WO2019008209A1 - Compuestos y sus usos como sondas fluorescentes - Google Patents

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WO2019008209A1
WO2019008209A1 PCT/ES2018/070477 ES2018070477W WO2019008209A1 WO 2019008209 A1 WO2019008209 A1 WO 2019008209A1 ES 2018070477 W ES2018070477 W ES 2018070477W WO 2019008209 A1 WO2019008209 A1 WO 2019008209A1
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hydrogen
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Jose Luís CHIARA ROMERO
Inmaculada GARCÍA-MORENO GONZALO
Alberto BLÁZQUEZ MORALEJA
Maria Dolores CHIARA ROMERO
Inés SÁENZ DE SANTA MARÍA FERNÁNDEZ
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Consejo Superior De Investigaciones Científicas
Fundación Para El Fomento En Asturias De La Investigación Aplicada Y La Tecnología (Ficyt)
Fundación Para La Investigación E Innovación Biosanitaria En El Principado De Asturias (Finba)
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    • G03C1/00—Photosensitive materials
    • G03C1/72—Photosensitive compositions not covered by the groups G03C1/005 - G03C1/705
    • G03C1/73—Photosensitive compositions not covered by the groups G03C1/005 - G03C1/705 containing organic compounds

Definitions

  • the present invention relates to compounds based on F-BODIPY derivatives and carnitine as organic dyes.
  • it refers to its obtaining procedure and its application for fluorescent labeling specific to mitochondria in living cells. Therefore, the invention is encompassed in the field of fluorescent probes for biological labeling.
  • Mitochondria are the organelles present in almost all eukaryotic cells responsible for the production of energy in the form of ATP through cellular respiration. In addition, they are involved in the metabolism of heme groups, calcium homeostasis, production of reactive oxygen species (ROS), inflammation, cell proliferation and apoptosis, thus fulfilling an essential role in the survival of the cell. These organelles also contain their own mitochondrial DNA (mtDNA), which is independent of the DNA of the cell nucleus.
  • mtDNA mitochondrial DNA
  • the set of mitochondria in the cell (cellular chondrioma) has a dynamic character that is regulated by complex mechanisms of cellular communication, both intra- and extracellular, to respond to variations in the energy demands of the cell through fusion processes.
  • a fluorescent probe For use in live cell microscopy, a fluorescent probe must ideally fulfill a series of basic requirements: 1) high luminescence (high quantum yield) in aqueous medium when illuminated in the near-infrared visible range; 2) high specificity and affinity for its cellular structure or target biomolecule; 3) high chemical stability and photostability in the cell medium; 4) ability to penetrate the cell; 5) good solubility in water; and 6) low or no toxicity.
  • TMRE tetramethylrhodamine ethyl ester
  • CiOC6 (3) 3,3'- dihexyl oxacarbocyanine iodide
  • MitoTracker® Red or MitoTracker® green none complies with all the mentioned requirements (Xu, Z .; Xu, L. Chem. Commun. 2016, 52, 1094).
  • a common characteristic of all these probes is the presence of a cationic group (ammonium or phosphonium) that promotes its incorporation into the mitochondria thanks to the high negative potential gradient characteristic of this organelle.
  • a cationic group ammonium or phosphonium
  • all of them are based on xanthene or harmful structures as a chromophoric group, both incorporating amines in their skeleton, which significantly reduces their photostability, especially in drastic pumping conditions such as those involved in high resolution microscopy (Alvarez, M .; Amat, F., Costela, A., Garcia-Moreno, I., Gomez, C, Liras, M., Sastre, R. Appl. Phys. B.
  • the present invention describes new fluorescent probes as specific markers of mitochondria in living cells based on a compound comprising an F-BODIPY unit as a fluorophore group and an L-carnitine unit as a locator group, whose system overcomes the limitations of the systems currently marketed for this application. Both units have been bonded through the boron atom of the fluorophore, which greatly simplifies the final structure and synthesis procedure.
  • F-BODIPY directly as a starting product, the method is general in nature and can provide other similar probes with tunable absorption and emission frequencies throughout the visible spectrum depending only on the F-BODPY used.
  • a first aspect of the present invention relates to a compound of general formula (I) (hereinafter compound of the invention):
  • Z is selected from a nitrogen atom (N) or a group C (R 7 );
  • Ri to R 7 are each independently selected from hydrogen, substituted or unsubstituted C1-C18 alkyl, substituted or unsubstituted C2-C18 alkenyl, substituted or unsubstituted C2-C18 alkynyl, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted heteroaryl , halogen, -OR ⁇ -COOR ', -SR ⁇ -SOR', -SOOR 'and -NR “R”; or two radicals R1 to R7, continuous with one another such as R1 and R2, R2 and R3, R 4 and R 5 or R 5 and R 6, form a cycloalkyl, aryl or heteroaryl;
  • R 'and R are each independently selected from hydrogen, C1-C18 alkyl, C2-C18 alkenyl, C2-C18 alkynyl, aryl or heteroaryl;
  • X " is a counterion
  • Z is C (R 7 ) and the compound would be the following compound of formula (II):
  • alkyl refers, in the present invention, to saturated, linear or branched hydrocarbon chains, having from 1 to 18 carbon atoms, for example, methyl, ethyl, n-propyl, i-propyl, n-butyl , tere-butyl, sec-butyl, n-pentyl, n-hexyl, etc.
  • the alkyl group has between 1 and 6 carbon atoms.
  • the alkyl groups may be optionally substituted by one or more substituents such as alkynyl, alkenyl, halo, hydroxyl, alkoxy, carboxyl, cyano, carbonyl, acyl, alkoxycarbonyl, amino, nitro or mercapto.
  • substituents such as alkynyl, alkenyl, halo, hydroxyl, alkoxy, carboxyl, cyano, carbonyl, acyl, alkoxycarbonyl, amino, nitro or mercapto.
  • alkenyl refers, in the present invention, to linear or branched unsaturated hydrocarbon chains, having from 2 to 18 carbon atoms, preferably from 2 to 6, and containing one or more double carbon-carbon bonds and which may optionally contain some triple bond, for example, vinyl, 1-propenyl, allyl, isoprenyl, 2-butenyl, 1,3-butadienyl, etc.
  • the alkenyl radicals may be optionally substituted by one or more substituents such as alkyl, alkynyl, halo, hydroxyl, alkoxy, carboxyl, cyano, carbonyl, acyl, alkoxycarbonyl, amino, nitro or mercapto.
  • alkynyl refers to straight or branched hydrocarbon chain residues, of 2 to 18 carbon atoms, preferably 2 to 6, and containing at least one or more triple carbon-carbon bonds and optionally containing some double bond, for example, ethyl, propynyl, butynyl, etc.
  • Alkynyl radicals may be optionally substituted by one or more substituents such as alkyl, alkenyl, halo, hydroxyl, alkoxy, carboxyl, cyano, carbonyl, acyl, alkoxycarbonyl, amino, nitro or mercapto.
  • aryl refers, in the present invention, to single or multiple aromatic rings, having from 5 to 18 carbon atoms in the ring part, such as but not limited to, phenyl, naphthyl, diphenyl, indenyl, fenantrile, fluorenyl or anthracyl.
  • aryl group has from 5 to 7 carbon atoms and more preferably the aryl group is a phenyl.
  • the aryl radicals may be optionally substituted at any one of their positions by one or more substituents or two substituents by forming a fused ring to the aryl and are independently selected from such as alkyl, alkenyl, alkynyl, O-alkyl, O, halogen, hydroxyl, amino or carboxylic acid.
  • the aryl is an optionally substituted phenyl and more preferably a phenyl optionally substituted by more than one alkyl group, as defined above.
  • heteroaryl refers to an aryl, as defined above, that contains at least one atom other than carbon, such as S, N, or O, forming part of the aromatic ring.
  • cycloalkyl refers to a stable monocyclic or bicyclic radical of 3 to 10 members, which is saturated or partially saturated, and which consists of carbon and hydrogen atoms, such as cyclopentyl, cyclohexyl or adamantyl.
  • Cycloalkyl radicals may be optionally substituted at any one of their positions by one or more substituents or two substituents by forming a cycloalkyl fused cycle and are independently selected from such as alkyl, alkenyl, alkynyl, O-alkyl, O, halogen, hydroxyl, amino or carboxylic acid.
  • halogen is meant in the present invention a bromine, chlorine, iodine or fluorine atom.
  • R 7 is an optionally substituted aryl, more preferably R 7 is an optionally substituted phenyl and more preferably phenyl substituted by C 1 -C 6 alkyl, still more preferably it is a trimethylphenyl.
  • R 2 and / or R 5 are hydrogen or C 1 -C 6 alkyl, more preferably hydrogen or methyl and even more preferably are hydrogen.
  • R2 and R5 are hydrogen.
  • R1, R3, R4 and R6 are each independently hydrogen or C1-C6 alkyl, more preferably R1, R3, R4 and R6 are each independently hydrogen or methyl. More preferably R1, R3, R4 and R6 are hydrogen or methyl.
  • the counterion (X " ) is any pharmaceutically acceptable anion known to one skilled in the art and can preferably be selected from the list comprising Cl-, Br, I “ , P, S0 4 “ , BF 4 “ , PF 4 “ , HS0 4 “ , (S0 4 2” ) i / 2 , CF3SO3-, CI0 4 " , and BF 4 " , more preferably X " can be selected from a halogenide which can be selected from Cl “ , Br, I " , P; S0 “ , BF 4 “ , PF 4 “ , HS0 “ and (S0 2 “ ) i / 2. More preferably X " is a halide, even more preferably Cl " .
  • the compound of the invention is selected from:
  • Another aspect of the present invention relates to a process for obtaining a compound of the invention comprising the reaction between a compound of formula (III) and carnitine:
  • carnitine can be selected from L-carnitine, D-carnitine and racemic mixture D / L-carnitine, preferably it is L-carnitine.
  • the reaction described can be carried out in the presence of an excess of reagent, where this reagent can be selected from trimethylsilyl chloride (TMSCI), BC, BBr3, AlC, AIBr3, SnCU, SnBr 4 , SiCl 4 , SiBr 4 , trifluoromethylmethanesulfonate of trimethylsilyl (MesSiOTf), triethylsilyl trifluoromethylmethanesulfonate (EtsSiOTf) and triisopropylsilyl trifluoromethylmethanesulfonate (/ -PrsSiOTf).
  • TMSCI trimethylsilyl chloride
  • BC BBr3, AlC, AIBr3, SnCU, SnBr 4 , SiCl 4 , SiBr 4
  • MesSiOTf trimethylsilyl
  • EtsSiOTf triethylsilyl trifluoromethylmethanesul
  • the reaction is carried out in a polar aprotic solvent capable of dissolving carnitine.
  • the solvent may be selected from acetonitrile, dimethylformamide, dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, sulfolane, or mixtures of this polar aprotic solvent with other less polar aprotic solvents, such as, for example, without being limited to dichloromethane, 1,2-dichloethane, tetrahydrofuran, 2-methyl tetrahydrofuran, 1,4-dioxane, 1,2-dichlorobenzene, ethyl acetate or acetone.
  • the solvent is acetonitrile.
  • the solubility of carnitine in organic solvents can be improved by changing the anion of the salt to the following anions: BF 4 " , PF6 “ , BPh 4 “ , p toluenesulfonate, mesylate, trifluoromethanesulfonate, acetate, benzoate, trichloroacetate or trifluoroacetate.
  • the process is carried out at a temperature between 50-150 ° C, in a preferred embodiment the reaction is carried out under thermal conditions by microwave irradiation.
  • the method of the invention is carried out in the presence of an excess of trimethylsilyl chloride in acetonitrile and under thermal conditions by microwave irradiation.
  • the obtained compound of formula (I) can be recrystallized or purified chromatographically, after evaporating the reaction mixture under reduced pressure.
  • Another aspect of the present invention relates to the use of the compound of the invention as a fluorescent label or probe. More preferably for cellular labeling and even more preferably for specific cellular labeling of mitochondria, more preferably of living cells, and even more preferably in living cells of mammals, preferably humans.
  • the cells to be labeled will preferably be cells of tumoral origin.
  • Another aspect of the present invention relates to the use of the compound of the invention, for the manufacture of markers for the diagnosis of mitochondrial diseases.
  • diseases can be selected from translocase-carnitine-acylcarnitine deficiency, metabolic decompensation in childhood, cardiomyopathy in childhood, fatigability in adulthood, disorders in metabolism and carnitine transport, as well as diseases such as cancer, type-2 diabetes , neurological diseases, such as Parkinson's and cardiovascular diseases, such as atherosclerosis.
  • FIG. 1 Labeling of SCC38 cells in vivo with compound 4 at different concentrations (50, 100 and 500 nM). Scale bar: 10 ⁇
  • Fig. 2 Flow cytometry studies in cells marked with compound 4 and red MitoTracker® of SCC38 and HeLa lines. Histograms in which the intensity of the labeling is plotted against the number of events, for each of the staining times (5, 15 and 30 min) and the control (Ctrl), for the SCC38 and HeLa cells, and for each one of the two markers.
  • Fig. 3 Spectra of absorption (A) and fluorescence (B), normalized in molar absorption and quantum yield of fluorescence of probe 4 in different solvents; chloroform (green), acetone (black), acetonitrile (red), ethanol (Blue) and water (gray).
  • Fig. 4 Fluorescent labeling with probe 4 does not depend on A4
  • A Flow cytometric analysis of SCC38 cells incubated in the presence (+ FCCP) or absence (- FCCP) of 60 ⁇ FCCF for 3 h before staining with 20 nM of 4 or 0.5 nM of MitoTracker. The data represents the mean fluorescence intensity (MFI) of the stained cells.
  • B Microscopy analysis of SCC38 cells pretreated or not with FCCP before co-staining with 20 nM of 4 and 0.5 nM of MitoTracker. The graphs show the fluorescence profiles of the regions of interest indicated by the white lines in the panels on the right. Scale bars, 10 ⁇ .
  • Fig. 5 Mechanistic hypothesis of transport (and final destination) of probe 4 to the mitochondrial matrix via the carnitine transport system.
  • Fig. 6 Inhibition of mitochondria staining with compound 4 in the presence of increasing concentrations of () -palmitoylcarnitine.
  • the SCC38 cells were co-incubated with the indicated concentrations of () -palmitoylcarnitine and 50 nM of 4 (A) or 50 nM of MitoTracker (B) before analyzing by flow cytometry.
  • the data represent the mean fluorescence intensity (MFI) of the stained cells (upper panels) and images representative of the cytometry profiles (lower panels).
  • Fig. 7. Flow cytometric analysis of SCC38 cells stained with 4 and their (S) -4 enantiomer with increasing concentrations of both probes.
  • Kas cells SCC38 were incubated with the indicated concentrations of 4 and its (S) -4 enantiomer for 30 min before the cytometry analysis.
  • A Representative images of the cytometry profiles.
  • B The data represent the average fluorescence intensity of the labeled cells.
  • the invention will be illustrated by means of tests carried out by the inventors where the obtaining of fluorescent probes of the invention is described, as well as their evaluation as markers of mitochondria in living cells of tumoral origin, which shows the effectiveness of the compound of the invention by monitoring its activity by both confocal fluorescence microscopy and flow cytometry.
  • TLC thin layer chromatography
  • the reaction was heated with the following temperature gradient in a focused microwave reactor: 25-80 ° C in 30 minutes, 80-100 ° C in 5 minutes, 100 ° C for 30 minutes, 100-120 ° C in 10 minutes , 120 ° C for 30 minutes and 120-150 ° C in 1 hour.
  • the reaction mixture was evaporated under reduced pressure and the reaction crude was dissolved in the minimum amount of CH 2 Cl 2 and re-precipitated by adding tert-butyl methyl ether, to give compound 3 (26.5 mg, 63%) as a red solid with green fluorescence in solution.
  • reaction mixture was evaporated under reduced pressure and the reaction crude was dissolved in the minimum amount of CH2Cl2 and re-precipitated by adding tert-butyl methyl ether, to give compound 4 (31.8 mg, 88%) as a red solid with green fluorescence in solution.
  • the cell assays were carried out on two human cell lines: SCC38 and HeLa.
  • SCC38 line comes from epidermoid carcinoma of the larynx of human patients, whereas HeLa, the first human cell line established in culture, derives from cervical cancer.
  • the culture medium used for both cell lines was DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U / mL of penicillin, 200 ⁇ g / mL of streptomycin, 100 ⁇ / L of non-amino acid essential oils and 2 mmol / L of glutamine.
  • FBS fetal bovine serum
  • the cells were also stained with MitoTracker® Red CMXRos (Thermo Fisher) according to the manufacturer's instructions, in order to carry out comparative studies with the new fluorescent labels synthesized here. Initially, both compounds 3 and 4 were used at a concentration of 50 nM, and the staining time was also 30 minutes.
  • Fig. 1 the intensity of labeling according to the concentration of dye in the medium is presented.
  • the kinetics of cell labeling with 4 was studied by flow cytometry with SCC38 and HeLa cell lines, using red MitoTracker® as a control marker, both at a concentration of 50 nM.
  • the staining times studied were 5, 15, 30 and 45 minutes After staining, the medium was removed, washed with PBS, trypsinized and the pellet re-suspended in 500 ⁇ l of PBS and introduced into the cytometer after filtration.
  • a flow cytometer Cytomics FC500 Cell Analyzer from Beckman Coulter (Scientific-Technical Services, University of Oviedo) was used. Part of the re-suspended cells were seeded and also observed under a microscope. As can be seen in Fig.
  • probes 3 and 4 The photophysical characterization of probes 3 and 4 was carried out by analyzing the corresponding absorption and fluorescence spectra in the UV-visible region of the spectrum. According to the spectral profiles and their dependence on concentration, these probes do not show any tendency of aggregation or type H- or J-, even working at concentrations as high as 10 "4 M. Since these probes have been designed as markers fluorescent mitochondrial, its photophysics has been analyzed in water (Fig.1).
  • Table 1 shows the photophysical properties 3 of probe 3 in water and probe 4 in different solvents.
  • probe 4 in water is characterized by a high molar absorption coefficient (3.8 x 10 4 M -1 crrr 1 at 499 nm) and a highly efficient fluorescence emission at 511 nm, with a yield that reaches 80% .
  • the rigid and compact structure of the probe 4 determines that this is a highly efficient dye regardless of the solvent, since its photophysical behavior is similar, although the polarity of the solvent decreases significantly, for example from water to chloroform ( Figure 3) .
  • probe 4 also has a high photostability, which is a critical factor in the development of dyes for biological labeling.
  • the hydrolysis of 4 observed by 1 H NMR does not lead to a significant reduction of its fluorescence emission.
  • Table 2 shows the time evolution of the photophysical properties of the probe 4 in water
  • FCCP carbonylcyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone
  • Fatty acids are first activated by acyl-CoA synthetase (ACSL) in the cytosol to thioesters of acyl-CoA, which cross the outer mitochondrial membrane through the voltage-dependent anion channel (VDAC), but do not cross the mitochondrial membrane internal due to the lack of a specific transporter.
  • the acyl-CoA fatty acid derivatives are transesterified into acylcarnitines by the "carnitine palmitoyltransferase-1a" (CPT-1a), an integral outer mitochondrial membrane enzyme, and thus released into the intermembrane space.
  • CACT carnitine / acylcarnitine translocase
  • CPT-2 carnitine palmitoyltransferase-2
  • probe 4 can be considered reasonably as a biomimetic of acylcarnitines, being able to travel in place through the carnitine transport system.
  • CACT is really involved in the channeling of 4 towards the mitochondrial matrix.

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Abstract

Colorantes orgánicos basados en derivados de F-BODIPY y carnitina, su procedimiento de obtención y su aplicación para el etiquetado o mareaje fluorescente específico de mitocondrias en células vivas.

Description

DESCRIPCIÓN
Compuestos y sus usos como sondas fluorescentes
La presente invención se refiere a unos compuestos basados en derivados de F- BODIPY y carnitina como colorantes orgánicos. Además, se refiere a su procedimiento de obtención y su aplicación para el etiquetado fluorescente específico de mitocondrias en células vivas. Por tanto, la invención se engloba en el campo de las sondas fluorescentes para mareaje biológico.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Las mitocondrias son los orgánulos presentes en casi todas las células eucariotas encargados de la producción de energía en forma de ATP a través de la respiración celular. Además, están involucradas en el metabolismo de grupos hemo, la homeostasis del calcio, la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), la inflamación, la proliferación celular y la apoptosis, cumpliendo así un papel esencial en la supervivencia de la célula. Estos orgánulos contienen además su propio ADN mitocondrial (mtADN), que es independiente del ADN del núcleo celular. El conjunto de mitocondrias de la célula (condrioma celular) tiene un carácter dinámico que está regulado por complejos mecanismos de comunicación celular, tanto a nivel intra- como extracelular, para responder a las variaciones en las demandas energéticas de la célula mediante procesos de fusión, fisión, autofagia (mitofagia) y biogénesis mitocondrial. El daño o desregulación de estos mecanismos está implicado en numerosos procesos patológicos, bien directamente, como en las enfermedades genéticas mitocondriales, o de forma secundaria en enfermedades neurodegenerativas, inflamatorias, cardiovasculares y en algunos síndromes metabólicos (Suliman, H. B.; Piantadosi, C. A. Pharmacol. Rev. 2016, 68, 20). Se conoce desde hace tiempo que existe además una relación entre los cambios en el condrioma celular y los procesos de envejecimiento, bien como causa o como efecto (Harman, D. J Gerontol 1956, 11, 298; Balaban, R. S.; Nemoto, S.; Finkel, T. Cell 2005, 720, 483). Estudios recientes están empezando a demostrar que el metabolismo mitocondrial puede ser también una diana terapéutica importante para el tratamiento del cáncer (Weinberg, S. E.; Chandel, N. S. Nat. Chem. Biol. 2015, 11, 9).
Aunque se han dedicado grandes esfuerzos al estudio de la biología de las mitocondrias, estamos todavía lejos de conocer en detalle muchas de sus funciones y actividades básicas. El desarrollo de nuevas tecnologías que faciliten este estudio es esencial para poder desentrañar el complejo papel que juegan estos orgánulos en el metabolismo celular y sus efectos sobre el envejecimiento y el desarrollo y posible tratamiento de muchas enfermedades. En comparación con las técnicas analíticas tradicionales, como los ensayos colorimétricos, las sondas fluorescentes (Li, X.; Gao, X.; Shi, W.; Ma, H. Chem. Rev. 2014, 114, 590) son actualmente las herramientas moleculares más eficientes y versátiles para el estudio de los sistemas biológicos gracias a su gran sensibilidad, selectividad y facilidad de uso, proporcionando una información muy variada en tiempo real y de forma no destructiva. Para su uso en microscopía de células vivas, una sonda fluorescente debe de cumplir idealmente una serie de requisitos básicos: 1) alta luminiscencia (alto rendimiento cuántico) en medio acuoso al ser iluminada en el rango visible-infrarrojo cercano; 2) alta especificidad y afinidad por su estructura celular o biomolécula objetivo; 3) elevada estabilidad química y fotoestabilidad en el medio celular; 4) capacidad para penetrar en la célula; 5) buena solubilidad en agua; y 6) baja o nula toxicidad.
Aunque se conocen actualmente una gran variedad de sondas fluorescentes para la visualización específica de mitocondrias, algunas de ellas disponibles comercialmente como por ejemplo etil éster de tetrametilrodamina (TMRE), yoduro de 3,3'- dihexiloxacarbocianina (CiOC6(3)), MitoTracker® rojo o MitoTracker® verde, ninguna cumple con todos los requerimientos mencionados (Xu, Z.; Xu, L. Chem. Commun. 2016, 52, 1094).
Una característica común de todas estas sondas es la presencia de un grupo catiónico (amonio o fosfonio) que promueve su incorporación a la mitocondria gracias al elevado gradiente de potencial negativo característico de este orgánulo. Además, todos ellos están basados en estructuras de xantenos o dañinas como grupo cromofórico, ambos incorporando aminas en su esqueleto, lo que reduce significativamente su fotoestabilidad, especialmente en condiciones drásticas de bombeo como las implicadas en microscopía de alta resolución (Alvarez, M.; Amat, F., Costela, A.,Garcia-Moreno, I., Gómez, C, Liras, M., Sastre, R. Appl. Phys. B. 2005, 80, 993; Cerdan, I., Enciso, E, Martin, V., Bañuelos, J., López Arbeloa, I.; Costela, A., Garcia-Moreno, I. Nature Photonics, 2012, 6, 621).
Por tanto, es de gran interés el desarrollo de nuevas sondas fluorescentes como marcadores específicos de mitocondrias en célula viva que puedan superar las limitaciones que presentan los sistemas actualmente comercializados para esta aplicación.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención describe unas nuevas sondas fluorescentes como marcadores específicos de mitocondrias en célula viva basadas en compuesto que comprende una unidad F-BODIPY como grupo fluoroforo y una unidad L-carnitina como grupo localizador, cuyo sistema supera las limitaciones que presentan los sistemas actualmente comercializados para esta aplicación. Ambas unidades se han unido a través del átomo de boro del fluoroforo, lo que simplifica enormemente la estructura final y el procedimiento de síntesis. Al usar directamente un F-BODIPY como producto de partida, el método tiene carácter general y puede proporcionar otras sondas similares con frecuencias de absorción y emisión sintonizables a lo largo del espectro visible dependiendo solo del F-BODPY empleado.
Los ensayos de tinción de células vivas humanas de origen tumoral con los nuevos marcadores fluorescentes han mostrado la selectividad por mitocondrias demostrada con ensayos de co-tinción con MitoTracker® rojo comercial. La eficiencia y selectividad del mareaje es independiente del patrón de sustitución en el cromóforo así como de la línea celular ensayada. Las nuevas sondas muestran propiedades interesantes con respecto al MitoTracker® rojo comercial. En primer lugar, el MitoTracker® rojo parece concentrarse en los bordes de la mitocondria, mientras que la tinción con las nuevas sondas se localiza preferentemente en su interior (la matriz mitocondrial). Además, la intensidad de la tinción con las nuevas sondas aumenta progresivamente con el tiempo de incubación de las células, mientras que el colorante comercial aparenta teñir estos orgánulos de forma casi instantánea. Estas características están revelando, en el caso de las nuevas sondas y a diferencia del marcador comercial, la intervención de un mecanismo de transporte activo de las mismas hacia el interior de la mitocondria.
La metodología descrita en la presente invención proporciona un nuevo y eficaz protocolo de síntesis para el desarrollo de nuevos colorantes con propiedades avanzadas para ser aplicados como biomarcadores selectivos, estables, eficaces y baratos. Por tanto, un primer aspecto de la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula general (I) (a partir de ahora compuesto de la invención):
Figure imgf000005_0001
donde:
Z se selecciona de entre un átomo de nitrógeno (N) o un grupo C(R7);
Ri a R7 se seleccionan cada uno independientemente entre hidrógeno, alquilo C1-C18 sustituido o no sustituido, alquenilo C2-C18 sustituido o no sustituido, alquinilo C2-C18 sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, halógeno, -OR\ -COOR', -SR\ -SOR', -SOOR' y -NR'R"; o cada dos radicales R1 a R7, continuos entre sí como por ejemplo R1 y R2, R2 y R3, R4 y R5 o R5 y R6, forman un cicloalquilo, arilo o heteroarilo;
R' y R" se seleccionan cada uno independientemente entre hidrógeno, alquilo C1-C18, alquenilo C2-C18, alquinilo C2-C18, arilo o heteroarilo; y
X" es un contraión,
o cualquiera de sus isómeros.
En una realización preferida, Z es C(R7) y el compuesto sería el siguiente compuesto de fórmula (II):
Figure imgf000006_0001
donde Ri a R7y X" son los definidos anteriormente.
El término "alquilo" se refiere, en la presente invención, a cadenas hidrocarbonadas saturadas, lineales o ramificadas, que tienen de 1 a 18 átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, tere-butilo, sec-butilo, n-pentilo, n-hexilo, etc. Preferiblemente el grupo alquilo tiene entre 1 y 6 átomos de carbono. Los grupos alquilo pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes tales como alquinilo, alquenilo, halo, hidroxilo, alcoxilo, carboxilo, ciano, carbonilo, acilo, alcoxicarbonilo, amino, nitro o mercapto.
El término "alquenilo" se refiere, en la presente invención, a cadenas hidrocarbonadas insaturadas, lineales o ramificadas, que tienen de 2 a 18 átomos de carbono, preferiblemente de 2 a 6, y que contienen uno o más enlaces carbono-carbono dobles y que opcionalmente puede contener algún enlace triple, por ejemplo, vinilo, 1-propenilo, alilo, isoprenilo, 2-butenilo, 1 ,3-butadienilo, etc. Los radicales alquenilos pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes tales como alquilo, alquinilo, halo, hidroxilo, alcoxilo, carboxilo, ciano, carbonilo, acilo, alcoxicarbonilo, amino, nitro o mercapto.
El término "alquinilo" se refiere a radicales de cadenas hidrocarbonadas, lineales o ramificadas, de 2 a 18 átomos de carbono, preferiblemente de 2 a 6, y que contienen al menos uno o más enlaces carbono-carbono triples y que opcionalmente puede contener algún enlace doble, por ejemplo, etilino, propinilo, butinilo, etc. Los radicales alquinilos pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes tales como alquilo, alquenilo, halo, hidroxilo, alcoxilo, carboxilo, ciano, carbonilo, acilo, alcoxicarbonilo, amino, nitro o mercapto.
El término "arilo", se refiere, en la presente invención, a anillos aromáticos, sencillos o múltiples, que tienen entre 5 a 18 átomos de carbono en la parte del anillo, tales como pero sin limitarse a, fenilo, naftilo, difenilo, indenilo, fenantrilo, fluorenilo o antracilo. Preferiblemente el grupo arilo tiene de 5 a 7 átomos de carbono y más preferiblemente el grupo arilo es un fenilo. Los radicales arilo pueden estar opcionalmente sustituidos en cualquiera de sus posiciones por uno o más sustituyentes o dos sustituyentes formando un ciclo condensado al arilo y se seleccionan independientemente entre tales como alquilo, alquenilo, alquinilo, O-alquilo, O, halógeno, hidroxilo, amino o ácido carboxílico. En una realización preferida el arilo es un fenilo opcionalmente sustituido y más preferiblemente un fenilo opcionalmente sustituido por más de un grupo alquilo, tal como se ha definido anteriormente.
El término "heteroarilo" se refiere a un arilo, como se ha definido anteriormente, que contiene al menos un átomo distinto de carbono, tales como S, N, ó O, formando parte del anillo aromático.
Por "cicloalquilo" se refiere la presente invención a un radical estable monocíclico o bicíclico de 3 a 10 miembros, que está saturado o parcialmente saturado, y que consiste en átomos de carbono e hidrógeno, tal como ciclopentilo, ciclohexilo o adamantilo. Los radicales cicloalquilo pueden estar opcionalmente sustituidos en cualquiera de sus posiciones por uno o más sustituyentes o dos sustituyentes formando un ciclo condensado al cicloalquilo y se seleccionan independientemente entre tales como alquilo, alquenilo, alquinilo, O-alquilo, O, halógeno, hidroxilo, amino o ácido carboxílico.
Por "halógeno" se entiende en la presente invención a un átomo de bromo, cloro, yodo o flúor.
En otra realización preferida, R7 es un arilo opcionalmente sustituido, más preferiblemente R7 es un fenilo opcionalmente sustituido y más preferiblemente fenilo sustituido por alquilo C1-C6, aún más preferiblemente es un trimetilfenilo. En otra realización preferida, R2 y/o R5 son hidrógeno o alquilo C1-C6, más preferiblemente hidrógeno o metilo y aún más preferiblemente son hidrógeno. En una realización aún más preferida R2 y R5 son hidrógeno.
En otra realización preferida, R1, R3, R4 y R6 son cada uno independientemente hidrógeno o alquilo C1-C6, más preferiblemente R1, R3, R4 y R6 son cada uno independientemente hidrógeno o metilo. Más preferiblemente R1, R3, R4 y R6 son hidrógeno o metilo.
El contraión (X") es cualquier anión farmacéuticamente aceptable conocido por un experto en la materia y preferiblemente se puede seleccionar de la lista que comprende Cl-, Br, I", P, S04 ", BF4 ", PF4 ", HS04 ", (S04 2")i/2, CF3SO3-, CI04 ", y BF4 ", más preferiblemente X" se puede seleccionar de entre un halogenuro que se puede seleccionar de entre Cl", Br, I", P; S0 ", BF4 ", PF4 ", HS0 " y (S0 2")i/2. Más preferiblemente X" es un halogenuro, aún más preferiblemente Cl".
Por "isómero" se refiere en la presente invención también a cualquier mezcla racémica.
En una realización aún más preferida, el compuesto de la invención se selecciona de entre:
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Otro aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento para la obtención de un compuesto de la invención que comprende la reacción entre un compuesto de fórmula (III) y carnitina:
Figure imgf000009_0001
donde Z, Ri a Rey X" son los definidos anteriormente.
En una realización preferida del procedimiento de la invención, carnitina puede seleccionarse entre L-carnitina, D-carnitina y mezcla racémica D/L-carnitina, preferiblemente es L-carnitina.
La reacción descrita se puede llevar a cabo en presencia de un exceso de reactivo, donde este reactivo se puede seleccionar entre cloruro de trimetilsililo (TMSCI), BC , BBr3, AlC , AIBr3, SnCU, SnBr4, SiCI4, SiBr4, trifluorometilmetanosulfonato de trimetilsililo (MesSiOTf), trifluorometilmetanosulfonato de trietilsililo (EtsSiOTf) y trifluorometilmetanosulfonato de triisopropilsililo (/-PrsSiOTf). Preferilbemente la reacción se lleva a cabo en presencia de exceso de cloruro de trimetilsililo, aproximadamente entre 20-50 mol-equiv.
En otra realización preferida del procedimiento de la invención la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar aprótico capaces de disolver la carnitina. El disolvente se puede seleccionar de entre acetonitrilo, dimetilformamida, dimetilacetamida, N- metilpirrolidona, sulfolano, o mezclas de este disolvente polar aprótico con otros disolventes apróticos menos polares, como por ejemplo, sin limitarse a diclorometano, 1 ,2-dicloetano, tetrahidrofurano, 2-methyl tetrahidrofurano, 1 ,4-dioxano, 1 ,2- diclorobenceno, acetato de etilo o acetona. En una realización preferida el disolvente es acetonitrilo.
Por otro lado, la solubilidad de la carnitina en disolventes orgánicos se puede mejorar cambiando el anión de la sal a los siguientes aniones: BF4 ", PF6", BPh4 ", p- toluensulfonato, mesilato, trifluorometanosulfonato, acetato, benzoato, tricloroacetato o trifluoroacetato.
En otra realización de la presente invención el procedimiento se lleva a cabo a una temperatura de entre 50-150 °C, en una realización preferida la reacción se lleva a cabo en condiciones térmicas mediante irradiación por microondas.
En una realización preferida, el procedimiento de invención se lleva a cabo en presencia de un exceso de cloruro de trimetilsililo en acetonitrilo y en condiciones térmicas mediante irradiación por microondas.
Posteriormente a la reacción el compuesto obtenido de fórmula (I) se puede recristalizar o purificar cromatograficamente, después de evaporar la mezcla de reacción a presión reducida.
Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso del compuesto de la invención como marcador o sonda fluorescente. Más preferiblemente para el mareaje celular y aún más preferiblemente para el mareaje celular específico de mitocondrias, más preferiblemente de células vivas, y aún más preferiblemente en células vivas de mamíferos, preferiblemente humanas. Las células a marcar serán preferiblemente células de origen tumoral.
Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso del compuesto de la invención, para la fabricación de marcadores para el diagnóstico de enfermedades mitocondriales. Estas enfermedades se pueden seleccionar de entre deficiencia en translocasa carnitina-acilcarnitina, descompensación metabólica en la infancia, cardiomiopatía en la niñez, fatigabilidad en la edad adulta, trastornos en el metabolismo y transporte de carnitina, además de enfermedades como cáncer, diabetes tipo-2, enfermedades neurológicas, como por ejemplo el Parkinson y enfermedades cardiovasculares, como por ejemplo ateroesclerosis.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Fig. 1. Mareaje de células SCC38 in vivo con el compuesto 4 a diferentes concentraciones (50, 100 y 500 nM). Barra de escala: 10 μηι
Fig. 2. Estudios de citometría de flujo en células marcadas con el compuesto 4 y MitoTracker® rojo de las líneas SCC38 y HeLa. Histogramas en los que se representa la intensidad del mareaje frente al número de eventos, para cada uno de los tiempos de tinción (5, 15 y 30 min) y el control (Ctrl), para las células SCC38 y HeLa, y para cada uno de los dos marcadores.
Fig. 3. Espectros de absorción (A) y fluorescencia (B), normalizados en absorción molar y rendimiento cuántico de fluorescencia de la sonda 4 en diferentes disolventes; cloroformo (verde), acetona (negro), acetonitrilo (rojo), etanol (Azul) y agua (gris).
Fig. 4. El etiquetado fluorescente con la sonda 4 no depende de A4 (A) Análisis de citometría de flujo de células SCC38 incubadas en presencia (+FCCP) o ausencia (- FCCP) de FCCP 60 μΜ durante 3 h antes de teñir con 20 nM de 4 o 0.5 nM de MitoTracker. Los datos representan la intensidad media de fluorescencia (MFI) de las células teñidas. (B) Análisis de microscopía de células SCC38 pretratadas o no con FCCP antes de co-teñir con 20 nM de 4 y 0.5 nM de MitoTracker. Los gráficos muestran los perfiles de fluorescencia de las regiones de interés indicadas con las líneas blancas en los paneles de la derecha. Barras de escala, 10 μηι.
Fig. 5. Hipótesis mecanística del transporte (y destino final) de la sonda 4 a la matriz mitochondrial via el sistema de transporte de carnitina.
Fig. 6. Inhibición de la tinción de mitocondrias con el compuesto 4 en presencia de concentraciones crecientes de ( )-palmitoilcarnitina. Las células SCC38 se coincubaron con las concentraciones indicadas de ( )-palmitoilcarnitina y 50 nM de 4 (A) o 50 nM de MitoTracker (B) antes de analizar por citometría de flujo. Los datos representan la intensidad media de fluorescencia (MFI) de las células teñidas (paneles superiores) e imágenes representativas de los perfiles de citometría (paneles inferiores). Fig. 7. Análisis de citometría de flujo de células SCC38 teñidas con 4 y su enantiómero (S)-4 con concentraciones crecientes de ambas sondas. Kas células SCC38 se incubaron con las concentraciones indicadas de 4 y su enantiómero (S)-4 durante 30 min antes del análisis de citometría. (A) Imágenes representativas de los perfiles de citometría. (B) Los datos representan la intensidad media de fluorescencia de las células etiquetadas.
EJEMPLOS
A continuación, se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores donde se describe la obtención de unas sondas fluorescentes de la invención, así como su evaluación como marcadores de mitocondrias en células vivas de origen tumoral, que pone de manifiesto la efectividad del compuesto de la invención mediante el seguimiento de su actividad tanto por microscopía confocal de fluorescencia como por citometría de flujo.
A. SÍNTESIS DE LOS COMPUESTOS 3 y 4
El método general para la preparación de estas sondas fluorescentes derivadas de L- carnitina se basa en la funcionalización racional de la molécula objetivo que se muestra en forma genérica en el esquema 1 :
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Esquema 1 - Síntesis de dos sondas BODIPY-carnitina (compuestos 3 y 4).
Mediante esta síntesis la carnitina se une directamente al átomo de boro del F-BODIPY en forma de B-espiro-derivado a través de los grupos hidroxilo y carboxilo para generar el correspondiente derivado O-BODIPY. De esta forma, se simplifica el proceso de síntesis al evitar procesos de funcionalización previa del fluoróforo o la introducción de conectores, reduciendo con ello el tamaño y complejidad de la sonda final al mínimo posible. Aunque se conocen varios métodos de síntesis de O-BODIPYs a partir de los correspondientes F-BODIPYs en la presente invención se ensaya el descrito en Manzano, H. et al., Adv. Funct. Mater. 2016, 26, 2756.
Todos los reactivos utilizados en la preparación de los compuestos anteriores son comerciales o se prepararon siguiendo métodos previamente descritos en la literatura. Los disolventes anhidros se trataron mediante las técnicas habituales de secado o con un sistema de purificación de disolventes PureSol modelo 400-3-MD para el secado de los siguientes disolventes (THF, CH2CI2, MeCN, tolueno, éter dietílico y DMF) y se usaron en la reacción inmediatamente. Las reacciones con irradiación de microondas (MW) se llevaron a cabo en un tubo cerrado en un reactor de microondas focalizadas CEM Discover o Antón Parr Monowave 300, usando tubos estándar de Pyrex de 10 mL de capacidad cerrados con un tapón con septum. Todos los experimentos se llevaron a cabo a una potencia máxima de 300 W y una presión máxima de 20 bares. El seguimiento de las reacciones se llevó a cabo mediante cromatografía en capa fina (CCF) empleando cromatofolios de gel de sílice tipo 60 F254 (230-400 mesh) con soporte de alumino y un espesor de capa de 0,2 mm (Merck). Las placas de CCF se visualizaron bajo una lámpara de UV 254/365 nm.
Compuesto 3. A una suspensión de hidrocloruro de L-carnitina (20 mg, 0,100 mmol) en MeCN anhidro (5 mL) en un vial de microondas de 10 mL con barra agitadora se añadió el compuesto 1 (Nepomnyashchii, A. B.; et al., J. Am. Chem. Soc. 2011 , 133, 8633) (30 mg, 0,097 mmol) y cloruro de trimetilsililo (TMSCI) (491 μί, 3,87 mmol). La reacción se calentó con el siguiente gradiente de temperatura en un reactor de microondas focalizadas: 25-80 °C en 30 minutos, 80-100 °C en 5 minutos, 100 °C durante 30 minutos, 100-120 °C en 10 minutos, 120 °C durante 30 minutos y 120-150 °C en 1 hora. La mezcla de reacción se evaporó a presión reducida y el crudo de reacción se disolvió en la mínima cantidad de CH2CI2 y se re-precipitó añadiendo terc-butil metil éter, para dar el compuesto 3 (26,5 mg, 63%) como un sólido rojo con fluorescencia verde en disolución.
Figure imgf000014_0001
1Η NMR (CDCU, 400 ΜΗζ): δ = 8.14 (s, 1 Η, C5H), 7.83 (s, 1 Η, C3H), 6.95 (s, 2Η, C3'H, C5'H), 6.70 (m, J = 4.15 Hz, 2H, C1 H, C7H), 6.49 (dd, J = 8.40, 4.15 Hz, 2H, C2H, C6H), 4.98 (t, J = 10.75 Hz, 1 H, C3"H), 4.33 (d, J = 13.49 Hz, 1 H, C4"H), 3.62 - 3.52 (m, 1 H, C4"H), 3.41 (s, 9H, C5"H3, C6"H3, C7"H3), 2.98 (d, J = 16.3 Hz, 1 H, C2"H), 2.74 - 2.59 (m, 1 H, C2"H), 2.36 (s, 3H, CH3-C4'),2.05 (s, 6H, CH3-C2', CH3-C6'). 13C NMR (101 MHz, CDCU): δ= 168.80 (C1 "), 148.00 (C8), 145.25 (C3), 144.45 (C5), 139.23 (C4'), 136.44 (C2'), 135.91 (C6'), 135.53 (C7a), 135.49 (C8a), 131.10 (C7H), 130.78 (C1), 129.54 (C1 '), 128.51 (C3'), 128.34 (C5'), 119.20 (C6), 119.16 (C2), 69.53 (C4"), 63.06 (C3"), 55.01 (C5", C6", C7"), 36.95 (C2"), 21.28 (CH3-C4'), 20.11 (CH3-C2'), 20.04 (CH3-C6'). HRMS (ESI+) m/z: calculada para C25H3iBN303 + [M+]: 432.2453, encontrada 432.2453. IR (KBr): v = 1719.76 (C=0), 1560.24, 1411.23, 1383.73, 1257.88, 1108.77, 1070.62 cm-1.
Compuesto 4. A una suspensión de hidrocloruro de L-carnitina (14,5 mg, 0,072 mmol) en MeCN anhidro (5 mL) en un vial de microondas de 10 mL con barra agitadora, se añadió el compuesto 2 (Kee, H. L; et al., J. Phys. Chem. B 2005, 109, 20433) (32,3 mg, 0,088 mmol) y TMSCI (466 μί, 3,67 mmol). La reacción se calentó con el siguiente gradiente de temperatura en un reactor de microondas focalizadas: 25-80 °C en 30 minutos, 80-100 °C en 5 minutos, 100 °C durante 30 minutos, 100-120 °C en 10 minutos y 120 °C durante 2 horas. La mezcla de reacción se evaporó a presión reducida y el crudo de reacción se disolvió en la mínima cantidad de CH2CI2 y se re-precipitó añadiendo terc-butil metil éter, para dar el compuesto 4 (31 ,8 mg, 88%) como un sólido rojo con fluorescencia verde en disolución.
Figure imgf000015_0001
1H NMR (CDCU, 400 MHz): δ = 6.97 (s, 1 H, C3'H), 6.95 (s, 1 H, C5'H), 5.99 (s, 1 H, C6H), 5.97 (s, 1 H, C2H), 4.55 (s, 1 H, C3"H), 4.17 (s, 1 H, C4"H), 3.32 (s, 9H, C5"H, C6"H, C7"H), 3.26 (s, 1 H, C4"H), 2.87 (d, J = 14.45 Hz, 1 H, C2"H), 2.54 (s, 3H, CH3-C5), 2.47 (d, J = 14.45 Hz, 1 H, C2"H), 2.39 (s, 3H, CH3-C3), 2.34 (s, 3H, CH3-C4'), 2.08 (s, 3H, CH3-C2'), 1.98 (s, 3H, CH3-C6'), 1.39 (s, 3H, CH3-C7), 1.38 (s, 3H, CH3-C1). 13C NMR (101 MHz, CDCU): δ = 168.85 (C1 "), 155.71 (C3), 154.12 (C5), 143.83 (C8a), 143.52 (C7a), 142.52 (C8), 139.23 (C4'), 135.03 (C6'), 133.90 (C2'), 131.52 (C1), 131.39 (C7), 130.83 (C1'), 129.57 (C5'), 129.25 (C3'), 122.46 (C6), 122.43 (C2), 69.45 (C4",), 62.31 (C3"), 55.07 (C5", C6", C7"), 37.06 (C2"), 21.36 (CH3-C4'), 19.76 (CH3-C2'), 19.42 (CH3- C6'), 17.39 (CH3-C5), 15.67 (CH3-C3), 13.85 (CH3-C7), 13.72 (CH3-C1). HRMS (ESI+) m/z: calculada para C29H39BN303 + [M+]: 488.3079, encontrada 488.3090. IR (KBr): v = 1720.45 (C=0), 1546.29, 1505.72, 1470.57, 1295.12, 1187.69, 1155.63, 1083.56, 1043.53, 982.88 crrr1.
B. Caracterización de las nuevas sondas fluorescentes (compuestos 3 y 4) como marcadores de mitocondrias
Los ensayos celulares se llevaron a cabo sobre dos líneas celulares humanas: SCC38 y HeLa. La línea SCC38 procede de carcinoma epidermoide de laringe de pacientes humanos, mientras que HeLa, la primera línea celular humana establecida en cultivo, deriva de cáncer de cérvix. El medio de cultivo utilizado para ambas líneas celulares fue DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Médium) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 100 U/mL de penicilina, 200 μg/mL de estreptomicina, 100 μΓΤΐοΙ/L de aminoácidos no esenciales y 2 mmol/L de glutamina. Los cultivos se incubaron a 37 °C y 5% de C02.
Estas líneas celulares se tiñeron con las sondas fluorescentes sintetizadas siguiendo el protocolo que se describe: Se sembraron 30000-50000 células SCC38 en placas de 24 pocilios con fondo de cristal que se cultivaron hasta alcanzar una confluencia del 70%. Entonces se retiró el medio de cultivo del pocilio y se realizaron al menos 3 lavados con medio DMEM sin aditivos. Tras ello se añadió al pocilio 1 ml_ de DMEM y el compuesto fluorescente correspondiente. Las células se incubaron a 37 °C durante 30 minutos, tras lo que se retiró el medio y se realizaron nuevos lavados con DMEM. Por último, se añadió medio completo y se observaron las células al microscopio. El análisis al microscopio se realizó usando un equipo Zeiss AxioObserver Z1 con AxioCam MRM y ApoTome 2 (Cari Zeiss, Alemania) con distintos objetivos de aceite de inmersión 40X 63X. Las células se tiñeron también con MitoTracker® Red CMXRos (Thermo Fisher) según las instrucciones del fabricante, con el fin de realizar estudios comparativos con los nuevos marcadores fluorescentes aquí sintetizados. Inicialmente, ambos compuestos 3 y 4 se utilizaron a una concentración de 50 nM, y el tiempo de tinción fue también de 30 minutos.
A modo de ejemplo, se describe el comportamiento del compuesto 4 marcando células de SCC38 y analizado por microscopía celular de fluorescencia. En la Fig. 1 se presentan la intensidad de mareaje en función de la concentración de colorante en el medio.
Para confirmar la especificidad del mareaje por las mitocondrias, se llevaron a cabo estudios de co-localización mediante co-tinción con el marcador de mitocondrias comercial MitoTracker® rojo en la línea celular. El compuesto 4 se utilizó a una concentración de 50 nM y el MitoTracker® Red a 25 nM. Se añadieron ambos compuestos a la vez y se incubaron durante 30 minutos. Las células marcadas con ambos compuestos se observaron tanto con el microscopio Zeiss AxioObserver Z1 como con un microscopio láser confocal espectral Leica TCS-SP8X (Servicios Científico-Técnicos, Universidad de Oviedo).
Los estudios de microscopía celular mostraron, en el caso de la co-tinción con ambos compuestos a la vez, una buena co-localización de las dos sondas sin interferencias ni efectos citotóxicos. Cabe destacar que en muchos casos se pudo observar que la tinción del MitoTracker® rojo se concentró en los bordes de la mitocondria, mientras que la tinción verde del compuesto 4 se localizó preferentemente en su interior (la matriz mitocondrial).
La cinética del mareaje celular con 4 se estudió por citometría de flujo con las líneas celulares SCC38 y HeLa, utilizando MitoTracker® rojo como marcador control, ambos a una concentración de 50 nM. Los tiempos de tinción estudiados fueron de 5, 15, 30 y 45 minutos. Tras la tinción, se retiró el medio, se lavó con PBS, se tripsinizó y el pellet se re-suspendió en 500 μΙ_ de PBS y se introdujo en el citómetro tras filtración. Se utilizó un citómetro de flujo Analizador Celular Cytomics FC500 de Beckman Coulter (Servicios Científico-Técnicos, Universidad de Oviedo). Parte de las células re-suspendidas fueron sembradas y observadas también al microscopio. Como se puede observar en la Fig. 2, la tinción con MitoTracker® rojo apenas varió al aumentar el tiempo de incubación con el marcador, mientras que el mareaje con el compuesto 4 aumentó claramente de intensidad con el tiempo de incubación. Se realizó un nuevo experimento de citometría en el que se incluyó un tiempo de tinción más largo (45 min), y en el que se pudo ver que el mareaje era aún más intenso que con el tiempo de 30 minutos. Este hecho parece apuntar a la actuación de un mecanismo de transporte activo del compuesto 4 en la mitocondria. Por otro lado, en los experimentos de co-tinción se observó que el MitoTracker® rojo parece concentrarse en los bordes de la mitocondria, mientras que la tinción verde del compuesto 4 se localiza preferentemente en su interior (la matriz mitocondrial). Estos hechos indicarían que la internalización de la sonda 4, a diferencia del marcador comercial, implica la presencia de un mecanismo de transporte activo del compuesto 4 en la mitocondria.
C. Estabilidad en agua
Uno de los factores críticos que condiciona la viabilidad y aplicabilidad de los colorantes funcionales 3 y 4 como sondas fluorescentes de mitocondrias es su estabilidad en agua ya que estos compuestos contienen dos enlaces B-0 potencialmente lábiles conectando el fluoróforo con sustituyente carnitina. Esta estabilidad se determinó analizando la evolución temporal de 3 y 4 en disolución 15 mM en D2O a 25 °C usando 1H NMR. Esta técnica permite no solo definir su estabilidad sino además identificar los posibles productos de degradación (Esquema 2). Ambas sondas se hidrolizan generando carnitina libre y los correspondientes 4,4-dihidroxi-BODIPY derivados 5 y 6.
Figure imgf000018_0001
Esquema 2 - Hidrólisis de las dos sondas BODIPY-carnitina (sondas 3 y 4).
La sonda 3 se hidroliza rápidamente ( /2 = 10 min) sin embargo, la mayor sustitución del derivado tetrametilado en 4 le confiere una mayor estabilidad ( i2 = 6 h), lo que potencia su uso como marcador fluorescente en células vivas. Contrario a lo que podría pensarse, la generación de carnitina libre y de los correspondientes derivados BODIPY 5 y 6 a pH fisiológico es de hecho una ventaja para su aplicación en mareaje celular. Así, (R)- carntina se incorporara al metabolismo mitocondrial mientras que, a través del grupo ácido sobre el boro del BODIPY hidrolizado, éste puede unirse covalentemente con moléculas poli-hidroxiladas (sacáridos y glicoproteinas, por ejemplo) generando esteres de boro cíclicos. La formación reversible de estos esteres borónicos inmobilizaran la sonda dentro de la mitocondria, impidiendo así su disfusión fuera del orgánulo celular, incluso en aquellos casos donde el potencial de la membrana mitocondrial haya sido eliminado.
D. Caracterización fotofísica
La caracterización fotofísica de las sondas 3 y 4 se realizó analizando los correspondientes espectros de absorción y fluorescencia en la región UV-visible del espectro. De acuerdo con los perfiles espectrales y su dependencia con la concentración, estas sondas no presentan ninguna tendencia de agregación ni tipo H- ni J-, incluso trabajando a concentraciones tan elevadas como 10"4 M. Ya que estas sondas han sido diseñadas como marcadores fluorescentes mitocondriales, su fotofísica se ha analizado en agua. (Fig.1 ).
La Tabla 1 recoge las propiedades fotofísicas3 de la sonda 3 en agua y la sonda 4 en diferentes disolventes. Tabla 1
Figure imgf000019_0001
Su comportamiento fotofísico resulta dependiente del grado de sustitución del BODIPY ya que la alquilación del cromóforo induce un impedimento estérico suficiente para reducir el giro libre del grupo 8-mesitilo, un proceso que conlleva a una reducción significativa de la eficiencia de fluorescencia. Así, la sonda 4 en agua destaca por un elevado coeficiente de absorción molar (3.8 x 104 M-1 crrr1 at 499 nm) y una emisión de fluorescencia a 511 nm muy eficiente, con un rendimiento que llega a alcanzar el 80%. Además, la estructura rígida y compacta de la sonda 4 determina que éste sea un colorante altamente eficiente con independencia del disolvente, ya que su comportamiento fotofísico es similar aun disminuyendo significativamente la polaridad del disolvente, pasando por ejemplo de agua a cloroformo (Figura 3).
Hay que destacar que la sonda 4 presenta además una elevada fotoestabildiad, que es un factor crítico en el desarrollo de colorantes para mareaje biológico. La hidrólisis del 4 observada por 1H NMR no conlleva una reducción significativa de su emisión de fluorescencia.
La Tabla 2 muestra la evolución temporal de las propiedades fotofísicas de la sonda 4 en agua.
Tabla 2
Figure imgf000020_0001
De hecho, el rendimiento de fluorescencia permanece constante durante 7 horas. Sin embargo, debido a la oligomerización del producto de hidrólisis 6 y a la consecuente precipitación de los oligómeros resultantes, la eficiencia de fluorescencia disminuye gradualmente en 24 horas, aunque mantiene un rendimiento del 65%. Basándonos en estos resultados es posible concluir que la hidrólisis del colorante no afecta significativamente a su comportamiento fluorescente y, además, su capacidad para unirse covalentemente a las proteínas mitocondriales evita su subsecuente liberación y su potencial difusión, secreción o metabolismo no deseado. De hecho, la difusión del colorante fuera del orgánulo celular, que ocurre en aquellos colorantes no unidos covalentemente a los mismos, es uno de los mayores problemas en el desarrollo de marcadores biológicos fluorescente porque conlleva una disminución significativa de la eficiencia fluorescente y, con ello de la precisión y reproducibilidad de los experimentos. El diseño racional de la sonda 4 debe, por tanto, evitar esa pérdida de señal fluorescente y mejorar la calidad y precisión de las medidas, potenciando así su aplicabilidad como sonda biológica. E. Impacto del potencial de la membrana mitocondrial en la distribución subcellular de 4
El mareaje fue analizado por citometría de flujo frente a carbonilcianuro-p- trifluorometoxifenilhidrazona (FCCP), un protonóforo usado para disminuir el potencial de membrana mitocondrial (ΔΨ,π) por despolarización de la membrana mitocondrial. Las células tratadas con FCCP (60 μΜ FCCP durante 3 h, at 37 °C) presentan muy atenuada la fluorescencia mitocondrial después de ser incubadas con MitoTracker Red, una sonda fluorescente dependiente de A4 Sin embargo, las mismas células incubadas con la sonda (R)-BCT-2 presentan no sólo un aumento de la fluorescencia con la disminución del potencial ΔΨ,π, sino que son capaces de marcar mitocondrias despolarizadas (Fig. 4). De hecho, la supresión de la atracción electrostática colorante-mitocondria como mecanismo pasivo de mareaje reduce la concentración del colorante dentro del orgánulo celular, y con ello la probabilidad y extensión de los procesos de desactivación de la fluorescencia con el consiguiente incremento de su eficiencia. Todos estos resultados permiten afirmar que la nueva sonda 4 se internaliza en la mitocondria vía un sistema de transporte activo, independiente del potencial de membrana, a diferencia del Mitotracker Red y de similares colorantes catiónicos que son rápidamente absorbidos en este orgánulo cargado negativamente por un mecanismo pasivo basado en su atracción electrostática. Un potencial transportador de 4 es el sistema de carnitina (CS), que canaliza los ácidos grasos a través de la membrana mitocondrial hacia la matriz mitocondrial interna donde se convierten en sustratos de la oxidación β (Figura 5). Los ácidos grasos son primero activados por la acil-CoA sintetasa (ACSL) en el citosol a tioésteres de acil-CoA, que atraviesan la membrana mitocondrial externa a través del canal de aniones dependiente de voltaje (VDAC), pero no cruzan la membrana mitocondrial interna debido a la falta de un transportador específico. Los derivados acil- CoA de ácidos grasos se transesterifican en acilcarnitinas por la "carnitina palmitoiltransferasa-1a" (CPT-1a), una enzima de membrana mitocondrial externa integral, y así se liberan en el espacio intermembrana. Las acilcarnitinas se translocan a través de la membrana mitocondrial interna mediante la translocasa de carnitina / acilcarnitina (CACT), que media una reacción antiportadora que permite la entrada de acilcarnitinas en la matriz mitocondrial y la salida de la carnitina libre. Finalmente, la enzima carnitina palmitoiltransferasa-2 (CPT-2) cataliza la transesterificación del grupo acilo desde carnitina a CoA en la matriz mitocondrial que proporciona los sustratos para la β-oxidación. La función de transporte de CACT es crucial para la vía de β-oxidación. Debido a la naturaleza lipófila de la subunidad BODIPY, la sonda 4 puede considerarse razonablemente como un biomimético de acilcarnitinas, pudiendo viajar en su lugar a través del sistema de transporte de carnitina. Para comprobar si CACT está realmente involucrado en la canalización de 4 hacia la matriz mitocondrial, primero se estudió el efecto de (f?)-(+)-palmitoilcarnitina, un sustrato CACT natural, en el mareaje celular por 4. El análisis por citometría de flujo de células SCC38 co-incubadas con 4 (50 nm) y concentraciones crecientes de ( )-palmitoylcarnitine (100, 250 and 500 nM), muestran una reducción de la intensidad de fluorescencia dependiente de la concentración (Figura 6). Por el contrario, sólo se observó una disminución marginal de la fluorescencia en el caso del mareaje celular con MitoTracker Red en las mismas condiciones experimentales (Figura 6).
Estos experimentos implican la participación de CACT en el transporte activo de 4 en mitocondrias. Para apoyar aún más esta conclusión, se estudió también la esteroespecificidad del marcado mitocondrial, comparando la tinción resultante de 4 y su enantiomero (S)-4, en condiciones experimentales idénticas. La evaluación por citometría de flujo de los experimentos de tinción para todas las concentraciones seleccionadas reveló que la intensidad de fluorescencia era considerablemente menor cuando las células SCC38 se cargaban con (S)-4, que contiene el enantiómero-(S) no natural de carnitina, que cuando las mismas están marcadas con 4. Las actividades observadas son paralelas a las conocidas estereoespecificidades mostradas por CACT para las correspondientes palmitoilcanitinas enantioméricas (Figura 7). En general, estas observaciones corroboran la opinión de que 4 es un sustrato de CACT, que canaliza activamente la sonda a través de la membrana interna mitocondrial hacia la matriz, donde se hidroliza a carnitina y al derivado de ácido borónico 6. La carnitina es así transportada de regreso de la matriz hacia el citoplasma por CACT, mientras que es probable que 6 sea retenido en la matriz por complejación covalente a glicoproteínas.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Compuesto de fórmula general (I)
Figure imgf000023_0001
donde:
Z se selecciona de entre un N o un grupo C(R7);
R1 a R7 se seleccionan cada uno independientemente entre hidrógeno, alquilo C1-C18 sustituido o no sustituido, alquenilo C2-C18 sustituido o no sustituido, alquinilo C2-C18 sustituido o no sustituido, a rilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, halógeno, -OR\ -COOR', -SR', -SOR', -SOOR' y -NR'R"; o cada dos radicales R1 a R7 forman un cicloalquilo, arilo o heteroarilo;
R' y R" se seleccionan cada uno independientemente entre hidrógeno, alquilo C1-C18, alquenilo C2-C18, alquinilo C2-C18, arilo o heteroarilo; y
X' es un contraión,
o cualquiera de sus isómeros.
2. Compuesto según la reivindicación 1 , donde Z es C(R ).
3. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, donde R7 es un arilo opcionalmente sustituido.
4. Compuesto según la reivindicación 3, donde R7es un trimetilfenilo.
5. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde R2 y/o R5 son hidrógeno.
6. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde R1 , R3, R4 y R6 son cada uno independientemente hidrógeno o metilo.
7. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde R1 , Rs, R4 y Re son hidrógeno o metilo.
8. Compuesto según cualquier de las reivindicaciones 1 a 7, donde X" se selecciona de entre un halogenuro, SO4-, BF4-, PF4-, HSO4- y (S04 2-)1/2.
9. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde X" es Cl\
10. Compuesto según la reivindicación 1, donde el compuesto se selecciona de entre:
Figure imgf000024_0001
11. Procedimiento de obtención del compuesto de fórmula (I) descrito según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende la reacción de un compuesto de fórmula (III) con carnitina:
Figure imgf000024_0002
donde: Z y R1 a Re son los definidos en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
12. Uso del compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 como marcador o sonda fluorescente.
13. Uso según la reivindicación 12, para el mareaje celular.
14. Uso según la reivindicación 13, para el mareaje celular de mitocondrias.
15. Uso según la reivindicación 14, en células vivas.
16. Uso del compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, para la fabricación de marcadores para el diagnóstico de enfermedades mitocondriales.
17. Uso según la reivindicación 16, donde las enfermedades mitocondriales se seleccionan de entre deficiencia en translocasa carnitina-acilcarnitina, descompensación metabólica en la infancia, cardiomiopatía en la niñez, fatigabilidad en la edad adulta, trastornos en el metabolismo, cáncer, diabetes tipo-2, enfermedades neurológicas y enfermedades cardiovasculares.
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