ES2693080T3 - Mutaciones en el dominio extracelular III del gen del receptor del factor de crecimiento epidérmico - Google Patents

Mutaciones en el dominio extracelular III del gen del receptor del factor de crecimiento epidérmico Download PDF

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Abstract

Una secuencia peptídica con una longitud de entre 17 y 100 aminoácidos y que comprende la secuencia SEQ ID NO: 13 X1SLKEISDGDVIIX4X5NX2, en la que X1 se selecciona entre R y C; X4 se selecciona entre S y L; X5 se selecciona entre G y R; X2 se selecciona entre K y T; y en la que al menos uno de X1, X4, X5 y X2 es, respectivamente, C, L, R o T.

Description

DESCRIPCION
Mutaciones en el dominio extracelular III del gen del receptor del factor de crecimiento epidermico
5 La presente invencion se refiere a nuevas mutaciones del gen del receptor del factor de crecimiento epidermico humano, como un marcador para la determinacion de la respuesta al tratamiento con un anticuerpo monoclonal.
Antecedentes de la tecnica
10 El gen del receptor del factor de crecimiento epidermico (EGFR) es un receptor de cinasa de tirosina transmembranario que pertenece a la familia de receptores del factor de crecimiento epidermico (familia ErbB), que incluye cuatro receptores de cinasa de tirosina estrechamente relacionados: el EGFR (ErbB-1), el HER2/c-neu (ErbB-2), el Her 3 (ErbB-3) y el Her 4 (ErbB-4). Tras la union con el ligando, el EGFR activa las rutas de senalizacion intracelular, principalmente la cascada RAS-RAF-MEK-ERK y la ruta PI3K-AKT, que regulan unos acontecimientos 15 oncogenicos claves tales como la apoptosis, el crecimiento celular, la angiogenesis y la metastasis. Se ha notificado una activacion aberrante o una sobreexpresion del EGFR en diversos tipos de cancer (es decir, Mendelsohn J, Baselga J et al., " Epidermal growth factor receptor targeting in cancer". Semin Oncol - 2006, Vol. 33, pags.: 369-38). Se han descrito mutaciones imagen del EGFR en el cancer de pulmon. Algunos ejemplos de dichas mutaciones se divulgan, por ejemplo, en el documento de TJ et al., "Activating mutations in the epidermal growth factor receptor 20 underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib", N Engl J Med-2004, Vol. 350, pags.: 21292139.
El cancer colorrectal metastasico (CCRm) es la segunda causa inmediata de muerte por cancer en los pafses occidentales.
25
Una terapia basada en anticuerpos monoclonales (AcMc), por ejemplo, cetuximab y panitumumab, que estan dirigidos contra el dominio extracelular III del EGFR, proporciona un beneficio de supervivencia significativo para los pacientes con CCRm, y ahora son los componentes convencionales de los regfmenes terapeuticos de estos pacientes, es decir, tanto solos como junto con otro(s) farmaco(s) antineoplasico(s).
30
Los AcMc se unen a los antfgenos foraneos expresados en las celulas cancerosas. Una vez unidos, las celulas cancerosas son marcadas para su destruccion por el sistema inmunitario del paciente. Ademas de su direccionamiento a las celulas cancerosas, los AcMc pueden estar disenados para actuar sobre otros tipos de celulas y de moleculas necesarios para el crecimiento del tumor. Por ejemplo, los anticuerpos pueden neutralizar los 35 factores de crecimiento e inhibir asf la expansion del tumor. Es posible crear un AcMc espedfico para practicamente cualquier objetivo extracelular/de la superficie de la celula (tal como en las celulas cancerosas). En resumen, los AcMc pueden usarse para destruir celulas tumorales malignas e impedir el crecimiento del tumor mediante el bloqueo de los receptores celulares espedficos. Los AcMc terapeuticos cetuximab y panitumumab se unen al EGFR e impidan la activacion de las rutas de senalizacion intracelular dirigidas por el EGFR (es decir, la cascada RAS- 40 RAF-MEK-ERK y la ruta PI3K-AKT).
No todos los pacientes con CCRm responden a un regimen terapeutico que comprende AcMc. La ausencia de respuesta de un paciente con CCRm a dicho tratamiento podna ser primaria (es decir, desde el comienzo del tratamiento con el AcMc anti-EGFR), lo que se conoce como resistencia primaria. Ademas, todos los pacientes con 45 CCRm que inicialmente responden a los AcMc anti-EGFR invariablemente desarrollan una resistencia secundaria, es decir, una resistencia adquirida contra el AcMc anti-EGFR. En ambos casos, el resultado es un fracaso del tratamiento. Los mecanismos que contribuyen a la adquisicion de dicha resistencia al tratamiento en los pacientes con CCRm todavfa no se han comprendido en su totalidad.
50 El KRAS (tambien conocido como homologo del oncogen vmco del sarcoma de rata de Kirsten V-Ki-ras2) es un efector del EGFR anterogrado y un marcador de la resistencia primaria a los AcMc anti-EGFR. El KRAS tiene un significativo impacto sobre la optimizacion del tratamiento en los pacientes con CCRm. El cuarenta por ciento de los tumores colorrectales portan una mutacion en el gen KRAS, y estos pacientes no se benefician de los AcMc anti- EGFR. En la practica clinica habitual, a todos los pacientes con CCRm que estan siendo considerados para una 55 terapia con AcMc anti-EGFR se les debenan realizar pruebas del KRAS, y los pacientes debenan ser excluidos de la terapia con cetuximab o panitumumab si se detecta una mutacion del KRAs.
Aunque el uso de las mutaciones del KRAS y mas recientemente de las mutaciones del NRAS (homologo del oncogen vmco Ras de neuroblastomas) como marcadores de la resistencia primaria a los AcMc anti-EGFR ha 60 supuesto una etapa significativa hacia la optimizacion del tratamiento de los pacientes con CCRm, la comprension de los cambios moleculares subyacentes en la resistencia adquirida a los AcMc anti-EGFR es actualmente un desaffo crucial para mejorar el beneficio clinico de estos farmacos. Recientemente se han elucidado los mecanismos de resistencia secundaria (resistencia adquirida) en algunos pacientes. El acontecimiento mas habitual es la aparicion de mutaciones KRAS o una amplificacion genica en aproximadamente el 50 % de los casos, como se 65 deduce a partir de Misale et al., "Emergence of KRAS mutations y acquired resistance to anti-EGFR therapy in
colorectal cancer", Nature -2012, Vol. n° 486, pags.: 532-536.
Otros mecanismos de resistencia secundaria incluyen la adquisicion de una mutacion en el dominio extracelular del EGFR que anula la union del cetuximab al EGFR, segun ilustran Montagut et al., "Identification of a mutation in the 5 extracellular dominio of the Epidermal Growth Factor Receptor conferring cetuximab resistance in colorectal cancer", Nature Medicine - 2012, Vol. n° 18, pags.: 221-223. La mutacion es el polimorfismo en la porcion extracelular del gen EGFR, que da como resultado la sustitucion de aminoacidos S492R en el dominio III de la protema codificada.
Con el objetivo de estudiar la interaccion del anticuerpo monoclonal con los epftopos del EGFR, numerosos informes 10 estan dirigidos al cartografiado de los epftopos cnticos. Estos informes proporcionan datos de las mutaciones obtenidas por mutagenesis dirigida en el dominio III del EGFR. Un ejemplo de estos informes es el de Voigt et al., "Functional Dissection of the Epidermal Growth Factor Receptor Epitopes Targeted by Panitumumab and Cetuximab", Neoplasia -2012, Vol. n° 14(11), pags.: 1023-1031. Este documento desvela mutaciones en las que el aminoacido natural ha sido en su mayor parte cambiado por una alanina, segun los protocolos y las herramientas de 15 los ensayos de mutagenesis dirigida. Voigt concluye que los datos in vitro de la mutagenesis dirigida pueden no ser significativos in vivo debido a que podna ser que los residuos definidos como cnticos para la union del cetuximab o del panitumumab mediante una metodologfa de cribado de alanina estuvieran mutados in vivo en otros aminoacidos sin ninguna consecuencia funcional. Por lo tanto, esas posiciones clave en un epftopo definido identificado por la mutagenesis dirigida no sugieren una mutacion significativa in vivo (el intercambio del aminoacido en particular).
20
La resistencia a los farmacos es por lo tanto un importante reto en los pacientes con cancer colorrectal tratados con farmacos anti-EGFR, a saber, cetuximab y panitumumab. La elucidacion de los mecanismos moleculares de resistencia representa un gran objetivo, pero esto implica la deteccion de mutaciones significativas o de otras alteraciones genicas como marcadores para la prediccion de la respuesta y, al mismo tiempo, para la determinacion 25 de si un regimen medico en particular debe ser modificado debido a la resistencia adquirida (resistencia secundaria). En resumen, el estado de la tecnica proporciona herramientas utiles para la deteccion de la resistencia primaria y secundaria a las terapias con AcMc anti-EGFR en pacientes con CCRm, pero es necesaria la identificacion de biomarcadores adicionales y alternativos predictivos de la resistencia con objeto de tener en cuenta a los pacientes con diferentes mutaciones, o con una evolucion diferente en los mecanismos de resistencia molecular.
30
Sumario de la invencion
Los inventores han identificado nuevas mutaciones en el dominio extracelular del EGFR humano (dominio III) que se correlacionan con la resistencia al tratamiento con algunos de los AcMc usados en la terapia oncologica. Las 35 mutaciones dan lugar a las sustituciones de aminoacidos de una arginina por una cistema en la posicion 451 de la protema EGFR; de una serina por una leucina en la posicion 464 del EGFR; de una glicina por una arginina en la posicion 465 de la protema EGFR; y de una lisina por una treonina en la posicion 467 de la protema EGFR.
La protema EGFR humana natural tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 2 y las mutaciones se 40 conocen en el presente documento como R451C, S464L, G465R y K467T. Las mutaciones pueden ser detectadas solas o junto con cada una de las otras en pacientes con CCRm despues del tratamiento con un AcMc anti-EGFR.
Todas estas mutaciones estan localizadas en un fragmento en particular de la secuencia de aminoacidos del epftopo de union al cetuximab. A saber, estan localizadas en un fragmento desde el aminoacido en la posicion 450 hasta el 45 aminoacido en la posicion 470 de la SEQ ID NO: 2, esta SEQ ID NO: 2 se corresponde con la secuencia de aminoacidos consenso natural del EGFR humano. Este fragmento de la secuencia de aminoacidos del epftopo de union al cetuximab es denominado tambien en el presente documento SEQ ID NO: 12 (LRSLKEISDGDVIISGNKNLC). De forma interesante, los inventores descubrieron que este fragmento incluye muchos de los intercambios de aminoacidos en particular (mutaciones) que dan lugar a un deterioro real (es decir, 50 no hay eficacia) de muchos tratamientos con un AcMc anti-EGFR. Como se ha expuesto anteriormente, mediante mutagenesis se ha determinado que muchas posiciones de aminoacidos son posiciones clave mientras se cartografiaban los sitios de union anti-EGFR-AcMc, no obstante, tambien se sabe que los ensayos de cartografiado no son concluyentes para la determinacion de la resistencia a los tratamientos.
55 Por lo tanto, los inventores proporcionan por primera vez un fragmento del dominio extracelular III del EGFR que contiene o resume muchas mutaciones puntuales con un efecto real sobre la terapia. El analisis o la determinacion de la secuencia de este fragmento (SEQ ID NO: 12) proporciona la ventaja de detectar muchos de los posibles pacientes resistentes a los tratamientos que incluyen un AcMc anti-EGFR. Algunos ejemplos de aminoacidos de esta SEQ ID NO: 12 (LRSLKEISDGDVIISGNKNLC) que dan lugar a una resistencia al ampliamente empleado AcMc anti- 60 EGFR cetuximab estan indicados en negrita y subrayados.
Todas estas mutaciones estan localizadas en el exon 12 de la variante 1 del ARNm del gen EGFR humano que finalmente codifica la protema EGFR de la SEQ ID NO: 2. Ademas, todas ellas estan relacionadas con un cambio de los aminoacidos naturales por aminoacidos voluminosos (es decir, aquellos con una cadena lateral que consiste en 65 hidrocarburos C1-C4 ramificados o no ramificados, opcionalmente con un grupo amino terminal) y/o por aminoacidos
polares o cargados. En particular, la mayor parte de las mutaciones se relacionan con un cambio en un aminoacido polar y/o cargado con una cadena lateral que comprende un amino terminal (-NH2). Mas en particular, dos de las mutaciones se relacionan con el cambio de un aminoacido con una cadena lateral que comprende un amino terminal (-NH2). Ademas, las mutaciones R451C y K467T implican la sustitucion de un aminoacido con una cadena lateral 5 que comprende un amino terminal (-NH2) por un aminoacido polar, cuya cadena lateral de carbohidrato comprende radicales con atomos del grupo del oxigeno, a saber -OH y -SH, y tienen un tamano de la cadena lateral similar, segun se representa a continuation:
10
15
I-CHC-OH
0 11
ch2
h2n-chc-oh
ch2
ch2
ch2
ch2
NH
ch2
C=NH
ch2
nh2
nh2
, R
Lys, K
O
h2n-chc-oh
CHOH
ch3
h2n-chc-oh
ch2
I *■
SH
Thr, T
Cys, C
Por lo tanto, los inventores proporcionan por primera vez la asociacion de mutaciones en el dominio III del EGFR humano cambiando un aminoacido basico con una cadena lateral que comprende un amino terminal (-NH2), con una probada resistencia al tratamiento con algunos de los AcMc usados en la terapia oncologica. Mas particularmente, esta asociacion se observa cuando estos aminoacidos basicos cambian por algunos aminoacidos polares seleccionados entre cistema y treonina.
Ademas, los cambios de los aminoacidos en la anteriormente mencionada SEQ ID NO: 12, siendo dichos aminoacidos polares o neutros y estando sustituidos por aminoacidos voluminosos, con carga o neutros, tambien estan asociados con una resistencia probada al tratamiento con algunos de los AcMc usados en la terapia 20 oncologica. Este es el caso, por ejemplo, de la mutation S464L y de la mutation G465R.
Las mutaciones en particular R451C y K467T son detectadas en una protema mutada que comprende la secuencia peptidica definida en la SEQ ID NO: 1.
25 Ademas, las mutaciones indicadas anteriormente y las mutaciones S464L y G465R son detectadas en una protema mutada que comprende la secuencia peptidica definida en la SEQ ID NO: 13.
Estos marcadores pueden usarse despues para seguir la evolution de los mecanismos de resistencia adquirida frente a las terapias anti-EGFR. La detection de la resistencia adquirida puede ser una herramienta util para 30 proponer otra metodologia terapeutica o regimen medico junto con el seguimiento de la evolucion de la enfermedad.
Por lo tanto, en un primer aspecto, la invention se refiere a una secuencia peptidica con una longitud de entre 17 y 100 aminoacidos y que comprende la secuencia SEQ ID NO: 13
35 X1SLKEISDGDVIIX4X5NX2,
en la que
X1 se selecciona entre R y C;
X4 se selecciona entre S y L;
40 X5 se selecciona entre G y R;
X2 se selecciona entre K y T; y en la que al menos uno de X1, X4, X5 y X2 es, respectivamente, C, L, R o T.
La SEQ ID NO: 13 engloba cualquiera de las mutaciones definidas anteriormente, pero al menos una de ellas: R451C, S464L, G465R o K467T.
En una realizacion en particular, la invencion se refiere a una secuencia peptidica con una longitud de entre 17 y 100 aminoacidos y que comprende la secuencia SEQ ID NO: 1
5
en la que:
X1SLKEISDGDVIISGNX2,
X1 se selecciona entre R y C;
X2 se selecciona entre K y T; y
10
en la que si X1 es C, entonces X2 se selecciona independientemente entre K y T, y si X1 es R, entonces X2 es T.
La SEQ ID NO: 1 engloba cualquiera de las mutaciones definidas anteriormente, pero al menos una de ellas: R451C o K467T. En otras palabras, X1 yX2tienen el significado indicado, pero con la condicion de que al menos uno de X1 o 15 X2 sean, respectivamente, las formas mutadas C o T; o ambas X1 yX2 sean las formas mutadas C y T.
Esta SEQ iD NO: 1 deriva de la protema humana EGFR de la SEQ ID NO: 2. Por lo tanto, es un fragmento de la secuencia de protemas humana, incluyendo dicho fragmento al menos una de las mutaciones indicadas. Por lo tanto, el resto de los aminoacidos hasta 100 son aquellos que estan localizados en la secuencia de protemas de la SEQ ID NO: 2, siendo cualquiera de los flanqueantes dicha SEQ ID NO: 1 o una secuencia unida al extremo C 20 terminal de la SEQ ID NO: 1 y definido por el aminoacido X2.
Ventajosamente, estas mutaciones (R451C, S464L, G465R o K467T) representan alternativas que pueden ensayarse en una muestra de un sujeto sospechoso de haber adquirido resistencia o una resistencia primaria a las terapias con AcMc anti-EGFR. Por lo tanto, ademas de otras mutaciones que pueda haber presentes o no en la 25 muestra de un sujeto, las mutaciones propuestas en la SEQ ID NO: 1 (R451C o K467T) o incluso en la SEQ ID NO: 13 (R451C, S464l, G465R o K467T) sirven para la deteccion de posibles sujetos resistentes no detectables por otros medios. En particular, las mutaciones R451C y K467T implican la ventaja adicional de indicar que algunas de las terapias con AcMc anti-EGFR todavfa son permisivas (o eficaces). En particular, las mutaciones R451C y K467T son permisivas al panitumumab. Esto significa que, si se detecta al menos una de estas dos mutaciones, al menos 30 puede recomendarse el tratamiento con panitumumab.
En un segundo aspecto, la invencion se refiere a un oligonucleotido que comprende una secuencia que codifica la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 13.
35 El peptido aislado que comprende la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 13 es el producto clave que da lugar a la deteccion de las formas mutadas de la protema EGFR, de gran interes en el campo de la terapia oncologica. Estas formas mutadas de la protema tambien son detectables en forma de un oligonucleotido que comprende una secuencia que codifica la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 13.
40 Los oligonucleotidos que codifican la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 13 son aquellos que incluyen los cambios de nucleotidos que dan lugar a al menos uno de los cambios de aminoacidos mencionados anteriormente, teniendo en cuenta la degeneracion de los codones (la redundancia del codigo genetico) en estas posiciones de mutacion. Estos oligonucleotidos pueden usarse entonces como sondas de hibridacion para la deteccion de las mutaciones en particular que dan lugar a cambios de aminoacidos.
45
Ademas, todos estos oligonucleotidos son sondas adecuadas que permiten la deteccion de la presencia o no de las mutaciones de nucleotidos que dan lugar a los cambios de aminoacidos en una secuencia peptidica que comprende la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 13.
50 En particular, la invencion se basa en la sorprendente identificacion de las sustituciones de aminoacidos de una arginina por una cistema en la posicion 451 de la protema EGFR; de una serina por una leucina en la posicion 464 del EGFR; de una glicina por una arginina en la posicion 465; y de una lisina por una treonina en la posicion 467 de la protema EGFR.
55 El cambio de aminoacidos K467T es el resultado del cambio de nucleotidos A^-C en el nucleotido 1400 (tambien conocido en el presente documento como A1400C) de la variante 1 del ARNm del gen EGFR (el codon AAA es cambiado por ACA). El cambio de aminoacidos R451C es el resultado del cambio de nucleotidos C^T en el nucleotido 1351 (tambien conocido en el presente documento como C1351T) de la variante 1 del ARNm del gen EGFR (el codon CGC es cambiado por TGC). El cambio de aminoacidos S464L es el resultado del cambio de
60 nucleotidos C^T en el nucleotido 1391 (tambien conocido en el presente documento como C1391T) de la variante 1 del ARNm del gen EGFR (el codon TCA es cambiado por TTA). El cambio de aminoacidos G465R es el resultado del cambio de nucleotidos G^A en el nucleotido 1393 (tambien conocido en el presente documento como G1393A) de la variante 1 del ARNm del gen EGFR (el codon GGA es cambiado por AGA).
65 Todos estos cambios de aminoacidos pueden ser el resultado de otras mutaciones en el codon que los codifica. En
particular, todos aquellos cambios de nucleotidos que dan lugar a una cistema en la posicion 451 de la SEQ ID NO: 2 (protema EGFR humana), a una leucina en la posicion 464 de la SEQ ID NO: 2, a una arginina en la posicion 465 de la SEQ ID NO: 2; y a una treonina en la posicion 467 de la SEQ ID NO: 2.
5 Como ya se ha indicado anteriormente, cada uno de los anteriores cambios de nucleotidos se refiere al ARNm, la variante del transcrito 1 de la secuencia del gen EGFR (tambien conocido como ERBB1, PIG61, protooncogen c- ErbB-1, tirosina cinasa de protema del receptor homologo del oncogen vmco de la leucemia eritroblastica aviar (v- erb-b) erbB-1 o HER1). La secuencia del ARNm, la variante del transcrito 1, del gen EGFR es la correspondiente a la SEQ ID NO: 3 (o numero de registro del GenBank NM_005228.3, version 3 de secuencia y edicion de la base de 10 datos disponible el 18.05.2014), asf como cualquier variante de la misma, en el que dicha variante codifica la protema EGFR. La protema EGFR se corresponde con la SEQ ID NO: 2 (numero de registro del GenBank NP_005219.2 version 2 de secuencia y edicion de la base de datos del 18.05.2014) o cualquier variante de la misma que mantenga la estructura basica de la protema EGFR. Las SEQ ID NOs: 2 y 3 son humanas (Homo sapiens). No obstante, el EGFR esta muy conservado en la mayona de los mairnferos y las mutaciones puntuales del presente 15 documento comprenden las secuencias naturales, los mismos aminoacidos en la mayona de los marnfferos. Por lo tanto, la invencion engloba las mismas mutaciones, pero determinadas en una secuencia de la protema o del gen EGFR de cualquier mam^era.
Otro aspecto de la invencion es un conjunto de cebadores que consiste en las SEQ ID Nos: 6 20 (CAAAGTTTTCAGGGATACATTGTTTTT) y 7 (TTAAATGGGAATAGCCCTTCAATATT).
Este conjunto de cebadores permite la amplificacion de la region genomica que comprende la porcion de la region codificante del EGFR en la que se localizan los cambios de nucleotidos que dan como resultado las mutaciones de la presente invencion. Por lo tanto, estan relacionados con las nuevas mutaciones de aminoacidos identificadas por 25 los inventores y permiten la amplificacion de la region codificante del EGFR que codifica el fragmento denominado en el presente documento SEQ ID NO: 12 (LRSLKEISDGDVIISGNKNLC) que se ha encontrado sorprendentemente como una region clave que incluye muchas mutaciones que dan lugar a una resistencia (adquirida o primaria) al tratamiento con AcMc anti-EGFR. Particularmente, el conjunto de cebadores que consiste en la SEQ ID NO: 6 y 7 permite la amplificacion de la region codificante del EGFR que da lugar al exon 12 en la variante 1 del transcrito del 30 ARNm. Este conjunto permite determinar si las mutaciones R451C, S464L, G465R y K467T estan presentes en la protema EGFR resultante final. Mas en particular, si las mutaciones R451C y K467T estan presentes en la protema EGFR resultante final.
Otro aspecto de la invencion es un kit que comprende un conjunto de cebadores que consiste en: el conjunto de 35 cebadores de las SEQ ID NOs: 6 y 7 y/o un oligonucleotido segun se define en el segundo aspecto de la invencion.
Este kit es una herramienta utilizable para detectar la presencia de las mutaciones (R451C, S464L, G465R y K467T) de la SEQ ID NO: 13 y mas particularmente de las mutaciones R451C y K467T de las SEQ ID NOs: 1, o de cualquier secuencia de aminoacidos que las comprenda, de una forma facil y rapida, dado que incluye los cebadores para la 40 amplificacion de las regiones del gen EGFR que pueden incluir las mutaciones divulgadas que se correlacionan con la resistencia al tratamiento con cetuximab.
Tambien, otro aspecto de la invencion es, por lo tanto, el kit como se ha definido anteriormente, para su uso en la prediccion de la respuesta de un sujeto a un regimen terapeutico que comprende anticuerpos monoclonales anti- 45 EGFR. O el uso de un kit como se ha definido anteriormente para predecir la respuesta de un sujeto a un regimen terapeutico que comprende anticuerpos monoclonales anti-EGFR.
Ademas, la invencion tambien se refiere a un metodo in vitro para predecir la respuesta de un sujeto a un regimen terapeutico que comprende cetuximab y/o panitumumab, en el que el metodo comprende:
50
(i) la determinacion en una muestra tomada del sujeto y mediante un medio seleccionado entre el grupo que consiste en metodos de genotipado y/o metodos de secuenciacion de protemas, de si hay mutaciones presentes o ausentes en un fragmento definido por la SEQ ID NO: 12, que es un fragmento desde el aminoacido 450 hasta el aminoacido 470 de la secuencia de aminoacidos consenso natural del EGFR humano de la SEQ ID NO: 2; y 55 ii) la correlacion de la presencia de cualquier mutacion identificada en la etapa i) con la resistencia del sujeto al regimen terapeutico que comprende cetuximab, o la correlacion de la ausencia de mutaciones en la etapa i) con la respuesta del sujeto al regimen terapeutico que comprende panitumumab.
Por lo tanto, la SEQ ID NO: 12 se corresponde con el fragmento (o la secuencia) del aminoacido natural del EGFR 60 humano, y las mutaciones relacionadas con esta secuencia de aminoacidos consenso natural estan determinadas en esta SEQ ID NO: 12, que se ha descubierto como un fragmento significativo fragmento del EGFR en relacion con la prediccion de los tratamientos con AcMc anti-EGFR. Esta SEQ ID NO: 12 tambien forma parte de la invencion (LRSLKEISDGDVIISGNKNLC) como un peptido aislado.
65 La invencion tambien se refiere a metodos in vitro de prediccion de la respuesta de un sujeto a un regimen
terapeutico que comprende cetuximab y/o panitumumab, en el que el metodo comprende:
i) la determinacion mediante un medio seleccionado entre el grupo que consiste en metodos de genotipado y/o metodos de secuenciacion de protemas, de la presencia o la ausencia de al menos uno de los siguientes 5 aminoacidos:
una cistema en la posicion 451 de la secuencia de aminoacidos correspondiente a la SEQ ID NO: 2, una leucina en la posicion 464 de la secuencia de aminoacidos correspondiente a la SEQ ID NO: 2, una arginina en la posicion 465 de la secuencia de aminoacidos correspondiente a la SEQ ID NO: 2; y una treonina en la posicion 467 de la secuencia de aminoacidos correspondiente a la SEQ ID NO: 2, en una muestra tomada del sujeto; y 10 ii) la correlacion de la presencia de cualquiera de los aminoacidos identificados en la etapa i) con la resistencia del sujeto al regimen terapeutico que comprende cetuximab, o la correlacion de la ausencia de todos estos aminoacidos en la etapa i) con la respuesta del sujeto al regimen terapeutico que comprende panitumumab.
Ademas, la invencion tambien se refiere, en una realizacion en particular, a un metodo in vitro de prediccion de la 15 respuesta de un sujeto a un regimen terapeutico que comprende cetuximab y/o panitumumab, en el que el metodo comprende:
i) la determinacion mediante un medio seleccionado entre el grupo que consiste en metodos de genotipado y/o metodos de secuenciacion de protemas, de la presencia o la ausencia de al menos uno de los siguientes
20 aminoacidos:
una cistema en la posicion 451 de la secuencia de aminoacidos correspondiente a la SEQ ID NO: 2 y una treonina en la posicion 467 de la secuencia de aminoacidos correspondiente a la SEQ ID NO: 2, en una muestra tomada del sujeto; y
ii) la correlacion de la presencia de cualquiera de los aminoacidos identificados en la etapa i) con la resistencia 25 del sujeto al regimen terapeutico que comprende cetuximab, o la correlacion de la ausencia de todos estos
aminoacidos en la etapa i) con la respuesta del sujeto al regimen terapeutico que comprende panitumumab.
Este metodo in vitro engloba la deteccion de si, en el exon 12 de la variante 1 del ARNm del gen EGFR humano que finalmente codifica la protema EGFR de la SEQ ID NO: 2, hay un cambio de nucleotidos que da lugar a un cambio 30 de un aminoacido con una cadena lateral que comprende un amino terminal (-NH2) en el gen natural por un aminoacido polar, cuya cadena lateral de carbohidrato comprende radicales con atomos del grupo del oxfgeno.
La puesta en practica del metodo in vitro de prediccion de la respuesta de un sujeto a un regimen terapeutico que comprende cetuximab y/o panitumumab, implica la ventaja de acomodar la terapia mas adecuada para el sujeto y 35 evita metodologfas erroneas o no lo suficientemente utiles terapeuticamente que producen una perdida de tiempo, lo que es un aspecto esencial para el sujeto y para el exito del tratamiento, especialmente si el sujeto esta afectado por cancer.
Ademas, la deteccion de cualquiera de estas mutaciones permite determinar si se ha desarrollado una resistencia 40 secundaria al tratamiento con cetuximab en el sujeto, no portando inicialmente dicho sujeto las mutaciones en el gen EGFR.
Por lo tanto, otro aspecto de la invencion es un metodo in vitro para la determinacion de la resistencia adquirida a un regimen terapeutico que comprende cetuximab, metodo que comprende:
45
i) la determinacion mediante un medio seleccionado entre el grupo que consiste en metodos de genotipado y/o metodos de secuenciacion de protemas, de la presencia o la ausencia de al menos uno de los siguientes aminoacidos:
una cistema en la posicion 451 de la secuencia de aminoacidos correspondiente a la SEQ ID NO: 2, una leucina 50 en la posicion 464 de la secuencia de aminoacidos correspondiente a la SEQ ID NO: 2, una arginina en la posicion 465 de la secuencia de aminoacidos correspondiente a la SEQ ID NO: 2 y una treonina en la posicion 467 de la secuencia de aminoacidos correspondiente a la SEQ ID NO: 2, en una muestra tomada del sujeto; y
ii) la correlacion de la presencia de cualquiera de los aminoacidos identificados en la etapa i) con la resistencia adquirida del sujeto al regimen terapeutico que comprende cetuximab, o la correlacion de la ausencia de todos
55 estos aminoacidos en la etapa i) con la respuesta del sujeto al regimen terapeutico que comprende panitumumab.
Este metodo in vitro para la determinacion de la resistencia adquirida en un sujeto despues de un tratamiento con cetuximab permite ventajosamente suspender el tratamiento y ademas evitar efectos adversos secundarios o 60 colaterales del cetuximab.
Ademas, pueden iniciarse otras metodologfas lo mas rapido posible.
Como antes, este metodo in vitro para la determinacion de la resistencia adquirida engloba la deteccion de si en el 65 exon 12 de la variante 1 del ARNm del gen EGFR humano que finalmente codifica la protema EGFR de la SEQ ID
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
NO: 2 hay un cambio de nucleotidos que da lugar a un cambio de un aminoacido con una cadena lateral que comprende un amino terminal (-NH2) en el gen natural por un aminoacido polar, cuya cadena lateral de carbohidrato comprende radicales con atomos del grupo del oxfgeno. Este metodo in vitro tambien engloba la deteccion de si al menos en el exon 12 de la variante 1 del ARNm del gen EGFR humano que finalmente codifica el fragmento de la protema EGFR de la SEQ ID NO: 12, hay un cambio de nucleotidos que da lugar a un cambio de aminoacidos naturales por aminoacidos voluminosos (es decir, aquellos con una cadena lateral que consiste en hidrocarburos C1- C4 ramificados o no ramificados, opcionalmente con un grupo amino terminal) y/o por aminoacidos polares o cargados. El aminoacido natural se refiere al aminoacido segun la secuencia consenso de aminoacidos de la protema EGFR humana (SEQ ID NO: 2).
Otro aspecto de la invencion es un metodo in vitro de identificacion, en una muestra tomada de un sujeto, de la presencia o la ausencia de una cistema en la posicion 451 de la secuencia de aminoacidos correspondiente a la SEQ ID NO: 2; y/o de la presencia o la ausencia de una leucina en la posicion 464 de la secuencia de aminoacidos correspondiente a la SEQ ID NO: 2; y/o de la presencia o la ausencia de una arginina en la posicion 465 de la secuencia de aminoacidos correspondiente a la SEQ ID NO: 2; y/o de la presencia o la ausencia de una treonina en la posicion 467 de la secuencia de aminoacidos correspondiente a la SEQ ID NO: 2, metodo que comprende la determinacion de la secuencia de la SEQ ID NO: 2, al menos desde la posicion 450 hasta la posicion 470.
Este ultimo aspecto tambien puede formularse como un metodo in vitro de identificacion, en una muestra tomada de un sujeto, de la presencia o la ausencia de una cistema en la posicion 451 de la secuencia de aminoacidos correspondiente a la SEQ ID NO: 2; y/o de la presencia o la ausencia de una leucina en la posicion 464 de la secuencia de aminoacidos correspondiente a la SEQ ID NO: 2; y/o de la presencia o la ausencia de una arginina en la posicion 465 de la secuencia de aminoacidos correspondiente a la SEQ ID NO: 2; y/o de la presencia o la ausencia de una treonina en la posicion 467 de la secuencia de aminoacidos correspondiente a la SEQ ID NO: 2, metodo que comprende la determinacion del aminoacido en las posiciones 451 y/o 464 y/o 465 y/o 467 mediante un medio seleccionado entre el grupo que consiste en metodos de genotipado y/o metodos de secuenciacion de protemas.
Breve descripcion de los dibujos
La FIG. 1 es la grafica de dos visualizaciones de los resultados de la secuenciacion obtenidos mediante una secuenciacion convencional de Sanger (grafica A) y una plataforma de secuenciacion de siguiente generacion (NGS) 454 GS Junior (Roche Applied Science, Mannheim, Alemania) (grafica B). Muestra la adquisicion de mutaciones en el ectodominio del EGFR despues del tratamiento con cetuximab en dos muestras. (A) En el paciente #31, la muestra tumoral posterior al tratamiento habfa adquirido una sustitucion A -> C en el nucleotido 1400 del gen EGFR que no estaba presente en una biopsia previa al tratamiento, causando una sustitucion de una lisina por una treonina en el aminoacido 467 (K467T). (B) En el paciente #35 se detecto una sustitucion C -> T en el nucleotido 1351 del gen EGFR en la muestra posterior al tratamiento, dando lugar a una sustitucion de una arginina por una cistema en el aminoacido 451 (R451C).
La FIG. 2 es el analisis mediante una citometna de flujo de la union de NIH3T3 tripsinizadas que sobreexpresan el EGFR natural (EGFR natural) y la K467T del EGFR mutante incubado con cetuximab (FIG. 2A) o con panitumumab (FIG. 2B) como anticuerpos primarios, y usando un anticuerpo secundario conjugado con ficoeritrina dirigido contra la IgG humana. C significa recuento; FL2H representa la intensidad maxima de la senal en el segundo canal de deteccion de fluorescencia con un paso de banda de 585 ± 21 que se usa para detectar la fluorescencia de la ficoeritrina (PE); E significa vacm.
La FIG. 3 es tambien un analisis de la union mediante citometna de flujo de NIH3T3 tripsinizadas que sobreexpresan el EGFR natural (EGFR natural) y la S464L del EGFR mutante incubado con cetuximab (FIG. 3a) o con panitumumab (FIG. 3B) como anticuerpos primarios, y usando un anticuerpo secundario conjugado con ficoeritrina dirigido contra la IgG humana. C significa recuento; FL2H representa la intensidad maxima de la senal en el segundo canal de deteccion de fluorescencia con un paso de banda de 585 ± 21 que se usa para detectar la fluorescencia de la ficoeritrina (PE); E significa vacm.
La FIG. 4 muestra un analisis mediante una citometna de flujo de la union de NIH3T3 tripsinizadas que sobreexpresan el EGFR natural (EGFR natural) y la G465R del EGFR mutante incubado con cetuximab (FIG. 4A) o con panitumumab (FIG. 4B) como anticuerpos primarios, y usando un anticuerpo secundario conjugado con ficoeritrina dirigido contra la IgG humana. C significa recuento; FL2H representa la intensidad maxima de la senal en el segundo canal de deteccion de fluorescencia con un paso de banda de 585 ± 21 que se usa para detectar la fluorescencia de la ficoeritrina (PE); E significa vacm.
Descripcion detallada de la invencion
En general, las siguientes palabras o frases tienen la definicion indicada cuando se usan en la descripcion, los ejemplos y las reivindicaciones.
El termino "regimen terapeutico" segun se usa en el estado de la tecnica y tambien en el presente documento, se refiere a cualquier terapia destinada a impedir, ralentizar, detener o revertir el crecimiento de una lesion precancerosa, de un cancer o de una metastasis cancerosa. Incluye la quimioterapia, la radioterapia, la inmunoterapia, la terapia con anticuerpos monoclonales u otros metodos.
5
Por "respuesta" debe entenderse cualquier tipo de mejora tanto clmica como no clinica seleccionada entre, pero no se limita a, una reduccion apreciable en el tamano del tumor o en las evidencias de enfermedad o de la progresion de la enfermedad, una enfermedad estable, un aumento o una prolongacion de la supervivencia sin progresion o de la reduccion en la toxicidad.
10
"Supervivencia sin progresion" indica la cantidad de tiempo durante y despues del tratamiento en la que el cancer no crece. La supervivencia sin progresion incluye la cantidad de tiempo en la que los pacientes han experimentado una respuesta completa o una respuesta parcial, asf como la cantidad de tiempo en la que los pacientes han experimentado una enfermedad estable.
15
"Una respuesta completa" a una terapia define a los pacientes con una enfermedad valorable pero no apreciable, cuyo tumor y cualquier signo de enfermedad ha desaparecido.
"Una respuesta parcial" a una terapia define a los pacientes con cualquier cosa menor que una respuesta completa.
20
"Un anticuerpo monoclonal anti-EGFR (AcMc anti-EGFR)" se refiere a un anticuerpo monoclonal y a un fragmento del mismo que son capaces de reconocer los epftopos de la secuencia proteica del EGFR. Los AcMc aprobados que reconocen diferentes epftopos del EGFR son cetuximab y panitumumab, pero podnan usarse otros AcMc en el regimen terapeutico para afrontar el cancer divulgado en la presente invencion. Algunos fragmentos de anticuerpos 25 adecuados incluyen F(ab), F(ab'), Fvy nanocuerpos, entre otros.
La expresion "metodos de genotipado" incluye todas aquellas metodologfas y procesos adecuados para la determinacion de genotipo o, lo que es lo mismo, para la identificacion del nucleotido en una posicion dada. Algunos ejemplos de dichas metodologfas engloban la secuenciacion de Sanger, la pirosecuenciacion, la PCR espedfica de 30 alelos, la cromatograffa ftquida desnaturalizante a alta presion (DHPLC), la extension de cebadores espedficos de alelos (ASPE), los biochips/micromatrices de ADN y la hibridacion dinamica espedfica de alelo (DASH).
Por "metodos de secuenciacion de protemas" debe entenderse cualquier tecnica que permita la determinacion de la secuencia de aminoacidos de una protema, asf como la conformacion que adopta la protema y la magnitud en la que 35 esta complejada con cualquier molecula no peptfdica. La determinacion de la composicion de aminoacidos puede llevarse a cabo mediante una hidrolisis o la separacion de los aminoacidos. Algunas tecnologfas conocidas incluyen la secuenciacion de Sanger, la degradacion de Edman y la espectrometna de masas.
Si no se indica lo contrario, todas las secuencias relativas al gen EGFR, la variante del ARNm y la protema EGFR se 40 refieren a las humanas, estando los numeros de registro de la base de tratos recogidos a lo largo de la descripcion. Tambien, si no se indica lo contrario, las secuencias de oligonucleotidos se muestran en la direccion 5'-3' y las secuencias peptfdicas se muestran partiendo del aminoacido N terminal ((conocido tambien como el amino terminal, el NH2 terminal, el extremo N terminal y el amino terminal) del peptido, segun la convencion para la escritura de secuencias peptfdicas.
45
Todas las secuencias de aminoacidos, asf como las de oligonucleotidos, pueden ser sintetizadas siguiendo la apropiada smtesis qmmica de peptidos o de oligonucleotidos. Algunos ejemplos de smtesis peptfdica incluyen smtesis en fase solida y smtesis en fase liquida, acoplando ambos procesos el grupo carboxilo o C terminal de un aminoacido al grupo amino o N terminal de otro. Las reacciones no deseadas se evitan en la smtesis en fase solida 50 usando grupos protectores, tales como 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) y terc-butiloxicarbonilo (t-Boc). Alternativamente, los peptidos pueden obtenerse mediante tecnologfas de ADN recombinante. Los oligonucleotidos pueden obtenerse mediante una smtesis en fase solida usando el metodo del fosforamidito y bloques de construccion de fosforamidito derivados de 2'-desoxinucleosidos protegidos (dA, dC, dG y T), de ribonucleosidos (A, C, G y U) o de nucleosidos modificados qmmicamente. Los oligonucleotidos tambien pueden derivar de la digestion 55 del aDn con las enzimas de restriccion apropiadas.
Como ya se ha explicado anteriormente, las ensenanzas de la tecnica anterior muestran que las mutaciones en el dominio III del EGFR pueden ayudar a localizar puntos crfticos para la interaccion de los AcMc (cetuximab y/o panitumumab). No obstante, estos datos pueden servir para detectar epftopos espedficos, pero no son concluyentes 60 en terminos de resistencia al tratamiento, dado que unicamente unos intercambios de aminoacidos espedficos engloban esta informacion (la de la resistencia, tanto la resistencia primaria como la secundaria). Particularmente, la resistencia adquirida al tratamiento es de gran importancia con objeto de modificar las metodologfas terapeuticas y evitar la perdida de tiempo y de esfuerzo.
65 La presente invencion esta basada en nuevas mutaciones en la region codificante del gen EGFR. Las nuevas
mutaciones de la presente invencion son utiles para predecir la respuesta a la terapia basada en AcMc de un paciente con CCRm. En particular, son utiles para predecir la resistencia primaria y la aparicion de una resistencia secundaria.
5 Como ya se ha indicado anteriormente, cada uno de los cambios de nucleotido divulgados da lugar a la sustitucion por una cistema en la posicion 451 de la SEQ ID NO: 2 (protema humana del EGFR), por una leucina en la posicion 464 de la SEQ ID NO: 2, por una arginina en la posicion 465 de la SEQ ID NO: 2 y por una treonina en la posicion 467 de la SEQ ID NO: 2. Todas estas mutaciones en particular estan localizadas en un fragmento entre el aminoacido 450 y el aminoacido 470 de esta SEQ ID NO: 2, denominandose dicho fragmento en el presente 10 documento, la SEQ ID NO: 12.
El peptido segun la invencion, con una longitud de entre 17 y 100 aminoacidos y que comprende la secuencia SEQ ID NO: 1 incluye cualquiera de las mutaciones R451C o K467t.
15 En una realizacion en particular, este peptido se selecciona entre el grupo que consiste en: una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 1 en la que X1 es R y X2 es T; una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 1 en la que X1 es C y X2 es T; y una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 1 en la que X1 es C y X2 es K.
En una realizacion mas en particular, el peptido consiste en la SEQ ID NO: 1 y, mas particularmente en la SEQ ID 20 NO: 1 seleccionado entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 en la que X1 es R y X2 es T; la SEQ ID NO: 1 en la que X1 es C y X2 es T; y la SEQ ID NO: 1 en la que X1 es C y X2 es K. Estas secuencias estan representadas por la SEQ ID NO: 8 (RSLKEISDGDVIISGNT), la SEQ ID NO: 9 (CSLKEISDGDVIISGNT) y la SEQ ID NO: 10 (CSLKEISDGDVIISGNK).
25 En una realizacion en particular, el peptido con una longitud de entre 17 y 100 aminoacidos y que comprende la secuencia SEQ ID NO: 1, comprende adicionalmente la SEQ ID NO: 4
en la que
30 X3 se selecciona entre S y R.
NLCYANTINWKKLFGTSGGKTKIIX3,
El peptido que comprende tanto la SEQ ID NO: 1 como la SEQ ID NO: 4 se corresponde, en una realizacion en particular, con una secuencia continua de aminoacidos partiendo de la SEQ ID NO: 1. Esta secuencia tiene 42 aminoacidos y se corresponde con un fragmento de la protema EGFR codificada parcialmente por el exon 12 del 35 gen EGFR. Esta representada por, o consiste en, la SEQ ID NO: 5
(X1SLKEISDGDVIISGNX2NLCYANTINWKKLFGTSGGKTKIIX3)
En otra realizacion en particular, el peptido con una longitud de entre 17 y 100 aminoacidos y que comprende la secuencia SEQ ID NO: 13, comprende adicionalmente la SEQ ID NO: 4. Este peptido que comprende tanto la SEQ 40 ID NO: 13 como la SEQ ID NO: 4 se corresponde, en una realizacion en particular, con una secuencia continua de aminoacidos partiendo de la SEQ ID NO: 13. Tiene 42 aminoacidos y se corresponde con un fragmento de la protema EGFR codificado parcialmente por el exon 12 del gen EGFR. Esta representado por, o consiste en, la SEQ ID NO: 14(X1SLKEISDGDVIIX4X5NX2NLCYANTINWKKLFGTSGGKTKIIX3)
45 De hecho, esta SEQ ID NO: 5 incluye cualquiera o todas las mutaciones R451C y K467T, y adicionalmente engloba la opcion de incluir la mutacion S492R. Por lo tanto, X1, X2 y X3 tienen los mismos significados a los indicados anteriormente; y si X1 es C, entonces X2 se selecciona independientemente entre K y T, y si X1 es R, entonces X2 es T.
50 La mutacion S492R fue divulgada por primera vez por los inventores Montagut et al., (supra) como una mutacion clave para la determinacion tambien de la resistencia a los AcMc en canceres, incluyendo el cancer colorrectal metastasico.
Ademas, la SEQ ID NO: 14 incluye cualquiera o todas las mutaciones R451C, S464L, G465R y K467T, y 55 adicionalmente engloba la opcion de incluir la mutacion S492R. Por lo tanto, X1, X2, X3, X4 y X5 tienen los mismos significados a los indicados anteriormente, pero al menos uno de X1, X2, X4 o X5 es, respectivamente, C, L, R o T.
En otra realizacion en particular, la secuencia peptfdica que comprende la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 13 tiene una longitud de entre 17 y 50 aminoacidos. En otra realizacion en particular, tiene una longitud de entre 17 y 25 60 aminoacidos (esto es 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25). En otra realizacion aun mas en particular, la secuencia peptfdica tiene una longitud de 17 aminoacidos. En otra realizacion en particular tiene una longitud de 21 aminoacidos, estando cualquiera de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 13 flanqueada en el extremo N terminal por una leucina (L) y en el extremo C terminal por el tripeptido N-Asparagina-Leucina-Cistema-C (abreviado como NLC)
65 Ademas, y como se representara en los siguientes ejemplos, los inventores tambien han detectado una nueva
mutacion que da lugar a una resistencia a los AcMc en canceres, incluyendo el cancer colorrectal metastasico, a saber, un cambio de una isoleucina por una metionina en la posicion 491 de la SEQ ID NO: 2 (la protema humana EGFR). Esta mutacion se denomina en el presente documento I491M. El cambio de aminoacido I491M es el resultado del cambio de nucleotidos A^-G en el nucleotido 1473 (conocido tambien en el presente documento como 5 A1473G) de la variante 1 del ARNm del gen EGFR (el codon ATA es cambiado por ATG)
Las nuevas mutaciones identificadas en la presente invencion son alternativas, pero tambien pueden usarse en combinacion para asegurar una apropiada seleccion de la terapia.
10 La invencion engloba oligonucleotidos que codifican la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 13. En la realizacion en particular de un oligonucleotido que codifica la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 13, opcionalmente junto con cualquier realizacion anterior o posterior, dicho oligonucleotido codifica adicionalmente la SEQ ID NO: 4, y por lo tanto en otra realizacion en particular, el oligonucleotido codifica la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 14. Algunos oligonucleotidos en particular son aquellos que consisten en las secuencias de nucleotidos que codifican cualquiera de las 15 secuencias SEQ ID NO: 8 hasta 10. Estos oligonucleotidos, como se ha expuesto anteriormente, pueden usarse como sondas de hibridacion para la deteccion de las mutaciones.
El kit segun la invencion comprende, ademas del conjunto de cebadores divulgado anteriormente, sondas oligonucleotfdicas para la deteccion de las formas naturales o mutadas del gen EGFR que codifica cualquiera de las 20 mutaciones R451C y K467T. Algunos ejemplos de estas sondas para la deteccion de las formas mutadas del gen EGFR consisten en oligonucleotidos seleccionados entre aquellos que codifican cualquiera de las SEQ ID NO: 1,5, 8, 9 y 10.
Las sondas consistentes en los oligonucleotidos seleccionados entre aquellos que codifican cualquiera de las SEQ 25 ID NO: 1, 5, 8, 9 y 10 son secuencias de nucleotidos que comprenden las diversas opciones de la degeneracion de los codones en los correspondientes puntos de mutacion.
Algunas sondas en particular para la deteccion de la mutacion R451C son aquellas complementarias de la region mutada del EGFR en la que se localizan los cambios en los nucleotidos que dan como resultado la mutacion R451C 30 de la presente invencion, siendo tanto la region codificante como la complementaria del gen. Por lo tanto, hibridan con un fragmento de la secuencia de nucleotidos portador de la mutacion, y permiten la deteccion del cambio de nucleotido C^T en la posicion 1351, divulgado anteriormente.
Algunas sondas en particular para la deteccion de la mutacion K467T son aquellas complementarias de la region 35 mutada del EGFR en la que se localizan los cambios en los nucleotidos que dan como resultado la mutacion K467T de la presente invencion, siendo tanto la region codificante como la complementaria del gen. Por lo tanto, hibridan con un fragmento de la secuencia de nucleotidos portador de la mutacion, y permiten la deteccion del cambio de nucleotido A^C en la posicion 1400, divulgado anteriormente.
40 Otras sondas oligonucleotidicas en particular del kit son para la deteccion de las formas naturales o mutadas del gen EGFR que codifica cualquiera de las mutaciones S464L y G465R.
Algunas sondas en particular para la deteccion de la mutacion S464L son aquellas complementarias de la region mutada del EGFR en la que se localizan los cambios en los nucleotidos que dan como resultado la mutacion S464L 45 de la presente invencion, siendo tanto la region codificante como la complementaria del gen. Por lo tanto, hibridan con un fragmento de la secuencia de nucleotidos portador de la mutacion, y permiten la deteccion del cambio de nucleotido C^T en la posicion 1391, divulgado anteriormente.
Otras sondas en particular para la deteccion de la mutacion G465R son aquellas complementarias de la region 50 mutada del EGFR en la que se localizan los cambios en los nucleotidos que dan como resultado la mutacion G465R de la presente invencion, siendo tanto la region codificante como la complementaria del gen. Por lo tanto, hibridan con un fragmento de la secuencia de nucleotidos portador de la mutacion, y permiten la deteccion del cambio de nucleotido G^A en la posicion 1393, divulgado anteriormente.
55 Por "secuencia de nucleotidos portadora de la mutacion" debe entenderse cualquiera de las cadenas de ADN codificantes o complementarias de la estructura genomica del ADN, asf como una cadena de ARNm que va a ser traducida.
Los kits de la invencion pueden comprender, ademas, opcionalmente junto con cualquier realizacion anterior o 60 posterior, reactivos adicionales para la deteccion de mutaciones en los genes KRAS y/o PIK3CA y/o BRAF y/o mutaciones adicionales en el gen EGFR. Estos reactivos incluyen cebadores espedficos para la deteccion de mutaciones en particular en todos estos genes, y particularmente las mutaciones asociadas con la resistencia a un regimen terapeutico que comprende cetuximab y/o panitumumab.
65 Otros reactivos incluidos en el kit estan relacionados con las sondas oligonucleotidicas que pueden hibridar con las
formas tanto naturales como mutadas de todos esos genes.
Por lo tanto, en una realizacion en particular, opcionalmente junto con cualquiera de las realizaciones anteriores o posteriores, el kit comprende herramientas y medios (reactivos) para detectar las mutaciones en KRAS 5 seleccionadas entre el grupo que consiste en G12A; G12C; G12D; G12R; G12S; G12V; G13A; G13C, G13D; G13V segun se define en Karapetis et al., "K-ras Mutations and Benefit from Cetuximab in Advanced Colorectal Cancer", The New England Journal of Medicine - 2008, Vol. 359, pags.: 1757-1765. Todas estas mutaciones estan ubicadas en los codones 12 y 13 de la secuencia de la protema K-ras identificada con el numero de registro del GenBank NP_004976.2 del 24.07.2011 (denominado precursor de la isoforma b del KRas de la GTPasa) y NP_203524.1 del 10 24.07.2011 (denominado precursor de la isoforma a del KRas de la GTPasa). En otra realizacion preferida, el kit comprende reactivos para la deteccion de mutaciones en los exones 9 y 20 del gen PIK3CA que codifica la protema PIK3CA con el numero de registro del GenBank NP_006209.2 del 17.07.2011; y/o la mutacion V600E ubicada en el codon 600 de la secuencia de protemas del BRAF identificada con el numero de registro del GenBank NP_004324.2 del 24.07.2011. En otra realizacion, preferida el kit comprende medios (reactivos) para la deteccion de la mutacion 15 S492R en la protema EGFR de la SEQ ID NO: 2. En otra realizacion preferida, el kit comprende medios (reactivos) para la deteccion de la mutacion I491M en la protema EGFR de la SeQ ID NO: 2.
Los kits de la invencion son para su uso, en particular, en la prediccion de la respuesta de un sujeto a un regimen terapeutico que comprende anticuerpos monoclonales anti-EGFR, en particular cetuximab y/o panitumumab. Mas 20 particularmente, el sujeto esta afectado por cancer, y el cancer es cancer colorrectal metastatico.
La invencion se refiere, segun un aspecto de la invencion, a un metodo in vitro para la prediccion de la respuesta de un sujeto a un regimen terapeutico que comprende cetuximab y/o panitumumab, en el que el metodo comprende:
25 (i) la determinacion en una muestra tomada del sujeto y mediante un medio seleccionado entre el grupo que
consiste en metodos de genotipado y/o metodos de secuenciacion de protemas, de si hay mutaciones presentes o ausentes en un fragmento definido por la SEQ ID NO: 12, que es un fragmento entre el aminoacido 450 y el aminoacido 470 de la secuencia de aminoacidos natural consenso del EGFR humano de la SEQ ID NO: 2; y ii) la correlacion de la presencia de cualquier mutacion identificada en la etapa i) con la resistencia del sujeto al 30 regimen terapeutico que comprende cetuximab, o la correlacion de la ausencia de mutaciones en la etapa i) con la respuesta del sujeto al regimen terapeutico que comprende panitumumab.
En una realizacion en particular del metodo in vitro, en la etapa (i) se determina si en la SEQ ID NO: 12 estan presentes o ausentes al menos una de las siguientes mutaciones: un cambio de una arginina por una cistema en la 35 correspondiente posicion 451 de la SEQ ID NO:2; una serina por una leucina en la correspondiente posicion 464 de la SEQ ID NO: 2; una glicina por una arginina en la correspondiente posicion 465 de la SEQ ID NO: 2; y una lisina por una treonina en la correspondiente posicion 467 de la SEQ ID NO: 2.
En otra realizacion en particular, el metodo in vitro para la prediccion de la respuesta de un sujeto a un regimen 40 terapeutico que comprende cetuximab y/o panitumumab comprende:
i) la determinacion mediante un medio seleccionado entre el grupo que consiste en metodos de genotipado y/o metodos de secuenciacion de protemas, de la presencia o la ausencia de al menos uno de los siguientes aminoacidos:
45 una cistema en la posicion 451 de la secuencia de aminoacidos correspondiente a la SEQ ID NO: 2 y una treonina en la posicion 467 de la secuencia de aminoacidos correspondiente a la SEQ ID NO: 2, en una muestra tomada del sujeto; y ii) la correlacion de la presencia de cualquiera de los aminoacidos identificados en la etapa i) con la resistencia del sujeto al regimen terapeutico que comprende cetuximab, o la correlacion de la ausencia de todos estos aminoacidos de la etapa i) con la respuesta del sujeto al regimen terapeutico que comprende 50 panitumumab.
Esta realizacion en particular engloba la determinacion de si la SEQ ID NO: 1 esta presente en la muestra del sujeto y la correlacion ademas en la etapa ii) de la presencia de cualquiera de las mutaciones R451C y/o K467T con la resistencia del sujeto al regimen terapeutico que comprende cetuximab, o la correlacion de la ausencia de todos 55 estos aminoacidos de la etapa i) con la respuesta del sujeto al regimen terapeutico que comprende panitumumab.
En una realizacion mas en particular del metodo, opcionalmente junto con cualquiera de las realizaciones anteriores o posteriores, la etapa i) engloba la determinacion de si la SEQ ID NO: 4 esta adicionalmente presente en la muestra del sujeto. Por lo tanto, despues de determinar si esta presente cualquiera de las mutaciones R451C y/o S464L y/o 60 G465R y/o K467T, el metodo incluye tambien la determinacion de si esta presente la mutacion S492R en la protema EGFR.
La deteccion de la mutacion S492R se refiere a la realizacion en particular del metodo in vitro, opcionalmente junto con cualquiera de las realizaciones anteriores o posteriores, en las que la etapa i) comprende adicionalmente la 65 determinacion de la presencia o la ausencia de una arginina en la posicion 492 de la secuencia de aminoacidos
correspondiente a la SEQ ID NO: 2 y en la que en la etapa ii) la presencia adicional de la arginina identificada en la etapa i) se correlaciona con la resistencia del sujeto al regimen terapeutico que comprende cetuximab.
En otra realizacion en particular, opcionalmente junto con cualquiera de las realizaciones anteriores o posteriores, el 5 metodo in vitro para la prediccion de la respuesta de un sujeto a un regimen terapeutico que comprende cetuximab y/o panitumumab, comprende adicionalmente la determinacion en la etapa (i) de la presencia o la ausencia de una metionina en la posicion 491 de la secuencia de aminoacidos correspondiente a la SEQ ID NO: 2 y en la que en la etapa ii) la presencia adicional de la metionina identificada en la etapa i) se correlaciona con la resistencia del sujeto al regimen terapeutico que comprende cetuximab.
10
En otra realizacion en particular, opcionalmente junto con cualquiera de las realizaciones anteriores o posteriores, la etapa i) se lleva a cabo con un conjunto de cebadores que consiste en las SEQ ID NO: 6 y 7.
Ademas de la amplificacion con los anteriormente mencionados cebadores, en una realizacion en particular, la etapa 15 i) se lleva a cabo mediante metodos de genotipado. En otra realizacion mas en particular, opcionalmente junto con cualquier realizacion anterior o posterior, dicho metodo de genotipado se selecciona entre secuenciacion de Sanger, pirosecuenciacion, PCR digital de gotita (ddPCR), PCR espedfica de alelos, cromatograffa lfquida desnaturalizante a alta presion (DHPLC), extension de cebadores espedficos de alelos (ASPE), biochips/micromatrices de ADN e hibridacion dinamica espedfica de alelo (DASH). En otra realizacion mas en particular, el metodo de genotipado es 20 la pirosecuenciacion.
Algunos ejemplos de metodos de genotipado por pirosecuenciacion incluyen, entre otros, los metodos de secuenciacion de siguiente generacion (NGS) conocidos como pirosecuenciacion 454 de alto rendimiento, la secuenciacion mediante smtesis (Illumina) y la secuenciacion de terminacion de la cadena (secuenciacion de 25 Sanger).
Alternativamente, la etapa i) incluye sondas espedficas para la deteccion de mutaciones naturales o puntuales como metodo de genotipado de las regiones amplificadas. Algunas sondas en particular son aquellos oligonucleotidos que codifican la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 5, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 9 y la SEQ ID NO: 10. Todos estos 30 oligonucleotidos son complementarios de las secuencias de nucleotidos de los genes EGFR mutados.
El metodo in vitro para la prediccion de la respuesta de un sujeto a un regimen terapeutico que comprende cetuximab y/o panitumumab, se lleva a cabo en una muestra que comprende el tumor, en la que pueden detectarse los cambios de nucleotidos en el gen EGFR de la presente invencion. En los casos de CCRm, la muestra puede 35 usarse directamente segun se obtiene de la fuente, o despues de un pretratamiento de la muestra. La muestra puede comprender adicionalmente tejido normal adyacente a dicho tumor. Consecuentemente, en el caso de un CCRm, la muestra se selecciona entre una biopsia de un cancer colorrectal primario o una biopsia de una metastasis del mismo. En otras palabras, la muestra puede ser una biopsia de unas muestras de cancer colorrectal, incluyendo tumores primarios y metastasis. En una realizacion preferida, la metastasis esta en el tejido hepatico.
40
Es probable que los pacientes que comprendan cualquiera de las recien identificadas mutaciones muestren una respuesta a un regimen terapeutico que no comprende cetuximab, segun se mide mediante cualquier aumento o prolongacion clmica o subclmica adecuada en la supervivencia sin progresion.
45 En una realizacion preferida, el regimen terapeutico es cetuximab solo o junto con un regimen quimioterapeutico basado en irinotecan, oxaliplatino y/o 5-fluorouracilo (5-FU o 5FU). En una realizacion preferida, el regimen terapeutico es panitumumab solo o junto con un regimen quimioterapeutico basado en irinotecan, oxaliplatino y/o 5- fluorouracilo.
50 La invencion proporciona adicionalmente tambien metodos para decidir y/o recomendar un regimen terapeutico para sujetos afectados por cancer, preferentemente por CCRm, que comprenden: i) la determinacion mediante un medio seleccionado entre el grupo que consiste en metodos de genotipado y/o metodos de secuenciacion de protemas, de la presencia o la ausencia de al menos uno de los siguientes aminoacidos:
una cistema en la posicion 451 de la secuencia de aminoacidos correspondiente a la SEQ ID NO: 2 y una treonina 55 en la posicion 467 de la secuencia de aminoacidos correspondiente a la SEQ ID NO: 2, en una muestra tomada del sujeto; y ii) recomendar la administracion a dicho sujeto de una cantidad eficaz de cetuximab, o de una composicion del mismo, si todas las mutaciones estan ausentes, o de panitumumab, o de una composicion del mismo, si hay presente al menos una de las mutaciones.
60 La invencion engloba tambien un metodo in vitro para la determinacion de la resistencia adquirida a un regimen terapeutico que comprende cetuximab, metodo que comprende, en una realizacion en particular de este aspecto:
i) la determinacion mediante un medio seleccionado entre el grupo que consiste en metodos de genotipado y/o metodos de secuenciacion de protemas, de la presencia o la ausencia de al menos uno de los siguientes 65 aminoacidos:
una cistema en la posicion 451 de la secuencia de aminoacidos correspondiente a la SEQ ID NO: 2 y una treonina en la posicion 467 de la secuencia de aminoacidos correspondiente a la SEQ ID NO: 2, en una muestra tomada del sujeto; y
ii) la correlacion de la presencia de cualquiera de los aminoacidos identificados en la etapa i) con la resistencia 5 adquirida del sujeto al regimen terapeutico que comprende cetuximab, o la correlacion de la ausencia de todos estos aminoacidos en la etapa i) con la respuesta del sujeto al regimen terapeutico que comprende panitumumab.
Como se ha expuesto anteriormente, la invencion proporciona tambien un metodo in vitro de identificacion, en una 10 muestra tomada de un sujeto, de la presencia o la ausencia de una cistema en la posicion 451 de la secuencia de aminoacidos correspondiente a la sEq ID NO: 2; y/o de la presencia o la ausencia de una treonina en la posicion 467 de la secuencia de aminoacidos correspondiente a la SEQ ID NO: 2 mediante un medio seleccionado entre el grupo que consiste en metodos de genotipado y/o metodos de secuenciacion de protemas. En una realizacion preferida, el metodo in vitro de identificacion de la presencia o la ausencia de una o ambas mutaciones en la SEQ ID 15 NO: 2 comprende adicionalmente la identificacion de la presencia o la ausencia de una arginina en la posicion 492 de la SEQ ID NO: 2 mediante un medio seleccionado entre el grupo que consiste en metodos de genotipado y/o metodos de secuenciacion de protemas.
En una realizacion en particular, opcionalmente junto con cualquier realizacion anterior o posterior, el metodo de 20 identificacion de la presencia o la ausencia de una cistema en la posicion 451 de la secuencia de aminoacidos correspondiente a la SEQ ID NO: 2; y/o de la presencia o la ausencia de una leucina en la posicion 464 de la secuencia de aminoacidos correspondiente a la SEQ ID NO: 2; y/o de la presencia o la ausencia de una arginina en la posicion 465 de la secuencia de aminoacidos correspondiente a la SEQ ID NO: 2; y/o de la presencia o la ausencia de una treonina en la posicion 467 de la secuencia de aminoacidos correspondiente a la SEQ ID NO: 2, se 25 lleva a cabo mediante la determinacion de la secuencia de la SEQ ID NO: 2 hasta la posicion 467 mediante un medio seleccionado entre el grupo que consiste en metodos de genotipado y/o metodos de secuenciacion de protemas. En una realizacion preferida, el metodo se lleva a cabo mediante la determinacion de la secuencia de la SEQ ID NO: 2 desde la posicion 450 hasta la 470 (SEQ ID NO: 12) y mas preferentemente desde la 451 hasta la posicion 467. Por "la determinacion de una secuencia hasta una posicion" debe entenderse que la secuenciacion se 30 lleva a cabo desde un oligonucleotido o aminoacido desde la posicion 1 de dicha secuencia hasta la posicion (nucleotido o aminoacido) de interes (en este caso en particular, hasta el aminoacido 467 o hasta el nucleotido que da lugar a este aminoacido).
A lo largo de la descripcion y de las reivindicaciones, la palabra "comprende" y las variaciones de la palabra no 35 pretenden excluir otras caractensticas tecnicas, aditivos, componentes o etapas. Adicionalmente, la palabra "comprende" engloba el caso de "que consiste en". Otros objetos, ventajas y caractensticas adicionales de la invencion seran evidentes para los expertos en la materia tras el analisis de la descripcion, o pueden ser aprendidos mediante la practica de la invencion. Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustracion y no pretenden ser limitantes de la presente invencion. Adicionalmente, la presente invencion cubre todas las posibles 40 combinaciones de las realizaciones particulares y preferidas descritas en el presente documento.
Ejemplos
Ejemplo 1. Muestras de tumores y pacientes
45
Se llevo a cabo una metodologfa de prueba preliminar para estudiar y caracterizar la presencia de las mutaciones heterogeneas que aparecen despues de una terapia basada en cetuximab en la practica clinica habitual. Todos los pacientes con CCRm que consintieron, tratados con AcMc anti-EGFR en la institucion Parc de Salut Mar Biobank (MARBiobanc, Barcelona, Espana) Hospital del Mar entre enero de 2010 y junio de 2013, fueron incluidos en este 50 estudio. En 34 pacientes, las muestras fueron recogidas prospectivamente para este estudio, y en 3 pacientes se analizaron biopsias secuenciales tomadas en el pasado en el contexto de su gestion clmica rutinaria. En el analisis solo se incluyeron los pacientes que teman una buena calidad en las biopsias previas y posteriores al tratamiento y que habfan tenido una resistencia adquirida a la terapia basada en anti-EGFR, definida como la progresion de la enfermedad despues de a) una respuesta completa o una respuesta parcial o b) una enfermedad estable durante 55 mas de 16 semanas (7-9). La respuesta fue evaluada segun los criterios de evaluacion de la respuesta en tumores solidos (RECIST) (Eisenhauer et al., "New response evaluation criteria in solid tumours: revised RECIST guideline (version 1.1)", Eur J Cancer 2009, Vol. 45 (2): 228-247). Se uso la biopsia tumoral obtenida durante el procedimiento habitual de diagnostico como la muestra previa al tratamiento (inicial). En la mayona de los casos, esta muestra se obtuvo a partir del tumor primario durante una colonoscopia rutinaria. Una segunda biopsia inicial de un sitio 60 metastasico no es de rutina, y no se realizo salvo que fuera necesaria para el diagnostico patologico. El estudio incluia una nueva biopsia despues del fracaso del tratamiento en los pacientes que consintieron este procedimiento adicional. Las nuevas biopsias en el momento de la progresion se obtuvieron a partir de la lesion mas accesible con menos riesgo potencial de complicaciones relacionadas para el paciente, segun las consideraciones eticas. Se recogieron muestras de suero antes de comenzar la terapia basada en cetuximab y en el momento de la progresion. 65 Cuando se detecto una mutacion en la muestra de biopsia posterior al tratamiento, la muestra de suero de ese
paciente fue analizada para evaluar esa mutacion espedfica. En este estudio se incluyeron nueve casos (los pacientes #21 hasta #28 y el paciente #36) que habian sido evaluados previamente para las mutaciones EGFR S492R, exon 2 del KRAS, BRAF V600E y PIK3CA mediante una secuenciacion directa y que en el trabajo actual fueron analizados para evaluar las mutaciones indicadas anteriormente (R451C y K467T) usando una secuenciacion 5 profunda. Las muestras biologicas se obtuvieron en el Parc de Salut Mar Biobank (MARBiobanc). Este estudio fue aprobado por el comite de etica local (CEIC-2012/4741/I). Todos los pacientes participates firmaron el consentimiento informado por escrito.
Para la secuenciacion de KRAS, BRAF, NRAS, PIK3CA y EGFR, se llevo a cabo una extraction del ADN a partir de 10 muestras tumorales como se ha descrito anteriormente en Diaz et al. "The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers", Nature-2012, Vol n° 486, pags.: 537-40. El analisis de las mutaciones del KRAS (exones 2, 3 y 4), del BRAF (exon 15), del NRAS (exones 2 y 3), del PIK3CA (exones 9 y 20) y del EGFR (exon 12, 13) se llevo a cabo mediante una secuenciacion de Sanger usando BigDye v3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante, y se analizo con un analizador genetico 15 3500Dx (Applied Biosystems). Todos los casos fueron cribados tambien mediante una pirosecuenciacion usando una plataforma de secuenciacion de siguiente generation (NGS) 454 GS Junior (Roche Applied Science, Mannheim, Alemania). Ademas, las lecturas procesadas y con filtro de calidad fueron analizadas mediante el uso del soporte logico GS Amplicon Variant Analyzer version 2.5p1 (Roche). Las mutaciones detectadas con la NGS fueron confirmadas mediante una PCR competitiva espetifica de alelos TaqMan® (CAST-PCR, Applied Biosystems) 20 cuando estaban disponibles los ensayos espetificos.
Los cebadores para las secuencias del EGFR eran los divulgados anteriormente y estaban definidos por el conjunto de cebadores consistente en las SEQ ID NO: 6 y 7. El par de la SEQ ID NO: 6 y la SEQ ID NO: 7 sirvio para la amplification de la totalidad del exon 12 que podria contener las mutaciones R451C y K467T y algunas regiones 25 flanqueantes del intron. Esta secuencia esta representada por la SEQ ID NO: 11:
caaagttttcaqqqatacattqtttttatattttca cca catg atttttcttctctccaatgtagT GGT CAGTTT T CT CTT GCAGTCGT CAGCCT G AACATAACATCCTTGG G ATT ACGCT CCCT CAAGGAGAT AAGT GAT G GAG AT GT GATAATTTCAGGAAACAAAAATTT GT GCT AT GCAAAT ACAATAAACTGGAAAAAACT GTTT GGGACCTCCGGT CAG AAAACCAAAATTATAAGCAACAGAGGTGAAAACAGCTGCAgtaagtcaccgcttt ctqtttaqtttatqqaqttqqttctaatqqqtcctttatttqtatttaqaatattqaaqqqctattcccatttaa;
en la que los nucleotidos subrayados se corresponden con las secuencias identicas (para la SEQ ID NO: 6) o 30 complementarias (para la SEQ ID NO: 7) de los cebadores del conjunto, las letras mayusculas se refieren al exon 12 y las minusculas son fragmentos del intron.
La amplificacion se llevo a cabo en las siguientes condiciones: 95 °C durante 10 minutos; 40 ciclos a 95 °C, 1 minuto, a 60 °C, 1’ 30" y a 72 °C, 1 minuto; y una extension final de 10 minutos a 72 °C.
35
Ademas, se llevo a cabo una hibridacion fluorescente in situ (FISH). La FISH se llevo a cabo siempre que hubiera material restante suficiente despues del analisis de las mutaciones. La amplificacion del EGFR fue evaluada mediante una hibridacion fluorescente in situ (FISH) usando la sonda LSI EGFR/CEP7 (Abbott Molecular Inc., DesPlaines, IL), como se ha descrito previamente (por ejemplo, en documentos tales como Salido et al., "Increased 40 ALK gene copy number and amplification are frequent in non-small cell lung cancer", J Thorac Oncol - 2011, Vol. n° 6, pags.: 21-7). La amplificacion del KRAS se analizo usando un ensayo de FISH de dos colores con una sonda KRAS/CEP12 (Abnova). Se puntuaron las muestras con una proportion KRAS/CEP12 mayor de 3, en al menos el 10 % de los 50 nucleos analizados. Cuando el numero medio del cromosoma 12 excedia 2,5 o 4 por celula, el caso se consideraba polisomico o muy polisomico, respectivamente.
45
Ejemplo 2. Presencia de las mutaciones R451C y K467T en el EGFR y resistencia adquirida al cetuximab
Segun se representa en la FIG 1, que es una grafica de dos visualizaciones diferentes de una plataforma de secuenciacion de la siguiente generacion (NGS) 454 GS Junior (Roche Applied Science, Mannheim, Alemania), 50 muestra que algunos pacientes adquirieron mutaciones en el ectodominio del EGFR despues del tratamiento con cetuximab. La FIG. 1 (A) muestra un paciente #31, en el que la muestra de tumor posterior al tratamiento habia adquirido una sustitucion A -> C en el nucleotido 1400 del gen EGFR que no estaba presente en la biopsia previa al tratamiento, causando una sustitucion de una lisina por una treonina en el aminoacido 467 (K467T). La sustitucion es detectada mediante el metodo de genotipado y visualizada (flecha) mediante un medio de doble pico (banda o 55 curva) en esta position. El pico inferior se corresponde con el nucleotido C.
Por otro lado, en la FIG. 1 (B) se muestra la visualization del proceso de secuenciacion (la lectura menos la referencia) del paciente #35, en el que se detecto una sustitucion C -> T en el nucleotido 1351 del gen EGFR en la
15
muestra posterior al tratamiento, dando lugar a la sustitucion de una arginina por una cistema en el aminoacido 451 (R451C). La sustitucion tambien esta marcada por una flecha, y en este caso el cambio es visualizado por un valor negativo.
5 Ejemplo 3. Las mutaciones en la SEQ ID NO: 12 (fragmento desde el aminoacido 450 hasta el aminoacido 470 de la SEQ ID NO: 2) implican una resistencia al tratamiento con cetuximab.
3A: mutaciones en el ectodominio del EGFR y resistencia adquirida al cetuximab en modelos de celulas CCR
10 Previamente se ha^a notificado que la adquisicion de resistencia en celulas de CCR estaba asociada con la aparicion de una mutacion activante de KRAS, BRAF y NRAS. Para descubrir mecanismos de resistencia adicionales al bloqueo del EGFR se explotaron 5 lmeas celulares de CCR (DiFi, LIM1215, HCA-46, NCIH508, OXCO-2 y CCK81), que son muy sensibles al cetuximab. Todas estas lmeas celulares son naturales para KRAS, NRAS, bRaF y PIK3CA, con la excepcion de NCIH508, que muestra la mutacion p.E545K PIK3CA. En conjunto, 15 todos estos modelos celulares recogen las caractensticas moleculares de los tumores de los pacientes con CCR que es probable que respondan a terapias anti EGFR. Para cada lmea se expusieron al menos cinco millones de celulas de forma continua al cetuximab hasta que aparecieron poblaciones resistentes. Para definir los mecanismos moleculares subyacentes en la adquisicion de la resistencia, inicialmente se llevo a cabo una secuenciacion de Sanger de los genes implicados en la regulacion de la ruta de senalizacion del EGFR (EGFR, KRAS, BRAF, NRAS y 20 PIK3CA). Segun los informes previos, las poblaciones resistentes a menudo muestran las mutaciones KRAS, BRAF y NRAS (vease Misale et al. "Blockade of egfr and mek intercepts heterogeneous mechanisms of acquired resistance to anti-egfr therapies in colorectal cancer", Sci Transl Med-2014; 6: 224ra226). Todos estos alelos fueron detectados en las celulas resistentes, pero no en la correspondiente poblacion parental a partir de la cual se habfan originado. De forma importante, en numerosas ocasiones habfa presentes simultaneamente multiples alteraciones geneticas 25 en la poblacion de celulas resistentes, lo que indicaba su estado policlonal. Para evaluar las caractensticas moleculares de los clones individuales se llevaron a cabo por lo tanto unas diluciones celulares limitadas de LIM1215 y de CCK81, ya que estas lmeas celulares son susceptibles a este procedimiento. Despues, los clones individuales fueron sometidos a una secuenciacion de Sanger para buscar los genes candidatos (EGFR, KRAS, BRAF, NRAS y PIK3CA). De forma notable, el perfil de la mutacion de los clones identifico tres nuevas variantes del EGFR: S464L, 30 G465R y I491M. Las mutaciones S464L, G465R, junto con las mutaciones del Ejemplo 2 (R541C y K467T) estan localizadas en la SEQ ID NO: 12 (un fragmento que define parte del epftopo de union al cetuximab). Considerando que los derivados resistentes son policlonales, y a la luz de la limitada sensibilidad del metodo de secuenciacion de Sanger, se postulo que las variantes presentes en menos del 20 % de las poblaciones celulares podnan haber quedado sin detectar. Para identificar las mutaciones presentes con una baja frecuencia, se empleo una PCR digital 35 de gotita (ddPCR) que es conocida por tener una sensibilidad de mutante/natural de 1:20.000. Las sondas de la ddPCR fueron disenadas y validadas individualmente usando un ADN mutante de control para detectar las variantes del EGFR identificadas previamente en las biopsias tumorales o en las lmeas celulares. Este analisis desvelo la presencia de 3 nuevas variantes del EGFR (S464L, G465R y I491M) que no habfan sido detectadas mediante la secuenciacion de Sanger en las poblaciones de celulas resistentes. La ddPCR no pudo llevarse a cabo en las 40 muestras tisulares debido a que no habfa quedado suficiente material. Globalmente, el panorama de mutaciones de las lmeas celulares con resistencia adquirida al cetuximab resume los perfiles moleculares de los tumores que reaparecieron tras el tratamiento con cetuximab.
ddPCR™ Supermix para sondas (Bio-Rad) usando un ensayo para KRAS, NRAS, BRAF y EGFR (PrimePCR™ 45 ddPCR™ Mutation Assay, Bio-Rad y de diseno personalizado). La ddPCR se llevo a cabo segun el protocolo del fabricante, y los resultados se notificaron en forma de un porcentaje o de la abundancia fraccionaria de los alelos del ADN mutante con respecto a alelos del ADN total (mutante mas natural). Se anadieron entre 8 y 10 pl de molde de ADN a 10 pl de ddPCR™ Supermix para sondas Probes (Bio-Rad) y 2 pl de la mezcla cebador/sonda. Esta muestra de 20 pl se anadio a 70 pl de aceite de generacion de gotitas para sondas (Bio-Rad) y se uso para la generacion de 50 gotitas. Despues, las gotitas se termociclaron en las siguientes condiciones: 5 minutos a 95 °C, 40 ciclos a 94 °C durante 30 s, a 55 °C durante 1 minuto seguido de 98 °C durante 10 minutos (velocidad de ascenso de 2 °C/s). Despues, las muestras se transfirieron a un lector de gotitas QX200™ (Bio-Rad) para la medicion fluorescente de las sondas FAM y HEX. La separacion se llevo a cabo basandose en los controles positivos y negativos y se identificaron las poblaciones mutantes. Se calcularon las abundancias fraccionarias del ADN mutante en el trasfondo 55 de ADN natural para cada muestra usando el soporte logico QuantaSoft (Bio-Rad). Se llevaron a cabo multiples replicas (mmimo de cuatro) para cada muestra. Se llevaron a cabo analisis de ddPCR del ADNg normal de control de las lmeas celulares y de los controles sin molde de ADN (agua) en paralelo para todas las muestras, incluyendo de nuevo multiples replicas como control exento de contaminacion. Las secuencias de las sondas y los cebadores de EGFR estan disponibles bajo solicitud.
60
El cultivo celular y la generacion de las celulas resistentes utilizadas en el presente documento ya han sido descritos previamente (vease Misale S et al. Emergence of KRAS mutations and acquired resistance to anti-EGFR therapy in colorectal cancer. Nature. 2012; 486: 532-6; Misale S, Arena S et al Blockade of EGFR and MEK intercepts heterogeneous mechanisms of acquired resistance to anti-EGFR therapies in colorectal cancer. Sci Transl Med. 65 2014; 6: 224ra26). Las celulas CCK81 se cultivaron en medio MEM (Invitrogen) suplementario con un 5 % de FBS,
L-glutamina 2 mM, antibioticos (100 U/ml de penicilina y 100 mg/ml de estreptomicina) y se cultivaron en una estufa de incubacion a 37 °C y aire con un 5 % de CO2. Los derivados CCK81 resistentes al cetuximab se obtuvieron aumentando progresivamente la dosis de cetuximab desde 80 nM hasta 1,4 pM en el transcurso de seis meses.
5 3B: presencia de las mutaciones S464L, G465R y K467T en el EGFR y resistencia al cetuximab
Para establecer si las mutaciones del EGFR S464L, G465R y K467T de la invencion eran responsables de la resistencia observada al cetuximab, el EGFR natural completo y cualquiera de las mutaciones S464L, G465R o K467T del EGFR fueron expresados ectopicamente en la lmea celular de fibroblastos embrionarios de raton 10 cultivados NIH3T3 que carecen de una expresion endogena detectable del EGFR.
El EGFR fue estimulado con su ligando natural EGF en presencia de cetuximab o de panitumumab en celulas transfectadas. La union del anticuerpo se analizo mediante una citometna de flujo usando un anticuerpo secundario contra la IgG humana conjugada con ficoeritrina (PE). Se usaron celulas NIH 3T3 que expresan el vector vado como 15 control negativo (VACto). El porcentaje de celulas que se unen al anticuerpo se muestra en los diagramas de puntos bidimensionales de las FIG 2-4. En esta FIG. 2-4, los recuentos celulares (C de "recuentos", eje Y) del canal FL2H de deteccion de la fluorescencia estan representados para el ensayo con cetuximab (FIG. 2A, 3A y 4A) y para el ensayo con panitumumab (FIG. 2B, 3B y 4B).
20 En las celulas naturales para el EGFR (EGFR natural en las FIG. 2-4 A/B), tanto el cetuximab como el panitumumab inhibieron la activacion del EGFR, mientras que en las celulas portadoras de la mutacion K467T (EGFR_K467T en la FIG. 2 A/B), S464L (EGFR_S464L en la FIG. 3 A/B) y G465R (EGFR_G465R en la FIG. 4 A/B), el panitumumab, pero no el cetuximab, efectivamente bloqueo la activacion del EGFR inducida por el EGF. VACfo es el control negativo (celulas que no expresan el EGFR)
25 Para las construcciones de ADN, la construccion pLX301-EGFR natural, una generosa donacion del Dr. C. Sun y del Prof R. Bernards (NKI, Amsterdam), se construyo a partir de pLX301 (Addgene®). Los mutantes del EGFR que conteman las 4 mutaciones puntuales (R451C, S464L, G465r y K467T) se construyeron usando los kits de mutagenesis dirigida QuikChange® II de Agilent Technologies con el plasmido pLX301-EGFR natural como ADN de molde. La presencia de las mutaciones se confirmo mediante una secuenciacion del ADN.
30
Referencias citadas en la solicitud
- Mendelsohn J, Baselga J et al., "Epidermal growth factor receptor targeting in cancer". Semin Oncol - 2006, Vol. 33, pags.: 369-38.
35 - Lynch TJ et al., "Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of nonsmall-cell lung cancer to gefitinib", N Engl J Med-2004, Vol. 350, pags.: 2129-2139.
- Misale et al., "Emergence of KRAS mutations and acquired resistance to anti-EGFR therapy in colorectal cancer", Nature - 2012, Vol. n° 486, pags.: 532-536.
- Montagut et al., "Identification of a mutation in the extracellular domain of the Epidermal Growth Factor Receptor 40 conferring cetuximab resistance in colorectal cancer", Nature medicine - 2012, Vol. n° 18, pags.: 221-223.
- Voigt et al., "Functional Dissection of the Epidermal Growth Factor Receptor Epitopes Targeted by Panitumumab and Cetuximab", Neoplasia -2012, Vol. n° 14 (11), pags.: 1023-1031.
- Karapetis et al., "K-ras Mutations and Benefit from Cetuximab in Advanced Colorectal Cancer", The New England Journal of Medicine - 2008, Vol. 359, pags.: 1757-1765.
45 - Eisenhauer et al., "New response evaluation criteria in solid tumours: revised RECIST guideline (version 1.1)", Eur J Cancer 2009, Vol. 45 (2): 228-247.
- Salido et al., "Increased ALK gene copy number and amplification are frequent in non-small cell lung cancer", J Thorac Oncol - 2011, Vol. n° 6, pags.: 21-7.
- Diaz et al. "The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers", 50 Nature- 2012, Vol. n° 486, pags.: 537-40.
- Misale et al. "Blockade of egfr and mek intercepts heterogeneous mechanisms of acquired resistance to anti-egfr therapies in colorectal cancer", Sci Transl Med- 2014; 6: 224ra226.
LISTADO DE SECUENCIAS 55
<110> Fundacio Institut Mar d'Investigacions Mediques (FIMIM) ALBERTO BARDELLI SABRINA
<120> Mutaciones en el dominio extracelular III del gen del receptor del factor de crecimiento epidermico
60 <130> P2949PC00
<150> EP14382288 <151>
65 <160> 14
5
10
15
20
25
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens
<220>
<221> VARIANTE <222> (1)..(1)
<223> X es un aminoacido seleccionado entre arginina (R) y cistema (C) <220>
<221> VARIANTE <222> (17)..(17)
<223> X es un aminoacido seleccionado entre lisina (K) y treonina (T) <400> 1
Xaa Ser Leu Lys Glu lie Ser Asp Gly Asp Val lie lie Ser Gly Asn 15 10 15
xaa
<210>2 <211> 1210 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 2

Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala 15 10 15
Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gin

20 25 30
Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gin Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe

35 40 45

Claims (14)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una secuencia peptidica con una longitud de entre 17 y 100 aminoacidos y que comprende la secuencia SEQ ID NO: 13
    5 X1SLKEISDGDVIIX4X5NX2, en la que X1 se selecciona entre R y C;
    X4 se selecciona entre S y L;
    X se selecciona entre G y R;
    X2 se selecciona entre K y T; y en la que al menos uno de X1, X4, X5 y X2 es, respectivamente, C, L, R o T.
    10
  2. 2. La secuencia peptidica segun la reivindicacion 1, con una longitud de entre 17 y 100 aminoacidos y que comprende la secuencia SEQ ID NO: 1
    X1SLKEISDGDVIISGNX2, en la que:
    15 X1 se selecciona entre R y C;
    X se selecciona entre K y T; y
    1 2 1 2 en la que si X es C, entonces X se selecciona independientemente entre K y T, y si X es R, entonces X es T.
  3. 3. El peptido segun cualquiera de las reivindicaciones 1 -2, comprendiendo adicionalmente dicho peptido la SEQ ID 20 NO: 4
    NLCYANTINWKKLFGTSGGKTKIIX3, en la que X3 se selecciona entre S y R.
  4. 4. La secuencia peptidica segun cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende la secuencia SEQ ID NO: 5 25 X1SLKEISDGDVNSGNX2NLCYANTINWKKLFGTSGGKTKNX3, en la que
    X1, X2 y X3 tienen el mismo significado que en las reivindicaciones 1,2 y 3 y
    en la que si X1 es C, entonces X2 se selecciona independientemente entre K y T, y si X1 es R, entonces X2 es T, o que comprende la secuencia SEQ ID NO: 14
    X1SLKEISDGDVNX4X5NX2NLCYANTINWKKLFGTSGGKTKNX3, en la que 30 X1, X2 y X3, X4 y X5 tienen el mismo significado que en las reivindicaciones 1, 2 y 3; y en la que al menos uno de X1, X4, X5 y X2 es, respectivamente, C, L, R o T.
  5. 5. Un oligonucleotido que comprende una secuencia que codifica la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 13.
    35 6. El oligonucleotido segun la reivindicacion 5, que codifica adicionalmente la SEQ ID NO: 4.
  6. 7. El oligonucleotido segun cualquiera de las reivindicaciones 5-6, que comprende una secuencia que codifica la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 14.
    40 8. Un conjunto de cebadores que consiste en las SEQ ID Nos: 6 (CAAAGTTTTCAGGGATACATTGTTTTT) y 7 (TTAAATGGGAATAGCCCTTCAATATT).
  7. 9. Un kit que comprende un conjunto de cebadores segun se define en la reivindicacion 8 y/o un oligonucleotido segun se define en cualquiera de las reivindicaciones 5-7.
    45
  8. 10. El kit segun la reivindicacion 9, que comprende adicionalmente reactivos para la deteccion de mutaciones en los genes KRAS y/o PIK3CA y/o BRAF y/o de mutaciones adicionales en el gen EGFR.
  9. 11. El kit segun se define en cualquiera de las reivindicaciones 9-10, para su uso en la prediccion de la respuesta de 50 un sujeto a un regimen terapeutico que comprende anticuerpos monoclonales anti-EGFR, preferentemente
    cetuximab y/o panitumumab.
  10. 12. Un metodo para la prediccion in vitro de la respuesta de un sujeto a un regimen terapeutico que comprende cetuximab y/o panitumumab, en el que el metodo comprende
    55
    (i) la determinacion en una muestra tomada del sujeto y mediante un medio seleccionado entre el grupo que consiste en metodos de genotipado y/o metodos de secuenciacion de protemas, de si hay presentes o ausentes mutaciones en un fragmento definido por la SEQ ID NO: 12, que es un fragmento desde el aminoacido 450 hasta el aminoacido 470 de la secuencia de aminoacidos natural consenso del EGFR humano de la SEQ ID NO: 2; y 60 (ii) la correlacion de la presencia de cualquier mutacion identificada en la etapa i) con la resistencia del sujeto al regimen terapeutico que comprende cetuximab, o
    la correlacion de la ausencia de las mutaciones en la etapa i) con la respuesta del sujeto al regimen terapeutico que comprende panitumumab.
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
  11. 13. El metodo in vitro segun la reivindicacion 12, en el que en la etapa (i) se determina si en la SEQ ID NO: 12 esta presente o ausente al menos una de las siguientes mutaciones: un cambio de una arginina por una cistema en la correspondiente posicion 451 de la SEQ ID NO: 2; de una serina por una leucina en la correspondiente posicion 464 de la SEQ ID NO: 2; de una glicina por una arginina en la correspondiente posicion 465 de la SEQ ID NO: 2; y de una lisina por una treonina en la correspondiente posicion 467 de la SEQ ID NO: 2.
  12. 14. El metodo in vitro segun cualquiera de las reivindicaciones 12-13, en el que la etapa i) comprende adicionalmente la determinacion de la presencia o la ausencia de una arginina en la posicion 492 de la secuencia de aminoacidos correspondiente a la SEQ ID NO: 2 y en la que en la etapa ii) la presencia adicional de la arginina identificada en la etapa i) se correlaciona con una resistencia del sujeto al regimen terapeutico que comprende cetuximab.
  13. 15. Un metodo in vitro de identificacion, en una muestra tomada de un sujeto, de la presencia o la ausencia de una cistema en la posicion 451 de la secuencia de aminoacidos correspondiente a la SEQ ID NO: 2;
    y/o de la presencia o la ausencia correspondiente a la SEQ ID NO: 2;
    de una leucina en la posicion "3- (O de la secuencia de aminoacidos
    y/o de la presencia o la ausencia correspondiente a la SEQ ID NO: 2;
    de una arginina en la posicion LO CD de la secuencia de aminoacidos
    y/o de la presencia o la ausencia correspondiente a la SEQ ID NO: 2,
    de una treonina en la posicion 467 de la secuencia de aminoacidos
    comprendiendo el metodo la determinacion de la secuencia de la SEQ ID NO: 2, al menos desde la posicion 450 hasta la posicion 470.
  14. 16. Un metodo in vitro de identificacion, en una muestra tomada de un sujeto, de
    la presencia o la ausencia de una cistema en la posicion 451 de la secuencia de aminoacidos correspondiente a la SEQ ID NO: 2; y/o
    la presencia o la ausencia de una leucina en la posicion 464 de la secuencia de aminoacidos correspondiente a la SEQ ID NO: 2; y/o
    la presencia o la ausencia de una arginina en la posicion 465 de la secuencia de aminoacidos correspondiente a la SEQ ID NO: 2; y/o
    la presencia o la ausencia de una treonina en la posicion 467 de la secuencia de aminoacidos correspondiente a la SEQ ID NO: 2,
    comprendiendo el metodo la determinacion de los aminoacidos en las posiciones 451 y/o 464 y/o 465 y/o 467 mediante un medio seleccionado entre el grupo que consiste en metodos de genotipado y/o metodos de secuenciacion de protemas.
    imagen1
    A>C
    AAA>ACA
    Lys>Thr
    K467T
    C>T
    CGC>TGC
    Arg'-Cys
    R451C
    FIG. 1
    imagen2
    T"lTlrn^rTl;^
    VACO
    EGFR NATURAL
    14,4
    i "null i i ilij!
    10
    FL2-H
    FL2-H
    EGFR K467T
    200
    5,46
    FL2-H
    EGFR NATURAL
    VAC O
    200
    13,05
    FL2-H
    FL2-H
    EGFR K467T
    35,14
    FL2-H
    FIG. 2
    imagen3
    imagen4
    (Al
    Vac io
    imagen5
    FL2-H
    imagen6
    imagen7
    REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCION
    Esta lista de referencias citadas por el solicitante es unicamente para la comodidad del lector. No forma parte del
    documento de la patente europea. A pesar del cuidado tenido en la recopilacion de las referencias, no se pueden
    excluir errores u omisiones y la EPO niega toda responsabilidad en este sentido.
    Documentos de patentes citados en la descripcion
    • EP 14382288 A [0126]
    Literatura diferente de patentes citada en la descripcion
    • MENDELSOHN J ; BaSELGA J et al. Epidermal growth factor receptor targeting in cancer. Semin Oncol, 2006, vol. 33, 369-38 [0002] [0125]
    • LYNCH TJ et al. Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of nonsmall-cell lung cancer to gefitinib. N Engl J Med, 2004, vol. 350, 2129-2139 [0002] [0125]
    • MISALE et al. Emergence of KRAS mutations and acquired resistance to anti-EGFR therapy in colorectal cancer. Nature, 2012, vol. 486 (532-536 [0008]
    • MONTAGUT et al. Identification of a mutation in the extracellular domain of the Epidermal Growth Factor Receptor conferring cetuximab resistance in colorectal cancer. Nature Medicine, 2012, vol. 18, 221-223 [0009]
    • VOIGT et al. Functional Dissection of the Epidermal Growth Factor Receptor Epitopes Targeted by Panitumumab and Cetuximab. Neoplasia, 2012, vol. 14 (11), 1023-1031 [0010] [0125]
    • KARAPETIS et al. K-ras Mutations and Benefit from Cetuximab in Advanced Colorectal Cancer. The New England Journal of Medicine, 2008, vol. 359, 1757-1765 [0091] [0125]
    • EISENHAUER et al. New response evaluation criteria in solid tumours: revised RECIST guideline (version 1.1). Eur J Cancer, 2009, vol. 45 (2), 228-247 [0112] [0125]
    • DIAZ et al. The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers. Nature, 2012, vol. 486, 537-40 [0113] [0125]
    • SALIDO et al. Increased ALK gene copy number and amplification are frequent in non-small cell lung cancer. J Thorac Oncol, 2011, vol. 6, 21-7 [0116] [0125]
    • MISALE et al. Blockade of egfr and mek intercepts heterogeneous mechanisms of acquired resistance to anti- egfr therapies in colorectal cancer. Sci Transl Med, 2014, vol. 6, 224ra226 [0119] [0125]
    • MISALE S et al. Emergence of KRAS mutations and acquired resistance to anti-EGFR therapy in colorectal cancer. Nature, 2012, vol. 486, 532-6 [0121]
    • MISALE S; ARENA S et al. Blockade of EGFR and MEK intercepts heterogeneous mechanisms of acquired resistance to anti-EGFR therapies in colorectal cancer. Sci Transl Med, 2014, vol. 6, 224ra26 [0121]
    • MISALE et al. Emergence of KRAS mutations and acquired resistance to anti-EGFR therapy in colorectal cancer. Nature, 2012, vol. 486, 532-536 [0125]
    • MONTAGUT et al. Identification of a mutation in the extracellular domain of the Epidermal Growth Factor Receptor conferring cetuximab resistance in colorectal cancer. Nature medicine, 2012, vol. 18, 221-223 [0125]
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10982287B2 (en) * 2015-01-06 2021-04-20 The Johns Hopkins University Response to EGFR blockade
CN111499749B (zh) * 2020-03-13 2021-11-09 浙江大学 一种西妥昔单抗突变体及应用
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5914269A (en) * 1997-04-04 1999-06-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide inhibition of epidermal growth factor receptor expression
CN107794302B (zh) * 2004-03-31 2022-03-15 综合医院公司 测定癌症对表皮生长因子受体靶向性治疗反应性的方法
EP2710172B1 (en) * 2011-05-20 2017-03-29 Fluidigm Corporation Nucleic acid encoding reactions
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