayo de la prueba de puntos previamente descrita en la seccion 1, pero esta vez sobre cepas de C. difficile cuyos ribotipos se determinaron como antes.

Se pueden encontrar los resultados del analisis anterior para la determinacion del espectro de hospedadores en la tabla 2.

Tabla 2: Determinacion del espectro de hospedadores

En la mayona de los casos, se estudio el analisis de especificidad de hospedador para cada ribotipo usando una serie de colonias de C. diff.de diferentes ongenes que se haWan identificado todas ellas como del mismo ribotipo. La segunda columna de la tabla 2 indica cada una de las colonias por separado usadas durante el analisis de cada ribotipo (cada codigo de letra-numero representa una colonia diferente de un origen diferente). Un valor de 2 en la tabla 2 representa un aclaramiento en el cesped de C. difficile tras una prueba de puntos, y, por lo tanto, demuestra la capacidad del fago estudiado para matar a C. difficile de ese ribotipo especificado. Un valor de 1 en la tabla 2 significa que se identificaron placas turbias sobre el cesped de C. difficile tras una prueba de puntos, lo que indica que el fago estudiado era capaz de matar a C. difficile de ese ribotipo especificado. Finalmente, un valor de 0 en la tabla 2 significa que no habfa aclaramientos o placas turbias sobre el cesped de C. difficile tras una prueba de puntos, lo que indica que el fago estudiado no era capaz de matar, o tema un titulo insuficiente para matar, a C. difficile de ese ribotipo especificado.

3.2 Segunda determinacion

Despues del estudio discutido anteriormente en el parrafo 3.1, se realizo un estudio similar usando C. difficile derivado de tres ongenes geograficos: muestras clmicas del R.U., de los EE.UU. y de Australia. Se ribotipificaron todas las cepas por PCR y se les asigno su grupo, segun el sistema de denominacion universal, del modo discutido anteriormente en el parrafo 3.1. En general, se usaron tttulos superiores de fago en la segunda determinacion al compararla con la primera determinacion.

Se ha realizado el analisis del espectro de hospedadores mediante el ensayo de la prueba de puntos descrito previamente en la seccion 1, pero esta vez sobre las cepas de C. difficile del segundo estudio.

En la tabla 4, se pueden encontrar los resultados del anterior analisis para la determinacion del espectro de hospedadores.

Tabla 4: Determinacion del espectro de hospedadores

Se dan a los valores de eficacia de muerte/lisis del fago proporcionados en la tabla 4 valores de 0, 1 o 2. Estos valores corresponden a las mismas designaciones de eficacia proporcionadas en la tabla 2 anterior.

4. Deposito de fagos

Se han depositado los 7 fagos todos ellos en la National Collection of Type Cultures (NCTC) el 14 de agosto de 2012. Se ha dado a cada uno de los fagos el numero de deposito mostrado en la tabla 3.

Tabla 3:- Numero de deposito NCTC

5. Analisis in vivo de la virulencia del fago (Grupo 1)

Se usaron cinco hamsteres en este estudio (C1, C2, T1, T2, T3). Se usaron C1 y C2 como controles y no se les trato con fago CD-HM1 (tambien llamado fago 12), sino que se les inoculo con 1,15x104 esporas de C. difficile de ribotipo 005 (1342) (al que tambien se hace referencia como C. difficile 1342). Se infecto a T1-T3 con 1,15x104 *C. difficile ribotipo 005 y se les trato con 3 dosis de fago CD-HM1 cada 8 h durante 24 horas (dosis de 108 ufp). Se dieron a los animales tratados con bacteriofago 400 pl de bicarbonato de sodio 1 M por via oral 30 min antes de la administracion del fago y C. difficile para neutralizar el pH del estomago.

Se sacrifico a todos los animales 24 h despues de la infeccion y se enumeraron los numeros de bacterias y bacteriofagos.

Abreviaturas:

Cie = Ciego

Col = Colon

AT = Asociado a tejidos

AL = Asociado al lumen

Despues de sacrificar a los animales, se retiraron el ciego y el colon. Se abrieron los organos longitudinalmente y se lavaron. Se plaquearon muestras del lavado intestinal asociado al lumen (AL) sobre agar de Brazier CCEY. Se pusieron entonces los organos en bolsas Stomacher en 5 ml de medio de almacenamiento y se digirieron durante 2 min para enumerar el numero de bacterias asociadas al tejido (AT), de nuevo plaqueando sobre agar de Brazier CCEY. Se incubaron las placas en la camara anaerobica durante 48 h.

En la figura 2, se pueden encontrar los resultados de este analisis.

La Figura 3 muestra los datos reunidos para los animales que no recibieron fago (figura 3A) y los que estaban siendo tratados con fago (figura 3B) del estudio anterior. Esta claro que hay una marcada reduccion en la colonizacion con C. difficile ribotipo 005 cuando se trata a los animales con bacteriofago.

Se lleva a cabo la determinacion del numero de bacteriofagos recuperados del lavado intestinal asociado al lumen como sigue:-

Se determinaron los numeros de bacteriofagos depositando 10 pl de cada muestra intestinal filtrada por triplicado sobre una capa superior de agar que contema C. difficile ribotipo 076. Se incubaron las placas en la camara anaerobica durante 24 h y se contaron los numeros de placas y se calculo la media de UFP/ml.

La Figura 4 muestra los numeros de bacteriofagos recuperados del intestino de cada uno de T1-T3 (es decir, H3-H5) del estudio anterior. La Figura 4, parte inferior derecha, muestra una media de los resultados para todos los animales tratados con fago. El fago 12 corresponde a CD-HM1.

La Figura 5 muestra la recuperacion de fagos de los excrementos (heces) de los animales T1 y T2 (es decir, H3 y H4) en el estudio anterior.

Los resultados muestran que se aislaron bacteriofagos en numeros elevados en el material asociado al lumen tanto en el ciego como en el colon en 2 animales, y tambien se encontraron en heces. Esto demuestra que los bacteriofagos pueden sobrevivir al paso a traves del estomago y del intestino. T3 (H5) mostro un mayor recuento bacteriano y tambien un menor tttulo de bacteriofagos, pero los numeros bacterianos eran aun mucho mas bajos que en los animales no tratados.

El efecto letal del bacteriofago tambien elimino suficiente toxina activa derivada de C. difficile como para evitar cualquier efecto adverso sobre el intestino de los hamsteres. No se observaron signos clmicos de infeccion, es decir, ni diarrea, ni letargia, ni movimiento doloroso.

6. Analisis in vivo tras la administracion de clindamicina (Grupo 2)

Hamsteres (C1, C2, T1, T2, T3) recibieron una dosis oral de clindamicina 30 mg/kg para alterar su microbiota y permitir la colonizacion por C. difficile. Algunos animales recibieron 400 pl de bicarbonato de sodio 1M 30 min antes de la administracion de bacterias y bacteriofago. Se inoculo a todos con 9,4x103 esporas de C. difficile 005. T1 - T3 recibieron adicionalmente tratamiento con bacteriofago CD-HM1. Se administraron los bacteriofagos por via oral con tres dosis de 500 pl que conteman 1x108 ufp a intervalos de 8 h. Se sacrifico a todos los animales 24 h despues de la inoculacion.

Despues de sacrificar a los animales, se extrajeron el ciego y el colon. Se abrieron los organos longitudinalmente y se lavaron. Se plaquearon muestras del lavado intestinal asociado al lumen (AL) sobre agar de Brazier CCEY. Se puso entonces cada organo en una bolsa Stomacher en 5 ml de medio de almacenamiento y se digirio durante 2 min para permitir la enumeracion del numero de bacterias asociadas al tejido (AT) plaqueando sobre agar de Brazier CCEY. Se incubaron las placas en una camara anaerobica durante 48 h. La Figura 6 proporciona los resultados del calculo del numero de bacterias en el estudio. La Figura 7 muestra la media de estos resultados separados en grupo control (7A) y grupo tratado (7B).

Se analiza la recuperacion de fagos bacteriofagos del lavado intestinal asociado al lumen como sigue:-

Se determinaron los numeros de bacteriofagos depositando 10 pl de cada muestra intestinal filtrada por triplicado sobre una capa superior de agar que contema C. difficile ribotipo 076. Se incubaron las placas en la camara anaerobica durante 24 h y se contaron los numeros de placas y se calculo la media de UFP/organo (UFP = unidad formadora de placas). En la figura 8 se muestran los resultados del analisis.

T1 y T2 recibieron bicarbonato de sodio 1 M antes de la inoculacion con esporas de C. difficile, ribotipo 005 (1342). No hubo diferencia significativa en la colonizacion de estos animales a las 24 h en comparacion con animales inoculados sin la etapa de neutralizacion (es decir, T3). Esto muestra que el bicarbonato de sodio no tiene efectos adversos sobre el perfil de infeccion de C. difficile ribotipo 005 (1342) en el modelo de hamster.

Los resultados obtenidos eran consistentes con los discutidos en la seccion 6. Hubo una marcada reduccion en la colonizacion con C. difficile ribotipo 005 cuando se trata a los animales con bacteriofago.

Se aislaron bacteriofagos en numeros elevados del material asociado al lumen tanto en el ciego como en el colon en dos animales (T2 y T3), y tambien se encontraron en heces. Esto demuestra que el bacteriofago puede sobrevivir al paso a traves del estomago y del intestino. T3 mostro un mayor recuento bacteriano sin recuperacion de bacteriofagos.

Los numeros bacterianos son muy inferiores a los de los animales de control, especialmente el numero de esporas presentes.

Hay pocas o ninguna espora de C. difficile presentes en el material fecal, y tambien hay presencia de bacteriofagos en este material.

El tratamiento con bacteriofagos no libero toxinas al nivel de tener un impacto sobre el intestino de los hamsteres. No se observaron signos clmicos de infeccion, es decir, diarrea, letargia o movimiento doloroso. Se extrajeron muestras del colon y del ciego y se prepararon para examen histologico para asegurarse de que no habfa danos visibles en el intestino debido a la administracion de bacteriofagos.

7. Impacto del fago sobre la prevencion de la enfermedad

Se emprendio un estudio usando la cepa productora de toxina de C. difficile B1 (ribotipo 031). Una amplia experiencia con esta cepa ha revelado un 100% de infeccion fatal aproximadamente 28-33 h postinfeccion (ref. Goulding 2009). En este experimento, se trato a seis animales por via oral con clindamicina y 24 h despues se les infecto con 5.000 esporas de C. difficile B1. Para reducir la acidez del estomago antes del tratamiento con fago, se dosifico a todos los animales con bicarbonato de sodio 30 min antes del tratamiento con bacteriofago CD-HM1 (10⁸ufp/dosis). Los animales control recibieron un tratamiento simulado con los diluyentes del fago unicamente. El tratamiento con CD-HM1 comenzo en el momento de la infeccion y continuo cada 8 h hasta el criterio de valoracion clmico experimental. Los animales control desarrollaron diarrea aproximadamente 26 h despues de la infeccion y se les sacrifico en el criterio de valoracion clmico a alrededor de 30 h. Por el contrario, los animales tratados permanecieron libres de smtomas durante 38 h y finalmente sucumbieron a una infeccion fatal unas 50 h despues de la infeccion (p=0,0075). En la Figura 9 se encuentran los resultados.

8. Preparacion de multiples fagos

Se seleccionaron dos bacteriofagos de la familia Siphoviridae, CD-HS1 (al que tambien se hace referencia como AIU-PhiX2) y AIU-ST, como fagos que se sabe infectan a cepas de C. difficile del ribotipo importante desde el punto de vista epidemico 027. En particular, se han usado ambos fagos para infectar a AIU, una cepa nosocomial de un ribotipo 027. Se infecto un cultivo de crecimiento exponencial de AIU a una DO de 0,2 (550 nm) con una mezcla de los dos bacteriofagos a una MDI (Multiplicidad de Infeccion) de 10. Tambien se usaron los dos fagos individualmente a la misma MDI para infectar a cultivos separados de AIU. Se uso el medio de cultivo (BHI) como control.

Se incubo cada uno de los cultivos durante 24 horas y se recogieron las celulas por centrifugacion a 4.000 g. Se decanto el sobrenadante y se suspendieron las pellas en BHI. Se uso una mitad de las resuspensiones para determinar el recuento total de UFC por plaqueo, mientras que se calento la otra mitad primeramente a 60°C durante 20 minutos para matar a todas las celulas vegetativas y se plaqueo despues para determinar los recuentos de esporas. Se hicieron todos los recuentos sobre placas con agar CCEY, que permite el crecimiento de las esporas de C. difficile. Despues de 24 horas de incubacion en la camara anaerobica, se enumeraron los recuentos de UFC totales y de esporas y en la figura 10 se muestran los resultados.

Los resultados mostraron que los cultivos infectados con bacteriofagos teman un recuento total de UFC (Unidades Formadoras de Colonias) y de esporas de C. difficile reducido en comparacion con el control. Ademas, se vio que el uso simultaneo de dos fagos no disminma el efecto del uso de un solo fago, demostrandose asf que los dos fagos diferentes no se inhiben entre sf.

9. Terapia con fagos sobre la infeccion por C. difficile en celulas HT29

Con objeto de determinar el efecto de CD-HS1 sobre celulas HT29 de la lmea celular epitelial humana infectada con C. difficile ribotipo 027, se cultivaron celulas HT29 a 37°C, en una incubadora humidificada con un 5% de dioxido de carbono (CO²) en medio de crecimiento consistente en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, Sigma) suplementado con un 10% de suero bovino inactivado por calor (FBS, Invitrogen), antibioticos (penicilina/estreptomicina, Sigma) y L-glutamina. Se recibieron las celulas HT29 en un pequeno matraz de cultivo de tejidos de 25 cm2 de la Glasgow University, a partir del cual se prepararon stocks, se criopreservaron y se guardaron en un Dewar de nitrogeno lfquido en fase de vapor (Taylor-Wharton) hasta necesitarlos. Se llevo a cabo todo el trabajo de cultivo celular en una cabina de seguridad biologica de clase II (Faster) usando tecnicas asepticas. Se cultivaron las celulas hasta la confluencia en matraces de cultivo de tejidos. Se retiro el medio de crecimiento por vertido suave y se lavaron suavemente las celulas en 25 ml de suero salino tamponado con fosfatos de Dulbecco templado (DPBS, Oxoid). Se anadieron 3 ml de solucion de Tripsina-EDTA (Sigma) al matraz para cubrir la monocapa despues de verter el DPBS. Se incubo entonces el matraz a 37°C durante 1 a 2 minutos y se lavaron las celulas con medio de crecimiento precalentado y se centrifugaron a 500 x g durante 3 minutos.

Se elimino el sobrenadante y se uso la pella de celulas HT29 para uno de los siguientes: subcultivo, criopreservacion o investigacion de los efectos citotoxicos de C. difficile sobre celulas HT29 en presencia y ausencia de fago.

Se alicuotaron 2 x 106 celulas/ml de celulas HT29 en volumenes de 0,5 ml en crioviales (Nalgene) y se anadieron 0,5 ml de crioprotector. Se guardaron los viales a -70°C en un Dewar de nitrogeno lfquido en fase de vapor (Taylor-Wharton) hasta necesitarlos.

Cultivo de celulas HT29 para determinar los efectos citotoxicos.

Se sembraron 5x104 celulas/ml de celulas HT29 en una placa de microtitulacion de 24 pocillos y se incubaron a 37°C en una incubadora humidificada con un 5% de CO²hasta la confluencia. Se usaron entonces las celulas para valorar los efectos de C. difficile, del fago y del cultivo de C. difficile infectado con fago sobre celulas HT29. Se infectaron las celulas HT29 con C. difficile ribotipo 027. Se determino la enumeracion de C. difficile viables en el medio de cultivo por ensayo de puntos en 4 puntos de tiempo (es decir, 1 hora despues del tratamiento, 2 horas despues del tratamiento, 4 horas despues del tratamiento y 8 horas despues del tratamiento). Se llevo a cabo este estudio en ausencia o presencia de infeccion del C. difficile con el fago antes mencionado. Como control, se llevo a cabo el estudio en ausencia de infeccion de C. difficile y de fago, es decir, que se cultivaron celulas HT29 no infectadas en el medio de cultivo. En la Figura 11 se presentan los valores medios para las tres replicas biologicas para cada uno de los anteriores estudios. En el curso del tratamiento, el numero de C. difficile viables en las celulas HT29 infectadas con C. difficile tratado con fago se redujo de 8,9 x 106 UFC/ml a casi todas las celulas bacterianas muertas 8 horas despues de la infeccion. Sin embargo, en las celulas HT29 infectadas no tratadas con fago, 8 x 103 UFC/ml de C. difficile permanedan viables despues de 8 horas, lo que demuestra que la terapia con fagos de la infeccion por C. difficile en celulas HT29 reduda el numero de C. difficile viables.

10. El efecto de la terapia con fagos sobre el numero de fagos libres

Claramente, los fagos necesitan ser capaces de replicarse si se tienen que propagar a traves del ambiente intestinal y producir una infeccion. Para determinar su capacidad para replicarse, se enumero el numero de fagos libres tras una terapia con fagos de la infeccion por C. difficile en celulas HT29 mediante pruebas de puntos y ensayos de placa, y se muestran en la Figura 12.

La terapia con fagos de la infeccion por C. difficile en celulas HT29 (Figura 12) dio como resultado un aumento en el numero de fagos libres (UFP), produciendose estallidos de fagos 2 horas despues del tratamiento en comparacion con celulas HT29 no infectadas tratadas con fagos. Esta observacion demuestra el exito en la replicacion de los fagos en C. difficile cuando se cultivan en celulas epiteliales.

11. El efecto de la terapia con fagos sobre la liberacion de lactato deshidrogenasa por celulas HT29

Con objeto de determinar la perdida de integridad de la membrana de las celulas HT29 y, por lo tanto, el nivel de citotoxicidad, se valoro la cantidad de lactato deshidrogenasa (LDH) citosolica liberada al medio de cultivo por celulas HT29 infectadas por C. difficile en presencia y ausencia de fagos, y se muestra en la Figura 13.

Se uso un kit de citotoxicidad comercial (Promega, CytoTox 96) para determinar la cantidad de LDH liberada por las celulas HT29 al medio de cultivo en presencia y ausencia de fagos a lo largo de un penodo de tiempo de 8 horas. Se presentan los valores medios de tres replicas biologicas consistentes en tres repeticiones tecnicas. Las barras de error representan el error estandar de la media. Se restaron los valores de fondo de los medios BHI y de crecimiento de cada resultado.

La cantidad de LDH liberada por las celulas HT29 infectadas con C. difficile era significativamente mayor a las 8 horas en comparacion con celulas HT29 infectadas con C. difficile tratado con fagos durante el mismo penodo de tiempo (P < 0,0001). El tratamiento con fagos, por lo tanto, redujo el efecto citotoxico causado por la infeccion por C. difficile en celulas HT29 y no se liberaron niveles significativos de toxina.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un panel de bacteriofagos, en donde el panel comprende uno cualquiera o mas bacteriofagos seleccionados del grupo que consiste en:- NCTC 12081404, NCTC 12081405, NCTC 12081406, NCTC 12081407, NCTC 12081408, NCTC 12081409 y NCTC 12081410.

2. Un panel segun la reivindicación 1, en donde el panel es capaz de lisar a C. difficile.

3. Un panel segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende o consiste en NCTC 12081404, NCTC 12081405, NCTC 12081406, NCTC 12081407, NCTC 12081408, NCTC 12081409 y NCTC 12081410.

4. Un panel segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende o consiste en NCTC 12081404 y NCTC 12081408, y que opcionalmente ademas comprende o consiste en NCTC 12081409 y/o NCTC 12081410.

5. Un panel segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende o consiste en NCTC 12081404.

6. Un panel segun la reivindicación 1, que comprende o consiste en NCTC 12081404, NCTC 12081405, NCTC 12081408 y NCTC 12081410.

7. Un panel segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que es capaz de lisar a mas de 5 ribotipos diferentes de C. difficile.

8. Un panel de bacteriofagos que comprende una pluralidad de bacteriofagos y que es capaz de lisar a mas de 5 ribotipos diferentes de C. difficile.

9. Un panel segun la reivindicación 7 o la reivindicación 8, donde al menos uno de los ribotipos es 027 y/o 014/020.

10. Un panel segun la reivindicación 8 o la reivindicación 9, donde el panel incluye al menos 3 bacteriofagos diferentes.

11. Una composicion farmaceutica que comprende o consiste en cualquiera de los paneles de las reivindicaciones anteriores.

12. Una composicion que comprende o consiste en los paneles o las composiciones de cualquiera de las reivindicaciones anteriores para uso en un metodo de tratamiento.

13. Una composicion para uso segun la reivindicación 12, en donde el metodo es para tratar la infeccion por C. difficile.

14. Una composicion para uso segun la reivindicación 13, en donde la infeccion se caracteriza por uno cualquiera o mas de los siguientes:- diarrea, colitis, sepsis, megacolon toxico, hipotension o perforacion gasteroenterica.

15. Una composicion que comprende o consiste en los paneles o las composiciones de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, para uso en un metodo de tratamiento profilactico, eventualmente en donde se administra la composicion a un sujeto que aun no ha sido colonizado por C. difficile.