CN103958666B - 用于三维组织培养和工程化的葡甘聚糖支架 - Google Patents

用于三维组织培养和工程化的葡甘聚糖支架 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种中和的葡甘聚糖支架，所述葡甘聚糖支架能够促进细胞生长并且适用于三维组织培养和工程化。本发明还提供用于制备和降解所述中和的葡甘聚糖支架的方法。本发明进一步提供一种在中和的葡甘聚糖支架上培养细胞的方法。

Description

用于三维组织培养和工程化的葡甘聚糖支架
相关申请的交叉引用
本申请要求2011年11月29日提交的美国临时申请号61/564,553的优先权，所述申请出于所有目的整体并入本文。
发明背景
用以修复受损或病变组织(如心脏、骨骼、肝脏、角膜和皮肤)的工程生物材料是再生医学中的活跃研究分支。正在研究的一种方法是使用与促进细胞生长和分化的生物材料构建体或支架结合的细胞，以在体外产生可以移植的功能性组织。仿真细胞外微环境的关键物理特征和分子特征的三维(3D)组织培养系统为组织工程提供了巨大优势。
生物材料可以是天然来源的，如基于蛋白质和多糖的生物材料；或可以是合成的，例如基于聚合物、肽和陶瓷的生物材料。针对用于临床组织工程的这些生物材料的设计和开发，需要对如免疫原性、生物降解性、生物相容性、易于修饰和通透性的特性进行严格的探索。高孔隙率和足够的孔径对于细胞接种以及细胞和营养物质的扩散尤其重要。
天然生物材料(如胶原蛋白、藻酸盐和壳聚糖)的易获得性和生物相容性已经使得这些天然生物材料成为3D组织培养的有吸引力的基底。然而，不一致的机械特性和所接种细胞的行为所带来的挑战限制了其临床应用。
对于骨工程，已经证明支架的孔隙率和孔径是关键因素。先前研究已表明较大孔隙(约200-300μm)产生可促进离子/气体交换、蛋白质吸附以及骨磷灰石矿化的较大表面积(Karageorgiou等，Biomaterials200526:5474-91；Yuan等，Biomaterials199920:1799-806)。同时认为较大的孔径对于血管化植入物以及模拟天然骨骼的皮质表面和松质内部是必需的(Karageorgiou等，Biomaterials200526:5474-91)。因此，存在对于可以接种骨细胞并且用于骨再生的、具有大孔隙的支架的需要。
葡甘聚糖是一种天然来源的多糖，所述多糖由1:1.6比率的β-1,4连接的D-葡萄糖与D-甘露糖组成，并且大约每11个残基就带有支链(Alonso-Sande等，Eur J PharmBiopharm.200972:453-62)。葡甘聚糖具有含大约5％-10％取代的乙酰基的主链，所述乙酰基参与提供溶解性的氢键合和疏水相互作用。乙酰基在碱的存在下的水解降低葡甘聚糖的溶解性，并且导致聚集，随后形成凝胶。由于葡甘聚糖的胶凝特性和生物降解特性以及其成形为膜、珠粒和水凝胶的延展性，其通常作为乳化剂或增稠剂用在食物中，并且正在针对生物制药应用进行研究。已经开发出用于DNA和药物释放的基于葡甘聚糖的珠粒、微粒和纳米粒子(Liu等，Drug Deliv.200714:397-402；Wang等，Int J Pharm.2002244:117-26；Wen等，Int J Biol Macromol.200842:256-63)，其中没有观察到口服毒性、皮肤致敏、肠毒性、胚胎毒性或细胞衰老的明显迹象(Konishi等，Jpn J Exp Med.198454:139-42)。
近期已经对葡甘聚糖作为用于软骨细胞培养的复合支架和用于软骨再生的可注射支架进行了研究(Kondo等，J Tissue Eng Regen Med.20093:361-7)。此研究导致魔芋葡甘聚糖/透明质酸水凝胶的产生，其中对细胞进行培养并允许其作为凝胶中的悬浮物凝集。然而，仍然有待于对开发葡甘聚糖作为用于组织工程化应用的多孔支架进行探索。
令人惊奇地是，本发明提供一种葡甘聚糖微孔基质，其能够促进细胞生长，并且可用作用于3D细胞培养和组织工程化、以及体内组织再生(例如骨再生)的新型生物材料支架。
发明概述
已经发现当中和碱性葡甘聚糖支架时，所得到的中和葡甘聚糖支架可用作用于三维(3D)细胞培养和组织工程化的基质。中和的葡甘聚糖支架具有适合有效的细胞生长的pH，以及可以允许氧、营养物质、表达的产物和细胞废物扩散的多孔结构。此外，本发明的中和的葡甘聚糖支架可以进行表面修饰以促进细胞粘附和增殖。这种天然来源的生物材料支架是热稳定的、无毒的和可生物降解的，并且可模拟广泛范围的细胞类型(如成骨细胞、肝细胞、淋巴细胞和干细胞)的天然三维微环境。
在其它实施方案中，本发明提供一种制备中和的葡甘聚糖支架的方法，所述方法包括使pH大于约8的碱性葡甘聚糖支架在大于或约等于大气压的压力下与水溶液接触，以形成pH为约7的中和的葡甘聚糖支架，由此制备中和的葡甘聚糖支架。
在一个实施方案中，本发明提供一种制备中和的葡甘聚糖支架的方法，所述方法包括使pH大于约8的碱性葡甘聚糖支架在真空压力下与水溶液接触，以形成pH为约7的中和的葡甘聚糖支架，由此制备中和的葡甘聚糖支架。
在另一个实施方案中，本发明提供一种在中和的葡甘聚糖支架上培养细胞的方法，所述方法包括加热本发明的中和的葡甘聚糖支架和细胞的反应混合物，以使细胞繁殖，由此在中和的葡甘聚糖支架上培养细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供一种中和的葡甘聚糖支架，所述中和的葡甘聚糖支架通过使pH大于约8的碱性葡甘聚糖支架与水溶液接触，以形成pH为约7的中和的葡甘聚糖支架来制备。
在另一个实施方案中，本发明提供一种中和的葡甘聚糖支架，所述中和的葡甘聚糖支架通过使pH大于约8的碱性葡甘聚糖支架在大于或约等于大气压的压力下与水溶液接触，以形成pH为约7的中和的葡甘聚糖支架来制备，其中碱性葡甘聚糖支架包含细胞粘附促进剂。
在另一个实施方案中，本发明提供一种降解本发明的中和的葡甘聚糖支架的方法，其通过使中和的葡甘聚糖支架与降解剂接触来实现。
附图简述
图1示出葡甘聚糖支架和人间充质干细胞(hMSC)的扫描电子显微照片(表面拓扑)，其示出水升华后葡甘聚糖凝胶的表面(A)和内部结构(B)，以及接种在葡甘聚糖支架上的hMSC(C、D)。
图2示出聚-L-赖氨酸(PLL)对hMSC的粘附的影响。在胶凝之前将PLL添加至葡甘聚糖混合物中。与对照相比，hMSC对所得到的支架显示出显著较大的附着(p<0.05)。
图3a和图3b示出在葡甘聚糖支架中培养的hMSC的生物发光。将表达萤火虫荧光素酶的hMSC接种到对照或PLL处理的葡甘聚糖支架上并且每周成像。经过一段时间，在对照支架中培养的细胞显示出生物发光水平的增加。然而，在葡甘聚糖支架中培养的hMSC局限于接种部位，并且没有显示出生物发光的增加。
图4示出葡甘聚糖支架中的hMSC的组织学。在葡甘聚糖支架中培养的hMSC用苏木精和曙红染色。在细胞接种之前的葡甘聚糖支架显示出遍布的多孔结构[200-300μm](A)。接种后，细胞显示出不同的形态并且形成为结构(B-D)(10x放大倍数)。
图5示出波形蛋白和细胞角蛋白的表达。在培养板上培养的所有hMSC均显示出强烈的波形蛋白(B)表达而无细胞角蛋白(A)表达。接种在葡甘聚糖支架上的细胞显示出波形蛋白表达(D，C＝同种型对照)。不规则形状的内腔周围的细胞显示出强烈的细胞角蛋白表达，并且衬在这些内腔上的扁平细胞表达波形蛋白和细胞角蛋白(E、F)。
图6示出葡甘聚糖支架的酶消化。用0.5单位/ml、5.0单位/ml和50单位/ml的纤维素酶或β-甘露聚糖酶消化接种了rhMSC的葡甘聚糖支架，并且使从支架释放的细胞胰蛋白酶化并计数。与纤维素酶一起孵育的支架在所有浓度下均显示出有效的细胞释放。然而，较高的β-甘露聚糖酶浓度导致次优的细胞计数，而0.5单位/ml显示出与纤维素类似的结果(C)。对所释放的细胞聚集物进行洗涤和过夜培养(A)。观察到细胞的生长晕(outgrowth)(B)。放大倍数＝10x，插入图＝20x。
图7示出接种在葡甘聚糖支架上的hMSC的成骨分化。用针对人骨桥蛋白和骨唾液蛋白II(BSP II)的抗体对接种在葡甘聚糖支架上并且用或不用成骨诱导培养基培养的rhMSC进行染色。诱导的hMSC显示出骨桥蛋白和BSP II表达。未诱导的细胞开始BSP II表达。在未诱导的支架和诱导的支架中，冯库萨(Von Kossa)染色均显示出矿物质沉积。放大倍数10x。
图8示出在葡甘聚糖支架中与CD34+造血细胞共培养的hMSC的扫描电子显微照片。hMSC接种在葡甘聚糖支架上并且与CD34+造血细胞共培养。SEM图像显示出CD34+细胞对hMSC的粘附(A-D)。hMSC显示出给孔隙“搭桥”的能力(B)。
图9示出制作前后的葡甘聚糖支架。此图像可以是实施例1的一部分。使用刀或活检穿孔器将葡甘聚糖支架制作成脊椎形(右上)和各种形状以适合装入细胞培养容器。这张图提供了概念证明实例，其示出本发明的支架可以制作成类似于不同器官系统的各种形状。
图10示出使用中和的葡甘聚糖支架和人干细胞产生的三维骨构建体的总体图像。
发明详述
I.定义
如本文所使用，术语“葡甘聚糖”指的是天然来源的寡糖及其衍生物，所述寡糖由大约1:1.6比率的β-1,4连接的D-葡萄糖与D-甘露糖组成，并且大约每11个残基就带有支链(Alonso-Sande等，Eur J Pharm Biopharm.200972:453-462)。葡甘聚糖具有含大约5％-10％取代的乙酰基的主链，所述乙酰基参与提供溶解性的氢键合和疏水相互作用。示例性葡甘聚糖衍生物包括但不限于：水溶性衍生物(如O-烷基衍生物和O-羧基烷基衍生物)、具有不同取代程度的衍生物(例如，大于或小于5％-10％取代的乙酰基)、具有不同氧化程度的衍生物、接枝共聚物(例如，丙烯酸酯和丙烯酰胺共聚物)及以上的盐(例如，以上的季铵盐)。
如本文所使用，术语“葡甘聚糖凝胶”指的是交联葡甘聚糖的热稳定的均匀悬浮液。葡甘聚糖凝胶可以以多种方式形成，所述方式包括但不限于：通过在碱的存在下水解葡甘聚糖的乙酰基。本发明的葡甘聚糖凝胶可以进行修饰以促进细胞粘附和增殖。示例性修饰包括但不限于：掺入细胞粘附促进剂、化学交联、表面涂层以及引入官能团。
如本文所使用，术语“碱性葡甘聚糖支架”指的是三维多孔基质，其通过葡甘聚糖凝胶脱水形成并且具有大于约8的pH。本发明的碱性葡甘聚糖支架可进行修饰以促进细胞粘附和增殖。示例性修饰包括但不限于：掺入细胞粘附促进剂、表面涂层，以及引入官能团。
如本文所使用，术语“中和的葡甘聚糖支架”指的是多孔基质，其提供适合细胞培养和组织工程化(包括组织再生)的三维环境，并且具有约7的pH。本发明的中和的葡甘聚糖支架通过用水溶液中和碱性葡甘聚糖支架形成。本发明的中和的葡甘聚糖支架可进行修饰以促进细胞粘附和增殖。
如本文所使用，术语“接触”指的是使至少两种不同物质进行接触以使其可以反应的过程。然而应认识到，所得到的反应产物可以由所添加的试剂之间的反应直接产生，或由来自一种或多种所添加的试剂的中间体产生，所述中间体可以在反应混合物中产生。
如本文所使用，术语“细胞粘附促进剂”指的是天然或合成试剂，其通过例如修饰基底表面和/或通过改变表面电荷来增强细胞对培养基底的粘附或附着。细胞粘附促进剂还可增强血清或细胞外基质蛋白对培养基底的吸附。示例性细胞粘附促进剂包括：聚-L-赖氨酸(PLL)、聚-D-赖氨酸(PDL)、RGD肽(RGD)、KQAGDV、VAPG、FGL、胺基，以及如纤连蛋白、弹性蛋白、胶原蛋白和层粘连蛋白的细胞外基质蛋白。细胞粘附促进剂还可以促进细胞生长和细胞分化。
如本文所使用，术语“缓冲溶液”指的是缓冲剂或离子化合物在水中的均匀混合物，并且抵抗pH的改变，所述离子化合物是弱酸及其共轭碱或弱碱及其共轭酸的混合物。示例性缓冲剂包括但不限于：如磷酸盐缓冲盐水(PBS)的磷酸盐缓冲液、3-{[三(羟甲基)甲基]氨基}丙磺酸(TAPS)、1,3-二(三(羟甲基)甲氨基)丙烷(BIS-TRIS)、三(羟甲基)甲胺(TRIS)、4-2-羟乙基-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES)、2-{[三(羟甲基)甲基]氨基}乙磺酸(TES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、哌嗪-N,N'-二(2-乙磺酸)(PIPES)以及2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)。
如本文所使用，术语“酸性溶液”指的是酸或充当质子供体的物质在水中的均匀混合物。酸性溶液具有小于7的pH。示例性酸性溶液包括但不限于：盐酸，醋酸、酒石酸、苹果酸和柠檬酸。
如本文所使用，术语“碱性溶液”指的是含有碱金属或碱土金属的盐、pH大于7的碱性溶液。代表性的碱金属和碱土金属的盐包括但不限于：氢氧化钠、碳酸钠、氢氧化钾、碳酸钾、氢氧化镁、碳酸镁、氢氧化钙和碳酸钙。
如本文所使用，术语“细胞培养基”指的是支持细胞生长的物质。细胞培养基通常含有溶解在缓冲溶液中的营养物质的混合物，并且不同类型的细胞培养基可用于培养不同类型的细胞。示例性细胞培养基包括但不限于：洛斯维帕克纪念研究所(Roswell ParkMemorial Institute)培养基(RPMI)、达尔伯克氏改良的伊格尔培养基(Dulbecco’sModified Eagle Medium)(DMEM)、最低必需培养基(MEM)，达尔伯克氏改良的伊格尔培养基：营养混合物F-12培养基(DMEM/F12)、伊斯科夫氏改良的达尔伯克氏培养基(Iscove’sModified Dulbecco's Medium)(IMDM)、国家典型培养物保藏中心培养基(NCTC)和成骨诱导培养基(OIM)。
如本文所使用，术语“降解”指的是将支架保持在一起的交联键的断裂。降解使用水解糖苷键的降解剂完成。支架降解剂可以是不消化附着到或嵌入中和的葡甘聚糖支架中的细胞的任何化学物质或酶，如内切-1,4-β-甘露聚糖酶、甘露聚糖内切-1,4-β-甘露糖苷酶、糖基水解酶或纤维素酶。其它酶可用于本发明。
II.中和的葡甘聚糖支架
本发明提供一种中和的葡甘聚糖支架，其作为用于三维细胞培养和组织工程化的新型支架。中和的葡甘聚糖支架提供适合培养细胞的中性环境以及高度多孔结构和孔径。中和的葡甘聚糖支架可以掺入细胞粘附促进剂。此外，支架是均匀的、热稳定的、弹性的、生物相容的以及可生物降解的，并且可以通过例如模制或切割制成适合3D组织培养和工程化的任何形状和大小。中和的葡甘聚糖支架还可以通过高压灭菌进行灭菌，使其可用于移植和其它体内应用。
与基于藻酸盐的支架(例如AlgiMatrix)不同，中和的葡甘聚糖支架的大小不受限制。另外，与需要多个、复杂的化学反应来修饰基于藻酸盐的支架相比，中和的葡甘聚糖支架可以在单一步骤中针对细胞粘附进行修饰。
中和的葡甘聚糖支架可以通过适于中和碱性葡甘聚糖支架的任何条件来制备。合适的条件是(例如)可以将葡甘聚糖支架的pH在适量时间内从约8或更高降低至约7的那些条件。例如，碱性葡甘聚糖支架可以在加热环境中(如在高压釜中)暴露于水溶液。或者，合适的条件涉及使用水溶液持续冲洗碱性葡甘聚糖支架适量时间。
在一些实施方案中，本发明提供一种用于制备中和的葡甘聚糖支架的方法，所述方法包括使pH大于约8的碱性葡甘聚糖支架在大于或约等于大气压的压力下与水溶液接触，以形成pH为约7的中和的葡甘聚糖支架，由此制备中和的葡甘聚糖支架。
碱性葡甘聚糖支架可以具有等于或大于约8.0的任何合适的pH。合适的pH的实例包括约8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0以及更高。
中和的葡甘聚糖支架可以具有约7的任何合适的pH。合适的pH的实例包括约6.0至约8.0，如约6.1至约7.9、约6.2至约7.8、约6.3至约7.7、约6.4至约7.6，以及约6.5至约7.5。
接触可以在任何合适的温度下进行。例如，温度可以是室温、高于室温或低于室温。在一些实施方案中，温度适于形成蒸汽。在一些实施方案中，温度可以是约0℃至约200℃，或约20℃至约200℃，或约20℃至约150℃，或约0℃至约130℃，或约20℃至约130℃，或约20℃至约100℃，或约20℃至约50℃，或约30℃至约50℃，或约50℃至约200℃，或约75℃至约150℃，或约100℃至约150℃。温度还可以是约0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃、110℃、120℃、130℃、140℃、150℃、160℃、170℃、180℃、190℃或约200℃。温度还可以是约30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃或45℃。在一些实施方案中，接触可以在约0℃至约130℃的温度下进行。在其它实施方案中，接触可以在约20℃至约50℃的温度下进行。在其它实施方案中，接触可以在约37℃的温度下进行。在一些实施方案中，温度约为室温。
接触可以在任何合适的压力下进行。在一些实施方案中，接触可以在减压或加压下进行。在一些实施方案中，接触在高于大气压时进行。在一些实施方案中，接触可以在高于大气压约0.1psi至约50psi的压力下进行。在一些实施方案中，接触可以在高于大气压约1psi至约50psi的压力下进行。其它有用的压力包括：高于大气压约5psi、10psi、15psi、20psi、25psi、30psi、35psi、40psi或约45psi。在另一个实施方案中，接触在高于大气压约1psi至约30psi的压力下进行。在其它实施方案中，接触在高于大气压约10psi至约20psi的压力下进行。在一些实施方案中，接触在高于大气压约15psi的压力下进行。
可以使用温度和压力的任何组合来中和碱性葡甘聚糖支架。例如，温度可以足以产生蒸汽(如大于100℃)，并且压力可以高于大气压(如高于大气压约0.1psi至约50psi)。在本发明中可使用温度和压力的其它组合，如在大气温度和压力下。
接触可以进行任何合适的时间段在一些实施方案中，时间段可以是约1分钟至约1个月。在其它实施方案中，接触可以进行约1小时至约1周。在其它实施方案中，接触可以进行约1小时至约1天。在其它实施方案中，接触可以进行约8小时至约20小时。
碱性葡甘聚糖支架可以包括多种其它组分。例如，在碱性葡甘聚糖支架中可以掺入细胞粘附促进剂、趋化分子和细胞信号传导分子。
在一些实施方案中，碱性葡甘聚糖支架包括合适的细胞粘附促进剂。在本发明中有用的细胞粘附促进剂能够将细胞粘附至葡甘聚糖支架。细胞粘附促进剂还可以促进细胞生长和/或促进细胞分化。示例性细胞粘附促进剂包括但不限于：聚-L-赖氨酸(PLL)、聚-D-赖氨酸(PDL)、RGD肽(RGD)、KQAGDV、VAPG、FGL、胺基，以及如纤连蛋白、弹性蛋白、胶原蛋白和层粘连蛋白的细胞外基质蛋白。在一些实施方案中，细胞粘附促进剂可以是聚-L-赖氨酸(PLL)、聚-D-赖氨酸(PDL)、RGD肽(RGD)、KQAGDV、VAPG、FGL、胺基、纤连蛋白、弹性蛋白、胶原蛋白或层粘连蛋白。细胞外基质蛋白可以来自任何合适的来源，所述来源包括但不限于哺乳动物细胞。在一些实施方案中，细胞粘附促进剂是PLL或RGD。在某些实施方案中，细胞粘附促进剂是PLL。
在一些实施方案中，本发明提供一种用于制备中和的葡甘聚糖支架的方法，所述方法包括使pH大于约8的碱性葡甘聚糖支架与水溶液接触，以形成pH为约7的中和的葡甘聚糖支架，其中碱性葡甘聚糖支架包含细胞粘附促进剂，由此制备中和的葡甘聚糖支架。
在另一个实施方案中，碱性葡甘聚糖支架包括合适的趋化分子。示例性趋化分子包括但不限于：血清、趋化因子、形态发生蛋白、生长因子、透明质酸。
在另一个实施方案中，碱性葡甘聚糖支架包括合适的细胞信号传导分子。示例性细胞信号传导分子包括但不限于：细胞外基质蛋白、肽基序和生长因子。
水溶液可以具有任何合适的组成。水溶液可以是水，或水和不降解或消化中和的葡甘聚糖支架的一种或多种非碱性试剂的混合物。合适的水溶液的实例包括但不限于：水、缓冲溶液、酸性溶液和细胞培养基。在一些实施方案中，水溶液是水、缓冲溶液、酸性溶液或细胞培养基。
在一个实施方案中，水溶液是缓冲溶液。合适的缓冲溶液的实例包括但不限于：PBS、TAPS、BIS-TRIS丙烷、TRIS、HEPES、TES、MOPS、PIPES以及MES。在一些实施方案中，缓冲溶液是PBS、HEPES、MES、MOPS、TRIS或BIS-TRIS丙烷。在某些实施方案中，缓冲溶液是PBS。
在另一个实施方案中，水溶液是酸性溶液。合适的酸性溶液的实例包括但不限于：如但不限于盐酸、醋酸、酒石酸、苹果酸和柠檬酸。
在另一个实施方案中，水溶液是细胞培养基。合适的细胞培养基的实例包括但不限于：络斯维帕克纪念研究所培养基(RPMI)、达尔伯克氏改良的伊格尔培养基(DMEM)、最低必需培养基(MEM)，达尔伯克氏改良的伊格尔培养基：营养混合物F-12培养基(DMEM/F12)、伊斯科夫氏改良的达尔伯克氏培养基(IMDM)、国家典型培养物保藏中心培养基(NCTC)和成骨诱导培养基(OIM)。在一些实施方案中，细胞培养基是洛斯维帕克纪念研究所培养基(RPMI)、达尔伯克氏改良的伊格尔培养基(DMEM)、最低必需培养基(MEM)，达尔伯克氏改良的伊格尔培养基：营养混合物F-12培养基(DMEM/F12)、伊斯科夫氏改良的达尔伯克氏培养基(IMDM)或国家典型培养物保藏中心培养基(NCTC)。
本发明的方法可以包括多种附加步骤。在一些实施方案中，所述方法进一步包括：形成包括葡甘聚糖粉末、碱性溶液和水的反应混合物；将反应混合物在约50℃至约130℃的温度下加热以形成葡甘聚糖凝胶；将葡甘聚糖凝胶的压力增加到高于大气压约0.1psi至约50psi；将葡甘聚糖凝胶冷却至低于约50℃的温度；以及将水从葡甘聚糖凝胶中移除以形成碱性葡甘聚糖支架。碱性葡甘聚糖支架可以用上文所描述的细胞粘附促进剂进行进一步改良。
本发明的方法可以包括多种附加步骤。在一些实施方案中，所述方法进一步包括：形成包括葡甘聚糖粉末、细胞粘附促进剂、碱性溶液和水的反应混合物；将反应混合物在约50℃至约130℃的温度下加热以形成葡甘聚糖凝胶；将葡甘聚糖凝胶的压力增加到高于大气压约0.1psi至约50psi；将葡甘聚糖凝胶冷却至低于约50℃的温度；以及将水从葡甘聚糖凝胶中移除以形成碱性葡甘聚糖支架。
碱性溶液可以是含有碱金属或碱土金属的盐的任何溶液。碱性溶液是碱性的,具有大于7的pH。代表性的碱金属和碱土金属的盐包括但不限于：氢氧化钠、碳酸钠、氢氧化钾、碳酸钾、氢氧化镁、碳酸镁、氢氧化钙和碳酸钙。在一些实施方案中，碱性溶液包含氢氧化钙。
葡甘聚糖粉末、细胞粘附促进剂和氢氧化钙各自可以以任何合适的量存在于反应混合物中。在一些实施方案中，将葡甘聚糖粉末溶解于水中以提供在水中含有约1％w/v至约5％w/v葡甘聚糖的葡甘聚糖溶液。
在其它实施方案中，将细胞粘附促进剂添加至葡甘聚糖溶液中，作为含有约0.0001％w/v至约20％w/v细胞粘附促进剂的水溶液。在一个实施方案中，将细胞粘附促进剂添加至葡甘聚糖溶液中，作为含有约0.0001％w/v至约10％w/v细胞粘附促进剂的水溶液。在另一个实施方案中，将细胞粘附促进剂添加至葡甘聚糖溶液中，作为含有约0.0001％w/v至约1％w/v细胞粘附促进剂的水溶液。
在其它实施方案中，将氢氧化钙以提供氢氧化钙与葡甘聚糖溶液的任何合适比率的量添加至葡甘聚糖溶液中。例如，氢氧化钙与葡甘聚糖溶液的比率可以是约1:1000至约1:1(w/w)。在一个实施方案中，比率为1:10(w/w)。在另一个实施方案中，将氢氧化钙添加至葡甘聚糖溶液中，作为含有约1％w/v至约2％w/v氢氧化钙的水溶液。
可以在如上文针对接触步骤所描述的那些任何合适的温度下，形成反应混合物。
可以将反应混合物加热至任何合适的温度。在一些实施方案中，温度可以高于约20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃、105℃、110℃、115℃、120℃、125℃、130℃或更高。在一些实施方案中，可以在高于约130℃的温度下加热反应混合物。在一些实施方案中，可以将反应混合物加热至高于约80℃的温度。
可以将葡甘聚糖凝胶的压力增加至任何合适的压力。在一些实施方案中，可以将压力增加至高于大气压约0.1psi至约200psi。在其它实施方案中，将压力增加至高于大气压约0.1psi至约50psi。在某些实施方案中，将压力增加至约30psi。
可以将葡甘聚糖凝胶的温度冷却至任何合适的温度。在一些实施方案中，将温度冷却至约低于80℃。在某些实施方案中，将温度冷却至低于约50℃。
可以通过任何合适的方法将水从葡甘聚糖凝胶中移除。在一些实施方案中，通过冷冻干燥、升华或热诱导的相分离操作进行移除步骤。在某些实施方案中，通过升华进行移除步骤。
中和的葡甘聚糖支架可以具有任何合适的孔径。在一些实施方案中，中和的葡甘聚糖支架具有约100μm至约400μm的孔径。在其它实施方案中，中和的葡甘聚糖支架可以具有约150μm至约350μm的孔径。在其它实施方案中，中和的葡甘聚糖支架可以具有约200μm至约300μm的孔径。
在其它实施方案中，本发明提供一种制备中和的葡甘聚糖支架的方法，所述方法包括使pH大于约8的碱性葡甘聚糖支架在大于或约等于大气压的压力下与水溶液接触，以形成pH为约7的中和的葡甘聚糖支架，由此制备中和的葡甘聚糖支架。
接触还可以在任何合适的真空压力下进行。在一些实施方案中，接触可以在约0.1mmHg至约760mmHg的真空压力下进行。在一些实施方案中，接触可以在约10mmHg至约500mmHg的真空压力下进行。其它有用的真空压力包括约20mmHg、50mmHg、100mmHg、200mmHg、300mmHg、400mmHg或500mmHg。在另一个实施方案中，接触在约10psi至约300mmHg的真空压力下进行。在其它实施方案中，接触在约400mmHg的真空压力下进行。
在另一个实施方案中，本发明提供一种中和的葡甘聚糖支架，所述中和的葡甘聚糖支架通过使pH大于约8的碱性葡甘聚糖支架与水溶液接触，以形成pH为约7的中和的葡甘聚糖支架来制备。
在另一个实施方案中，本发明提供一种中和的葡甘聚糖支架，所述葡甘聚糖支架通过使pH大于约8的碱性葡甘聚糖支架与水溶液接触，以形成pH为约7的中和的葡甘聚糖支架来制备，其中碱性葡甘聚糖支架包含细胞粘附促进剂。
本发明还提供一种降解本发明的中和的葡甘聚糖支架的方法，其通过使中和的葡甘聚糖支架与降解剂接触来实现。降解剂可以是能够水解糖苷键的任何合适的试剂。降解剂可以是任何化学物质或酶。可用作降解剂的酶包括但不限于：内切-1,4-β-甘露聚糖酶、甘露聚糖内切-1,4-β-甘露糖苷酶、糖基水解酶和纤维素酶。其它降解剂包括但不限于：如甘露聚糖酶，果胶酶，木聚糖酶，葡聚糖酶，半乳聚糖酶，或其它的酶。
本发明还提供一种复合支架，其包含本发明的中和的葡甘聚糖支架和合适的生物材料。合适的生物材料包括：基于蛋白质和多糖的生物材料以及基于聚合物、肽和陶瓷的生物材料。示例性生物材料包括但不限于：细胞外基质蛋白(例如，纤连蛋白、弹性蛋白、胶原蛋白和层粘连蛋白)、藻酸盐、壳聚糖、透明质酸、基质胶、明胶、羟基磷灰石、磷酸钙和生物活性玻璃。
本发明的方法可以用于制备多种葡甘聚糖支架。在一些实施方案中，本发明提供一种中性葡甘聚糖支架。中性葡甘聚糖支架可以具有约7的pH。
在一些实施方案中，葡甘聚糖支架可以是pH等于或大于约8的碱性葡甘聚糖支架。
在一些实施方案中，葡甘聚糖支架包括细胞粘附促进剂。在本发明中可以使用任何合适的细胞粘附促进剂，如上文所描述的那些。在一些实施方案中，细胞粘附促进剂可以是聚-L-赖氨酸(PLL)、聚-D-赖氨酸(PDL)、RGD肽(RGD)、KQAGDV、VAPG、FGL、胺基、纤连蛋白、弹性蛋白、胶原蛋白或层粘连蛋白。在一些实施方案中，细胞粘附促进剂可以是聚-L-赖氨酸(PLL)。
如上所述，可以通过多种方法(如上文所描述的那些)制备本发明的葡甘聚糖支架。在一些实施方案中，通过本发明的方法制备本发明的葡甘聚糖支架。
III.培养细胞
本发明的中和的葡甘聚糖支架可用于培养细胞。在中和的葡甘聚糖支架上培养的细胞可以与其它细胞和细胞类型相互作用并形成聚集物。可以通过掺入细胞粘附促进剂来促进细胞对中和的葡甘聚糖支架的粘附以及在其上的增殖。中和的葡甘聚糖支架支持长期培养。当在中和的葡甘聚糖支架上培养时，细胞可以经历增殖和分化。例如，干细胞可以分化成如骨细胞、软骨、皮肤细胞和血液细胞的功能谱系(functional lineages)。因此，在中和的葡甘聚糖支架上可以支持如骨生成、软骨生成和血细胞生成的细胞过程。
在另一个实施方案中，本发明提供一种在中和的葡甘聚糖支架上培养细胞的方法，所述方法包括将本发明的中和的葡甘聚糖支架和细胞的反应混合物加热，以使细胞繁殖，由此在中和的葡甘聚糖支架上培养细胞。可以在体内或体外培养细胞。
合适的细胞类型包括但不限于：体细胞，如成纤维细胞、皮肤细胞、内皮细胞、上皮细胞、骨细胞、肝细胞、神经元和软骨细胞；以及干细胞和祖细胞，如内皮祖细胞、胚胎干细胞，诱导的多潜能干细胞、间充质干细胞、造血干细胞、神经干细胞和肌肉干细胞，以及其衍生物。在一些实施方案中，细胞是体细胞。在其它实施方案中，细胞是干细胞或祖细胞。在某些实施方案中，细胞是干细胞。在某些其它实施方案中，细胞是干细胞的衍生物。
可以通过使用任何合适的试剂溶解葡甘聚糖支架来回收在葡甘聚糖支架上培养的细胞。例如，可以使用如甘露聚糖酶、纤维素酶、果胶霉、木聚糖酶、葡聚糖酶、半乳聚糖酶等的一种或多种酶溶解葡甘聚糖支架。用于溶解葡甘聚糖支架的其它试剂是本领域技术人员已知的。
IV.实施例
实施例1：葡甘聚糖支架的制备
将葡甘聚糖粉末(1-5g)溶解于100ml的蒸馏水中并缓慢搅拌5分钟，接着将溶液在室温下孵育60分钟。将氢氧化钙溶液(1.5％，10ml；Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)添加至葡甘聚糖溶液中并剧烈混合1分钟。将聚-L-赖氨酸(Sigma-Aldrich)(0.001％w/v至1％w/v水溶液)添加至混合物中，并在去封闭室(decloaking chamber)中加热至125℃持续30分钟。冷却至室温后，将葡甘聚糖凝胶浸泡在蒸馏水中过夜。将葡甘聚糖凝胶放置在培养皿中并接着在气流冷冻机中在低于或等于-50℃下冷冻30分钟。使用Vitris型50-SRC-5升华器使水升华。搁板温度为12℃，并且冷凝器温度低于或等于-58℃，并且真空维持在80-100毫托。接着将所得到的葡甘聚糖产物包装在聚乙烯袋中、真空密封并且在低于或等于-20℃下贮存直到使用。
中和葡甘聚糖支架
升华之前的水冲洗。在水升华之前，在大量的水(大约5升)中过夜(16-24小时)洗涤葡甘聚糖凝胶若干次。水升华之后，将葡甘聚糖支架浸泡在水中，并且将支架压靠在pH指示器上。支架显示出大于10的pH。这表明在水升华之前洗涤葡甘聚糖凝胶和水升华后将葡甘聚糖支架简短浸泡在水中不足以中和所述支架。
常规PBS洗涤。将葡甘聚糖支架在PBS中洗涤一次或三次。这导致支架的表层(仅表面)中和，其中内部pH大于9或10。还将葡甘聚糖支架在PBS中洗涤10分钟、30分钟和60分钟。在所有情况下，这些方法导致如上文所描述的支架的表层中和。这些发现表明在缓冲溶液中对支架的常规洗涤对于对培养哺乳动物细胞至关重要的支架的中和来说是不够的。
加热的PBS洗涤。接着将葡甘聚糖支架在95℃-100℃的PBS中孵育30分钟。注意到支架的可见收缩。在沸腾的PBS中30分钟后，将支架切割并压靠到pH指示器上。支架的外部区域显示出中性pH。然而，支架的中心显示出支架材料的凝缩，并且此中心区域仍保持在中性范围外。在如上文所描述的所有情况中，支架保持漂浮，表明存在内部气穴(airpockets)。即使在用沸腾的PBS处理30分钟后，支架仍保持漂浮，并有明显的不希望的形状改变。这些发现表明PBS并未将滞留在支架内部的空气完全排出，这导致中和不充分。
加压的PBS洗涤。将葡甘聚糖支架转移到含有PBS的烧杯，并且在120℃下在高于大气压15psi的加压室中孵育30分钟。未观察到支架的收缩。支架浸没在PBS中，表明用PBS完全排出了气穴。将葡甘聚糖产物冷却并在无菌PBS中在4℃下贮存直到使用。使用pH指示器以确认支架的pH为中性。整个支架显示出中性pH而没有任何形状改变。
真空下PBS洗涤。将葡甘聚糖支架放置在过滤器上，并且将400mmHg真空压力施加到支架底部。将1ml PBS施加到支架顶部10次。在此过程后，使用pH指示器来确认支架的pH为中性。整个支架显示出中性pH而没有任何形状改变。
实施例2：中和的葡甘聚糖支架上的细胞生长
细胞的制备。对于人间质干细胞(hMSC)，将骨髓单核细胞(N＝3，1名女性和2名男性，20-40岁；Cambrex,East Rutherford,NJ,USA)铺在含有20％胎牛血清(FBS)、1％L-谷胺酰胺和1％青霉素-链霉素(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)的α-MEM的100mm板上，并且在37℃下5％CO2中孵育。每隔一天用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤板三次，直到细胞达到大约80％汇合。用0.25％胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)在37℃下孵育细胞5分钟。以1：1比率将培养基添加至胰蛋白酶-EDTA中的细胞中以灭活。将细胞以5x103细胞/cm2重新铺在培养基中。培养细胞达3代，在每次传代时使用受控速率方案冷藏保存，并且贮存在液氮中直到使用。对于CD34+细胞，将上文所提到的骨髓单核细胞的子集与偶联到PE的CD34抗体(克隆581,BDBiosciences,San Jose,CA,USA)在选择缓冲液(含有0.5％牛血清白蛋白-BSA的PBS和PBS中的2mM EDTA)中在4℃下孵育30分钟。在选择缓冲液中洗涤细胞并与抗-PE微珠(MiltenyiBiotec,Bergisch Gladbach,Germany)在4℃下孵育20分钟。洗涤细胞并重悬于500μL选择缓冲液中，接着施加到分离柱(Miltenyi Biotec)。洗涤分离柱三次，并用1ml选择缓冲液洗脱保留的细胞。对洗脱的细胞进行第二轮分离。
转导。将来自第二代的冷藏保存的hMSC解冻，并用在MND启动子控制下的表达萤火虫荧光素酶的HIV-1衍生的慢病毒载体(1x106感染性颗粒/ml)，在含有4mg/ml聚凝胺的培养基(Sigma-Aldrich)中进行转导。将细胞孵育过夜、用PBS洗涤，并用新培养基补充。培养细胞直到其达到大约80％汇合。将100mg/ml的D-荧光素添加至细胞子集中，并使用光度计(Sirius,Berthold,Pforzheim,Germany)测量生物发光以确认转导成功。
细胞接种和生物发光成像。将葡甘聚糖支架切割成大约1cm x1cm x0.5cm(宽度x深度x高度)、再水合，并用PBS洗涤5次，并且在培养基中孵育过夜。将hMSC(1x106/支架)接种到12孔板中的葡甘聚糖支架上并且培养5周。向每个孔中添加100mg/ml的D-荧光素之后，使用IVIS200成像系统(Caliper Life Sciences,Hopkinton,MA,USA)针对生物发光每3-4天对细胞成像，并且使用Living Image软件(3.1版，Caliper Life Sciences)分析图像。
扫描电子显微术。将接种和未接种hMSC的葡甘聚糖支架在一系列梯度乙醇中脱水。具有hMSC的支架还与CD34+细胞(1x106)共培养并孵育3天，接着进行乙醇脱水。将样品用碳双面胶带安置在12mm铝销短桩(aluminum pin stub)上，使用PELCO Auto SputterCoater SC-7溅射镀金，并在Philips XL30TMP扫描电子显微镜上进行观察。
实施例3：酶消化
将冻干的内切-1,4-β-甘露聚糖酶(Megazyme)或获自黑曲霉(Aspergillusniger)的纤维素酶(Sigma-Aldrich)溶解于培养基中。将接种了hMSC的支架在0.5单位/ml、5.0单位/ml，或50单位/ml的内切-1,4-β-甘露聚糖酶或纤维素酶中孵育过夜。目测支架的降解。一旦支架完全溶解，就对细胞进行计数。
实施例4：成骨分化
将接种了hMSC的支架在成骨诱导培养基(Cambrex)或培养基(对照)中孵育，按照制造商的推荐每3-4天更换培养基。三周后，在10％福尔马林中固定支架，接着进行乙醇脱水和石蜡包埋。将支架切成6mm切片，以用于免疫组织化学和冯库萨染色。
免疫细胞化学。用二甲苯处理切片(5-6μm)，接着用梯度浓度乙醇处理。在柠檬酸缓冲液(pH6，Invitrogen)中进行热介导的抗原修复之前，在PBS中洗涤载玻片。冷却后，施加浓度逐渐降低的PBS中的热柠檬酸缓冲液，接着用添加到每个载玻片的BackgroundSniper(BioCare Medical,Concord,CA,USA)孵育15分钟。用PBS洗涤载玻片两次，接着用具有2％山羊血清(Sigma-Aldrich)的封闭缓冲液(1％BSA、0.1％鱼皮明胶，0.1％Triton X，0.05％吐温-20)孵育1小时。用PBS洗涤两次后，将稀释于第一抗体缓冲液(1％BSA、0.1％鱼皮凝胶)中的第一抗体在加湿室中在4℃下与载玻片孵育过夜。所用的第一抗体是以1:50稀释的广谱兔多克隆抗人细胞角蛋白抗体(Abeam,Cambridge,MA,USA)和以1:100稀释的小鼠单克隆抗人波形蛋白抗体(Sigma-Aldrich)。对于骨标记物，使用在1:200稀释度下的大鼠单克隆抗人骨桥蛋白抗体和小鼠单克隆抗人骨唾液蛋白II抗体(Millipore,Billerica,MA,USA)。包括小鼠IgG、大鼠IgG和兔IgG同种型对照(Invitrogen)。将载玻片用PBS洗涤5分钟并与第二抗体在黑暗中、室温下孵育1h。所用的第二抗体是以1:200稀释于荧光抗体稀释剂(BioCare Medical)中的Alexa Fluor488山羊抗小鼠、Alexa Fluor954山羊抗大鼠和Alexa Fluor594山羊抗兔抗体(Invitrogen)。用PBS洗涤两次后，用具有DAPI的ProLong
Figure BDA0000513236410000191
抗褪色试剂(Invitrogen)封固载玻片，并且放置盖玻片。在Olympus BX61显微镜下观察载玻片。
冯库萨染色。用二甲苯处理切片(5-6μm)，接着用梯度浓度的乙醇处理。将切片在蒸馏水中洗涤并在紫外光下用1％硝酸银水溶液孵育1小时，接着在蒸馏水中洗涤并用5％硫代硫酸钠孵育5分钟。将切片在蒸馏水中洗涤并用0.1％核固红(nuclear fast red)溶液孵育5分钟，接着通过梯度醇和二甲苯进行脱水。接着将盖玻片放置在永久封固培养基中的载玻片上，并在Olympus BX61显微镜下进行观察。
结果以平均值±平均值标准误差(SEM)报道，并使用Microsoft Excel(Microsoft,Redmond,WA)计算。统计学显著性(p<0.05)由双侧学生t-检验分析来确定。
尽管为了清楚理解的目的已通过说明和实例的方式对前述发明进行了较为详细的描述，但本领域技术人员应认识到，可在随附权利要求的范围内实施某些改变和修改。另外，本文所提供的每个参考文献以引用的方式整体并入，其程度如同每个参考文献单独地以引用的方式并入一样。

Claims (17)

1.一种制备中和的葡甘聚糖支架的方法，所述方法包括：使碱性葡甘聚糖支架在高于大气压1psi至30psi的压力下与水溶液接触，以形成中和的葡甘聚糖支架，由此制备所述中和的葡甘聚糖支架，其中所述碱性葡甘聚糖支架通过葡甘聚糖凝胶脱水形成且具有大于8的pH。
2.如权利要求1所述的方法，其中在20℃至50℃的温度下进行所述接触。
3.如权利要求1所述的方法，其中在37℃的温度下进行所述接触。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述接触进行1小时至1周的时间段。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述接触进行1小时至1天的时间段。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述接触进行8小时至20小时的时间段。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述碱性葡甘聚糖支架进一步包含细胞粘附促进剂。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述细胞粘附促进剂选自：聚-L-赖氨酸(PLL)、聚-D-赖氨酸(PDL)、RGD肽(RGD)、KQAGDV、VAPG、FGL、胺基、纤连蛋白、弹性蛋白、胶原蛋白和层粘连蛋白。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述细胞粘附促进剂是聚-L-赖氨酸(PLL)。
10.如权利要求7所述的方法，其中所述方法进一步包括：
形成包含葡甘聚糖粉末、所述细胞粘附促进剂、碱性溶液和水的反应混合物；
将所述反应混合物在50℃至130℃的温度下加热以形成葡甘聚糖凝胶；
将所述葡甘聚糖凝胶冷却至低于50℃的温度；以及
将水从所述葡甘聚糖凝胶移除以形成所述碱性葡甘聚糖支架。
11.如权利要求10所述的方法，其中通过升华进行所述移除步骤。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述水溶液是缓冲溶液。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述缓冲溶液选自：PBS、HEPES、MES、MOPS、TRIS和BIS-TRIS丙烷。
14.如权利要求12所述的方法，其中所述缓冲溶液是PBS。
15.如权利要求1所述的方法，其中所述水溶液是细胞培养基。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述细胞培养基选自：洛斯维帕克纪念研究所培养基(RPMI)、达尔伯克氏改良的伊格尔培养基(DMEM)、最低必需培养基(MEM)，达尔伯克氏改良的伊格尔培养基：营养混合物F-12培养基(DMEM/F12)、伊斯科夫氏改良的达尔伯克氏培养基(IMDM)、国家典型培养物保藏中心培养基(NCTC)和成骨诱导培养基。
17.一种制备中和的葡甘聚糖支架的方法，所述方法包括：使碱性葡甘聚糖支架在10mmHg至500mmHg的真空压力下与水溶液接触，以形成中和的葡甘聚糖支架，由此制备所述中和的葡甘聚糖支架，其中所述碱性葡甘聚糖支架通过葡甘聚糖凝胶脱水形成且具有大于8的pH。
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