ES2695754B2 - Compuestos y sus usos como sondas fluorescentes - Google Patents
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Description
DESCRIPCION
Compuestos y sus usos como sondas fluorescentes
La presente invention se refiere a unos compuestos basados en derivados de F-BODIPY y carnitina como colorantes organicos. Ademas se refiere a su procedimiento de obtencion y su aplicacion para el etiquetado fluorescente especlfico de mitocondrias en celulas vivas. Por tanto, la invencion se engloba en el campo de las sondas fluorescentes para marcaje biologico.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
Las mitocondrias son los organulos presentes en casi todas las celulas eucariotas encargados de la production de energla en forma de ATP a traves de la respiration celular. Ademas, estan involucradas en el metabolismo de grupos hemo, la homestasis del calcio, la produccion de especies reactivas de oxlgeno (ROS), la inflamacion, la proliferation celular y la apoptosis, cumpliendo asl un papel esencial en la supervivencia de la celula. Estos organulos contienen ademas su propio ADN mitocondrial (mtADN), que es independiente del ADN del nucleo celular. El conjunto de mitocondrias de la celula (condrioma celular) tiene un caracter dinamico que esta regulado por complejos mecanismos de comunicacion celular, tanto a nivel intra- como extracelular, para responder a las variaciones en las demandas energeticas de la celula mediante procesos de fusion, fision, autofagia (mitofagia) y biogenesis mitocondrial. El dano o desregulacion de estos mecanismos esta implicado en numerosos procesos patologicos, bien directamente, como en las enfermedades geneticas mitocondriales, o de forma secundaria en enfermedades neurodegenerativas, inflamatorias, cardiovasculares y en algunos slndromes metabolicos (Suliman, H. B.; Piantadosi, C. A. Pharmacol. Rev. 2016, 68, 20). Se conoce desde hace tiempo que existe ademas una relacion entre los cambios en el condrioma celular y los procesos de envejecimiento, bien como causa o como efecto (Harman, D. J Gerontol 1956, 11, 298; Balaban, R. S.; Nemoto, S.; Finkel, T. Cell 2005, 120, 483). Estudios recientes estan empezando a demostrar que el metabolismo mitocondrial puede ser tambien una diana terapeutica importante para el tratamiento del cancer (Weinberg, S. E.; Chandel, N. S. Nat. Chem. Biol. 2015, 11, 9).
Aunque se han dedicado grandes esfuerzos al estudio de la biologla de las mitocondrias, estamos todavla lejos de conocer en detalle muchas de sus funciones y actividades basicas. El desarrollo de nuevas tecnologlas que faciliten este estudio es esencial para poder desentranar el complejo papel que juegan estos organulos en el metabolismo celular y sus efectos sobre el envejecimiento y el desarrollo y posible tratamiento de muchas enfermedades. En comparacion con las tecnicas anallticas tradicionales, como los ensayos colorimetricos, las sondas fluorescentes (Li, X.; Gao, X.; Shi, W.; Ma, H. Chem. Rev. 2014, 114, 590) son actualmente las herramientas moleculares mas eficientes y versatiles para el estudio de los sistemas biologicos gracias a su gran sensibilidad, selectividad y facilidad de uso, proporcionando una information muy variada en tiempo real y de forma no destructiva. Para su uso en microscopla de celulas vivas, una sonda fluorescente debe de cumplir idealmente una serie de requisitos basicos: 1) alta luminiscencia (alto rendimiento cuantico) en medio acuoso al ser iluminada en el rango visible-infrarrojo cercano; 2) alta especificidad y afinidad por su estructura celular o biomolecula objetivo; 3) elevada estabilidad qulmica y fotoestabilidad en el medio celular; 4) capacidad para penetrar en la celula; 5) buena solubilidad en agua; y 6) baja o nula toxicidad.
Aunque se conocen actualmente una gran variedad de sondas fluorescentes para la visualization especlfica de mitocondrias, algunas de ellas disponibles comercialmente como por ejemplo etil ester de tetrametilrodamina (TMRE), yoduro de 3,3’-dihexiloxacarbocianina (CiOC6(3)), MitoTracker® rojo o MitoTracker® verde, ninguna cumple con todos los requerimientos mencionados (Xu, Z.; Xu, L. Chem. Commun.
2016, 52, 1094).
Una caracterlstica comun de todas estas sondas es la presencia de un grupo cationico (amonio o fosfonio) que promueve su incorporacion a la mitocondria gracias al elevado gradiente de potencial negativo caracterlstico de este organulo. Ademas, todos ellos estan basados en estructuras de xantenos o cianinas como grupo cromoforico, ambos incorporando aminas en su esqueleto, lo que reduce significativamente su fotoestabilidad, especialmente en condiciones drasticas de bombeo como las implicadas en microscopla de alta resolution (Alvarez, M.; Amat, F., Costela, A.,Garcia-Moreno, I., Gomez, C., Liras, M., Sastre, R. Appl. Phys. B. 2005, 80, 993; Cerdan, l., Enciso, E, Martin, V., Banuelos, J., Lopez Arbeloa, I.; Costela, A., Garcia-Moreno, I. Nature Photonics, 2012, 6, 621).
Por tanto, es de gran interes el desarrollo de nuevas sondas fluorescentes como marcadores espedficos de mitocondrias en celula viva que puedan superar las limitaciones que presentan los sistemas actualmente comercializados para esta aplicacion.
DESCRIPCION DE LA INVENCION
La presente invencion describe unas nuevas sondas fluorescentes como marcadores espedficos de mitocondrias en celula viva basadas en compuesto que comprende una unidad F-BODIPY como grupo fluoroforo y una unidad L-carnitina como grupo localizador, cuyo sistema supera las limitaciones que presentan los sistemas actualmente comercializados para esta aplicacion. Ambas unidades se han unido a traves del atomo de boro del fluoroforo, lo que simplifica enormemente la estructura final y el procedimiento de smtesis. Al usar directamente un F-BODIPY como producto de partida, el metodo tiene caracter general y puede proporcionar otras sondas similares con frecuencias de absorcion y emision sintonizables a lo largo del espectro visible dependiendo solo del F-BODPY empleado.
Los ensayos de tincion de celulas vivas humanas de origen tumoral con los nuevos marcadores fluorescentes han mostrado la selectividad por mitocondrias demostrada con ensayos de co-tincion con MitoTracker® rojo comercial. La eficiencia y selectividad del marcaje es independiente del patron de sustitucion en el cromoforo asi como de la lmea celular ensayada. Las nuevas sondas muestran propiedades interesantes con respecto al MitoTracker® rojo comercial. En primer lugar, el MitoTracker® rojo parece concentrarse en los bordes de la mitocondria, mientras que la tincion con las nuevas sondas se localiza preferentemente en su interior (la matriz mitocondrial). Ademas, la intensidad de la tincion con las nuevas sondas aumenta progresivamente con el tiempo de incubacion de las celulas, mientras que el colorante comercial aparenta tenir estos organulos de forma casi instantanea. Estas caracteristicas estan revelando, en el caso de las nuevas sondas y a diferencia del marcador comercial, la intervencion de un mecanismo de transporte activo de las mismas hacia el interior de la mitocondria.
La metodologia descrita en la presente invencion proporciona un nuevo y eficaz protocolo de smtesis para el desarrollo de nuevos colorantes con propiedades
avanzadas para ser aplicados como biomarcadores selectivos, estables, eficaces y baratos.
Por tanto, un primer aspecto de la presente invencion se refiere a un compuesto de
formula general (I) (a partir de ahora compuesto de la invencion):
donde:
Z se selecciona de entre un atomo de nitrogeno (N) o un grupo C(R7);
R1 a R7 se seleccionan cada uno independientemente entre hidrogeno, alquilo C1-C18 sustituido o no sustituido, alquenilo C2-C18 sustituido o no sustituido, alquinilo C2-C18 sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, halogeno, -OR’, -COOR’, -SR’, -SOR’, -SOOR’ y -NR'R''; o cada dos radicales R1 a R7, continuos entre si como por ejemplo R1 y R2, R2 y R3, R4 y R5 R6, forman un cicloalquilo, arilo o heteroarilo;
R’ y R’’ se seleccionan cada uno independientemente entre hidrogeno, alquilo C1-C18, alquenilo C2-C18, alquinilo C2-C18, arilo o heteroarilo; y
X- es un contraion,
o cualquiera de sus isomeros.
En una realization preferida, Z es C(R7) y el compuesto serla el siguiente compuesto
de formula (II):
donde R1 a R7 y X" son los definidos anteriormente.
El termino “alquilo” se refiere, en la presente invencion, a cadenas hidrocarbonadas saturadas, lineales o ramificadas, que tienen de 1 a 18 atomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, terc-butilo, sec-butilo, n-pentilo, nhexilo, etc. Preferiblemente el grupo alquilo tiene entre 1 y 6 atomos de carbono. Los grupos alquilo pueden estar opcionalmente sustituldos por uno o mas sustituyentes tales como alquinilo, alquenilo, halo, hidroxilo, alcoxilo, carboxilo, ciano, carbonilo, acilo, alcoxicarbonilo, amino, nitro o mercapto.
El termino “alquenilo” se refiere, en la presente invencion, a cadenas hidrocarbonadas insaturadas, lineales o ramificadas, que tienen de 2 a 18 atomos de carbono, preferiblemente de 2 a 6, y que contienen uno o mas enlaces carbono-carbono dobles y que opcionalmente puede contener algun enlace triple, por ejemplo, vinilo, 1-propenilo, alilo, isoprenilo, 2-butenilo, 1,3-butadienilo, etc. Los radicales alquenilos pueden estar opcionalmente sustituldos por uno o mas sustituyentes tales como alquilo, alquinilo, halo, hidroxilo, alcoxilo, carboxilo, ciano, carbonilo, acilo, alcoxicarbonilo, amino, nitro o mercapto.
El termino “alquinilo” se refiere a radicales de cadenas hidrocarbonadas, lineales o ramificadas, de 2 a 18 atomos de carbono, preferiblemente de 2 a 6, y que contienen al menos uno o mas enlaces carbono-carbono triples y que opcionalmente puede contener algun enlace doble, por ejemplo, etilino, propinilo, butinilo, etc. Los radicales
alquinilos pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o mas sustituyentes tales como alquilo, alquenilo, halo, hidroxilo, alcoxilo, carboxilo, ciano, carbonilo, acilo, alcoxicarbonilo, amino, nitro o mercapto.
El termino “arilo”, se refiere, en la presente invencion, a anillos aromaticos, sencillos o multiples, que tienen entre 5 a 18 atomos de carbono en la parte del anillo, tales como pero sin limitarse a, fenilo, naftilo, difenilo, indenilo, fenantrilo, fluorenilo o antracilo. Preferiblemente el grupo arilo tiene de 5 a 7 atomos de carbono y mas preferiblemente el grupo arilo es un fenilo. Los radicales arilo pueden estar opcionalmente sustituidos en cualquiera de sus posiciones por uno o mas sustituyentes o dos sustituyentes formando un ciclo condensado al arilo y se seleccionan independientemente entre tales como alquilo, alquenilo, alquinilo, O-alquilo, O, halogeno, hidroxilo, amino o acido carboxllico. En una realizacion preferida el arilo es un fenilo opcionalmente sustituido y mas preferiblemente un fenilo opcionalmente sustituido por mas de un grupo alquilo, tal como se ha definido anteriormente.
El termino “heteroarilo” se refiere a un arilo, como se ha definido anteriormente, que contiene al menos un atomo distinto de carbono, tales como S, N, o O, formando parte del anillo aromatico.
Por “cicloalquilo” se refiere la presente invencion a un radical estable monoclclico o biclclico de 3 a 10 miembros, que esta saturado o parcialmente saturado, y que consiste en atomos de carbono e hidrogeno, tal como ciclopentilo, ciclohexilo o adamantilo. Los radicales cicloalquilo pueden estar opcionalmente sustituidos en cualquiera de sus posiciones por uno o mas sustituyentes o dos sustituyentes formando un ciclo condensado al cicloalquilo y se seleccionan independientemente entre tales como alquilo, alquenilo, alquinilo, O-alquilo, O, halogeno, hidroxilo, amino o acido carboxllico.
Por “halogeno” se entiende en la presente invencion a un atomo de bromo, cloro, yodo o fluor.
En otra realizacion preferida, R7 es un arilo opcionalmente sustituido, mas preferiblemente R7 es un fenilo opcionalmente sustituido y mas preferiblemente fenilo sustituido por alquilo C1-C6, aun mas preferiblemente es un trimetilfenilo.
En otra realization preferida, R2 y/o R5 son hidrogeno o alquilo C1-C6, mas preferiblemente hidrogeno o metilo y aun mas preferiblemente son hidrogeno. En una realization aun mas preferida R2 y R5 son hidrogeno.
En otra realizacion preferida, R1, R3, R4 y R6 son cada uno independientemente hidrogeno o alquilo C1-C6, mas preferiblemente R1, R3, R4 y R6 son cada uno independientemente hidrogeno o metilo. Mas preferiblemente R1, R3, R4 y R6 son hidrogeno o metilo.
El contraion (X-) es cualquier anion farmaceuticamente aceptable conocido por un experto en la materia y preferiblemente se puede seleccionar de la lista que
preferiblemente X- se puede seleccionar de entre un halogenuro que se puede seleccionar de entre Cl-, Br-, I-, F-; SO4-, BF4-, PF4-, HSO4- y (SO42-)1/2. Mas preferiblemente X- es un halogenuro, aun mas preferiblemente Cl-.
Por “isomero” se refiere en la presente invention tambien a cualquier mezcla racemica.
En una realizacion aun mas preferida, el compuesto de la invention se selecciona de entre:
Otro aspecto de la presente invention se refiere a un procedimiento para la obtencion de un compuesto de la invention que comprende la reaction entre un compuesto de formula (III) y carnitina:
donde Z, R1 a R6 y X" son los definidos anteriormente.
En una realizacion preferida del procedimiento de la invencion, carnitina puede seleccionarse entre L-carnitina, D-carnitina y mezcla racemica D/L-carnitina, preferiblemente es L-carnitina.
La reaccion descrita se puede llevar a cabo en presencia de un exceso de reactivo, donde este reactivo se puede seleccionar entre cloruro de trimetilsililo (TMSCl), BCl3, BBr3, AlCl3, AlBr3, SnCl4, SnBr4, SiCl4, SiBr4, trifluorometilmetanosulfonato de trimetilsililo (Me3SiOTf), trifluorometilmetanosulfonato de trietilsililo (Et3SiOTf) y trifluorometilmetanosulfonato de triisopropilsililo (/-Pr3SiOTf). Preferilbemente la reaccion se lleva a cabo en presencia de exceso de cloruro de trimetilsililo, aproximadamente entre 20-50 mol-equiv.
En otra realizacion preferida del procedimiento de la invencion la reaccion se lleva a cabo en un disolvente polar aprotico capaces de disolver la carnitina. El disolvente se puede seleccionar de entre acetonitrilo, dimetilformamida, dimetilacetamida, N-metilpirrolidona, sulfolano, o mezclas de este disolvente polar aprotico con otros disolventes aproticos menos polares, como por ejemplo, sin limitarse a diclorometano, 1,2-dicloetano, tetrahidrofurano, 2-methyl tetrahidrofurano, 1,4-dioxano, 1,2-diclorobenceno, acetato de etilo o acetona. En una realizacion preferida el disolvente es acetonitrilo.
Por otro lado, la solubilidad de la carnitina en disolventes organicos se puede mejorar cambiando el anion de la sal a los siguientes aniones: BF4-, PF6-, BPh4-, p
toluensulfonato, mesilato, trifluorometanosulfonato, acetato, benzoato, tricloroacetato o trifluoroacetato.
En otra realization de la presente invention el procedimiento se lleva a cabo a una temperatura de entre 50-150 °C, en una realizacion preferida las reaction se lleva a cabo en condiciones termicas mediante irradiation por microondas.
En una realizacion preferida, el procedimiento de invencion se lleva a cabo en presencia de un exceso de cloruro de trimetilsililo en acetonitrilo y en condiciones termicas mediante irradiacion por microondas.
Posteriormente a la reaccion el compuesto obtenido de formula (I) se puede recristalizar o purificar cromatograficamente, despues de evaporar la mezcla de reaccion a presion reducida.
Otro aspecto de la presente invencion se refiere al uso del compuesto de la invencion como marcador o sonda fluorescente. Mas preferiblemente para el marcaje celular y aun mas preferiblemente para el marcaje celular especlfico de mitocondrias, mas preferiblemente de celulas vivas, y aun mas preferiblemente en celulas vivas de mamlferos, preferiblemente humanas. Las celulas a marcar seran preferiblemente celulas de origen tumoral.
Otro aspecto de la presente invencion se refiere al uso del compuesto de la invencion, para la fabrication de marcadores para el diagnostico de enfermedades mitocondriales. Estas enfermedades se pueden seleccionar de entre deficiencia en translocasa carnitina-acilcarnitina, descompensacion metabolica en la infancia, cardiomiopatla en la ninez, fatigabilidad en la edad adulta, trastornos en el metabolismo y transporte de carnitina, ademas de enfermedades como cancer, diabetes tipo-2, enfermedades neurologicas, como por ejemplo el Parkinson y enfermedades cardiovasculares, como por ejemplo ateroesclerosis.
A lo largo de la description y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras caracterlsticas tecnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y caracterlsticas de la invencion se desprenderan en parte de la descripcion y en parte de la practica de la invencion. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustracion, y
no se pretende que sean limitativos de la presente invencion.
DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
Fig. 1. Marcaje de celulas SCC38 in vivo con el compuesto 4 a diferentes concentraciones (50, 100 y 500 nM). Barra de escala: 10 pm
Fig. 2. Estudios de citometrla de flujo en celulas marcadas con el compuesto 4 y MitoTracker® rojo de las llneas SCC38 y HeLa. Histogramas en los que se representa la intensidad del marcaje frente al numero de eventos, para cada uno de los tiempos de tincion (5, 15 y 30 min) y el control (Ctrl), para las celulas SCC38 y HeLa, y para cada uno de los dos marcadores.
EJEMPLOS
A continuation se ilustrara la invencion mediante unos ensayos realizados por los inventores donde se describe la obtencion de unas sondas fluorescentes de la invencion, as! como su evaluation como marcadores de mitocondrias en celulas vivas de origen tumoral, que pone de manifiesto la efectividad del compuesto de la invencion mediante el seguimiento de su actividad tanto por microscopla confocal de fluorescencia como por citometrla de flujo.
A. SINTESIS DE LOS COMPUESTOS 3 y 4
El metodo general para la preparation de estas sondas fluorescentes derivadas de l-carnitina se basa en la funcionalizacion racional de la molecula objetivo que se muestra en forma generica en el esquema 1:
Esquema 1 - Sfntesis de dos sondas BODIPY-carnitina (compuestos 3 y 4).
Mediante esta sfntesis la carnitina se une directamente al atomo de boro del F-BODIPY en forma de B-espiro-derivado a traves de los grupos hidroxilo y carboxilo para generar el correspondiente derivado O-BODIPY. De esta forma, se simplifica el proceso de sfntesis al evitar procesos de funcionalizacion previa del fluoroforo o la introduction de conectores, reduciendo con ello el tamano y complejidad de la sonda final al mfnimo posible. Aunque se conocen varios metodos de sfntesis de O-BODIPYs a partir de los correspondientes F-BODIPYs en la presente invention se ensaya el descrito en Manzano, H. et al., Adv. Funct. Mater. 2016, 26, 2756.
Todos los reactivos utilizados en la preparation de los compuestos anteriores son comerciales o se prepararon siguiendo metodos previamente descritos en la literatura. Los disolventes anhidros se trataron mediante las tecnicas habituales de secado o con un sistema de purification de disolventes PureSol modelo 400-3-MD para el secado de los siguientes disolventes (THF, CH2Cl2, MeCN, tolueno, eter dietflico y DMF) y se usaron en la reaction inmediatamente. Las reacciones con irradiation de microondas (MW) se llevaron a cabo en un tubo cerrado en un reactor de microondas focalizadas CEM Discover o Anton Parr Monowave 300, usando tubos estandar de Pyrex de 10 mL de capacidad cerrados con un tapon con septum. Todos los experimentos se llevaron a cabo a una potencia maxima de 300 W y una presion maxima de 20 bares. El seguimiento de las reacciones se llevo a cabo mediante cromatograffa en capa fina (CCF) empleando cromatofolios de gel de sflice tipo 60 F254 (230-400 mesh) con soporte de alumino y un espesor de capa de 0,2 mm (Merck). Las placas de CCF se visualizaron bajo una lampara de UV 254/365 nm.
Compuesto 3. A una suspension de hidrocloruro de L-carnitina (20 mg, 0,100 mmol) en MeCN anhidro (5 mL) en un vial de microondas de 10 mL con barra agitadora se anadio el compuesto 1 (Nepomnyashchii, A. B.; et al., J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 8633) (30 mg, 0,097 mmol) y cloruro de trimetilsililo (TMSCl) (491 pL, 3,87 mmol). La reaction se calento con el siguiente gradiente de temperatura en un reactor de microondas focalizadas: 25-80 °C en 30 minutos, 80-100 °C en 5 minutos, 100 °C durante 30 minutos, 100-120 °C en 10 minutos, 120 °C durante 30 minutos y 120-150 °C en 1 hora. La mezcla de reaccion se evaporo a presion reducida y el crudo de reaccion se disolvio en la minima cantidad de CH2Cl2 y se re-precipito anadiendo terc-butil metil eter, para dar el compuesto 3 (26,5 mg, 63%) como un solido rojo con fluorescencia verde en disolucion.
1H NMR (CDCI3, 400 MHz): 5 = 8.14 (s, 1H, C5H), 7.83 (s, 1H, C3H), 6.95 (s, 2H, C3'H, C5'H), 6.70 (m, J = 4.15 Hz, 2H, C1H, C7H), 6.49 (dd, J = 8.40, 4.15 Hz, 2H, C2H, C6H), 4.98 (t, J = 10.75 Hz, 1H, C3"H), 4.33 (d, J = 13.49 Hz, 1H, C4"H), 3.62 -3.52 (m, 1H, C4"H), 3.41 (s, 9H, C5"H3, C6"H3, C7"H3), 2.98 (d, J = 16.3 Hz, 1H, C2"H), 2.74 - 2.59 (m, 1H, C2"H), 2.36 (s, 3H, CH3-C4'),2.05 (s, 6H, CH3-C2 ', CH3-C6'). 13C NMR (101 MHz, CDCU): 5= 168.80 (C1"), 148.00 (C8), 145.25 (C3), 144.45 (C5), 139.23 (C4'), 136.44 (C2'), 135.91 (C6'), 135.53 (C7a), 135.49 (C8a), 131.10 (C7H), 130.78 (C1), 129.54 (C1'), 128.51 (C3'), 128.34 (C5'), 119.20 (C6), 119.16 (C2), 69.53 (C4"), 63.06 (C3"), 55.01 (C5", C6", C7"), 36.95 (C2"), 21.28 (CH3-C4'), 20.11 (CH3-C2 '), 20.04 (CH3-C6'). HRMS (ESI+) m/z: calculada para C25H31BN3O3+ [M+]: 432.2453, encontrada 432.2453. IR (KBr): v = 1719.76 (C=O), 1560.24, 1411.23, 1383.73, 1257.88, 1108.77, 1070.62 cm-1.
Compuesto 4. A una suspension de hidrocloruro de L-carnitina (14,5 mg, 0,072 mmol) en MeCN anhidro (5 mL) en un vial de microondas de 10 mL con barra agitadora, se anadio el compuesto 2 (Kee, H. L.; et al., J. Phys. Chem. B 2005, 109, 20433) (32,3
mg, 0,088 mmol) y TMSCI (466 pL, 3,67 mmol). La reaccion se calento con el siguiente gradiente de temperatura en un reactor de microondas focalizadas: 25-80 °C en 30 minutos, 80-100 °C en 5 minutos, 100 °C durante 30 minutos, 100-120 °C en 10 minutos y 120 °C durante 2 horas. La mezcla de reaccion se evaporo a presion reducida y el crudo de reaccion se disolvio en la minima cantidad de CH2Cl2 y se reprecipito anadiendo terc-butil metil eter, para dar el compuesto 4 (31,8 mg, 88%) como un solido rojo con fluorescencia verde en disolucion.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): 5 = 6.97 (s, 1H, C3'H), 6.95 (s, 1H, C5'H), 5.99 (s, 1H, C6H), 5.97 (s, 1H, C2H), 4.55 (s, 1H, C3"H), 4.17 (s, 1H, C4"H), 3.32 (s, 9H, C5"H, C6”H, C7"H), 3.26 (s, 1H, C4"H), 2.87 (d, J = 14.45 Hz, 1H, C2"H), 2.54 (s, 3H, CH3-C5), 2.47 (d, J = 14.45 Hz, 1H, C2"H), 2.39 (s, 3H, CH3-C3), 2.34 (s, 3H, CH3-C4'), 2.08 (s, 3H, CH3-C2'), 1.98 (s, 3H, CH3-C6'), 1.39 (s, 3H, CH3-C7), 1.38 (s, 3H, CH3-C1). 13C NMR (101 MHz, CDCI3): 5 = 168.85 (C1"), 155.71 (C3), 154.12 (C5), 143.83 (C8a), 143.52 (C7a), 142.52 (C8), 139.23 (C4'), 135.03 (C6'), 133.90 (C2'), 131.52 (C1), 131.39 (C7), 130.83 (C1'), 129.57 (C5'), 129.25 (C3'), 122.46 (C6), 122.43 (C2), 69.45 (C4”,), 62.31 (C3"), 55.07 (C5", C6", C7"), 37.06 (C2"), 21.36 (CH3-C4'), 19.76 (CH3-C2 '), 19.42 (CH3-C6'), 17.39 (CH3-C5), 15.67 (CH3-C3), 13.85 (CH3-C7), 13.72 (CH3-C1 ). HRMS (ESI+) m/z: calculada para C29H39BN3O3+ [M+]: 488.3079, encontrada 488.3090. IR (KBr): v = 1720.45 (C=O), 1546.29, 1505.72, 1470.57, 1295.12, 1187.69, 1155.63, 1083.56, 1043.53, 982.88 cm-1.
B. Caracterizacion de las nuevas sondas fluorescentes (compuestos 3 y 4) como marcadores de mitocondrias
Los ensayos celulares se llevaron a cabo sobre dos llneas celulares humanas: SCC38 y HeLa. La llnea SCC38 procede de carcinoma epidermoide de laringe de pacientes humanos, mientras que HeLa, la primera llnea celular humana establecida en cultivo, deriva de cancer de cervix. El medio de cultivo utilizado para ambas llneas celulares fue DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) suplementado con 10% de suero
bovino fetal (FBS), 100 U/mL de penicilina, 200 pg/mL de estreptomicina, 100 pmol/L de aminoacidos no esenciales y 2 mmol/L de glutamina. Los cultivos se incubaron a 37 °C y 5% de CO2.
Estas llneas celulares se tineron con las sondas fluorescentes sintetizadas siguiendo el protocolo que se describe: Se sembraron 30000-50000 celulas SCC38 en placas de 24 pocillos con fondo de cristal que se cultivaron hasta alcanzar una confluencia del 70%. Entonces se retiro el medio de cultivo del pocillo y se realizaron al menos 3 lavados con medio DMEM sin aditivos. Tras ello se anadio al pocillo 1 mL de DMEM y el compuesto fluorescente correspondiente. Las celulas se incubaron a 37 °C durante 30 minutos, tras lo que se retiro el medio y se realizaron nuevos lavados con DMEM. Por ultimo se anadio medio completo y se observaron las celulas al microscopio. El analisis al microscopio se realizo usando un equipo Zeiss AxioObserver Z1 con AxioCam MRM y ApoTome 2 (Carl Zeiss, Alemania) con distintos objetivos de aceite de inmersion 40X 63X. Las celulas se tineron tambien con MitoTracker® Red CMXRos (Thermo Fisher) segun las instrucciones del fabricante, con el fin de realizar estudios comparativos con los nuevos marcadores fluorescentes aqul sintetizados. Inicialmente, ambos compuestos 3 y 4 se utilizaron a una concentration de 50 nM, y el tiempo de tincion fue tambien de 30 minutos.
A modo de ejemplo, se describe el comportamiento del compuesto 4 marcando celulas de SCC38 y analizado por microscopia celular de fluorescencia. En la Fig. 1 se presentan la intensidad de marcaje en funcion de la concentracion de colorante en el medio.
Para confirmar la especificidad del marcaje por las mitocondrias, se llevaron a cabo estudios de co-localizacion mediante co-tincion con el marcador de mitocondrias comercial MitoTracker® rojo en la llnea celular. El compuesto 4 se utilizo a una concentracion de 50 nM y el MitoTracker® Red a 25 nM. Se anadieron ambos compuestos a la vez y se incubaron durante 30 minutos. Las celulas marcadas con ambos compuestos se observaron tanto con el microscopio Zeiss AxioObserver Z1 como con un microscopio laser confocal espectral Leica TCS-SP8X (Servicios Cientlfico-Tecnicos, Universidad de Oviedo).
Los estudios de microscopla celular mostraron, en el caso de la co-tincion con ambos
compuestos a la vez, una buena co-localizacion de las dos sondas sin interferencias ni efectos citotoxicos. Cabe destacar que en muchos casos se pudo observar que la tincion del MitoTracker® rojo se concentro en los bordes de la mitocondria, mientras que la tincion verde del compuesto 4 se localizo preferentemente en su interior (la matriz mitocondrial).
La cinetica del marcaje celular con 4 se estudio por citometrla de flujo con las llneas celulares SCC38 y HeLa, utilizando MitoTracker® rojo como marcador control, ambos a una concentration de 50 nM. Los tiempos de tincion estudiados fueron de 5, 15, 30 y 45 minutos. Tras la tincion, se retiro el medio, se lavo con PBS, se tripsinizo y el pellet se re-suspendio en 500 pL de PBS y se introdujo en el citometro tras filtracion. Se utilizo un citometro de flujo Analizador Celular Cytomics FC500 de Beckman Coulter (Servicios Cientlfico-Tecnicos, Universidad de Oviedo). Parte de las celulas resuspendidas fueron sembradas y observadas tambien al microscopio. Como se puede observar en la Fig. 2, la tincion con MitoTracker® rojo apenas vario al aumentar el tiempo de incubation con el marcador, mientras que el marcaje con el compuesto 4 aumento claramente de intensidad con el tiempo de incubacion. Se realizo un nuevo experimento de citometrla en el que se incluyo un tiempo de tincion mas largo (45 min), y en el que se pudo ver que el marcaje era aun mas intenso que con el tiempo de 30 minutos. Este hecho parece apuntar a la actuation de un mecanismo de transporte activo del compuesto 4 en la mitocondria. Por otro lado, en los experimentos de cotincion se observo que el MitoTracker® rojo parece concentrarse en los bordes de la mitocondria, mientras que la tincion verde del compuesto 4 se localiza preferentemente en su interior (la matriz mitocondrial). Estos hechos indicarlan que la internalization de la sonda 4, a diferencia del marcador comercial, implica la presencia de un mecanismo de transporte activo del compuesto 4 en la mitocondria.
Claims (17)
1. Compuesto de formula general (I)
donde:
Z se selecciona de entre un N o un grupo C(R7);
R1 a R7 se seleccionan cada uno independientemente entre hidrogeno, alquilo C1-C18 sustituido o no sustituido, alquenilo C2-C18 sustituido o no sustituido, alquinilo C2-C18 sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, halogeno, -OR’, -COOR’, -SR’, -SOR’, -SOOR’ y -NR'R''; o cada dos radicales R1 a R7 forman un cicloalquilo, arilo o heteroarilo;
R’ y R’’ se seleccionan cada uno independientemente entre hidrogeno, alquilo C1-C18, alquenilo C2-C18, alquinilo C2-C18, arilo o heteroarilo; y
X- es un contraion,
o cualquiera de sus isomeros.
2. Compuesto segun la reivindicacion 1, donde Z es C(R7).
3. Compuesto segun cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, donde R7 es un arilo opcionalmente sustituido.
4. Compuesto segun la reivindicacion 3, donde R7 es un trimetilfenilo.
5. Compuesto segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde R2 y/o R5 son hidrogeno.
6. Compuesto segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde R1, R3, R4 y R6 son cada uno independientemente hidrogeno o metilo.
7. Compuesto segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde R1, R3, R4 y R6 son hidrogeno o metilo.
8. Compuesto segun cualquier de las reivindicaciones 1 a 7, donde X" se selecciona de entre un halogenuro, SO4", BF4", PF4", HSO4" y (SO42")1/2.
9. Compuesto segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde X" es Cl".
10. Compuesto segun la reivindicacion 1, donde el compuesto se selecciona de entre:
11. Procedimiento de obtencion del compuesto de formula (I) descrito segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende la reaccion de un compuesto de formula (III) con carnitina:
donde: Z y R1 a R6 son los definidos en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
12. Uso del compuesto segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 como marcador o sonda fluorescente.
13. Uso segun la reivindicacion 12, para el marcaje celular.
14. Uso segun la reivindicacion 13, para el marcaje celular de mitocondrias.
15. Uso segun la reivindicacion 14, en celulas vivas.
16. Uso del compuesto segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, para la fabrication de marcadores para el diagnostico de enfermedades mitocondriales.
17. Uso segun la reivindicacion 16, donde las enfermedades mitocondriales se selecciona de entre deficiencia en translocasa carnitina-acilcarnitina, descompensacion metabolica en la infancia, cardiomiopatla en la ninez, fatigabilidad en la edad adulta, trastornos en el metabolismo, cancer, diabetes tipo-2, enfermedades neurologicas y enfermedades cardiovasculares.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BA2A | Patent application published |
Ref document number: 2695754 Country of ref document: ES Kind code of ref document: A1 Effective date: 20190110 |
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| PC2A | Transfer of patent |
Owner name: FUNDACION PARA LA INVESTIGACION E INNOVACION BIOSA Effective date: 20190128 |
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| FG2A | Definitive protection |
Ref document number: 2695754 Country of ref document: ES Kind code of ref document: B2 Effective date: 20190517 |
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| FD2A | Announcement of lapse in spain |
Effective date: 20240327 |