ES2710444T3 - Un polipéptido de interleucina 34 aislado para uso en la prevención del rechazo de trasplante y el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias - Google Patents

Abstract

Un polipéptido de interleucina 34 (IL-34) aislado o un polinucleótido que codifica el mismo para uso en la inducción de tolerancia inmunitaria en un paciente necesitado de ello.

Description

DESCRIPCION

Un polipeptido de interleucina 34 aislado para uso en la prevencion del rechazo de trasplante y el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias

CAMPO:

La invencion esta en el campo de la inmunoterapia.

ANTECEDENTES:

La induccion de tolerancia inmunitaria es una potente herramienta para controlar respuestas inmunitarias causantes de situaciones patologicas. Se han descrito citocinas, enzimas que controlan las rutas metabolicas y moleculas de superficie celular capaces de inducir tolerancia. A pesar de estos hallazgos, existen evidencias de otros mecanismos no identificados y es por tanto importante identificar nuevos mediadores de la tolerancia inmunitaria.

El trasplante de organos ha mostrado mejoras muy significativas tanto en la prevencion como en el tratamiento de rechazo agudo, pero los episodios subclmicos y la disfuncion cronica de injerto siguen afectando en gran medida la supervivencia del injerto a medio y largo plazo (1). Las estrategias terapeuticas emergentes, entre ellas induccion de tolerancia ante antfgenos del donante, estan trasladandose a la clmica despues de anos de trabajo en modelos experimentales (2, 3). Entre los mecanismos naturales y las estrategias inductivas de tolerancia, diferentes tipos de celulas reguladoras estan entre las mas prometedoras (4). Los linfocitos T reguladores CD8+ (Treg CD8+) en el campo de los trasplantes, pero tambien en otras situaciones patofisiologicas, se han destacado en los ultimos anos (5-8). Tambien se han descrito citocinas, enzimas que controlan las rutas metabolicas, y moleculas de superficie celular capaces de inducir tolerancia como nuevos mediadores de tolerancia inmunitaria.

Una nueva citocina llamada IL-34 se identifico en 2008 (9). Los estudios mostraron que IL-34 comparte homologfa con M-CSF y actua a traves de un receptor comun, CD115, tambien llamado CSF-1R (9), expresado sobre la superficie celular de monocitos, y en el cerebro a traves de un receptor nuevo descrito, protema-tirosina fosfatasa C de tipo receptor (PTP-C) (10). Sin embargo, los estudios han demostrado que IL-34 y M-CSF presentaban distinta actividad biologica y activacion de senal (11), probablemente debido a la expresion espacial y temporal diferencial de IL-34 y M-CSF (12). La funcion de IL-34 se ha relacionado principalmente hasta ahora con la supervivencia y funcion de monocitos y macrofagos (osteoclastos, microglia) asf como DC (12). Los datos sobre la expresion de IL-34 en celulas en reposo se superpoman parcialmente, puesto que los ratones con GFP bajo el control del promotor de IL-34 mostraban queratinocitos, foifculos pilosos, neuronas, celulas de tubulo renal proximal y celulas germinales de tubulo semimfero positivos (12), mientras que los analisis de ARNm y protema mostraban corazon, cerebro, pulmon, hugado, rinon, bazo, timo, testmulos, ovarios, prostata, colon e intestino delgado y abundante expresion de protema en pulpa roja de bazo y osteoclastos (9). Tras la inflamacion, otras celulas tales como fibroblastos (13), osteoclastos (14) y celulas sinoviales articulares (13) regulaban positivamente la expresion de IL-34. Hasta ahora, no se ha descrito ni demostrado la expresion de IL-34 por otras celulas linfoides y particularmente linfocitos T. De forma similar, no se ha ligado IL-34 con efectos sobre la funcion inmunitaria de DC o linfocitos T, puesto que la respuesta disminuida ante antfgenos de DTH o infecciones vmcas del SNC en ratones deficientes de IL-34 estaba ligada a la escasez de celulas de Langerhan y microglia en piel y SNC, respectivamente (12). Finalmente, no hay hasta la fecha una descripcion del papel de IL-34 en la tolerancia en trasplantes.

En un modelo de aloinjerto cardiaco en ratas, se ha mostrado anteriormente que el bloqueo de CD40-CD40L, por tratamiento con CD40Ig, induce la supervivencia del injerto a largo plazo mediante la generacion de Treg CD8+CD45RCbajo (denominados Treg CD8+CD40Ig) (15). Se ha mostrado tambien que estos Treg CD8+ imponen tolerancia alogenica parcialmente mediante la produccion de IFNy y protema de tipo fibrinogeno 2 (FGL2) (15, 16) y el reconocimiento de un peptido donante derivado de MHC-II dominante (17). Se sospecho en primer lugar un papel potencial para FGL2 como mecanismo tolerogenico inmunitario cuando la comparacion transcriptomica pangenomica de Treg CD8+CD40Ig frente a Treg CD8+CD45RCbajo de ratas no expuestas mostro una expresion de FGL2 aumentada (16). El mismo analisis transcriptomico revelo que IL-34 se sobreexpresaba en Treg CD8+CD40Ig de receptores a largo plazo frente a Treg CD8+CD45RCbajo de animales no expuestos.

Por lo tanto, a pesar de los considerables avances en la prevencion del rechazo de trasplante, tal patologfa sigue asociada a una alta morbilidad y mortalidad y existe una necesidad desesperada de nuevos mediadores de tolerancia inmunitaria y nuevas estrategias inductivas de tolerancia (mas particularmente por regulacion negativa de las respuestas de linfocitos T) para uso en la prevencion o el tratamiento de rechazo de trasplante (o para uso en la induccion de tolerancia a trasplantes) asf como enfermedades autoinmunitarias, respuestas inmunitarias indeseadas contra protemas expresadas en el transcurso de terapia genica y/o protemas terapeuticas y alergia.

Ademas, existe la necesidad de un biomarcador facilmente medible que prediga el riesgo de rechazo de trasplante. Tal biomarcador sena por tanto util para monitorizar los pacientes trasplantados, y tambien para ajustar su tratamiento inmunosupresor.

Hasta ahora, ningun estudio ha examinado si IL-34 podna inducir tolerancia inmunitaria y predecir si un paciente trasplantado es tolerante o no (presentando por tanto un riesgo aumentado de rechazo de trasplante y requiriendo por lo tanto un tratamiento inmunosupresor apropiado). De forma similar, IL-34 no se ha ligado con efectos sobre la funcion inmunitaria de DC o linfocitos T y su potencial supresor en trasplantes no se ha sospechado ni estudiado nunca. Por el contrario, el documento WO2014/036357 divulga el uso de anticuerpos dirigidos a IL-34 para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias. Se reseno tambien que IL-34 aumenta en artritis reumatoide y esta implicada en el smdrome de Sjogren (YAMING WANG ET AL: "lnterkeukin-34, a cytokine crucial for the differentiation and maintenance of tissue resident macrophages and Langerhans cells", EUROPEAN JOURNAL OF IMMUNOLOGY, vol.

44, n° 6, 22 de mayo de2014 (22-05-2014), paginas 1575-1581).

COMPENDIO:

La presente invencion se define por las reivindicaciones, en particular, la presente invencion se refiere a:

- Un polipeptido de interleucina 34 (IL-34) aislado o un polinucleotido que codifica el mismo para uso en la induccion de tolerancia inmunitaria en un paciente necesitado de ello;

- un polipeptido de IL-34 aislado o un polinucleotido que codifica el mismo para uso en la prevencion o reduccion del rechazo de trasplante en un paciente necesitado de ello;

- un polipeptido de IL-34 aislado o un polinucleotido que codifica el mismo para uso en la prevencion o el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias, respuesta inmunitaria indeseada contra protemas terapeuticas y alergias en un paciente necesitado de ello;

- una composicion farmaceutica o una composicion de kit de piezas que comprende un polipeptido de IL-34 aislado o un polinucleotido que codifica el mismo y un farmaco inmunosupresor y

- un metodo in vitro para determinar si un paciente esta en riesgo de rechazo de trasplante, enfermedades autoinmunitarias, respuesta inmunitaria indeseada contra protemas terapeuticas o alergias, que comprende una etapa de determinacion del nivel de expresion de IL-34 en una muestra biologica obtenida de dicho paciente, en el que la presencia de IL-34 es indicativa de un riesgo reducido de rechazo de trasplante, enfermedades autoinmunitarias, respuesta inmunitaria indeseada contra protemas terapeuticas o alergias.

DESCRIPCION DETALLADA:

Los inventores demostraron que IL-34 induce inmunosupresion, inhibe respuestas de linfocitos T primarios e induce tolerancia de linfocitos T. Este enfoque es de interes en los campos de autoinmunidad, alergia, trasplantes, tratamiento con protemas terapeuticas y terapia genica para evitar la degradacion de moleculas/tejidos propios o terapeuticos por el sistema inmunitario.

Los inventores demostraron por primera vez la implicacion de IL-34 en la funcion inmunosupresora de Treg CD8+ in vitro. El bloqueo de su receptor CD115, expresado exclusivamente en celulas mieloides, revertfa el efecto supresor de IL-34 sobre la proliferacion de linfocitos CD4+ efectores ante pDC, sugiriendo una supresion indirecta de la respuesta de linfocitos T a traves de pDC. Mostraron por primera vez que la sobreexpresion de IL-34 induce celulas reguladoras in vivo, capaces de tolerancia infecciosa. Por consiguiente, identificaron a IL-34 como un nuevo mediador de la supresion por Treg CD8+, y como una citocina tolerogenica que inhibe eficazmente el rechazo de aloinjerto.

Los inventores demostraron tambien que una combinacion que comprende IL-34 y un tratamiento inmunosupresor a corto plazo suboptimo (rapamicina) posibilita un aumento sinergico de la supervivencia del injerto a largo plazo frente a cada tratamiento separadamente. Evaluaron por tanto el potencial inmunoregulador de esta citocina en trasplantes usando sobreexpresion mediada por AAV y demostraron una prolongacion significativa de la supervivencia de aloinjerto en asociacion con una tanda corta de 10 dfas de dosis suboptima de rapamicina, conduciendo a un 75 % de supervivencia indefinida, con inhibicion total de la produccion de aloanticuerpos.

Los inventores demostraron ademas que IL-34 es util como biomarcador para predecir el riesgo de rechazo de trasplante.

Metodos y usos terapeuticos:

La presente divulgacion proporciona metodos y composiciones (tales como composiciones farmaceuticas y de kit de piezas) para uso en la induccion y/o mantenimiento de tolerancia inmunitaria en un paciente necesitado de ello.

La presente divulgacion proporciona tambien metodos y composiciones para uso en la prevencion o reduccion del rechazo de trasplante en un paciente necesitado de ello.

La presente divulgacion proporciona ademas metodos y composiciones para uso en la prevencion o el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias, respuestas aloinmunitarias y alergias en un paciente necesitado de ello.

En un primer aspecto, la presente divulgacion se refiere a un polipeptido de interleucina 34 (IL-34) aislado para uso en la induccion y/o el mantenimiento de tolerancia inmunitaria en un paciente necesitado de ello.

Como se usa en la presente memoria, la expresion “tolerancia inmunitaria” hace referencia a un estado de insensibilidad del sistema inmunitario ante sustancias o tejidos que tienen la capacidad de desencadenar una respuesta inmunitaria.

Como se usa en la presente memoria, la expresion “respuesta inmunitaria” incluye respuestas inmunitarias mediadas por linfocitos T y/o mediadas por linfocitos B. Las respuestas inmunitarias ejemplares incluyen respuestas de linfocitos T, p. ej. produccion de citocina y citotoxicidad celular, ademas, la expresion respuesta inmunitaria incluye respuestas inmunitarias que se efectuan indirectamente por la activacion de linfocitos T, p. ej. produccion de anticuerpos (respuestas humorales) y activacion de celulas sensibles a citocinas, p. ej. macrofagos. Las celulas inmunitarias implicadas en la respuesta inmunitaria incluyen linfocitos tales como linfocitos B y linfocitos T (celulas CD4+, CD8+, Th1 y Th2); celulas presentadoras de antigeno (p. ej., celulas presentadoras de antigeno profesionales tales como celulas dendnticas); linfocitos citoltticos naturales; celulas mieloides tales como macrofagos, eosinofilos, mastocitos, basofilos y granulocitos.

Por ejemplo, las respuestas inmunitarias estan implicadas en el rechazo de trasplante, asf como en el resultado fisiologico concomitante de tales respuestas inmunitarias tal como, por ejemplo, fibrosis intersticial, arteriosclerosis de injerto cronica o vasculitis. Las respuestas inmunitarias estan tambien implicadas en enfermedades autoinmunitarias y en el resultado fisiologico concomitante de tales respuestas inmunitarias, incluyendo infiltracion dependiente de linfocitos T y lesion de tejido directa, reclutamiento dependiente de linfocitos T y activacion de macrofagos y otras celulas efectoras y respuestas de linfocitos B dependientes de linfocitos T que conducen a la produccion de autoanticuerpos.

Por tanto, los pacientes tratados con un polipeptido de IL-34 en comparacion con los pacientes no tratados presentan los siguientes rasgos fisiologicos: a) un nivel disminuido de respuesta inmunitaria (espedfica o no) (que se cree que esta mediada en parte por linfocitos T CD4+ y CD8+ efectores espedficos de antigeno); b) un retardo en el inicio o la progresion de una respuesta inmunitaria (espedfica o no); o c) un riesgo reducido de inicio o progresion de una respuesta inmunitaria (espedfica o no). Como se usa en la presente memoria, el termino tolerancia inmunitaria “espedfica” aparece cuando se provoca preferentemente tolerancia inmunitaria ante ciertos antfgenos en comparacion con otros.

Se entiende por “paciente necesitado de ello” un individuo que padece o es susceptible de padecer rechazo de trasplante, enfermedades autoinmunitarias, respuestas aloinmunitarias o alergias para tratar. Los individuos para tratar en el marco de la presente divulgacion son mamfferos, preferiblemente seres humanos.

En una realizacion particular, el paciente necesitado de ello es un paciente sometido a trasplante.

En un segundo aspecto, la presente divulgacion se refiere a un polipeptido de IL-34 aislado para uso en la prevencion o reduccion del rechazo de trasplante en un paciente necesitado de ello.

Como se usa en la presente memoria, la expresion “prevenir o reducir el rechazo de trasplante” pretende englobar la prevencion o inhibicion del rechazo inmunitario de trasplante, asf como el retardo del inicio o progresion del rechazo inmunitario de trasplante. La expresion pretende tambien englobar la prolongacion de la supervivencia de un trasplante en un paciente o la reversion del fracaso de un trasplante en un paciente. Ademas, la expresion pretende englobar la mejora de un smtoma de un rechazo inmunitario de trasplante incluyendo, por ejemplo, la mejora de una complicacion inmunologica asociada a rechazo inmunitario tal como, por ejemplo, fibrosis intersticial, aterosclerosis cronica de injerto o vasculitis.

Como se usa en la presente memoria, la expresion “rechazo de trasplante” engloba tanto rechazo de trasplante agudo como cronico. “Rechazo agudo” es el rechazo por el sistema inmunitario de un receptor de trasplante de tejido cuando el tejido trasplantado es inmunologicamente ajeno. El rechazo agudo se caracteriza por la infiltracion del tejido de trasplante por celulas inmunitarias del receptor, que llevan a cabo su funcion efectora y destruyen el tejido de trasplante. El inicio del rechazo agudo es rapido y aparece generalmente en seres humanos al cabo de pocas semanas despues de la cirugfa de trasplante. Generalmente, el rechazo agudo puede inhibirse o suprimirse con farmacos inmunosupresores tales como rapamicina, ciclosporina, anticuerpo monoclonal anti-CD40L y similares. El “rechazo de trasplante cronico” aparece generalmente en seres humanos al cabo de varios meses a anos despues del injerto, incluso en presencia de inmunosupresion exitosa del rechazo agudo. La fibrosis es un factor comun en el rechazo cronico de todos los tipos de trasplantes de organos.

El termino “trasplante” y variaciones del mismo hacen referencia a la insercion de un trasplante (tambien llamado injerto) en un receptor, ya sea el trasplante singenico (donde donante y receptor son geneticamente identicos), alogenico (donde donante y receptor son de ongenes geneticos diferentes pero de la misma especie) o xenogenico (donde donante y receptor son de diferentes especies). Por tanto, en un escenario tfpico, el hospedador es humano y el injerto es un isoinjerto, derivado de un ser humano del mismo o diferente origen genetico. En otro escenario, el injerto deriva de una especie diferente de en la que se trasplanta, incluyendo animales de especies ampliamente separadas filogeneticamente, por ejemplo un corazon de mandril trasplantado a un hospedador humano.

En una realizacion, el donante del trasplante es un ser humano. El donante del trasplante puede ser un donante vivo o un donante fallecido, a saber un donante cadaver.

En una realizacion, el trasplante es un organo, un tejido o celulas.

Como se usa en la presente memoria, el termino “organo” hace referencia a un organo vascularizado solido que efectua una funcion espedfica o grupo de funciones en un organismo. El termino organo incluyen, pero sin limitacion corazon, pulmon, rinon, hugado, pancreas, piel, utero, hueso, cartflago, intestino delgado o grueso, vejiga, cerebro, mama, vasos sangumeos, esofago, trompa de Falopio, vesmula, ovarios, pancreas, prostata, placenta, medula espinal, miembros incluyendo superiores e inferiores, bazo, estomago, testmulos, timo, tiroides, traquea, ureter, uretra y utero. Como se usa en la presente memoria, el termino “tejido” hace referencia a cualquier tipo de tejido en ser humano o animales e incluye, pero sin limitacion, tejido vascular, tejido cutaneo, tejido hepatico, tejido pancreatico, tejido neural, tejido urogenital, tejido gastrointestinal, tejido esqueletico incluyendo hueso y cartflago, tejido adiposo, tejido conectivo incluyendo tendones y ligamentos, tejido amniotico, tejido corionico, dura, pericardio, tejido muscular, tejido glandular, tejido facial y tejido oftalmico.

En una realizacion particular, el rechazo de trasplante es rechazo de alotrasplante cardiaco.

Como se usa en la presente memoria, el termino “celulas” hace referencia a una composicion enriquecida en celulas de interes, preferiblemente una composicion que comprende al menos un 30 %, preferiblemente al menos un 50 %, incluso mas preferiblemente al menos un 65 % de dichas celulas.

En ciertas realizaciones, las celulas se seleccionan del grupo consistente en citoblastos hematopoyeticos multipotentes derivados de medula osea, sangre periferica o sangre de cordon umbilical o celulas diferenciadas derivadas de citoblastos pluripotentes (concretamente, citoblastos embrionarios (ES) o citoblastos pluripotentes inducidos (iPS)) o multipotentes de diferentes linajes celulares tales como cardiomiocitos, celulas beta pancreaticas, hepatocitos, neuronas, etc.

En una realizacion, la composicion celular se usa para trasplante de citoblastos hematopoyeticos alogenicos (HSCT) y por tanto comprende citoblastos hematopoyeticos multipotentes, habitualmente derivados de medula osea, sangre periferica o sangre de cordon umbilical.

El HSCT puede ser curativo para pacientes con leucemia y linfomas. Sin embargo, es una limitacion importante del HCT alogenico el desarrollo de enfermedad de injerto contra hospedador (EICH), que aparece en forma grave en aproximadamente un 30-50 % de los seres humanos que reciben esta terapia.

Los polipeptidos de la presente divulgacion son utiles en la prevencion o reduccion de la enfermedad de injerto contra hospedador (EICH).

Por consiguiente, en una realizacion, el paciente necesitado de ello esta afectado por una enfermedad seleccionada del grupo consistente en leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia linfoide aguda (LLA), leucemia mieloide cronica (LMC), smdrome mielodisplasico (SMD)/smdrome mieloproliferativo, linfomas tales como linfomas de Hodgkin y no de Hodgkin, leucemia linfatica cronica (LLC) y mieloma multiple.

En un tercer aspecto, la presente divulgacion se refiere a un polipeptido de IL-34 aislado para uso en la prevencion o tratamiento de enfermedades autoinmunitarias, respuestas inmunitarias indeseadas contra protemas expresadas en el transcurso de terapia genica o protemas terapeuticas y alergias en un paciente de las mismas.

Como se usan en la presente memoria, los terminos “previenen”, “prevenir” y “prevencion” hacen referencia a la administracion de terapia a un individuo que puede manifestar en ultima instancia al menos un smtoma de una enfermedad, trastorno o afeccion, pero que todavfa no lo ha hecho, para reducir la posibilidad de que el individuo desarrolle el smtoma de la enfermedad, trastorno o afeccion durante un periodo dado de tiempo. Tal reduccion puede reflejarse, por ejemplo, en un inicio retardado de al menos un smtoma de la enfermedad, trastorno o afeccion en el paciente.

Como se usan en la presente memoria, los terminos “tratan”, “tratar” o “tratamiento” hacen referencia a la administracion de terapia a un individuo en un intento por reducir la frecuencia y/o gravedad de los smtomas de una enfermedad, trastorno o afeccion adversa de un paciente.

Como se usa en la presente memoria, la expresion “enfermedad autoinmunitaria” hace referencia a una enfermedad en que el sistema inmunitario produce una respuesta inmunitaria (por ejemplo, una respuesta de linfocitos B o linfocitos T) contra un antfgeno que es parte del hospedador normal (es decir, un autoantfgeno), con posterior lesion de tejidos. En una enfermedad autoinmunitaria, el sistema inmunitario del hospedador no consigue reconocer un antfgeno particular como “propio” y se monta una reaccion inmunitaria contra los tejidos del hospedador que expresan el antfgeno.

Las enfermedades autoinmunitarias ejemplares que afectan a seres humanos incluyen artritis reumatoide, oligoartritis juvenil, artritis inducida por colageno, artritis inducida por coadyuvante, smdrome de Sjogren, esclerosis multiple, encefalomielitis autoinmunitaria experimental, enfermedad intestinal inflamatoria (por ejemplo, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa), atrofia gastrica autoinmunitaria, penfigo vulgar, psoriasis, vitiligo, diabetes de tipo 1, diabetes en no obesos, miastenia grave, enfermedad de Grave, tiroiditis de Hashimoto, colangitis esclerosante, sialadenitis esclerosante, lupus sistemico eritematoso, purpura trombocitopenica autoinmunitaria, smdrome de Goodpasture, enfermedad de Addison, esclerosis sistemica, polimiositis, dermatomiositis, hemofilia adquirida, purpura trombocitopenica trombotica y similares.

Como se usa en la presente memoria, el termino “respuesta inmunitaria indeseada contra una protema terapeutica” hace referencia a cualquier reaccion inmunitaria indeseada dirigida a protemas expresadas en el transcurso de terapia genica y/o protemas terapeuticas tales como factor VIII (hemofilia A) y otros factores de coagulacion, terapias de sustitucion hormonal, anticuerpos monoclonales (p. ej., natalizumab, rituximab, infliximab), anticuerpos policlonales, enzimas o citocinas (p. ej. IFN-P).

Por ejemplo, este enfoque puede aplicarse de hecho a suprimir una respuesta inmunitaria, especialmente para prevenir reacciones inmunitarias ante protemas espedficas cuando se restaura su expresion por terapia genica en individuos con las correspondientes deficiencias geneticas. Por tanto, un polipeptido de IL-34 aislado segun la presente divulgacion puede usarse para prevenir la reactividad inmunitaria hacia protemas normalmente ausentes en el paciente debido a mutaciones, mientras que se consigue su reconstitucion por terapia genica.

Ademas, la terapia de protemas es un area de innovacion medica que se esta volviendo mas generalizada, e implica la aplicacion de protemas, tales como enzimas, anticuerpos o citocinas, directamente a pacientes como productos terapeuticos. Uno de los obstaculos principales en el suministro de tales medicamentos implica las respuestas inmunitarias dirigidas contra la protema terapeutica misma. La administracion de terapias basadas en protema esta a menudo acompanada por la administracion de inmunosupresores, que se usan para facilitar una vida util mas larga de la protema y por lo tanto una captacion aumentada de la protema en las celulas y tejidos del organismo. Los inmunosupresores generales pueden ser sin embargo desventajosos debido a la naturaleza inespedfica de la inmunosupresion que se lleva a cabo, dando como resultado efectos secundarios indeseados en el paciente. Por lo tanto, este enfoque puede aplicarse a suprimir una respuesta inmunitaria contra protemas y peptidos terapeuticos, tales como anticuerpos terapeuticos, citocinas, enzimas o cualquier otra protema administrada a un paciente.

Como se usa en la presente memoria, el termino “alergia” o “alergias” hace referencia a un trastorno (o reaccion incorrecta) del sistema inmunitario. Las reacciones alergicas aparecen ante sustancias ambientales normalmente inocuas conocidas como alergenos; estas reacciones son adquiridas, predecibles y rapidas. Estrictamente, la alergia es una de las cuatro formas de hipersensibilidad y se llama hipersensibilidad de tipo I (o inmediata). Se caracteriza por una activacion excesiva de ciertos globulos blancos llamados mastocitos y basofilos por un tipo de anticuerpo conocido como IgE, dando como resultado una respuesta inflamatoria extrema. Las reacciones alergicas comunes incluyen eczema, urticaria, fiebre del heno, asma, alergias alimentarias y reacciones al veneno de insectos picadores tales como avispas y abejas.

Como se usan en la presente memoria, las expresiones “polipeptido de interleucina 34” o “polipeptido de IL-34” son bien conocidas en la materia y hacen referencia a una citocina que promueve la proliferacion, supervivencia y diferenciacion de monocitos y macrofagos. La expresion incluye isoformas de IL-34 de origen natural (p. ej. Q6ZMJ4 y Q6ZMJ4-2 con y sin Q81), variantes (p. ej. las variantes rs8046424 y rs7206509) y formas modificadas de las mismas. La protema IL-34 humana de origen natural tiene una secuencia aminoaddica de 242 aminoacidos proporcionada en la base de datos UniProt con el numero de acceso Q6ZMJ4 y se muestra como sigue (SEQ ID NO: 1) o un polipeptido que tiene una secuencia al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % identica a la secuencia SEQ ID NO: 1:

MPRGFTWERYLGIFLGVALGNEPLEMWPLTQNEECTVTGFLRDKLQYRSRLQ

YMKHYFPINYKISVPYEGVFRIANVTRLQRAQVSERELRYLWVLVSLSATESVQDVL

l e g h p s w k y l q e v e t l l l n v q q g l t d v e v s p k v e s v l s l l n a p g p n l k l v r p k a l l d

NCFRVMELLYCSCCKQSSVLNWQDCEVPSPQSCSPEPSLQYAATQLYPPPPWSPSSPP

HSTGSVRPVRAQGEGLLP

Como se usa en la presente memoria, el termino “polipeptido” hace referencia a un polfmeros de residuos de aminoacidos unidos por enlaces peptfdicos, ya sea producido de forma natural o sintetica, que no tiene una longitud espedfica. Por tanto, los peptidos, oligopeptidos y protemas se incluyen en la definicion de polipeptido y estos terminos se usan intercambiablemente a lo largo de la memoria descriptiva, asf como en las reivindicaciones. El termino polipeptido no excluye modificaciones postraduccionales que incluyen, pero sin lmitacion, fosforilacion, acetilacion, glicosilacion y similares. El termino se aplica tambien a polfmeros de aminoacidos en que uno o mas residuos de aminoacidos son un mimetico qrnmico artificial de un correspondiente aminoacido de origen natural, asf como a polfmeros de aminoacidos de origen natural y un polfmero de aminoacidos de origen no natural.

Se entiende por un polipeptido “aislado” que el polipeptido no esta presente en un organismo vivo, p. ej. en el cuerpo humano. Sin embargo, el polipeptido aislado puede ser parte de una composicion o un kit. El polipeptido aislado esta preferiblemente purificado. Tal polipeptido esta esencialmente libre de componentes celulares contaminantes, tales como carbohidratos, lfpidos u otras impurezas proteicas asociadas al polipeptido en la naturaleza. Tfpicamente, una preparacion de polipeptido aislado contiene el polipeptido en una forma altamente purificada, concretamente al menos aproximadamente un 80 % pura, al menos aproximadamente un 90 % pura, al menos aproximadamente un 95 % pura, mas de un 95 % pura tal como un 96 %, 97 % o 98 % o mas pura, o mas de un 99 % pura. Un modo de mostrar que una preparacion de protema particular contiene un polipeptido aislado es por la aparicion de una unica banda despues de electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS de la preparacion de protema y tincion con azul brillante de Coomasie del gel.

La expresion “polipeptido de IL-34” se define en la presente memoria por incluir el polipeptido de IL-34 humano de origen natural y las variaciones alelicas de origen natural del polipeptido. Las variaciones alelicas son cambios de base de origen natural en la poblacion de la especie que pueden dar como resultado un cambio de aminoacido o no en un polipeptido o protema. Adicionalmente, los polipeptidos de IL-34 segun la presente divulgacion no solo engloban polipeptidos que comprenden o consisten en IL-34 de longitud completa y variantes de la misma, sino tambien polipeptidos consistentes en fragmentos de la misma, a condicion de que los fragmentos sean biologicamente activos. Estan incluidos adicionalmente en esta definicion las versiones tanto recombinante como sintetica del polipeptido de IL-34, que pueden contener modificaciones inducidas en el polipeptido y secuencias de ADN del mismo. Por consiguiente, la expresion polipeptido de IL-34 pretende englobar los equivalentes funcionales del polipeptido de IL-34 codificado por la secuencia s Eq ID NO: 1.

Como se usa en la presente memoria, un “equivalente funcional” hace referencia a una molecula (p. ej., un polipeptido recombinante) que retiene la actividad biologica y especificidad del polipeptido parental. Por lo tanto, la expresion “equivalente funcional del polipeptido de IL-34” incluye variantes y fragmentos del polipeptido al que se hace referencia (concretamente, el polipeptido de IL-34) a condicion de que los equivalentes funcionales exhiban al menos una, preferiblemente todas las actividades biologicas del polipeptido de referencia, como se describe a continuacion. Los equivalentes funcionales del polipeptido de IL-34 se han descrito anteriormente (40).

Una “variante” de polipeptido hace referencia a un polipeptido biologicamente activo que tiene al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia aminoaddica con el polipeptido de secuencia nativa. Tales variantes incluyen, por ejemplo, polipeptidos en los que se anaden o eliminan uno o mas residuos de aminoacidos en el extremo N o C del polipeptido. Normalmente, una variante tendra al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia aminoaddica, mas preferiblemente al menos aproximadamente un 90 % de identidad de secuencia aminoaddica e incluso mas preferiblemente al menos aproximadamente un 95 % de identidad de secuencia aminoaddica con el polipeptido se secuencia nativa.

Se entiende por un polipeptido que tiene una secuencia aminoaddica al menos, por ejemplo, un 95 % “identica” a una secuencia aminoaddica de consulta de la presente divulgacion que la secuencia aminoaddica del polipeptido en cuestion sea identica a la secuencia de consulta excepto porque la secuencia polipeptfdica en cuestion puede incluir hasta 5 alteraciones de aminoacido por cada 100 aminoacidos de la secuencia aminoaddica de consulta. En otras palabras, para obtener un polipeptido que tenga una secuencia aminoaddica al menos un 95 % identica a una secuencia aminoaddica de consulta, hasta el 5 % (5 de 100) de los residuos aminoaddicos en la secuencia en cuestion pueden insertarse, eliminarse o sustituirse por otro aminoacido.

En el marco de la solicitud, se calcula el porcentaje de identidad usando un alineamiento global (concretamente, se comparan las dos secuencias en su longitud completa). Los metodos para comparar la identidad y homologfa de dos o mas secuencias son bien conocidos en la materia. Puede usarse, por ejemplo, el programa “Needle”, que usa el algoritmo de alineamiento global de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970 J. Mol. Biol, 48: 443-453) para encontrar el alineamiento optimo (incluyendo huecos) de dos secuencias cuando se considera su longitud completa. El programa Needle esta por ejemplo disponible en el sitio www.ebi.ac.uk. El porcentaje de identidad de acuerdo con la presente divulgacion se calcula preferiblemente usando el programa EMBOSS::needle (global) con un parametro de “apertura de hueco” igual a 10,0, un parametro de "extension de hueco” igual a 0,5 y una matriz Blosum62.

Los polipeptidos que consisten en una secuencia aminoaddica “al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % identica” a una secuencia de referencia pueden comprender mutaciones tales como deleciones, inserciones y/o sustituciones en comparacion con la secuencia de referencia. El polipeptido consistente en una secuencia aminoaddica al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % identica a una secuencia de referencia puede corresponder a una variante alelica de la secuencia de referencia. Puede comprender por ejemplo solo sustituciones en comparacion con la secuencia de referencia. Las sustituciones corresponden preferiblemente a sustituciones conservativas como se indica en la tabla siguiente.

Como se usa en la presente memoria polipeptido, un “fragmento” hace referencia a un polipeptido biologicamente activo que es mas corto que un polipeptido de referencia (concretamente, un fragmento del polipeptido de IL-34). Por tanto, el polipeptido segun la presente divulgacion engloba polipeptidos que comprenden o consisten en fragmentos de IL-34, a condicion de que los fragmentos sean biologicamente activos.

En el marco de la presente divulgacion, el fragmento biologicamente activo puede comprender por ejemplo al menos 175, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235 o 240 aminoacidos consecutivos del polipeptido de IL-34.

Se entiende por “actividad biologica” de IL-34 o un equivalente funcional del mismo:

(i) la capacidad de inducir y/o mantener (al menos 120 dfas en rata) la tolerancia inmunitaria (como se describe en la Seccion de Ejemplos; concretamente la capacidad de inhibir la proliferacion de linfocitos T CD4+ y CD8+ en una reaccion de linfocitos mixtos (MLR); y/o

(ii) la capacidad de prevenir el rechazo de trasplante en un modelo de alotrasplante de organo (modelo de alotrasplante cardiaco).

El especialista en la materia puede determinar facilmente si un equivalente funcional del polipeptido de IL-34 es biologicamente activo. Para comprobar si los polipeptidos recien generados inhiben la proliferacion de linfocitos T CD4+ en una MLR y/o previenen el rechazo de trasplante en un modelo de alotrasplante de organo, puede efectuarse un analisis FACS o un analisis de perfil de expresion genica de celula unica (vease en la seccion de Ejemplos) para cada polipeptido. Ademas, para comprobar si los polipeptidos recien generados previenen el rechazo de trasplante, puede usarse un modelo de alotrasplante de organo (vease en la seccion de Ejemplos). Adicionalmente, el curso temporal y la respuesta a la dosis efectuados in vitro o in vivo (p. ej., usando un modelo de alotrasplante de organo) determinaran las condiciones optimas para cada polipeptido.

En una realizacion, los polipeptidos de la presente divulgacion pueden comprender un marcaje. Un marcaje es una secuencia que contiene epftopo que puede ser util para la purificacion de los polipeptidos. Se enlaza mediante una variedad de tecnicas tales como cromatograffa de afinidad, para la localizacion de dicho polipeptido en una muestra de celula o tejido usando tecnicas de inmunomarcaje, la deteccion de dicho polipeptido por inmunotransferencia, etc. Los ejemplos de marcajes empleados comunmente en la materia son el marcaje GST (glutation-S-transferasa), el marcaje FLAG™, el marcaje Strep™, marcaje V5, marcaje myc, marcaje His (que consiste tipicamente en seis residuos de histidina), etc.

En otra realizacion, los polipeptidos de la presente divulgacion pueden comprender modificaciones qmmicas que mejoran su estabilidad y/o su biodisponibilidad. Tales modificaciones qmmicas apuntan a obtener polipeptidos con una proteccion aumentada de los polipeptidos frente a degradacion enzimatica in vivo, y/o una capacidad aumentada de cruzar barreras de membrana, aumentando por tanto su semivida y manteniendo o mejorando su actividad biologica. Puede emplearse cualquier modificacion qmmica conocida en la materia segun la presente divulgacion. Tales modificaciones qmmicas incluyen, pero sin limitacion:

- Un reemplazo o reemplazos de un aminoacido por un aminoacido modificado y/o inhabitual, p. ej. un reemplazo de un aminoacido por un aminoacido inhabitual como Nle, Nva u Om; y/o

- modificaciones en los extremos N-terminal y/o C-terminal de los peptidos tales como, p. ej., acilacion (preferiblemente acetilacion) o desaminacion N-terminal, o modificacion del grupo carboxilo C-terminal a un grupo amida o alcohol;

- modificaciones en el enlace amida entre dos aminoacidos: acilacion (preferiblemente acetilacion) o alquilacion (preferiblemente metilacion) en el atomo de nitrogeno o el carbono alfa del enlace amida que liga dos aminoacidos;

- modificaciones en el carbono alfa del enlace amida que liga dos aminoacidos tales como, p. ej., acilacion (preferiblemente acetilacion) o alquilacion (preferiblemente metilacion) en el carbono alfa del enlace amida que liga dos aminoacidos;

- cambios de quiralidad tales como, p. ej., reemplazo de uno o mas aminoacidos de origen natural (enantiomero L) por los correspondientes enantiomeros D;

- retroinversiones en que se reemplazan uno o mas aminoacidos de origen natural (enantiomero L) por los correspondientes enantiomeros D, junto con inversion de la cadena aminoaddica (del extremo C-terminal al extremo N-terminal);

- azapeptidos, en que se reemplaza uno o mas de los carbonos alfa por atomos de nitrogeno; y/o

- betapeptidos, en que se une el grupo amino de uno o mas aminoacidos al carbono p en lugar de al carbono a.

Otra estrategia para mejorar la viabilidad del farmaco es la utilizacion de polfmeros hidrosolubles. Se ha mostrado que diversos polfmeros hidrosolubles modifican la biodistribucion, mejoran el modo de captacion celular, cambian la permeabilidad a traves de barreras fisiologicas y modifican la tasa de aclaramiento del cuerpo. Para conseguir un efecto diana o bien de liberacion mantenida, se han sintetizado polfmeros hidrosolubles que contienen restos farmacologicos como grupos terminales, como parte del esqueleto o como grupos pendientes en la cadena polimerica.

El polietilenglicol (PEG) se ha usado ampliamente como portador farmacologico, dado su alto grado de biocompatibilidad y facilidad de modificacion. Se ha mostrado que el enlazamiento con diversos farmacos, protemas y liposomas mejora el tiempo de residencia y disminuye la toxicidad. El PEG puede acoplarse con agentes activos a traves de los grupos hidroxilo en los extremos de la cadena y a traves de otros metodos qmmicos; sin embargo, el PEG mismo esta limitado a como maximo dos agentes activos por molecula. En un enfoque diferente, se exploraron copolfmeros de PEG y aminoacidos como biomateriales novedosos que retendnan las propiedades de biocompatibilidad del PEG, pero que tendnan la ventaja anadida de numerosos puntos de enlace por molecula (proporcionando mayor carga de farmaco) y que podnan disenarse sinteticamente para adecuarse a una variedad de aplicaciones.

Los especialistas en la materia son conocedores de las tecnicas de PEGilacion para la modificacion eficaz de farmacos. Por ejemplo, se han usado polfmeros de suministro de farmaco que consisten en polfmeros alternados de PEG y monomeros trifuncionales tales como lisina por VectraMed (Plainsboro, N.J.). Las cadenas de PEG (tfpicamente de 2000 daltones o menos) estan ligadas a los grupos amino a y e de la lisina a traves de grupos de enlace de uretano estables. Tales copolfmeros retienen las propiedades deseables del PEG, mientras que proporcionan grupos pendientes reactivos (los grupos acido carboxflico de lisina) a intervalos estrictamente controlados y predeterminados a lo largo de la cadena polimerica. Los grupos pendientes reactivos pueden usarse para derivatizacion, reticulacion o conjugacion con otras moleculas. Estos polfmeros son utiles en la produccion de profarmacos estables de larga circulacion al variar el peso molecular del polfmero, el peso molecular de los segmentos de PEG y el grupo de enlace escindible entre el farmaco y el polfmero. El peso molecular de los segmentos de PEG afecta al espaciado del complejo de farmaco/grupo de enlace y a la cantidad de farmaco por peso molecular de conjugado (los fragmentos de PEG menores proporcionan mayor carga de farmaco). En general, aumentar el peso molecular global del conjugado de copolfmero de bloque aumentara la semivida circulatoria del conjugado. No obstante, el conjugado debe ser facilmente degradable o bien tener un peso molecular por debajo de la filtracion glomerular limitante de umbral (p. ej., menor de 60 kDa).

Ademas de ser importante el esqueleto polimerico en el mantenimiento de la semivida circulatoria y la biodistribucion, pueden usarse ligadores para mantener el agente terapeutico en forma de profarmaco hasta que se libera del polfmero del esqueleto por un desencadenante espedfico, tfpicamente actividad enzimatica en el tejido diana. Por ejemplo, este tipo de suministro de farmaco activado por tejido es particularmente util cuando se requiere el suministro a un sitio espedfico de biodistribucion y el agente terapeutico se libera en o cerca del sitio de patologfa. Las colecciones de grupo ligador para uso en el suministro de farmaco activado son conocidas por los especialistas en la materia y pueden estar basadas en la cinetica enzimatica, la prevalencia de la enzima activa y la especificidad de escision de las enzimas espedficas de enfermedad seleccionadas. Tales ligadores pueden usarse en la modificacion de los polipeptidos descritos en la presente memoria para suministro terapeutico.

En aun otra realizacion, los polipeptidos de la presente divulgacion pueden fusionarse con un polipeptido heterologo (concretamente, polipeptido derivado de una protema no relacionada, por ejemplo de una protema inmunoglobulina).

Como se usa en la presente memoria, los terminos “fusionado” y “fusion” se usan intercambiablemente. Estos terminos hacen referencia a la union conjunta de dos elementos o componentes mas por cualquier medio, incluyendo conjugacion qrnmica o medios recombinantes. Una “fusion en marco” hace referencia a la union de dos o mas marcos abiertos de lectura (ORF) de polinucleotidos para formar un ORF mas largo continuo de manera que se mantenga el marco de lectura traduccional correcto de los ORF originales. Por ejemplo, una protema de fusion recombinante puede ser una protema unica que contiene dos o mas segmentos que corresponden a los polipeptidos codificados por los ORF originales (cuyos segmentos no estan normalmente unidos asf en la naturaleza). Aunque el marco de lectura se hace por tanto continuo a lo largo de los segmentos fusionados, los segmentos pueden estar ffsica o espacialmente separados, por ejemplo, por una secuencia ligadora en marco.

Como se usa en la presente memoria, “protema de fusion de IL-34” hace referencia a un polipeptido que comprende el polipeptido de IL-34 o un equivalente funcional del mismo fusionado con un polipeptido heterologo. La protema de fusion de IL-34 compartira generalmente al menos una propiedad biologica en comun con el polipeptido de IL-34 (como se describe anteriormente).

Es un ejemplo de una protema de fusion de IL-34 una inmunoadhesina de IL-34.

Como se usa en la presente memoria, el termino “inmunoadhesina” designa moleculas de tipo anticuerpo que combinan la especificidad de union de una protema heterologa (una “adhesina”) con las funciones efectoras de dominios constantes de inmunoglobulina. Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden una fusion de una secuencia aminoaddica con la especificidad de union deseada que es distinta del sitio de reconocimiento y union a antfgeno de un anticuerpo (concretamente, es “heterologa”) y una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina. La parte de adhesina de una molecula de inmunoadhesina es tfpicamente una secuencia aminoaddica contigua que comprende al menos el sitio de union de un receptor o un ligando. La secuencia de dominio constante de inmunoglobulina en la inmunoadhesina puede obtenerse a partir de cualquier inmunoglobulina, tal como los subtipos IgG-1, IgG-2, IgG-3 o IgG-4, IgA (incluyendo IgA-1 e IgA-2), IgE, IgD o IgM.

La secuencia de inmunoglobulina preferible, pero no necesariamente, es un dominio constante de inmunoglobulina (region Fc). Las inmunoadhesinas pueden poseer muchas de las propiedades qmmicas y biologicas valiosas de los anticuerpos humanos. Puesto que las inmunoadhesinas pueden construirse a partir de una secuencia de protema humana con una especificidad deseada ligada con una secuencia de bisagra y dominio constante (Fc) de inmunoglobulina humana apropiada, puede conseguirse la especificidad de union de interes usando componentes enteramente humanos. Tales inmunoadhesinas son mmimamente inmunogenicas para el paciente, y son seguras para uso cronico o repetido. En una realizacion, la region Fc es una region Fc de secuencia nativa. En otra realizacion, la region Fc es una region Fc variante. En aun otra realizacion, la region Fc es una region Fc funcional. La porcion de secuencia de IL-34 y la porcion de secuencia de inmunoglobulina de la inmunoadhesina de IL-34 pueden ligarse por un ligador mmimo. La secuencia de inmunoglobulina preferible, pero no necesariamente, es un dominio constante de inmunoglobulina. El resto de inmunoglobulina en las quimeras de la presente divulgacion puede obtenerse de los subtipos IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, IgA, IgE, IgD o IgM, pero preferiblemente IgG1 o IgG3.

Como se usa en la presente memoria, “region Fc” se usa para definir una region C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina, incluyendo regiones Fc de secuencia nativa y regiones Fc variantes. Aunque los lfmites de la region Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina podnan variar, la region Fc de cadena pesada de IgG humana se define habitualmente para abarcar del residuo aminoaddico en posicion Cys226, o Pro230, al extremo carboxilo de la misma.

Es otro ejemplo de una protema de fusion de IL-34 una fusion del polipeptido de IL-34 con anticuerpos de dominio de union a seroalbumina humana (AlbudAb) segun la plataforma de tecnologfa AlbudAb™ como se describe en Konterman et al. 2012 AlbudAb™ Technology Platform-Versatile Albumin Binding Domains for the Development of Therapeutics with Tunable Half-Lives.

En otra realizacion, los polipeptidos de la presente divulgacion pueden combinarse/formularse con un sistema de suministro de farmaco adecuado para protemas terapeuticas.

Los ejemplos de tales sistemas de suministro de farmaco que pueden usarse incluyen diversos microportadores asf como nanoportadores como microesferas/micropartfculas, liposomas, nanopartmulas, dendnmeros, niosomas y nanotubos de carbono para el suministro orientado de protemas terapeuticas. En una realizacion particular, tal sistema de suministro de farmaco es un sistema de suministro de farmaco adecuado para el suministro de farmaco mediado por celulas, en particular suministro de farmaco mediado por monocitos y/o macrofagos como se divulga en Jain et al., 2013 (42).

Como alternativa, los polipeptidos de la presente divulgacion pueden encapsularse en globulos rojos o eritrocitos. Se han descrito diversos metodos para permitir la incorporacion de ingredientes activos a globulos rojos, incluyendo el metodo descrito en la solicitud Ep 1773452, que es el metodo que ofrece actualmente el mejor desempeno y tiene la ventaja de ser reproducible y de mejorar el rendimiento de encapsulacion del ingrediente activo.

Los polipeptidos de la presente divulgacion pueden producirse mediante cualquier medio adecuado, como resultara evidente para los especialistas en la materia. Para producir suficientes cantidades de IL-34 para uso de acuerdo con la presente divulgacion, puede conseguirse convenientemente la expresion cultivando en condiciones apropiadas celulas hospedadoras recombinantes que contienen el polipeptido de la presente divulgacion. Preferiblemente, el polipeptido se produce por medios recombinantes, por expresion a partir de una molecula de acido nucleico codificante. Son bien conocidos los sistemas para a clonacion y expresion de un polipeptido en una variedad de diferentes celulas hospedadoras.

Cuando se expresa en forma recombinante, el polipeptido se genera preferiblemente por expresion de un acido nucleico codificante en una celula hospedadora. Puede usarse cualquier celula hospedadora, dependiendo de los requisitos individuales de un sistema particular. Las celulas hospedadoras adecuadas incluyen bacterias, celulas de mairnfero, celulas de planta, levadura y sistemas de baculovirus. Las estirpes celulares de mairnfero disponibles en la materia para expresion de un polipeptido heterologo incluyen celulas de ovario de hamster chino, celulas HeLa, celulas de rinon de hamster neonato y muchas otras. Las bacterias son tambien hospedadores preferidos para la produccion de protema recombinante, debido a la facilidad con que las bacterias pueden manipularse y crecer. Es un hospedador bacteriano comun preferido E coli.

Ademas, debena senalarse que la mayona de los productos biofarmaceuticos basados en protema ostentan alguna forma de modificacion postraduccional que puede afectar profundamente las propiedades de la protema relevantes para su aplicacion terapeutica. La glicosilacion de protema representa la modificacion mas comun (aproximadamente un 50 % de las protemas humanas estan glicosiladas). La glicosilacion puede introducir una considerable heterogeneidad en una composicion de protema mediante la generacion de diferentes estructuras de glicano en las protemas de la composicion. Tales estructuras de glicano se elaboran mediante la accion de diversas enzimas de la maquinaria de glicosilacion a medida que la glicoprotema circula por el retmulo endoplasmico (RE) y el complejo de Golgi (cascada de glicosilacion). La naturaleza de la estructura o estructuras de glicano de una protema tiene impacto sobre el plegamiento, estabilidad, vida util, trafico, farmacodinamica, farmacocinetica e inmunogenicidad de la protema. La estructura de glicano tiene un gran impacto sobre la actividad funcional primaria de la protema. La glicosilacion puede afectar la estructura local de la protema y puede ayudar a dirigir el plegamiento de la cadena polipeptidica. Una clase importante de estructuras de glicano son los llamados N-glicanos. Se generan por enlazamiento covalente de un oligosacarido con el grupo amino (N) de residuos de asparagina en la secuencia de consenso NXS/T de la cadena polipeptidica naciente. Los N-glicanos pueden participar ademas en la clasificacion o direccionamiento de una protema a su diana final: el N-glicano de un anticuerpo, por ejemplo, puede interaccionar con componentes complementarios. Los N-glicanos sirven tambien para estabilizar una glicoprotema, por ejemplo potenciando su solubilidad, apantallando los parches hidrofobos sobre su superficie, protegiendo de proteolisis y dirigiendo interacciones estabilizantes intracatenarias. La glicosilacion puede regular la semivida de protemas, por ejemplo, en seres humanos la presencia de acidos sialicos terminales en N-glicanos puede aumentar la semivida de protemas circulantes en la corriente sangumea.

Como se usa en la presente memoria, el termino “glicoprotema” hace referencia a cualquier protema que tenga uno o mas N-glicanos enlazados con la misma. Por tanto, el termino hace referencia tanto a protemas que se reconocen generalmente en la materia como una glicoprotema como a protemas que se han genomanipulado para contener uno o mas sitios de glicosilacion N-ligados. Como se usa en la presente memoria, los terminos “N-glicano” y “glicoforma” se usan intercambiablemente y hacen referencia a un oligosacarido N-ligado, por ejemplo aquel que esta enlazado por un grupo de enlace asparagina-N-acetilglucosamina con un residuo de asparagina de un polipeptido. Las glicoprotemas N-ligadas contienen un residuo de N-acetilglucosamina ligado al nitrogeno de amida de un residuo de asparagina de la protema. Los azucares predominantes encontrados en glicoprotemas son glucosa, galactosa, manosa, fucosa, N-acetilgalactosamina (GalNAc), N-acetilglucosamina (GlcNAc) y acido sialico (p. ej., acido N-acetilneurammico (NANA)). El procesamiento de los grupos de azucar aparece cotraduccionalmente en el lumen del RE y continua postraduccionalmente en el aparato de Golgi para glicoprotemas N-ligadas.

Una serie de levaduras, por ejemplo Pichia pastoris, Yarrowia lipolWca y Saccharomyces cerevisiae, estan ultimamente en desarrollo para usar las ventajas de tales sistemas pero eliminando las desventajas con respecto a la glicosilacion. Varias cepas estan en desarrollo genetico para producir estructuras de glicano de tipo humano definidas en una protema. Los metodos para genomanipular levadura para producir N-glicanos de tipo humano se describen en las patentes de EE. UU. n°. 7.029.872 y 7.449.308 junto con los metodos descritos en las solicitudes publicadas de EE. UU. n° 20040230042, 20050208617, 20040171826, 20050208617 y 20060286637. Estos metodos se han usado para construir levaduras recombinantes que pueden producir glicoprotemas terapeuticas que tienen N-glicanos predominantemente complejos de tipo humano o Imbridos en las mismas en lugar de N-glicanos de tipo levadura. Como se describe anteriormente, la glicosilacion de tipo humano se caracteriza principalmente por estructuras de N-glicano “complejas” que contienen N-acetilglucosamina, galactosa, fucosa y/o acido N-acetineurammico. Por tanto, se han genomanipulado varias cepas de levaduras para producir glicoprotemas que comprenden uno o mas N-glicanos complejos de tipo humano o hforidos de tipo humano tales como GlcNAcMan3GlcNAc2.

Como alternativa, puede usarse un acido nucleico que codifica un polipeptido de la presente divulgacion (tal como el polipeptido de IL-34 como se muestra en la SEQ ID NO: 1) o un vector que comprende tal acido nucleico o una celula hospedadora que comprende tal vector.

Por consiguiente, otro aspecto de la presente divulgacion se refiere a un acido nucleico que codifica una secuencia aminoaddica que comprende la SEQ ID NO: 1 como se describe aqrn anteriormente, o un vector que comprende dicho acido nucleico o una celula hospedadora que comprende tal vector, para uso en la induccion y/o el mantenimiento de la tolerancia inmunitaria en un paciente necesitado de ello.

Otro aspecto de la presente divulgacion se refiere a un acido nucleico que codifica una secuencia aminoaddica que comprende la SEQ ID NO: 1 como se describe aqrn anteriormente, o un vector que comprende dicho acido nucleico o una celula hospedadora que comprende tal vector, para uso en la prevencion o reduccion del rechazo de trasplante en un paciente necesitado de ello.

Aun otro aspecto de la presente divulgacion se refiere a un acido nucleico que codifica una secuencia aminoaddica que comprende la SEQ ID NO: 1 como se describe aqrn anteriormente, o un vector que comprende tal acido nucleico o una celula hospedadora que comprende tal vector, para uso en la prevencion o el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias, respuestas aloinmunitarias y alergias en un paciente de las mismas.

Los acidos nucleicos de la presente divulgacion pueden producirse mediante cualquier tecnica conocida en sf en la materia, tal como, sin limitacion, cualquier tecnica qrnmica, biologica, genetica o enzimatica, sola o en combinacion o combinaciones.

En su sentido mas amplio, un “vector” es cualquier vehmulo capaz de facilitar la transferencia de un acido nucleico a las celulas. Preferiblemente, el vector transporta el acido nucleico a celulas con degradacion reducida respecto a la extension de la degradacion que resultana en ausencia del vector. En general, los vectores utiles en la presente divulgacion incluyen, pero sin limitacion, plasmidos, fagemidos, virus y otros vehmulos derivados de fuentes vmcas o bacterianas que se han manipulado mediante la insercion o incorporacion de secuencias del acido nucleico de interes. Los vectores vmcos son un tipo preferido de vector e incluyen, pero sin limitacion, secuencias de acido nucleico de los siguientes virus: retrovirus tales como virus de leucemia de murino Moloney, virus de sarcoma de murino Harvey, virus de tumor mamario de murino y virus de sarcoma de Roux; adenovirus, virus adenoasociados; virus de tipo SV40; poliomavirus; virus de Epstein-Barr; papilomavirus; herpesvirus; virus vaccinia; poliovirus y virus de ARN tales como un retrovirus. Pueden emplearse facilmente otros vectores no nombrados pero conocidos en la materia.

Los vectores vmcos preferidos estan basados en virus eucarioticos no citopaticos en que se han reemplazado genes no esenciales por el gen de interes. Los virus no citopaticos incluyen retrovirus (p. ej., lentivirus), cuyo ciclo vital implica la transcripcion inversa de ARN vmco genomico a ADN con posterior integracion provmca en ADN celular del hospedador. Los retrovirus se han aprobado para ensayos de terapia genica humana. Los mas utiles son aquellos retrovirus que son deficientes de replicacion (concretamente, capaces de dirigir la smtesis de las protemas deseadas, pero incapaces de fabricar una partmula infecciosa). Tales vectores de expresion retrovmcos geneticamente alterados tienen utilidad general para la transduccion de alta eficacia de genes in vivo. Se proporcionan protocolos estandares para producir retrovirus deficientes de replicacion (incluyendo las etapas de incorporacion de material genetico exogeno a un plasmido, transfeccion de una estirpe celular de empaquetamiento con plasmido, produccion de retrovirus recombinantes por la estirpe celular de empaquetamiento, recogida de partmulas vmcas de medios de cultivo de tejido e infeccion de las celulas diana con partmulas vmcas) en KRIEGLER (A Laboratory Manual," W.H. Freeman C.O., Nueva York, 1990) y en MURRY ("Methods in Molecular Biology," vol.7, Humana Press, Inc., Cliffton, N.J., 1991).

Son virus preferidos para ciertas aplicaciones los adenovirus y virus adenoasociados, que son virus de ADN bicatenario que se han aprobado ya para uso humano en terapia genica. Los virus adenoasociados pueden genomanipularse para ser deficientes de replicacion y ser capaces de infectar un amplio intervalo de tipos celulares y especies. Tiene ademas ventajas tales como estabilidad termica y en disolventes lipfdicos; altas frecuencias de transduccion en celulas de diversos linajes, incluyendo celulas hematopoyeticas y falta de inhibicion de superinfeccion, permitiendo asf series multiples de transducciones. Aparentemente, el virus adenoasociado puede integrarse en ADN celular humano de manera espedfica de sitio, minimizando asf la posibilidad de mutagenesis de insercion y la variabilidad de la caractenstica de expresion genica insertada de infeccion retrovmca. Ademas, las infecciones con virus adenoasociados de tipo silvestre se han seguido en cultivo de tejido durante mas de 100 pases en ausencia de presion selectiva, implicando que la integravion genomica de virus adenoasociado es un evento relativamente estable. El virus adenoasociado puede funcionar tambien de forma extracromosomica.

Otros vectores incluyen vectores de plasmido. Los vectores de plasmido se han descrito extensamente en la materia y son bien conocidos por los especialistas en la materia. Vease, p. ej. SANBROOK et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," segunda edicion, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. En los ultimos anos, se han usado vectores de plasmido como vacunas de ADN para suministrar genes que codifican antfgeno a celulas in vivo. Son particularmente ventajosos para esto debido a que no tienen los mismos problemas de seguridad que con muchos de los vectores vmcos. Estos plasmidos, sin embargo, al tener un promotor compatible con la celula hospedadora, pueden expresar un peptido a partir de un gen codificado operativamente en el plasmido. Algunos plasmidos usados comunmente incluyen pBR322, pUC18, pUC19, pRC/cMv, SV40 y pBlueScript. Otros plasmidos son bien conocidos por los especialistas en la materia. Adicionalmente, los plasmidos pueden disenarse a medida usando enzimas de restriccion y reacciones de ligacion para retirar y anadir fragmentos espedficos de ADN. Los plasmidos pueden suministrarse por una variedad de vfas parenteral, mucosa y topica. Por ejemplo, el plasmido de ADN puede inyectarse por via intramuscular, intradermica, subcutanea u otras. Puede administrarse tambien por pulverizadores o gotas intranasales, supositorio rectal y por via oral. Puede administrarse tambien a la epidermis o una superficie mucosa usando una pistola genica. Los plasmidos pueden darse en solucion acuosa, secados sobre partmulas de oro o en asociacion con otro sistema de suministro de ADN incluyendo, pero sin limitacion, liposomas, dendnmeros y microencapsulacion.

Segun la presente divulgacion, son ejemplos de celulas hospedadoras que pueden usarse los monocitos o macrofagos humanos (particularmente aquellos obtenidos de los sujetos para tratar).

Los medios por los que el vector portador del gen puede introducirse en las celulas incluyen, pero sin limitacion, microinyeccion, electroporacion, transduccion o transfeccion usando DEAE-dextrano, lipofeccion, fosfato de calcio u otros procedimientos conocidos por un especialista en la materia.

Composiciones farmaceuticas:

La presente divulgacion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende un polipeptido de IL-34 aislado o un polinucleotido que codifica el mismo.

La presente divulgacion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende un polipeptido de IL-34 aislado o un polinucleotido que codifica el mismo y un farmaco inmunosupresor.

La presente divulgacion se refiere tambien a una composicion farmaceutica que comprende un polipeptido como se define en la presente memoria (o un acido nucleico que codifica el mismo, un vector de expresion o una celula hospedadora como se define anteriormente) y un farmaco inmunosupresor para uso en la induccion y/o mantenimiento de tolerancia inmunitaria en un paciente necesitado de ello.

La presente divulgacion se refiere ademas a una composicion farmaceutica que comprende un polipeptido como se define en la presente memoria (o un acido nucleico que codifica el mismo, un vector de expresion o una celula hospedadora como se define anteriormente) y un farmaco inmunosupresor para uso en la prevencion o reduccion del rechazo de trasplante en un paciente necesitado de ello.

La presente divulgacion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende un polipeptido como se define en la presente memoria (o un acido nucleico que codifica el mismo, un vector de expresion o una celula hospedadora como se define anteriormente) y un farmaco inmunosupresor para uso en un paciente necesitado de ello.

Las composiciones farmaceuticas que comprenden un polipeptido de la presente divulgacion incluyen todas las composiciones en las que el polipeptido esta contenido en una cantidad eficaz para conseguir el fin pretendido. Ademas, las composiciones farmaceuticas pueden contener portadores fisiologicamente aceptables adecuados que comprenden excipientes y auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos a preparaciones que pueden usarse farmaceuticamente.

El termino “portador fisiologicamente aceptable” pretende englobar cualquier portador que no interfiera con la eficacia de la actividad biologica del ingrediente activo y que no sea toxico para el hospedador al que se administra. Los portadores fisiologicamente aceptables adecuados son bien conocidos en la materia y se describen, por ejemplo, en Pharmaceutical Sciences de Remington (Mack Publishing Company, Easton, EE. UU., 1985), que es un texto de referencia estandar en este campo. Por ejemplo, para administracion parenteral, los ingredientes activos anteriores pueden formularse en forma de dosificacion unitaria para inyeccion en vehuculos tales como solucion salina, solucion de dextrosa, seroalbumina y solucion de Ringer.

Aparte del portador fisiologicamente aceptable, las composiciones farmaceuticas de la presente divulgacion pueden comprender tambien cantidades menores de aditivos tales como estabilizadores, excipientes, tampones y conservantes. La composicion farmaceutica de la presente divulgacion puede comprender ademas un farmaco inmunosupresor.

En una realizacion, el farmaco inmunosupresor se selecciona del grupo consistente en cistostaticos tales como inhibidores de la diana de rapamicina de mairnfero (mTOR) y rapamicina (sirolimus); agentes alquilantes (ciclofosfamida) y antimetabolitos (azatioprina, mercaptopurina y metotrexato); anticuerpos terapeuticos (tales como anticuerpos monoclonales anti-CD40L, anticuerpos monoclonales anti-IL-2R, anticuerpos monoclonales anti-CD3, globulina antilinfocftica (GAL) y globulina antitimocftica (GAT)); inhibidores de calcineurina (ciclosporina); glucocorticoides y micofenolato de mofetilo.

En una realizacion, el farmaco inmunosupresor es rapamicina (sirolimus).

Los polipeptidos de la presente divulgacion pueden administrarse mediante cualquier medio que consiga el fin pretendido. Por ejemplo, la administracion puede conseguirse mediante una serie de diferentes vfas incluyendo, pero sin limitacion, uso subcutaneo, intravenoso, intradermico, intramuscular, intraperitoneal, intracerebral, intratecal, intranasal, oral, rectal, transdermico, bucal, topico, local, inhalativo o subcutaneo. Se prefieren particularmente las vfas parenteral y topica,

Las dosificaciones para administrar dependen de las necesidades del individuo, del efecto deseado y de la via de administracion elegida. Se entiende que la dosificacion administrada dependera de la edad, sexo, salud y peso del receptor, del tratamiento concurrente, si lo hubiera, de la frecuencia de tratamiento y de la naturaleza del efecto deseado. La dosis total requerida para cada tratamiento puede administrarse por multiples dosis o en una dosis unica.

Las dosis usadas para la administracion pueden adaptarse en funcion de diversos parametros, y en particular en funcion del modo de administracion usado, de la patologfa relevante o, como alternativa, de la duracion deseada del tratamiento. Por ejemplo, esta dentro de las habilidades de la materia empezar con dosis de los compuestos a niveles menores de los requeridos para conseguir el efecto terapeutico deseado y aumentar gradualmente la dosificacion hasta que se consigue el efecto deseado. Sin embargo, la dosificacion diaria de los polipeptidos puede variar en un amplio intervalo de 0,01 a 1.000 mg por adulto al dfa. Preferiblemente, las composiciones contienen 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0, 50,0, 100, 250 y 500 mg del ingrediente activo para el ajuste sintomatico de la dosificacion al sujeto para tratar. Un medicamento contiene tfpicamente de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 500 mg del ingrediente activo, preferiblemente de 1 mg a aproximadamente 100 mg del ingrediente activo. Se suministra normalmente una cantidad eficaz del farmaco a un nivel de dosificacion de 0,0002 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal al dfa, especialmente de aproximadamente 0,001 mg/kg a 10 mg/kg de peso corporal al dfa.

En una realizacion, se administra el farmaco inmunosupresor al paciente necesitado de ello a una dosis disminuida (comparativamente a la dosis administrada habitualmente).

En una realizacion, se administra el farmaco inmunosupresor al paciente necesitado de ello a una dosis suboptima.

En una realizacion particular, se administra rapamicina (sirolimus) al paciente necesitado de ello a una dosis suboptima.

En un aspecto, la presente divulgacion se refiere a un metodo para inducir y/o mantener la tolerancia inmunitaria en un paciente necesitado de ello, que comprende una etapa de administracion a dicho paciente de una cantidad terapeuticamente eficaz de un polipeptido de IL-34 o un polinucleotido que codifica el mismo.

En una realizacion, el metodo para inducir y/o mantener la tolerancia inmunitaria en un paciente necesitado de ello comprende una etapa de administracion a dicho paciente una cantidad terapeuticamente eficaz de un polipeptido de IL-34 o un polinucleotido que codifica el mismo y una cantidad terapeuticamente eficaz de un agente inmunosupresor.

En otro aspecto, la presente divulgacion se refiere a un metodo para prevenir o reducir el rechazo de trasplante en un paciente necesitado de ello, que comprende una etapa de administracion a dicho paciente de una cantidad terapeuticamente eficaz de un polipeptido de IL-34 o un polinucleotido que codifica el mismo simultanea y/o posteriormente al trasplante.

En una realizacion, el metodo para prevenir o reducir el rechazo de trasplante en un paciente necesitado de ello comprende una etapa de administracion a dicho paciente de una cantidad terapeuticamente eficaz de un polipeptido de IL-34 o un polinucleotido del mismo y de una cantidad terapeuticamente eficaz de un agente inmunosupresor simultanea y/o posteriormente al trasplante.

Como se usa en la presente memoria, el termino “simultaneamente” significa que el polipeptido de interes se administra al paciente receptor el mismo dfa que el trasplante.

Como se usa en la presente memoria, “posteriormente” significa que el polipeptido de interes se administra al paciente receptor despues del trasplante, por ejemplo 2, 3, 4, 5, 6 o 7 dfas despues del trasplante.

En aun otro aspecto, la presente divulgacion se refiere a un metodo para prevenir o tratar enfermedades autoinmunitarias, respuestas inmunitarias indeseadas o anti-protemas terapeuticas y alergias en un paciente necesitado de ello, que comprende una etapa de administracion a dicho paciente de una cantidad terapeuticamente eficaz de un polipeptido de lL-34 o un polinucleotido que codifica el mismo.

Se entiende por “cantidad terapeuticamente eficaz” una cantidad suficiente para conseguir una concentracion de polipeptido que sea capaz de prevenir, tratar o retardar la enfermedad para tratar. Tales concentraciones pueden determinarse rutinariamente por los especialistas en la materia. La cantidad de polipeptido administrada realmente se determinara tipicamente por un medico o un veterinario a la vista de las circunstancias relevantes, incluyendo la afeccion para tratar, la via de administracion elegida, el compuesto real administrado, la edad, peso y respuesta del paciente, la gravedad de los smtomas del sujeto y similares. Se apreciara tambien por los especialistas en la materia que la dosificacion puede ser dependiente de la estabilidad del polipeptido administrado.

En una realizacion, el tratamiento con un polipeptido de IL-34 se administra en mas de un ciclo, concretamente la administracion de un polipeptido de IL-34 se repite al menos una vez.

Por ejemplo, pueden administrarse 2 a 10 ciclos o incluso mas, dependiendo del estado y respuesta del paciente espedficos. Los intervalos, concretamente el tiempo entre el inicio de dos ciclos consecutivos, son tfpicamente de varios dfas.

Composiciones de kit de piezas:

El polipeptido de IL-34 puede combinarse en una formulacion y administrarse simultaneamente,

El polipeptido de IL-34 y el farmaco inmunosupresor pueden combinarse en una formulacion y administrarse simultaneamente. Sin embargo, pueden administrarse tambien separadamente, usando composiciones separadas. Se senala ademas que pueden administrarse en diferentes momentos.

La presente divulgacion se refiere tambien a una composicion de kit de piezas que comprende un polipeptido de IL-34 aislado o un polinucleotido que codifica el mismo y un farmaco inmunosupresor para uso en la induccion y/o mantenimiento de tolerancia inmunitaria en un paciente necesitado de ello.

La presente divulgacion se refiere ademas a una composicion de kit de piezas que comprende un polipeptido de IL-34 aislado o un polinucleotido que codifica el mismo y un farmaco inmunosupresor para uso en la prevencion o el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias, respuestas aloinmunitarias y alergias en un paciente necesitado de ello.

Los terminos “kit”, “producto” o la expresion “preparacion combinada”, como se usan en la presente memoria, definen especialmente un “kit de piezas” en el sentido de que los copartfcipes de combinacion como se definen anteriormente pueden dosificarse independientemente o mediante el uso de diferentes combinaciones fijas con cantidades distintas de los copartfcipes de combinacion, concretamente simultaneamente o en diferentes puntos temporales. Las piezas del kit de piezas pueden administrarse entonces, p. ej., simultaneamente o escalonadas cronologicamente, es decir en diferentes puntos temporales y con intervalos temporales iguales o diferentes para cualquier pieza del kit de piezas. La relacion de cantidades totales de los copartfcipes de combinacion para administrar en la preparacion combinada puede variar. Los copartfcipes de combinacion pueden administrarse por la misma via o por diferentes vfas. Cuando la administracion es secuencial, el primer copartfcipe puede administrarse por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 dfas antes del segundo copartfcipe.

Metodos de pronostico:

En un aspecto adicional, la presente divulgacion se refiere a un metodo in vitro para determinar si un paciente esta en riesgo de rechazo de trasplante, enfermedades autoinmunitarias, respuesta inmunitaria indeseada contra protemas terapeuticas o alergias, que comprende una etapa de determinacion del nivel de expresion de IL-34 en una muestra biologica obtenida de dicho paciente, en el que la presencia de IL-34 es indicativa de un riesgo reducido de rechazo de trasplante, enfermedades autoinmunitarias, respuesta inmunitaria indeseada contra protemas terapeuticas o alergias.

Como se usa en la presente memoria, el termino “riesgo” hace referencia a la probabilidad de que aparezca un evento durante un periodo de tiempo espedfico, tal como el inicio de rechazo de trasplante, y puede significar un riesgo “absoluto” o riesgo “relativo” del sujeto. El riesgo absoluto puede medirse con referencia a la observacion real despues de la medida de la cohorte temporal relevante, o con referencia a valores de mdice desarrollados a partir de cohortes historicas estadfsticamente validas que se han seguido durante el periodo de tiempo relevante. El riesgo relativo hace referencia a la relacion de riesgos absolutos de un paciente en comparacion con los riesgos absolutos de cohortes de bajo riesgo o el riesgo de poblacion media, que pueden variar segun como se valoren los factores de riesgo clmico. Se usan tambien comunmente los cocientes de posibilidades, la proporcion de eventos positivos a eventos negativos para un resultado de prueba dado (las posibilidades son segun la formula p/(1-p) donde p es la probabilidad del evento y (1-p) es la probabilidad de no evento) sin conversion.

“Determinacion del riesgo” en el contexto de la presente divulgacion engloba hacer una prediccion de la probabilidad, posibilidad o expectativa de que pueda aparecer un evento. La determinacion del riesgo puede comprender tambien la prediccion de parametros clmicos futuros, valores de factor de riesgo de laboratorio tradicionales tales como edad, disparidad de sexos, ensayo de HLA, etc.; en terminos absolutos o bien relativos con referencia a una poblacion medida anteriormente. Los metodos de la presente divulgacion pueden usarse para hacer medidas categoricas del riesgo de rechazo de trasplante, definiendo por tanto el espectro de riesgos de una categona de paciente trasplantado definido como el riesgo de rechazo de trasplante.

En aun otro aspecto, la presente divulgacion se refiere a un metodo in vitro para determinar si un paciente trasplantado (receptor) es tolerante, que comprende una etapa de determinacion del nivel de expresion de IL-34 en una muestra biologica obtenida de dicho paciente de trasplante, en el que la presencia de IL-34 es indicativa de tolerancia.

Como se usa en la presente memoria, el termino “determinar” incluye la deteccion cualitativa y/o cuantitativa (concretamente, la deteccion y/o medida del nivel de expresion) con o sin referencia a un control o un valor predeterminado. Como se usa en la presente memoria, “detectar” significa determinar si IL-34 esta presente o no en una muestra biologica y “medir” significa determinar la cantidad de IL-34 en una muestra biologica. Tfpicamente, el nivel de expresion puede determinarse por ejemplo por inmunoensayos tales como un ELISA efectuado en una muestra biologica.

Como se usa en la presente memoria, la expresion “muestra biologica” tiene su significado general en la materia y hace referencia a cualquier muestra que pueda obtenerse de un paciente con el fin de evaluacion in vitro. Es una muestra biologica preferida una muestra de sangre (p. ej., muestra de sangre completa, muestra de suero o muestra de plasma).

Metodos para determinar el nivel de expresion del biomarcador de la presente divulgacion:

La determinacion del nivel de expresion de IL-34 puede efectuarse mediante una variedad de tecnicas. Generalmente, el nivel de expresion determinado es un nivel de expresion relativo.

Por ejemplo, la determinacion del nivel de expresion de IL-34 puede comprender una etapa de poner en contacto de la muestra biologica con reactivos selectivos tales como anticuerpos, y detectar asf la presencia, o medir la cantidad, del polipeptido de interes originalmente en dicha muestra biologica. La puesta en contacto puede efectuarse en cualquier dispositivo adecuado, tal como una placa, disco de microvaloracion, tubo de ensayo, pocillo, vidrio, columna y demas.

En una realizacion, la puesta en contacto se efectua sobre un sustrato recubierto con el reactivo. El sustrato puede ser un sustrato solido o semisolido tal como cualquier soporte adecuado que comprenda vidrio, plastico, nailon, papel, metal, polfmeros y similares. El sustrato puede ser de diversas formas y tamanos, tales como un portaobjetos, una membrana, una perla, una columna, un gel, etc. La puesta en contacto puede hacerse en cualquier condicion adecuada para que se forme un complejo detectable, tal como un complejo de anticuerpo-antfgeno, entre el reactivo y los polipeptidos de la muestra biologica.

La presencia del polipeptido de IL-34 puede detectarse usando tecnicas electroforeticas e inmunodiagnosticas estandares, incluyendo inmunoensayos tales como ensayos de competicion, reaccion directa o de tipo sandwich. Tales ensayos incluyen, pero sin limitacion, transferencias Western; pruebas de aglutinacion; inmunoensayos marcados y mediados por enzimas tales como ELISA; ensayos de tipo biotina/avidina; radioinmunoensayos; inmunoelectroforesis; inmunoprecipitacion, etc. Las reacciones incluyen generalmente marcajes reveladores tales como marcajes fluorescentes, quimioluminiscentes, radiactivos, enzimaticos o moleculas de tinte, u otros metodos para detectar la formacion de un complejo entre el antfgeno y el anticuerpo o anticuerpos con los que reaccionan. Son conocidos en la materia marcajes que proporcionan generalmente (directa o bien indirectamente) una senal.

Como se usa en la presente memoria, el termino “marcado” con respecto al anticuerpo o aptamero pretende englobar el marcaje directo del anticuerpo o aptamero por acoplamiento (concretamente, ligamiento ffsico) de una sustancia detectable, tal como un agente radiactivo o un fluoroforo (p. ej., isotiocianato de fluorescema (FITC) o ficoeritrina (PE) o indocianina (Cy5), al anticuerpo o aptamero, asf como el marcaje indirecto de la sonda o anticuerpo (p. ej., peroxidasa de rabano picante, HRP) por reactividad con una sustancia detectable. Un anticuerpo o aptamero puede marcarse tambien con una molecula radiactiva mediante cualquier metodo conocido en la materia. Por ejemplo, las moleculas radioactivas incluyen, pero sin limitacion, atomos radioactivos para estudios escintigraficos tales como I123, I124, In111, Re186 y Re188. Los ensayos anteriormente mencionados implican generalmente la separacion de protema no unida en una fase lfquida de un soporte en fase solida al que se unen los complejos de antigeno-anticuerpo. Los soportes solidos que pueden usarse en la practica de la presente divulgacion incluyen sustratos tales como nitrocelulosa (p. ej., en forma de membrana o pocillo de microvaloracion); poli(cloruro de vinilo) (p. ej., laminas o pocillos de microvaloracion); latex de poliestireno (p. ej., perlas o placas de microvaloracion); poli(fluoruro de vinilideno); papel diazotizado; membranas de nailon; perlas activadas, perlas sensibles magneticamente, etc.

Mas particularmente, puede usarse un metodo ELISA en el que los pocillos de una placa de microvaloracion se recubren con un anticuerpo contra la protema para ensayar. Se anade entonces una muestra biologica que contiene o se sospecha que contiene el biomarcador a los pocillos recubiertos. Despues de un periodo de incubacion suficiente para permitir la formacion de complejos de anticuerpo-antfgeno, la placa o placas pueden lavarse para retirar los restos no unidos y anadirse una molecula de union secundaria marcada detectablemente. La molecula de union secundaria se permite reaccionar con cualquier protema marcadora de la muestra capturada, se lava la placa y se detecta la presencia de la molecula de union secundaria usando metodos bien conocidos en la materia.

El reactivo selectivo es generalmente un anticuerpo que puede ser policlonal o monoclonal, preferiblemente monoclonal. Los anticuerpos policlonales dirigidos contra IL-34 son bien conocidos por el especialista en la materia, tales como los anticuerpos comercializados por Abnova PAB16574.

Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra IL-34 son tambien bien conocidos tales como el anticuerpo monoclonal comercializado por Abnova MAB10698.

Adicionalmente, los kits ELISA de IL-34 son tambien bien conocidos tales como aquellos comercializados por Abnova KA2217 Kit o por R&D Systems (Human IL-34 Quantikine ELISA).

En una realizacion particular, se determina el nivel de expresion de IL-34 midiendo la concentracion de IL-34 en dicha muestra biologica.

Por consiguiente, los metodos segun la presente divulgacion comprenden una etapa de puesta en contacto de la muestra de sangre con un copartfcipe de union capaz de interaccionar selectivamente con el polipeptido de IL-34 en dicha muestra de sangre.

El copartfcipe de union puede ser generalmente un anticuerpo que puede ser policlonal o monoclonal, preferiblemente monoclonal. Los anticuerpos policlonales dirigidos contra IL-34 pueden crearse segun metodos conocidos administrando el antfgeno o epttopo apropiado a un animal hospedador seleccionado, p. ej., de cerdos, vacas, caballos, conejos, cabras, ovejas y ratones entre otros. Pueden usarse diversos coadyuvantes conocidos en la materia para potenciar la produccion de anticuerpo.

Los anticuerpos monoclonales de la presente divulgacion pueden prepararse y aislarse usando cualquier tecnica que proporcione la produccion de moleculas de anticuerpo por estirpes celulares continuas en cultivo. Las tecnicas para la produccion y aislamiento incluyen, pero sin limitacion, la tecnica de hibridoma originalmente descrita por Kohler y Milstein (1975); la tecnica de hibridoma de linfocitos B humanos (Cote et al., 1983) y la tecnica de hibridoma de EBV (Cole et al., 1985). Como alternativa, pueden adaptarse las tecnicas descritas para la produccion de anticuerpos monocatenarios (vease p. ej. la patente de EE. uU. n° 4.946.778) para producir anticuerpos monocatenarios. Los anticuerpos utiles en la practica de la presente divulgacion incluyen fragmentos que incluyen, pero sin limitacion, fragmentos F(ab')2 que pueden generarse por digestion por pepsina de una molecula de anticuerpo intacta, y fragmentos Fab, que pueden generarse reduciendo los puentes disulfuro de los fragmentos F(ab')2. Como alternativa, pueden construirse colecciones de expresion de Fab y/o scFv para permitir una identificacion rapida de fragmentos que tienen la especificidad deseada. Por ejemplo, puede usarse presentacion en fago de anticuerpos. En tal metodo, los Fv monocatenarios (scFv) o fragmentos Fab se expresan sobre la superficie de un bacteriofago adecuado, p. ej. M13. Brevemente, se retiran las celulas de bazo de un hospedador adecuado, p. ej. raton, que se ha inmunizado con una protema. Se obtienen las regiones codificantes de las cadenas VL y VH a partir de estas celulas que producen el anticuerpo deseado contra la protema. Estas regiones codificantes se fusionan entonces con un extremo de una secuencia de fago. Una vez se inserta el fago en un portador adecuado, p. ej. bacterias, el fago presenta el fragmento de anticuerpo. La presentacion en fago de anticuerpo puede proporcionarse tambien por metodos combinatorios conocidos por los especialistas en la materia. Los fragmentos de anticuerpo presentados por un fago pueden usarse entonces como parte de un inmunoensayo.

En otra realizacion, el copartfcipe de union puede ser un aptamero. Los aptameros son una clase de molecula que representa una alternativa a los anticuerpos en terminos de reconocimiento molecular. Los aptameros son secuencias oligonucleotidicas u oligopeptidicas con la capacidad de reconocer practicamente cualquier clase de moleculas diana con alta afinidad y especificidad. Tales ligandos pueden aislarse mediante evolucion sistematica de ligandos por enriquecimiento exponencial (SELEX) de una coleccion de secuencias aleatorias, como se describe en Tuerk C. y Gold L., 1990. La coleccion de secuencias aleatorias es obtenible por smtesis qmmica combinatoria de ADN. En esta coleccion, cada miembro es un oligomero lineal, eventualmente modificado qmmicamente, de una unica secuencia. Las posibles modificaciones, usos y ventajas de esta clase de moleculas se han revisado en Jayasena S.D., 1999. Los aptameros peptidicos consisten en regiones variables de anticuerpo limitadas conformacionalmente presentadas por una protema de plataforma, tal como tiorredoxina A de E. coli, que se seleccionan de colecciones combinatorias por metodos de dos tnbridos (Colas et al., 1996).

En otras realizaciones, la medida de la concentracion de IL-34 puede incluir tambien la separacion de las protemas: centrifugacion basada en el peso molecular de la protema; electroforesis basada en masa y carga; HPLC basada en la hidrofobicidad; cromatograffa de exclusion por tamano basada en el tamano y afinidad en fase solida basada en la afinidad de la protema por la fase solida particular que esta en uso. Una vez separada, IL-34 puede identificarse basandose en el “perfil de separacion” conocido, p. ej. tiempo de retencion, para esa protema y medido usando tecnicas estandar. Como alternativa, las protemas separadas pueden detectarse y medirse, por ejemplo, por un espectrometro de masas.

Metodos para ajustar un tratamiento inmunosupresor:

La presente divulgacion proporciona ademas metodos para desarrollar planes de tratamiento personalizado. La informacion lograda mediante los metodos descritos anteriormente puede usarse para desarrollar un plan de tratamiento personalizado para un receptor de trasplante.

Por consiguiente, en un aspecto adicional, la presente divulgacion se refiere a un metodo para ajustar el tratamiento inmunosupresor administrado a un paciente necesitado de ello, que comprende las siguientes etapas de (i) efectuar el metodo para determinar el riesgo segun la presente divulgacion y (ii) ajustar el tratamiento inmunosupresor.

Los metodos pueden llevarse a cabo, por ejemplo, usando cualquiera de los metodos para determinar el riesgo descritos anteriormente y, en consideracion de los resultados obtenidos, disenando un plan de tratamiento para el receptor de trasplante. Si IL-34 no esta presente en la muestra biologica obtenida a partir de un paciente de interes, esto indica que dicho paciente esta en riesgo de un resultado clmico indeseable (p. ej., rechazo de trasplante). Por lo tanto, dicho paciente es un candidato a tratamiento con una cantidad eficaz de un tratamiento inmunosupresor (p. ej., por un agente antirrechazo). Por el contrario, la presencia de IL-34 en la muestra biologica es indicativa de un riesgo reducido de rechazo de trasplante. Ademas, dependiendo del nivel de expresion de IL-34 (concretamente, bajo nivel o alto nivel de IL-34 en la muestra biologica analizada), el paciente puede requerir un regimen de tratamiento que sea mas o menos agresivo que un regimen estandar, o puede determinarse que es mas adecuado para el paciente un regimen estandar. Por ejemplo, un paciente con un alto nivel de IL-34 puede evitar un tratamiento inmunosupresor (o requerir un regimen menos agresivo) y sus efectos secundarios asociados.

La invencion se ilustrara adicionalmente por las siguientes figuras y ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos y figuras no debenan interpretarse en modo alguno como limitantes del alcance de la presente invencion.

FIGURAS:

Figura 1: Expresion de IL-34 aumentada en injertos y Treg CD8+ esplenicos despues de tratamiento con CD40Ig. A. Se analizo en Treg CD8+CD45RCbaj° clasificados por FACS Aria del bazo de receptores no expuestos o tratados con AdCD40Ig de 120 dfas de edad (n= 6) la expresion de ARNm de IL-34 por RT-PCR cuantitativa. Se comparo la expresion de ARNm de IL-34 en los injertos cardiacos (B) y esplenicos (C) de receptores tratados con AdCD40Ig el dfa 5 (n= 3) y 120 (n= 7) despues del trasplante con los injertos de receptores no tratados el dfa 5 (n= 8), el dfa 7 (n= 8) y el dfa 120 (n= 6) y los corazones nativos de animales no expuestos (n= 7). (D) Se clasificaron Treg CD8+CD45RCbajo del bazo de ratas tratadas con CD40Ig y se analizo su expresion de IL-34 (negro) despues de 7 horas de estimulacion con PMA-ionomicina (24 pg/ml). El histograma en gris representa la tincion de control isotfpico. Mann Whitney, *p< 0,05, ** p<0,01.

Figura 2: IL-34 y CD115, pero no M-CSF, estaban implicados en la supresion mediada por Treg CD8+CD45RCbajo. Se analizo la proporcion relativa de linfocitos T CD4+CD25- en division LEW.1A marcados con CFSE estimulados con pDC LEW.1W de donante despues de 6 dfas de cultivo, en presencia de Treg LEW.1A CD8+CD45RCbajo a una relacion de efector:supresor de 1:1. Se evaluo la proliferacion despues de la adicion de un Ab bloqueante anti-IL-34 (A ), un Ab bloqueante anti-M-CSF (B) o un Ab bloqueante anti-CD115 (C) en comparacion con control isotfpico (n= 4 por triplicado). Los resultados se expresan como media ± EEM de porcentaje normalizado de proliferacion frente a proliferacion en ausencia de Treg CD8+ (100 %).*, p<0,01.

Figura 3: Deteccion de IL-34 usando un AAV-IL-34 e inhibicion de las respuestas de alolinfocitos T. A. Se ensayo en sobrenadantes de celulas transducidas con AAV-IL-34 o AAV-GFP la supresion de la proliferacion de linfocitos T CD4+CD25' en respuesta a pDC alogenicas y se analizo por citometna de flujo la dilucion de CFSE despues de 5 dfas de cultivo. Se usaron Treg CD8+ como control positivo de supresion. n= 3 por duplicado. Los resultados se expresan como media ±EEM del porcentaje normalizado de proliferacion frente a la proliferacion en ausencia de Treg CD8+ (100 %). Histograma representativo de 1 experimento; en gris: proliferacion de linfocitos T CD4+ cocultivados con pDC con sobrenadante de celulas transducidas con AAV-GFP al 20 %; lmea negra: con sobrenadante de celulas transducidas con AAV-IL-34 al 20 %. B. Se ensayo en la dilucion en serie de sueros de ratas tratadas con AAV-IL-34 o AAV-GFP o animales no expuestos la supresion de la proliferacion de linfocitos T CD4+CD25' en respuesta a pDC alogenicos y se analizo por citometna de flujo la dilucion de CFSE despues de 5 dfas de cultivo. Se usaron Treg CD8+ como control positivo de supresion. n= 3 por duplicado. Los resultados se expresan como media ± EEM del porcentaje normalizado de proliferacion frente a la proliferacion en ausencia de Treg CD8+ (100 %). *, p< 0,01; **, p< 0,001; ***, p< 0,0001 frente a sueros de animales no expuestos.

Figura 4: La transferencia genica de IL-34 prolonga la supervivencia de aloinjerto de manera dominante. Los receptores recibieron por v^a intravenosa 1012 vg/rata de AAV-IL-34 o AAV no codificante o no tratado, se injertaron 30 dfas despues sin tratamiento adicional o en combinacion con una dosis suboptima de rapamicina (14 dfas, d^a de inicio 0). Se evaluo la supervivencia del injerto por palpacion a traves de la pared abdominal. ***p< 0,0001.

Figura 5: Tolerancia en serie mediada por Treg despues de la induccion de IL-34. A. Se irradiaron subletalmente (4,5 Gy) receptores LEW.1A el dfa -1 y recibieron aloinjertos cardiacos e inyecciones i.v. de 1,5x108 esplenocitos de un receptor de larga supervivencia o animales no expuestos el dfa 0. Se monitorizo la supervivencia del injerto por palpacion abdominal. B. Se irradiaron subletalmente (4,5 Gy) receptores LEW.1A el dfa -1 y recibieron aloinjertos cardiacos e inyecciones i.v. de esplenocitos totales o subpoblaciones purificadas (linfocitos T: 4x107; linfocitos T: 6x107, celulas CD11b/c+: 1,5x107; Treg CD8+CD45RCbajo; 4x106; Treg CD4+CD25alto: 4x106) de un receptor de larga supervivencia el dfa 0. Se monitorizo la supervivencia del injerto por palpacion abdominal. Prueba de rangos logantmicos, **p< 0,01, *p< 0,05.

Figura 6: Supresion dependiente de la dosis mediada por M-CSF de las respuestas de linfocitos T CD4+CD25-efectoras antidonantes. (A ) Se analizo en Treg CD8+CD45RCbajo clasificados por FACS Aria de bazo de receptores no expuestos o tratados con AdCD40Ig de 120 dfas de edad (n= 6) la expresion de ARNm de M-CSF por r T-PCR cuantitativa. *p< 0,05. (B) Se ensayo en M-CSF de rata (0,1 a 2 pg/ml de concentracion final) la actividad supresora de la proliferacion de linfocitos T CD4+CD25' marcados con CFSE despues de 6 dfas de cultivo. Se usaron Treg CD8+ como control positivo de supresion. n= 3 por triplicado. Los resultados se expresan como media ± EEM de porcentaje normalizado de proliferacion frente a proliferacion en ausencia de Treg CD8+ (100 %). *, p< 0,01.

Figura 7: Acumulacion de transcrito en macrofagos despues de tratamiento con IL-34. Se valoro la expresion de ARNm por PCR cuantitativa instantanea en macrofagos clasificados de bazo no tratado o bazo tratado con AAV-IL34, sangre e injerto de receptores el dfa 15 despues del trasplante. Se normalizan los resultados a HPRT y se expresan como 2'ddCT±EEM. Prueba de Kruskal Wallis y posterior de Dunn, *, p< 0,01.

Figura 8: El agotamiento de macrofagos daba como resultado el rechazo de injerto despues del tratamiento con IL-34. Los receptores recibieron el dfa -30 por via intravenosa 1012 vg/rata de AAV-IL-34 o AAV no codificante o no se trataron con o sin administracion intraperitoneal semanal de liposomas de clodronato del dfa -25 al dfa 3, y se injertaron el dfa 0 en combinacion con una dosis suboptima de rapamicina (10 dfas, dfa de inicio 0). Se evaluo la supervivencia del injerto por palpacion a traves de la pared abdominal. Prueba de rangos logantmicos, **p< 0,01.

Figura 9: IL-34 esta implicada en la actividad supresora de Treg CD4+ y CD8+ humanos, que pueden inhibir respuestas inmunitarias antidonantes. (A ) Se ensayo en IL-34 soluble la supresion de la proliferacion de linfocitos T CD4+CD25' en respuesta a PBMC con linfocitos T alogenicos agotados y se analizo por citometna de flujo la dilucion de CFSE despues de 5 dfas de cultivo. n= 2 a 5 por duplicado. Los resultados se expresan como media ± EEM de la proporcion relativa de linfocitos T CD4+CD25' en division. (B) Se analizo la proporcion relativa de linfocitos T CD4+CD25' en division marcados con CFSE estimulados con PBMC con linfocitos T alogenicos agotados despues de 5 dfas de cultivo en presencia de Treg CD8+CD45RCbajo o CD4+CD25alto a relaciones de efector:supresor 1:1. Se evaluo la proliferacion despues de la adicion de Ab bloqueante anti-IL-34 y se comparo con el control isortpico (n= 5­ 6 por triplicado). La proporcion de linfocitos T CD4+CD25' en division en condiciones de proliferacion de control con PBMC con linfocitos T alogenicos agotados representaba solo aproximadamente un 60 % de las celulas el dfa 5 y se le dio un valor de 100 en cada experimento. Los resultados se expresan como media ± EEM de la proporcion relativa de linfocitos T CD4+CD25' en division.

EJEMPLO 1: INTERLEUCINA 34, UN NUEVO MEDIADOR DE CITOCINA ESPEdFICO DE TREG DE LA TOLERANCIA A TRASPLANTE

Material y Metodos

Recogida de sangre de voluntarios sanos y separacion de PBMC: Se recogio sangre de donante sanos, despues de dar el consentimiento informado, en el Etablissement Frangais du Sang (Nantes, Francia). Se diluyo la sangre 2 veces con PBS antes de aislar las PBMC por centrifugacion en gradiente de densidad Ficoll-Paque (Eurobio) a 2000 rpm durante 30 min a temperatura ambiente sin frenado. Se lavaron las PBMC recogidas con 50 ml de PBS a 1800 rpm durante 10 min.

Modelos animales y de trasplante cardiaco: Se efectuo el alotrasplante de corazon entre ratas macho LEW-1W (donantes) y LEW-1A (receptores) de MHC incompatible como se describe anteriormente (15). Se evaluo la supervivencia del corazon por palpacion a traves de la pared abdominal y se graduo el latido cardiaco de ++ a -. Los experimentos se aprobaron por el comite etico regional para experimentacion animal.

RT-PCR cuantitativa de IL-34: Se han descrito el aislamiento y retrotranscripcion de ARNm as ^como la cuantificacion de los niveles de ARNm espedficos usando la tecnologfa Taqman despues de normalizacion a los valores de HPRT (15). Las secuencias de sonda eran para el cebador directo

y para el cebador inverso

Clasificacion celular, anticuerpos monoclonales y citometria de flujo: Se clasificaron los macrofagos en celulas negativas TCR«p (R7/3) y TCRyS (V65), celulas positivas CD45RA-FITC (OX33) y CD11b/c-APC (OX42). Se clasificaron los subconjuntos de linfocitos T LEW.Ia CD4+CD25' no expuestos, pDC LEW.1W y Treg LEW.1A CD8+CD45RCbajo como se describe anteriormente (16). Se obtuvieron los anticuerpos usados para clasificacion de linfocitos T (TCRap, clon R7/3), linfocitos T CD4+CD25' (clones OX35 y OX39), linfocitos T CD8+ (clon OX8), linfocitos T CD8+CD45RCbajo (clones OX8 y OX22), y pDC CD4+CD45R+85C7+ (clones His24, OX35 y 85C7) de la European Collection of Cell Culture (Salisbury, RU). Se visualizaron todos los mAb marcados con biotina usando estreptavidina-PE-Cy7 (BD Biosciences) o estreptavidina-Alexa405. Se clasificaron los linfocitos T CD4+CD25- humanos por seleccion de poblaciones en celulas CD3+CD4+CD25- (clones SKY7, L-200 y MA251), los Treg CD4+ por seleccion de poblaciones en celulas CD25alto y CD127bajo (clon HIL7-R M21) y los Treg CD8+ por seleccion de poblaciones en celulas CD3+CD4"CD45RCbaj° (clon MT2). Se detecto IL-34-Myc usando un anticuerpo anti-myc (9E10, Sigma). Se bloquearon IL-34, CD115 y MCSF con los anticuerpos anti-IL-34 (PAB16574, Abnova), anti-CD115 (MCA1898, Serotec) y anti-M-CSF (AB-416-NA, R&D System). Se analizaron los anticuerpos contra linfocitos B MHC-II (OX6), CD11b y CD45RA+ (OX33) para caracteriza el fenotipo celular. Se usaron los anticuerpos contra CD3-PeCy7 (SKY7), CD4-PercPCy5.5 (L200), CD25-APCCy7 (M-A251), CD127-PE (HIL7-R M21, BD Bioscience), CD45RC-FITC (MT2, IQ Product), Foxp3-APC (236A/E7, Ebiosciences) e IL34-PE (578416, R&D) para caracterizar los fenotipos celulares humanos. Se uso un FACS ARIA I (BD Biosciences, Mountain View, CA) para clasificar celulas. Se uso un citometro Canto II (BD Biosciences, Mountain View, CA) para medir la fluorescencia y se analizaron los datos usando el software FLOWJO (Tree Star, Inc. EE. UU.). En primer lugar, se seleccionaron poblaciones de celulas por su morfologfa, excluyendo las celulas muertas al seleccionar celulas viables por DAPI.

Generacion y uso de AAV in vitro e in vivo: Se colocaron la secuencia de ADNc completa de Q81 que contiene IL-34 de rata (9), o GFP como control, en direccion 3' de un promotor RSV. Se ensayaron en primer lugar los plasmdos en celulas HEK293T transfectadas con reactivo Lipofectamine (Life Technologies, Carlsbad, Nuevo Mexico). Se analizaron las celulas por GFP y expresion de IL-34-myc 48 horas despues por FACS con Ab anti-myc. Se usaron entonces plasmidos para producir vectores de AAV de serotipo 8 (plataforma LTG, INSERM UMR 1089, Nantes). Se transdujeron celulas HEK293T con 10.000, 100.000 a 1.000.000 de MOl de copias genomicas del vector/celula de AAV-IL-34 o AAV-GFP y 5.000 de MOl de AdLacZ. 24 h despues, se recolectaron las celulas, se analizo la expresion de IL-34-Myc por FACS y se ensayo en el sobrenadante la actividad de supresion sobre linfocitos T CD4+ que responden a pDC alogenicas, a un dilucion de 1/10 y 1/5. Se inyectaron vectores AAV-IL-34 y AAV-GFP recombinantes (4,5x1010, 1x1012 y 2x1012 genomas de vector/rata) i.v. en ratas de 4 semanas de edad un mes antes del trasplante para permitir una expresion optima de vectores AAV (23). Se tomaron muestras de sangre para la cuantificacion de anticuerpos aloespedicos de donante.

Transferencia adoptiva de celulas: Se clasificaron las celulas de rata como se describe anteriormente (5, 8) por FACS Aria (BD Biosciences, Mountain View, CA) por seleccion de poblaciones en celulas positivas TCRap-APC (R7/3), CD45RA-FITC (OX33) y CD11b/c-biotina-estreptavidina PECy7 (OX42). Los receptores que recibieron esplenocitos de ratas tratadas con IL-34 se definen como 1° transferidos y las transferencias iterativas se definieron entonces como 2° a 3° transferido. Se transfirieron adoptivamente i.v. los esplenocitos totales (1,5x108 celulas) y linfocitos B CD45RA+ clasificados por FACS-Aria (6x107), linfocitos T (4x107), celulas CD11b/c+ (1,5x107), Treg CD4+CD25alto (4x106) o Treg CD8+CD45RCbajo (4x106) el dfa antes del trasplante de corazon a receptores LEW-1A no expuestos que habfan recibido 4,5 Gy de irradiacion de cuerpo entero el mismo dfa.

Reaccion de linfocitos mixtos: Se clasificaron subconjuntos de linfocitos T Lewis 1A CD4+ no expuestos, pDC Lewis 1W no expuestos y Treg Lewis 1A CD8+CD45RCbajo tratados con AdCD40Ig como se describe anteriormente (16). Se anadio suero de receptores tratados con AAV-IL-34, tratados con AdCD40Ig y ratas no expuestas en cocultivo para alcanzar 3,12 %, 6,25 % y 12,5 % de concentracion final. Se anadio sobrenadante de celulas transducidas a linfocitos T CD4+ y pDC de 10 % a 20 % de concentracion final para la prueba de actividad supresora Se ensayo en Ab bloqueantes de IL-34, CD115 o M-CSF de rata o control isoripico la actividad bloqueante de 1,25 a 30 pg/ml en presencia o no de Treg CD8+CD40Ig. Se ensayo protema M-CSF (ab56288, ABCAM) de 0,1 a 2 pg/ml. Se analizo la proliferacion de linfocitos T CD4+CD25' marcados con CFSE por citometria de flujo 6 dfas despues, por seleccion de poblaciones de celulas TCR+CD4+ (R7/3-APC, Ox35-PECY7) entre las celulas vivas (negativas de DAPI).

Se sembraron linfocitos T CD4+CD25' humanos clasificados por triplicado con PBMC con linfocitos T humanos alogenicos agotados en 200 |jl de medio RPMI-1640 completo en placas de 96 pocillos de fondo redondo o conico, respectivamente, a 37 °C y 5 % de CO2. Se uso Ab de IL-34 humano a 50 jg/m l y se anadieron numeros variables de Treg. Se uso Ab de control isotipico a la maxima concentracion presentada en la grafica respectiva. Se ensayo la protema M-CSF (ab56288, ABCAM) de 0,1 a 2 jg/ml. Se anadio IL-34 humana soluble (eBiosciences) a una concentracion de 1,2 o 5 jg/m l para la prueba de actividad supresora.

Cuantificacion de aloanticuerpos especificos de donante: Se digirieron bazos donantes con colagenasa D, se detuvo con 400 j l de EDTA 0,1 mM y se lisaron los globulos rojos. Se anadio suero de receptores a esplenocitos donantes a una dilucion 1/8 y se incubo con IgG-FITC anti-rata (Jackson ImmunoResearch Labs INC, Baltimore, EE. UU.), IgG1 anti-rata (MCA 194, Serotec), IgG2a anti-rata (Mc A 278, Serotec) o bien IgG2b anti-rata (STAR114F, Serotec) y anti-Ms Ig-FITC (115-095-164, Jackson ImmunoResearch). Se uso un FACS Canto (BD Biosciences, Mountain View, CA) para medir la fluorescencia y se analizaron los datos usando el software FLOWJO (Tree Star, Inc. EE. UU.). Se dividio la media geometrica de fluorescencia (MFI) de los sueros ensayados entre la MFI media de 5 sueros de Lewis 1A no expuestos como control.

Analisis estadistico: Se usaron la prueba de Kruskal Wallis de ANOVA de una cola y la prueba posterior de Dunn para experimentos de PCR y cocultivo. Se aplicaron la prueba ANOVA de dos colas y las pruebas posteriores de Bonferroni para anticuerpos dirigidos a donante y caracterizacion del fenotipo de esplenocitos, y se uso la prueba de Mantel Cox para analizar las curvas de supervivencia.

Tratamiento in vivo con liposomas de clodronato: Se adquirieron liposomas de clodronato para agotamiento de macrofagos en Vrije University, Holanda (www.clodronateliposomes.org) y se prepararon como se recomienda (5041). Brevemente, se administraron semanalmente por via intraperitoneal 2,5 ml de solucion suspendida del dfa -25 al dfa 3.

RT-PCR cuantitativa: Se aislo ARN total de celulas usando el reactivo Trizol (Invitrogen) o un kit RNeasy Mini (Qiagen). Se amplifico el ARN de macrofagos con el kit de amplificacion MessageAmpTMII aRNA segun las instrucciones del fabricante (Life Technologies) y se transcribio de forma inversa con cebadores aleatorios y transcriptasa inversa de M-MLV (Life Technologies). Se realizo la PCR instantanea usando la tecnologfa Fast SYBR Green en un volumen de reaccion final de 20 j l que contiene 10 j l de mezcla maestra 2X (Life Technologies), 0,6 j l de cebadores (10 jM ), 1 j l de ADNc y 8,4 j l de agua. Se efectuo la reaccion en Applied Biosystems StepOne™ (Life Technologies). Las condiciones termicas fueron las siguientes: 3 s a 95 °C, 30 s a 60 °C y 15 s a TM-5 °C con un paso de curva de fusion final.

Resultados

IL-34 se expresaba por Treg CD8+CD45RCbajo esplenico y el aloinjerto tolerante: El analisis de micromatriz de ADN de Treg CD8+CD40Ig frente a Treg CD8+CD45RCbajo no expuestos de bazo destacaba la regulacion positiva de IL-34 (entre los genes mas regulados positivamente) por Treg CD8+CD40Ig, con un cambio en veces de 4,05. Esta regulacion positiva se confirmaba por qPCR con un aumento > 11 veces de la expresion de ARNm de IL-34 en Treg CD8+CD40Ig esplenicos a largo plazo en comparacion con Treg CD8+CD45RCbajo no expuestos (p<0,05, Figura 1A).

Viendo los organos enteros, el ARNm de IL-34 se expresaba endogenamente en bazo y corazon de animales no expuestos (como se observa por Lin et al. (18)) (Figura 1B), y disminrna ligeramente durante el rechazo de aloinjerto agudo tanto en bazo como en injerto (NT, Figuras 1B y 1C). En correlacion con las observaciones anteriores de que los Treg CD8+CD40Ig se acumulaban en el injerto durante la primera semana (16), la expresion de ARNm de IL-34 aumentaba significativamente el dfa 5 en injerto y bazo tratados con AdCD40Ig (Figura 1B y 1C). Este aumento significativo era aun detectable en injerto tratado con AdCD40Ig 120 dfas despues del trasplante; sin embargo, en el bazo total, el nivel de ARNm de IL-34 habfa vuelto a la normalidad.

Para confirmar la expresion de protema de IL-34, se marcaron Treg CD8+CD40Ig con un anticuerpo de raton anti-IL-34 de rata (Ab) que se genero. Con este Ab, se confirmo la expresion significativa de IL-34 por Treg CD8+CD40Ig en comparacion con Treg CD8+CD45RCbajo no expuestos (Figura 1D).

En conjunto, estos resultados demostraron por primera vez que IL-34 puede expresarse por Treg CD8+CD45RCbajo inducidos, asf como aloinjerto tolerado. Ademas, la expresion temprana de IL-34 en injerto y bazo sugiere su implicacion temprana en la inhibicion del rechazo de injerto agudo y por tanto el establecimiento de tolerancia a aloinjerto.

La IL-34 expresada por Treg CD8+CD45RCbajo, pero no por M-CSF, esta implicada en la supresion medida por Treg: Se demostro anteriormente que los Treg CD8+CD40Ig suprimen la proliferacion anti-donante de linfocitos T efectores CD4+ en respuesta a pDC alogenicas ex vivo (16). Ademas, se demostro la implicacion de IFNy y FGL2 en este proceso; sin embargo, permaneda algo de supresion despues del bloqueo del efecto inhibidor de IFNy y FGL2 (15, 16). Para abordar si IL-34 estaba implicada en la supresion de Treg CD8+CD40Ig, se ensayo un anticuerpo neutralizante anti-IL-34 en el ensayo de MLR supresor (Figura 2A). La adicion a concentracion aumentada de Ab anti-IL-34 bloqueante daba como resultado una reversion aumentada dependiente de la dosis de la proliferacion de CD4+ de hasta un 59 % de la inhibicion mediada por Treg CD8+.

Dado que IL-34 tiene similitudes con M-CSF, que se observo una expresion significativa de M-CSF por Treg CD8+CD40Ig en comparacion con Treg CD8+CD45RCbajo no eratados (Figura 6A) y que compite por el mismo receptor (18, 19), se quena abordar la posibilidad de que M-CSF pudiera desempenar un papel en la inhibicion de la proliferacion de linfocitos T efectores. En primer lugar, se ensayo el potencial supresor de M-CSF en el ensayo de MLR descrito anteriormente. De forma interesante, se observo que M-CSF supriirna eficazmente de manera dependiente de la dosis hasta un 93,5 % de la proliferacion de linfocitos T CD4+CD25' (Figura 6B), sugiriendo que la supresion mediada por M-CSF, como para IL-34, actua a traves de pDC que expresan CSF1-R (20, 21). Sin embargo, la adicion de un Ab anti-M-CSF bloqueante en ensayos supresores de cocultivo en presencia de Treg CD8+ no restauraba la proliferacion de linfocitos T CD4+, demostrando que M-CSF no estaba implicado en la supresion mediada por Treg CD8+CD40Ig (Figura 2B).

Se ensayo a continuacion la implicacion de CSF1-R, el unico receptor periferico descrito hasta ahora para IL-34 (18, 19) expresado por monocitos/macrofagos, cDC y pDC (20,21). Por tanto, se uso un Ab bloqueante anti-CSF1-R que se habfa mostrado anteriormente que inhibfa las acciones de M-CSF tanto en ratas como en ratones (22). Se demostro que el bloqueo de CSF1-R anulaba significativamente la supresion mediada por Treg CD8+ de la proliferacion de linfocitos T CD4+ en presencia de pDC (Figura 2C).

En conclusion, se demostro la implicacion de las interacciones IL-34/CFS1-R, pero no las interacciones M-CSF/CSF1-R, en el efecto supresor de Treg CD8+CD40Ig.

Generacion de un vector virico adenoasociado (AAV) para expresion mantenida de IL-34: Para analizar adicionalmente la actividad supresora de IL-34, y puesto que la citocina de rata IL-34 recombinante no estaba comercialmente disponible y era diffcil de producir para experimentos in vivo, se genero un vector AAV recombinante que codifica la molecula IL-34 de rata, como se ha hecho para otras moleculas en primates (23) ratas (24). En este vector, se fusiono el ADNc de IL-34 de rata con un marcaje Myc C-terminal y se usaron en primer lugar tanto plasmido (pIIL-34) como lentivirus para transfectar o transducir establemente estirpes de linfocitos T HEK293. La expresion de IL-34 se indicaba en citometna de flujo por el marcaje Myc. La tincion con Myc no era detectable en linfocitos T HEK293 no transfectados o transducidos con a AV-GFP, asf como en linfocitos T HEK293 tenidos con Ab de control isotipico. Sin embargo, los linfocitos T HEK293 transfectados con pIIL-34 o transducidos con AAV-IL-34 expresaban una fuerte cantidad de protema IL-34 de manera dependiente de la dosis, demostrando la secrecion de IL-34 y la funcionalidad del vector.

Se ensayo entonces el potencial supresor del sobrenadante de cultivo de linfocitos T HEK293 transducidos con AAV-IL-34 (Figura 3A) y los sueros de ratas tratadas con AAV-IL-34 (Figura 3B), que conternan ambos una alta cantidad de protema IL-34, como se muestra anteriormente. Se observo que tanto el sobrenadante de celulas transducidas con AAV-IL-34 como los sueros de ratas tratadas con AAV-IL34 inhibfan significativamente la respuesta proliferativa de linfocitos T efectores CD4+ estimulada por pDC alogenicas (de manera dependiente de la dosis) en comparacion con los controles (Figuras 3A y 3B).

En conjunto, estos resultados demostraban la funcionalidad del vector y la eficacia supresora de IL-34 en la inhibicion de la proliferacion de linfocitos T efectores, sugiriendo por tanto su potencial in vivo en trasplantes.

Efecto terapeutico de IL-34 en la induccion de tolerancia de aloinjerto: Para determinar adicionalmente el potencial supresor de IL-34 in vivo como estrategia terapeutica, se trataron receptores con 1x1012 vg/ratade AAV-IL-34 o un AAV no codificante de control, i.v, un mes antes del trasplante. Tal tratamiento con IL-34 sola daba como resultado una prolongacion significativa de la supervivencia de aloinjerto (tiempo medio de supervivencia 32,6 ± 7,8 dfas) frente a controles inyectados con AAV no codificantes (14,2±1,8 dfas) o receptores no tratados (7,8±0,6 dfas) (Figura 4). Para mejorar la supervivencia de aloinjerto, se trataron entonces los receptores con una dosis suboptima de rapamicina (durante 14 dfas) ademas del vector AAV. 14 dfas de rapamicina sola no extendfan significativamente la supervivencia del aloinjerto (Figura 4, circulo negro). En contraposicion, se observo una supervivencia de aloinjerto indefinida en un 75 % de los receptores que habfan recibido la terapia combinada de AAV-IL-34 y rapamicina en comparacion con los controles (p< 0,001, Figura 4). El analisis en el injerto de receptores de larga supervivencia de signos de rechazo cronico revelo una ausencia completa de lesiones vasculares, concretamente una estructura de vasos normal y ausencia de infiltracion leucocftica en el miocardio en todos los receptores analizados. Ademas, el analisis de la presencia de anticuerpos anti-donante en los sueros de receptores de larga supervivencia revelo una inhibicion significativa de los Av IgG, IgG1, IgG2a y IgG2b totales anti-donante frente al receptor tratado con el AAV no codificante.

En conjunto, pudo demostrarse por primera vez que IL-34 es una estrategia terapeutica valiosa para la induccion de tolerancia en combinacion con rapamicina y que daba como resultado una anulacion de todas las respuestas inmunitarias alogenicas.

IL-34 induce potentemente linfocitos T reguladores capaces de tolerancia infecciosa: Como se demuestra anteriormente, IL-34 se produce espedficamente por Treg CD8+CD40Ig. Se valoro a continuacion si se indudan celulas reguladoras en el contexto del tratamiento con IL-34 y estaban implicadas en la supervivencia de aloinjerto a largo plazo generada por la combinacion de AAV-IL-34 y rapamicina. Para hacer eso, se efectuaron experimentos de transferencia celular adoptiva usando esplenocitos de receptores de larga supervivencia en receptores irradiados injertados no expuestos, como se ha hecho antes (15). La primera transferencia adoptiva de 1,5x108 esplenocitos en receptores irradiados injertados no expuestos secundarios daba como resultado una prolongacion significativa de la supervivencia del aloinjerto del 60 % de los receptores (Figura 5A), demostrando que IL-34 induce eficazmente celulas reguladoras. Se investigo el estado anatomopatologico del injerto de receptores de esplenocitos a largo plazo transferidos adoptivamente por primera vez y se observo una ausencia completa de lesiones y obstrucciones vasculares (concretamente, sin signos de rechazo cronico). Se determino entonces si esta prolongacion de la supervivencia de aloinjerto puede transferirse en serie a segundos y terceros receptores y se observo que la tolerancia puede transferirse en serie al menos 3 veces a receptores irradiados injertados no expuestos (Figura 5, 2a y 3a transferencia).

Dado que se ha descrito recientemente que IL-34 induce macrofagos reguladores (25), se investigo la poblacion reguladora que permite la transferencia de tolerancia adoptiva en serie incluyendo macrofagos. Para hacer esto, se purificaron subpoblaciones de los diferentes subconjuntos principales (linfocitos B, linfocitos T y macrofagos) de receptores tolerantes tratados con IL-34 y se efectuo la transferencia celular adoptiva a receptores injertados irradiados no expuestos (Figura 5B). Con sorpresa, se observo que la transferencia de tolerancia se consegrna solo con transferencia de linfocitos T, y no de macrofagos como se sugiere por otros, demostrando por primera vez que IL-34 puede inducir linfocitos T reguladores y que, en este modelo, los macrofagos no eran suficientemente potentes para inhibir el rechazo agudo de aloinjerto. Sin embargo, los linfocitos T reguladores no expresan el receptor de lL-34, sugiriendo que los macrofagos son un intermedio necesario en las funciones de linfocitos T reguladores. Para determinar adicionalmente cual poblacion de Treg (concretamente, linfocitos T CD4+CD25alt° o CD8+CD45RCbajo) podna dar tolerancia a receptores recien injertados, se clasificaron Treg CD4+CD25alto y CD8+CD45RCbajo y se efectuo la transferencia celular adoptiva (Figura 5B). Se observo que tanto las transferencias adoptivas de Treg CD4+CD25alto como CD8+CD45RCbajo daban como resultado un 50 % de supervivencia del aloinjerto a largo plazo en receptores, sugiriendo que ambas poblaciones de Treg se habfan potenciado igualmente por los macrofagos modificados por IL-34

En conjunto, estos resultados in vivo demuestran que se generan Treg eficaces despues del tratamiento con IL-34 en el contexto de inflamacion reducida y trasplante, y que esos Treg pueden inducir tolerancia en serie de forma dominante.

La induccion de Treg esta mediada por macrofagos modificados por IL-34 que se infiltran en el injerto: En un intento de identificar adicionalmente el papel de los macrofagos inducidos por IL-34 en la induccion de tolerancia, se caracterizo el efecto de IL-34 sobre macrofagos en el contexto de induccion de tolerancia a un aloinjerto. Se clasificaron primero los macrofagos de bazo, sangre e injerto de receptores tratados con AAV-IL-34 el dfa 15 despues del trasplante (concretamente, dfa 45 despues de la inyeccion de AAV) y macrofagos de ratas no expuestas y se analizaron por qPCR una serie de genes (Figura 7). De forma interesante, se observo que los macrofagos en el injerto de receptores tratados con AAV-IL-34 regulaban positivamente con fuerza arginasa 1 y NO sintasa inducible (iNOS), ambas implicadas en el metabolismo de aminoacidos esenciales y descritas como un mecanismo comun de inmunoregulacion de macrofagos supresores al limitar la proliferacion de linfocitos T (34), en comparacion con macrofagos no expuestos. Se observo tambien una expresion aumentada de CD14 y una expresion disminuida de CD23, CD86 e IL10, sobre todo en el injerto, pero tambien en el bazo y la sangre de macrofagos tratados con AAV-IL34 en comparacion con macrofagos no expuestos. Finalmente, no se observaron diferencias significativas para la expresion de CD16, CD32, IL1, TGFp and TNFa. Es tambien interesante senalar que habfa diferencias significativas entre los macrofagos localizados en la sangre frente al injerto, sugiriendo que los macrofagos reguladores modificados por IL-34 migran y se localizan en el injerto rapidamente despues del trasplante. Se agotaron adicionalmente las poblaciones de macrofagos usando liposomas cargados con clodronato del dfa -25 antes del trasplante al dfa 3 despues del trasplante y se trataron simultaneamente con IL-34 o AAV no codificante mas dosis suboptima de rapamicina durante 10 dfas, como se describe anteriormente por otros. Desgraciadamente, esta terapia daba como resultado en sf misma la supervivencia del injerto y no pudo usarse para revelar el papel de los macrofagos inducidos por IL-34. Al hacer esto, los AAV-IL-34 inyectados 30 dfas antes del trasplante no pudieron actuar a traves de macrofagos, que se agotaron al mismo tiempo. De forma significativa, para el momento en que se inicio el agotamiento de liposomas, la mayona del serotipo 8 de AAV se habfa integrado en los hepatocitos del tngado. Se observo que los receptores tratados con liposomas cargados con clodronato rechazaban su injerto mas rapidamente despues del trasplante en comparacion con el grupo de control, demostrando que los macrofagos son esenciales en la induccion de tolerancia por IL-34 (Figura 8).

IL-34 posee un fuerte potencial supresor: Como se sospechaba un potencial supresor de IL-34 en seres humanos, se anadieron diferentes dosis de IL-34 humana soluble a una MLR, donde se cultivaron linfocitos T efectores CD4+CD25' marcados con CFSE en presencia de PBMC alogenicas con linfocitos T agotados como APC (Figura 9A). Se observo una inhibicion significativa dependiente de la dosis de la proliferacion de linfocitos T efectores en presencia de IL-34, confirmando por tanto el potencial supresor de IL-34 sobre la respuesta inmunitaria anti-donante. Finalmente, para demostrar la implicacion de IL34 en la actividad supresora mediada por Treg CD4+CD25alt°CD127baj° y CD8+CD45RCbajo sobre las respuestas inmunitarias anti-donante, se anadio Ab bloqueante anti-IL-34 humana o bien Ab de isotipo de control a una MLR donde se inhibfa por Treg la proliferacion de linfocitos T efectores CD4+CD25' marcados con CSFE en presencia de PBMC con linfocitos T alogenicos agotados (Figura 9B). Se observo que bloquear IL-34 revertfa significativamente la supresion mediada por Treg tanto de Treg CD4+ como CD8+ en comparacion con el Ab de control de isotipo, demostrando el papel clave de IL-34 en la actividad supresora de Treg.

En conjunto, estos datos prueban la relevancia de estos hallazgos y proporcionan la prueba de concepto de IL-34 como una protema espedfica de Treg y una diana terapeutica potencial en la manipulacion de la respuesta inmunitaria anti-donante.

DISCUSION

La relevancia biologica de IL-34 permanece hasta la fecha desconocida en gran medida y es controvertida. La comprension actual del papel de IL-34 estaba impulsada sobre todo por el estudio en situaciones patologicas en que se encontraba que IL-34 ejerda funciones inflamatorias, tales como M-CSF. Diversos estudios han mostrado que la administracion de M-CSF aumenta la inflamacion en un modelo de AR inducida por colageno (26) y que IL-34 se correlaciona con la gravedad de sinovitis, inflamacion en un modelo de AR (13) y puede inducirse por TNFa, como M-CSF (27). Ademas, tanto IL-34 como M-CSF inducen citocinas proinflamatorias como IL-6, IP10/c Xc L10, IL-8/CXCL8, MCP1/CCL2 (28). En contraposicion con estos estudios, se ha mostrado tambien que M-CSF, y mas recientemente IL-34, solas o en combinacion con otras citocinas, pueden inducir macrofagos reguladores (25, 29-32). En trasplantes, se ha demostrado que el pretratamiento con M-CSF de ratones expande los macrofagos e inhibe la EICH (33). Ademas, la combinacion de M-CSF e IFNy diferencia los monocitos a macrofagos reguladores capaces de prolongar la supervivencia de aloinjerto cardiaco de manera dependiente de iNOS (34). Estos estudios subrayan el papel paradojico de IL-34. En este estudio, en un intento de desentranar los complejos mecanismos de induccion de tolerancia en trasplantes, se proporcionan evidencias, por primera vez, de las propiedades inesperadas de IL-34 como regulador maestro de las respuestas y tolerancia inmunitarias. Se proporciona tambien la primera prueba de que IL-34 puede expresarse por aloinjertos tolerados y Treg CD8+CD45RCbaj°, y lo mas importante puede inducir linfocitos T reguladores potentes.

Se demostro anteriormente que el tratamiento de receptores de injerto cardiaco con un adenovirus que codifica CD40Ig conduce a una supervivencia de aloinjerto indefinida en el 93 % de los receptores, y que esta aceptacion estaba mediada por Treg CD8+CD45RCbajo de manera dependiente de IFNy, IDO y FGL2. Se demostro mas recientemente que los Treg CD8+CD45RCbajo recombinaban un repertorio de Vp 11 restringido sesgado para reconocer un peptido derivado de MHC de clase II dominante, y que este peptido induce Treg reguladores e induce tolerancia (17). En la presente memoria descriptiva, se muestra que IL-34 se expresaba a alto nivel por injertos tolerados de receptores tratados con AdCD40Ig, y de forma importante, tambien por Treg CD8+CD45RCbajo esplenicos de los mismos receptores. Ademas, la supresion mediada por Treg CD8+CD45RCbajo puede anularse parcialmente por el bloqueo de IL-34. Por tanto, IL-34 posee propiedades inmunosupresoras que no se han estudiado nunca hasta ahora, y actua en sinergia con FGL2, IDO e IFNy en el modelo de CD40Ig de supresion mediada por Treg CD8+CD45RCbajo (16).

Se demostro tambien que esta propiedad era espedfica de IL-34, puesto que se observo que M-CSF no estaba implicado en este modelo. Las evidencias acumuladas sugieren que IL-34 y M-CSF exhiben propiedades espedficas y no redundantes. Esto se resalta por la comparacion del analisis estructural, que muestra que IL-34 y M-CSF se unen diferentemente a CD115 (11, 19). La identificacion mas recientemente de un segundo receptor distinto para IL-34 refuerza esta interpretacion (10). Muy recientemente, se han generado ratones deficientes de IL-34 y han mostrado la desaparicion de ciertos subconjuntos celulares tales como celulas de Langerhan y microglia (12), efectos que no se habfan observado en ratones con desactivacion genica de M-CSF y demostrando no solo un papel de expresion temporal y espacial diferente, sino tambien efectos funcionales diferentes para IL-34 frente a M-CSF.

El valor terapeutico de esta molecula se evidencio con la generacion de un AAV que codifica IL-34. Con este vector, se pudieron mostrar por primera vez las potentes propiedades inmunosupresoras de IL-34 in vitro y, lo mas importante in vivo, donde se obtuvo una supervivencia de aloinjerto indefinida en el 80 % de los receptores cuando se combinaba con una dosis suboptima de rapamicina. Se demostro tambien que tal terapia daba como resultado la anulacion de respuestas inmunitarias alogenicas y la induccion de tolerancia. Estudios anteriores demostraron que tanto M-CSF como IL-34 pueden diferenciar monocitos en macrofagos reguladores (25, 34) y que los macrofagos reguladores inducidos in vitro por M-CSF e IFNy pueden usarse in vivo para prolongar la supervivencia de aloinjerto cardiaco en ratones (34). Otro estudio demostro en ratones que la administracion de M-CSF antes del trasplante puede expandir macrofagos y por tanto limitar la expansion de linfocitos T donantes y la EICH (33). Chen et al. mostraron en ratones tratados con protema IL-34 soluble un aumento de la poblacion de CD11b+ (35). Ademas, otros estudios senalaron una disminucion de pDC y cDC en ratones osteopetroticos deficientes en CSF-1 (21), y un aumento inducido por CFS1 en el numero de DC (20). Sorprendentemente, y en contraposicion con otros estudios, el efecto tolerogenico de IL-34 in vivo despues de la administracion estaba mediado por linfocitos T reguladores. Es mas, se demostro que la tolerancia obtenida en receptores tratados con AAV-IL-34 podfa transferirse a receptores irradiados recien injertados durante al menos 3 generaciones y que este efecto estaba mediado por Treg pero, a pesar del aumento observado de la poblacion de CD11b+, no por macrofagos. Sin embargo, puesto que los Treg no expresan el receptor de IL-34, puede plantearse la hipotesis de que IL-34 mediaba su efecto sobre Treg mediante macrofagos, ya que se ha mostrado en la bibliograffa que los macrofagos reguladores pueden anergizar los linfocitos T efectores CD4 (36), convirtiendo linfocitos T en Treg (37) o inhibiendo otra presentacion de APC (38). No pudo concluirse que IL-34 induzca macrofagos reguladores en este modelo, pero estos son intermedios necesarios en los Treg inducidos por IL-34. Estos resultados destacan las diferencias funcionales de IL-34 y M-CSF y la controversia sobre este tema, ya que varios estudios mostraron el papel proinflamatorio de M-CSF, que aumenta la proliferacion de macrofagos y la acumulacion en aloinjerto renal rechazado (39).

En conclusion, se ha descrito aqu el papel en la tolerancia al trasplante de una nueva citocina, IL-34, y se ha revelado su potencial como terapia en trasplantes o como biomarcador asociado a un mejor pronostico en trasplantes, pero tambien por extension en otras enfermedades. Se ha demostrado tambien por primera vez que esta citocina puede producirse por Treg CD8+ y que puede, a su vez, inducir Treg capaces de induccion de tolerancia de manera dominante, abriendo nuevas posibilidades en la generacion de Treg transferibles a un entorno humano.

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Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un polipeptido de interleucina 34 (IL-34) aislado o un polinucleotido que codifica el mismo para uso en la induccion de tolerancia inmunitaria en un paciente necesitado de ello.

2. Un polipeptido de IL-34 aislado o un polinucleotido que codifica el mismo para uso en la prevencion o reduccion del rechazo de trasplante en un paciente necesitado de ello.

3. El polipeptido de IL-34 aislado o un polinucleotido que codifica el mismo para uso segun la reivindicacion 2, en el que el rechazo de trasplante es rechazo de alotrasplante cardiaco.

4. Un polipeptido de IL-34 aislado o un polinucleotido que codifica el mismo para uso en la prevencion o el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias, respuesta inmunitaria indeseada contra protemas terapeuticas y alergias en un paciente necesitado de ello.

5. El polipeptido de IL-34 aislado o el polinucleotido que codifica el mismo para uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el polipeptido de IL-34 tiene una secuencia que comprende o consiste en la SEQ ID NO: 1 o una secuencia que es al menos un 80 % identica a la secuencia SEQ ID NO: 1.

6. Una composicion farmaceutica o una composicion de kit de piezas que comprende un polipeptido de IL-34 aislado o un polinucleotido que codifica el mismo y un farmaco inmunosupresor.

7. La composicion farmaceutica o la composicion de kit de piezas segun la reivindicacion 6, en las que el farmaco inmunosupresor se selecciona del grupo consistente en citostaticos tales como inhibidores de diana de rapamicina de mairnfero (mTOR) y rapamicina (sirolimus); agentes alquilantes (ciclofosfamidas) y antimetabolitos (azatioprina, mercaptopurina y metotrexato); anticuerpos terapeuticos (tales como anticuerpos monoclonales anti-CD40L, anticuerpos monoclonales anti-IL-2R, anticuerpos monoclonales anti-CD3, globulina antilinfodtica (GAL) y globulina antitimodtica (GAT)); inhibidores de calcineurina (ciclosporina); glucocorticoides y micofenolato de mofetilo.

8. La composicion farmaceutica o la composicion de kit de piezas segun la reivindicacion 7, en las que el farmaco inmunosupresor es rapamicina (sirolimus).

9. La composicion farmaceutica o la composicion de kit de piezas segun una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, para uso en la prevencion o el tratamiento de rechazo de trasplante, enfermedades autoinmunitarias, respuestas inmunitarias indeseadas contra protemas terapeuticas y alergias.

10. Un metodo in vitro para determinar si un paciente esta en riesgo de rechazo de trasplante, enfermedades autoinmunitarias, respuesta inmunitaria indeseada contra protemas terapeuticas o alergias, que comprende una etapa de determinacion del nivel de expresion de IL-34 en una muestra biologica obtenida de dicho paciente, en el que la presencia de IL-34 es indicativa de un riesgo reducido de rechazo de trasplante, enfermedades autoinmunitarias, respuesta inmunitaria indeseada contra protemas terapeuticas o alergias.

11. El metodo segun la reivindicacion 10, en el que el nivel de expresion de IL-34 se determina midiendo la concentracion de IL-34 en dicha muestra biologica.

12. El metodo segun las reivindicaciones 10 u 11, en el que la muestra biologica es una muestra de sangre (muestra de suero o plasma).

13. El metodo para determinar el riesgo segun una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 para ajustar el tratamiento inmunosupresor administrado a un paciente necesitado de ello.