ES2698384T3

ES2698384T3 - Microcápsulas probióticas multicapa

Info

Publication number: ES2698384T3
Application number: ES16382056T
Authority: ES
Inventors: Garcia Izaskun Maranon; Vicente Laurent Leire San; Lemus Noelia Hidalgo; Hueda María Blanca Chavarri
Original assignee: Fundacion Tecnalia Research and Innovation
Current assignee: Fundacion Tecnalia Research and Innovation
Priority date: 2016-02-10
Filing date: 2016-02-10
Publication date: 2019-02-04
Anticipated expiration: 2036-02-10
Also published as: EP3205216A1; WO2017137496A1; EP3205216B1

Abstract

Una microcápsula con un tamaño de 10 a 3000 mm que comprende i) un núcleo que comprende al menos un probiótico, un prebiótico o una mezcla de los mismos embebido en un polímero seleccionado entre alginato y pectina, ii) una capa interna que rodea el núcleo que comprende al menos un probiótico, un prebiótico o una mezcla de los mismos embebido en un polímero seleccionado de alginato y pectina, y iii) una capa externa que comprende un material hidrófobo con un punto de fusión de 35 a 90 °C rodeando la capa interna, en la que el al menos un probiótico o prebiótico comprendido en el núcleo es diferente e incompatible con el al menos un probiótico o prebiótico comprendido en la capa interna.

Description

DESCRIPCIÓN

Microcápsulas probióticas multicapa

La presente invención se refiere al campo de la microencapsulación de probióticos. En particular, la invención se refiere a microcápsulas que comprenden varios probióticos o simbióticos con resistencia al procesamiento de alimentos y resistencia entérica.

Estado de la técnica

La presencia de productos probióticos / simbióticos en el mercado de alimentos y suplementos nutricionales ha aumentado constantemente en los últimos años.

La Consulta de Expertos de la Organización Conjunta de Alimentación y Agricultura de las Naciones Unidas y la Organización Mundial de la Salud (FAO / OMS) define los probióticos como microorganismos vivos que, cuando se administran en cantidades adecuadas, otorgan un beneficio de salud al huésped. Estos microorganismos deberían ser levaduras o bacterias, predominantemente bacterias como bacterias de ácido láctico (LAB) con efectos beneficiosos bien conocidos en la salud humana, como la mejora de la función intestinal o el equilibrio microbiano en el tracto intestinal y otros efectos terapéuticos que incluyen: modulación de la respuesta inmune, reducción del nivel de colesterol en sangre, reducción de los síntomas de intolerancia a la lactosa, reducción de la duración de la diarrea, reducción de la presión arterial y prevención del cáncer de colon. Un producto simbiótico es una combinación de al menos un compuesto prebiótico y una bacteria probiótica con efecto sinérgico en la salud humana. Los prebióticos se definieron por primera vez como componentes alimenticios no digeribles que afectan de manera beneficiosa al huésped al estimular selectivamente el crecimiento y / o la actividad de una o una cantidad limitada de bacterias en el colon, mejorando así la salud del huésped. Esta definición se ha refinado para incluir otras áreas que pueden beneficiarse de la selección de microorganismos particulares. Hoy en día, se acepta que un prebiótico puede definirse como un componente de fermentación selectivo que permite cambios específicos que confieren beneficios, tanto en la composición como en la actividad de la microflora gastrointestinal. Estas sustancias pueden ser polisacáridos o beta-glucanos, fructooligosacáridos, galactooligosacáridos, etc., que facilitan el desarrollo de la microflora colónica.

Los probióticos y los prebióticos se añaden frecuentemente a los alimentos o productos alimenticios para proporcionar lo que se conoce como alimentos o piensos funcionales. El alimento o pienso funcional es un alimento o pienso natural o procesado que contiene componentes biológicamente activos conocidos que, cuando se encuentran en cantidades cuantitativas y cualitativas definidas, proporcionan un beneficio para la salud clínicamente comprobado y documentado. Una dificultad común asociada con la incorporación de probióticos en alimentos o productos alimenticios es la pérdida de su viabilidad o actividad, y su descomposición y / o destrucción. Estos problemas generalmente surgen durante el proceso de fabricación de alimentos y / o durante el paso de estos componentes a través del tracto digestivo del consumidor (huésped). Los probióticos, como la mayoría de las sustancias funcionales, son sensibles a la mayoría de los tipos de técnicas de procesamiento de alimentos convencionales, tales como altas temperaturas, molienda, mezcla, cocción o extrusión. Incluso durante la vida útil del producto alimenticio, es difícil asegurar la estabilidad o viabilidad de estos componentes, ya que podrían interactuar con otros componentes del alimento, como los quelantes de metales, surfactantes, oxidantes, etc. La supervivencia de estos microorganismos a través del proceso industrial, el almacenamiento y el paso a través del tracto intestinal son esenciales para lograr sus efectos saludables beneficiosos en el huésped (como se destaca en la definición dada para el término "probiótico"). Por lo tanto, los microorganismos probióticos deben alcanzar el intestino vivos y en cantidades suficientes. Más específicamente, deben alcanzar el colon vivos. De la misma manera, las sustancias prebióticas deben estar químicamente inalteradas y en una cantidad adecuada hasta que alcancen el intestino, más específicamente el colon, para impactar de manera beneficiosa en la salud del huésped.

La microencapsulación es conocida como un método adecuado para proteger bacterias y otros compuestos lábiles de factores ambientales adversos. El éxito de esta tecnología reside en la creación de un microentorno en el que las bacterias podrían sobrevivir independientemente de las condiciones externas del medio circundante: concentración de oxígeno, agua, calor, luz o cualquier otra sustancia externa que no sea conveniente para la estabilidad del compuesto o supervivencia del microorganismo. Finalmente, la encapsulación es un método adecuado para proteger y mejorar la retención y la liberación apropiada de sustancias funcionales y microorganismos en el intestino. El desafío es desarrollar una microcápsula capaz de mejorar la supervivencia de los microorganismos y / o la estabilidad de las sustancias activas, seleccionando correctamente los materiales de encapsulación y el proceso de microencapsulación.

La bibliografía describe una amplia gama de materiales y procesos de encapsulación que pueden utilizarse en el desarrollo de ingredientes funcionales. Algunos de los procesos de encapsulación comúnmente utilizados para encapsular los agentes activos alimenticios son el secado por pulverización (spray-drying), el enfriamiento por pulverización (spray-chilling), el recubrimiento en lecho fluidizado (fluid bed coating), la extrusión en caliente (melt extrusión), la emulsificación, la coacervación, la extrusión o goteo (dropping), encapsulamiento en liposomas, el acomplejamiento por inclusión (inclusion complexation) o el fluido supercrítico. Con respecto a los materiales de encapsulación, se conocen varias sustancias que pueden usarse para atrapar, recubrir o encapsular sólidos, líquidos o gases de diferentes tipos, orígenes y propiedades; sin embargo, solo un número limitado de los mismos ha sido certificado para aplicaciones alimentarias como materiales "generalmente reconocidos como seguros" (GRASS, por sus siglas en inglés): almidón y derivados, celulosa y derivados, gomas, alginato, carragenato, quitosano, gelatina, proteínas de suero o soja, ceras, fosfolípidos, entre otros. Algunos ejemplos relevantes del estado de la técnica anterior que describen microencapsulación de probióticos son el documento WO2013114185, que describe microcápsulas que comprenden un núcleo formado por bifidobacterias secas cubiertas por al menos dos capas de lípidos de origen vegetal, y el documento WO2012142153, que describe microcápsulas que comprenden una mezcla gelificada de alginato y proteína de suero, y bacterias probióticas atrapadas dentro de la mezcla gelificada. Otros ejemplos relevantes de la técnica anterior son:

WO2011004375 que describe un gránulo probiótico que comprende i) un núcleo que comprende uno o una mezcla de microorganismos probióticos y un sustrato en el que se absorben dichos microorganismos; ii) una capa aceitosa interna que reviste dicho núcleo; y iii) una primera capa externa y una segunda capa externa que comprenden al menos dos polímeros diferentes, por ejemplo, alginato y quitosano, las cuales capas externas recubren dicho núcleo y dicha capa interna.

El documento US2010196323 describe un alimento, pienso y / o ingrediente para agua potable probiótico saludable que contiene una mezcla de microorganismos, el cual comprende al menos dos microorganismos seleccionados del grupo que consiste en Enterococcus faecium, DSM 16211, Lactobacillus reuteri, DSM 16350, y Lactobacillus salivarius ssp, salivarius, DSM 16351, Pediococcus acidilactici, DSM 16210 y Bifidobacterium animalis, DSM 16284, en el que además se incluye un material de recubrimiento seleccionado de maltodextrinas, harina de guar, goma arábiga, alginatos, almidón modificado y derivados de almidón, dextrinas, derivados de celulosa como éster y éter de celulosa, proteínas como gelatina, albúmina, caseína, goma arábiga, tragacanto, lípidos como ceras, parafina, ácido esteárico, mono y diglicéridos.

El documento US2007048295 describe un método para preparar cápsulas de alginato, que comprende las etapas de: (a) proporcionar una solución formadora de matriz que comprende de aproximadamente 1% a aproximadamente 3% de alginato de sodio, hasta 5% de proteína pancreática digerida, y hasta aproximadamente 5 % de al menos un prebiótico, así como bacterias probióticas o mezclas de las mismas; (b) hacer gotitas de la solución formadora de matriz; y (c) introducir las gotitas en una solución de cloruro de calcio para formar cápsulas de alginato; y (d) permitir que se solidifiquen las cápsulas de alginato formadas.

La US2013323362 describe una composición que comprende bacterias probióticas que comprende: (a) un núcleo que contiene una composición de bacterias probióticas y un estabilizador, (b) una capa de recubrimiento más interna recubriendo dicho núcleo que comprende al menos una grasa sólida hidrófoba, un ácido graso o una cera que tenga un punto de fusión inferior a 60°C, o una combinación de los mismos; (c) una capa de recubrimiento intermedia recubriendo dicha capa de recubrimiento más interna que cuando está presente en una solución acuosa en cantidad de 0.1% peso / peso sobre el peso total de la solución tiene una tensión superficial inferior a 60 nN / m medida a 25°C, y (d) una capa de recubrimiento exterior que recubre dicha capa de recubrimiento intermedia; donde la composición está en forma de partículas.

Anal et al ("Recent advances in microencapsulation of probiotics for industrial applications and targeted delivery", Trends in Food Science and Technology 2007, vol. 18, no. 5, p. 240-251), divulgan que la encapsulación de probióticos en alginato es la forma de encapsulación más apropiada y que el recubrimiento adicional de las cápsulas con grasa con elevado punto de fusión mejora la termoestabilidad de los probióticos.

Sin embargo, las microcápsulas probióticas descritas no combinan satisfactoriamente la resistencia entérica con la resistencia al procesamiento y con la resistencia al almacenamiento.

Otro problema que surge se refiere a los productos que contienen varias cepas probióticas o productos simbióticos. Se acepta comúnmente que algunas cepas probióticas tienen efectos sinérgicos en términos de bioactividad y, por lo tanto, es deseable proporcionar productos probióticos que contengan múltiples cepas. Sin embargo, también se sabe que la inclusión de varias cepas probióticas puede dar lugar a un efecto negativo en la eficacia debido a un efecto de inhibición mutua. A este respecto, también se han descrito los efectos tóxicos sobre las bacterias probióticas de ciertas sustancias prebióticas en las altas concentraciones requeridas en las formulaciones de productos simbióticos.

Se han realizado algunos intentos para administrar cepas incompatibles en un solo producto encapsulandolas por separado. Chávarri M et al (International Journal of Food Microbiology (2010), vol. 142, p. 185-189) describen la encapsulación de dos cepas diferentes y una sustancia prebiótica separando cada componente en microcápsulas distintas. La encapsulación mejora la viabilidad de las bacterias probióticas y evita la descomposición prebiótica a lo largo del tracto gástrico. La encapsulación individual de cada componente en la formulación del ingrediente evita la pérdida de viabilidad de las cepas de bacterias probióticas que puede suceder debido a su inhibición mutua durante el tiempo de almacenamiento de dicho ingrediente.

El problema con este enfoque es que implica la adición individual de cada una de las cepas encapsuladas a la preparación de alimentos, lo que genera dificultades para garantizar la homogeneidad de la mezcla, así como dificulta la dosificación final de cada cepa administrada al consumidor al ingerir el producto final.

En vista de lo anterior, existe la necesidad de superar las deficiencias anteriores mediante el desarrollo de nuevas estrategias para proporcionar productos alimenticios y piensos con una composición probiótica y / o simbiótica homogénea que a su vez mantenga una buena viabilidad durante todo el proceso industrial, el almacenamiento y hasta llegar a su sitio de acción.

Resumen de la invención

Los inventores han desarrollado nuevas microcápsulas y un método para su preparación que supera las deficiencias mencionadas anteriormente.

Así, un primer aspecto de la invención se refiere a una microcápsula con un tamaño de 10 a 3000 |jm que comprende i) un núcleo que comprende al menos un probiótico, un prebiótico o una mezcla de los mismos embebido en un polímero seleccionado entre alginato y pectina,

ii) una capa interna que rodea el núcleo que comprende al menos un probiótico, un prebiótico o una mezcla de los mismos embebido en un polímero seleccionado de alginato y pectina, y

iii) una capa externa que comprende un material hidrófobo con un punto de fusión de 35 a 90 °C rodeando la capa interna,

en la que el al menos un probiótico o prebiótico comprendido en el núcleo es diferente e incompatible con el al menos un probiótico o prebiótico comprendido en la capa interna.

Las microcápsulas de la invención proporcionan varias ventajas. Estas microcápsulas albergan diferentes probióticos y / o prebióticos en el núcleo y en la capa interna, una compartimentación que evita de manera eficaz las interacciones negativas dentro de la microcápsula entre microorganismos incompatibles, o entre microorganismos y ciertos prebióticos.

Las microcápsulas de la invención también tienen un perfil de resistencia óptimo, que incluye una combinación ideal de resistencia al procesamiento, al almacenamiento y resistencia entérica.

En particular, la capa exterior confiere una mayor resistencia a las tensiones mecánicas y térmicas, que son típicas de los procesos de fabricación de alimentos. Dicha capa exterior proporciona adicionalmente una barrera eficaz contra la humedad. La barrera contra la humedad es una gran ventaja ya que evita la fuga de componentes prebióticos solubles, pero también porque evita el aumento de la actividad del agua dentro de la microcápsula, lo que dañaría los probióticos atrapados.

Además, dado que varios probióticos, prebióticos o mezclas de los mismos pueden administrarse en una sola microcápsula, es decir, en una sola unidad, se garantiza la facilidad de fabricación del alimento o pienso funcional final que contiene la cantidad deseada de ingredientes funcionales.

Las microcápsulas de la invención son muy adecuadas para la fabricación de productos alimenticios o piensos funcionales. Al fabricar alimentos o productos alimenticios que contienen varias cepas probióticas y / o prebióticos por procesos industriales, es importante garantizar la homogeneidad de la mezcla, así como la dosis final de cada cepa administrada al consumidor al ingerir el producto final. Sin embargo, esta homogeneidad es muy difícil de lograr cuando se agregan diferentes cepas probióticas por separado, lo que hasta la fecha ha sido obligatorio cuando dichas cepas interactúan negativamente entre sí y, en particular, para la preparación de productos sólidos tales como productos de confitería, productos cárnicos o cereales. En este sentido, las microcápsulas de la invención que contienen diferentes probióticos en una sola unidad son ventajosas para el uso en la industria de alimentos y piensos, ya que permiten un control más estricto de la homogeneidad y la dosificación de los probióticos y / o prebióticos en el producto final.

Las microcápsulas de la invención también son útiles para la administración de probióticos y simbióticos en forma de nutracéuticos, tales como ingredientes dietéticos, o productos sanitarios, tales como productos diseñados para mejorar la salud vaginal. Además, las microcápsulas de la invención son útiles para administrar probióticos o simbióticos a plantas y suelos.

Por lo tanto, un segundo aspecto de la invención está dirigido al uso de las microcápsulas definidas anteriormente para la fabricación de un producto alimenticio o pienso, un ingrediente alimenticio o alimenticio, un nutracéutico, un producto sanitario o un producto agronómico.

Un tercer aspecto de la invención se refiere a un alimento o pienso, un ingrediente alimenticio o para piensos, un nutracéutico, un producto sanitario o un producto agronómico que comprende microcápsulas definidas anteriormente.

En conjunto, el diseño y las características específicas de las microcápsulas de la invención mejoran la facilidad de fabricación del producto final deseado, proporcionando al mismo tiempo un microambiente ideal para mejorar la viabilidad de los probióticos y / o prebióticos durante la fabricación, el almacenamiento y el paso a través del tracto gastrointestinales (o el tiempo de residencia en condiciones ambientales adversas) hasta llegar a su sitio de acción.

La obtención de microcápsulas que contengan todas las características y ventajas definidas anteriormente no es trivial. Como resultado de una extensa investigación, los inventores han desarrollado un método para preparar las microcápsulas de la invención. Por lo tanto, un cuarto aspecto de la invención se refiere a un proceso para la preparación de una microcápsula como se define anteriormente que comprende:

i) preparar una solución para el núcleo que comprende al menos un probiótico, un prebiótico o una mezcla de los mismos en un polímero seleccionado de alginato o pectina,

ii) preparar una solución para la capa interna que compernde al menos un probiótico, un prebiótico o una mezcla de los mismos en alginato o pectina;

iii) opcionalmente preparar una solución para capa intermedia que comprende al menos un probiótico, un prebiótico o una mezcla de los mismos en alginato o pectina;

iv) extrudir a través de boquillas concéntricas capilares con vibración (prilling by vibration) las soluciones preparadas en las etapas i) y ii), y opcionalmente la etapa iii), en una solución de iones divalentes,

v) secar las microcápsulas obtenidas en la etapa iv) y

vi) aplicar a las microcápsulas resultantes de la fase v) un revestimiento que comprende un material hidrófobo con punto de fusión de 35 a 90 °C,

en el que el núcleo comprende al menos un probiótico o prebiótico que sea diferente e incompatible con al menos un probiótico o prebiótico contenido en la capa interna.

Breve descripción de los dibujos

FIG. 1: Representación esquemática de la microcápsula multicapa con (a) una capa externa regular y (b) una capa externa irregular. (c) representa microcápsulas aglomeradas a través de la capa exterior. C: núcleo, I: capa interna, O: capa externa.

FIG. 2: Representación esquemática del proceso de extrusión a través de boquillas concéntricas capilares con vibración (prilling by vibration).

FIG. 3: Imágenes que muestran la inhibición de las cepas probióticas por la presencia de otras cepas probióticas mediante la técnica de resultados de rayas cruzadas. Las rayas principales (verticales) son a) L.casei; b) L.plantarum; c) L.lactis. En cada placa de Petri, las rayas horizontales (enfrentadas) representan: BB: B. bifidum, LA: L. acidophilus, LC: L.casei, LG: L. gasseri, LL: L. lactis, l P: L. plantarum.

FIG. 4: Imagen de la microcápsula H antes de aplicar la capa exterior.

FIG. 5: Distribución del tamaño de las micropartículas F (antes de aplicar el revestimiento exterior). El eje X representa el diámetro de las micropartículas (|Jm); El eje Y representa el % de micropartículas que tienen un diámetro particular.

FIG. 6: Imágenes de las microcápsulas D (a) y C (b).

FIG. 7: Distribución del tamaño de las micropartículas C (antes de aplicar el recubrimiento exterior). El eje X representa el diámetro de las micropartículas (jm); El eje Y representa el% de micropartículas que tienen un diámetro particular.

FIG. 8: Efecto de secado. Comparativa de estabilidad de supervivencia de Lactobacillus plantarum (a) y Bifidobacterium bifidum y Lactobacillus gasseri (b) después del secado en lecho fluido o liofilización. A: lecho fluido de L. plantarum, B: liofilización de L. plantarum, C: lecho fluido de B. bifidum, D: Lecho fluido de L.gasseri, E: liofilizador de B. bifidum, F: liofilizador de L. gasseri. El eje X representa el tiempo (en días). El eje Y representa log ufc / g microcápsulas secas.

FIG. 9: Imagen de una microcápsula F después del secado.

FIG. 10: Imágenes de una microcápsula F después de aplicar la capa externa de parafina (a) o la capa externa de cera de abeja (b).

FIG. 11: % de aumento de peso de las microcápsulas F debido a la absorción de agua. A: microcápsulas no recubiertas, B: microcápsulas recubiertas con parafina, C: microcápsulas recubiertas con cera de abeja. El eje X representa la temperatura (°C). El eje Y representa el % de aumento de peso.

FIG. 12: % de supervivencia de la suma de B. bifidum L. plantarum contenida en las microcápsulas F después del tratamiento térmico. A: microcápsulas no recubiertas, B: microcápsulas recubiertas con parafina, C: microcápsulas recubiertas con cera de abeja. El eje X representa la temperatura (°C). El eje Y representa el % de supervivencia.

FIG. 13: A: Resistencia térmica en condiciones secas. % de supervivencia de la suma de B. bifidum L. plantarum contenida en las microcápsulas F después de un tratamiento térmico directo en un horno. A: microcápsulas no recubiertas, B: (1: 1) microcápsulas recubiertas con cera de abeja, C: (1: 2) microcápsulas recubiertas con cera de abeja. El eje X representa el tiempo (minutos). El eje Y representa log ufc / g microcápsulas secas.

FIG. 14: Supervivencia de bacterias probióticas tras simulación gastrointestinal. De izquierda a derecha, las barras acopladas representan la supervivencia antes de la simulación gastrointestinal, la supervivencia después de la simulación gástrica y la supervivencia después de la simulación intestinal. A: L. plantarum no encapsulado, B: L. plantarum contenido en microcápsulas D. El eje X representa el tiempo (minutos). El eje Y representa el % de supervivencia.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a microcápsulas multicapa. El término "microcápsula" se entiende como una micropartícula de tamaño de 10 a 3000 jm que contiene componentes activos que está diseñada para liberar sus componentes en el sitio de acción. Preferiblemente, las microcápsulas tienen un tamaño de 50 a 1000 jm , más preferiblemente de 50 a 500 jm , aún más preferiblemente de 100 a 400 jm .

Las microcápsulas de la invención pueden tener diferentes formas y tamaños, por ejemplo, esferas, bastones, cubos, tubos y hemisferios. Generalmente, las microcápsulas son esféricas o cuasi esféricas. Como se usa en este documento, el término "tamaño" se refiere a una dimensión física característica. Por ejemplo, en el caso más común de una microcápsula que es esférica o sustancialmente esférica, el tamaño de la microcápsula corresponde al diámetro de la esfera o el diámetro equivalente de la cuasi esfera asimilada como una esfera. El estado de la técnica proporciona métodos apropiados para calcular el diámetro de micropartículas que son sustancialmente esféricas. Por ejemplo, el diámetro de las microcápsulas se puede calcular utilizando un software como el software de análisis de imágenes Ellix (Microvision, Francia). Cuando se hace referencia a un conjunto de microcápsulas como de un tamaño particular, se contempla que el conjunto de microcápsulas puede tener una distribución de tamaños alrededor del tamaño especificado. Por lo tanto, como se usa en este documento, un tamaño de un conjunto de microcápsulas puede referirse a un modo de una distribución de tamaños, tal como un tamaño máximo de la distribución de tamaños.

En particular, los componentes activos contenidos en las microcápsulas de la invención son probióticos, prebióticos, mezclas de varios probióticos, mezclas de varios prebióticos o mezclas de probióticos y prebióticos. El componente activo probiótico puede ser bacterias o levaduras, en particular cepas bacterianas con actividad probiótica bien conocida, seleccionadas entre especies de lactobacillus y bifidobacterias. Ejemplos no limitativos de probióticos son Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Bididobacterium bifidum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus helveticus. Los componentes activos prebióticos suelen ser sustancias fermentables como las fibras dietéticas. Los ejemplos no limitantes de prebióticos para uso en la presente invención son pectina, almidón resistente, algunos polifenoles, beta-glucanos, xilooligosacáridos, galactooligosacáridos, oligofructosa e inulina. En realizaciones particulares, los prebióticos son polisacáridos de cadena corta (oligosacáridos), que han demostrado ser particularmente eficaces para promover el crecimiento de bacterias probióticas.

Estos componentes activos están “embebidos” en material polimérico. Por "embebido" se entiende que los componentes activos se distribuyen dentro de una matriz polimérica. El término "atrapado" también se puede emplear con el mismo significado. Estos componentes activos están ubicados en espacios separados dentro de la microcápsula, lo que evita las interacciones negativas entre los componentes activos incompatibles, en particular, durante la vida útil prolongada. Por componentes "incompatibles" se entienden componentes que afectan negativamente la actividad normal o la estructura de otros componentes, disminuyendo así su viabilidad, biodisponibilidad o funcionalidad. Por ejemplo, dos probióticos pueden ser incompatibles entre ellos porque cuando se encuentran juntos uno de ellos reduce la viabilidad del otro, como se ilustra en el ejemplo 1.

Un esquema de la estructura de las microcápsulas de la invención se muestra en la figura 1. Las microcápsulas de la invención contienen al menos dos matrices poliméricas, cada una atrapando al menos un componente activo diferente del otro, organizado en una estructura núcleo-cubierta, que Es decir, la microcápsula comprende un núcleo (C) que comprende al menos un componente activo incrustado en una matriz polimérica y una capa interna (I) que rodea al núcleo que comprende al menos un componente activo diferente del que está en el núcleo embebido en una matriz polimérica. En ciertas realizaciones, el núcleo comprende al menos un probiótico o prebiótico que es incompatible con al menos un probiótico o prebiótico comprendido en la capa interna.

La invención contempla que más de un probiótico, más de un prebiótico o más de un prebiótico y probiótico están integrados en el mismo compartimento dentro de la microcápsula. Como será evidente para el experto en la materia, se prefiere que los probióticos y / o prebióticos contenidos en el mismo compartimento sean compatibles, es decir, que no afecten negativamente la actividad o la función normal de los demás.

El sitio de acción donde se liberan estos componentes activos es a menudo el colon. Como tal, es necesario que los componentes activos se protejan de las condiciones adversas presentes en el tracto gastrointestinal. Los componentes activos también deben protegerse de condiciones adversas frecuentes en el procesamiento de alimentos o nutracéuticos y también durante el almacenamiento. En conjunto, las microcápsulas de la invención poseen resistencia entérica, resistencia térmica y resistencia mecánica. Por "resistencia entérica" se entiende la protección contra condiciones en el tracto gastrointestinal que usualmente dañan a los microorganismos probióticos, lo que resulta en su pérdida de viabilidad, como pH altamente ácido, ácidos gástricos, sales biliares, etc. En ciertas aplicaciones, como en agronomía , los probióticos deben protegerse de factores ambientales adversos, como una concentración inadecuada de oxígeno (muchas bacterias probióticas son anaerobios), pH ácido, toxicidad de ciertos compuestos, etc. Por lo tanto, las microcápsulas de la invención además tienen resistencia ambiental.

Sin embargo, los microorganismos probióticos son sensibles al material utilizado para su inmovilización o encapsulación. Los biopolímeros de grado alimenticio, tales como alginato, gelatina, pectina, proteína de suero desnaturalizada, almidón y derivados, goma xantana, carragenina, entre otros, son materiales adecuados para encapsular microorganismos probióticos vivos. Los inventores han encontrado que se logra una resistencia óptima entérica y de procesamiento seleccionando alginato o pectina como materiales poliméricos para las microcápsulas. Estos polímeros también confieren resistencia a las condiciones adversas encontradas en el suelo (pH bajo, elementos tóxicos, etc.) o en la superficie de una planta (exceso de oxígeno, compuestos tóxicos, etc.). Estos polímeros tampoco comprometen la viabilidad de los probióticos. El polímero en el núcleo puede ser igual o diferente al polímero en la capa interna, aunque se prefiere que el polímero en el núcleo sea alginato. Por lo tanto, una realización particular de la invención se refiere a una microcápsula en la que el núcleo comprende al menos un probiótico, prebiótico o mezclas de los mismos embebidos en alginato. El polímero en el material interno puede ser alginato o pectina. Por tanto, en otra realización, la invención se refiere a una microcápsula en la que la capa interna comprende al menos un probiótico, prebiótico o mezclas de los mismos embebidos en alginato. Sin embargo, algunos alginatos no proporcionan una resistencia entérica suficientemente buena. En estos casos, la pectina se puede usar como polímero para la capa interna, ya que la pectina siempre proporciona una alta resistencia entérica. Así, en otra realización, la invención se refiere a una microcápsula en la que la capa interna comprende al menos un probiótico, prebiótico o mezclas de los mismos embebidos en pectina.

Las microcápsulas de la invención también comprenden una capa exterior de un material hidrófobo que tiene un punto de fusión de 35 a 90 °C, preferiblemente de 40 a 80 °C, más preferiblemente de 60 a 80 °C. Esta capa exterior no solo contribuye a la protección entérica de los componentes activos, sino que también confiere resistencia térmica y mecánica. La capa exterior proporciona adicionalmente una barrera a la humedad. En realizaciones particulares, el material hidrófobo en la capa externa comprende ácidos grasos o cera, ya que estos materiales proporcionan la mejor protección. En realizaciones más particulares, el material exterior comprende ceras, tales como cera de abeja, parafina o cera de carnauba. En una realización preferida, la capa exterior comprende cera de abeja. La capa exterior puede comprender uno de los compuestos anteriores o, más a menudo, consiste en uno de los compuestos anteriores.

En algunas realizaciones, la capa exterior forma un recubrimiento uniforme (regular) que rodea cada microcápsula individual. En otras realizaciones, la capa exterior forma un recubrimiento no uniforme (irregular) que rodea cada microcápsula individual. En otras realizaciones, la capa exterior constituye un material aglomerante de microcápsulas. La diferencia entre estas realizaciones se puede ver en la figura 1, donde el dibujo (a) muestra una microcápsula con recubrimiento regular, el dibujo (b) muestra una microcápsula con recubrimiento irregular y el dibujo (c) muestra microcápsulas aglomeradas por el recubrimiento exterior. La aglomeración proporciona una macroestructura con un tamaño mayor en comparación con las microcápsulas individuales, que se requiere para ciertas aplicaciones.

Una realización particular de la invención se refiere a la microcápsula como se define anteriormente, que tiene un tamaño de 50 a 500 |jm y comprende además:

(i) un núcleo que comprende al menos un probiótico, prebiótico o una mezcla de los mismos embebidos en alginato, (ii) una capa interna que rodea el núcleo que comprende al menos un probiótico, prebiótico o una mezcla de los mismos embebidos en un polímero seleccionado de alginato y pectina, y

(iii) una capa exterior que rodea la capa interna que comprende cera,

en la que el núcleo comprende al menos un probiótico o prebiótico que es diferente e incompatible con al menos un probiótico o prebiótico contenido en la capa interna.

Una microcápsula preferida tiene las características definidas en la realización anterior y, adicionalmente, el polímero en la capa interna es alginato y la cera en la capa externa es cera de abeja.

En algunas realizaciones, la microcápsula de la invención como se define anteriormente comprende adicionalmente una o más capas adicionales. En otras realizaciones, la una o más capas adicionales son capas intermedias ubicadas entre la capa interna y la capa externa, en la que la una o más capas intermedias comprenden al menos un probiótico, prebiótico o una mezcla de los mismos embebidos en un polímero seleccionado de alginato y pectina que es diferente del al menos un probiótico o prebiótico contenido en las capas adyacentes.

En una realización particular, la microcápsula comprende una capa intermedia entre la capa interna y la capa externa, esta capa intermedia comprende al menos un probiótico, prebiótico o una mezcla de los mismos embebidos en un polímero seleccionado de alginato y pectina que es diferente de al menos un probiótico o prebiótico contenido en la capa interna. En una realización particular, al menos un probiótico o prebiótico en la capa intermedia no solo es diferente, sino que también es incompatible con al menos un probiótico o prebiótico en la capa interna. Se prefiere que todas las capas que comprenden el componente activo comprendan al menos un componente activo diferencial. Como se mencionó anteriormente, el polímero en el núcleo de la microcápsula es preferiblemente alginato. Cuando la microcápsula contiene una capa intermedia, dicha capa intermedia contiene alginato o pectina, mientras que la capa interna contiene alginato. Además, en aquellos casos en los que la microcápsula contiene varias capas intermedias, se prefiere que el polímero en todas las capas intermedias, con excepción de la que está en contacto con la capa externa, sea alginato. El polímero en la capa intermedia que está en contacto con la capa externa puede ser alginato o pectina, pero es preferiblemente alginato si dicho alginato proporciona una buena resistencia entérica. De lo contrario puede seleccionarse pectina.

En una realización particular, la invención se refiere a una microcápsula de tamaño de 200 a 600 jm que comprende (i) un núcleo que comprende al menos un probiótico, prebiótico o una mezcla de los mismos embebidos en alginato, (ii) una capa interna que rodea el núcleo que comprende al menos un probiótico, prebiótico o una mezcla de los mismos embebidos en alginato,

(iii) una capa intermedia que rodea la capa interna que comprende al menos un probiótico, prebiótico o una mezcla de los mismos embebidos en un polímero seleccionado de alginato y pectina, y

(iii) una capa exterior que rodea la capa interna que comprende cera,

en la que la capa interna comprende al menos un probiótico o prebiótico que es diferente e incompatible con al menos un probiótico o prebiótico contenido en el núcleo y con al menos un probiótico o prebiótico contenido en la capa intermedia.

Una microcápsula preferida tiene las características definidas en la realización anterior y, adicionalmente, el polímero en la capa intermedia es alginato y la cera en la capa exterior es cera de abeja.

Las microcápsulas de la invención son muy adecuadas para la fabricación de ingredientes alimentarios funcionales, alimentos o piensos funcionales, nutracéuticos, productos sanitarios y productos agronómicos. En una realización, las microcápsulas de la invención que se añadirán en el producto alimenticio final contienen de 105 a 1010 ufc de cada cepa probiótica por g de microcápsulas (secas) y / o de 0,1 a 0,5 g de prebiótico por g de microcápsulas (secas). En realizaciones particulares, la cantidad de cada cepa probiótica en la microcápsula es de 107 a 109 ufc de cada cepa probiótica por g de microcápsulas (secas) y / o de 0,2 a 0,4 g prebiótico por g de microcápsulas (secas). Preferiblemente, la cantidad de cada cepa probiótica en la microcápsula es de 108 a 109 ufc de cada cepa probiótica por g de microcápsulas (secas) y / o de 0,2 a 0,3 g prebiótico por g de microcápsulas (secas). "ufc" significa unidades formadoras de colonias.

Los alimentos o piensos que contienen las microcápsulas de la invención pueden ser cualquier tipo de alimento o alimento funcional, como productos lácteos (leche fermentada, yogur, kéfir, helado, queso, etc.), productos a base de carne (como salchichas, empanadas de carne, etc.), productos a base de soja (como tofu, miso, yakult, etc.), alimentos para bebés (leche de fórmula, cereales, etc.), alimentos de fórmula para fines médicos especiales, barritas nutritivas, barritas de snacks, cereales para el desayuno y productos a base de cereales, productos de confitería, postres, zumos de frutas, zumos a base de cereales, zumos de verduras, mayonesa, etc. Las microcápsulas de la invención también pueden comercializarse directamente como ingredientes alimentarios, con o sin otros aditivos apropiados o en combinación con otros compuestos, para usar en la preparación de un alimento o producto alimenticio. Sin embargo, las microcápsulas de la invención también son útiles para la preparación de nutracéuticos, entendiendo el término "nutracéutico" como un producto derivado de un alimento que se comercializa en forma de medicina y se demuestra que tiene un beneficio fisiológico o que proporciona protección contra enfermedades crónicas. Los suplementos dietéticos son un ejemplo típico de nutracéuticos. Los productos para la salud vaginal que consisten en o que contienen probióticos, prebióticos o ambos, también pueden considerarse nutracéuticos, aunque en general también se clasifican como productos sanitarios. Generalmente, los nutracéuticos toman la forma de píldoras, tabletas, cápsulas, óvulos, geles, granulados. El campo agronómico es también un campo de administración de ciertos probióticos, que se han descrito para beneficiar el crecimiento de las plantas, inhibir plagas o beneficiar el valor nutricional general del suelo. También se conocen aplicaciones ambientales como la reducción de la toxicidad del suelo. También es ventajoso aplicar probióticos, prebióticos o mezclas de los mismos particularmente adecuados en forma de las microcápsulas de la invención a plantas y suelos.

También se proporciona un proceso para la preparación de una microcápsula de acuerdo con la invención que comprende:

(i) preparar una solución para el núcleo que comprende al menos un probiótico, prebiótico o una mezcla de los mismos en un polímero seleccionado de alginato o pectina,

(ii) preparar una solución para la capa interna que comprende al menos un probiótico, prebiótico o una mezcla de los mismos en alginato o pectina;

(iii) extrudir a través de boquillas concéntricas capilares con vibración (prilling by vibration) ambas soluciones en una solución de ión divalente,

(iv) secar las microcápsulas obtenidas en la etapa (iii) y

(v) aplicar, a las microcápsulas resultantes de la etapa (iv), un recubrimiento que comprende un material hidrófobo que tiene un punto de fusión de 35 a 90 °C,

En el que el núcleo comprende al menos un probiótico o prebiótico que es diferente e incompatible con al menos un probiótico o prebiótico contenido en la capa interna.

Por "extrudir a través de boquillas concéntricas capilares con vibración (prilling by vibration en inglés)" se entiende extrudir simultáneamente las soluciones a través de boquillas concéntricas capilares vibratorias (ver figura 2). Como será evidente para la persona experta, la solución del núcleo se extruye a través de la boquilla de menor diámetro, mientras que la solución de la capa interna se extruye a través de la boquilla de mayor diámetro.

En una realización particular, la microcápsula contiene una capa intermedia que rodea la capa interna, y el proceso de preparación comprende:

(i) preparar una solución para núcleo que comprende al menos un probiótico, prebiótico o una mezcla de los mismos en un polímero seleccionado de alginato o pectina,

(iii) preparar una solución para la capa intermedia que comprenda al menos un probiótico, prebiótico o una mezcla de estos en alginato o pectina

(iv) extrudir a través de boquillas concéntricas capilares con vibración (prilling by vibration) las tres soluciones en una solución de ión divalente,

(v) secar las microcápsulas obtenidas en la etapa (iv) y

(vi) aplicar, a las microcápsulas resultantes de la etapa (v), un recubrimiento que comprende un material hidrófobo que tiene un punto de fusión de 35 a 90 °C,

Preferiblemente, el polímero en la solución para el núcleo es alginato. En realizaciones particulares, el polímero de la solución para el núcleo y para la solución interna es alginato. El polímero en la solución para la capa intermedia que estará en contacto con la capa externa puede ser alginato o pectina, pero es preferiblemente alginato si dicho alginato proporciona una buena resistencia entérica. De lo contrario, se puede seleccionar pectina para la solución para esta capa.

La concentración de polímero en las soluciones es de 1 a 3% (p/v) cuando el polímero es alginato y de 3 a 7% (p/v) cuando el polímero es pectina. "% p/v" se entiende como porcentaje de concentración en masa, es decir, porcentaje de masa/volumen. Preferiblemente, la solución de alginato comprende de 1,5 a 2% (p/v) de alginato y la solución de pectina comprende de 4 a 6 (p/v) pectina, ya que se ha encontrado que estas concentraciones son las óptimas para la invención porque combinan una matriz adecuada para las capas de las microcápsulas, así como una viscosidad adecuada para el proceso de preparación. La cantidad de componente activo en las soluciones de polímeros es generalmente de 107 a 109 ufc de cada cepa probiótica/ml de solución y/o de 0,01 a 0,05 g de solución prebiótica/ml de solución, y preferiblemente de 108 a 109 ufc de cada cepa probiótica/ml de solución y/o de 0,015 a 0,03 g de prebiótico/ml de solución. Por lo tanto, una realización particular se refiere a un método como se definió anteriormente para la preparación de microcápsulas en el que el probiótico, cuando está presente en la solución para el núcleo y/o en la solución para la capa interna y/o en la solución para la capa intermedia, está en una concentración de 107 a 1010 cfu y el prebiótico, cuando está presente en la solución para el núcleo y/o en la solución para la capa interna y/o en la solución para la capa intermedia, se encuentra en una concentración de 0,01 a 0,05 g/ml de solución.

Una realización particular contempla un método como se definió anteriormente que comprende preparar (i) una solución para el núcleo que comprende de 1,5 a 2% de alginato y de 107 a 109 ufc de al menos una cepa probiótica/ml de solución y/o de 0,01 a 0,05 g de al menos una solución prebiótica/ml de solución, (ii) una solución para la capa interna que comprende de 1,5 a 2% de alginato y de 107 a 109 ufc de al menos una cepa probiótica/ml de solución y/o de 0,01 a 0,05 g de al menos un prebiótico/ml de solución y, opcionalmente, una capa intermedia que comprende de 1,5 a 2% de alginato y de 107 a 109 ufc de al menos probiótico/ml de solución y/o de 0,01 a 0,05 g de al menos un prebiótico/ml de solución. Otra realización contempla la preparación de una solución para el núcleo y una solución para la capa interna como anteriormente y una solución para la capa intermedia que comprende de 4 a 6 (p/v) de pectina y de 107 a 109 ufc de al menos una cepa probiótica/ml de solución y/o de 0,01 a 0,05 g de al menos un prebiótico/ml de solución. Otra realización contempla la preparación de una solución para el núcleo como anteriormente y una solución para la capa interna que comprende de 4 a 6 (p/v) pectina y de 107 a 109 ufc de al menos una solución de probiótico/ml de solución y/o de 0,01 a 0,05 g de al menos un prebiótico/ml de solución.

En la técnica de extrusión a través de boquillas concéntricas capilares con vibración (prilling by vibration), las boquillas vibradoras generan una onda sinusoidal en el chorro de líquido extruido, particularmente en el régimen de flujo laminar, para formar gotas con una distribución de tamaño considerablemente reducida, con una gota formada por frecuencia de hertz aplicada (figura 2). El tamaño de las microcápsulas obtenidas se puede seleccionar dentro de un cierto rango dependiendo del diámetro de las boquillas y la frecuencia aplicada. Se requiere un compromiso entre la velocidad del flujo del chorro y la frecuencia aplicada, debido a que el rango óptimo de formación de gotas está limitado por varios factores: una velocidad del flujo del chorro demasiado pequeña no produce la formación del chorro, mientras que una velocidad del flujo del chorro demasiado grande resulta en un chorro ondulado ; y frecuencias demasiado pequeñas que dan como resultado la formación de gotas de satélite, pero una frecuencia de vibración demasiado grande que da como resultado una formación de gotas inestable. Además de lo anterior, otros parámetros afectan las características de las cápsulas resultantes: la velocidad relativa del flujo del chorro (es decir, la relación entre las velocidades del chorro de las diferentes soluciones), la geometría de la boquilla, la relación entre los diámetros de la boquilla o la diferencia en la viscosidad dinámica de las soluciones poliméricas.

Con el fin de obtener resultados adecuados, se recomienda el uso de un diámetro de boquilla exterior de tamaño aproximadamente doble que el interior. Preferiblemente, la boquilla más pequeña tiene un diámetro de 100 a 200 |jm, la boquilla mediana tiene un diámetro de 200 a 400 jm y, si está presente, la boquilla más grande tiene un diámetro de 300 a 600 jm .

Con respecto a otros parámetros relevantes, la frecuencia de vibración es de 100 a 7000 Hz, preferiblemente de 400 a 4000 Hz, y la velocidad de flujo de chorro relativa de las soluciones que se extruyen a través de las boquillas es de 1: 1 a 1: 2,5 (cuando se extruyen dos soluciones) , más preferiblemente de 1: 1 a 1: 1,5. Cuando se extruyen tres soluciones, la velocidad de flujo de chorro relativa de las soluciones que se extruyen a través de las boquillas es de 1: 1: 2 a 1: 2,5: 5, preferiblemente de 1: 1: 2 a 1: 1,5: 3. La velocidad relativa del flujo del chorro es la relación entre las velocidades del chorro de las soluciones que se extruyen a través de la boquilla más pequeña, la boquilla del medio y, si está presente, la boquilla más grande y se expresa como la velocidad del flujo del chorro de la boquilla más pequeña: velocidad del flujo del chorro de la boquilla del medio : velocidad de flujo del chorro de la boquilla más grande (si está presente).

En algunas realizaciones, el prilling por vibración se combina con una fuerza electrostática para ionizar el aire a través del cual se forman las gotas. Esto se puede hacer por medio de un dispositivo electrostático y permite optimizar la formación de gotas, y por lo tanto, las propiedades de las microcápsulas. Por lo tanto, en una realización, el método comprende adicionalmente la etapa de aplicar una fuerza electrostática a las microcápsulas que se están extrusionando. Una fuerza electrostática de 300 a 700 mV es útil para trabajar con soluciones viscosas medias-altas (las condiciones óptimas dependen de la viscosidad dinámica de las soluciones). La fuerza electrostática logra una estrecha distribución del tamaño de partícula y permite una reducción del diámetro de la microcápsula de alrededor del 20-40%, así como una forma más esférica de la microcápsula y una mejor distribución de la capa. En una realización preferida, se aplica una fuerza electrostática de 450 a 550 mV, más preferiblemente 500 mV.

Las soluciones se extruyen a través de boquillas concéntricas en una solución de iones divalentes para el endurecimiento. El ion divalente se selecciona de cobre, bario, estroncio, calcio, zinc, cobalto y níquel. En realizaciones preferidas, el ion divalente es calcio. En realizaciones particulares, la solución es una solución acuosa de sal de calcio con una concentración de 1 a 20% (p/v), preferiblemente de 1 a 15%, más preferiblemente de 1 a 10. En algunas realizaciones, la solución de sal de calcio tiene una concentración de 1 a 3%. Esta concentración es adecuada para microcápsulas que contienen alginato como único polímero. En otras realizaciones, la solución de sal de calcio tiene una concentración de 7 a 15%. Esta concentración es adecuada para microcápsulas que también contienen pectina. En realizaciones preferidas, la sal de calcio es cloruro de calcio.

Las microcápsulas se secan a un valor de actividad de agua inferior a 0,4, preferiblemente inferior a 0,3. El secado se puede lograr por métodos convencionales, pero se realiza preferentemente a temperaturas suaves. Ejemplos no limitativos de métodos de secado apropiados son los hornos convencionales, que trabajan preferentemente a temperaturas de 40 a 60 °C o por secado en lecho fluido, que funciona preferentemente a temperaturas de 20 a 60 °C, y la liofilización, preferiblemente a temperaturas inferiores a 0 °C. Cuando la liofilización es el método de secado seleccionado, se puede agregar un crioprotector. Los crioprotectores adecuados para uso en productos alimenticios y nutracéuticos son conocidos en la técnica. En una realización particular, el secado se logra mediante secado en lecho fluido, trabajando preferentemente a temperaturas de 20 a 60 °C.

Cuando la microcápsula de la invención contiene una capa intermedia, el método de preparación puede comprender la aplicación de la capa intermedia sobre una primera cápsula seca que comprende un núcleo y una capa interna preparada mediante el prilling por vibración como se definió anteriormente. La aplicación de la capa intermedia en este caso se puede realizar mediante métodos convencionales, como el revestimiento en recipiente (pan coating), la deposición de la capa atómica (atomic layer deposition) o el revestimiento de lecho fluido. En una realización particular, la capa intermedia se aplica mediante un revestimiento de lecho fluido. Por ejemplo, la capa intermedia de la microcápsula se podría aplicar en un proceso de lecho fluido Wurster donde la solución de alginato se atomiza desde una boquilla de pulverización inferior a una temperatura de entrada de aire seleccionada para secar la capa depositada. Si se desean capas intermedias adicionales, dichas capas también se aplican preferiblemente mediante recubrimiento de lecho fluido en un proceso continuo cambiando la solución de alimentación.

Finalmente, los métodos convencionales, preferiblemente el revestimiento de lecho fluido, también se usan para aplicar la capa externa que comprende material hidrófobo con un punto de fusión de 35 a 90 °C, preferiblemente de 40 a 80 °C.

El material hidrófobo usado para la etapa de recubrimiento se selecciona entre ácidos grasos y cera, preferiblemente cera como la cera de abeja, parafina o cera de carnauba. En una realización preferida, el material hidrófobo usado para la etapa de recubrimiento es cera de abeja. Como será evidente para el experto en la materia, cuando se usa un revestimiento de lecho fluido para aplicar la capa exterior, el método requiere el uso de material fundido, es decir, ácidos grasos fundidos o cera fundida.

Como resultado del proceso anterior, se obtienen microcápsulas que contienen varias capas, cada una de las cuales contiene diferentes probióticos y/o prebióticos y está rodeada por una capa externa altamente resistente. Estas microcápsulas son ideales para aplicaciones en las que es importante evitar interacciones negativas entre diferentes componentes activos, además de poseer una alta resistencia al procesamiento y resistencia entérica o ambiental. Por lo tanto, la invención también se refiere a una microcápsula obtenida por el método definido anteriormente, que posee todas las ventajas y características de la microcápsula de la invención.

La caracterización de la microcápsula se puede hacer usando varias técnicas. Como ya se mencionó, el microscopio (Zeiss) y el software de análisis de imágenes Ellix (Microvision Image Analysis) se pueden usar para analizar el tamaño y la forma de las microcápsulas. La concentración de bacterias por gramo de producto final se puede calcular rompiendo las microcápsulas con una solución de citrato de sodio 0,1 M. Una vez que las microcápsulas están completamente rotas, se hacen diluciones en serie y se vierten en placas de MRS agar para contar las bacterias viables contenidas en las microcápsulas. Además, las microcápsulas pueden ser enfrentadas a condiciones gástricas e intestinales para demostrar su resistencia y su capacidad para alcanzar el colon. La misma solución de citrato puede utilizarse para romper las microcápsulas y determinar la concentración prebiótica mediante técnicas cromatográficas, por ejemplo.

En toda la descripción y las reivindicaciones, el término "comprende" y sus variaciones no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Además, el término "comprende" abarca el término "consiste en". Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no están destinados a limitar la presente invención. Los signos de referencia relacionados con los dibujos y colocados entre paréntesis en una reivindicación son únicamente para intentar aumentar la claridad de la reivindicación, y no deben interpretarse como limitantes para el alcance de la reivindicación.

Ejemplos

Ejemplo 1. Efecto de la combinación de diferentes cepas en su viabilidad

Se realizó un ensayo in vitro para comprobar qué cepas probióticas pueden inhibir el crecimiento de otras utilizando un ensayo cruzado.

Para realizar el experimento, las cepas seleccionadas se incubaron en medio de cultivo De Man Rogosa y Sharpe (MRS) a 37°C hasta alcanzar una concentración de 108 ufc/mL. Las placas de agar MRS fueron preparadas e inoculadas con las diferentes bacterias mediante una sola veta en el centro de la placa de Petri. A continuación, las cepas se enfrentaron entre sí mediante una línea perpendicular a la línea principal, como se puede ver en la figura 3. El efecto inhibidor del crecimiento de la cepa principal se puede ver estudiando la falta de crecimiento en el área que rodea la veta central en los platos.

Las cepas utilizadas en el experimento son cepas de referencia obtenidas de la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) y de la National Collection of Industrial, Food and Marine Bacteria (NCIMB). Lactobacillus plantarum CECT 220, Lactobacillus gasseri NCIMB 11718, Bifidobacterium bifidum CECT 870, Lactobacillus acidophilus CECT 903, Lactobacillus lactis NCIMB 702118 y Lactobacillus caseiCECT 475 fueron probados por el método de corte transversal.

En la figura 3 se puede observar un área inhibitoria en la zona derecha de la placa de Petri cuando Bifidibacterium bifidum se enfrenta a Lactobacillus plantarum, Lactobacillus lactis y Lactobacillus casei. Estos resultados muestran que B. bifidum es incompatible con estas tres cepas de Lactobacillus y, por lo tanto, no deben administrarse conjuntamente (es decir, en contacto entre sí) porque la presencia de las cepas de Lactobacillus mencionadas afecta negativamente a la viabilidad de la cepa de B. bifidum.

Ejemplo 2: efecto de una concentración de sustancia prebiótica en la viabilidad de un microorganismo probiótico

Para estudiar el efecto inhibidor de las sustancias prebióticas seleccionadas se estimó la Concentración Mínima Inhibitoria de los prebióticos seleccionados.

Lactobacillus plantarum CECT 220, Bifidobacterium bifidum CECT 870, Lactobacillus helveticus CECT 402 y Lactobacillus casei CECT 475 se cultivaron hasta que las suspensiones alcanzaron 108 ufc/mL en el caldo MRS. Se preparó una solución madre de las sustancias antimicrobianas que debían someterse a ensayo. A partir de la solución madre, se realizaron cuatro diluciones principales utilizando el caldo MRS. La concentración final de quercetina y FOS fue, por tanto, de 0,25%, 0,5%, 1% y 2,5%. Cada tubo recibió 250 |jL de la suspensión de cultivo. A continuación, los tubos se incubaron a la temperatura adecuada en condiciones anaeróbicas. La concentración en la que hay una falta de turbidez en los tubos se considera la concentración inhibitoria mínima.

Los resultados mostraron que la quercetina mostró un efecto inhibidor sobre el crecimiento de las bacterias probadas, como puede verse en la siguiente tabla.

Tabla1. Concentración Mínima Inhibitoria de quercetina

: inhibición observada, no se observa turbidez

Ejemplo 3: encapsulación en una microcápsula multicapa en un solo paso de cepas de probióticos o combinaciones de probióticos y prebióticos mediante tecnología de prilado con boquilla concéntrica.

La Tabla 2 muestra los parámetros empleados para la preparación de varias microcápsulas que contienen diferentes combinaciones de componentes activos encapsulados y material encapsulado similar. El diámetro se expresa como valor medio con una dispersión de alrededor del 10% medida tras la recuperación de la solución de baño de calcio; el contenido de bacterias para cada cepa de las microcápsulas secas fue de 108-109 ufc/g.

Para la preparación de las microcápsulas, se disolvió una cantidad adecuada de polímero (alginato de sodio) en agua desionizada a temperatura ambiente, removiendo suavemente para obtener una solución de 20 g/L. Los componentes activos se incorporaron a 100 mL de esta solución para obtener las solucciones para las capas interna y núcleo. La cantidad de probióticos fue la suficiente para asegurar al menos 108 UFC/mL de solución de alginato de sodio. Por ejemplo, para la preparación de la microcápsula de modelo A mostrada en la Tabla 2 que contiene L. helveticus en alginato al 2% en el núcleo y L. plantarum en alginato al 2% en la capa interna, se agregó 1 g de L. helveticus pellet a la solución de alginato para obtener la solución del núcleo, y se agregó 1 g de L. plantarum a la solución de la capa interna para obtener 108 y 109 UFC/mL, respectivamente. La solución para el núcleo de L. helveticus fue extruida por la boquilla interna y la solución para la capa interna de L. plantarum por la solución anular con velocidad de flujo de chorro de 21 mL/min. Para descomponer el chorro en pequeñas gotas, se aplicó una frecuencia de 600 Hz. Estas gotas fueron cosechadas en baño de cloruro de calcio (20 g/L).

La preparación de la microcápsula B de la Tabla 2 implica la incorporación de fructooligosacáridos (FOS) de 20 g/L en 100 mL de solución de 20 g/L de alginato de sodio para formar la solución para la capa interna. La solución para el núcleo de L. helveticus se preparó como se indica más arriba. Estas soluciones fueron extrudidas a través de boquillas concéntricas ajustando la velocidad de flujo del chorro a 6 mL/min y las microcápsulas adecuadas se obtuvieron con 500 Hz. Las gotitas se recogen y se cosechan en un baño de cloruro de calcio (20 g/l).

Los otros modelos de microcápsulas que figuran en la Tabla 2 se prepararon siguiendo el procedimiento anterior. Las condiciones particulares para cada modelo de microcápsula se muestran en la tabla. Todas las microcápsulas se prepararon sin aplicar ninguna fuerza electrostática.

La estructura de la cápsula es una estructura de núcleo-capa donde cada cepa o compuesto se encuentra en una capa individual de la microcápsula: una en el núcleo y la otra en la capa circundante. 4 muestra una imagen de una microcápsula donde dos combinaciones de probióticos están atrapados en capas separadas. La imagen fue tomada inmediatamente después de la recuperación en la solución de baño de calcio. La figura 5 muestra una comparativa sobre la distribución del diámetro de las cápsulas.

Sin embargo, ambas capas no siempre son visibles por microscopía. La diferenciación de capas se observa por microscopía cuando existe algún cambio relevante en la formulación de la capa, como por ejemplo, diferentes materiales de encapsulación; núcleo con probiótico y capa interna que contiene cualquier prebiótico; etc. Por otro lado, la fluorescencia es una herramienta útil para comprobar el confinamiento del microorganismo en una capa específica. La fluorescencia puede utilizarse para observar las diferentes capas cuando la única diferencia consiste en que en cada una de ellas hay diferentes probióticos embebidos. Una rápida gelificación de los materiales encapsulados es un factor clave para asegurar la generación de diferentes capas, y este es un tema importante a considerar para optimizar el método de preparación de las microcápsulas de la invención.

Las microcápsulas se caracterizaron por su diámetro, la distribución de tamaño y el número de bacterias inmovilizadas por gramo de producto final. Las condiciones de encapsulación dependen del aspecto intrínseco de las soluciones y del producto final esperado.

La Tabla 2 incluye algunos ejemplos de combinaciones simbióticas en las que el contenido prebiótico estaba entre el 20 y el 40% del contenido de materia seca. Más específicamente, el modelo de la microcápsula B tiene un 38% de contenido prebiótico y el modelo de la microcápsula C tiene un 20%.

Tabla 2. Parámetros de preparación de diferentes microcapsulas

La figura 6 muestra una imagen de la microcápsula D que contiene el probiótico L.plantarum embebido en la capa central y el prebiótico FOS incrustado en la capa interna. La figura 7 muestra una distribución de tamaño típica de las microcápsulas recuperadas de la solución de baño de calcio.

Ejemplo 4: proceso de secado

Las microcápsulas fueron secadas por dos métodos diferentes, a saber, secado en lecho fluido a 40°C de entrada de aire y salida de aire a temperatura ambiente y liofilización con condiciones: congelación a -40°C durante 3 horas, proceso de secado durante 44 horas a diferentes temperaturas -20°C, 0°C, 12°C y 4°C. La figura 8 muestra la viabilidad de las bacterias encapsuladas después del secado de las microcápsulas mediante dos métodos diferentes (la figura 8a se refiere a las microcápsulas del modelo D (véase la tabla 2) que contienen L. plantarum, mientras que la figura 8b se refiere a las microcápsulas del modelo H (véase el tabla 2) que contienen B. bifidum y L. gasseri). Puede observarse que la viabilidad después del secado y durante el almacenamiento no difiere mucho con el método de secado seleccionado. Consiguientemente, se concluyó que el secado en lecho fluido, el cual es un método altamente económico y conveniente para la industria alimenticia, puede ser tan conveniente para el proceso de la invención como la liofilización.

La figura 9 muestra una imagen de microscopía de la microcápsula F después del secado.

Ejemplo 5: proceso de recubrimiento con cera

Las microcápsulas secadas obtenidas en el ejemplo 4 fueron recubiertas con una capa de cera mediante un equipo de lecho fluido UNI-Glatt (Glatt Ingenieurtechnik GmbH, Alemania) configurado en la opción de pulverización superior. Con este método, las microcápsulas endurecidas podían secarse y recubrirse en pasos sucesivos en el mismo lote.

Por ejemplo, las microcápsulas F secas se cubrieron con a) cera de abeja derretida o b) parafina. La cera de abeja fundida se rocía a 75° C y el aire de fluidización se introduce a 20° C para controlar la temperatura de salida del aire a 30° C. El material de recubrimiento se rocía para obtener una relación 1:1 ó 1:2 (p/p) de microcápsulas:recubrimiento. La parafina fundida fue rociada a 45° C, a la misma temperatura del aire de entrada para obtener una relación 1:1 o 1:2 (p/p) de microcápsulas:recubrimiento.

La figura 10 muestra las microcápsulas F recubiertas de parafina (figura 10 A) y recubiertas de cera de abeja (figura 10 B) con una relación 1:1 (p/p).

Ejemplo 6: Barrera de humedad y estabilidad térmica en solución.

Las microcápsulas F recubiertas de cera de abeja y parafina a una relación 1:1 obtenidas en el ejemplo 5 y las microcápsulas equivalentes no recubiertas se enfrentaron a un rango de temperatura entre 50 y 80°C. Las temperaturas se eligieron de acuerdo con los parámetros de procesamiento de los alimentos comúnmente utilizados.

Las microcápsulas fueron suspendidas en 10 mL de agua y sumergidas en un baño de agua a 50, 60 y 80°C durante 15 minutos. La absorción de agua se midió pesando las microcápsulas filtradas y referenciando dicho peso al peso seco añadido a cada tubo. También se consideró el agua superficial. La figura 11 muestra los resultados en términos de aumento del porcentaje de peso debido a la absorción de agua. Puede observarse que las microcápsulas recubiertas de cera de abeja y parafina poseen una barrera efectiva contra la humedad (es decir, son más impermeables a la absorción de agua) en comparación con las microcápsulas no recubiertas. La reducción de la absorción de agua es interesante para preservar las bacterias microencapsuladas en un ambiente de baja actividad de agua y lograr una mayor vida útil del probiótico.

También se estudió la viabilidad de bacterias probióticas (B. bifidum L. plantarum) contenidas en las mismas microcápsulas bajo las condiciones anteriores en solución. Para ello, todas las microcápsulas se recuperaron por filtración y se rompieron en presencia de 10 mL de solución de ácido cítrico 0.1 M. Las microcápsulas no recubiertas se rompieron directamente por la acción del vortex. Las microcápsulas recubiertas se rompieron mecánicamente en un mortero. Las bacterias se cultivaron directamente en placas de MRS agar. La cantidad de bacterias supervivientes se comparó con la cantidad de bacterias antes del tratamiento térmico (% de supervivencia). Los resultados expresados como % de supervivencia de la suma de B. bifidum + L. plantarum se muestran en la Figura 12. Se puede observar que la supervivencia tras el tratamiento térmico aumenta considerablemente en las microcápsulas recubiertas, hasta el punto de que la viabilidad bacteriana se pierde completamente tras el tratamiento a 80 °C en las microcápsulas no recubiertas, mientras que la supervivencia de las bacterias en las micropartículas recubiertas se mantiene en torno al 50%.

Ejemplo 7: mejora de la estabilidad térmica

La supervivencia bacteriana en el experimento anterior podría estar relacionada tanto con la reducción de la absorción de agua como con la mejora de la resistencia térmica. Para estudiar la influencia de la resistencia térmica de las microcápsulas sobre la viabilidad bacteriana como factor aislado, se realizó un nuevo experimento en condiciones secas. Las microcápsulas F de control (no recubiertas) y las microcápsulas F recubiertas de cera de abeja con una relación 1:1 y 1:2 (p/p), como las obtenidas en el ejemplo 5, se sometieron a una temperatura de 80 °C durante 40 minutos en un horno. Luego se rompieron las microcápsulas y se determinó el porcentaje de supervivencia de los probióticos como se explicó anteriormente. Los resultados se muestran en la Figura 13. Se observó una mejora significativa de la supervivencia de las bacterias debido al recubrimiento de cera de abeja después de 40 minutos de tratamiento térmico. Ejemplo 8: resistencia gástrica del microorganismo probiótico encapsulado

Para asegurar la actividad óptima de los componentes activos probióticos y simbióticos, las bacterias tienen que estar vivas hasta que lleguen al colon. La supervivencia de los microcápsulas D (antes del recubrimiento) y una cantidad similar de bacterias libres de L.plantarum se determinó antes y después de una simulación gástrica e intestinal. Se siguió un protocolo que ha sido descrito previamente (Chávarri et al, supra). Los resultados expresados en % de supervivencia se muestran en la Figura 14. Se puede observar que la supervivencia de las bacterias microencapsuladas según la invención aumentó significativamente cuando se comparan con las mismas bacterias sin microencapsulación.

Referencias citadas en la solicitud

WO2013114185

WO2012142153

Chávarri M et al, “Microencapsulation of a probiotic and prebiotic in alginate-chitosan capsules improves survival in simulated gastro-intestinal conditions”. International Journal of Food Microbiology (2010), vol. 142, p. 185-189.

WO2011004375

US2010196323

US2007048295

US2013323362

Anal et al ("Recent advances in microencapsulation of probiotics for industrial applications and targeted delivery", Trends in Food Science and Technology 2007, vol. 18, no. 5, pages 240-251).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una microcápsula con un tamaño de 10 a 3000 mm que comprende

i) un núcleo que comprende al menos un probiótico, un prebiótico o una mezcla de los mismos embebido en un polímero seleccionado entre alginato y pectina,

2. La microcápsula según la reivindicación 1, que comprende una o más capas intermedias entre la capa interna y la capa externa, en la que la una o más capas intermedias comprenden al menos un probiótico, un prebiótico o una mezcla de los mismos embebido en un polímero seleccionado de alginato y pectina que es diferente de al menos un probiótico o prebiótico contenido en las capas adyacentes.

3. La microcápsula según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en la que el núcleo comprende al menos un probiótico, prebiótico o una mezcla de los mismos embebido en alginato.

4. La microcápsula según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que la capa interna comprende al menos un probiótico, prebiótico o una mezcla de los mismos embebido en alginato.

5. La microcápsula según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que la capa interna comprende al menos un probiótico, prebiótico o una mezcla del mismo embebido en pectina.

6. La microcápsula según cualquiera de las reivindicacione 1-5, en la que el material hidrófobo de la capa externa está formado por ácidos grasos o cera.

7. La microcápsula según la reivindicación 1, que tiene un tamaño de 50 a 500 mm y además comprende:

i) un núcleo que comprende al menos un probiótico, un prebiótico o una mezcla de los mismos embebido en alginato, ii) una capa interna que rodea el núcleo y que comprende al menos un probiótico, un prebiótico o una mezcla de los mismos embebido en un polímero seleccionado de alginato y pectina, y

iii) una capa externa de cera que rodea la capa interna,

en la que el núcleo comprende al menos un probiótico o prebiótico que sea diferente e incompatible con al menos un probiótico o prebiótico contenido en la capa interna.

8. Uso de la microcápsula tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para la fabricación de un alimento, un pienso, un ingrediente para alimentos o piensos, un nutracéutico, un producto sanitario o un producto agronómico.

9. Un alimento, un pienso, un ingrediente para alimentos o piensos, un nutracéutico, un producto sanitario o un producto agronómico que comprende microcápsulas tal como se definen en cualquiera de las reivindicaciones 1 -7.

10. Un procedimiento para la preparación de una microcápsula como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-7 que comprende:

v) secar las microcápsulas obtenidas en la etapa iv) y

11. El procedimiento según la reivindicación 10, en el que la concentración del polímero en las soluciones i) y ii) es del 1 al 3 % (p/v) cuando el polímero es alginato y de 3 a 7% (p/v) cuando el polímero es pectina.

12. El procedimiento de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 10-11, en el que el probiótico, cuando está presente en las soluciones para el núcleo y/o para la capa interna y/o para la capa intermedia, se encuentra a una concentración de 107 a 109 cfu/mL de solución y el prebiótico, cuando está presente en las soluciones para el núcleo y/o para la capa interna y/o para la capa intermedia, se encuentra a una concentración de 0,01 a 0,05 g/mL de solución.

13. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 10-12, en el que el material hidrófobo comprendido en el recubrimiento del paso (vi) se selecciona de ácidos grasos y cera.

14. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 10-13, que adicionalmente comprende el paso de aplicar una fuerza electroestática a las microcápsulas en extrusión.