ES2683385T3

ES2683385T3 - Método para el tratamiento de microorganismos durante la propagación, el acondicionamiento y la fermentación empleando extractos de ácidos del lúpulo y ácido orgánico

Info

Publication number: ES2683385T3
Application number: ES14719583.8T
Authority: ES
Inventors: John S. Chapman; Corinne E. Consalo
Original assignee: Solenis Technologies Cayman LP
Current assignee: Solenis Technologies Cayman LP
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2014-03-14
Publication date: 2018-09-26
Anticipated expiration: 2034-03-14
Also published as: CN105051199B; US8778646B1; BR112015021883A2; CA2901154A1; EP2971017B1; BR112015021883B1; WO2014143938A1; UA118188C2; CN105051199A; EP2971017A1; PL2971017T3; CA2901154C; HUE039660T2; BR112015021883A8

Abstract

Un método para controlar la concentración de microorganismos indeseables en una disolución acuosa empleada en un proceso de fermentación, comprendiendo dicho método las etapas de: (a) introducir un carbohidrato fermentable en la disolución acuosa; (b) introducir al menos una levadura en la disolución; (c) introducir un extracto de ácidos del lúpulo en la disolución; y (d) introducir al menos un ácido orgánico, o una de sus sales, en la disolución, en el que el microorganismo indeseable es una bacteria productora de ácido láctico y el ácido orgánico es ácido cítrico.

Description

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DESCRIPCION

Metodo para el tratamiento de microorganismos durante la propagacion, el acondicionamiento y la fermentacion empleando extractos de acidos del lupulo y acido organico

Campo de la invencion

La presente tecnologfa se refiere en general al control microbiano en procesos de fermentacion. En particular, la presente tecnologfa implica un metodo para reducir o controlar la concentracion de microorganismos indeseables.

Antecedentes de la invencion

Se emplean microorganismos, tales como levaduras, hongos y bacterias, para producir una serie de productos de fermentacion, tales como etanol de calidad industrial, bebidas espirituosas destiladas, cerveza, vino, productos farmaceuticos y nutraceuticos (productos alimentarios que proporcionan beneficios para la salud, tales como alimentos reforzados y suplementos dieteticos), productos qmmicos de la industria panadera e industriales.

De modo habitual se emplean levaduras en los procesos de fermentacion. Un tipo habitual de levadura es Saccharomyces cerevisiae, la especie que se emplea predominantemente en la fabricacion de pan y la fermentacion. Igualmente se emplean levaduras que no son Saccharomyces, tambien conocidas como levaduras no convencionales, para fabricar una serie de productos comerciales.

Otros microorganismos tambien pueden ser utiles en la fabricacion de productos de fermentacion. Por ejemplo, la produccion de etanol celulosico, la produccion de etanol a partir de biomasa celulosica, emplea hongos y bacterias. Los ejemplos de estos hongos celulolfticos incluyen Trichoderma reesei y Tichoderma viride. Un ejemplo de una bacteria usada en la produccion de etanol celulosico es Clostridium Ijungdahlii.

La mayor parte de las levaduras empleadas en las destilenas y en las fabricas de etanol para combustible se adquieren de fabricantes de levaduras especializadas. La levadura se fabrica mediante un proceso de propagacion. La propagacion implica cultivar una gran cantidad de levaduras a partir de un pequeno cultivo de laboratorio de levadura. Durante la propagacion, a las levaduras se les suministra oxfgeno, nitrogeno, azucares, protemas, lfpidos e iones que son necesarios o deseables para el crecimiento optimo a traves de la respiracion aerobia.

Una vez en la destilena, la levadura puede someterse a un acondicionamiento. El condicionamiento se diferencia de la propagacion porque no implica cultivar una gran cantidad de levaduras a partir de un pequeno cultivo de laboratorio. Durante el acondicionamiento se proporcionan las condiciones para rehidratar la levadura, sacarla de la hibernacion y dejar que se produzca el maximo crecimiento y reproduccion. El objetivo de la propagacion y el acondicionamiento es conseguir un gran volumen de levaduras para el tanque de fermentacion que tengan una elevada viabilidad, una alta tasa de gemacion y un bajo nivel de infeccion por otros microorganismos.

Tras la propagacion y/o el acondicionamiento, la levadura entra en el proceso de fermentacion. La levadura se combina en una disolucion acuosa con azucares fermentables. La levadura consume los azucares, convirtiendolos en alcoholes alifaticos, tales como etanol.

El proceso de fermentacion comienza con la preparacion de un carbohidrato fermentable. En la produccion de etanol, el mafz es una posible fuente de carbohidrato fermentable. Tambien puede sustituirse por otras fuentes de carbohidratos, que incluyen cereales de grano y materiales que contienen celulosa-almidon, tales como trigo o sorgo. Tambien puede emplearse una biomasa celulosica, tal como paja y tallos de mafz. En fechas recientes, la produccion de etanol celulosico ha recibido bastante atencion porque emplea una biomasa no alimentaria facilmente disponible para formar un combustible valioso.

Los procesos de propagacion, acondicionamiento y fermentacion pueden realizarse empleando metodos discontinuos o continuos. El proceso discontinuo se emplea para la produccion a pequena escala. Cada lote se completa antes de empezar con otro nuevo. El metodo de fermentacion continuo se emplea para la produccion a gran escala porque produce un suministro continuo sin tener que volver a empezar cada vez. Puede utilizarse una mezcla de acidos del lupulo y un acido organico en los metodos discontinuos o continuos.

Durante el proceso de propagacion, acondicionamiento o fermentacion, la pulpa o la mezcla de fermentacion puede contaminarse con otros microorganismos, tales como bacterias de descomposicion. Estos microorganismos compiten con la especie deseada de levadura por los azucares fermentables y retrasan la reaccion bioqmmica deseada, con lo que se produce un rendimiento menor del producto. Tambien pueden producir subproductos qmmicos no deseados que pueden provocar la descomposicion de lotes enteros de fermentacion.

Los productores de etanol intentan aumentar la cantidad de etanol producido a partir de un celemm de granos de cereales (aproximadamente 56 libras (25,4 kilogramos)). La contaminacion con microorganismos disminuye la eficacia de la levadura haciendo que sea diffcil lograr o superar los niveles deseados de 2,8-2,9 galones de etanol por celemm (0,42-0,44 litros por kilogramo). La reduccion de la concentracion de microorganismos estimulara la propagacion y/o el acondicionamiento de las levaduras y aumentara la eficacia de las levaduras, haciendo que se

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posible lograr y superar estos niveles deseados.

Durante cualquiera de estos tres procesos, las levaduras pueden contaminarse con levaduras no deseadas, bacterias u otros microorganismos indeseables. Esto puede ocurrir en uno de los muchos recipientes empleados en la propagacion, el acondicionamiento o la fermentacion. Estos incluyen, pero no se limitan a tanques de propagacion, tanques de acondicionamiento, tanques de iniciacion, tanques de fermentacion y tubenas, e intercambiadores de calor entre estas unidades.

La contaminacion bacteriana o microbiana reduce el rendimiento del producto de fermentacion de tres formas principales. En primer lugar, los azucares que podnan estar disponibles para que las levaduras produzcan alcohol son consumidos por las bacterias u otros microorganismos indeseables y son desviados de la produccion de alcohol, con lo que se reduce el rendimiento. En segundo lugar, los productos finales del metabolismo bacteriano, tales como acido lactico y acido acetico, inhiben el crecimiento de las levaduras y la fermentacion/respiracion de las levaduras, lo cual provoca una produccion menos eficaz de levaduras. Por ultimo, las bacterias u otros microorganismos indeseables compiten con las levaduras por nutrientes distintos de los azucares.

Despues de que el sistema o recipiente de fermentacion se ha contaminado con bacterias u otros microorganismos indeseables, estas bacterias u otros microorganismos pueden crecer con mucha mas rapidez que la levadura deseada. Las bacterias u otros microorganismos compiten con la levadura por los azucares fermentables y retrasan la reaccion bioqmmica deseada, con lo que se producen un rendimiento menor del producto. Las bacterias tambien producen subproductos qmmicos no deseados, que pueden provocar la descomposicion de lotes enteros de fermentacion. La eliminacion de estas bacterias u otros microorganismos indeseables permite que las levaduras deseadas crezcan, lo cual provoca una mayor eficacia de produccion.

Una disminucion de tan solo 1% en el rendimiento del etanol es muy significativa en la industria del etanol para combustible. En las instalaciones mas grandes, esta disminucion en la eficacia reducira las ganancias de un millon a tres millones de dolares anuales.

Algunos metodos para reducir las bacterias u otros microorganismos indeseables durante la propagacion, el acondicionamiento y la fermentacion aprovechan la mayor tolerancia frente a la temperatura y el pH de las levaduras frente a otros microorganismos. Esto se realiza aplicando calor o disminuyendo el pH de la disolucion de levaduras. Sin embargo, estos procesos no son totalmente eficaces para retrasar el crecimiento bacteriano. Ademas, los microorganismos de levadura deseables, aunque sobreviven, resultan estresados y no son tan vigorosos ni sanos. Asf, las levaduras no actuan tan bien.

La tendencia predominante en la industria del etanol es reducir el pH de la pulpa (materia prima) a menos de 4,5 al inicio de la fermentacion. La disminucion del pH de la pulpa reduce la poblacion de algunas especies de bacterias. Sin embargo, es mucho menos eficaz para reducir las bacterias problematicas, tales como las bacterias que producen acido lactico. Tambien reduce significativamente el rendimiento del etanol porque las levaduras empleadas para la produccion de etanol se estresan.

Otra estrategia implica lavar las levaduras con acido fosforico. Este metodo no mata las bacterias y otros microorganismos con eficacia. Tambien puede estresar a las levaduras empleadas para la produccion de etanol, disminuyendo con ello su eficacia.

Otro metodo consiste en utilizar calor o productos qmmicos agresivos para esterilizar el equipo del proceso entre lotes. No es eficaz para matar a las bacterias y otros microorganismos dentro de la mezcla de levaduras durante la produccion.

En otro metodo se anaden antibioticos al lote de propagacion, acondicionamiento o fermentacion de las levaduras para neutralizar a las bacterias. Las industrias de la fermentacion generalmente aplican antibioticos a los procesos de acondicionamiento, propagacion y fermentacion. Las tasas de dosificacion de antibioticos vanan entre 0,1 a 3,0 mg/l y, en general, no son mayores que 6 mg/l. Sn embargo, existen problemas con la utilizacion de antibioticos en el condicionamiento, la propagacion y la fermentacion. Los antibioticos son caros y pueden aumentar mucho los costes de la produccion a gran escala. Ademas, los antibioticos no son eficaces contra todas las cepas de bacterias, tales como cepas de bacterias resistentes a antibioticos. El abuso de antibioticos puede conducir a la creacion de otros variantes de cepas de bacterias resistentes a antibioticos.

Los restos de antibioticos y el establecimiento de cepas resistentes a antibioticos es un problema global. Estos problemas pueden conducir a una futura accion legislativa contra el uso de antibioticos. Un area preocupante son los granos de destilacion que se emplean como pienso animal. Los granos de destilacion son el residuo de los granos del proceso de fermentacion. Los pafses europeos no permiten que los subproductos de una fabrica de etanol se comercialicen como pienso animal si se emplean antibioticos en las instalaciones. La venta de los granos de destilacion supone hasta 20% de los ingresos de las fabricas de etanol. La concentracion de antibioticos en el subproducto puede variar del 1-3% en peso, de modo que se anula esta importante fuente de ingresos.

Ademas, existen otros problemas a considerar cuando se emplean antibioticos. Las mezclas de antibioticos con frecuencia deben equilibrarse y cambiarse para evitar usos individuales que conduzcan a la aparicion de cepas

resistentes a antibioticos. A veces la cantidad eficaz de un antibiotico no puede anadirse a la mezcla de fermentacion. Por ejemplo, la utilizacion de mas de 2 mg/l de virginiamicina suprimira la fermentacion, pero son necesarios mas de 25 mg/l para inhibir el crecimiento de Weisella confusa, una cepa problematica de bacterias emergente. La sobredosis o el abuso de antibioticos puede estresar a las levaduras y afectar a la eficacia o provocar 5 la no observancia de la legislacion.

Las industrias que emplean la fermentacion para bebidas han aplicado historicamente los acidos del lupulo en la propagacion y la fermentacion para controlar a los microbios no deseados que compiten con la levadura por los nutrientes. Con la reciente expansion del etanol para combustible, los acidos del lupulo se han utilizado a pequeno nivel para solucionar el problema de los microbios no deseados. El documento WO 2004/072291 A2, RUCKLE 10 (International Sugar Journal, 2006, 108(1287), 139-147) y ARUNACHALAM MUTHAIYAN (Progess in Energy and Combustion Science, 2011, vol. 37, n.° 3, 351-370) describen metodo para controlar especies de Lactobacillus en procesos de fermentacion empleando acidos del lupulo. Los documentos SU 1463747 A1 y AU 2012201464 A1 describe procesos de fermentacion que emplean levaduras en presencia de lupulo y acido cftrico. El documento US 6326185 B1 describe un metodo para reducir el numero de bacterias productoras de acido lactico en levaduras 15 empleando al menos 40 ppm de acidos del lupulo y acido dtrico hasta alcanzar un pH 2,0-2,6.

La competicion entre las levaduras y los microbios no deseados produce una perdida de rendimiento del etanol para combustible, puesto que los microbios no deseados, principalmente Lactobacillus y Acetobacter, reducen la eficacia de la fermentacion. En la produccion de bebidas, los microbios competitivos no solo reducen la eficacia, sino que tambien pueden alterar la estetica y el sabor del producto final.

20 Los acidos organicos tienen muchas aplicaciones, que incluyen sus usos como acidificantes, tampones, antioxidantes, quelantes, sinergicos, suplementos dieteticos, agentes aromatizantes, conservantes y antimicrobianos. Los acidos organicos se han empleado como conservantes debido a su efecto sobre las bacterias. El modo de accion del acido organico consiste en que los acidos no disociados penetran a traves de la pared celular bacteriana mediante difusion pasiva y alteran la fisiologfa normal de la celula de dos formas. Los acidos se disocian 25 y, asf, disminuyen el pH interno, que normalmente es cercano a la neutralidad, lo cual dificulta la funcion de la bacteria. La parte anionica del acido, que no puede salir de la celula en su forma disociada, se acumula en el interior, alterando las funciones metabolicas y aumentando la presion osmotica. Sin embargo, el documento US 2004/033289 A1, Arto Visti (Food Research International, 2003, 36(6), 597-602) y A. ULLAH (Applied and Environmental Microbiology, 2012, 78(23), 8377-8387) indican que el acido acetico, el acido propionico, el acido 30 sorbico y el acido benzoico inhiben el crecimiento de levaduras.

Puesto que una pequena disminucion en el rendimiento del etanol es muy importante para la industria del etanol para combustible, los productores de etanol constantemente estan buscando formas de aumentar la eficacia. Se emplean antimicrobianos para eliminar, reducir o controlar de otro modo el numero de microbios en los sistemas acuosos. Sin embargo, el uso de antimicrobianos siempre anadira un coste a las operaciones y los productos y, por 35 tanto, se buscan formas mas eficaces para lograr el control microbiano. Ademas, algunos antimicrobianos pueden presentar deficiencias en su espectro de accion antimicrobiana o tienen limitaciones operativas en su forma de aplicacion, tales como falta de estabilidad termica o susceptibilidad a la inactivacion por factores ambientales o qmmicos.

Breve descripcion de la figuras

40 La figura 1 es una grafica que muestra las concentraciones bacterianas en momentos del tiempo despues de la adicion de antimicrobianos y al final de la fermentacion (64 horas).

La figura 2 es una grafica que muestra el rendimiento promedio de etanol segun el tratamiento, expresado como gramos de etanol por gramos de mafz seco.

La figura 3 es una grafica que muestra el control del acido acetico en diversas fermentaciones en un ensayo en 45 planta.

La figura 4 es una grafica que muestra el control del acido lactico en diversas fermentaciones en un ensayo en planta.

La figura 5 es una grafica que muestra el control del glicerol en diversas fermentaciones en un ensayo en planta. Descripcion de la invencion

50 Mediante la combinacion de un acido organico y acidos del lupulo en el acondicionamiento, la propagacion y la fermentacion, se ha determinado que no solo los acidos del lupulo son compatibles con el acido organico, sino que son sinergicos cuando se aplican ambas tecnologfas simultaneamente. La combinacion de estos productos proporciona un tratamiento antimicrobiano poderoso sin antibioticos. La invencion puede emplearse para reducir la concentracion de microorganismos indeseables, para estimular la propagacion de microorganismos deseables y 55 para aumentar la eficacia de los microorganismos deseables en un sistema acuoso.

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Tal como se emplea en la presente, los ppm se miden como masa por volumen o 1 ppm es igual a 1 mg (activo) por litro. La dosificacion se define como la concentracion del componente en el sistema que se esta tratando.

Tal como se emplea en la presente, la expresion "acido organico" tambien se refiere a su sal. Por ejemplo, cuando se emplea la expresion acido cftrico, esta incluye la forma de sal del acido cftrico. Cualquier referencia a un acido organico incluye la referencia a su sal.

Las expresiones "acidos del lupulo" y "extracto de acidos del lupulo" se emplean de modo intercambiable.

En un aspecto de la invencion, definido en la reivindicacion 1, se describe un metodo para controlar la concentracion de microorganismos indeseables en un sistema acuoso empleado en un proceso de fermentacion. El metodo comprende las etapas de:

(a) introducir un carbohidrato fermentable en un sistema acuoso;

(b) introducir al menos una levadura en dicho sistema;

(c) introducir un extracto de acidos del lupulo en dicho sistema; y

(d) introducir al menos un acido organico, o una de sus sales en dicho sistema,

en el que el microorganismo indeseable es una bacteria productora de acido lactico y el acido organico es acido cftrico.

La reduccion del subproducto residual de antibiotico en un proceso de fermentacion puede lograrse empleando los metodos de la invencion descritos en la presente. Cuando se emplean los metodos de la invencion, puede emplearse menos antibiotico o no emplearse antibiotico en el proceso de fermentacion, con lo que se producen menos subproductos.

El presente metodo para reducir la concentracion de microorganismos indeseables, para estimular la propagacion de microorganismos deseables y para aumentar la eficacia de los microorganismos deseables en un sistema acuoso comprende (a) introducir un carbohidrato fermentable en un sistema acuoso, (b) introducir al menos una levadura en el sistema acuoso, y (c) poner en contacto un extracto de acidos del lupulo y un acido organico con el carbohidrato fermentable y/o la levadura. El acido organico es acido cftrico.

Estas etapas de la invencion pueden realizarse de modo secuencial o en un orden diferente. Los acidos del lupulo y el acido organico pueden ponerse en contacto con la levadura o con el carbohidrato de fermentacion, o la levadura y el carbohidrato fermentable pueden combinarse y despues los acidos del lupulo y el acido organico pueden introducirse en la combinacion de levadura y carbohidrato. El extracto de acidos del lupulo y dicho al menos un acido organico pueden mezclarse y despues anadirse al sistema acuoso, o pueden anadirse por separado al sistema acuoso. El sistema acuoso puede estar en un proceso continuo o puede ser un tanque en el caso de un proceso discontinuo.

Otra realizacion no limitante del presente metodo para reducir la concentracion de microorganismos indeseables, para estimular la propagacion de microorganismos deseables y para aumentar la eficacia de los microorganismos deseables en un sistema acuoso comprende (a) introducir una cantidad de un carbohidrato fermentable en un sistema acuoso, (b) introducir una cantidad de una levadura en el sistema acuoso, y (c) poner en contacto un extracto de acidos del lupulo y al menos acido cftrico con el carbohidrato fermentable y/o la levadura. Estas etapas pueden realizarse de modo secuencial o en un orden diferente. El extracto de acidos del lupulo y dicho al menos acido cftrico pueden mezclarse y despues anadirse al sistema acuoso, o pueden anadirse por separado al sistema acuoso.

En el anterior metodo, los microorganismos "indeseables" que se quieren reducir son los que compiten por los nutrientes con los microorganismos deseables que estimulan los procesos de fermentacion deseados, y estos son bacterias productoras de acido lactico ("lactic acid producing bacteria", LAB), de las cuales Lactobacillus es un notable representante. A este respecto, el extracto de acidos del lupulo y el acido organico empleados en el presente metodo no afectan de modo perjudicial al crecimiento y la viabilidad de los microorganismos estimulantes de la fermentacion deseables, pero sf eliminan o suprimen el crecimiento de microorganismos indeseables que interfieren con el proceso de fermentacion. Ademas, la eliminacion o la supresion de los microorganismos indeseables tiene un efecto favorable sobre el crecimiento y la viabilidad de los microorganismos deseables.

El pH del sistema acuoso que se va a tratar es, en general, de 3 a 11, o de 3 a 7, o de 4 a 9, o de 4 a 8, o de 4 a 6,5, o de 4,5 a 6. En general, los acidos organicos actuan mejor en sistemas en los que el pH del sistema es menor que al menos uno de los valores de pKa del acido o su sal.

El acido organico empleado en la presente invencion es el acido cftrico y sus sales. Para los fines de esta invencion, el acido organico no es un acido del lupulo.

Los ejemplos no limitantes de acidos del lupulo que pueden emplearse en la invencion incluyen compuestos de beta-

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acidos, alfa-acidos, alfa-acidos isomerizados, alfa-acidos rho-isomerizados, alfa-acidos tetra-isomerizados, alfa- acidos hexa-isomerizados y hojas de lupulo. En la invencion pueden emplearse unas dosificaciones del extracto de acidos del lupulo en el sistema acuoso que se esta tratando de al menos 0,5 ppm y menos de 120 ppm, o entre 1 ppm y 100 ppm, o entre 2 y 70 ppm, o entre 5 y 50 ppm, o entre 5 y 45 ppm. En la invencion pueden emplearse unas dosificaciones del extracto de acidos del lupulo de al menos 0,5 ppm, o entre 2 y 15 ppm, o entre 5 y 15 ppm, o entre 5 y 10 ppm.

En algunas realizaciones no limitantes, la disolucion sinergica esta formada por extractos de acidos del lupulo y acido cftrico o su sal en unas proporciones de 1:10 a 1:6500, o de 1:15 a 1:6400, de 1:20 a 1:6400, o de 1:20 a 1:1600, o de 1:25 a 1:500, o de 1:25 a 1:100, o de 1:10 a 1:200.

Los acidos del lupulo y el acido dtrico pueden anadirse en una unica localizacion o en multiples localizaciones en el proceso de fermentacion, que incluyen el tanque o tanques de suspension, los recipientes de coccion, los enfriadores de la pulpa, los propagadores y los tanques de fermentacion. Los expertos en la tecnica tambien pueden determinar otros puntos de adicion. Los acidos del lupulo y los acidos organicos pueden anadirse a un recipiente del proceso, tal como un tanque de acondicionamiento que puede calentarse, capaz de realizar la licuacion, o un recipiente de propagacion de las levaduras. El recipiente del proceso tambien puede ser un tanque de fermentacion.

En el presente metodo, las concentraciones de bacterias y otros microorganismos indeseables se reducen, al mismo tiempo que se estimula la propagacion y/o el acondicionamiento de los microorganismos deseables.

Se ha descubierto que los extractos de acidos del lupulo, en combinacion con al menos un acido organico, son eficaces para reducir la concentracion de bacterias y otros microorganismos indeseables, y simultaneamente estimulan la propagacion y/o el acondicionamiento de los microorganismos deseables. La combinacion de estos productos proporciona un tratamiento antimicrobiano sinergico sin el uso de antibioticos.

Se ha descubierto que la adicion de una pequena cantidad de extracto de acidos de lupulo, por ejemplo, aproximadamente 0,5 ppm y menos de 120 ppm (medidos en el sistema que se esta tratando), o entre 1 ppm y 100 ppm, o entre 2 y 70 ppm, o entre 5 y 50 ppm, o entre 5 y 45 ppm, o de 5-10 ppm, junto con al menos el acido dtrico produce un efecto sinergico. En algunas realizaciones no limitantes, los acidos del lupulo se anaden simultaneamente con el acido dtrico. En otras realizaciones, los acidos del lupulo se anaden por separado del acido dtrico al sistema que se esta tratando. La adicion de los extractos de acidos del lupulo junto con la adicion del acido cftrico produce una mejor eficacia antimicrobiana.

Se emplea como ejemplo la produccion de etanol para combustible mediante la fermentacion de levaduras. Sin embargo, esto es simplemente una ilustracion. Otros productos de fermentacion que pueden emplear la combinacion de acidos del lupulo y acido cftrico pueden incluir bebidas espirituosas destiladas, cerveza, vino, productos farmaceuticos, intermedios de productos farmaceuticos, productos de panadena, nutraceuticos (productos alimentarios que proporcionan beneficios para la salud, tales como alimentos reforzados y suplementos dieteticos), intermedios de nutraceuticos, materias primas qmmicas industriales y enzimas. El presente metodo tambien puede utilizarse para tratar las levaduras empleadas en la industria panadera.

Las levaduras Saccharomyces son un tipo de levadura util, tal como Saccharomyces cerevisiae. En la invencion tambien pueden emplearse levaduras que no son Saccharomyces. Tambien se divulga que puedan utilizarse otros microorganismos fermentadores deseables y que estos puedan beneficiarse de la invencion, tales como los hongos y las bacterias que generalmente se emplean en la produccion de etanol celulosico. Algunos ejemplos no limitantes de microorganismos fermentadores deseables incluyen, pero no se limitan a Trichoderma reesei, Trichoderma viride, y Clostridiumljungdahlii.

Los extractos de acidos del lupulo son utiles para matar bacterias, al mismo tiempo que permiten que las levaduras sobrevivan y crezcan. Las industrias de la fermentacion generalmente aplican extractos de acidos del lupulo en la propagacion y la fermentacion.

Los acidos del lupulo y el acido cftrico pueden anadirse en diversos puntos en los procesos de propagacion, acondicionamiento y/o fermentacion. Los acidos del lupulo y el acido cftrico pueden anadirse a recipientes de coccion, tanques de fermentacion, tanques de propagacion, tanques de acondicionamiento, tanques de iniciacion o durante la licuacion. Los acidos del lupulo y el acido cftrico tambien pueden anadirse directamente a la pulpa de mafz. Los acidos del lupulo y el acido cftrico tambien pueden anadirse al sistema de intercambio de calor entre etapas o a los intercambiadores de calor. Los acidos del lupulo y el acido cftrico tambien pueden anadirse a las tubenas entre estas unidades o intercambiadores de calor.

Los acidos del lupulo y el acido cftrico pueden anadirse directamente a la mezcla de fermentacion. Esto puede realizarse anadiendo los acidos del lupulo y el acido dtrico junto con la levadura u otros microorganismos deseables y el carbohidrato fermentable, por ejemplo, durante la etapa de SSF ("simultaneous saccharification and fermentation", sacarificacion y fermentacion simultaneas).

En una realizacion no limitante, las dosificaciones del extracto de acidos del lupulo de al menos 0,5 ppm y menos de 120 ppm, o entre 1 ppm y 100 ppm, o entre 2 y 70 ppm, o entre 5 y 50 ppm, o entre 5 y 45 ppm, o una dosificacion

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de entre 2 y 15 ppm, o una dosificacion de entre 3 y 10 ppm, o una dosificacion de entre 5 y 10 ppm, y unas dosificaciones del acido organico de entre 100 y 2000 ppm o mayores, o de entre 200 y 1000 ppm pueden anadirse directamente a la mezcla de fermentacion.

Los acidos del lupulo y el acido cftrico tambien pueden anadirse a la pulpa antes del proceso de fermentacion. Las dosificaciones del extracto de acidos del lupulo de al menos 0,5 ppm y menos de 120 ppm, o entre 1 ppm y 100 ppm, o entre 2 y 70 ppm, o entre 5 y 50 ppm, o entre 5 y 45 ppm, o entre 2 y 15 ppm, o entre 5 y 15 ppm, o entre 5 y 10 ppm, y unas dosificaciones del acido cftrico de entre 100 y 2000 ppm o mayores, pueden anadirse a la pulpa antes de la fermentacion.

Los acidos del lupulo y el acido cftrico tambien pueden anadirse durante la propagacion y/o el acondicionamiento. Por ejemplo, los extractos de acidos del lupulo pueden anadirse a la suspension de levaduras reemplazando a una etapa de lavado con acidos.

Tambien se divulga que los acidos del lupulo, junto con el acido organico, puedan utilizarse para lograr mejores resultados en la produccion de etanol celulosico. El etanol celulosico es un tipo de etanol que se produce a partir de celulosa, en oposicion a los azucares y almidones empleados en la produccion de etanol basada en carbohidratos. La celulosa esta presente en fuentes de biomasa no tradicionales, tales como pasto varilla, rastrojos de mafz y silvicultura. Este tipo de produccion de etanol es particularmente atractiva debido a la enorme disponibilidad de fuentes de celulosa. El etanol celulosico, por la naturaleza de la materia prima, introduce unos niveles mayores de contaminantes y microorganismos competitivos en el proceso de fermentacion. Los acidos del lupulo, junto con el acido organico, pueden utilizarse en la produccion de etanol celulosico para controlar a los microorganismos indeseables.

Existen dos procesos principales para producir alcohol a partir de celulosa. Un proceso es un proceso de hidrolisis que emplea hongos, como por ejemplo, Trichoderma reesei y/o Trichoderma viride. El otro es un proceso de gasificacion que emplea bacterias, tales como Clostridium Ijungdahlii. Los acidos del lupulo, junto con el acido organico, pueden utilizarse en cualquiera de los procesos.

En el proceso de hidrolisis, las cadenas de celulosa se descomponen en azucares de cinco carbonos y de seis carbonos antes del proceso de fermentacion. Esto se hace de modo qmmico o enzimatico.

En el metodo de hidrolisis qmmica, la celulosa puede tratarse con un acido diluido a alta temperatura y presion o con acido concentrado a menor temperatura y presion atmosferica. En el proceso de hidrolisis qmmica, la celulosa reacciona con el acido y agua para formar moleculas de azucares individuales. Estas moleculas de azucares despues se neutralizan, y se emplea la fermentacion con levaduras para producir etanol. Los acidos del lupulo, junto con el acido organico, pueden utilizarse durante la porcion de fermentacion con levaduras de este metodo.

La hidrolisis enzimatica puede realizarse empleando dos metodos. El primero se conoce como conversion microbiana directa (“direct microbial conversion”, DMC). El metodo de DMC emplea un unico microorganismo para convertir la biomasa celulosica en etanol. El etanol y las enzimas necesarias son producidos por el mismo microorganismo. Los acidos del lupulo, junto con el acido organico, pueden utilizarse durante las etapas de propagacion/acondicionamiento o fermentacion con este organismo especializado.

El segundo metodo se conoce como metodo de hidrolisis enzimatica, y en este metodo las cadenas de celulosa se descomponen empleando enzimas celulasas. Estas enzimas generalmente estan presentes en el estomago de rumiantes, tales como vacas y ovejas, para descomponer la celulosa que comen. El metodo enzimatico generalmente se realiza en cuatro o cinco etapas. La celulosa se pretrata para hacer que la materia prima, tal como madera o paja, sea mas susceptible a la hidrolisis. Despues se emplean las enzimas celulasas para descomponer las moleculas de celulosa en azucares fermentables. Despues de la hidrolisis, los azucares se separan de los materiales residuales y se anaden a las levaduras. Los azucares hidrolizados se fermentan en etanol empleando las levaduras. Por ultimo, el etanol se recupera mediante destilacion. Como alternativa, la hidrolisis y la fermentacion pueden realizarse al mismo tiempo empleando bacterias u hongos especiales que lleven a cabo ambos procesos. Cuando ambas etapas se realizan al mismo tiempo, el proceso se denomina hidrolisis y fermentacion secuencial ("sequential hydrolysis and fermentation", SHF).

Los acidos del lupulo, junto con el acido organico, puedan introducirse para conseguir la eficacia microbiologica en diversos puntos del metodo enzimatico de hidrolisis. Los acidos del lupulo, junto con el acido organico, pueden utilizarse durante la produccion, la fabricacion y la fermentacion de enzimas celulasas producidas por Trichoderma y otras cepas fungicas. Los acidos del lupulo y el acido organico pueden anadirse a la fase de sacarificacion y fermentacion simultaneas (SSF) celulosica. Los acidos del lupulo y el acido organico pueden introducirse en la fase de hidrolisis y fermentacion secuencial (SHF). Tambien pueden introducirse en un momento anterior, durante o despues de la fermentacion por hongos celulolfticos que crean las enzimas celulasas. Como alternativa, los acidos del lupulo, junto con el acido organico, puedan anadirse durante la fase de fermentacion con levaduras, tal como se analizo anteriormente.

El proceso de gasificacion no descompone la cadena de celulosa en moleculas de azucares. En primer lugar, el carbono en la celulosa se convierte en monoxido de carbono, dioxido de carbono e hidrogeno en una reaccion de

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combustion parcial. Despues el monoxido de carbono, el dioxido de carbono y el hidrogeno se introducen en un fermentador especial que emplea un microorganismo, tal como Clostridium ljungdahlii, que es capaz de consumir el monoxido de carbono, el dioxido de carbono y el hidrogeno para producir etanol y agua. Por ultimo, el etanol se separa del agua en una etapa de destilacion. Los acidos del lupulo y el acido organico pueden emplearse como agente antimicrobiano en la etapa de fermentacion que implica a microorganismo, tal como Clostridium ljungdahlii, que es capaz de consumir el monoxido de carbono, el dioxido de carbono y el hidrogeno para producir etanol y agua.

Por ejemplo, los acidos del lupulo y el acido organico se anaden a un tanque y se diluyen hasta una concentracion predeterminada a una proporcion predeterminada. En el tanque, el extracto de acidos del lupulo, tal como un extracto alfa-isomerizado, y un acido organico, concretamente el acido cftrico, se disuelven en agua para formar una mezcla de acidos del lupulo y acido organico. La concentracion de la disolucion del extracto de acidos del lupulo y la disolucion del acido organico en el tanque de proceso discontinuo puede variar a traves de un amplio intervalo. La disolucion de extracto de acidos del lupulo/acido organico mezclada despues sale del tanque de proceso discontinuo a traves de un puerto de salida a una dosificacion especificada para crear una disolucion con la concentracion deseada.

Por ejemplo, la proporcion de acidos del lupulo al acido organico es una proporcion de 1:200 a 1:10. El tanque generalmente es un tanque de premezcla.

Un recipiente del proceso que contiene una disolucion acuosa de microorganismos esta en conexion fluida con el tanque de proceso discontinuo mediante puertos de salida del tanque de proceso discontinuo. El recipiente del proceso puede ser un recipiente de coccion, un tanque de fermentacion, un tanque de acondicionamiento, un tanque de iniciacion, un tanque de propagacion, un recipiente de licuacion y/o las tubenas o el intercambiador de calor entre estas unidades. La disolucion de extractos de acidos del lupulo/acido organico en el recipiente del proceso es capaz de estimular la propagacion del microorganismo productor presente, al mismo tiempo que disminuye simultaneamente la concentracion de microorganismos indeseables.

Para la produccion a menor escala de productos de fermentacion, un equipo montado en una plataforma rodante es ideal. La plataforma rodante permite fabricar el equipo en otro sitio, para enviarse despues a la localizacion deseada y allf ser instalado con facilidad. Esto permite una facilidad del transporte, y un montaje y puesta en marcha mas rapidos. El tanque de proceso discontinuo, el recipiente del proceso y el equipo de conexion pueden fabricarse de un modo que emplea una plataforma rodante.

Los acidos del lupulo y el acido organico pueden combinarse y despues anadirse al sistema que se va a tratar. Tambien pueden anadirse de modo secuencial o por separado al sistema que se va a tratar. La proporcion de acidos del lupulo a acido organico que se anade a los sistemas que se van a tratar puede ser tan alta como de 1:6000 a 1:5, o de 1:6000 a 1:10, o de 1:500 a 1:10, o de 1:200 a 1:20, o de 1:100 a 1:10, o de 1:100 a 1:20.

El acido organico puede emplearse en cantidades de 12500 ppm hasta 100 ppm en la invencion, de 6250 hasta 100 ppm, o de 4000 hasta 100 ppm, o de 4000 hasta 200 ppm, o de 1000 hasta 100 ppm, o de 1000 hasta 200 ppm. En general, se emplean al menos 100 ppm o al menos 200 ppm o al menos 300 ppm del acido organico. Los acidos del lupulo pueden emplearse en cantidades de al menos 0,5 ppm y menos de 120 ppm, o entre 1 ppm y 100 ppm, o entre 2 y 70 ppm, o entre 5 y 50 ppm, o entre 5 y 45 ppm, o de 0,5 ppm a 20 ppm, o de 0,5 ppm a 15 ppm, o de 2 a 15 ppm, o de 2 a 12 ppm, o de 3 a 12 ppm, o de 3 a 10 ppm. En general, la cantidad de acidos del lupulo utilizada en la invencion es al menos 2 ppm o al menos 3 ppm. Los componentes (acidos del lupulo y acido organico) pueden anadirse al sistema acuoso por separado o pueden mezclarse antes de la adicion. Los acidos organicos pueden anadirse a los sistemas laterales acuosos con otros aditivos, tales como, pero sin limitarse a tensioactivos, compuestos para el control de incrustaciones y de la corrosion, polfmeros ionicos o no ionicos, agentes de control de pH y otros aditivos empleados para alterar o modificar la qmmica del sistema acuoso.

Los expertos en la tecnica pueden determinar, empleando las indicaciones descritas en la presente, la concentracion de la composicion necesaria para lograr un control microbiano aceptable, y esa concentracion depende de la matriz.

Cuando se emplean en un sistema de fermentacion, los acidos pueden anadirse en diversas localizaciones del sistema de fermentacion, tal como pueden anadirse en una unica localizacion o en multiples localizaciones en el proceso de fermentacion, que incluyen el tanque o tanques de suspension, los recipientes de coccion, los enfriadores de la pulpa, los propagadores y los tanques de fermentacion. Los expertos en la tecnica tambien pueden determinar otros puntos de adicion.

Ejemplos

Los indices de sinergia indicados en los siguientes ejemplos emplean la siguiente formula, que fue divulgada por primera vez en F.C. Kull, P.C. Eisman, H.D. Sylwestrowka, y R.L Mayer, Applied Microbiology, 9:538-541, 1961:

fndice de sinergia = Qa QA + Qb/QB

en la que Qa es la concentracion de antimicrobiano A necesaria para lograr la inhibicion completa del crecimiento del microbio de ensayo cuando se emplea en combinacion con el antimicrobiano B;

QA es la concentracion de antimicrobiano A necesaria para lograr la inhibicion completa del crecimiento del microbio de ensayo cuando se emplea por sf solo;

5 Qb es la concentracion de antimicrobiano B necesaria para lograr la inhibicion completa del crecimiento del microbio de ensayo cuando se emplea en combinacion con el antimicrobiano A;

QB es la concentracion de antimicrobiano B necesaria para lograr la inhibicion completa del crecimiento del microbio de ensayo cuando se emplea por sf solo.

Un mdice de sinergia (SI) de 1 indica que las interacciones entre los dos antimicrobianos son meramente aditivas, un 10 SI mayor que uno indica que los dos antimicrobianos son antagonistas entre sf, y un SI menor que 1 indica que los dos antimicrobianos interaccionan de modo sinergico.

En los siguientes ejemplos, el criterio de valoracion empleado para medir los niveles de actividad antimicrobiana se conoce como concentracion minima inhibidora ("Minimal Inhibitory Concentration", o MIC). Es la concentracion mas baja de una sustancia o sustancias que puede lograr la inhibicion completa del crecimiento.

15 Para determinar la concentracion minima inhibidora, se construye una dilucion en serie en dos veces del antimicrobiano, haciendose las diluciones en medio de crecimiento. Las diluciones se realizan en una microplaca de 96 pocillos, de modo que cada pocillo tiene un volumen final de 280 pl de medio y antimicrobiano. El primer pocillo tiene, por ejemplo, una concentracion de 1000 ppm del antimicrobiano, el segundo de 500 ppm, el tercero de 250 ppm, etc., y el 12° y ultimo pocillo de la fila no contiene antimicrobiano y actua como control de crecimiento positivo. 20 Despues de construir la dilucion en serie, los pocillos reciben un inoculo del microbio suspendido en medio de crecimiento, de modo que la concentracion final de microbios en el pocillo es de aproximadamente 5 x 105 cfu/ml. En estos ejemplos, el microbio de ensayo empleado es Lactobacillus plantarum. Los cultivos se incuban a 37 °C durante 18-24 horas, y los pocillos se puntuan como positivos o negativos para el crecimiento basandose en un examen visual para detectar pocillos turbios, siendo la turbidez un indicador del crecimiento. La concentracion mas baja de 25 antimicrobiano que inhibe completamente el crecimiento (por ejemplo, un pocillo transparente) se denomina concentracion minima inhibidora.

Para determinar si la interaccion entre dos antimicrobianos es aditiva, antagonica o sinergica contra un microbio diana, se emplea una modificacion del metodo MIC, conocido como metodo de "tablero de ajedrez", usando microplacas de 96 pocillos. Para construir una placa de tablero de ajedrez, se disminuye el contenido en el primer 30 antimicrobiano empleando el metodo de dilucion en serie en dos veces para construir una placa de MIC, excepto que cada una de las ocho filas es una dilucion en serie identica que termina despues de la octava columna. Se disminuye el contenido en el segundo antimicrobiano anadiendo volumenes identicos de una dilucion en serie en dos veces en los angulos derechos a la primera serie. El resultado es que cada pocillo del cuadrado de 8 x 8 pocillos tiene una combinacion diferente de concentraciones de antimicrobiano, que produce 64 combinaciones diferentes en 35 total. Las columnas 9 y 10 no reciben antimicrobiano y actuan como controles del crecimiento positivo y negativo, respectivamente. Despues de construir la microplaca de tablero de ajedrez, esta se inocula con Lactobacillus plantarum, se incuba a 37 °C, y se puntua como se describio para el metodo MIC.

Ejemplo 1: Sinergia del acido cftrico con los acidos del lupulo

Se determinaron las concentraciones mmimas inhibidoras para el acido cftrico y los acidos del lupulo a pH 6 40 empleando el protocolo descrito anteriormente con Lactobacillus plantarum como microbio de ensayo. Se construyeron placas de sinergia de tablero de ajedrez como se describio, los pocillos se inocularon hasta una concentracion final de aproximadamente 5 x 105 cfu/ml, se incubaron durante 18-24 horas y despues se puntuaron visualmente para el crecimiento/no crecimiento. Se calcularon los indices de sinergia segun la formula descrita por Kull et al. Este ejemplo demuestra que el efecto de combinar el acido cftrico y los acidos del lupulo es mayor que el 45 efecto de cualquiera de los antimicrobianos por sf solo. La cantidad de acido cftrico necesaria para inhibir el crecimiento bacteriano se reduce de 100.000 ppm a 391-12.500 ppm. La concentracion de los acidos del lupulo disminuye de 31,3 ppm a un intervalo de 1,96-15,6 ppm.

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Tabla 1

Empleado por sf solo: Empleado en combinacion

MIC del acido cftrico, (QA) ppm: MIC de los acidos del lupulo, (QB) ppm MIC del acido cftrico, (Qa) ppm MIC de los acidos del lupulo, (Qb) ppm Proporcion acido cftrico:acidos del lupulo fndice de sinergia

100000: 31,3 12500 1,96 6378:1 0,188

100000: 31,3 6250 3,91 1598:1 0,187

100000: 31,3 3125 7,81 400:1 0,281

100000: 31,3 1563 7,81 200:1 0,265

100000: 31,3 781 15,6 50:1 0,506

100000: 31,3 391 15,6 25:1 0,502

Ejemplo 2 (no segun la invencion): Sinergia del acido benzoico con los acidos del lupulo

Se determinaron las concentraciones mmimas inhibidoras para el acido benzoico y los acidos del lupulo a pH 6 empleando el protocolo descrito anteriormente con Lactobacillus plantarum como microbio de ensayo. Se construyeron placas de sinergia de tablero de ajedrez como se describio, los pocillos se inocularon hasta una concentracion final de aproximadamente 5 x 105cfu/ml, se incubaron durante 18-24 horas y despues se puntuaron visualmente para el crecimiento/no crecimiento. Se calcularon los indices de sinergia segun la formula descrita por Kull et al. Este ejemplo demuestra que el efecto de combinar el acido benzoico y los acidos del lupulo es mayor que el efecto de cualquiera de los antimicrobianos por sf solo.

Tabla 2

Empleado por sf solo: Empleado en combinacion

MIC del acido benzoico, (QA) ppm: MIC de los acidos del lupulo, (QB) ppm MIC del acido benzoico, (Qa) ppm MIC de los acidos del lupulo, (Qb) ppm Proporcion acido benzoico:acidos del lupulo fndice de sinergia

100000: 31,3 50000 1,96 25510:1 0,563

100000: 31,3 25000 1,96 12755:1 0,313

Ejemplo 3: Datos de laboratorio de fermentacion

Se realizaron evaluaciones en the National Corn-to-Ethanol Research Center, empleando extractos de acidos del lupulo y acido cftrico. Las muestras ensayadas y sus concentraciones pueden encontrarse en la figura 1 y la tabla 3. Los ensayos se realizaron para evaluar los efectos de antimicrobianos binarios sobre la produccion de etanol en pulpa de mafz producida bajo condiciones que son similares a las que se emplean en la industria del etanol para combustible. Se investigaron dos efectos espedficos: (1) la capacidad de los antimicrobianos para afectar al rendimiento del etanol y la conversion de azucares en fermentaciones que estan contaminadas por bacterias de acido lactico, y (2) la capacidad de los antimicrobianos para controlar infecciones bacterianas comparado con fermentaciones sin bacterias control. Se prepararon tres suspensiones de 160 gramos de harina de mafz, agua y enzima (al 30% en p/p de solidos secos) para cada tratamiento y control (inoculado y no inoculado). Las suspensiones se incubaron durante 90 minutos a 83 °C, se enfriaron hasta 40 °C, y despues se inocularon con L. plantarum. Despues las suspensiones se dosificaron con antimicrobiano. En las instalaciones se introdujeron dioxido de cloro, extractos de acidos del lupulo y acido cftrico en matraces Erlenmeyer de 250 ml, y las muestras se recolectaron a los 15, 30 y 60 minutos despues de la adicion del antimicrobiano. Despues se recogieron muestras en 3 momentos, se ajusto el pH de la pulpa a <5,2 mediante la adicion de 300 pi de acido 5-N sulfurico. Todas las enzimas, los nutrientes y otras rectificaciones anadidos a los matraces de fermentacion fueron preparados frescos antes del uso. Se anadio urea como una disolucion esteril de 0,2 g/ml hasta una concentracion final de 500 ppm (en p/p) basado en el contenido en nitrogeno de la urea (en p/p, basado en la masa total de la pulpa). Se preparo la enzima glucoamilasa (Spirizyme Excel, Novozymes) como una disolucion 0,25 g/ml y se anadio a una dosis de 0,066% (en p/p, basado en el peso humedo del mafz). Se anadio agua esteril para igualar el contenido total en

solidos de cada tratamiento. Todos los matraces de fermentacion se inocularon con una suspension 0,2 g/ml de levaduras (Saccharomyces cerevisiae). Esta suspension se incubo y se mezclo durante 30 minutos a 40 °C antes de la inoculacion en los matraces de fermentacion. Cada matraz de fermentacion se inoculo con 170 pi de la suspension de levaduras para lograr una concentracion inicial de 1 x 107celulas de levadura/ml. La masa de cada 5 matraz se registro despues de realizar todas las adiciones, despues se insertaron trampas de fermentacion desinfectadas dentro de cada matraz y se volvieron a pesar. Los matraces se incubaron a 32 °C con agitacion a 170 rpm en un incubador/agitador durante un total de 64 horas. El avance de la fermentacion se controlo pesando periodicamente los matraces de fermentacion durante la incubacion de 3 dfas (a las 0, 17,5, 22,5, 42,5, 48, y 64 horas despues de la inoculacion con la levadura). Las concentraciones de los sustratos (glucosa, DP2, DP3, y DP4+, 10 en los que "DPx" representa a los oligomeros de glucosa con "x" subunidades) y de los productos (etanol, glicerol, acido lactico y acido acetico) se midieron mediante HPLC al final de la fermentacion. Las muestras se prepararon para una HPLC mediante una centrifugacion para eliminar los solidos mas grandes, seguida de una filtracion a traves de filtros de jeringa de 0,45 pm y una acidificacion hasta un pH de aproximadamente 2 mediante la adicion de acido sulfurico hasta una concentracion final de 0,01 N. El pH final, las concentraciones de solidos secos totales y de 15 solidos secos disueltos, y la densidad del filtrado de cerveza se midieron despues de una incubacion durante 64 horas. Las muestras de cada matraz se cultivaron en placa para los recuentos de colonias bacterianas.

Tabla 3

Tiempo (horas): Control (*106 cfu) 5 lupulo/200 cftrico (*106 cfu) 5 lupulo/400 cftrico (*106 cfu) 10 lupulo/400 cftrico (*106cfu)

0,25: 1,30 1,30 1,01 0,745

0,5: 0,9 1,14 1,19 0,535

1: 3,47 10,7 5,28 3,19

64: 0,0334 0,00424 0,00208 0,0000167

Este ejemplo demuestra que, durante la fermentacion, 5 ppm de acidos del lupulo combinados con 200 ppm de acido cftrico son eficaces para reducir el numero de bacterias, lo cual es una cantidad sorprendentemente baja. La 20 combinacion de 5 ppm de acidos del lupulo con 400 ppm de acido cftrico produjo resultados aun mejores. La mezcla sinergica de 10 ppm de acidos del lupulo/400 ppm de acido cftrico produjo una reduccion en aproximadamente 3 unidades logarftmicas (reduccion del 99,9%) en Lactobacillus.

La figura 2 y la tabla 4 muestran los rendimientos promedio de etanol del control no infectado y las tres muestras despues de la fermentacion. No se observaron diferencias significativas en los rendimientos promedio de etanol 25 entre todos los tratamientos (P = 0,055) empleando ANOVA. En la figura 2 y la tabla 4, los datos representan el promedio de tres matraces de fermentacion por duplicado independientes.

Tabla 4

Dosificacion de lupulo/acido cftrico: Rendimiento de etanol

Control sin infeccion: 0,421

5 ppm de lupulo/200 ppm de acido cftrico: 0,427

5 ppm de lupulo/400 ppm de acido cftrico: 0,422

10 ppm de lupulo/400 ppm de acido cftrico: 0,429

El rendimiento promedio de etanol para los tratamientos se expresa como gramos de etanol por gramos de mafz seco.

Ejemplo 4: Datos del ensayo en planta

30 Se realizo una evaluacion a escala de planta en una instalacion de produccion de etanol de 55 millones de galones anuales (208197648,12 litros) para evaluar los efectos del antimicrobiano binario formado por los acidos del lupulo/acido cftrico sobre la produccion de etanol. La planta utiliza una mezcla de 50% de mafz/50% de sorgo (milo) como materia prima. Las concentraciones y proporciones de los acidos del lupulo al acido cftrico ensayadas se encuentran en la tabla 5. Se investigaron tres efectos especfticos durante este ensayo: (1) el efecto sobre los niveles

35 de glicerol, (2) el efecto sobre los niveles de acido lactico, y (3) el efecto sobre los niveles de acido acetico. En la planta se construye un propagador de proceso discontinuo aproximadamente cada 17 horas para entregarlo al comienzo de una etapa de carga de fermentacion/SSF (sacarificacion y fermentacion simultaneas). En la hora 1 se

empezo a llenar el recipiente de propagacion hasta un volumen de trabajo de 47317,6 l (12.500 galones) con 15% de solidos de la pulpa y se anaden 45,4 kg (100 libras) de urea en este momento. En la hora 2 se anaden 11,4 l (3 galones) de Provia (una proteasa disenada para mezclas de sorgo) y 30 kg de Beta-Tec (Vita-Hop) a traves del tanque de disparo cuando el propagador esta lleno al 67%. En la hora 3 se anade el extracto de isoacidos del lupulo 5 a traves de la parte superior del recipiente de propagacion (la cantidad vana, vease la tabla 5). Despues se anadieron 200 ml de glucoamilasa por la parte superior del recipiente de propagacion, seguidos de 60 kg de levaduras ftquidas SLY a traves del tanque de disparo. Despues se enjuaga el tanque de disparo. Despues se anade acido cftrico (vease la tabla 5) al recipiente de propagacion a traves del tanque de disparo y el montaje del propagador ya esta completo. En la hora 5 se miden los analisis de calidad/actuacion de las levaduras midiendo el 10 pH, Brix, temperatura, porcentaje de gemacion, recuento de celulas y porcentaje de viabilidad. En la hora 8 se repiten las mediciones y se realiza el ensayo de HPLC para determinar DP4, DP3, maltosa, dextrosa, acido lactico, glicerol, acido acetico y porcentaje de etanol. En la hora 9, el volumen del propagador se envfa al fermentador. Las figuras 3, 4 y 5 son diagramas de control que muestran los datos estadfsticos generados. En las figuras se indica el UCL (ftmite de control superior) y el LCL (ftmite de control inferior). Las bacterias de acido lactico metabolizan los 15 azucares y producen acido lactico y acido acetico. Las figuras 3 y 4 demuestran que los acidos acetico y lactico fueron administrados suficientemente, lo cual demuestra que la combinacion de acidos del lupulo/acido cftrico mantiene el control microbiano en la planta de etanol. Las mediciones de glicerol, que indican la salud de las levaduras, demuestran que la mezcla de acidos del lupulo/acido cftrico no afecta a la actuacion de S. cerevisiae (figura 5). La instalacion funciono correctamente en todas las dosificaciones, en la que los acidos del lupulo se 20 redujeron en al menos 42% de la dosificacion historica.

Tabla 5

Volumen de 30% de acidos del lupulo anadido al propagador (galones): Volumen de 50% de acido cftrico anadido al propagador (galones) Concentracion correspondiente de lupulo (ppm) Concentracion correspondiente de acido cftrico (ppm) Proporcion de lupulo:cftrico

1,36 (5,14 l): 24 (90,8 l) 34 1000 1:29

1,42 (5,37 l): 25 (94,6 l) 35,5 1042 1:29

1,48 (5,60 l): 28,8 (109,0 l) 37 1200 1:32

1,6 (6,06 l): 24 (90,8 l) 40 1000 1:25

1,67 (6,32 l): 25 (94,6 l) 41,75 1042 1:25

1,8 (6,81 l): 24 (90,8 l) 45 1000 1:22

Claims

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REIVINDICACIONES

1. - Un metodo para controlar la concentracion de microorganismos indeseables en una disolucion acuosa empleada en un proceso de fermentacion, comprendiendo dicho metodo las etapas de:

(a) introducir un carbohidrato fermentable en la disolucion acuosa;

(b) introducir al menos una levadura en la disolucion;

(c) introducir un extracto de acidos del lupulo en la disolucion; y

(d) introducir al menos un acido organico, o una de sus sales, en la disolucion,

en el que el microorganismo indeseable es una bacteria productora de acido lactico y el acido organico es acido cftrico.
2. - El metodo de la reivindicacion 1, en el que dichas etapas se realizan de modo secuencial.
3. - El metodo de la reivindicacion 1 o 2, en el que la cantidad de extracto de acidos del lupulo en la disolucion acuosa comprende de 1 ppm a 100 ppm.
4. - El metodo de la reivindicacion 3, en el que la cantidad de extracto de acidos del lupulo en la disolucion acuosa comprende de 2 ppm a 70 ppm.
5. - El metodo de la reivindicacion 3, en el que la cantidad de extracto de acidos del lupulo en la disolucion acuosa comprende de 5 ppm a 50 ppm.
6. - El metodo de la reivindicacion 3, en el que la cantidad de extracto de acidos del lupulo en la disolucion acuosa comprende de 5 ppm a 45 ppm.
7. - El metodo de la reivindicacion 1 o 2, en el que el extracto de acidos del lupulo se encuentra en una dosificacion de al menos 5 ppm.
8. - El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el acido organico, o su sal, se encuentra en una dosificacion de 100 ppm.
9. - El metodo de la reivindicacion 8, en el que el acido organico, o su sal, se encuentra en una dosificacion de al menos 200 ppm.
10. - El metodo de la reivindicacion 8, en el que el acido organico, o su sal, se encuentra en una dosificacion de al menos 300 ppm.
11. - El metodo de la reivindicacion 1, en el que la proporcion en peso de extracto de acidos del lupulo a acido cftrico, o su sal, es de 1:10 a 1:6500.
12. - El metodo de la reivindicacion 11, en el que la proporcion en peso de extracto de acidos del lupulo a acido cftrico, o su sal, es de 1:20 a 1:6400.
13. - El metodo de la reivindicacion 11, en el que la proporcion en peso de extracto de acidos del lupulo a acido cftrico, o su sal, es de 1:10 a 1:200.
14. - El metodo de la reivindicacion 11, en el que la proporcion en peso de extracto de acidos del lupulo a acido cftrico, o su sal, es de 1:25 a 1:100.