ES2681443T3 - Andamiaje de glucomanano para el cultivo e ingeniería de tejidos tridimensionales - Google Patents

Andamiaje de glucomanano para el cultivo e ingeniería de tejidos tridimensionales Download PDF

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Abstract

Un método para preparar un andamiaje de glucomanano neutralizado, comprendiendo el método poner en contacto un andamiaje de glucomanano básico que tiene un pH mayor de 8 con una solución acuosa a una presión de 690 Pa a 340 kPa por encima de la presión atmosférica, para formar un andamiaje de glucomanano neutralizado que tiene un pH de 6,0 a 8,0, preparando así el andamiaje de glucomanano neutralizado.

Description

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DESCRIPCION
Andamiaje de glucomanano para el cultivo e ingeniería de tejidos tridimensionales Referencia cruzada con solicitudes relacionadas
La presente solicitud reivindica prioridad a la Solicitud Provisional de los Estados Unidos N.° 61/564.553, presentada el 29 de noviembre de 2011.
Antecedentes de la invención
La ingeniería de biomateriales para reparar tejidos dañados o enfermos tales como el tejido cardíaco, óseo, hepático, corneal y piel es una rama activa de investigación en la medicina regenerativa. Un enfoque que se está investigando es el uso de células combinado con construcciones de biomaterial, o andamiajes, que facilitan el crecimiento y la diferenciación celular para crear tejidos funcionales in vitro que se puedan implantar. Los sistemas de cultivo de tejido tridimensional (3D), que emulan rasgos moleculares y físicos clave del microambiente extracelular, proporcionan grandes ventajas a la ingeniería de tejidos.
Los biomateriales pueden ser de origen natural, tal como biomateriales a base de proteínas y polisacáridos, o sintéticos, por ejemplo, biomateriales a base de polímero, péptido y cerámica. La exploración rigurosa de propiedades tales como inmunogenicidad, biodegradabilidad, biocompatibilidad, facilidad de modificación y permeabilidad es necesaria para el diseño y desarrollo de estos biomateriales para la ingeniería de tejidos clínica. La alta porosidad y el tamaño de poro adecuado, en particular, son importantes para la siembra y difusión celular de células y nutrientes.
La fácil disponibilidad y biocompatibilidad de biomateriales naturales tales como colágeno, alginato y quitosano han convertido a estos biomateriales naturales en sustratos atractivos para el cultivo de tejidos 3D. Sin embargo, las dificultades que presentan las propiedades mecánicas y el comportamiento inconsistentes de las células cultivadas limitan su aplicación clínica.
Para la ingeniería ósea, se ha demostrado que la porosidad y el tamaño de los poros de los andamiajes es un factor crítico. Estudios previos han indicado que los poros mayores (-200-300 pm) dan como resultado un área de superficie mayor que puede promover el intercambio de iones/gas, la adsorción de proteínas y la mineralización de la apatita ósea (Karageorgiou et al. Biomaterials 2005 26:5474- 91; Yuan et al. Biomaterials 1999 20:1799-806). También se cree que puede ser necesario un tamaño de poro mayor para vascularizar implantes e imitar la superficie cortical y el interior esponjoso del hueso natural (Karageorgiou et al. Biomaterials 2005 26:5474-91). Como tal, existe una necesidad de andamiajes con grandes poros que se puedan cultivar con células óseas y usar para la regeneración ósea.
El glucomanano es un polisacárido de origen natural compuesto por una relación 1:1,6 entre D-glucosa unida por enlaces (3-1,4 y D-manosa con ramas aproximadamente cada 11 residuos (Alonso-Sande et al. Eur J Pharm Biopharm. 2009 72:453-62). El glucomanano tiene una estructura principal de aproximadamente 5-10 % de grupos acetilo sustituidos que participan en el enlace de hidrógeno e interacciones hidrófobas que otorgan solubilidad. La hidrólisis del grupo acetilo en presencia de un álcali disminuye la solubilidad del glucomanano y da como resultado la agregación seguida de la formación de gel. El glucomanano se usa comúnmente en alimentos como emulsionante o espesante y se está investigando para aplicaciones biofarmacéuticas debido a sus propiedades gelificantes y biodegradables, así como a su maleabilidad para que adopte la forma de películas, perlas e hidrogeles. Se han desarrollado perlas, micropartículas y nanoparticulas a base glucomanano para la administración de ADN y fármacos (Liu et al. Drug Deliv. 2007 14:397-402; Wang et al. Int J Pharm. 2002 244:117-26; Wen et al. Int J Biol Macromol. 2008 42:256-63) sin observarse señales significativas de toxicidad oral, sensibilización de la piel, toxicidad intestinal, embriotoxicidad o envejecimiento celular observado (Konishi et al. Jpn J Exp Med. 1984 54:139- 42).
El glucomanano se ha investigado recientemente para su uso como andamiajes compuestos para el cultivo de condrocitos y andamiajes inyectables para la regeneración del cartílago (Kondo et al. J Tissue Eng Regen Med. 2009 3:361-7). Esta investigación dio como resultado la producción de un glucomanano konjac/hidrogel de ácido hialurónico, en el que las células se cultivan y dejan aglomerar como una suspensión en el gel. Sin embargo, aún se tiene que explorar el desarrollo de glucomanano como andamiaje poroso para aplicaciones de ingeniería de tejidos.
Sorprendentemente, la presente invención proporciona una matriz microporosa de glucomanano capaz de promover el crecimiento celular y útil como un novedoso andamiaje de biomaterial para el cultivo celular e ingeniería tisular 3D, así como para la regeneración de tejido in vivo, por ejemplo, la regeneración ósea.
Breve sumario de la invención
Se ha encontrado que cuando se neutraliza un andamiaje de glucomanano básico, el andamiaje de glucomanano
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neutralizado resultante es útil como matriz para el cultivo celular e ingeniería tisular tridimensionales (3D). El andamiaje de glucomanano neutralizado tiene un pH que es adecuado para un crecimiento celular eficaz y una estructura porosa que puede permitir la difusión de oxígeno, nutrientes, productos expresados y residuos celulares. Además, el andamiaje de glucomanano neutralizado de la invención es adecuado para la modificación superficial para promover la proliferación y adhesión celular. Este andamiaje de biomaterial de origen natural es térmicamente estable, no tóxico y biodegradable y puede imitar el microambiente tridimensional natural de un amplio abanico de tipos celulares, tales como osteoblastos, hepatocitos, linfocitos y células madre.
La presente invención proporciona un método para preparar un andamiaje de glucomanano neutralizado, método que comprende el contacto de un andamiaje de glucomanano básico que tiene un pH mayor de 8 con una solución acuosa a una presión de 690 Pa a 340 kPa por encima de la presión atmosférica, para formar un andamiaje de glucomanano neutralizado que tiene un pH de 6,0 a 8,0, preparando así el andamiaje de glucomanano neutralizado.
La presente invención también proporciona un método para preparar un andamiaje de glucomanano neutralizado, método que comprende el contacto de un andamiaje de glucomanano básico que tiene un pH mayor de 8 con una solución acuosa a una presión de vacío, para formar un andamiaje de glucomanano neutralizado que tiene un pH de 6,0 a 8,0, preparando así el andamiaje de glucomanano neutralizado.
En otra realización, la presente invención proporciona un método para cultivar células en un andamiaje de glucomanano neutralizado, que incluye calentar una mezcla de reacción del andamiaje de glucomanano neutralizado de la presente invención y una célula, de modo que la célula se multiplique, cultivando así células en el andamiaje de glucomanano neutralizado.
En otra realización, la presente invención proporciona un andamiaje de glucomanano neutralizado, preparado mediante el método descrito anteriormente, que tiene un pH de 6,0 a 8,0.
En otra realización, el andamiaje de glucomanano neutralizado comprende un promotor de la adhesión celular.
En un aspecto adicional, la presente divulgación proporciona un método para degradar el andamiaje de glucomanano neutralizado de la presente invención mediante el contacto del andamiaje de glucomanano neutralizado con un agente de degradación.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra una micrografia electrónica de barrido (topología de superficie) de un andamiaje de glucomanano y células madre mesenquimales humanas (hMSC) que muestra la superficie (A) y la estructura interna (B) de un gel de glucomanano después de la sublimación del agua y hMSC sembradas en el andamiaje de glucomanano (C, D).
La Figura 2 muestra los efectos de la poli-L-lisina (PLL) en la adherencia de hMSC. Se añadió PLL a la mezcla de glucomanano antes de la gelificación. Las hMSC mostraban una unión significativamente mayor al andamiaje resultante en comparación con el control (p<0,05).
Las Figuras 3a y 3b muestran la bioluminiscencia de hMSC cultivadas en el andamiaje de glucomanano. Las hMSC que expresan la luciferasa de luciérnaga se sembraron en los andamiajes de glucomanano tratado con PLL o de control y fueron fotografiados semanalmente. Las células cultivadas en andamiajes de control mostraron un aumento en el nivel de bioluminiscencia con el tiempo. Sin embargo, las hMSC cultivadas en andamiajes de glucomanano se restringieron al sitio de siembra y no mostraron aumento en la bioluminiscencia.
La Figura 4 muestra la histología de las hMSC en el andamiaje de glucomanano. Las hMSC cultivadas en andamiajes de glucomanano se tiñeron con hematoxilina y eosina. El andamiaje de glucomanano antes de la siembra de las células mostraba estructuras porosas [200-300 pm] en todas partes (A). Después de la siembra, las células mostraron diferente morfología y se formaron en estructuras (B-D) (aumento de 10x).
La Figura 5 muestra la expresión de vimentina y citoqueratina. Todas las hMSC cultivadas en placas de cultivo mostraron una fuerte expresión de vimentina (B) pero no de citoqueratina (A). Las células sembradas en andamiajes de glucomanano mostraron expresión de vimentina (D, C = control de isotipo). Las células que rodean los lúmenes con forma irregular mostraban una fuerte expresión de citoqueratina y las células planas que revisten estos lúmenes expresaban tanto vimentina como citoqueratina (E, F) .
La Figura 6 muestra la digestión enzimática del andamiaje de glucomanano. Los andamiajes de glucomanano sembrados con rhMSC se digirieron con 0,5, 5,0 y 50 unidades/ml de celulosa o p-mananasa y las células liberadas del andamiaje se tripsinizaron y contaron. Los andamiajes incubados con celulasa mostraron una liberación eficiente de células en todas las concentraciones. Sin embargo, las concentraciones más altas de p- mananasa dieron como resultado recuentos celulares subóptimos, mientras que 0,5 unidades/ml mostraban resultados similares a la celulosa (C). Los agregados celulares liberados se lavaron y cultivaron durante la noche
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(A). Se observó un crecimiento de las células (B). Aumento = 10x, inserto = 20x.
La Figura 7 muestra la diferenciación osteogénica de las hMSC sembradas en andamiajes de glucomanano. Las rhMSC sembradas en andamiajes de glucomanano y cultivadas con y sin medio de inducción osteogénico se tiñeron con anticuerpos contra osteopontina humana y sialoproteína ósea II (BSP II). Las hMSC inducidas mostraban tanto expresión de osteopontina como de bSp II. Las células no inducidas iniciaron la expresión de BSP II. La tinción de Von Kossa mostró depósitos minerales tanto en andamiajes inducidos como no inducidos. Aumento = 10x.
La Figura 8 muestra una micrografia electrónica de barrido de hMSC co- cultivadas con células hematopoyéticas CD34+ en andamiajes de glucomanano. Las hMSC se sembraron en andamiajes de glucomanano y se cocultivaron con células hematopoyéticas CD34+. Las imágenes de SEM mostraban la adherencia de las células CD34+ a las hMSC (A-D). Las hMSC mostraban la capacidad de “puentear” un poro (B).
La Figura 9 muestra un andamiaje de glucomanano antes y después de la fabricación. Esta imagen puede ser parte del Ejemplo 1. Se fabricó un andamiaje de glucomanano con una forma de vértebra (arriba a la derecha) y varias formas para ajustarse a las células y recipientes de cultivo usando un cuchillo o punzón de biopsia. Esta figura proporciona un ejemplo de demostración preliminar de la eficacia que muestra que el andamiaje de esta invención se puede fabricar en una variedad de formas que se asemejan a los diferentes sistemas orgánicos.
La Figura 10 muestra una imagen macroscópica de una construcción ósea tridimensional producida usando el andamiaje de glucomanano neutralizado y células madre humanas.
Descripción detallada de la invención
I. Definiciones
Tal como se usa en la presente memoria, el término “glucomanano” se refiere a un oligosacárido de origen natural compuesto por una relación de aproximadamente 1:1,6 entre D-glucosa unida por enlaces (3-1,4 y D- manosa con ramificaciones cada aproximadamente 11 residuos (Alonso-Sande et al. Eur J Pharm Biopharm. 2009 72:453-462) y sus derivados. El glucomanano tiene una estructura principal de aproximadamente 5-10 % de grupos acetilo sustituidos que participan en el enlace de hidrógeno e interacciones hidrófobas que otorgan solubilidad. Los ejemplos de derivados de glucomanano incluyen, pero no se limitan a, derivados solubles en agua tales como derivados de O-alquilo y derivados de O-carboxialquilo, derivados con varios grados de sustitución (p.ej., mayores o menores de 5-10 % de grupos acetilo sustituidos), derivados con varios grados de oxidación, copolímeros de injerto (p.ej., copolímeros de acrilato y acrilamida) y sus sales (p.ej., sales de amonio cuaternario de estos).
Tal como se usa en la presente memoria, la expresión “gel de glucomanano” se refiere a una suspensión homogénea térmicamente estable de glucomanano reticulado. El gel de glucomanano se puede formar de una variedad de formas que incluyen, pero no se limitan a, hidrólisis de los grupos acetilo del glucomanano en presencia de álcali. El gel de glucomanano de la presente invención se puede modificar para promover la adhesión y proliferación celular. Los ejemplos de modificaciones incluyen, pero no se limitan a, la incorporación de un promotor de la adhesión celular, reticulación química, recubrimiento superficial e introducción de grupos funcionales.
Tal como se usa en la presente memoria, la expresión “andamiaje de glucomanano básico” se refiere a una matriz porosa tridimensional formada por deshidratación de un gel de glucomanano y que tiene un pH mayor de aproximadamente 8. El andamiaje de glucomanano básico de la presente invención se puede modificar para promover la adhesión celular y la proliferación. Ejemplos de modificaciones incluyen, pero no se limitan a, incorporación de un promotor de la adhesión celular, recubrimiento superficial y la introducción de grupos funcionales.
Tal como se usa en la presente memoria, la expresión “andamiaje de glucomanano neutralizado” se refiere a una matriz porosa que proporciona un ambiente tridimensional adecuado para la ingeniería de cultivos de células y tejidos, incluida la regeneración de tejido y que tiene un pH de aproximadamente 7. El andamiaje de glucomanano neutralizado de la presente invención se forma neutralizando un andamiaje de glucomanano básico con una solución acuosa. El andamiaje de glucomanano neutralizado de la presente invención se puede modificar para promover la adhesión y proliferación celular.
Tal como se usa en la presente memoria, el término “contacto” se refiere al proceso de poner en contacto al menos dos especies distintas de modo que puedan reaccionar. Sin embargo, se apreciará que el producto de reacción resultante se puede producir directamente a partir de una reacción entre los reactivos agregados o a partir de un intermedio de uno o más de los reactivos agregados que se pueden producir en la mezcla de reacción.
Tal como se usa en la presente memoria, la expresión “promotor de la adhesión celular” se refiere a un agente natural o sintético que potencia la adhesión o unión de células a un sustrato de cultivo, por ejemplo, modificando la superficie del sustrato y/o alterando la carga de la superficie. Un promotor de la adhesión celular también puede
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potenciar la adsorción de suero o proteínas de la matriz extracelular al sustrato del cultivo. Los ejemplos de promotores de la adhesión celular incluyen poli-L-lisina (PLL), poli-D-lisina (PDL), péptido RGD (RGD), kQaGDV, VAPG, FGL, grupos amina y proteínas de la matriz extracelular tales como fibronectina, elastina, colágeno y laminina. El promotor de la adhesión celular también puede promover el crecimiento celular y la diferenciación celular.
Tal como se usa en la presente memoria, la expresión “solución tamponada” se refiere a una mezcla homogénea de un tampón o compuesto iónico que es una mezcla de un ácido débil y su base conjugada o una base débil y su ácido conjugado y que resiste a los cambios de pH en agua. Los ejemplos de tampones incluyen, pero no se limitan a, tampones de fosfato, tales como solución salina tamponada con fosfato (PBS), ácido 3- {[tris(hidroximetil)metil]amino}propanosulfónico (TAPS), 1,3-bis(tris(hidroximetil)metilamino)propano (BIS-TRIS), tris(hidroximetil)metilamina (TRIS), ácido 4-2-hidroxietil-1-piperazinaetanosulfónico (HEPES), ácido 2- {[tris(hidroximetil)metil]amino} etanosulfónico (TES), ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico (MOPS), ácido piperazin- N,N'-bis(2-etanosulfónico) (PIPES) y ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES).
Tal como se usa en la presente memoria, la expresión “solución ácida” se refiere a una mezcla homogénea de un ácido o sustancia que actúa como donante de protones en agua. Una solución ácida tiene un pH menor que 7. Los ejemplos de soluciones ácidas incluyen, pero no se limitan a, ácido clorhídrico, ácido acético, ácido tartárico, ácido málico y ácido cítrico.
Tal como se usa en la presente memoria, el término “solución alcalina” se refiere a una solución básica que contiene la sal de un metal alcalino o metal alacalinotérreo, que tiene un pH mayor que 7. Las sales representativas de metales alcalinos y alcalinotérreos incluyen, pero no se limitan a, hidróxido de sodio, carbonato de sodio, hidróxido de potasio, carbonato de potasio, hidróxido de magnesio, carbonato de magnesio, hidróxido de calcio y carbonato de calcio.
Tal como se usa en la presente memoria, la expresión “medio de cultivo celular” se refiere a una sustancia que soporta el crecimiento de células. Un medio de cultivo celular generalmente contiene una mezcla de nutrientes disueltos en una solución tamponada y diferentes tipos de medios de cultivo celular son útiles para cultivar diferentes tipos de células. Los ejemplos de medios de cultivo celular incluyen, pero no se limitan a, medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI), medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), medio esencial mínimo (MEM), medio de Eagle modificado por Dulbecco: medio de mezcla de nutrientes F-12 (DMEM/F12), medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM), un medio de la Colección Americana de Cultivos Tipo (NCTC) y medio de inducción osteogénica (OIM).
Tal como se usa en la presente memoria, el término “degradar” se refiere a la rotura de los enlaces de reticulación que sostienen el andamiaje unido. La degradación se logra usando un agente de degradación que hidroliza los enlaces glicosídicos. El agente de degradación del andamiaje puede ser cualquier producto químico o enzima, tal como la endo-1,4-p-mananasa, la manano endo-1,4-p-manosidasa, la glicosil hidrolasa o la celulasa, que no digiere células unidas o incrustadas en un andamiaje de glucomanano neutralizado. Otras enzimas son útiles en la presente invención.
II. Andamiaje de glucomanano neutralizado
La presente invención proporciona un andamiaje de glucomanano neutralizado como un andamiaje novedoso para la ingeniería de cultivos celulares y de tejidos tridimensionales. El andamiaje de glucomanano neutralizado proporciona un ambiente neutro y una estructura altamente porosa y un tamaño de poro adecuado para cultivar células. El andamiaje de glucomanano neutralizado puede incorporar un promotor de la adhesión celular. Además, el andamiaje es homogéneo, térmicamente estable, elástico, biocompatible y biodegradable, y puede tener cualquier forma y tamaño adecuado para el cultivo e ingeniería de tejidos en 3D, por ejemplo, mediante moldeado o corte. El andamiaje de glucomanano neutralizado también se puede esterilizar mediante autoclave, haciéndolo útil para su implantación y otras aplicaciones in vivo.
A diferencia de los andamiajes a base de alginato (por ej., AlgiMatrix), no se limita el tamaño del andamiaje de glucomanano neutralizado. Además, el andamiaje de glucomanano neutralizado se puede modificar para lograr adherencia celular en un único paso en comparación con el requisito de reacciones químicas complejas múltiples para modificar andamiajes a base de alginato.
El andamiaje de glucomanano neutralizado se puede preparar mediante cualquier condición adecuada para neutralizar un andamiaje de glucomanano básico. Por ejemplo, el andamiaje de glucomanano básico se puede exponer a una solución acuosa en un ambiente caliente, tal como en un autoclave. De manera alternativa, las condiciones adecuadas implican el enjuague continuo del andamiaje de glucomanano básico usando una solución acuosa durante un período de tiempo adecuado.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un método para preparar un andamiaje de glucomanano neutralizado, incluyendo el contacto de un andamiaje de glucomanano básico que tiene un pH mayor
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de 8 con una solución acuosa a una presión de 690 Pa a 340 kPa por encima de la presión atmosférica, para formar el andamiaje de glucomanano neutralizado que tiene un pH de 6,0 a 8,0, preparando así el andamiaje de glucomanano neutralizado.
El andamiaje de glucomanano básico puede tener cualquier pH adecuado mayor de 8,0. Los ejemplos de pH adecuado incluyen 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 10,5, 11,0 y más.
El andamiaje de glucomanano neutralizado puede tener cualquier pH adecuado de aproximadamente 7. Los ejemplos de pH adecuado incluyen de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 8,0, tal como de aproximadamente 6,1 a aproximadamente 7,9, de aproximadamente 6,2 a aproximadamente 7,8, de aproximadamente 6,3 a aproximadamente 7,7, de aproximadamente 6,4 a aproximadamente 7,6, y de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,5.
El contacto puede realizarse a cualquier temperatura adecuada. Por ejemplo, la temperatura puede ser temperatura ambiente, mayor que temperatura ambiente o menor que temperatura ambiente. En algunas realizaciones, la temperatura es adecuada para formar vapor. En algunas realizaciones, la temperatura puede ser de 0 °C a 200 °C, o de 20 °C a 200 °C, o de 20 °C a 150 °C, o de 0 °C a 30 °C, o de 0 °C a 130 °C, o de 20 °C a 100 °C, o de 20 °C a 50 °C, o de 30 °C a 50 °C, o de 50 °C a 200 °C, o de 75 °C a 150 °C, o de 100 °C a 150 °C. La temperatura también puede ser de 0 °C, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 o 200 °C. La temperatura también puede ser de 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 o 45 °C. En algunas realizaciones, el contacto se puede realizar a una temperatura de 0 °C a 130 °C. En otras realizaciones, el contacto se puede realizar a una temperatura de 20 °C a 50 °C. Incluso en otras realizaciones, el contacto se puede realizar a una temperatura de 37 °C. En algunas realizaciones, la temperatura es la temperatura ambiente.
En algunas realizaciones, el contacto se puede realizar a presión reducida o aumentada. En algunas realizaciones, el contacto se realiza por encima de la presión atmosférica. En algunas realizaciones, el contacto se puede realizar a una presión de 0,68 kPa a 344,73 kPa por encima de la presión atmosférica. En algunas realizaciones, el contacto se puede realizar a una presión de 6,89 kPs a 344,73 kPa por encima de la presión atmosférica. Otras presiones útiles incluyen aproximadamente 34,47, 69,94, 103,42, 137,89, 172,36, 206,84, 241,31, 275,79 o aproximadamente 310,26 kPa por encima de la presión atmosférica. En otra realización, el contacto se realiza a una presión de 6,89 kPa a aproximadamente 206,84 kPa por encima de la presión atmosférica.
En algunos aspectos de la divulgación, cualquier combinación de temperatura y presión se puede usar para neutralizar el andamiaje de glucomanano básico. Por ejemplo, la temperatura puede ser suficiente para generar vapor, tal como más de 100 °C, y la presión puede ser mayor que la presión atmosférica, tal como de 0,68 kPa a 344,73 kPa por encima de la presión atmosférica. Otras combinaciones de temperatura y presión son útiles en la presente divulgación, tal como a temperatura y presión atmosférica.
El contacto se puede realizar durante cualquier periodo de tiempo adecuado. En algunas realizaciones, el período de tiempo puede ser de 1 minuto a 1 mes. En otras realizaciones, el contacto se puede realizar de 1 hora a 1 semana. En otras realizaciones, el contacto se puede realizar de 1 hora a 1 día. Incluso en otras realizaciones, el contacto se puede realizar desde 8 a 20 horas.
El andamiaje de glucomanano básico puede incluir una variedad de otros componentes. Por ejemplo, en el andamiaje de glucomanano básico se pueden incorporar promotores de la adhesión celular, moléculas quimiotácticas y moléculas de señalización celular.
En algunas realizaciones, el andamiaje de glucomanano básico incluye un promotor de la adhesión celular adecuado. Los promotores de la adhesión celular útiles en la presente invención son capaces de adherir células al andamiaje de glucomanano. Los promotores de la adhesión celular también pueden promover el crecimiento celular y/o promover la diferenciación celular. Los ejemplos de promotores de la adhesión celular incluyen, pero no se limitan a, poli-L-lisina (PLL), poli-D-lisina (PDL), péptido RGD (RGD), KQAGDV, VAPG, FGL, grupos amina, y proteínas de la matriz extracelular tales como fibronectina, elastina, colágeno y laminina. En algunas realizaciones, el promotor de la adhesión celular puede ser poli-L-lisina (PLL), poli-D-lisina (PDL), péptido RGD (RGD), KQAGDV, VAPG, FGL, grupos amina, fibronectina, elastina, colágeno o laminina. Las proteínas de la matriz extracelular pueden ser de cualquier fuente adecuada, que incluye, pero no se limitan a, células de mamífero. En algunas realizaciones, el promotor de la adhesión celular es PLL o RGD. En determinadas realizaciones, el promotor de la adhesión celular es PLL.
En algunas realizaciones, el andamiaje de glucomano básico comprende un promotor de la adhesión celular.
En otra realización, el andamiaje de glucomanano básico incluye una molécula quimiotáctica adecuada. Los ejemplos de moléculas quimiotácticas incluyen, pero no se limitan a, suero, quimiocinas, proteínas morfogenéticas, factores de crecimiento, hialuronano.
En otra realización, el andamiaje de glucomanano básico incluye una molécula de señalización celular adecuada.
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Los ejemplos de moléculas de señalización celular incluyen, pero no se limitan a, proteínas de matriz extracelular, motivos de péptido y factores de crecimiento.
La solución acuosa puede tener cualquier composición adecuada. La solución acuosa puede ser agua o una mezcla de agua y uno o más agentes no alcalinos que no degraden ni digieran el andamiaje de glucomanano neutralizado. Los ejemplos de solución acuosa adecuada incluyen, pero no se limitan a, agua, una solución tamponada, una solución ácida y un medio de cultivo celular. En algunas realizaciones, la solución acuosa es agua, una solución tamponada, una solución ácida o un medio de cultivo celular.
En una realización, la solución acuosa es una solución tamponada. Los ejemplos de soluciones tamponadas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, PBS, TAPS, BIS-tRiS propano, TRIS, HEPES, TES, MOPS, PIPES y MES. En algunas realizaciones, la solución tamponada es PBS, hEpES, MES, MOPS, TRIS o BIS-TRIS Propano. En determinadas realizaciones, la solución tamponada es PBS.
En otra realización, la solución acuosa es una solución ácida. Los ejemplos de soluciones ácidas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, ácido clorhídrico, ácido acético, ácido tartárico, ácido málico y ácido cítrico.
En otra realización, la solución acuosa es un medio de cultivo celular. Los ejemplos de medios de cultivo celular adecuados incluyen, pero no se limitan a, medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI), medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), medio esencial mínimo (MEM), medio de Eagle modificado por Dulbecco: medio de mezcla de nutrientes F-12 (DMEM/F12), medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM), un medio de la Colección Americana de Cultivos Tipo (NCTC) y medio de inducción osteogénica (OIM). En algunas realizaciones el medio de cultivo celular es el medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI), medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), medio esencial mínimo (MEM), medio de Eagle modificado por Dulbecco: medio de mezcla de nutrientes F- 12 (DMEM/F12), medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM) o un medio de la Colección Americana de Cultivos Tipo (NCTC).
El método de la invención puede incluir una variedad de etapas adicionales. En algunas realizaciones, el método incluye además formar una mezcla de reacción que incluye polvo de glucomanano, una solución alcalina y agua; calentar la mezcla de reacción a una temperatura de 50 °C a 130 °C para formar un gel de glucomanano; aumentar la presión del gel de glucomanano hasta de 6,89 kPa a 344,73 kPa por encima de la presión atmosférica; enfriar el gel de glucomanano a una temperatura menor de 50 °C y eliminar el agua del gel de glucomanano para formar el andamiaje de glucomanano básico. El andamiaje de glucomanano básico se puede modificar adicionalmente con un promotor de la adhesión celular descrito anteriormente.
El método de la invención puede incluir una variedad de etapas adicionales. En algunas realizaciones, el método incluye además formar una mezcla de reacción que incluye polvo de glucomanano, un promotor de la adhesión celular, una solución alcalina y agua; calentar la mezcla de reacción a una temperatura de 50 °C a 130 °C para formar un gel de glucomanano; aumentar la presión del gel de glucomanano hasta de 6,89 kPa a 344,73 kPa por encima de la presión atmosférica; enfriar el gel de glucomanano a una temperatura menor de 50 °C y eliminar el agua del gel de glucomanano para formar el andamiaje de glucomanano básico.
La solución alcalina puede ser cualquier solución que contiene la sal de un metal alcalino o un metal alcalinotérreo. La solución alcalina es básica, y tiene un pH mayor que 7. Las sales representativas de metales alcalinos y alcalinotérreos incluyen, pero no se limitan a, hidróxido de sodio, carbonato de sodio, hidróxido de potasio, carbonato de potasio, hidróxido de magnesio, carbonato de magnesio, hidróxido de calcio y carbonato de calcio. En algunas realizaciones, la solución alcalina comprende hidróxido de calcio.
El polvo de glucomanano, el promotor de la adhesión celular y el hidróxido de calcio pueden estar todos ellos presentes en la mezcla de reacción en cualquier cantidad adecuada. En algunas realizaciones, el polvo de glucomanano se disuelve en agua para proporcionar una solución de glucomanano que contiene de aproximadamente 1 % a aproximadamente 5 % p/v de glucomanano en agua.
En otras realizaciones, un promotor de la adhesión celular se añade a la solución de glucomanano como una solución acuosa que contiene de aproximadamente 0, 0001 % a aproximadamente 20 % p/v de promotor de la adhesión celular. En una realización, un promotor de la adhesión celular se añade a la solución de glucomanano como una solución acuosa que contiene de aproximadamente 0,0001 % a aproximadamente 10 % p/v de promotor de la adhesión celular. En otra realización, un promotor de la adhesión celular se añade a la solución de glucomanano como una solución acuosa que contiene de aproximadamente 0,0001 % a aproximadamente 1 % p/v de promotor de la adhesión celular.
Incluso en otras realizaciones, el hidróxido de calcio se añade a la solución de glucomanano en una cantidad para proporcionar cualquier relación adecuada entre el hidróxido de calcio y la solución de glucomanano. Por ejemplo, la relación entre el hidróxido de calcio y la solución de glucomanano puede ser de aproximadamente 1:1000 a aproximadamente 1:1 (p/p) . En una realización, la relación es 1:10 (p/p). En otra realización, se añade hidróxido de calcio a la solución de glucomanano como una solución acuosa que contiene de aproximadamente 1 % a
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aproximadamente 2 % p/v de hidróxido de calcio
La mezcla de reacción se puede formar a cualquier temperatura adecuada, tal como las descritas anteriormente para el paso de contacto.
La mezcla de reacción se puede calentar hasta cualquier temperatura adecuada. En algunas realizaciones, la temperatura puede ser mayor de aproximadamente 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130 °C o más. En algunas realizaciones, la mezcla de reacción se puede calentar a una temperatura mayor que aproximadamente 130 °C. En algunas realizaciones, la mezcla de reacción se puede calentar a una temperatura mayor que aproximadamente 80 °C.
En algunas realizaciones, la presión se puede aumentar de 0,68 kPa a 1378,95 kPa por encima de la presión atmosférica. En otras realizaciones, la presión se aumenta de 0,68 kPa a 344,73 kPa por encima de la presión atmosférica. En determinadas realizaciones, la presión se aumenta hasta aproximadamente 206,84 kPa.
La temperatura del gel de glucomanano se puede enfriar hasta cualquier temperatura adecuada. En algunas realizaciones, la temperatura se enfría hasta aproximadamente menos de 80 °C. En determinadas realizaciones, la temperatura se enfría hasta menos de aproximadamente 50 °C.
El agua se puede eliminar del gel de glucomanano por cualquier método adecuado. En algunas realizaciones, la etapa de eliminación se realiza por liofilización, sublimación o trabajo de separación de fases inducida térmicamente. En determinadas realizaciones, el paso de eliminación se realiza por sublimación.
El andamiaje de glucomanano neutralizado puede tener cualquier tamaño de poro adecuado. En algunas realizaciones, el andamiaje de glucomanano neutralizado tiene un tamaño de poro de aproximadamente 100 pm a aproximadamente 400 pm. En otras realizaciones, el andamiaje de glucomanano neutralizado puede tener un tamaño de poro de aproximadamente 150 pm a aproximadamente 350 pm. Incluso en otras realizaciones, el andamiaje de glucomanano neutralizado puede tener un tamaño de poro de aproximadamente 200 pm a aproximadamente 300 pm.
En otros aspectos, la presente divulgación proporciona un método para preparar un andamiaje de glucomanano neutralizado, que incluye el contacto de un andamiaje de glucomanano básico que tiene un pH mayor de aproximadamente 8 con una solución acuosa a una presión mayor de o aproximadamente la presión atmosférica, para formar el andamiaje de glucomanano neutralizado que tiene un pH de aproximadamente 7, preparando así el andamiaje de glucomanano neutralizado.
En otros aspectos de la divulgación, el contacto también se puede realizar a cualquier presión de vacío adecuada. En algunos aspectos, el contacto se puede realizar a una presión de vacío de aproximadamente 0,1 mmHg a 760 mmHg. En algunos aspectos, el contacto se puede realizar a una presión de vacío de aproximadamente 10 mmHg a aproximadamente 500 mmHg. Otras presiones de vacío útiles incluyen aproximadamente 20, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 mmHg. En otro aspecto, el contacto se realiza a una presión de vacío de aproximadamente 68,94 kPa a aproximadamente 300 mmHg. Incluso en otras realizaciones, el contacto se realiza a una presión de vacío de aproximadamente 400 mmHg.
En otra realización, la presente invención proporciona un andamiaje de glucomanano neutralizado, preparado mediante un método descrito anteriormente, que tiene un pH de 6,0 a 8,0.
En otra realización, el andamiaje de glucomanano básico comprende un promotor de la adhesión celular.
La presente divulgación también proporciona un método para degradar el andamiaje de glucomanano neutralizado de la presente invención mediante el contacto del andamiaje de glucomanano neutralizado con un agente de degradación. El agente de degradación puede ser cualquier agente adecuado capaz de hidrolizar los enlaces glicosídicos. El agente de degradación puede ser cualquier producto químico o enzima. Las enzimas útiles como agente de degradación incluyen, pero no se limitan a, endo-1,4 p-mananasa, manano endo-1,4-p-manosidasa, glicosil hidrolasa y celulasa. Otros agentes de degradación incluyen, pero no se limitan a, enzimas, tales como mananasa, pectinasa, xilanasa, glucanasa, galactanasa u otras.
La presente divulgación también proporciona un andamiaje compuesto que comprende el andamiaje de glucomanano neutralizado de la invención y un biomaterial adecuado. Los biomateriales adecuados incluyen biomateriales a base de proteína y a base de polisacárido y biomateriales a base de polímero, péptido y materiales cerámicos. Los ejemplos de biomateriales incluyen, pero no se limitan a, proteínas de la matriz extracelular (p.ej., fibronectina, elastina, colágeno y laminina), alginato, quitosano, ácido hialurónico, Matrigel, gelatina, hidroxiapatita, fosfatos de calcio y vidrios bioactivos.
Los métodos de la presente divulgación se pueden usar para preparar una variedad de andamiajes de glucomanano. En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un andamiaje de glucomanano neutro. El andamiaje de
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glucomanano neutro puede tener un pH de aproximadamente 7.
En algunos aspecto, el andamiaje de glucomanano puede ser un andamiaje de glucomanano básico que tiene un pH igual o mayor de aproximadamente 8.
En algunos aspectos, el andamiaje de glucomanano incluye un promotor de la adhesión celular. Se puede usar cualquier promotor de la adhesión celular adecuado en la presente invención, tal como los descritos anteriormente. En algunos aspectos, el promotor de la adhesión celular puede ser poli-L-lisina (PLL), poli-D-lisina (PDL), péptido RGD (RGD), KQAGDV, VAPG, FGL, grupos amina, fibronectina, elastina, colágeno o laminina. En algunas realizaciones, el promotor de la adhesión celular puede ser poli-L-lisina (PLL).
Tal como se ha descrito anteriormente, el andamiaje de glucomanano de la presente invención se puede preparar por una variedad de métodos, tales como los descritos anteriormente. En algunas realizaciones, el andamiaje de glucomanano de la presente invención se prepara mediante los métodos de la presente invención.
III. Cultivo de células
El andamiaje de glucomanano neutralizado de la presente invención es útil para cultivar células. Las células cultivadas en el andamiaje de glucomanano neutralizado pueden interactuar con otras células y tipos celulares y formar agregados. La adherencia de las células a y la proliferación celular en el andamiaje de glucomanano neutralizado se puede promover mediante la incorporación de un promotor de la adhesión celular. El cultivo a largo plazo es soportado por el andamiaje de glucomanano neutralizado. Cuando se cultivan en el andamiaje de glucomanano neutralizado, las células se pueden someter a proliferación y diferenciación. Por ejemplo, las células madre se pueden diferenciar en linajes funcionales tales como células óseas, cartílago, células de piel y células sanguíneas. Por consiguiente, los procesos celulares tales como osteogénesis, condrogénesis y hematopoyesis se pueden soportar en el andamiaje de glucomanano neutralizado.
En otra realización, la presente invención proporciona un método para cultivar células en un andamiaje de glucomanano neutralizado, que incluye calentar una mezcla de reacción del andamiaje de glucomanano neutralizado de la presente invención y una célula, de modo que la célula se multiplique, cultivando así células en el andamiaje de glucomanano neutralizado. Las células se pueden cultivar in vivo o in vitro.
Los tipos celulares adecuados incluyen, pero no se limitan a, células somáticas, tales como fibroblastos, células de la piel, células endoteliales, células epiteliales, osteocitos, hepatocitos, neuronas y condrocitos y células madre y progenitoras, tales como células progenitoras endoteliales, células madre embrionarias, células madre pluripotentes inducidas, células madre mesenquimales, células madre hematopoyéticas, células madre neuronales y células madre musculares y sus derivados. En algunas realizaciones, la célula es una célula somática. En otras realizaciones, la célula es una célula madre o una célula progenitora. En determinadas realizaciones, la célula es una célula madre. En determinadas otras realizaciones, la célula es un derivado de una célula madre.
Las células cultivadas en el andamiaje de glucomanano neutralizado se pueden recuperar disolviendo el andamiaje de glucomanano usando cualquier agente adecuado. Por ejemplo, el andamiaje de glucomanano se puede disolver usando una o más enzimas tales como mananasa, celulasa, pectinasa, xilanasa, glucanasa, galactanasa u otras. Los expertos en la materia conocen otros agentes para disolver el andamiaje de glucomanano.
IV. Ejemplos
Ejemplo 1: Preparación de la estructura de glucomanano
Se disolvió polvo de glucomanano (1-5 g) en 100 ml de agua destilada y se agitó lentamente durante 5 min, después la solución se incubó a temperatura ambiente durante 60 min. Se añadió una solución de hidróxido de calcio (1,5 %, 10 ml; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) a las soluciones de glucomanano y se mezcló vigorosamente durante 1 min. Se añadió poli-L-lisina (Sigma-Aldrich) (0,001 % a 1 % p/v de solución acuosa) a la mezcla y se calentó hasta 125 °C en una cámara de recuperación durante 30 min. Una vez enfriados hasta temperatura ambiente, los geles de glucomanano se dejaron en remojo con agua destilada durante la noche. Los geles de glucomanano se coloraron en placas de cultivo y después se congelaron en un congelador por chorro de aire durante 30 min a -50 °C o menos. El agua se sublimó usando un sublimador Vitris modelo 50-SRC-5. La temperatura de almacenamiento fue de 12 °C con una temperatura de condensador menor que o igual a -58 °C y el vacío se mantuvo a 80-100 militorr. Los productos de glucomanano resultantes se envasaron a continuación en bolsas de polietileno, selladas al vacío y se almacenaron a -20 °C o menos hasta su uso.
Neutralización del andamiaje de glucomanano
Enjuague con agua antes de la sublimación. Antes de la sublimación del agua, el gel de glucomanano se lavó varias veces en un amplio volumen de agua (aproximadamente 5 litros) durante la noche (16-24 horas). Después de la sublimación del agua, el andamiaje de glucomanano se remojó en agua y el andamiaje se presionó contra un
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indicador de pH. El andamiaje mostró un pH mayor de 10. Esto indicaba que el lavado del gel de glucomanano antes de la sublimación del agua y un breve remojo del andamiaje de glucomanano en agua después de la sublimación del agua eran insuficientes para neutralizar el andamiaje.
Lavado en PBS convencional. El andamiaje de glucomanano se lavó en PBS una o tres veces. Esto dio como resultado una neutralización superficial (solo en superficie) del andamiaje con un pH interno mayor que 9 o 10. El andamiaje de glucomanano también se lavó en PBS durante 10, 30 y 60 minutos. En todos los casos, estos enfoques dieron como resultado una neutralización superficial del andamiaje como se describe anteriormente. Estos hallazgos indicaron que el lavado convencional del andamiaje en una solución tamponada era insuficiente para la neutralización del andamiaje esencial para cultivar células de mamífero.
Lavado en PBS caliente. A continuación, el andamiaje de glucomanano se incubó en PBS a 95-100 °C durante 30 minutos. Se observó una contracción visible del andamiaje. Después de 30 minutos en PBS hirviendo, el andamiaje se cortó y se presionó contra un indicador de pH. La región exterior del andamiaje mostró un pH neutro. Sin embargo, el centro del andamiaje mostró condensación del material de andamiaje y esta región central permaneció fuera del intervalo neutro. En todos los casos descritos anteriormente, el andamiaje se mantuvo a flote, lo que indicó la presencia de bolsas de aire internas. Incluso después del tratamiento con PBS hirviendo durante 30 minutos, el andamiaje se mantuvo a flote con un cambio indeseable notorio en su forma. Estos hallazgos indicaron que la PBS no había desplazado completamente el aire atrapado en el andamiaje, con la consiguiente neutralización insuficiente.
Lavado en PBS presurizado. El andamiaje de glucomanano se transfirió a un vaso de precipitados que contenía PBS y se incubó a 120 °C en una cámara presurizada a 103,42 kPa por encima de presión atmosférica durante 30 minutos. No se observó contracción del andamiaje. El andamiaje se remojó en PBS, indicando un desplazamiento completo de las bolsas de aire con PBS. Los productos de glucomanano se enfriaron y almacenaron en PBS estéril a 4 °C hasta su uso. Se usó un indicador de pH para confirmar que el pH del andamiaje era neutro. Todo el andamiaje mostró un pH neutro sin cambio alguno en la forma.
Lavado en PBS al vacío. El andamiaje de glucomanano se colocó en un filtro y se aplicó una presión de vacío a la parte inferior del andamiaje a 400 mmHg. Se aplicó 1 ml de PBS a la parte superior del andamiaje 10 veces. Después del procedimiento, se usó un indicador de pH para confirmar que el pH del andamiaje era neutro. Todo el andamiaje mostró un pH neutro sin cambio alguno en la forma.
Ejemplo 2: Crecimiento celular en una estructura de glucomanano neutralizada
Preparación de las células. Para las células madre mesenquimales humanas (hMSC), se colocaron en placas células mononucleares de médula ósea (N=3, 1 mujer y 2 varones, de 20-40 años de edad; Cambrex, East Rutherford, NJ, EUA) en placas de 100 mm en a-MEM que contiene 20 % de suero fetal bovino (FBS) , 1 % de L- glutamina y 1 % de penicilina-estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) y se incubó a 37 °C en 5 % de CO2. Las placas se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (FBS) tres veces cada dos días hasta que las células alcanzaron una confluencia de aproximadamente 80 %. Las células se incubaron con 0,25 % de tripsina- EDTA (Invitrogen) durante 5 min a 37 °C. Se añadió medio de cultivo a las células en una relación 1:1 de tripsina- EDTA para inactivarlas. Las células se volvieron a cultivar en placas en medio de cultivo a 5x103 células/cm2. Las células se cultivaron hasta 3 pases, se conservaron criogénicamente usando un protocolo de velocidad controlada en cada pase y se almacenaron en nitrógeno líquido hasta su uso. Las células CD34+, un subconjunto de células mononucleares de médula ósea mencionadas anteriormente se incubaron con anticuerpos CD34 conjugados con PE (clon 581, BD Biosciences, San José, CA, EE.UU.) en tampón de selección (PBS que contiene 0,5 % de albúmina de suero bovino-BSA y EDTA 2 mM en PBS) durante 30 min a 4 °C. Las células se lavaron en tampón de selección y se incubaron con microperlas anti-PE (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania) durante 2,0 min a 4 °C. Las células se lavaron y se volvieron a suspender en 500 pl de tampón de selección, después se aplicaron a las columnas de separación (Miltenyi Biotec). Las columnas de separación se lavaron tres veces y las células retenidas se eluyeron con 1 ml de tampón de selección. Se realizó una segunda ronda de separación de las células eluidas.
Transducción. Las hMSC conservadas criogénicamente del segundo pase se descongelaron y transdujeron con un vector lentiviral derivado del VIH-1 (1x106 partículas infecciosas/ml) que expresan luciferasa de libélula bajo el control del promotor MND en medio que contiene 4 mg/ml de polibreno (Sigma-Aldrich). Las células se incubaron durante la noche, se lavaron con PBS y se volvieron a llenar con medio nuevo. Las células se cultivaron hasta que alcanzaron aproximadamente 80 % de confluencia. Se añadió D-luciferina a un subconjunto de células a 100 mg/ml y se midió la bioluminiscencia usando un luminómetro (Sirius, Berthold, Pforzheim, Alemania) para confirmar el éxito de la transducción.
Siembra de células y estudio de imagen de bioluminiscencia. Se cortaron andamiajes de glucomanano de aproximadamente 1 cm x 1 cm x 0,5 cm (ancho x profundidad x altura), se volvieron a hidratar y se lavaron en PBS 5 veces y se incubaron en medio de cultivo durante la noche. Se sembraron hMSC (1x106/andamiaje) en andamiajes de glucomanano en una placa de 12 pocillos y se cultivaron durante 5 semanas. Se tomaron imágenes de las células en un sistema de imagen IVIS 200 (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, EUA) cada 3-4 días para
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determinar la bioluminiscencia después de añadir 100 mg/ml de D-luciferina a cada pocilio y las imágenes se analizaron usando software Living Image (versión 3.1, Caliper Life Sciences).
Microscopía electrónica de barrido. Las andamiajes de glucomanano con y sin hMSC sembradas se deshidrataron en una serie de etanol graduado. Los andamiajes con hMSC también se co-cultivaron con células CD34 + (1x106) y se incubaron durante 3 días, seguido de deshidratación de etanol. Las muestras se montaron en soportes de muestras de aluminio de 12 mm usando lengüetas doble adhesivas de carbono, recubiertas con un rociado de oro usando un PELCO Auto Sputter Coater SC-7 y se visualizaron en el microscopio electrónico de barrido Philips XL30 TMP.
Ejemplo 3: Digestión enzimática
La endo-1,4 p-mananasa liofilizada (Megazyme) o celulasa obtenida de Aspergillus niger (Sigma-Aldrich) se disolvió en medio de cultivo. Los andamiajes sembrados con hMSC se incubaron en 0,5 unidades/ml, 5,0 unidades/ml o 50 unidades/ml de endo-1,4 p-mananasa o celulasa durante la noche. La degradación de los andamiajes se verificó visualmente. Las células se contaron una vez que los andamiajes se disolvieron completamente.
Ejemplo 4: Diferenciación osteogénica
Los andamiajes sembrados con hMSC se incubaron en medio de inducción osteogénico (Cambrex) o medio de cultivo (control), cambiándose el medio cada 3-4 días siguiendo las recomendaciones del fabricante. Después de 3 semanas, los andamiajes se fijaron en 10 % de formalina seguido de deshidratación de etanol y se incrustaron en parafina. Los andamiajes se dividieron en cortes de 6 mm para tinción inmunohistoquímica y von Kossa.
Inmunocitoquímica. Los cortes (5-6 pm) se trataron con xileno seguido de concentraciones graduadas de etanol. Los portaobjetos se lavaron en PBS antes de realizar la recuperación de antígeno mediada por calor en tampón citrato (pH 6, Invitrogen). Tras el enfriamiento, se aplicaron concentraciones cada vez menores de tampón de citrato templado en PBS seguido de incubación con Background Sniper (BioCare Medical, Concord, CA, EE.UU.) el cual se añadió a cada portaobjetos durante 15 min. Los portaobjetos se lavaron dos veces con PBS seguido de incubación durante 1 h con tampón de bloqueo (1 % de BSA, 0,1 % de gelatina de piel de pescado, 0,1 % de Tritón X, 0,05 % de tween 20) con 2 % de suero de cabra (Sigma-Aldrich). Después de dos lavados con PBS, se incubó anticuerpo primario diluido en tampón de anticuerpo primario (1 % de BSA, 0,1 % de gel de piel de pescado) con portaobjetos durante la noche en una cámara húmeda a 4 °C. Los anticuerpos primarios usados fueron anticuerpo policlonal anti- citoqueratina humana de conejo de amplio espectro (Abcam, Cambridge, MA, EE.UU.) diluido 1:50 y anticuerpo monoclonal anti-vimentina humana de ratón (Sigma-Aldrich) diluido 1:100. Para los marcadores óseos, se usaron anticuerpo monoclonal anti-osteopontina humana de rata y anticuerpo monoclonal anti-sialoproteina ósea II humana de ratón (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.) a 1:200 diluciones. Se incluyeron controles de isotipo de IgG de ratón, rata y conejo (lnvitrogen). Los portabojetos se lavaron con PBS durante 5 min y se incubaron con anticuerpo secundario durante 1 h en la oscuridad a temperatura ambiente. Los anticuerpos secundarios usados fueron anticuerpos antiratón de cabra Alexa Fluor 488, anti-rata de cabra, Alexa Fluor 954 y anti-conejo de cabra Fluor 594 (lnvitrogen) diluidos 1:200 en diluyente de anticuerpo de fluorescencia (BioCare Medical). Después de lavar dos veces con PBS, los portaobjetos se montaron con reactivo ProLong Gold® Antifade Reagent con DAPI (lnvitrogen) y se colocó un cubreobjetos. Los portaobjetos se observaron con un microscopio Olympus BX61.
Tinción con von Kossa. Los cortes (5-6 pm) se trataron con xileno seguido de concentraciones graduadas de etanol. Los cortes se lavaron en agua destilada y se incubaron con 1 % de solución acuosa de nitrato de plata con luz ultravioleta durante 1 h, luego se lavaron en agua destilada y se incubaron con 5 % de tiosulfato de sodio durante 5 min. Los cortes se lavaron en agua destilada y se incubaron con 0,1 % de solución roja rápida nuclear durante 5 min seguido de deshidratación con alcohol graduado y xileno. Después se colocó un cubreobjetos sobre el portaobjetos en un medio de montaje permanente y se observó con un microscopio Olympus BX61.
Los resultados se expresan como la media ± error estándar de la media (SEM) y se calculó usando Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA). La significancia estadística (p<0,05) se determinó por análisis de la prueba t de Student bidireccional.
Aunque la invención anterior se describió con cierto detalle a modo de ilustración y ejemplo a efectos de claridad de comprensión, los expertos en la materia apreciarán rápidamente que se pueden realizar determinados cambios y modificaciones.

Claims (14)

  1. 5
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    65
    REIVINDICACIONES
    1. Un método para preparar un andamiaje de glucomanano neutralizado, comprendiendo el método poner en contacto un andamiaje de glucomanano básico que tiene un pH mayor de 8 con una solución acuosa a una presión de 690 Pa a 340 kPa por encima de la presión atmosférica, para formar un andamiaje de glucomanano neutralizado que tiene un pH de 6,0 a 8,0, preparando así el andamiaje de glucomanano neutralizado.
  2. 2. El método de la reivindicación 1, en el que el contacto se lleva a cabo a
    (a) una temperatura de 0 °C a 130 °C.
    (b) una temperatura de 20 °C a 50 °C; o
    (c) una temperatura de 37 °C.
  3. 3. El método de la reivindicación 1, en el que el contacto se lleva a cabo a
    (a) durante un período de 1 minuto a 1 mes;
    (b) durante un período de1 hora a 1 semana;
    (c) durante un período de 1 hora a 1 día; o
    (d) durante un período de 8 a 20 horas.
  4. 4. El método de la reivindicación 1, en el que el andamiaje de glucomanano básico comprende además un promotor de la adhesión celular.
  5. 5. El método de la reivindicación 4, en el que el promotor de la adhesión celular se selecciona del grupo que consiste en poli-L-lisina (PLL), poli-D-lisina (PDL), péptido RGD (RGD), KQAGDV, VAPG, FGL, grupos amina, fibronectina, elastina, colágeno y laminina, y es preferiblemente poli-L-lisina (PLL).
  6. 6. El método de la reivindicación 4, en el que el método comprende además:
    formar una mezcla de reacción que comprende un polvo de glucomanano, el promotor de la adhesión celular, una solución alcalina y agua;
    calentar la mezcla de reacción a una temperatura de 50 °C a 130 °C para formar un gel de glucomanano; aumentar la presión del gel de glucomanano de 690 Pa a 1,4 mPa por encima de la presión atmosférica; enfriar el gel de glucomanano a una temperatura de menos de 50 °C; y eliminar el agua del gel de glucomanano para formar el andamiaje de glucomanano básico.
  7. 7. El método de la reivindicación 6, en el que donde dicha presión aumenta de 100 kPa a 340 kPa, o dicha etapa de eliminación se realiza por sublimación.
  8. 8. El método de la reivindicación 1, en el que
    (a) la solución acuosa se selecciona del grupo que consiste en agua, una solución tamponada, una solución ácida y un medio de cultivo celular;
    (b) la solución acuosa es una solución tamponada;
    (c) la solución acuosa es una solución tamponada y la solución tamponada se selecciona del grupo que consiste en PBS, HEPES, MES, MOPS, TRIS y BIS-TRIS Propano; o
    (d) la solución acuosa es una solución tamponada y la solución tamponada es PBS.
  9. 9. El método de la reivindicación 1, en el que la selección acuosa es un medio de cultivo celular del grupo que consiste en un medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI), medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), medio esencial mínimo (MEM), medio de Eagle modificado por Dulbecco: medio de mezcla de nutrientes F-12 (DMEM/F12), medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM), un medio de la Colección Americana de Cultivos Tipo (NCTC) y medio de inducción osteogénica (OIM).
  10. 10. Un método para preparar un andamiaje de glucomanano neutralizado, comprendiendo el método poner en contacto un andamiaje de glucomanano básico que tiene un pH mayor de 8 con una solución acuosa a una presión de vacío, en el que la solución acuosa es una solución ácida para formar un andamiaje de glucomanano neutralizado que tiene un pH de 6,0 a 8,0, preparando así el andamiaje de glucomanano neutralizado.
  11. 11. Un método para cultivar células en un andamiaje de glucomanano neutralizado, comprendiendo el método calentar una mezcla de reacción del andamiaje de glucomanano neutralizado preparado mediante el método de la reivindicación 1 y una célula, de modo que la célula se multiplica, cultivando así células en el andamiaje de glucomanano neutralizado.
  12. 12. El método de la reivindicación 11, en el que dicha célula se selecciona del grupo que consiste en células somáticas, células madre o progenitoras y sus derivados.
  13. 13. Un andamiaje de glucomanano preparado mediante el método de la reivindicación 1, que tiene un pH de 6,0 a 8,0.
  14. 14. El andamiaje de glucomanano de la reivindicación 13, en el que el andamiaje comprende un promotor de la 5 adhesión celular, en el que el promotor de la adhesión celular se selecciona opcionalmente del grupo que consiste
    en poli-L-lisina (PLL), poli-D-lisina (PDL), péptido RGD (RGD), KQAGDV, VAPG, FGL, grupos amina, fibronectina, elastina, colágeno y laminina y es preferiblemente poli-L-lisina (PLL).
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