ES2634902T3 - Composiciones sinérgicas que contienen ácido cítrico y ácido propiónico para controlar microorganismos en procesos de fermentación - Google Patents

Composiciones sinérgicas que contienen ácido cítrico y ácido propiónico para controlar microorganismos en procesos de fermentación Download PDF

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Abstract

Método de control de la concentración de microorganismos no deseados en un sistema acuoso empleado en un proceso de fermentación, comprendiendo el método las etapas de: (a) introducir un hidrato de carbono fermentable en una disolución acuosa; (b) introducir al menos una levadura en dicha disolución; (c) introducir un primer ácido orgánico y un segundo ácido orgánico en el sistema acuoso, en el que el primer ácido orgánico es ácido cítrico o su sal, el segundo ácido orgánico es ácido propiónico o su sal, y la razón del primer ácido orgánico o su sal con respecto al segundo ácido orgánico o su sal es de desde 32:1 hasta 1:32.

Description

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DESCRIPCION
Composiciones sinergicas que contienen acido cftrico y acido propionico para controlar microorganismos en procesos de fermentacion
Campo de la invencion
La invencion se refiere a metodos de control de microorganismos no deseados en procesos de fermentacion tal como se define en las reivindicaciones 1, 5 y 6 usando una combinacion de acido cftrico o su sal y acido propionico o su sal a la razon de desde 32:1 hasta 1:32.
Antecedentes de la invencion
Se usan microorganismos, tales como levaduras, hongos y bacterias para producir varios productos de fermentacion, tales como etanol de calidad industrial, bebidas alcoholicas destiladas, cerveza, vino, productos farmaceuticos y nutraceuticos (productos alimenticios que proporcionan beneficios para la salud, tales como alimentos enriquecidos y complementos dieteticos), productos qmmicos industriales y de la industria panificadora.
Se usa comunmente levadura en procesos de fermentacion. Un tipo comun de levadura es Saccharomyces cerevisiae, la especie predominantemente usada en panadena y fermentacion. Tambien se usan levaduras distintas de Saccharomyces, tambien conocidas como levaduras no convencionales, para preparar varios productos comerciales.
Tambien pueden usarse otros microorganismos en la preparacion de productos de fermentacion. Por ejemplo, la produccion de etanol celulosico, produccion de etanol a partir de biomasa celulosica, utiliza hongos y bacterias. Los ejemplos de estos hongos celulolfticos incluyen Trichoderma reesei y Trichoderma viride. Un ejemplo de una bacteria usada en la produccion de etanol celulosico es Clostridium Ijungdahlii.
La mayona de las levaduras usadas en destilenas y plantas de etanol para combustible se adquieren de fabricantes de levaduras especializadas. La levadura se fabrica a traves de un proceso de propagacion. La propagacion implica hacer crecer una gran cantidad de levadura a partir de un pequeno cultivo de laboratorio de levadura. Durante la propagacion, se proporcionan a la levadura oxfgeno, nitrogeno, azucares, protemas, ftpidos e iones que son necesarios o deseables para el crecimiento optimo a traves de respiracion aerobia.
Una vez en la destilena, la levadura puede someterse a acondicionamiento. El acondicionamiento es diferente de la propagacion porque no implica hacer crecer una gran cantidad a partir de un pequeno cultivo de laboratorio. Durante el acondicionamiento, se proporcionan condiciones para rehidratar la levadura, sacarla de la hibernacion y permitir una reproduccion y un crecimiento anaerobio maximos. El objetivo de tanto la propagacion como el acondicionamiento es suministrar un gran volumen de levadura al tanque de fermentacion con alta viabilidad, alta gemacion y un bajo nivel de infeccion por otros microorganismos.
Tras la propagacion y/o el acondicionamiento, la levadura entra en el proceso de fermentacion. La levadura se combina en una disolucion acuosa con azucares fermentables. La levadura consume los azucares, convirtiendolos en alcoholes alifaticos, tales como etanol.
El proceso de fermentacion comienza con la preparacion de un hidrato de carbono fermentable. En la produccion de etanol, el mafz es un posible hidrato de carbono fermentable. Otros hidratos de carbono incluyendo granos de cereal y materiales que llevan celulosa-almidon, tales como trigo o mijo, podnan ser tambien sustitutos. Tambien podna usarse biomasa celulosica tal como paja y tallos de mafz. La produccion de etanol celulosico ha recibido recientemente atencion porque usa biomasa no alimentaria facilmente disponible para formar un combustible valioso.
Los procesos de propagacion, acondicionamiento y fermentacion pueden llevarse a cabo usando metodos continuos o discontinuos. El proceso discontinuo se usa para la produccion a pequena escala. Cada lote se completa antes de que comience uno nuevo. El metodo de fermentacion continuo se usa para la produccion a gran escala porque produce un suministro continuo sin volver a empezar cada vez.
Durante el proceso de propagacion, acondicionamiento o fermentacion, el macerado o la mezcla de fermentacion puede contaminarse con otros microorganismos, tales como bacterias nocivas. Estos microorganismos compiten con la especie deseada de levadura por los azucares fermentables y otros hidratos de carbono fermentables y retardan la reaccion bioqmmica deseada dando como resultado un menor rendimiento de producto. Esto puede producir tambien subproductos qmmicos no deseados, que pueden provocar el deterioro de todos los lotes de fermentacion.
Los productores de etanol intentan aumentar la cantidad de etanol producida a partir de una fanega de granos de cereal (aproximadamente 56 libras (25,4 kilogramos)). La contaminacion por microorganismos reduce la eficacia de la levadura, haciendo diffcil lograr o superar los niveles deseados de 2,8-2,9 galones de etanol por fanega (0,42-0,44
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litros por kilogramo). La reduccion de la concentracion de microorganismos estimulara la propagacion y/o el acondicionamiento de la levadura y aumentara la eficacia de la levadura haciendo posible lograr y superar estos niveles deseados.
Durante cualquiera de estos tres procesos, la levadura puede contaminarse con levaduras, bacterias no deseadas u otros microorganismos no deseados. Esto puede producirse en uno de los muchos recipientes usados en la propagacion, el acondicionamiento o la fermentacion. Esto incluye, pero no se limita a, tanques de propagacion, tanques de acondicionamiento, tanques iniciadores, tanques de fermentaciones y tubenas e intercambiadores de calor entre estas unidades.
La contaminacion bacteriana o microbiana reduce el rendimiento de producto de fermentacion de tres modos principales. En primer lugar, los azucares que podnan estar disponibles para que la levadura produzca alcohol son consumidos por las bacterias u otros microorganismos no deseados y se desvfan de la produccion de alcohol, reduciendo el rendimiento. En segundo lugar, los productos finales del metabolismo microbiano, tales como acido lactico y acido acetico, inhiben el crecimiento de la levadura y la fermentacion/respiracion de la levadura, lo que da como resultado una produccion de la levadura menos eficaz. Finalmente, las bacterias u otros microorganismos no deseados compiten con la levadura por nutrientes distintos de azucar.
Despues de que el recipiente o sistema de fermentacion se haya contaminado con bacterias u otros microorganismos no deseados, esas bacterias u otros microorganismos pueden crecer mucho mas rapidamente que la levadura deseada. Las bacterias u otros microorganismos compiten con la levadura por los azucares fermentables y retardan la reaccion bioqmmica deseada dando como resultado un menor rendimiento de producto. Las bacterias tambien producen subproductos qmmicos no deseados, que pueden provocar el deterioro de todos los lotes de fermentacion. La eliminacion de estas bacterias u otros microorganismos no deseados permite que la levadura deseada prospere, lo que da como resultado una mayor eficacia de produccion.
Tan solo una disminucion de un uno por ciento en el rendimiento de etanol es altamente significativa para la industria del etanol para combustible. En instalaciones mas grandes, una disminucion de este tipo en la eficacia reducira los ingresos desde 1 millon hasta 3 millones de dolares al ano.
Algunos metodos de reduccion de bacterias u otros microorganismos no deseados durante la propagacion, el acondicionamiento y la fermentacion se aprovechan de la tolerancia al pH y la temperatura superior de las levaduras con respecto a otros microorganismos. Esto se realiza aplicando calor o disminuyendo el pH de la disolucion de levadura. Sin embargo, estos procesos no son totalmente eficaces en el retardo del crecimiento bacteriano. Ademas, los microorganismos de levadura deseables, aunque sobreviven, se ven sometidos a estres y no son tan vigorosos o sanos. Por tanto, las levaduras tampoco tienen un buen rendimiento.
La tendencia predominante en la industria del etanol es a reducir el pH del macerado (materia prima) hasta menos de 4,5 al inicio de la fermentacion. La disminucion del pH del macerado reduce la poblacion de algunas especies de bacterias. Sin embargo, es mucho menos eficaz en la reduccion de bacterias problematicas, tales como bacterias productoras de acido lactico. Tambien reduce significativamente el rendimiento de etanol al someter a estres a la levadura usada para la produccion de etanol.
Otro enfoque implica lavar la levadura con acido fosforico. Este metodo no destruye eficazmente las bacterias y otros microorganismos. Tambien puede suponer un estres para la levadura usada para la produccion de etanol, disminuyendo de ese modo su eficacia.
Aun otro metodo es usar calor o productos qmmicos fuertes para esterilizar el equipo de proceso entre lotes. Es ineficaz destruyendo bacterias y otros microorganismos dentro de la mezcla de levaduras durante la produccion.
En aun otro metodo, se anaden antibioticos al lote de propagacion, acondicionamiento o fermentacion de levaduras para neutralizar las bacterias. Las industrias de la fermentacion aplican normalmente antibioticos a los procesos de acondicionamiento, propagacion y fermentacion. Las tasas de dosificacion de antibioticos oscilan entre 0,1 y 3,0 mg/l y generalmente no superan 6 mg/l. Sin embargo, existen problemas con el uso de antibioticos en el acondicionamiento, la propagacion y la fermentacion. Los antibioticos son caros y pueden anadir un gran coste a la produccion a gran escala. Ademas, los antibioticos no son eficaces contra todas las cepas de bacterias, tales como cepas de bacterias resistentes a antibioticos. El uso excesivo de antibioticos puede conducir a la creacion de variantes adicionales de cepas de bacterias resistentes a antibioticos.
Los residuos de antibioticos y el establecimiento de cepas resistentes a antibioticos es una preocupacion global. Estas preocupaciones pueden conducir a una accion regulatoria futura contra el uso de antibioticos. Un area de preocupacion son los granos de destilena que se usan para pienso para animales. Los granos de destilena son el residuo de grano del proceso de fermentacion. Los pafses europeos no permiten que los subproductos de una planta de etanol se vendan como pienso para animales si se usan antibioticos en la instalacion. Las ventas de granos de destilena representan hasta el 20 % de las ganancias de una planta de etanol. La concentracion de antibiotico en el subproducto puede oscilar entre el 1-3 % en peso, anulando por tanto esta importante fuente de ingresos.
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Ademas, hay otros problemas a considerar cuando se usan antibioticos. Las mezclas de antibioticos deben equilibrarse y cambiarse frecuentemente con el fin de evitar usos de un solo tipo que conduciran a cepas resistentes a antibioticos. Algunas veces no puede anadirse la cantidad eficaz de antibiotico a la mezcla de fermentacion. Por ejemplo, la utilizacion de mas de 2 mg/l de virginiamicina suprimira la fermentacion, pero se requieren mas de 25 mg/l para inhibir el crecimiento de Weisella confusa, una cepa bacteriana problematica emergente. La sobredosificacion o el uso excesivo de antibiotico puede suponer un estres para la levadura y tener un impacto sobre la eficacia o provocar un no cumplimiento regulatorio.
El documento US 2011/054024 A1 da a conocer el uso de acidos de lupulo y sus mezclas para controlar los microbios no deseados que compiten con la levadura por los nutrientes. Con la reciente expansion del etanol para combustible, se han utilizado acidos de lupulo en un grado minoritario para tratar microbios no deseados, Gram- positivos. La competicion entre levaduras y microbios no deseados da como resultado una perdida de rendimiento de etanol para combustible ya que los microbios no deseados, principalmente Lactobacillus y Acetobacter, reducen la eficacia de la fermentacion. En bebidas, los microbios competidores no solo reducen la eficacia sino que pueden alterar la estetica y el sabor del producto final.
Los acidos organicos tienen muchas aplicaciones, incluyendo su uso como acidificantes, tampones, antioxidantes, quelantes, sinergistas, complementos dieteticos, agentes aromatizantes, conservantes y antimicrobianos. Se han usado acidos organicos como conservantes debido a su efecto sobre las bacterias. El modo de accion del acido organico es que los acidos no disociados penetran en la pared celular bacteriana por medio de difusion pasiva y alteran la fisiologfa normal de la celula de dos modos: los acidos se disocian y por tanto disminuyen el pH interno, que normalmente esta proximo al pH neutro, afectando a la funcion de las bacterias. La parte anionica del acido que es incapaz de salir de la celula en su forma disociada se acumula dentro de la misma, alterando las funciones metabolicas y aumentando la presion osmotica.
Saithong P et al. (Journal of Bioscience and Bioengineering, 2009, 108(3), 216-219) describen el uso de acetato para la prevencion de la contaminacion bacteriana durante la produccion de bioetanol a partir de melazas. El documento CN 101449740 A da a conocer la fermentacion de residuos de frutas o pulpa de remolacha con Lactobacillus acidophilus que comprende anadir acido propionico en combinacion con acido benzoico, acido sorbico o acido cftrico para la inhibicion de microorganismos no deseados. El documento CN 1 414 092 A da a conocer un medio de fermentacion acuoso que comprende propionato de sodio y citrato de hierro (vease la reivindicacion 9). Claudia Cristina A. Do A. Santos et al. (Journal of the Institute of Brewing, 2013, 119(4), 280-287) describen la fermentacion de zumo de naranja que contiene acido cftrico y acido propionico con Saccharomyces cerevisiae. ENERGAID® disolucion oral para el tratamiento de diarrea por E. Coli que contiene citrato de sodio 4865 ppm, acetato de sodio y propionato de sodio 955 ppm. El aditivo para pienso antimicrobiano NOVIBAC®CF 60 contiene formiato, propionato y acido cftrico. El documento US 2011/027387 A1 da a conocer un aditivo antibacteriano para agua potable que contiene acido cftrico y acido propionico.
Puesto que pequenas disminuciones en el rendimiento de etanol son altamente significativas para la industria del etanol para combustible, los productores de etanol estan buscando constantemente modos para aumentar la eficacia. Se usan antimicrobianos para eliminar, reducir o controlar de otro modo el numero de microbios en los sistemas acuosos. Sin embargo, el uso de antimicrobianos anadira siempre un coste a las operaciones y los productos. Ademas, algunos antimicrobianos pueden tener deficiencias en su espectro de accion antimicrobiana o limitaciones operativas en su manera de aplicacion, tales como falta de estabilidad a la temperatura o susceptibilidad a la inactivacion por factores medioambientales o qmmicos.
Se sabe que la presencia de microorganismos en sistemas de agua industriales es un problema significativo en procesos industriales, provocando problemas con la calidad de producto y los rendimientos de producto disminuidos. Un ejemplo espedfico de esto es en el biorrefinado de mafz para dar etanol, en donde se introducen bacterias del acido lactico en el proceso por medio de las reservas de mafz. Durante la fermentacion, estas bacterias compiten con la levadura productora de etanol por el sustrato y los nutrientes, lo que disminuye el rendimiento de etanol. Actualmente, casi todas las plantas de biorrefinado estadounidenses utilizan un agente antimicrobiano y muchas de ellas usan antibioticos tales como virginiamicina. Un producto importante del biorrefinado de mafz son granos de destilena secados para su uso como pienso para animales, y el mercado de granos para pienso libres de antibioticos esta creciendo. Se espera que la FDA formalice pronto regulaciones que reduzcan o eliminen el uso de antibioticos en pienso para animales. Canada tiene preocupaciones similares con respecto a los antibioticos en granos de destilena y la mayor parte de su produccion se exporta. Europa ha prohibido ya el uso de antibioticos en plantas de etanol en donde se producen granos de destilena para pienso para animales. En Brasil, el funcionamiento libre de antibioticos es obligatorio en plantas que producen extracto de levaduras para la exportacion.
El control de los microbios es muy significativo para muchas industrias y la estrategia predominante es el tratamiento con antimicrobianos. Se usan antimicrobianos para eliminar, reducir o controlar de otro modo el numero de microbios en sistemas acuosos. Sin embargo, el uso de la mayona de los antimicrobianos anadira un coste a las operaciones y los productos y por tanto se buscan modos mas eficaces para lograr el control microbiano. Ademas, muchos antimicrobianos tienen deficiencias en su espectro de accion antimicrobiana o limitaciones operativas en su manera
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de aplicacion tales como falta de estabilidad termica o susceptibilidad a la inactivacion por factores medioambientales o qmmicos.
Por tanto, pueden usare combinaciones de antimicrobianos, y en particular, se prefieren combinaciones sinergicas de antimicrobianos. Las combinaciones sinergicas de antimicrobianos pueden suministrar un efecto antimicrobiano mayor que la suma de los antimicrobianos individuales y por tanto pueden proporcionar un rendimiento de coste mejorado con respecto a las combinaciones que son meramente aditivas en cuanto a eficacia antimicrobiana.
Descripcion de la invencion
Para los fines de esta memoria descriptiva, el significado de “microorganismos” y “microbios” incluye, pero no se limita a, bacterias, hongos, algas, protozoos y virus. Microbios preferidos contra los que son eficaces las composiciones de la invencion son bacterias. Los ejemplos de bacterias no deseadas incluyen, pero no se limitan a, bacterias productoras de acido lactico, bacterias productoras de acido acetico y otras bacterias que contaminan procesos de fermentacion de etanol. Se entiende tambien que los microbios dentro de sistemas acuosos pueden estar ubicados o suspendidos dentro del fluido (por ejemplo, planctonicos) o localizados sobre una superficie en contacto con el sistema acuoso (por ejemplo, biopeftculas). Las palabras y frases “control”, “control microbiano”, “controlar” y “eficacia antimicrobiana” debe interpretarse que incluyen, dentro de su significado, sin limitarse a, la inhibicion del crecimiento de microbios, la destruccion de microbios, desinfeccion, conservacion, higienizacion o prevencion de que vuelvan a crecer microbios.
Tal como se usa en el presente documento, ppm se mide como masa por volumen o 1 ppm es igual a 1 mg (activo) por litro. Dosificacion se refiere a la concentracion del componente en el sistema acuoso que esta tratandose.
Tal como se usa en el presente documento el termino “acido organico” tambien se refiere a su sal.
La presente invencion se refiere a un metodo de control de la concentracion de microorganismos no deseados en un sistema acuoso empleado en un proceso de fermentacion, comprendiendo el metodo las etapas de: (a) introducir un hidrato de carbono fermentable en una disolucion acuosa; (b) introducir al menos una levadura en dicha disolucion; (c) introducir un primer acido organico y un segundo acido organico en el sistema acuoso, en el que el primer acido organico es acido dtrico o su sal, el segundo acido organico es acido propionico o su sal, y la razon del primer acido organico o su sal con respecto al segundo acido organico o su sal es de desde 32:1 hasta 1:32.
La presente invencion se refiere ademas a un metodo de control de la concentracion de microorganismos no deseados en una disolucion de fluido acuoso empleada en un proceso de fermentacion, comprendiendo el metodo las etapas de: (a) introducir un hidrato de carbono fermentable en una disolucion acuosa; (b) introducir al menos un microorganismo deseado que es capaz de fermentar hidrato de carbono en dicha disolucion acuosa; (c) introducir un primer acido organico y un segundo acido organico en el sistema acuoso, en el que el primer acido organico es acido dtrico o su sal, el segundo acido organico es acido propionico o su sal, y la razon del primer acido organico o su sal con respecto al segundo acido organico o su sal es de desde 32:1 hasta 1:32.
La presente invencion tambien se refiere a un metodo de control del crecimiento microbiano no deseado en caldos de fermentacion o sistemas o procesos de fermentacion industriales, consistiendo el metodo en la etapa de anadir a un caldo de fermentacion o sistema o proceso de fermentacion industrial una composicion acuosa que comprende: (a) un primer acido organico y (b) un segundo acido organico; en el que el primer acido organico es acido dtrico o su sal; el segundo acido organico es acido propionico o su sal; y la razon del primer acido organico o su sal con respecto al segundo acido organico o su sal es de desde 32:1 hasta 1:32.
El pH del sistema acuoso que va a tratarse es generalmente de desde 3 hasta 11, o desde 3 hasta 7, o desde 4 hasta 9, o desde 4 hasta 8, o desde 4 hasta 6,5, o desde 4,5 hasta 6. En general, los acidos organicos funcionan de la mejor manera en sistemas en los que el pH del sistema es inferior a al menos uno de los valores de pKa del acido o su sal.
Los componentes de la composicion pueden anadirse al sistema acuoso que va a tratarse secuencialmente o combinarse y luego anadirse al sistema que va a tratarse. Los acidos organicos pueden anadirse a los sistemas acuosos complementarios con otros aditivos tales como, pero sin restringirse necesariamente a, tensioactivos, compuestos de control de la incrustacion y corrosion, poftmeros ionicos y no ionicos, agentes de control del pH y otros aditivos usados para alterar o modificar la qmmica del sistema acuoso. Los acidos organicos se anaden a los sistemas que van a tratarse en las razones del primer acido con respecto al segundo acido de desde 32:1 hasta 1:32, o razones de desde 32:1 hasta 1:16, o razones de desde 8:1 hasta 1:32, o razones de desde 8:1 hasta 1:16 o razones de desde 8:1 hasta 1:8.
El primer acido organico es acido dtrico y la razon de acido dtrico con respecto al segundo acido organico es de desde 32:1 hasta 1:32 o desde 8:1 hasta 1:32 o desde 8:1 hasta 1:16. El segundo acido organico es acido propionico o sus sales. Puede usarse acido cftrico en cantidades de desde 12500 ppm hasta 100 ppm en el sistema acuoso que va a tratarse. Podna usarse acido cftrico en una cantidad de desde 6250 hasta 200 ppm o desde 4000
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hasta 200 ppm o desde 4000 hasta 300 ppm en el sistema acuoso que va a tratarse. Generalmente se usan al menos 100 ppm, o al menos 200 ppm, o al menos 300 ppm de acido dtrico o su sal en el sistema acuoso que va a tratarse.
En una realizacion de la invencion la razon de acido cftrico con respecto a acido propionico es de desde 32:1 hasta 1:16 y la cantidad del primer acido organico en el sistema acuoso que va a tratarse es de desde 200 hasta 1000 ppm.
Los ejemplos de bacterias no deseadas para las que la invencion es util incluyen bacterias productoras de acido lactico o bacterias productoras de acido acetico. Estas incluyen, pero no se limitan a, Lactobacillus y Acetobacter.
Cuando se usan en un sistema de fermentacion, los acidos pueden anadirse en diversas ubicaciones en el sistema de fermentacion de manera que pueden anadirse en una unica o en multiples ubicaciones en el proceso de fermentacion, incluyendo el/los tanque(s) de suspension, hornillos, enfriadores de macerado, propagadores y tanques de fermentacion. Un experto en la tecnica tambien puede determinar otros puntos de adicion.
En sistemas de fermentacion que usan el presente metodo, las concentraciones de bacterias y otros microorganismos no deseados pueden reducirse al tiempo que se estimula la propagacion y/o el acondicionamiento de microorganismos deseados. Se ha descubierto que el acido cftrico o su sal en combinacion con acido propionico o su sal es eficaz en la reduccion de la concentracion de bacterias no deseadas y otros microorganismos no deseados al tiempo que estimula simultaneamente la propagacion y/o el acondicionamiento de microorganismos deseados. Dicha combinacion proporciona un tratamiento sinergico, antimicrobiano sin el uso de antibioticos.
En los metodos definidos en las reivindicaciones 1-6, las etapas pueden realizarse secuencialmente o en un orden diferente. El primer acido organico y el segundo acido organico pueden ponerse en contacto con la levadura o con el hidrato de carbono de fermentacion; o la levadura y el hidrato de carbono fermentable pueden combinarse y luego introducirse el primer acido organico y segundo acido organico en la combinacion de levadura e hidrato de carbono. El primer acido organico y el segundo acido organico pueden combinarse entre sf y luego anadirse al sistema acuoso o pueden anadirse por separado al sistema acuoso. El sistema acuoso puede estar en un sistema continuo o puede estar en un tanque en el caso de un proceso discontinuo.
En los metodos de las reivindicaciones 1-9 los microorganismos “no deseados” que se pretenden reducir son los que compiten por los nutrientes con los microorganismos deseados que promueven los procesos de fermentacion deseados. En este sentido, el primer acido organico y segundo acido organico empleados en el presente metodo preferiblemente no afectan de manea perjudicial al crecimiento y la viabilidad de microorganismos deseados, que promueven la fermentacion, sino que eliminan o suprimen el crecimiento de microorganismos no deseados que interfieren con el proceso de fermentacion. Ademas, la eliminacion o supresion de microorganismos no deseados tiene un efecto favorable sobre el crecimiento y la viabilidad de microorganismos deseados. La produccion de etanol para combustible mediante fermentacion de levaduras se usa como ejemplo de donde puede usarse la presente invencion. Otros procesos de fermentacion que podnan emplear la combinacion de acido cftrico, conjuntamente con acido propionico podnan incluir la produccion de bebidas alcoholicas destiladas, cerveza, vino, productos farmaceuticos, productos intermedios farmaceuticos, productos de panadena, nutraceuticos (productos alimenticios que proporcionan beneficios para la salud, tales como alimentos enriquecidos y complementos dieteticos), productos intermedios nutraceticos, materias primas qmmicas industriales y enzimas. El presente metodo tambien podna utilizarse para tratar levadura usada en la industria panificadora.
La levadura no es el unico microorganismo beneficioso usado en la fermentacion. Tambien podnan usarse microorganismos fermentadores deseados adicionales y resultar beneficiados por la invencion tales como los hongos y las bacterias normalmente usados en la produccion de etanol celulosico. Algunos ejemplos no limitativos de microorganismos fermentadores deseados incluyen, pero no se limitan a, Trichoderma reesei, Trichoderma viride, y Clostridium Ijungdahlii.
El primer acido organico conjuntamente con el segundo acido organico puede anadirse en diversos puntos en los procesos de propagacion, acondicionamiento y/o fermentacion. El primer acido organico, conjuntamente con el segundo acido organico puede anadirse a recipientes de coccion, tanques de fermentacion, tanques de propagacion, tanques de acondicionamiento, tanques iniciadores o durante la licuefaccion. El primer acido organico conjuntamente con el segundo acido organico tambien puede anadirse directamente al macerado de mafz. El primer acido organico conjuntamente con el segundo acido organico tambien puede anadirse al sistema de intercambio de calor intermedio o intercambiadores de calor. El primer acido organico conjuntamente con el segundo acido organico tambien puede anadirse a las tubenas entre estas unidades o intercambiadores de calor.
El primer acido organico conjuntamente con el segundo acido organico puede anadirse directamente a la mezcla de fermentacion. Esto puede realizarse anadiendo el primer acido organico y segundo acido organico conjuntamente con la levadura u otro microorganismo deseado e hidrato de carbono fermentable, por ejemplo durante la fase de SSF (sacarificacion y fermentacion simultaneas). Pueden anadirse directamente las dosificaciones de primer acido organico de entre 200 y 10000 ppm o 200 y 5000 ppm y las dosificaciones de segundo acido organico de entre 200 y
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10000 ppm o 200 y 5000 ppm a la mezcla de fermentacion. La dosificacion es la concentracion en el sistema que esta tratandose.
El primer acido organico conjuntamente con el segundo acido organico tambien puede anadirse al macerado antes del proceso de fermentacion. Pueden anadirse las dosificaciones de primer acido organico de entre 200 y 10000 ppm o 200 y 5000 ppm y dosificaciones de acido organico de entre 200 y 10000 ppm o 200 y 5000 ppm al macerado antes de la fermentacion.
El primer acido organico conjuntamente con el segundo acido organico tambien puede anadirse durante la propagacion y/o el acondicionamiento. Por ejemplo el primer acido organico y el segundo acido organico pueden anadirse a la suspension de levaduras reemplazando una etapa de lavado con acido.
El primer acido organico conjuntamente con el segundo acido organico puede usarse para lograr resultados mejorados en la produccion de etanol celulosico. El etanol celulosico es un tipo de etanol que se produce a partir de celulosa, en contraposicion a los azucares y almidones usados en la produccion de etanol basado en hidratos de carbono. La celulosa esta presente en fuentes de biomasa no tradicionales tales como pasto varilla, rastrojo de mafz y restos forestales. Este tipo de produccion de etanol es particularmente atractiva debido a la gran disponibilidad de fuentes de celulosa. El etanol celulosico, por la misma naturaleza del material de partida, introduce niveles superiores de contaminantes y microorganismos competidores en el proceso de fermentacion. El primer acido organico usado conjuntamente con el segundo acido organico puede usarse en la produccion de etanol celulosico para controlar microorganismos no deseados.
Hay dos procesos principales de produccion de alcohol a partir de celulosa. Un proceso es un proceso de hidrolisis que utiliza hongos, como por ejemplo Trichoderma reesei y/o Trichoderma viride. El otro es un proceso de gasificacion usando una bacteria tal como Clostridium Ijungdahlii. El primer acido organico conjuntamente con el segundo acido organico puede utilizarse en cualquier proceso.
En el proceso de hidrolisis las cadenas de celulosa se descomponen en azucares de cinco carbonos y seis carbonos antes del proceso de fermentacion. Esto se realiza o bien qmmica o bien enzimaticamente.
En el metodo de hidrolisis qmmica la celulosa puede tratarse con acido diluido a alta temperatura y presion o acido concentrado a menor temperatura y presion atmosferica. En el proceso de hidrolisis qmmica la celulosa reacciona con el acido y agua para formar moleculas de azucar individuales. Estas moleculas de azucar se neutralizan entonces y se usa la fermentacion de levadura para producir etanol. El primer acido organico conjuntamente con el segundo acido organico puede usarse durante la parte de fermentacion de levadura de este metodo.
La hidrolisis enzimatica puede llevarse a cabo usando dos metodos. El primero se conoce como conversion microbiana directa (DMC). El metodo de DMC usa un unico microorganismo para convertir la biomasa celulosica en etanol. El etanol y las enzimas requeridas se producen por el mismo microorganismo. El primer acido organico conjuntamente con los segundos acidos organicos puede usarse durante las etapas de propagacion/acondicionamiento o fermentacion con este organismo especializado.
El segundo metodo se conoce como metodo de hidrolisis enzimatica. En este metodo las cadenas de celulosa se descomponen usando enzimas celulasa. Estas enzimas estan presentes normalmente en los estomagos de rumiantes, tales como vacas y ovejas, para descomponer la celulosa que comen. El metodo enzimatico se lleva a cabo normalmente en cuatro o cinco fases. La celulosa se trata previamente para preparar el material de partida, tal como madera o paja, mas propenso a la hidrolisis. A continuacion se usan las enzimas celulasa para romper las moleculas de celulosa en azucares fermentables. Tras la hidrolisis, los azucares se separan de los materiales residuales y se anaden a la levadura. Los azucares del hidrolizado se fermentan para dar etanol usando levadura. Finalmente, se recupera el etanol mediante destilacion. Alternativamente, la hidrolisis y fermentacion pueden llevarse a cabo juntas usando hongos o bacterias especiales que logran ambos procesos. Cuando se llevan a cabo ambas etapas juntas, el proceso se denomina hidrolisis y fermentacion secuenciales (SHF).
El primer acido organico y segundo acido organico pueden introducirse para lograr la eficacia microbiologica en diversos puntos en el metodo enzimatico de hidrolisis. El primer acido organico conjuntamente con el segundo acido organico puede usarse en la produccion, fabricacion y fermentacion de enzimas celulasa producidas por Trichoderma y otras cepas fungicas. El primer acido organico y segundo acido organico pueden anadirse en la fase de sacarificacion y fermentacion simultaneas (SSF) celulosicas. El primer acido organico y segundo acido organico pueden introducirse en la fase de hidrolisis y fermentacion secuenciales (SHF). Podnan introducirse tambien en un punto antes, durante o despues de la fermentacion por hongos celulolfticos que crean las enzimas celulasa. Alternativamente el primer acido organico y segundo acido organico pueden anadirse durante la fase de fermentacion de levadura, tal como se comento anteriormente.
El proceso de gasificacion no rompe la cadena de celulosa en moleculas de azucar. En primer lugar, el carbono en la celulosa se convierte en monoxido de carbono, dioxido de carbono e hidrogeno en una reaccion de combustion parcial. Entonces, el monoxido de carbono, dioxido de carbono e hidrogeno se suministran a un fermentador
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especial que usa un microorganismo tal como Clostridium Ijungdahlii que es capaz de consumir el monoxido de carbono, dioxido de carbono e hidrogeno para producir etanol y agua. Finalmente, el etanol se separa del agua en una etapa de destilacion. El primer acido organico conjuntamente con el segundo acido organico puede usarse como agente antimicrobiano en la etapa de fermentacion que implica microorganismos tales como Clostridium Ijungdahlii que son capaces de consumir monoxido de carbono, dioxido de carbono e hidrogeno para producir etanol y agua.
En una realizacion no limitativa, el primer acido organico y el segundo acido organico se anaden a un tanque y se diluyen hasta una concentracion predeterminada a una razon predeterminada. En el tanque, el primer acido organico y el segundo acido organico se disuelven en agua para formar una combinacion de primer acido organico y segundo acido organico. La concentracion del primer acido organico y segundo acido organico en el tanque discontinuo puede variar a lo largo de un amplio intervalo. El primer acido organico y segundo acido organico salen entonces del tanque discontinuo a traves de una salida a una tasa de dosificacion especificada para crear una disolucion de la concentracion deseada.
Ejemplos
Los indices de sinergia notificados en los siguientes ejemplos usan la siguiente formula, que se notifico por primera vez en F.C. Kull, P.C. Eisman, H.D. Silwestrowka, y R.L. Mayer, Letts. En Applied Microbiology 9:538-541, 196l:
fndice de sinergia = Qa/QA + Qb/QB
en donde Qa es la concentracion de antimicrobiano A requerida para lograr la inhibicion completa del crecimiento del microbio de prueba cuando se usa en combinacion con el antimicrobiano B;
QA es la concentracion de antimicrobiano A requerida para lograr la inhibicion completa del crecimiento del microbio de prueba cuando se usa solo;
Qb es la concentracion de antimicrobiano B requerida para lograr la inhibicion completa del crecimiento del microbio de prueba cuando se usa en combinacion con el antimicrobiano A;
QB es la concentracion de antimicrobiano B requerida para lograr la inhibicion completa del crecimiento del microbio de prueba cuando se usa solo.
Un mdice de sinergia (SI) de 1 indica que las interacciones entre los dos antimicrobianos son meramente aditivas, un SI de mas de uno indica que los dos antimicrobianos son antagonistas entre sf, y un SI de menos de 1 indica que los dos antimicrobianos interaccionan de una manera sinergica.
Aunque hay diversos metodos conocidos por los expertos en la tecnica para medir los niveles de actividad antimicrobiana, en los siguientes ejemplos el criterio de valoracion usado se conoce como concentracion inhibitoria minima, o CIM. Esta es la menor concentracion de una sustancia o sustancias que puede lograr una inhibicion completa del crecimiento.
Con el fin de determinar la concentracion inhibitoria minima, se construye una dilucion en serie a la mitad del antimicrobiano haciendose las diluciones en medio de crecimiento. Se preparan las diluciones en una microplaca de 96 pocillos de manera que cada pocillo tiene un volumen final de 280 |il de medio y antimicrobiano. El primer pocillo tiene, por ejemplo, una concentracion de 1000 ppm de antimicrobiano, el segundo 500 ppm, el tercero 250 ppm, y asf sucesivamente, no teniendo el pocillo 12° y final en la fila antimicrobiano en absoluto y sirviendo como control de crecimiento positivo. Tras construirse la dilucion en serie los pocillos reciben un inoculo de microbio suspendido en medio de crecimiento de manera que la concentracion final de microbios en el pocillo es de ~5 x 105 ufc/ml. En estos ejemplos el microbio de prueba usado es Lactobacillus plantarum. Se incuban los cultivos a 37 °C durante 18-24 horas, y se puntuan los pocillos como positivos o negativos para el crecimiento basandose en un examen visual para detectar pocillos turbios, siendo la turbidez un indicador de crecimiento. La menor concentracion de antimicrobiano que inhibe completamente el crecimiento (por ejemplo, un pocillo transparente) se designa la concentracion inhibitoria minima.
Con el fin de determinar si la interaccion entre dos antimicrobianos es aditiva, antagonista o sinergica contra un microbio diana, se emplea una modificacion del metodo de CIM conocida como el metodo de “damero” usando microplacas de 96 pocillos. Para construir una placa de damero se emplea el primer antimicrobiano usando el metodo de dilucion en serie de dos veces usado para construir una placa de CIM, excepto porque cada una de las ocho filas es una dilucion en serie identica que termina tras la octava columna. Se emplea el segundo antimicrobiano anadiendo volumenes identicos de una dilucion en serie a la mitad en angulos rectos con respecto a la primera serie. El resultado es que cada pocillo de la placa de 8 x 8 pocillos tiene una combinacion diferente de concentraciones de antimicrobiano, produciendo 64 combinaciones diferentes en total. Las columnas 9a y 10a no reciben antimicrobiano en absoluto y sirven como controles de crecimiento positivo y negativo, respectivamente. Tras construirse la microplaca de damero, se inoculo con Lactobacillus plantarum, se incubo a 37 °C y se puntuo tal como se describio para el metodo de CIM.
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Ejemplo 1: Sinergia de acido cftrico con propionato de sodio
Se determinaron las concentraciones inhibitorias mmimas para tanto acido cftrico como propionato de sodio a pH 6 usando el protocolo descrito anteriormente con Lactobacillus plantarum como microbio de prueba. Se construyeron las placas de sinergia de damero tal como se describio, se inocularon los pocillos hasta una concentracion final de ~5 x 105 ufc/ml, se incubaron durante 18-24 horas y luego se puntuaron visualmente para determinar el crecimiento/ausencia de crecimiento. Se calcularon los indices de sinergia segun la formula descrita por Kull et al. Este ejemplo demuestra que el efecto de combinar acido cftrico y propionato de sodio es mayor que el efecto de cualquier antimicrobiano solo. La cantidad de acido cftrico necesaria para inhibir el crecimiento bacteriano se reduce en mas de un orden de magnitud, desde 100.000 ppm hasta 3.125-6.250 ppm. La concentracion de propionato de sodio desciende en al menos el 50 por ciento, desde 100.000 ppm hasta un intervalo de 12.500-50.000 ppm.
Tabla 1
Usados solos
Usados en combinacion
CIM de acido cftrico (QA), ppm
CIM de acido propionico (QB), ppm CIM de acido cftrico (Qa), ppm CIM de acido propionico (Qb), ppm Razon de acido cftrico:propionato de sodio indice de sinergia
100000
100000
6250 12500 1:2 0,19
100000
100000
3125 50000 1:16 0,53
Ejemplo 2: Sinergia de acido citrico con propionato de sodio
Se determinaron las concentraciones inhibitorias mmimas para tanto acido cftrico como propionato de sodio a pH 5 usando el protocolo descrito anteriormente con Lactobacillus plantarum como microbio de prueba. Se usaron diferentes pH para las pruebas debido a que estos acidos organicos debiles tienen diversos valores de pKa que influyen en su eficacia. A pH 5, la CIM del acido cftrico se reduce desde 100.000 ppm (pH 6) hasta 25.000 ppm. Se construyeron placas de sinergia de damero tal como se describio, se inocularon los pocillos hasta una concentracion final de ~5 x 105 ufc/ml, se incubaron durante 18-24 horas y luego se puntuaron visualmente para determinar el crecimiento/ausencia de crecimiento. Se calcularon los indices de sinergia segun la formula descrita por Kull et al. Este ejemplo demuestra que el efecto de combinar acido cftrico y propionato de sodio es mayor que el efecto de cualquier antimicrobiano solo. La cantidad de acido cftrico necesaria para inhibir el crecimiento bacteriano se reduce en el 50 % o mas, desde 25.000 ppm hasta 3.125-12.500 ppm. La concentracion de propionato de sodio desciende un 50 % o mas, desde 100.000 ppm hasta un intervalo de 391-50.000 ppm.
Tabla 2
Usados solos Usados en combinacion
CIM de acido cftrico (QA), ppm CIM de propionato de sodio (QB), ppm CIM de acido cftrico (Qa) ppm CIM de propionato de sodio (QB), ppm Razon de acido cftrico:propionato de sodio indice de sinergia
2a
25000 100000 25000 391 64:1 1,00
2b
25000 100000 12500 391 32:1 0,50
2c
25000 100000 6250 25000 1:4 0,50
2d
25000 100000 3125 50000 1:16 0,63

Claims (6)

  1. 10
    15
  2. 2.
  3. 3.
    20
  4. 4.
    25
  5. 5.
    30
    35
    40 6.
    45
    50
  6. 7.
    55 8.
    REIVINDICACIONES
    Metodo de control de la concentracion de microorganismos no deseados en un sistema acuoso empleado en un proceso de fermentacion, comprendiendo el metodo las etapas de:
    (a) introducir un hidrato de carbono fermentable en una disolucion acuosa;
    (b) introducir al menos una levadura en dicha disolucion;
    (c) introducir un primer acido organico y un segundo acido organico en el sistema acuoso,
    en el que el primer acido organico es acido dtrico o su sal, el segundo acido organico es acido propionico o su sal, y la razon del primer acido organico o su sal con respecto al segundo acido organico o su sal es de desde 32:1 hasta 1:32.
    Metodo segun la reivindicacion 1, en el que el primer acido organico tiene una concentracion de al menos 100 ppm en el sistema acuoso que esta tratandose.
    Metodo segun la reivindicacion 1, en el que el primer acido organico tiene una concentracion de al menos 100 ppm y hasta 12500 ppm en el sistema acuoso que esta tratandose.
    Metodo segun la reivindicacion 1, en el que la razon de acido cftrico con respecto a acido propionico es de desde 32:1 hasta 1:16 y la cantidad del primer acido organico en el sistema acuoso que va a tratarse es de desde 100 hasta 12500 ppm.
    Metodo de control de la concentracion de microorganismos no deseados en una disolucion de fluido acuoso empleada en un proceso de fermentacion, comprendiendo el metodo las etapas de:
    (a) introducir un hidrato de carbono fermentable en una disolucion acuosa
    (b) introducir al menos un microorganismo deseado que es capaz de fermentar hidrato de carbono en dicha disolucion acuosa;
    (c) introducir un primer acido organico y un segundo acido organico en el sistema acuoso,
    en el que el primer acido organico es acido dtrico o su sal, el segundo acido organico es acido propionico o su sal, y la razon del primer acido organico o su sal con respecto al segundo acido organico o su sal es de desde 32:1 hasta 1:32.
    Metodo de control del crecimiento microbiano no deseado en caldos de fermentacion o sistemas o procesos de fermentacion industriales, consistiendo el metodo en la etapa de anadir a un caldo de fermentacion o sistema o proceso de fermentacion industrial una composicion acuosa que comprende:
    (a) un primer acido organico y
    (b) un segundo acido organico;
    en el que el primer acido organico es acido dtrico o su sal; el segundo acido organico es acido propionico o su sal; y la razon del primer acido organico o su sal con respecto al segundo acido organico o su sal es de desde 32:1 hasta 1:32.
    Metodo segun la reivindicacion 6, en el que el primer acido organico tiene una concentracion de al menos 100 ppm en el sistema acuoso.
    Metodo segun la reivindicacion 6, en el que el primer acido organico tiene una concentracion de al menos 100 ppm y hasta 12500 ppm en el sistema acuoso que esta tratandose.
    Metodo segun la reivindicacion 6, en el que la razon de acido dtrico con respecto a acido propionico es de desde 32:1 hasta 1:16 y la cantidad del primer acido organico en el sistema acuoso que va a tratarse es de desde 100 hasta 12500 ppm.
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