BR112015021883B1

BR112015021883B1 - Métodos para controle da concentração de microrganismos indesejáveis em uma solução aquosa empregada em um processo de fermentação

Info

Publication number: BR112015021883B1
Application number: BR112015021883-0A
Authority: BR
Inventors: John S. Chapman; Corinne E. Consalo
Original assignee: Solenis Technologies Cayman, L.P.
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2014-03-14
Publication date: 2021-07-20
Also published as: BR112015021883A8; BR112015021883A2; HUE039660T2; CN105051199B; ES2683385T3; EP2971017A1; CN105051199A; PL2971017T3; US8778646B1; CA2901154C; WO2014143938A1; EP2971017B1; UA118188C2; CA2901154A1

Abstract

métodos para controle da concentração de microrganismos indesejáveis em uma solução aquosa empregada em um processo de fermentação. a presente invenção refere-se a um método de redução da concentração de micro-organismos indesejáveis, não método compreendendo (a) introdução de uma quantidade de carboidrato fermentável, açúcar ou celulose em um sistema aquoso, (b) introdução de uma quantidade de micro-organismo desejável no sistema aquoso, (c) introdução de um extrato de ácido de lúpulo no sistema aquoso e (d) introdução de uma solução de ácido orgânico no sistema citado.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente tecnologia se refere de maneira geral ao contro le microbiano durante processos de fermentação. Em particular, a pre sente tecnologia envolve um método para se reduzir ou controlar a concentração de micro-organismos indesejáveis.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Micro-organismos, tais como leveduras, fungos e bactérias, são utilizados na produção de uma série de produtos fermentados, tais como etanol de grau industrial, bebidas destiladas, cerveja, vinho, far macêuticos e nutracêuticos (produtos alimentícios que proveem bene fícios para saúde, tais como alimentos fortificados e complementos alimentares), em confeitaria e na química industrial.

[003] As leveduras são comumente utilizadas nos processos de fermentação. Um dos tipos mais comuns de levedura é a Saccha- romyces cerevisiae, esta espécie é usada predominantemente na pa nificação e na fermentação. As leveduras não pertencentes ao gênero das Saccharomyces são conhecidas também por leveduras não con vencionais e são utilizadas em uma série de produtos comerciais.

[004] Outros micro-organismos também podem ser úteis na fabri cação de produtos fermentados. Por exemplo, a produção de etanol celulósico, que é a produção de etanol a partir da biomassa de celulo se, utiliza fungos e bactérias. Entre os exemplos de fungos celulóticos estão o Trichoderma reesei e o Trichoderma viride. Um dos exemplos de bacteria que pode ser utilizada na produção de álcool celulósico é a Clostridium Ijungdahlii.

[005] A maioria das leveduras utilizadas nas destilarias e nas usi- nas de álcool combustível são compradas de fabricantes de leveduras especiais. A levedura é fabricada através de um processo de propaga ção. A propagação envolve o cultivo de uma grande quantidade de le vedura a partir de uma pequena cultura laboratorial de levedura. Du rante a propagação, a levedura recebe oxigênio, nitrogênio, açúcares, proteínas, lipídios e íons que são necessários ou desejáveis para o crescimento ótimo por respiração aeróbica.

[006] Já na destilaria, a levedura pode passar por condiciona mento. O condicionamento é diferente da propagação uma vez que não envolve o cultivo de grande quantidade de levedura a partir de uma pequena cultura laboratorial. Durante o condicionamento, promo ve-se a reidratação da levedura e o fim da hibernação, permitindo-se o maior crescimento e a reprodução. O objetivo tanto da propagação quanto do condicionamento é fornecer um grande volume de levedura para o tanque de fermentação com alta viabilidade, elevado brotamen- to e nível reduzido de infecção por outros micro-organismos.

[007] Depois da propagação e/ou do condicionamento, a levedu ra entra no processo de fermentação. A levedura é então combinada em uma solução aquosa a açúcares fermentáveis. A levedura conso me os açúcares, convertendo-os em álcoois alifáticos, como o etanol.

[008] O processo de fermentação começa com o preparo de um carboidrato fermentável. Na produção de etanol, o milho é uma das fontes viáveis de carboidrato fermentável. Outras fontes de carboidra tos como os cereais e materiais com celulose-amido, tais como o trigo e o sorgo, também poderiam ser substituídas. Também pode de utili zar biomassa celulósica como palha e talos de milho. A produção de etanol celulósico tem recebido maior atenção recentemente por usar biomassa não comestível diretamente disponível para produção de um combustível valioso.

[009] Os processos de propagação, condicionamento e fermen- tação podem ser realizados utilizando a metodologia de fabricação em lotes ou fabricação continua. O método de fabricação em lotes é usado para produção em baixa escala. Cada lote é terminado antes do início de um novo. Já o método de fabricação continua é utilizado na produ ção em larga escala porque fornece um suprimento contínuo sem a necessidade de se reiniciar o processo a toda hora. Pode se utilizar a mistura de ácido de lúpulo e o ácido orgânico tanto no método de fa bricação em lotes quanto no de fabricação continua.

[0010] Durante os processos de propagação, condicionamento e fermentação, o mosto ou a mistura de fermentação podem ser conta minados com outros micro-organismos, tais como bactérias deteriora- doras. Estes micro-organismos competem com a espécie desejada de levedura pelos açúcares fermentáveis e retardam a reação bioquímica desejada resultando em menor produtividade. Eles também podem gerar subprodutos indesejáveis, os quais podem causar a deterioração de lotes inteiros de fermentação.

[0011] Os produtores de etanol tentam aumentar a quantidade de etanol produzido por alqueire de grão cultivado (aproximadamente 56 libras (25,4 quilogramas)). A contaminação por outros micro organismos reduz a eficiência da levedura, tornando difícil se obter ou exceder os 2,8-2,9 galões de etanol por alqueire (de 0,42 a 0,44 litros por quilograma). A redução da concentração de micro-organismos es timulará a propagação e/ou condicionamento, assim aumentando a eficiência da levedura e tornando possível se obter ou exceder aqueles níveis desejados.

[0012] Durante qualquer um destes três processos, a levedura po de ser contaminada por leveduras indesejáveis, bactérias ou outros micro-organismos indesejáveis. Isto pode ocorrer em um dos muitos recipientes utilizados na propagação, condicionamento ou fermenta ção. Isto inclui, mas não se limita a, tanques de propagação, tanques de condicionamento, tanques de partida, tanques de fermentação e encanamentos e permutadores térmicos entre estas unidades.

[0013] A contaminação bacteriana ou microbiana reduz a produti vidade da fermentação principalmente de três formas. Primeiro, os açúcares que deveriam estar disponíveis para a levedura transformar em álcool são consumidos pelas bactérias ou outros micro-organismos indesejáveis e assim desviados da produção de álcool, reduzindo a produtividade. Segundo, os produtos finais do metabolismo bacteriano, tais como o ácido láctico e o ácido acético, inibem o crescimento da levedura e a fermentação/respiração da levedura, o que resulta em menor produtividade. Por fim, a bactéria ou outros micro-organismos indesejáveis competem ainda com as leveduras pelos outros nutrien tesalém do açúcar.

[0014] Uma vez que o sistema ou o recipiente de fermentação seja contaminado por bactérias ou outros micro-organismos indesejáveis, estas bactérias ou outros micro-organismos podem crescer muito mais rapidamente do que a levedura desejada. As bactérias ou os outros micro-organismos competem com a levedura pelos açúcares fermen táveise retardam a reação bioquímica desejada, resultando em menor produtividade. As bactérias também produzem subprodutos químicos indesejáveis, os quais podem arruinar lotes inteiros de fermentação. A remoção destas bactérias ou de outros micro-organismos indesejáveis permite que a levedura se desenvolva, resultando em uma produção mais eficiente.

[0015] Mesmo uma redução de apenas 1% na produção de etanol é altamente significativa para a indústria de etanol combustível. Em uma usina de grande porte, uma redução da eficiência desta magnitu de reduziria a receita de 1 milhão a 3 milhões de dólares por ano.

[0016] Alguns dos métodos de redução da contaminação por bac térias e outros micro-organismos indesejáveis durante as etapas de propagação, condicionamento e fermentação se aproveitam da maior tolerância térmica e de pH das leveduras em relação a outros micro organismos. Isto é possível através do aquecimento ou acidificação de uma solução com leveduras. Contudo, esses processos não são intei ramente eficazes na redução do crescimento bacteriano. Além disto, as leveduras que sobrevivem ficam estressadas e menos vigorosas e saudáveis. Assim, as leveduras não apresentam seu melhor desem penho.

[0017] A principal tendência na indústria alcooleira é reduzir o pH do mosto (matéria prima) para menos de 4,5 no início da fermentação. A redução do pH da mistura reduz a população de algumas espécies de bactérias, mas é muito menos eficaz na redução de bactérias pro blemáticas, tais como as bactérias produtoras de ácido láctico. Este método também reduz significativamente a produção de etanol ao es- tressar a levedura utilizada para a produção de etanol.

[0018] Outra abordagem envolve a lavagem da levedura com áci dofosfórico. Este método não mata de forma eficaz as bactérias e ou tros micro-organismos. Ele também pode estressar a levedura utilizada para a produção de etanol, diminuindo assim a sua eficiência.

[0019] Ainda um outro método consiste em utilizar calor ou produ tosquímicos para esterilizar os equipamentos utilizados no processo entre um lote e outro. Este é ineficaz para matar bactérias e outros mi cro-organismos na mistura de leveduras durante a produção.

[0020] Ainda em outro método, são adicionados antibióticos nos lotes de propagação, condicionamento ou fermentação da levedura a fim de neutralizar bactérias. As indústrias de fermentação aplicam co- mumente os antibióticos nos processos de condicionamento, propaga ção e fermentação. As dosagens de antibióticos variam de 0,1 a 3,0 mg/L e, geralmente, não são superiores a 6 mg/L. Contudo, existem problemas na utilização de antibióticos nos processos de condiciona- mento, propagação e fermentação. Os antibióticos são caros e podem contribuir grandemente para aumentar os custos da produção em larga escala. Além disso, os antibióticos não são eficazes contra todas as cepas de bactérias, tais como as cepas de bactérias resistentes a an tibióticos. O uso excessivo de antibióticos pode levar à criação de vari antes adicionais das cepas de bactérias resistentes a antibióticos.

[0021] Os resíduos de antibióticos e o estabelecimento de cepas resistentes aos antibióticos é um problema global. Estas preocupações podem levar inclusive a ações futuras contra o uso de antibióticos. Uma das áreas onde há mais preocupação é a de grãos de destilaria, os quais são muito utilizados para a alimentação animal. Grãos de destilaria são o resíduo do processo de fermentação. Países europeus não permitem que os subprodutos de usinas de etanol sejam vendidos como ração animal caso sejam utilizados antibióticos na instalação. A venda dos grãos de destilaria corresponde a até 20% da receita de uma usina de etanol. A concentração de antibiótico no subproduto po de variar de 1-3% do peso, negando assim esta importante fonte de renda.

[0022] Além disso, há outras questões a serem consideradas quando se utilizam antibióticos. As misturas antibióticas devem ser constantemente alteradas e balanceadas a fim de se evitar a utilização continua de um tipo de antibiótico que poderia levar ao estabelecimen to de cepas resistentes a antibióticos. Por vezes, a quantidade eficaz do antibiótico não pode ser adicionada à mistura de fermentação. Por exemplo, utilizando-se mais de 2 mg/L de virginiamicina suprimir-se-á a fermentação, mas são necessários 25 mg/L para inibir o crescimento da Weisella confusa, uma cepa bacteriana emergente problemática. A superdosagem ou o uso excessivo de antibióticos pode estressar a levedura e impactar sua eficiência ou causar inconformidade regulató- ria.

[0023] As indústrias que empregam processos de fermentação pa ra bebidas têm historicamente utilizado ácidos de lúpulo na propaga ção e na fermentação a fim de controlar micróbios não desejados que competem com a levedura por nutrientes. Com a recente expansão das usinas de álcool combustível, os ácidos de lúpulo têm sido pouco utilizados no controle de micróbios não desejados. A competição entre as leveduras e os micróbios indesejados resulta em perda na produti vidade de etanol combustível uma vez que os micróbios indesejáveis, principalmente Lactobacillus e Acetobacter, reduzem a eficiência da fermentação. Na produção de bebidas, os micróbios indesejáveis po dem,além de reduzir a eficiência da produção, alterar as característi casestéticas e de paladar do produto final.

[0024] Os ácidos orgânicos possuem muitas aplicações, sendo utilizados inclusive como acidificantes, tampões, antioxidantes, agen tes quelantes, agentes sinérgicos, complementos alimentares, agentes aromatizantes, conservantes e antimicrobianos. Os ácidos orgânicos têm sido utilizados como conservantes por causa de seu efeito sobre as bactérias. A ação dos ácidos orgânicos se deve a penetração do ácido não dissociado na parede celular das bactérias por difusão pas siva e na perturbação da sua fisiologia normal de duas maneiras: os ácidos se dissociam e assim baixam o pH interno, o qual é normal mentepróximo de neutro, prejudicando o funcionamento da bactéria; e a parte aniônica do ácido que é incapaz de deixar a célula na sua for ma dissociada se acumula dentro dela, prejudicando suas funções me tabólicase aumentando a pressão osmótica.

[0025] Uma vez que mesmo pequenas reduções na produtividade de etanol se mostram altamente significativas na indústria alcooleira, os produtores de álcool buscam constantemente por formas de au mentar sua eficiência. Os antimicrobianos são utilizados para eliminar, reduzir ou controlar o número de micróbios nos sistemas aquosos. Contudo, o uso de antimicrobianos irá sempre onerar a operação e os produtos e, portanto, buscam-se sempre maneiras mais eficientes de se atingir o controle microbiano. Além disto, alguns antimicrobianos podem apresentar deficiências tanto no seu espectro de ação antimi- crobiana quanto no seu limite operacional na sua forma de aplicação, tais como falta de estabilidade térmica ou suscetibilidade à inativação por fatores químicos ou ambientais.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0026] A Figura 1 é um gráfico ilustrando as concentrações bacte- rianas em pontos temporais após a adição de antimicrobiano e ao fim da fermentação (64 horas).

[0027] A Figura 2 é um gráfico ilustrando a produtividade média de etanol conforme cada tipo de tratamento expressa em gramas de eta- nol por grama de milho seco.

[0028] A Figura 3 é um gráfico ilustrando o controle de ácido acéti co em várias fermentações em um experimento industrial.

[0029] A Figura 4 é um gráfico ilustrando o controle de ácido lácti co em várias fermentações em um experimento industrial.

[0030] A Figura 5 é um gráfico ilustrando o controle do glicerol em várias fermentações em um experimento industrial.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[0031] Na combinação de um ácido orgânico e ácidos de lúpulo no condicionamento, propagação e fermentação, determinou-se que não só os ácidos de lúpulo são compatíveis com o ácido orgânico, mas que eles atuam de forma sinérgica quando ambas as tecnologias são apli cadas simultaneamente. A combinação destes produtos proporciona um tratamento antimicrobiano não antibiótico poderoso. A invenção pode ser utilizada na redução da concentração de micro-organismos indesejados, promovendo a propagação dos micro-organismos dese jáveis, e aumentando a eficiência dos micro-organismos desejáveis em um sistema aquoso.

[0032] Aqui a medida ppm se refere a massa por volume, ou seja, 1 ppm é igual a 1 mg (ativo) por litro. A dosagem é definida como a concentração do componente no sistema sendo tratado.

[0033] Aqui o termo "ácido orgânico" também se refere ao seu sal. Por exemplo, quando o termo ácido cítrico é utilizado, ele inclui o sal de ácido cítrico. Todas as referências a ácidos orgânicos se referem também aos seus sais.

[0034] Os termos "ácido de lúpulo"e "extrato de ácido de lúpulo" são utilizados de forma intercambiável.

[0035] Em um dos aspectos da invenção, descreve-se um método de controle da concentração de micro-organismos indesejáveis em um Sistema aquoso empregado em um processo de fermentação. Tal método consiste nas etapas de:

[0036] (a) introdução de um carboidrato fermentável em um siste ma aquoso;

[0037] (b) introdução de pelo menos uma levedura no tal sistema;

[0038] (c) introdução de um extrato de ácido de lúpulo no tal sis tema; e

[0039] (d) introdução de pelo menos um ácido orgânico no tal sis tema.

[0040] Em um aspecto da invenção, descreve-se um método para se controlar a concentração de micro-organismos indesejáveis em uma solução fluida aquosa empregada em um processo de fermenta ção. Tal método consiste nas etapas de:

[0041] (a) introdução de um carboidrato fermentável a um sistema aquoso;

[0042] (b) introdução de pelo menos um micro-organismo capaz de fermentar o carboidrato no referido sistema aquoso;

[0043] (c) introdução de pelo menos um extrato de ácido de lúpulo no referido sistema aquoso; e

[0044] (d) introdução de pelo menos um ácido orgânico no referido sistema aquoso.

[0045] A redução da produção residual de antibiótico em um pro cesso de fermentação pode ser atingida através da utilização dos mé todos da invenção aqui descritos. Ao serem utilizados os métodos da invenção, pode-se utilizar pouco ou nenhum antibiótico no processo de fermentação resultando na menor produção de subprodutos.

[0046] Em uma das modalidades não limitantes do presente méto do para redução da concentração de micro-organismos indesejáveis e promoção da propagação do micro-organismo desejável com aumento da eficiência do micro-organismo desejável em um sistema aquoso consiste na (a) introdução de um carboidrato fermentável no sistema aquoso, (b) introdução de pelo menos uma levedura ou micro organismodesejável no sistema aquoso e (c) colocação de um extrato de ácido de lúpulo e um ácido orgânico em contato com o carboidrato fermentável e ou levedura. O ácido orgânico preferido é o ácido cítrico.

[0047] Estas etapas da invenção podem ser realizadas sequenci almente ou em diferentes ordens. Os ácidos de lúpulo e o ácido orgâ nico podem ser colocados em contato com a levedura ou com o car boidrato de fermentação, ou a levedura e o carboidrato fermentável podem ser combinados para só então serem introduzidos o ácido de lúpulo e o ácido orgânico nesta combinação. O extrato de ácido de lú pulo e pelo menos um ácido orgânico podem ser misturados e então adicionados ao sistema aquoso ou podem ser adicionados separada mente ao sistema aquoso. O sistema aquoso pode estar inserido em um processo contínuo os consistir em um tanque no caso do processo ser realizado em etapas.

[0048] Outra modalidade não limitante do presente método para redução da concentração de micro-organismos indesejáveis, promo- ção da propagação da levedura e aumento da eficiência da levedura em um sistema aquoso consiste na (a) introdução de uma quantidade de carboidrato fermentável em um sistema aquoso, (b) introdução de uma quantidade de levedura ao sistema aquoso, e (c) colocação de extrato de ácido de lúpulo e pelo menos um ácido orgânico em contato com o carboidrato fermentável e ou a levedura. Estas etapas podem ser realizadas de forma sequencial ou em diferentes ordens. O extrato de ácido de lúpulo e o ácido orgânico podem ser misturados e então adicionados ao sistema aquoso ou adicionados separadamente ao sis tema aquoso.

[0049] No método exposto acima, os micro-organismos "indesejá veis" que se pretende reduzir são aqueles que competem por nutrien tes com o micro-organismo desejável responsável pela promoção do processo de fermentação desejado. Os micróbios indesejados ou in desejáveis na fermentação incluem as bactérias produtoras de ácido láctico (BAL) e as bactérias produtoras de ácido acético, das quais são representantes proeminentes os Lactobacillus e as Acetobacter. Po dem ser considerados indesejáveis todos os micróbios que compitam pelo substrato fermentável, negando-o ao organismo fermentador pre tendido e, portanto, sendo responsável pela redução da produtividade. Neste quesito, o extrato de ácido de lúpulo e o ácido orgânico empre gados no presente método não afetam de forma prejudicial o cresci mento e a viabilidade dos micro-organismos fermentadores desejáveis, mas eliminam ou suprimem o crescimento de micro-organismos inde sejáveis que interferem no processo de fermentação. Mais além, a eliminação de micro-organismos indesejáveis possui um efeito favorá vel sobre o crescimento e a viabilidade dos micro-organismos desejá-veis.

[0050] O pH do sistema aquoso a ser tratado é em geral de 3 a 11, ou de 3 a 7, ou de 4 a 9, ou de 4 a 8, ou de 4 a 6,5, ou de 4,5 a 6. Em geral, os ácido orgânicos trabalham melhor em sistemas cujo pH seja inferior a pelo menos um dos valores de pKa do ácido os de seu sal.

[0051] Exemplos adequados e não limitadores de ácidos orgânicos úteis na presente invenção incluem, mas não se limitam a, o ácido cí trico, o ácido benzoico, o ácido propiônico, o ácido tartárico, o ácido acético, o ácido benzenossulfônico, o ácido oxálico, o ácido málico, o ácido salicílico, o ácido láctico, o ácido glucônico, o ácido hidroxiacéti- co e seus sais. Para os propósitos desta invenção, o ácido orgânico não é um ácido de lúpulo. Os ácidos cítrico, benzoico e propiônico são os ácidos preferidos. O ácido cítrico é o ácido preferido para a inven ção.

[0052] Os exemplos de ácido de lúpulo que podem ser utilizados nesta invenção incluem, mas não se limitam a, os compostos de beta- ácidos, alfa-ácidos, iso-alfa-ácidos, rho-iso-alfa-ácidos, tetra-iso-alfa- ácidos, hexa-iso-alfa-ácidos e folhas de lúpulo. As dosagens de extrato de ácido de lúpulo no sistema aquoso sendo tratado na forma desta invenção podem variar de pelo menos 0,5 ppm a menos de 120 ppm, de 1 ppm a 100 ppm, de 2 a 70 ppm, de 5 a 50 ppm, ou de 5 a 45 ppm. Pode-se utilizar na invenção dosagens de extrato de ácido de lúpulo de no mínimo 0,5 ppm ou de 2 a 15 ppm, de 5 a 15 ppm ou de 5 a 10 ppm.

[0053] Em algumas modalidades não limitantes, a solução sinérgi- ca consiste em extratos ácido de lúpulo e o ácido cítrico ou sais do mesmo em proporções de 1:10 a 1:6500, 1:15 a 1:6400, 1:20 a 1:6400, 1:20 a 1:1600, 1:25 a 1:500, 1:25 a 1:100 ou de 1:10 a 1:200.

[0054] Em algumas modalidades não limitantes, a solução sinérgi- ca consiste em extratos ácido de lúpulo e o ácido propiônico ou seu sal em proporções de 1:12,5 a 1:800, preferivelmente de 1:12,5 a 1:400, preferivelmente de 1:12,5 a 1:50 ou de 1:10 a 1:6500, ou 1:25 a 1:6400, ou de 1:25 a 1:1600, ou de 1:25 a 1:500.

[0055] Em algumas modalidades não limitantes, a solução sinérgi- ca consiste em extratos ácido de lúpulo e o ácido benzoico ou seu sal em proporções de 1:50 a 1:400, preferivelmente de 1:50 a 1:200.

[0056] Os ácidos de lúpulo e os ácidos orgânicos podem ser adici onados de uma única vez ou em diferentes partes do processo de fer-mentação, inclusive nos tanques de mistura, cozedores, resfriadores da mistura, propagadores e tanques de fermentação. Aqueles compe tentes na área também poderão identificar outros pontos de adição. Os ácidos de lúpulo e os ácidos orgânicos podem ser adicionados a um recipiente do processo tal como um tanque de condicionamento que possa ser aquecido e realizar liquefação, ou a um recipiente de propa gação da levedura. O recipiente do processo também pode ser um tanque de fermentação.

[0057] No presente método, as concentrações de bactérias e ou tros micro-organismos indesejáveis são reduzidas enquanto se enco raja a propagação e/ou condicionamento dos micro-organismos dese jáveis.

[0058] Descobriu-se que a combinação de extratos de ácido de lúpulo com pelo menos um ácido orgânico é eficiente na redução da concentração de bactérias e outros micro-organismos indesejáveis ao mesmo tempo em que encorajam a propagação e/ou condicionamento dos micro-organismos desejáveis. A combinação destes produtos pro vê um tratamento antimicrobiano sinérgico sem o uso de antibióticos.

[0059] Descobriu-se que ao se adicionar uma pequena quantidade de extrato de ácido de lúpulo, por exemplo, em torno de menos de 0,5 ppm e menos de 120 ppm (conforme mensurado no sistema sendo tratado) ou entre 1 ppm e 100ppm, ou entre 2 e 70 ppm ou entre 5 e 50 ppm ou entre 5 e 45 ou de 5-10 ppm, em conjunto com pelo menos um ácido orgânico, preferivelmente o ácido cítrico, obtêm-se como re sultado um efeito sinérgico. Em algumas modalidades não limitantes, os ácidos de lúpulo são adicionados simultaneamente com o ácido or gânico. Em outras modalidades, o ácido de lúpulo é adicionado de forma separada do ácido orgânico ao sistema sendo tratado. A adição dos extratos de ácido de lúpulo em conjunto com ácidos orgânicos re sulta em uma melhor eficiência antimicrobiana.

[0060] A produção de etanol combustível através da fermentação por leveduras é utilizada como exemplo. Contudo, esta é meramente uma ilustração. Outros produtos fermentados cuja produção poderia empregar a combinação de ácidos de lúpulo e os ácidos orgânicos, preferivelmente o ácido cítrico, poderiam incluir bebidas destiladas, cerveja, vinho, produtos farmacêuticos, intermediários farmacêuticos, produtos de confeitaria, nutracêuticos (alimentos que provêm benefí cios para saúde, tais como alimentos fortificados e complementos ali mentares),intermediários nutracêuticos, matérias primas para a indús tria e enzimas. O presente método poderia ainda ser utilizado para tra tar leveduras usadas na confeitaria.

[0061] As leveduras do gênero Saccharomycessão um tipo útil de levedura, tal como a Saccharomyces cerevisiae. Outras leveduras não pertencentes ao gênero das Saccharomycestambém podem ser utili zadas nesta invenção. As leveduras não são os únicos micro organismos utilizados na fermentação. A invenção ainda pode utilizar e beneficiar outros micro-organismos fermentadores desejáveis, tais como os fungos e bactérias habitualmente utilizados na produção de etanol celulósico. Os exemplos de micro-organismos fermentadores desejáveis são, mas não se limitam a, o Trichoderma reesei, o Tricho- derma viride, e a Clostridium Ijungdahlii.

[0062] Os extratos de ácido de lúpulo são úteis para matar bacté rias, ao mesmo tempo em que permitem que a levedura ou outros mi cro-organismos produtores desejáveis sobrevivam e prosperem. As indústrias que utilizam a fermentação usam habitualmente os extratos de ácido de lúpulo na propagação e fermentação.

[0063] O ácido de lúpulo e o ácido orgânico podem ser adiciona dos em vários pontos dos processos de propagação, condicionamento e/ou de fermentação. O ácido de lúpulo e o ácido orgânico podem ser adicionados nos recipientes de cozimento, tanques de fermentação, tanques de propagação, tanques de condicionamento, tanques de par tida ou durante a liquefação. O ácido de lúpulo e o ácido orgânico ain da podem ser adicionados diretamente ao mosto de milho. O ácido de lúpulo e o ácido orgânico ainda podem ser adicionados ao sistema de troca de calor entre os estágios ou nos trocadores de calor. O ácido de lúpulo e o ácido orgânico ainda podem ser adicionados ao encana mento entre estas unidades ou trocadores de calor.

[0064] O ácido de lúpulo e o ácido orgânico podem ser adiciona dos diretamente em uma mistura de fermentação. Isto pode ser feito ao se adicionar o ácido de lúpulo e o ácido orgânico em conjunto com a levedura ou outro micro-organismo desejável e o carboidrato fermen- tável, por exemplo, durante o estágio SFS (Sacarificação e Fermenta ção Simultânea).

[0065] Em uma modalidade não limitante, podem-se adicionar do sagens de extrato de ácido de lúpulo de pelo menos 0,5 ppm e meno res que 120 ppm ou entre 1 ppm e 100 ppm, ou entre 2 e 70 ppm ou entre 5 e 50 ppm ou entre 5 e 45 ppm, ou uma dosagem a partir de 2 e 15 ppm ou uma dosagem a partir de 3 e 10 ppm ou dosagens a partir de 5 e 10 ppm e dosagens de ácido orgânico entre 100 e 2000 ppm ou maiores que ou entre 200 e 1000 ppm diretamente à mistura de fer mentação. O ácido orgânico é preferivelmente o ácido cítrico, o ácido benzoico ou o ácido propiônico.

[0066] O ácido de lúpulo e o ácido orgânico ainda podem ser adi cionadosà mistura antes do processo de fermentação. Dosagens de extrato de ácido de lúpulo de pelo menos 0,5 ppm e menores que 120 ppm ou entre 1 ppm e 100 ppm, ou entre 2 e 70 ppm, ou entre 5 e 50 ppm, ou entre 5 e 45, ou entre 2 e 15 ppm, ou entre 5 e 15 ppm, ou entre 5 e 10 ppm, e dosagens de ácido orgânico entre 100 e 2000 ppm ou maiores podem ser adicionadas à mistura antes da fermentação.

[0067] O ácido de lúpulo e o ácido orgânico ainda podem ser adi cionados durante a propagação e/ou condicionamento. Os extratos de ácidos de lúpulo podem, por exemplo, ser adicionados à mistura de levedura substituindo uma etapa de lavagem ácida.

[0068] O ácido de lúpulo em conjunto com o ácido orgânico pode ser usado para se obter melhores resultados na produção de etanol celulósico. O etanol celulósico é um tipo de etanol que é produzido a partir de celulose, ao invés de ser produzido a partir de açúcares e amido como o etanol a base de carboidratos. A celulose está presente em fontes de biomassa não tradicionais tais como a Panicum virgatum, palha de milho e madeira. Este tipo de produção de etanol é particu larmente atraente devido à grande disponibilidade de fontes de celulo se. O etanol celulósico, pela própria natureza de sua matéria prima, introduz altos níveis de contaminantes e micro-organismos competido res ao processo de fermentação. O ácido de lúpulo em conjunto com o ácido orgânico pode ser usado na produção de etanol celulósico para controlar micro-organismos indesejáveis.

[0069] Existem dois processos primários de produção de álcool a partir de celulose. Um dos processos é um processo de hidrólise que utiliza fungos como, por exemplo, o Trichoderma reesei e/ou o Tricho- derma viride. O outro é um processo de gaseificação que utiliza bacté rias como a Clostridium Ijungdahlii. A combinação de ácido de lúpulo e ácido orgânico pode ser utilizada em ambos os processos.

[0070] No processo de hidrólise, as cadeias de celulose são que bradas em cinco carbonos e seis açúcares de carbono antes do pro cesso de fermentação. Isto pode ser realizado quimicamente ou enzi- maticamente.

[0071] No método de hidrólise química, a celulose pode ser tratada com ácido diluído em temperaturas e pressões elevadas, ou com ácido concentrado em temperaturas mais baixas e pressão atmosférica. No processo de hidrolise química, a celulose reage com o ácido e a água para formar moléculas individuais de açúcar. Estas moléculas de açú carsão então neutralizadas, utilizando-se a fermentação pelas levedu ras para se produzir o etanol. O ácido de lúpulo em conjunto com o ácido orgânico pode ser usado durante a porção de fermentação pela levedura deste método.

[0072] A hidrólise enzimática pode ser realizada através de dois métodos. O primeiro é conhecido por conversão microbiana direta (DMC - "Direct Microbial Conversion). O método de DMC usa um úni co micro-organismo para converter a biomassa celulósica em etanol. O etanol e as enzimas requeridas são produzidos pelo mesmo micro organismo. O ácido de lúpulo em conjunto com ácido orgânico pode ser usado durante as etapas de propagação/condicionamento ou de fermentação com este micro-organismo especializado.

[0073] O segundo método é conhecido como método de hidrólise enzimática. Neste método, as cadeias de celulose são quebradas usando enzimas celulase. Estas enzimas estão comumente presentes nos estômagos de ruminantes, tais como a vaca e a ovelha, e servem para quebrar a celulose que comem. O método enzimático é realizado tipicamente em quatro ou cinco etapas. A celulose é pré-tratada para gerar a matéria prima na forma, por exemplo, de palha ou madeira, mais suscetíveis à hidrólise. Então, as enzimas celulases são utiliza das para quebrar as moléculas de celulose em açúcares fermentáveis. Após a hidrólise, os açúcares são separados dos materiais residuais e adiciona-se a levedura. Os açúcares hidrolisados são fermentados em etanol usando as leveduras. Por fim, o etanol é recuperado através de destilação. Alternativamente, a hidrólise e a fermentação podem ser realizadas conjuntamente através da utilização de bactérias ou fungos especiais que cumprem ambos os processos. Quando ambas as eta pas são realizadas em conjunto o processo é chamado hidrólise e fer mentação sequencial (SHF - "sequencial hydrolysis and fermenta tion").

[0074] A introdução do ácido de lúpulo em conjunto com ácidos orgânico pode ser realizada com eficácia microbiológica em vários pontos no método de hidrólise enzimática. O ácido de lúpulo em con junto com ácido orgânico pode ser usado na produção, manufatura e fermentação das enzimas celulase feitas pelo Trichoderma e outros cepas de fungos. O ácido de lúpulo e o ácido orgânico podem ser adi cionados na fase de sacarificação e fermentação simultânea (SSF - "Simultaneous Saccharification and Fermentation") da celulose. O áci do de lúpulo e o ácido orgânico podem ser introduzidos na fase de hi drólise e fermentação sequencial (SHF). Eles podem ainda ser intro duzidos em pontos antes, durante ou depois da fermentação por fun gos celulósicos que criam enzimas celulase. Alternativamente, o ácido de lúpulo em conjunto com ácido orgânico pode ser adicionado duran te a fase de fermentação pela levedura, conforme discutido acima.

[0075] O processo de gaseificação não quebra a cadeia da celulo se em moléculas de açúcar. Primeiro, o carbono na celulose é conver tido em monóxido de carbono, dióxido de carbono e hidrogênio em uma reação de combustão parcial. Então, o monóxido de carbono, o dióxido de carbono e o hidrogênio são introduzidos em um fermenta- dor especial que usa micro-organismos como, por exemplo, a Clostri dium Ijungdahlii, capazes de consumir o monóxido de carbono, o dió xido de carbono e o hidrogênio para produzir etanol e água. Por fim, o etanol é separado da água em uma etapa de destilação. O ácido de lúpulo e o ácido orgânico podem ser usados como agente antimicrobi- ano na etapa de fermentação por micro-organismos tais como a Clos tridium Ijungdahlii que é capaz de consumir o monóxido de carbono, o dióxido de carbono e o hidrogênio para produzir etanol e água.

[0076] Em uma modalidade não limitante, o ácido de lúpulo e o ácido orgânico são adicionados a um tanque de carga e diluídos até uma determinada concentração em uma proporção pré-determinada. No tanque de carga, um extrato de ácido de lúpulo como, por exemplo, o extrato de isso-alfa-ácido, e um ácido orgânico como, por exemplo, o ácido cítrico, é dissolvido em água para formar uma mistura de ácido de lúpulo e ácido orgânico. A concentração da solução de extrato de ácido de lúpulo e da solução de ácido orgânico no tanque de carga pode variar amplamente. A solução mista de extrato de ácido de lúpu- lo/ácido orgânico é então drenada do tanque de carga através de uma saída em uma dosagem específica para criar uma solução com a con centração desejada.

[0077] Em uma modalidade não limitante, a razão de ácido de lú pulo para ácido orgânico é de 1:200 a 1:10. O tanque é comumente um tanque de pré mistura.

[0078] Um recipiente do processo contendo uma solução aquosa com micro-organismos é conectada ao tanque de carga de forma que os fluidos estejam em contato através de saídas no tanque de carga. O recipiente do processo pode ser um recipiente de cozimento, um tanque de fermentação, um tanque de condicionamento, um tanque de partida, um tanque de propagação, um recipiente de liquefação e/ou um encanamento um trocador de calor entre estas unidades. A solu ção de extrato de ácido de lúpulo/ácido orgânico no recipiente do pro cesso pode promover a propagação do micro-organismo de produção presente ao mesmo tempo em que é capaz de reduzir a concentração de micro-organismos indesejáveis.

[0079] Para a produção em menor escala de produtos fermenta- dos, o ideal é utilizar equipamentos "skidados" (montados sobre estra dos deslizantes). Uma linha "skidada" permite que o equipamento seja montado fora do seu local, enviado ao destino desejado e facilmente instalado. Isto garante facilidade de transporte, montagem mais rápida e comissionamento. O tanque de carga, o recipiente do processo e o equipamento de conexão podem todos ser montados sobre estes es quis.

[0080] O ácido de lúpulos e os ácidos orgânicos podem ser com binados e então adicionados ao sistema a ser tratado. Eles também podem ser adicionados de forma sequencial ou separadamente ao sis tema a ser tratado. A razão de ácidos de lúpulo para os ácidos orgâni cos adicionados aos sistemas a serem tratados podem ser de 1:6000 a 1:5, de 1: 6000 a 1:10, de 1:500 a 1:10, de 1:200 a 1:20, de 1:100 a 1:10, ou de 1:100 a 1:20.

[0081] Os ácidos orgânicos podem ser usados em quantidade de 12500 ppm a até no mínimo 100 ppm na invenção, de 6250 a até no mínimo 100 ppm, de 4000 a até no mínimo 100 ppm, de 4000 a até no mínimo 200 ppm, de 1000 a até no mínimo 100 ppm, de 1000 a até no mínimo 200 ppm. Em geral, utilizam-se pelo menos 100 ppm, pelo menos 200 ppm ou pelo menos 300 ppm de ácido orgânico. O ácido de lúpulo pode ser utilizado em quantidades de pelo menos 0,5 ppm e menores que 120 ppm, entre 1 ppm e 100ppm, entre 2 e 70 ppm, entre 5 e 50 ppm, entre 5 e 45, 0,5 ppm a 20 ppm, de 0,5 ppm a 15 ppm, de 2 a 15 ppm, de 2 a 12 ppm, de 3 a 12 ppm, de 3 a 10 ppm. A quanti dade de ácido de lúpulo geralmente utilizada na invenção é de pelo menos 2 ppm ou de pelo menos 3 ppm. Os ácidos orgânicos que po dem ser usados na invenção incluem os ácidos cítrico, benzoico e propiônico e seus sais, preferivelmente o ácido cítrico ou seu sal. Os componentes da invenção (ácido de lúpulo e ácido orgânico) podem ser adicionados ao sistema aquoso separadamente ou já misturados. Os ácidos orgânicos podem ser adicionados a sistemas aquosos late rais com outros aditivos tais como, mas não necessariamente, com postos surfactantes e de controle de corrosão e formação de crostas, polímeros iônicos ou não iônicos, agentes de controle do pH, e outros aditivos usados para alterar ou modificar a química do sistema aquoso.

[0082] Aqueles competentes na área poderão determinar a con centração da composição necessária para atingir um controle micro- biológico aceitável com base nos ensinamentos aqui descritos, saben do que a concentração dependerá da matriz.

[0083] Quando utilizados em um sistema de fermentação, os áci dos podem ser adicionados em vários pontos no sistema de fermenta ção, assim como podem ser adicionados em um ou em vários pontos no processo de fermentação, inclusive nos tanques de mistura, cozi mento, resfriadores de mosto, propagadores e tanques de fermenta ção. Alguém competente nesta área poderá ainda determinar outros pontos de adição.

[0084] Ao passo que certos elementos, modalidades e aplicações da presente invenção foram apresentados e descritos, deve-se com preender,é claro, que a invenção não se limita a eles já que podem ser feitas modificações por aqueles competentes na área sem fugirem ao conceito da presente revelação, particularmente a luz dos presen tes ensinamentos.

EXEMPLOS

[0085] Os índices de sinergia relatados nos exemplos a seguir se baseiam na fórmula a seguir primeiramente relatada em Applied Mi crobiology de F.C. Kull, P.C. Eisman, H.D. Sylwestrowka, e R.L. Ma yer, 9:538-541, 1961: Índice de sinergia = Qa/QA + Qb/QB

[0086] onde Qa é a concentração do Antimicrobiano A necessária para atingir inibição completa do crescimento do micróbio testado quando usado em combinação com o Antimicrobiano B;

[0087] QA é a concentração do Antimicrobiano A necessária para atingir inibição completa do crescimento do micróbio testado se utiliza do somente o mesmo;

[0088] Qb é a concentração do antimicrobiano B necessária para atingir inibição completa do crescimento do micróbio testado quando usado em combinação com o Antimicrobiano A;

[0089] QB é a concentração do Antimicrobiano B necessária para atingir inibição completa do crescimento do micróbio testado se utiliza do somente o mesmo.

[0090] Um índice de sinergia (IS) de 1 indica que a interação entre os dois antimicrobianos é meramente aditiva, um IS superior a 1 indica que os dois antimicrobianos são antagonistas um do outro, enquanto um IS inferior a 1 indica que os dois antimicrobianos interagem de for ma sinérgica.

[0091] Nos exemplos a seguir, o resultado utilizado para medir os níveis de atividade antimicrobiana é conhecido como Concentração Inibitória Mínima, ou CIM. Este se refere a concentração mais baixa de uma substância ou substâncias que lhe permite(m) atingir inibição completa do crescimento.

[0092] A fim de determinar a Concentração Inibitória Mínima, cons trói-se uma série de diluição do antimicrobiano na qual a concentração de uma amostra é sempre metade da concentração da amostra anteri or. As diluições são realizadas em meio de crescimento em bandejas de 96 poços de forma que cada poço possua um volume final de 280 μl de meio e antimicrobiano. O primeiro poço apresenta, por exemplo, uma concentração de 1000 ppm de antimicrobiano, o segundo 500 ppm, o terceiro 250 ppm, e assim por diante, até eu o 12° poço na filei ra é o último e não tem antimicrobiano algum, servindo como controle de crescimento positivo. Depois de se construir a série de diluição, os poços são inoculados com uma suspensão de micróbios em meio de crescimento de forma que a concentração final de micróbios no poço seja de ~5x105 cfu/ml. Os micróbios utilizados nestes exemplos foi o Lactobacillus plantarum. As culturas foram incubadas a 37°C por de 18 a 24 horas, e os poços classificados como positivos ou negativos para crescimento do micróbio com base em um exame visual da turbidez dos poços, sendo a turbidez um indicador de crescimento. A menor concentração de antimicrobiano que garante a completa inibição do crescimento (por exemplo,, um poço límpido) é designada a Concen tração Inibitória Mínima.

[0093] A fim de se determinar se a interação entre os dois antimi- crobianos contra um determinado micróbio é aditiva, antagônica ou sinérgica, emprega-se um método conhecido por tabuleiro de damas (uma modificação do método CIM) com bandejas de 96 poços. Para se construir o tabuleiro de damas, o primeiro antimicrobiano é disposto na série de diluição pela metade empregada na construção da bandeja usada no método CIM, exceto pelo fato de que cada uma das 8 fileiras da bandeja contém uma série de diluição idêntica que termina na oita va coluna. O segundo antimicrobiano é então disposto em volumes idênticos aos da série de diluição pela metade no sentido oposto ao da primeira série. O resultado é que cada poço do quadrado de 8x8 pos sui uma combinação diferente de concentrações dos antimicrobianos, gerando 64 combinações diferentes ao todo. A 9° e a 10° colunas não recebem antimicrobiano e servem como controles positivo e negativo de crescimento microbiano, respectivamente. Depois de construído o microtabuleiro de damas, inoculam-se os poços com o Lactobacillus plantarum, e incuba-se a bandeja a 37°C, posteriormente classifican do-se os poços conforme descrito para o método CIM.

Exemplo 1: Sinergia do Ácido Cítrico com os Ácidos de Lúpulo

[0094] Determinou-se a Concentração Inibitória Mínima de ambos o ácido cítrico e o ácido de lúpulo com o protocolo acima em pH6 usando como micróbio teste o Lactobacillus plantarum. Construiu-se um tabuleiro de damas para verificação da sinergia conforme descrito acima, os poços foram inoculados em uma concentração final de ~5x105 cfu/ml, incubados por de 18 a 24 horas, e então examinados visualmente para determinar-se crescimento/não crescimento. Os índi-ces de sinergia foram calculados de acordo com a fórmula descrita por Kull e seus colaboradores. Este exemplo demonstra que o efeito de se combinar o ácido cítrico e o ácido de lúpulo é maior que o efeito de ambos os antimicrobianos isoladamente. A quantidade de ácido cítrico necessária para inibir o crescimento bacteriano é reduzida de 100.000 ppm para 391-12.500 ppm. A concentração de ácido de lúpulo cai de 31,3 ppm para 1,96-15,6 ppm.

Exemplo 2: Sinergia do Ácido Benzoico com o Ácido de Lúpulo

[0095] Determinou-se a Concentração Inibitória Mínima de ambos o ácido benzoico e o ácido de lúpulo com o protocolo descrito acima em pH 6 usando como micróbio teste o Lactobacillus plantarum. Cons truiu-se um tabuleiro de damas para verificação da sinergia conforme descrito acima, os poços foram inoculados com uma concentração fi nal ~5x105 cfu/ml, incubados por de 18 a 24 horas, e então examina- dos visualmente para se determinar crescimento/ não crescimento. Os índices de sinergia foram calculados de acordo com a fórmula descrita por Kull e colaboradores. Este exemplo demonstra que o efeito da combinação de ácido benzoico e ácido de lúpulo é maior que o efeito de ambos os antimicrobianos isoladamente.

Exemplo 3: Dados do Laboratório de Fermentação

[0096] As avaliações foram conduzidas no National Corn-to- Ethanol Research Center, utilizando extratos de ácido de lúpulo e áci do cítrico. As amostras foram testadas e suas concentrações podem ser encontradas na Figura 1 e na Tabela 3. Os testes foram conduzi dos para avaliar os efeitos de antimicrobianos binários na produção de etanol com mosto de milho produzido sob condições similares àquelas observadas na indústria de etanol combustível. Foram investigados dois efeitos específicos: (1) a habilidade dos antimicrobianos de afetar a produtividade de etanol e a conversão do açúcar em processos de fermentação contaminados por bactérias produtoras de ácido láctico, e (2) a habilidade dos antimicrobianos para controlar a infecção bacteri- ana em comparação a um processo de fermentação livre de bactérias. Foram preparadas três misturas de 160 gramas de farinha de milho, água e enzimas (30% de sólidos secos) para cada tratamento e para o controle (inoculado e não inoculado). As misturas foram incubadas por 90 minutos a 83°C, resfriadas a 40°C, e então inoculadas com L. plan tarum. Depois, as misturas receberam doses dos antimicrobianos. A instalação usou doses de dióxido de cloro, extratos de ácido de lúpulo e ácido cítrico em frascos Erlenmeyer de 250-mL e colheu amostras após 15, 30 3 60 minutos depois da adição de antimicrobiano. Depois de as amostras serem colhidas nos 3 intervalos de tempo, o pH da mistura foi ajustado para <5,2 através da adição de 300 μl de uma so lução de 5N de ácido sulfúrico. Todas as enzimas, nutrientes e outros aditivos introduzidos aos frascos de fermentação foram preparados imediatamente antes do uso. Adicionou-se ureia como solução estéril de 0,2-g/ml até se obter uma concentração final de 500 ppm (w/w) conforme o conteúdo de nitrogênio da ureia (conforme a massa total da mistura). Preparou-se uma solução de 0,25-g/ml de enzima glicoa- milase (Spirizyme Excel, Novozymes) que foi adicionada em uma dose de 0.066% (peso percentual, com base no peso do milho úmido). Adi cionou-seágua esterilizada para equilibrar o conteúdo sólido total de cada tratamento. Todos os frascos de fermentação foram inoculados com uma suspensão com 2g/ml de levedura (Saccharomyces cerevisi- ae).Esta suspensão foi incubada e misturada por 30 minutos a 40°C antes da inoculação nos frascos de fermentação. Cada frasco de fer mentação foi inoculado com 170 μl da suspensão de levedura, obten do-se uma concentração inicial de 1x107 células de levedura/ml. Fo ram registradas as massas de todos os frascos depois que todas as adições foram feitas, então foram inseridas armadilhas de fermentação higienizadas em cada frasco e estes foram novamente pesados. Os frascos foram incubados a 32°C com agitação constante a 170 rpm em um incubador/agitador por um total de 64 horas. Monitorou-se o pro gresso na fermentação através da aferição do peso dos frascos perio dicamente durante os 3 dias de incubação (em 0, 17,5, 22,5, 42,5, 48, e 64 horas da inoculação com levedura). As concentrações dos subs tratos (glicose, DP2, DP3, e DP4+, onde "DPx" representa os oligôme- ros de glicose com "x" subunidades) e dos produtos (etanol, glicerol, ácido láctico e ácido acético) foram mensuradas por CLAE ao fim da fermentação. As amostras foram preparadas para serem submetidas à CLAE através de centrifugação para remoção de sólidos grandes, se guida de filtração em filtros seringa de 0,45-μm, e acidificação até um pH de aproximadamente 2 pela adição de ácido sulfúrico em uma con centração final de 0,01 N. O pH final, as concentrações totais de sóli dos secos e de sólidos secos dissolvidos, assim como a densidade do fermentado filtrado foram medidos após 64 horas de incubação. As amostras de cada frasco foram colocadas em pratos para contagem das colônias bacterianas. TABELA 3

[0097] Este exemplo mostra que durante a fermentação, 5 ppm de ácidos de lúpulo combinados a 200 ppm de ácido cítrico são eficazes na redução das bactérias, que se mostraram surpreendentemente poucas. Ao se combinar 5 ppm de ácidos de lúpulo a 400 ppm de áci docítrico se obtiveram resultados ainda melhores. A mistura sinérgica de 10 ppm de ácido de lúpulo a 400 ppm de ácido cítrico gerou uma redução de aproximadamente 3 log (redução de 99,9%) nos Lactobaci llus.

[0098] A Figura 2 e a Tabela 4 mostram a produtividade de etanol média no controle não infectado e nas três amostras após a fermenta ção. Não pode se observar nenhuma diferença significativa na produti vidade de etanol média entre os tratamentos (P =0,055), usando a ANOVA. Os dados na Figura 2 e na Tabela 4 representam as médias de cada um dos três frascos individuais de replicação do processo de fermentação. TABELA 4

[0099] A produtividade média de etanol nos tratamentos está ex pressa em gramas de etanol por gramas de milho seco.

Exemplo 4: Dados do Experimento Industrial

[00100] Realizou-se uma avaliação em escala industrial em uma usina produzindo 55 milhões de galões de etanol por ano a fim de se avaliar os efeitos do antimicrobiano binário de ácido de lúpulo/ácido cítrico sobre a produção de etanol. A usina utiliza uma mistura de 50% de milho e 50% de sorgo como matéria prima. As concentrações e ra zões das combinações de ácidos de lúpulo e ácido cítrico testadas po dem ser achadas na Tabela 5. Foram investigados 5 eventos específi cos: (1) o efeito sobre os níveis de glicerol, (2) o efeito sobre os níveis de ácido láctico e (3) o efeito sobre os níveis de ácido acético. Nesta usina, uma nova fornada de propagador é feita a cada 17 horas para ser alimentada no início de um estágio de fermentação SSF (sacarifi cação e fermentação simultâneas). Na Hora 1 se começa a encher o recipiente de propagação para se obter um volume de trabalho de 12.500 galões de mosto com 15% de sólidos e se adiciona 100 lbs de ureia na ocasião. Na Hora 2, são adicionados três galões de Provia (uma protease desenhada para misturas com sorgo) e 30 kg de Beta Tec (Vita-Hop) usando-se um tanque de injeção no momento que ain da se está com o tanque de propagador a 67%. Na Hora 3, adiciona- se extrato de isso-ácidos de lúpulo pelo topo do recipiente (quantida des distintas - veja Tabela 5). Depois, adiciona-se 200 mL de glicoa- milase pelo topo do recipiente de propagação seguidos de 60 kg de levedura líquida SLY através do tanque de injeção. O tanque de inje- ção é então descarregado. Adiciona-se então ácido cítrico (veja Tabela 5) ao recipiente de propagação através do tanque de injeção e o pro pagadorestá então completo. Na Hora 5, realiza-se uma análise da relação entre a qualidade da levedura com seu desempenho através da medição do pH, Brix, temperatura, brotamento%, contagem celular e viabilidade%. Na Hora 8, afere-se tudo novamente e se realiza o tes te com a CLAE para determinar as concentrações de DP4, DP3, mal tose, dextrose, ácido láctico, glicerol, ácido acético e etanol %. Na Ho ra 9, o volume de propagador é enviado ao fermentador. As Figuras 3, 4 e 5 são gráficos de controle que mostram os dados estatísticos ge rados. Os limites superiores e inferiores do controle (UCL - "upper control limit" e LCL- "lower control limit") são indicados nas Figuras. As bactérias de ácido láctico metabolizam os açúcares e produzem ácido láctico e ácido acético. As Figuras 3 e 4 mostram que as concentra ções dos ácidos acético e láctico se mantiveram suficientemente con troladas, demonstrando que as combinações de ácido de lúpulo/ácido cítrico mantiveram o controle microbiano na usina de etanol. As medi das de glicerol indicam a saúde da levedura; elas mostraram que a mistura de ácido de lúpulo/ácido cítrico não afeta o desempenho da S. cerevisiae (Figura 5). A usina funcionou bem com todas as dosagens, tendo se diminuído a dosagem de ácido de lúpulo em pelo menos 42% do seu histórico de dosagem. TABELA 5.

Claims

1. Método para controle da concentração de microrganis-mosindesejáveis em uma solução aquosa empregada em um proces so de fermentação, o dito método sendo caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) introdução de um carboidrato fermentável à solução aquosa; (b) introdução de pelo menos uma levedura à solução; (c) introdução de um ácido de lúpulo à solução; e (d) introdução de pelo menos um ácido orgânico ou um sal do mesmo à solução, em que o ácido orgânico ou sal do mesmo é o ácido cítrico ou sal do mesmo, em que que o microrganismo indesejável é selecionado a partir do grupo que consiste em bactéria produtora de ácido lático, bactéria produtora de ácido acético e uma combinação das mesmas,e em que a levedura é uma levedura Saccharomyces.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as etapas são realizadas de forma sequencial.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracteri-zado pelo fato de que a quantidade de ácido de lúpulo na solução aquosa compreende de 1 ppm a 100 ppm, preferencialmente de 2 ppm a 70 ppm, mais preferencialmente de 5 a 50 ppm, ainda mais prefe rencialmente de 5 a 45 ppm.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o extrato de ácido de lúpulo apre senta uma dosagem de pelo menos 5 ppm.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o ácido orgânico ou sal do mes mo apresenta uma dosagem de pelo menos 100 ppm, preferencial- mente de pelo menos 200 ppm, mais preferencialmente de pelo menos 300 ppm.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 4, caracterizado pelo fato de que o ácido orgânico ou sal do mesmo é o ácido cítrico ou sal do mesmo e a razão em peso de extra to de ácido de lúpulo para ácido cítrico ou sal do mesmo é de 1:10 a 1:6500, preferencialmente de 1:20 a 1:6400, mais preferencialmente de 1:10 a 1:200, ainda mais preferencialmente de 1:25 a 1:100.