ES2701238T3 - Método de degradación e inactivación de antibióticos en agua mediante enzimas inmovilizadas en soportes funcionalizados - Google Patents
Método de degradación e inactivación de antibióticos en agua mediante enzimas inmovilizadas en soportes funcionalizados Download PDFInfo
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Abstract
Método para la degradación e inactivación de al menos un xenobiótico, estando presente dicho al menos un xenobiótico en un medio acuoso, que comprende las etapas siguientes: a. injertar al menos una enzima sobre un soporte sólido, b. incubar dicho soporte sólido con dicha al menos una enzima en dicho medio acuoso y, c. medir la evolución de la concentración de dicho al menos un xenobiótico, caracterizado por el hecho de que dicha al menos una enzima es Nueva Delhi metalo-ß-lactamasa 1, una lacasa extraída de Pleurotus ostreatus y/o una ß-lactamasa extraída de Pseudomonas aeruginosa, y en que dicho soporte sólido es un portador Kaldnes de lecho móvil en polietileno de alta densidad.
Description
DESCRIPCIÓN
Método de degradación e inactivación de antibióticos en agua mediante enzimas inmovilizadas en soportes funcionalizados
Campo técnico
[0001] La invención se dirige a un método de degradación e inactivación de xenobióticos, preferentemente antibióticos, que están presentes en un medio acuoso. Más particularmente, la invención se dirige a enzimas inmovilizadas en un soporte sólido para degradar e inactivar antibióticos presentes en agua.
[0002] La invención también se dirige a los soportes sólidos, sobre los que se inmovilizan las enzimas capaces de degradar e inactivar antibióticos presentes en un medio acuoso.
Estado de la técnica
[0003] La solicitud de patente de EE.UU. publicada US 2013/0236944 A1 se refiere a métodos para inactivar antibióticos en el ambiente mediante el uso de una enzima, tal como lacasa, lipasa, celulasa, cetorreductasa, plactamasa y/o eritromicina esterasa. Las composiciones descritas tienen como fin descontaminar los ambientes contaminados y prevenir la contaminación ambiental por antibióticos de residuos y efluentes de aguas residuales antes de que alcancen el medio ambiente. La lacasa de la divulgación es de Trametes versicolor (o Coriolus versicolor). La lipasa de la divulgación es de Achromobacter spp. La celulosa de la divulgación es de Trichodrema reesei. Los antibióticos a los que se dirige la lacasa de la divulgación se seleccionan de la familia de las ciclinas (tetraciclina, oxitetraciclina (OTC) y clortetraciclina) o la familia de las p-lactamas, cuya penicilina (amoxicilina), cefalosporina (cefdinir) y/o carbapenem (imipenem). Los antibióticos a los que se dirige la lipasa de la divulgación se seleccionan de la familia de los macrólidos (eritromicina) o de la familia de la p-lactama (amoxicilina). Los antibióticos a los que se dirige la cetorreductasa de la divulgación se seleccionan de la familia de la p-lactama (amoxicilina o imipenem). Los antibióticos a los que se dirige la p-lactamasa se seleccionan de la familia de la plactama (penicilinas, cefalosporinas, cefamicinas o carbapenemos). Los antibióticos a los que se dirige la eritromicina esterasa de la divulgación se seleccionan de la familia de los macrólidos (eritromicina o claritromicina). La divulgación proporciona además un soporte sólido que comprende al menos una enzima inactivadora de antibióticos inmovilizada después. Los soportes sólidos pueden incluir materiales adsorbentes.
Los soportes sólidos pueden ser una membrana en la que se inmovilizan las enzimas mediante enlace covalente.
Las enzimas también pueden inmovilizarse por atrapamiento en gel. El soporte sólido se puede empacar en una columna o usarse en reactores de lecho empacado con aguas ambientales o residuales que se van a tratar fluyendo a través del reactor y estando en contacto con enzimas inmovilizadas. El soporte sólido también se puede acoplar a otros soportes sólidos para mejorar el proceso de inactivación.
[0004] Las ventajas del uso de soportes sólidos se conocen bien. Se aumenta el área de contacto entre los antibióticos que se van a tratar y la enzima, favoreciendo por lo tanto la velocidad y el rendimiento de la reacción enzimática. Además, los soportes sólidos se conocen por ser relativamente resistentes a altas presiones y a altas temperaturas.
[0005] Sin embargo, la preparación de la divulgación anterior, es decir, el empacado en una columna o el uso en los reactores de lecho empacado causaría dificultades tales como la retromezcla con "tapones" del fluido que pasa a través de los reactores, conduciendo a varios problemas, tales como las dificultades para conseguir una distribución uniforme de la carga (es decir, el agua que se va a tratar) en toda la superficie del portador.
Resumen de la invención
[0006] La invención tiene como problema técnico degradar e inactivar antibióticos, tales como antibióticos plactámicos y/o antibióticos de sulfonamida presentes en un medio acuoso, con enzimas inmovilizadas en un soporte sólido. La solución de este problema técnico busca un proceso que facilite los procesos conocidos y/o que prevenga algunos problemas inherentes causados sobre todo por el soporte sólido.
[0007] La presente invención se refiere en un aspecto principal a un método para degradar e inactivar al menos un xenobiótico, conforme a las reivindicaciones anexas 1 a 12.
[0008] La presente invención se refiere en su aspecto principal a un soporte sólido que comprende al menos una enzima adaptada para degradar e inactivar al menos un xenobiótico, estando dicho al menos un xenobiótico presente en un medio acuoso. Dicho soporte sólido es destacable en que dicha al menos una enzima es Nueva Delhi metalo-p-lactamasa 1, una lacasa extraída de Pleurotus ostreatus y/o una p-lactamasa extraída de
Pseudomonas aeruginosa, y en que dicho soporte sólido es el portador Kaldness de lecho móvil en polietileno de alta densidad.
[0009] La presente invención se refiere además en un primer aspecto auxiliar a un método para degradar e inactivar al menos un xenobiótico, estando dicho al menos un xenobiótico presente en un medio acuoso. Dicho método comprende las etapas siguientes:
a. incubar una lacasa extraída de Pleurotus ostreatus en dicho medio acuoso y,
b. medir la evolución de la concentración de dicho al menos un xenobiótico.
[0010] Dicho método es destacable en que dicha lacasa extraída de Pleurotus ostreatus se usa en su forma pura.
[0011] En una forma de realización, dicha etapa de incubación se realiza a temperatura ambiente y bajo agitación, preferentemente a 30, 50, 100, 200 y 300 rpm, más preferentemente a 100 rpm.
[0012] En una forma de realización, la etapa de medición de la evolución de la concentración de dicho al menos un xenobiótico se realiza mediante mediciones de absorbancia UV o por cromatografía líquida/espectrometría de masas en tándem.
[0013] En una forma de realización, dicho al menos un xenobiótico es al menos un antibiótico.
[0014] En una forma de realización, dicho al menos un antibiótico es un antibiótico elegido de la clase de antibióticos de sulfonamida.
[0015] En una forma de realización, dicho antibiótico es sulfametoxazol.
[0016] En una forma de realización, dicha lacasa extraída de Pleurotus ostreatus se inmoviliza en un soporte sólido, preferentemente un portador de lecho móvil.
[0017] En una forma de realización, dicho portador de lecho móvil está en polietileno de alta densidad.
[0018] En una forma de realización, dicho portador de lecho móvil es un biochip Kaldnes.
[0019] En una forma de realización, dicho portador de lecho móvil se funcionaliza con la deposición de una capa que contiene grupos reactivos, tales como grupos epoxi o quinona, antes de dicho injerto de dicha lacasa extraída de Pleurotus ostreatus.
[0020] En una forma de realización, dicha etapa de funcionalización se realiza mediante tratamiento de superficie, con dicho al menos un precursor, de dicho portador de lecho móvil por deposición de plasma frío a presión atmosférica o por recubrimiento, siendo dicho recubrimiento preferentemente un proceso de autopolimerización.
[0021] En una forma de realización, dicho al menos un precursor es poliglicidil metacrilato, dopamina, anhídrido maleico/viniltrimetoxisilano, o dopamina acrilamida/viniltrimetoxisilano, preferentemente poliglicidil metacrilato o dopamina.
[0022] En una forma de realización, dicha inmovilización de dicha lacasa extraída de Pleurotus ostreatus comprende además la etapa de saturación del soporte sólido por una capa de antiadhesión de microorganismos después de dicha inmovilización de dicha lacasa extraída de Pleurotus ostreatus sobre dicho soporte sólido.
[0023] En una forma de realización, dicha capa de antiadhesión de microorganismos comprende Tween 20.
[0024] La presente invención se refiere además, en un segundo aspecto auxiliar, a un método para degradar e inactivar al menos un antibiótico, estando dicho al menos un antibiótico presente en un medio acuoso. Dicho método comprende las etapas siguientes:
a. incubar Nueva Delhi metalo-p-lactamasa 1 en dicho medio acuoso y,
b. medir la evolución de la concentración de dicho al menos un antibiótico.
[0025] Dicho método es destacable en que dicho al menos un antibiótico es un antibiótico elegido entre la clase de p-lactamas, polipéptidos, lincosanidas, tetraciclinas, sulfonamidas y/o macrólidos.
[0026] En una forma de realización, dicha Nueva Delhi metalo-p-lactamasa 1 es producida por una bacteria Escherichia coli del tipo BL212D3.
[0027] En una forma de realización, dicha bacteria Escherichia coli del tipo BL21 2D3 se ha transformado con un plásmido, preferentemente un plásmido pOPINF.
[0028] En una forma de realización, dicho plásmido pOPINF comprende el gen codificante de la Nueva Delhi metalo-p-lactamasa 1 de Klebsiella pneumonia.
[0029] En una forma de realización, dicho antibiótico elegido entre la clase de p-lactamas se elige entre penicilina y carbapanem, preferentemente amoxicilina y/o imipenem.
[0030] En una forma de realización, dicho antibiótico elegido entre la clase de polipéptidos es bacitracina.
[0031] En una forma de realización, dicho antibiótico elegido entre la clase de linconsanidas es lincomicina.
[0032] En una forma de realización, dicho antibiótico elegido entre la clase de tetraciclinas es oxitetraciclina.
[0033] En una forma de realización, dicho antibiótico elegido entre la clase de sulfonamida es sulfametoxazol y/o trimetoprima.
[0034] En una forma de realización, dicho antibiótico elegido entre la clase de macrólido es tilosina y/o eritromicina.
[0035] En una forma de realización, la concentración de dicho al menos un antibiótico es de 100 pg-ml'1.
[0036] En una forma de realización, la concentración de dicha Nueva Delhi metalo-p-lactamasa 1 en dicho medio acuoso es de 300 pg-ml'1.
[0037] En una forma de realización, dicha etapa de incubación se realiza a temperatura ambiente y bajo agitación, preferentemente a 30, 50, 100, 200 y 300 rpm, más preferentemente a 100 rpm.
[0038] En una forma de realización, dicha etapa de incubación se realiza durante 1 hora.
[0039] En una forma de realización, dicho medio acuoso comprende agua desionizada.
[0040] En una forma de realización, dicho medio acuoso comprende además ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfonico (HEPES) como un agente tampón a una concentración de 12,5 mM.
[0041] En una forma de realización, la etapa de medición de la evolución de la concentración de dicho al menos un antibiótico se realiza mediante mediciones de absorbancia UV o mediante cromatografía líquida/espectrometría de masas en tándem.
[0042] Todas las características de los aspectos de la invención descritos anteriormente se pueden combinar o sustituir entre sí.
Breve descripción de los dibujos
[0043] A continuación, describimos brevemente la figura según las formas de realización de la presente invención. Se proporcionan detalles adicionales en la descripción detallada de las formas de realización. La figura tiene el fin de ilustrar la invención y no debería entenderse en un sentido limitativo.
Figura 1: Imagen obtenida por microscopía electrónica de barrido (SEM) de biochips Kaldnes biofuncionalizados con p-lactamasa extraída de Pseudomonas aeruginosa (capa a base de PGMA); figura 1a, sin Tween 20; figura 1b, con Tween 20 (5%) después de 196 h de contacto con una solución de microorganismos (Aspergillus nidulans y Pseudomonas aeruginosa).
Figura 2: Imagen obtenida por SEM de biochips Kaldnes biofuncionalizados con p-lactamasa extraída de Pseudomonas aeruginosa (dopamina como precursor de la capa); figura 2a, sin Tween 20; figura 2b, con Tween 20 (5%) después de 196 h de contacto con una solución de microorganismos (Aspergillus nidulans y Pseudomonas aeruginosa).
Figura 3: Imagen obtenida por SEM de biochips Kaldnes biofuncionalizados con lacasa extraída de Pleurotus ostreatus (capa a base de PGMA); figura 3a, sin Tween 20; figura 3b, con Tween 20 (5%) después de 196 h de contacto con una solución de microorganismos (Aspergillus nidulans y Pseudomonas aeruginosa).
Figura 4: Imagen obtenida por SEM de biochips Kaldnes biofuncionalizados con lacasa extraída de Pleurotus ostreatus (dopamina como precursor de capa); figura 4a, sin Tween 20; figura 4b, con Tween 20 (5%) después de 196 h de contacto con una solución de microorganismos (Aspergillus nidulans y Pseudomonas aeruginosa).
Descripción detallada de las formas de realización
[0044] La descripción siguiente es meramente de naturaleza ejemplar y no pretende limitar de ninguna manera las presentes instrucciones, solicitud o usos.
[0045] La inmovilización de la enzima en el soporte sólido es útil porque mejora las propiedades de la enzima. Por ejemplo, se pueden demostrar las ventajas siguientes:
1) se limita o se ralentiza considerablemente la autolisis de la enzima,
2) se protege la enzima del entorno químico y biológico donde se coloca el soporte,
3) se aumenta la durabilidad de la enzima y,
4) se aumenta la actividad de la enzima.
[0046] La última característica (aumento de la actividad enzimática) se debe probablemente al hecho de que, en primer lugar, la enzima es más estable cuando se injerta en un soporte sólido debido a una mayor rigidez, y a que, en segundo lugar, hay más enzimas dispuestas para reaccionar con un sustrato. En el soporte sólido, la enzima está en una configuración preparada para realizar la reacción enzimática, mientras que en masa, algunas enzimas pueden estar en un estado activado mientras que algunas otras no están activadas.
[0047] La Nueva Delhi metalo-p-lactamasa 1 (NDM-1) es una enzima de la familia metalo-p-lactamasa. Está codificada por el gen blandm-í que se aisló de bacterias causantes de problemas de multirresistencia en infecciones hospitalarias. De hecho, esta enzima se considera como una carbapenemasa. Los estudios de Kumarasamy K. K. et al. (Lancet Infect. Dis., 2010, 10, 597-602) han mostrado que la cepa de Klebsiella neumonía positiva para NDM-1 o la cepa de Escherichia coli positiva para NDM-1 son altamente resistentes a todos los antibióticos evaluados excepto tigeciclina y colistina.
[0048] Pseudomonas aeruginosa es una bacteria nosocomial muy prevalente. La p-lactamasa extraída de esta bacteria proporciona un gran panel de mecanismos que confieren resistencia a antibióticos, como se muestra en los estudios de Livermore D. M. (Antimicrobial Resistance, 2002, 34, 634-640).
[0049] Estas características negativas anteriormente mencionadas de la NDM-1 y la p-lactamasa extraída de Pseudomonas aeruginosa podrían emplearse así para degradar los antibióticos p-lactámicos encontrados en un medio acuoso.
[0050] Los estudios de Migliorie L. et al. (Journal of Hazardous Materials, 2012, 215-216, 227-232) demuestran que la oxitetraciclina (OTC) puede ser biodegradada por la lacasa cruda de Pleurotus ostreatus. Sin embargo, la lacasa en su forma purificada, es decir, extraída del hongo, es incapaz de degradar la OTC en ausencia de micelios.
[0051] La invención consiste, por lo tanto, en inmovilizar la Nueva Delhi metalo-p-lactamasa 1 (NDM-1), la lacasa extraída de Pleurotus ostreatus y/o la p-lactamasa extraída de Pseudomonas aeruginosa en el portador Kaldness de lecho móvil que se describe en la patente europea publicada EP 0 575 314 B1 y reduce los riesgos de obstrucción que son inherentes al uso de reactores de lecho empacado.
[0052] La solicitud de patente internacional publicada WO 2013/149662 A1 describe portadores de biopelícula de lecho móvil con la forma de portadores de tipo Kaldnes e inoculados con una o más cepa(s) microbiana(s). Estos
portadores se usan en el reactor de biopelícula de lecho móvil (MBBR). El papel principal de los portadores en un MBBR es proporcionar un soporte para el crecimiento de comunidades de microorganismos en su superficie. Los portadores ofrecen una solución óptima en cuanto a la proporción entre el volumen y la superficie que están disponibles para el crecimiento de los microorganismos en el portador mismo. Los portadores de tipo Kaldnes están hechos también de material biodegradable, tal como bioplásticos, y son, por lo tanto, una fuente de carbono para el microorganismo en crecimiento.
[0053] Preferentemente, dichos portadores que componen el reactor de lecho móvil están en polietileno de alta densidad, tal como un biochip Kaldnes.
[0054] Con fines comparativos, las enzimas anteriormente mencionadas se anclarán también en otro soporte sólido, tal como espejo de acero inoxidable de tipo 304 o membrana de poliamida de nailon.
[0055] Los portadores Kaldnes tienen la forma de un disco con una cuadrícula tridimensional dentro del disco y aletas en el exterior. El área superficial es equivalente a 75 cm2.
[0056] El área superficial del espejo de acero inoxidable de tipo 304 es equivalente a 3,14 cm2.
[0057] El área superficial de la membrana de poliamida de nailon es equivalente a 2,25 cm2.
Funcionalización del soporte sólido
[0058] Los portadores Kaldnes se bioactivan con las enzimas a través de enlaces covalentes resistentes. Antes de la inmovilización de las enzimas, se funcionaliza la superficie de los portadores Kaldnes.
[0059] El tratamiento de superficie de los portadores Kaldnes se puede realizar a través de la deposición de una capa funcionalizada por un método de deposición de plasma frío a presión atmosférica, por ejemplo con el uso de glicidil metacrilato para generar una capa de poliglicidil metacrilato (PGMA) funcionalizado con epoxi.
[0060] El tratamiento de superficie de los portadores Kaldnes también puede realizarse mediante el revestimiento, preferentemente por un proceso de autopolimerización, más preferentemente por autopolimerización de dopamina. Por ejemplo, el proceso de autopolimerización se puede realizar por inmersión de los portadores Kaldnes bajo agitación (a 150 rpm) en una solución (a pH = 8,5) que comprende hidrocloruro de dopamina (2 mgml-1) e hidrocloruro de tris(hidroximetil)aminometano - Tris-HCl (10 mM). Después de 4 horas de agitación, los portadores se enjuagan 5 veces con agua MilliQ®, se secan y se almacenan a 4°C. Las superficies funcionalizadas resultantes presentan grupos reactivos de quinona.
Biofuncionalización de los portadores activados
[0061] Estas superficies activas se pueden bioconjugar posteriormente con la enzima (NDM-1, lacasa extraída de Pleurotus ostreatus, y/o p-lactamasa extraída de Pseudomonas aeruginosa).
[0062] Las enzimas se anclan por unión covalente a través de una reacción con grupos funcionales. Esto asegura el anclaje fuerte de la enzima a la superficie. También es posible que estén implicadas interacciones más débiles (unión no covalente) entre la enzima y la superficie.
[0063] Para realizar el proceso de inmovilización, las enzimas se solubilizan en una solución tampón. La solución tampón es solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se añade la enzima a una concentración final de 1 mg ml-1. Los portadores Kaldnes funcionalizados se añaden entonces a esta solución de incubación y la funcionalización (es decir, la formación de los enlaces peptídicos) se consigue después de agitar a 100 rpm durante 1 hora. Luego, los soportes sólidos se enjuagan cinco veces con PBS y se secan.
[0064] Con el uso de dopamina como precursor de capa, la biofuncionalización del soporte sólido por la enzima es posible solo con los portadores Kaldnes. Ninguna enzima se ha injertado exitosamente en el espejo de acero inoxidable de tipo 304, aunque aquellas superficies se han funcionalizado con dopamina.
[0065] Hay que tener en cuenta que los portadores pueden biofuncionalizarse con varias enzimas diferentes, por ejemplo, con la lacasa extraída de Pleurotus ostreatus y con la p-lactamasa extraída de Pseudomonas aeruginosa.
Saturación de los portadores con Tween 20
[0066] Los portadores Kaldnes bioactivados se saturan adicionalmente con una capa de antiadhesión de microorganismos. Las capas de antiadhesión de microorganismos comprenden Tween 20 y tienen como función limitar la adhesion de microorganismos en la superficie de los portadores Kaldnes bioactivados.
[0067] El fin de esta etapa de saturación es proteger la enzima contra el metabolismo no deseado por microorganismos. El fin de esta etapa de saturación también es proteger la enzima contra la inhibición/neutralización provocada por la acumulación de microorganismos.
Cuantificación y distribución de las proteínas
[0068] La cuantificación de proteínas se realiza en los portadores Kaldnes bioactivados mediante un ensayo colorimétrico. El ensayo colorimétrico es el RC DC™ (Reducing agent and Detergent Compatible) Protein Assay disponible de Bio-Rad. El ensayo se consigue por retrotitulación en la solución de incubación que contiene la enzima solubilizada.
[0069] También se realiza la determinación de la distribución de las enzimas en los portadores Kaldnes bioactivados. El ensayo es el ensayo LavaPurple™, que es una tinción de proteína total de color morado oscuro que utiliza el proceso reversible de tinción fluorescente de enzimas con epicocconona y está disponible en GE Healthcare Life Sciences. En el presente caso, este ensayo LavaPurple™ se utiliza para mapear la superficie de los biochips por coloración de las enzimas inmovilizadas.
[0070] El ensayo LavaPurple™ también se empleó para determinar la resistencia de los portadores biofuncionalizados al flujo laminar de agua.
Medida de la actividad enzimática
[0071] Una vez los portadores Kaldnes se han activado según el protocolo anterior, se mide la actividad enzimática. Se han evaluado dos antibióticos presentes en un medio acuoso. Un antibiótico elegido de la clase de los antibióticos p-lactámicos, es decir, amoxicilina, y un antibiótico elegido de la clase de antibióticos de las sulfonamidas, es decir, sulfametoxazol, se han usado para determinar el potencial de los portadores Kaldnes bioactivados.
[0072] Una muestra de agua del grifo, previamente filtrada en una unidad de filtro de jeringa (tamaño de los poros de 0,22 pm, desechable) y con HEPES (12,5 mM), y los antibióticos a una concentración de 100 pg/ml.
[0073] Con fines comparativos, se evaluará la degradación del antibiótico con la enzima libre. Se prepara la muestra de agua del grifo, previamente filtrada en una unidad de filtro de jeringa (tamaño de los poros de 0,22 pm, desechable) y con HEPES (12,5 mM), y los antibióticos a una concentración de 100 pgml-1.
[0074] Las mediciones de absorbancia UV se consiguen para determinar la evolución de la concentración de los antibióticos. La amoxicilina es un compuesto que absorbe a 210 nm y el sulfametoxazol es un compuesto que absorbe a 260 nm. La absorbancia, y por tanto la concentración, se determina cada 24 horas.
Resultados
[0075] Las tablas siguientes identifican los resultados de los diferentes experimentos con respecto a la degradación de los antibióticos.
Tabla I: Cantidad de amoxicilina degradada cuando se emplea la p-lactamasa extraída de Pseudomonas aeruginosa (capa a base de PGMA).
Soporte sólido Tween Cantidad de Duración de la Cantidad de amoxicilina 20 (5%) enzima (mg) actividad (días) degradada (pg) 1 Espejo de acero No 0,240±0,005 12 72±9 inoxidable de tipo 304
2 / No 0,240±0,001 2 50±9 3 Kaldnes No 2,2±0,1 11 955±63 4 / No 2,2±0,05 2 79±2
5 Espejo de acero Sí 0,246±0,0008 16 117±2 inoxidable de tipo 304
6 Kaldnes Sí 2±0,01 24 1240±50
[0076] Los experimentos se repitieron 3 veces para los biochips Kaldnes y 9 veces para el espejo de acero. La cantidad de amoxicilina degradada corresponde a la cantidad total de amoxicilina degradada integrada a través de toda la duración de la actividad.
[0077] La tabla I indica claramente que cuando la enzima p-lactamasa extraída de Pseudomonas aeruginosa se ancla a través de una capa a base de PGMA que se aplicó en el soporte sólido por recubrimiento de plasma frío a presión atmosférica, la cantidad de enzima inmovilizada fue aproximadamente 10 veces más importante en el portador Kaldnes que en otro soporte (es decir, espejo de acero inoxidable de tipo 304).
[0078] La cantidad de antibióticos degradados también se elevó significativamente cuando la enzima se inmoviliza en el portador Kaldnes.
[0079] De hecho, usando un soporte Kaldnes, se ha degradado una concentración de amoxicilina 12 veces superior a cuando se usa la enzima en su forma libre (ver entradas 3 y 4). En comparación, el uso de un soporte de acero no mejoró el proceso de degradación del antibiótico en relación con el uso de la enzima libre (entradas 1 y 2).
[0080] La cantidad de enzima libre que se ha estudiado corresponde a la cantidad de la enzima que se ha inmovilizado en el soporte sólido y determinado por retrotitulación de la solución de incubación durante la biofuncionalización de los soportes sólidos.
[0081] Esto muestra la eficacia del portador Kaldnes para mejora la degradación enzimática de la amoxicilina.
[0082] La presencia de Tween 20 con la p-lactamasa en el portador Kaldnes tiene como efecto aumentar el tiempo de actividad del soporte sólido bioactivado.
Tabla II: Cantidad de sulfametoxazol degradado cuando se emplea la lacasa extraída de Pleurotus ostreatus (capa a base de Pg Ma ).
Soporte sólido Tween Cantidad de Duración de la Cantidad de sulfametoxazol 20 enzima (mg) actividad (días) degradado (pg) (5%)
1 Espejo de acero No 0,039±0,008 12 244±18 inoxidable de tipo
304
2 / No 0,040±0,005 2 120±5
3 Kaldnes No 5,8±0,02 11 2376±100 4 / No 5,7±0,008 2 183±10
5 Espejo de acero Sí 0,038±0,0005 27 761 ±88 inoxidable de tipo
304
6 Kaldnes Sí 5,6±0,1 27 6562±363
[0083] Los experimentos se repitieron 3 veces para los biochips Kaldnes y 9 veces para el espejo de acero. La cantidad de sulfametoxazol degradado corresponde a la cantidad total de sulfametoxazol degradado integrada a través de toda la duración de la actividad.
[0084] La tabla II indica claramente que cuando la enzima lacasa extraída de Pleurotus ostreatus se ancla a través de una capa a base de PGMA que se aplicó en el soporte sólido por recubrimiento de plasma frío a presión atmosférica, la cantidad de enzima inmovilizada fue aproximadamente 150 veces más importante en el portador Kaldnes que en otro soporte (es decir, espejo de acero inoxidable de tipo 304). La cantidad de antibióticos degradados también se elevó significativamente cuando la enzima se inmoviliza en el portador Kaldnes.
[0085] Con la lacasa, la inmovilización es un parámetro importante para mejorar la actividad de la enzima. De hecho, cuando se usa la enzima en su forma libre, no da un alto nivel de antibióticos degradados.
[0086] La presencia de Tween 20 con la lacasa en el portador Kaldnes tiene como efecto aumentar el tiempo de actividad del soporte sólido bioactivado.
Tabla III: Cantidad de amoxicilina degradada cuando se emplea la p-lactamasa extraída de Pseudomonas aeruginosa (dopamina como precursor de capa).
Soporte Tween 20 Cantidad de Duración de la Cantidad de amoxicilina sólido (5%) enzima (mg) actividad (días) degradada (pg) 1 Kaldnes No 1,5±0,1 13 2260±18 2 Kaldnes Sí 1,38±0,03 17 2502±110 3 / No 1,5±0,05 3 279±31
[0087] Los experimentos se repitieron 3 veces. La cantidad de amoxicilina degradada corresponde a la cantidad total de amoxicilina degradada integrada a través de toda la duración de la actividad.
[0088] La tabla III indica claramente que la amoxicilina se degrada aproximadamente 8 a 9 veces de manera más eficaz cuando la p-lactamasa se inmoviliza en portadores Kaldnes que cuando la p-lactamasa se usa en su forma libre.
[0089] La presencia de una capa de antiadhesión de microorganismos también mejora la reacción de degradación realizada por la enzima inmovilizada.
Tabla IV: Cantidad de sulfametoxazol degradado cuando se emplea la lacasa extraída de Pleurotus ostreatus (dopamina como precursor de capa).
Soporte Tween 20 Cantidad de Duración de la Cantidad de sulfametoxazol sólido (5%) enzima (mg) actividad (días) degradado (pg) 1 Kaldnes No 2,15±0, 15 5717±193 2 Kaldnes Sí 2,01±0,05 19,8 6101±43 3 / No 2,1±0,010 3 1090±56
[0090] Los experimentos se repitieron 3 veces. La cantidad de sulfametoxazol degradado corresponde a la cantidad total de sulfametoxazol degradado integrada a través de toda la duración de la actividad.
[0091] De forma similar a los resultados obtenidos cuando se emplea la p-lactamasa, la tabla IV indica claramente que la amoxicilina se degrada aproximadamente 8 a 9 veces de manera más eficaz cuando la lacasa se inmoviliza en portadores Kaldnes que cuando la lacasa se usa en su forma libre.
[0092] La presencia de una capa de antiadhesión de microorganismos también mejora la reacción de degradación realizada por la enzima inmovilizada.
Tabla V: Cantidad de amoxicilina degradada cuando se emplea Nueva Delhi metalo-p-lactamasa 1 (NDM-1) inmovilizada en biochips Kaldnes.
Comentarios Tween 20 Cantidad de Duración de la Cantidad de amoxicilina (5%) enzima (mg) actividad (días) degradada (pg) 1 dopamina como No 1,985±0,1 10 3021±51 precursor de capa
2 capa a base de Sí 1,985±0,1 22 3502±191 PGMA
3 enzima en su forma No 2±0,08 4 390±45
libre
[0093] Los experimentos se repitieron 3 veces. La cantidad de amoxicilina degradada corresponde a la cantidad total de amoxicilina degradada integrada a través de toda la duración de la actividad.
[0094] La tabla V indica los resultados obtenidos cuando la NDM-1 se ha inmovilizado en el portador Kaldnes. Cuando se inmoviliza la NDM-1, la cantidad de amoxicilina que se degrada es aproximadamente 8 veces más importante que cuando la enzima se usa en su forma libre.
[0095] Se descubrió además una característica interesante de la enzima NDM-1. De hecho, no solo la amoxicilina (un antibiótico p-lactámico) se puede degradar, sino también varios otros antibióticos de otras familias de antibióticos.
[0096] Para demostrar estas nuevas propiedades de la enzima NDM-1, se ha transformado una bacteria E. coli del tipo BL21 2D3 con el plásmido poPINF que contiene el gen que codifica la NDM-1 de K. pneumoniae. La producción de proteínas realizada como se describe por Green V.L. et al. (Acta Crystallogr. 2011, F67, 1160 1164) con pocas modificaciones: se añade una etapa adicional de congelación antes de la lisis celular con la prensa francesa. El aislamiento y la purificación de la NDM-1 se realizan solo con una columna HisTrap FF (GE Healthcare). Tres lavados en unidades para filtración con centrífuga Amicon® Ultra-4 3,000 NMWL (1000 x g durante 15 min) permiten eliminar el exceso de imidazol. Las enzimas se resuspenden luego en PBS.
[0097] Se han realizado los experimentos de degradación utilizando una concentración de enzima libre NDM-1 de 300 pgml'1 en un medio acuoso que comprende agua desionizada y 12,5 mM de HEPES. Se añade antibiótico a una concentración final de 100 pgm l'1 (volumen final: 1 ml). Los ensayos de degradación se realizan bajo agitación de 100 rpm a temperatura ambiente durante 1 hora. Las mediciones de absorbancia UV se consiguen para determinar la evolución de la concentración de los antibióticos en el medio.
Tabla VI: Lista de antibióticos degradados por la enzima NDM-1.
Antibiótico Familia Cantidad degradada tras 1 Autolisis de antibiótico tras 1 hora hora (pg) (pgml'1)
1 amoxicilina penicilina (p- 10±2 0
lactama)
2 imipenem carbapanem (p- 9±1,4 0
lactama)
3 bacitracina polipéptido 5±0,8 0
4 lincomicina lincosanida 5±1,5 0,01
5 oxitetraciclina tetraciclina 4,1 ±2,1 0,02
6 sulfametoxazol sulfonamida 3,2±0,8 0
7 trimetoprima sulfonamida 2,5±0,95 0,01
8 tilosina macrólido 7,4±1,1 0,01
9 eritromicina macrólido 6,8±2,3 0
[0098] Los experimentos se repitieron 4 veces.
[0099] Los resultados indican que la NDM-1 es capaz de degradar 9 antibióticos de 6 familias diferentes. No solo pueden degradarse p-lactamas (entradas 1 y 2), sino también antibióticos de polipéptido, lincosanida, tetraciclina, sulfonamida y macrólido.
[0100] Los portadores Kaldnes pueden funcionalizarse además mediante diferentes enzimas, según el mismo protocolo explicado anteriormente. El antibiótico que se estudia cuando se usan juntas tanto la p-lactamasa como la lacasa es la amoxicilina.
Tabla VII: Cantidad de amoxicilina degradada cuando se emplean tanto la p-lactamasa (Lact.) extraída de Pseudomonas aeruginosa como la lacasa (Lac.) extraída de Pleurotus ostreatus (capa a base de PGMA).
Soporte Tween 20 Cantidad de enzima Tiempo de Cantidad de amoxicilina sólido (5%) (mg) actividad (días) degradada (pg) 1 Kaldnes No Lac: 5,6±0,02 24 1925±85
Lact: 2,2±0,1
2 Kaldnes Sí Lac: 6,8±0,2 27 2239±41
Lact: 2±0,01
[0101] Los experimentos se repitieron 3 veces.
Tabla VIII: Cantidad de amoxicilina degradada cuando se emplean tanto la p-lactamasa (Lact.) extraída de Pseudomonas aeruginosa como la lacasa (Lac.) extraída de Pleurotus ostreatus (dopamina como precursor de capa).
Soporte Tween 20 Cantidad de Tiempo de Cantidad de amoxicilina sólido (5%) enzima (mg) actividad (días) degradada (pg) 1 Kaldnes No Lac: 2,15±0,09 15,4 2623±107
Lact: 1,5±0,1
2 Kaldnes Sí Lac: 2,01±0,05 20,8 3101±95
Lact: 1,38±0,03
[0102] Los experimentos se repitieron 3 veces.
Resultados con condiciones limitantes de sustrato
[0103] Los resultados presentados en las tablas precedentes se refieren a los resultados de la degradación de antibióticos en un medio acuoso a una concentración de 100 pgm l'1. Esta concentración es 1000 veces superior a la concentración que puede encontrarse en el medio acuoso del ambiente natural.
[0104] En la práctica, los portadores Kaldnes de la presente invención se diseñan para ser eficaces para tratar medios acuosos que son en particular aguas residuales industriales, aguas de proceso recicladas, aguas residuales de plantas farmacéutica, aguas residuales municipales, aguas residuales sanitarias, aguas residuales, fangos, aguas residuales de granjas, aguas residuales de granjas animales, aguas residuales de criaderos de peces, aguas residuales de sitios agrícolas, aguas residuales hospitalarias, aguas residuales de centros médicos, aguas residuales de asilos de ancianos, aguas residuales urbanas, aguas residuales colectivas, efluentes de plantas de tratamiento de aguas residuales o estiércol agrícola.
[0105] Los portadores Kaldnes biofuncionalizados con una o más enzimas se evaluaron así en un medio con una concentración de 100 ngml'1 (es decir, 1000 veces menos de antibióticos que en los experimentos precedentes).
[0106] Se sabe que una reacción enzimática está limitada por una concentración mínima bajo la que la probabilidad de la interacción entre la enzima y el sustrato es cero. La concentración por debajo de la concentración mínima no puede ser tratada por el sistema. Sin embargo, si la cantidad de enzima aumenta en los medios, por ejemplo mediante el aumento del número de biochips o portadores bioactivados, el tratamiento de medios que contienen solo una dosis débil de antibiótico (es decir, 100 ngml-1) podría tratarse.
[0107] La detección de la concentración de los antibióticos a esta dosis débil se consigue por cromatografía líquida/espectrometría de masas en tándem (LC/MS-MS).
Tabla IX: Cantidad de antibióticos degradados (Ab) cuando se usa una concentración débil de antibióticos (precursor de capa: dopamina; soporte sólido: biochips Kaldnes)
Enzima inmovilizada Número de portador Cantidad Cantidad inicial de Rendimiento de Kaldnes funcionalizado de enzima antibióticos (ngml-1) degradación Ab (mg)
1 p-lactamasa 7 10,5 191 > 99,5 % 2 lacasa 7 15,1 84,8 94,4 % 3 p-lactamasa Lac. 4 Lac. 191 > 99,5 % lacasa Lact. 3 La
.
[0108] Los experimentos se repitieron 3 veces.
[0109] Estos resultados anteriores indican que cuando varios portadores Kaldnes bioactivados se usan juntos (por ejemplo, 7 biochips juntos), el sistema entero es capaz de degradar una dosis débil de antibióticos.
[0110] Los ensayos se realizan a temperatura ambiente con una agitación de 100 rpm durante 1 hora.
[0111] El antibiótico que se estudia cuando se usa la p-lactamasa es la amoxicilina.
[0112] El antibiótico que se estudia cuando se usa la lacasa es el sulfametoxazol.
[0113] El antibiótico que se estudia cuando se usan juntas tanto la p-lactamasa como la lacasa es la amoxicilina.
Efecto de Tween 20
[0114] El efecto de la presencia de Tween 20 (polisorbato 20) se estudió además en detalle con biochips Kaldnes bioactivados.
[0115] Se preparó una solución que comprende un hongo Aspergillus nidulans y una bacteria Pseudomonas aeruginosa. Los cultivos biológicos se centrifugan y se lavan dos veces en PBS. Los sobrenadantes se eliminaron y los sedimentos se suspendieron en PBS. Los sedimentos suspendidos se incubaron con los biochips Kaldnes bioactivados para evaluar la adherencia de los microorganismos sobre estos biochips Kaldnes bioactivados. La incubación se realiza sin agitación para favorecer la adhesión y se realiza durante 196 horas.
[0116] La adherencia se controló por análisis de microscopía electrónica de barrido (SEM).
[0117] Por un lado, las figuras 1 (biochips Kaldnes biofuncionalizados con p-lactamasa extraída de Pseudomonas aeruginosa) y 3 (biochips Kaldnes biofuncionalizados con lacasa extraída de Pleurotus ostreatus) demuestran que cuando se emplea una capa a base de PGMA para funcionalizar los biochips Kaldnes, la saturación de superficies con el Tween 20 es esencial para prevenir la adhesión de Aspergillus nidulans. No se observa ninguna adhesión de las bacterias Pseudomonas aeruginosa con o sin saturación de superficies con tween 20.
[0118] Por otro lado, las figuras 2 (p-lactamasa extraída de Pseudomonas aeruginosa) y 4 (lacasa extraída de Pleurotus ostreatus) demuestran que cuando se emplea la dopamina como precursor de capa para funcionalizar los biochips Kaldnes, se requiere la saturación de superficies con Tween 20 para prevenir la adhesión del hongo Aspergillus nidulans a la superficie. No se observa ninguna adhesión de las bacterias Pseudomonas aeruginosa con o sin saturación de superficies con tween 20.
[0119] Se obtuvieron resultados similares con un soporte sólido de espejo de acero inoxidable de tipo 304 funcionalizado con PGMA o dopamina autopolimerizada. La incubación también se realizó sin agitación para favorecer la adhesión y se realizó durante 96 horas.
Resistencia al flujo de agua
[0120] Los soportes sólidos (portador Kaldnes o espejo de acero inoxidable de tipo 304) se han evaluado con flujo laminar de agua. El flujo fue de 30 kmh"1. El ensayo LavaPurple™ se usó para mapear las superficies de los soportes sólidos después de una cantidad determinada de tiempo.
[0121] Los ensayos de degradación de antibióticos se realizaron sobre los portadores para medir la actividad después del ensayo con flujo laminar.
[0122] Para los soportes funcionalizados con PGMA, los ensayos se realizaron después de 10 días.
[0123] Para los soportes funcionalizados con dopamina, los ensayos se realizaron después de 6 días.
[0124] En todos los casos, se ha observado que la actividad de los biochips se ha conservado.
Almacenamiento de los portadores Kaldnes
[0125] Los portadores Kaldnes biofuncionalizados, después de secarse, se han mantenido en la nevera a 4°C. Los ensayos de degradación de antibióticos se realizaron sobre los portadores para medir la actividad.
Tabla X: Duración de la conservación de portadores Kaldnes funcionalizados con PGMA a 4°C
Kaldnes PGMA Kaldnes PGMA enzima Kaldnes PGMA enzima Tween 20 p-lactamasa 1 mes 3 meses 2 semanas
lacasa 1 mes 4 meses 1 mes NDM-1 1 mes 2 meses 2 semanas
Tabla XI: Duración de la conservación de portadores Kaldnes funcionalizados con dopamina a 4°C Kaldnes Kaldnes dopamina enzima Kaldnes dopamina enzima Tween dopamina 20
p-lactamasa 1 mes 2 meses 2 semanas lacasa 1 mes 3 meses 1 mes
NDM-1 3 semanas 1 mes 2 semanas
[0126] En ambos casos (tablas X y XI), se ha observado que los portadores Kaldnes biofuncionalizados con las enzimas conservan la actividad enzimática para la reacción de degradación de antibióticos.
Evaluación de la toxicidad de los productos generados por la degradación
[0127] La toxicidad de los metabolitos secundarios generados se estima por ensayos de ecotoxicidad para probar la capacidad del proceso para degradar e inactivar antibióticos.
[0128] Para esto, los ensayos se efectuaron en los medios de degradación antes (T0) y después de la metabolización por enzimas inmovilizadas en Kaldnes funcionalizados con PGMA y DOPA tras 30 min, 1 h y 24 h de contacto.
[0129] La toxicidad de los sobrenadantes se estimó mediante la realización de los siguientes ensayos:
- Ensayo de toxicidad aguda en microalgas Selenastrum capricornutum según ISO 8692: 2012 calidad deI agua - ensayo de inhibición de crecimiento en algas de agua dulce con algas verdes unicelulares.
- Ensayo de toxicidad aguda en Daphnia según ISO 6341: 2012 calidad del agua - determinación de la inhibición de la movilidad de Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) - ensayo de toxicidad aguda.
- Ensayo de toxicidad no específica en bacterias: Microtox según EN ISO 11348-3 calidad del agua -determinación del efecto inhibitorio de muestras de agua en la emisión de luz de Vibrio fischeri (ensayo de bacterias luminiscentes).
- Ensayo de citotoxicidad en la línea celular de hepatoma de rata H4IIE.Luc: ensayo de viabilidad celular AlamarBlue®.
[0130] Los ensayos se realizan con el volumen máximo de solución de ensayo que puede proporcionarse y definirse por los estándares anteriormente citados. Los resultados se expresan como un porcentaje de la inhibición de crecimiento para los ensayos en algas y Daphnia, como porcentaje de inhibición de la emisión de luz para el ensayo Microtox y como porcentaje de la inhibición de la viabilidad celular para los ensayos de citotoxicidad.
Tabla XII: Evolución de la toxicidad durante la degradación de amoxicilina degradada por p-lactamasa extraída de Pseudomonas aeruginosa.
Ensayo de Concentración de antibiótico en el Porcentaje de inhibición (%) toxicidad aguda medio de ensayo a T0 (pgm l1) T0 T=30 min T=1h T=24h 1 Ensayo en algas 90 55 ± 6 53 ± 8 37 ± 5 0 2 Ensayo en 90 56 ± 4 52 ± 4 31 ± 3 0 Daphnia
3 Microtox 80 41 ± 12 42 ± 8 36 ± 5 10 ± 4 4 Ensayo de 80 19 ± 5 18 ± 5 5 ± 2 5 ± 1 viabilidad celular
Tabla XIII: Evolución de la toxicidad durante la degradación de amoxicilina degradada por p-lactamasa extraída de Pseudomonas aeruginosa y por lacasa extraída de Pleurotus ostreatus.
Ensayo de Concentración de antibiótico en el Porcentaje de inhibición (%) toxicidad aguda medio de ensayo a T0 (pgm l1) T0 T=30 min T=1h T=24h 1 Ensayo en algas 90 55 ± 6 22 ± 5 0 0 2 Ensayo en 90 56 ± 4 54 ± 5 28 ± 6 0
Daphnia
3 Microtox 80 41 ± 12 40 ± 6 27 ± 5 3 ± 0,5 4 Ensayo de 80 19 ± 5 13 ± 3 8 ± 3 0 viabilidad celular
Tabla XIV: Evolución de la toxicidad durante la degradación de amoxicilina degradada por Nueva Delhi metalo-plactamasa 1 (NDM-1).
Ensayo de Concentración de antibiótico en el Porcentaje de inhibición (%) toxicidad aguda medio de ensayo a T0 (pgm l1) T0 T=30 min T=1h T=24h 1 Ensayo en algas 90 55 ± 6 41 ± 4 30 ± 6 0 2 Ensayo en 90 56 ± 4 54 ± 5 21 ± 10 0 Daphnia
3 Microtox 80 41 ± 12 42 ± 9 24 ± 3 8 ± 1 4 Ensayo de 80 19 ± 5 18 ± 6 9 ± 2 0 viabilidad celular
Tabla XV: Evolución de la toxicidad durante la degradación de amoxicilina degradada por Nueva Delhi metalo-plactamasa 1 (NDM-1) y por lacasa extraída de Pleurotus ostreatus.
Ensayo de Concentración de antibiótico en el Porcentaje de inhibición (%) toxicidad aguda medio de ensayo a T0 (pgm l1) T0 T=30 min T=1h T=24h 1 Ensayo en algas 90 55 ± 6 35 ± 2 0 0 2 Ensayo en 90 56 ± 4 43 ± 8 0 0 Daphnia
3 Microtox 80 41 ± 12 25 ± 9 18 ± 4 4 ± 0,8 4 Ensayo de 80 19 ± 5 17 ± 5 5 ± 3 0 viabilidad celular
Tabla XVI: Evolución de la toxicidad durante la degradación de sulfametoxazol degradado por lacasa extraída de Pleurotus ostreatus.
Ensayo de Concentración de antibiótico en el Porcentaje de inhibición (%) toxicidad aguda medio de ensayo a T0 (pgm l1) T0 T=30 min T=1h T=24h 1 Ensayo en algas 90 51 ± 5 23 ± 5 0 0 2 Ensayo en 90 50 ± 5 51 ± 6 27 ± 5 0 Daphnia
3 Microtox 80 45 ± 10 52 ± 8 24 ± 6 11 ± 2 4 Ensayo de 80 15 ± 4 16 ± 5 7 ± 2 0 viabilidad celular
[0131] Los resultados (tablas XII a XVI) muestran que en todos los casos y para todos los ensayos, la toxicidad después de la degradación del antibiótico se reduce, lo que indica que los metabolitos generados no generan una toxicidad más alta que los compuestos parentales y/o citotoxicidad.
Claims (13)
1. Método para la degradación e inactivación de al menos un xenobiótico, estando presente dicho al menos un xenobiótico en un medio acuoso, que comprende las etapas siguientes:
a. injertar al menos una enzima sobre un soporte sólido,
b. incubar dicho soporte sólido con dicha al menos una enzima en dicho medio acuoso y,
c. medir la evolución de la concentración de dicho al menos un xenobiótico,
caracterizado por el hecho de que dicha al menos una enzima es Nueva Delhi metalo-p-lactamasa 1, una lacasa extraída de Pleurotus ostreatus y/o una p-lactamasa extraída de Pseudomonas aeruginosa, y en que dicho soporte sólido es un portador Kaldnes de lecho móvil en polietileno de alta densidad.
2. Método según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que dicho portador Kaldnes de lecho móvil se activa con al menos un precursor antes de dicho injerto de al menos una enzima.
3. Método según la reivindicación 2, caracterizado por el hecho de que dicha etapa de activación se realiza por tratamiento de superficie, con dicho al menos un precursor, de dicho portador de lecho móvil por deposición de plasma frío a presión atmosférica o por recubrimiento, siendo dicho recubrimiento preferentemente un proceso de autopolimerización.
4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 2 o 3, caracterizado por el hecho de que dicho al menos un precursor es poliglicidil metacrilato, dopamina, anhídrido maleico/viniltrimetoxisilano, o dopamina acrilamida/viniltrimetoxisilano, preferentemente poliglicidil metacrilato o dopamina.
5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por el hecho de que dicho método comprende además la etapa de saturación del soporte sólido por una capa de antiadhesión de microorganismos después de dicho injerto de dicha al menos una enzima sobre dicho soporte sólido.
6. Método según la reivindicación 5, caracterizado por el hecho de que dicha capa de antiadhesión de microorganismos comprende Tween 20.
7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por el hecho de que dicha al menos una enzima se elige en una forma purificada.
8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por el hecho de que dicha etapa de incubación se realiza a temperatura ambiente y bajo agitación, preferentemente a 30, 50, 100, 200 y 300 rpm, más preferentemente a 100 rpm.
9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado por el hecho de que dicha etapa de medición de la evolución de la concentración de dicho al menos un xenobiótico se realiza por mediciones de absorbancia ultravioleta o por cromatografía líquida/espectrometría de masas en tándem.
10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por el hecho de que dicho al menos un xenobiótico es al menos un antibiótico.
11. Método según la reivindicación 10, caracterizado por el hecho de que dicho al menos un antibiótico es un antibiótico elegido de la clase de antibióticos p-lactámicos o de la clase de antibióticos de sulfonamida.
12. Método según la reivindicación 11, caracterizado por el hecho de que dicho antibiótico es amoxicilina o sulfametoxazol.
13. Soporte sólido que comprende al menos una enzima adaptada para degradar e inactivar al menos un xenobiótico, estando presente dicho al menos un xenobiótico en un medio acuoso, caracterizado por el hecho de que dicha al menos una enzima es Nueva Delhi metalo-p-lactamasa 1, una lacasa extraída de Pleurotus ostreatus y/o una p-lactamasa extraída de Pseudomonas aeruginosa, y en que dicho soporte sólido es el portador Kaldness de lecho móvil en polietileno de alta densidad.
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