ES2679995T3 - Moléculas y métodos para la inhibición y detección de proteínas - Google Patents

Moléculas y métodos para la inhibición y detección de proteínas Download PDF

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Abstract

Un método para inducir la agregación de una proteína que comprende poner en contacto dicha proteína con una molécula de la siguiente estructura: (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, en donde: - n es un número entero de 1 a 5 e i aumenta de 1 a n con cada repetición; - cada uno de X2i-1 y X2i se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P; - cada Yi es una secuencia beta agregante seleccionada independientemente de entre una serie de 6 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que está presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E y en donde al menos un Yi es una serie idéntica o que difiere en no más de una sustitución de aminoácidos respecto de una serie contigua de aminoácidos que se encuentran en dicha proteína; y - cada Zi es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada; en donde la molécula es capaz de inducir la agregación de dicha proteína; y en donde el método no se practica en el cuerpo de un ser humano o un animal.

Description

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DESCRIPCION
Moléculas y métodos para la inhibición y detección de proteínas Campo de la invención
La presente solicitud pertenece al campo de los péptidos funcionales y más particularmente, al campo de la agregación controlada de proteínas. La solicitud divulga moléculas de una estructura peptídica, tal como se define en las reivindicaciones y la memoria descriptiva y métodos para usar dichas moléculas para aplicaciones terapéuticas y para usos diagnósticos, así como en otras aplicaciones, tales como en el campo de la agro-biotecnología y la biotecnología industrial. Las moléculas pueden usarse para curar y/o estabilizar infecciones, tales como enfermedades bacterianas, fúngicas y víricas, pero también son útiles en enfermedades humanas y veterinarias no infecciosas. Las moléculas también pueden usarse para la detección de biomarcadores de proteínas y para el pronóstico y diagnóstico de una serie de enfermedades.
Antecedentes
La agregación de proteínas está causada por el mal plegamiento y la consiguiente aglutinación de proteínas en aglomerados insolubles. La agregación de proteínas es, esencialmente, un proceso de auto-asociación en el que muchas moléculas de proteína idéntica forman aglomerados de un orden superior de baja solubilidad que en última instancia, se precipitan. Basándose en su morfología macroscópica, se clasifican generalmente como agregados ordenados o desordenados. En condiciones fisiológicas, puede inducirse la formación de agregados amorfos de prácticamente cualquier proteína a una alta concentración; en las mismas condiciones, un conjunto mucho más pequeño de proteínas forma fibras de amiloide ricas en p altamente ordenadas. Sin embargo, a nivel microscópico, la diferenciación entre estos dos tipos de agregados es más sutil. Los agregados amorfos no son solo acumulaciones de proteínas mal plegadas que se unen entre sí mediante contactos hidrofóbicos no específicos. Más bien, también se encuentran normalmente enriquecidos en estructura p cruzada y su propensión a la formación se correlaciona no solo con la hidrofobia, sino también con la propensión a una estructura secundaria y con la carga, lo que sugiere un mecanismo de formación específico (Chiti et al., PNAS 99:16419-16426 (2002); Chiti et al., Nature 424:805-808 (2003); Chiti et al., Nat Struct Biol 9:137-143 (2002)). Por otro lado, no todos los agregados y fibras comunicados están enriquecidos en estructura p, ya que se ha comunicado que tanto los agregados amorfos como las fibras conservan propiedades espectrales e incluso actividad enzimática similares a las naturales. En estos casos, se ha propuesto que la agregación se produce por otros mecanismos de oligomerización, tales como intercambio de dominios tridimensionales (Rousseau et al., PNAS 98: 5596-5601,2001; Liu y Eisenberg, Protein Sci 11: 1285-1299, 2002) tal como se observa a menudo en los dímeros de proteínas. El hecho de centrarse en la agregación de proteínas se debe, en gran medida, a la observación de que una serie de enfermedades humanas están caracterizadas por depósitos de proteínas compuestos por uno o un número muy limitado de proteínas. Algunos ejemplos de dichas enfermedades, donde se sabe que la conversión de proteínas normalmente solubles en proteínas insolubles alteradas conformacionalmente tiene una relevancia causal son, por ejemplo, la aparición de péptido beta amiloide en la enfermedad de Alzheimer y en la angiopatía amiloide cerebral, depósitos de a-sinucleína en los cuerpos de Lewi de la enfermedad de Parkinson, los priones en la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob, superóxido dismutasa en la esclerosis lateral amiotrófica y tau en los ovillos neurofibrilares en la demencia frontal temporal y la enfermedad de Pick. Por tanto, hasta ahora, la agregación de proteínas se ha estudiado principalmente con un fenómeno no deseado causante de enfermedades y en la actualidad se acepta ampliamente que la agregación mediada por beta cruzado es el mecanismo de agregación que se produce con más frecuencia y de mayor relevancia biológica. Aunque desde hace tiempo se considera que la agregación de proteínas es un proceso desordenador mediado por interacciones hidrófobas inespecíficas, en la actualidad resulta evidente que en particular, la agregación de amiloide es en muchos casos esencialmente un proceso de auto-asociación específico. Los agregados formados tanto in vitro como in vivo están generalmente enriquecidos en una proteína particular y aunque la agregación es un proceso espontáneo in vitro, en el ambiente celular este proceso está controlado de manera activa por las chaperonas. El mecanismo más común mediante el que se agregan las proteínas mal plegadas consiste en la auto-asociación de segmentos de polipéptido específicos de proteínas idénticas en una lámina beta intermolecular creciente (por ejemplo, Makin et al., PNAS 102(2): 315-20 (2005); Sawaya et al., Nature 447(7143):453-7 (2007)). En general, estos segmentos de agregación-nucleación son cortos, constando de 5-15 restos y pueden predecirse de manera precisa usando algoritmos biofísicos disponibles. En la actualidad hay datos abundantes para demostrar que las hebras individuales interactúan para formar una lámina beta intermolecular y que esta estructura forma el armazón del agregado. Las secuencias agregantes son muy comunes en las proteínas globulares y se producen con una frecuencia aproximadamente igual en proteínas a, p, a+p y a/p (Clasificación SCOP: Lo Conte et al., Nucleic Acids Res 28:257-259 (2000)) (Linding et al., J Mol Biol 342: 345-353 (2004)). Estas series cortas propensas a la agregación son suficientes para inducir la agregación de una proteína, tal como se ha demostrado mediante experimentos de injerto que demostraron que el trasplante de un segmento de nucleación- agregación de una proteína agregante a una proteína no agregante transfiere tanto la propensión a la agregación como la estructura del agregado de la primera a esta última (Esteras-Chopo et al., PNAS 102: 16672-16677, 2005). Se puede considerar que las secuencias de proteína sensibles a la agregación son el precio a pagar por la existencia de estructuras de proteína globulares: al producirse las interacciones de cadena lateral terciaria principalmente en el núcleo hidrofóbico, las series de proteína que abarcan esta región normalmente tienen
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propensión a la agregación. Sin embargo, para las proteínas globulares naturales, la agregación normalmente no representa un problema, ya que las series de proteína propensas a la agregación quedan normalmente secuestradas por la estructura de la proteína y de este modo, protegidas frente a la auto-asociación. Por otro lado, durante la traducción y el plegamiento de la proteína o en caso de haber estrés celular o mutaciones desestabilizantes, los estados parcialmente plegados tienen muchas más probabilidades de auto-asociarse e inducir agregación y amiloidosis.
Ya que la mayoría de proteínas portan secuencias de péptido propensas a la agregación en su estructura primaria y al ser la agregación específica de la secuencia, se demostró con éxito previamente que es posible desarrollar una estrategia general para inducir de manera específica la agregación de una proteína diana seleccionada (véase el documento WO2007071789). En este último método, se expuso una proteína diana a un portador que presentaba un péptido corto específico de la diana propenso a la agregación (es decir, una región beta-agregante procedente de una proteína diana seleccionada; sorprendentemente, se demostró que la exposición a una región agregante de nucleación tomada de la proteína es una condición suficiente para la agregación). Este portador (nombrado como resto solubilizante, véase, por ejemplo, la figura 1 y su leyenda en el documento WO2007071789) fue esencial para prevenir la agregación y por lo tanto, también la estabilidad de la región p-agregante antes de que esta región se expusiese a la diana.
Sería ventajoso proporcionar moléculas interferidoras adicionales mejoradas que no requieran de un resto portador o solubilizante para permanecer en solución y aun así lograr inhibir la función de proteínas mediante co-agregación. Dichas moléculas serían más fáciles de sintetizar o producir. Además, sería ventajoso definir de manera precisa los determinantes estructurales que permiten que las moléculas, por una parte, permanezcan solubles tal cual, mientras que por otra parte sean capaces de inducir la agregación de una proteína diana. Además, podrían ser muy útiles moléculas que sean capaces de inducir la formación estable de agregado beta intermolecular con una cinética favorable para aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas (biotecnología "roja"), así como en aplicaciones de agro- biotecnología (biotecnología "verde"), aplicaciones para organismos marinos y de agua dulce (biotecnología "azul"), industriales (biotecnología "blanca") o para su uso en investigación.
Sumario
La presente invención proporciona moléculas mejoradas (en el presente documento denominadas además moléculas interferidoras) para provocar la agregación de proteínas tras entrar en contacto. Estás moléculas interferidoras dejan de requerir la presencia de un resto solubilizante, a la vez que conservan las propiedades de estabilidad (es decir, prevenir la agregación prematura) y mientras, siguen siendo capaces de provocar la coagregación con una proteína diana. Por agregación prematura, se entiende que las moléculas se agregan entre sí de tal manera que no pueden lograr la agregación o inhibición de una proteína diana. Sorprendentemente, se ha descubierto que las secuencias inductoras de agregación que están flanqueadas por secuencias o restos con un bajo potencial de formación de lámina beta (es decir, restos que rompen la agregación) no solo son más solubles, sino que a la vez conservan propiedades inductoras de la agregación extremadamente eficaces y además, específicas. Las moléculas descritas en el presente documento pueden tener más de una región inductora de la agregación, que después están flanqueadas cada una por restos que rompen la agregación, más particularmente, las regiones inductoras de la agregación están separadas por un enlazador. En caso de que las proteínas diana sean biológicamente activas o funcionales, la inducción de la agregación dará como resultado normalmente una inhibición funcional de la proteína. Tal como resultará evidente a partir de los ejemplos adjuntos, los interferidores mejorados de la invención tienen aplicaciones terapéuticas y diagnósticas importantes, así como aplicaciones en la agro-biotecnología, la biotecnología blanca y como herramientas de investigación.
Por consiguiente, la presente invención proporciona materia objeto tal como se expone en un cualquiera y en todos de (1) a (32) a continuación:
(1) Un método para inducir la agregación de una proteína que comprende poner en contacto dicha proteína con
una molécula de la siguiente estructura: (X2¡-i-Yi-X2¡-Zi)n, en donde:
- es un número entero de 1 a 5 e i aumenta de 1 a n con cada repetición;
- cada uno de X2i-1 y X2¡ se selecciona independientemente de entre 1 a 4 restos de aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P;
- cada Y¡ es una secuencia beta agregante seleccionada independientemente de entre una serie de 6 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que está presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E y en donde al menos un Yi es una serie idéntica o que difiere en no más de una sustitución de aminoácidos respecto de una serie contigua de aminoácidos que se encuentran en dicha proteína; y
- cada Zi es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada;
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en donde la molécula es capaz de inducir la agregación de dicha proteína; y en donde el método no se practica en el cuerpo de un ser humano o un animal.
(2) Un método para regular a la baja la función biológica de una proteína que comprende poner en contacto dicha proteína con una molécula de la siguiente estructura: (X2¡-1-Yi-X2¡-Zi)n, en donde:
- n es un número entero de 1 a 5 e i aumenta de 1 a n con cada repetición;
- cada uno de X2¡-i y X2¡ se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos
seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados
de entre R, K, E, D y P;
- cada Y¡ es una secuencia beta agregante seleccionada independientemente de entre una serie de 6 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que está presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E y en donde al menos un Yi es una serie idéntica o que difiere en no más de una sustitución de aminoácidos respecto de una serie contigua de aminoácidos que se encuentran de manera natural en dicha proteína; y
- cada Zi es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada;
en donde la molécula se capaz de regular a la baja la función biológica de dicha proteína; y en donde el método no se practica en el cuerpo de un ser humano o un animal.
(3) Una molécula de la siguiente estructura: (X2¡-1 -Y¡-X2¡-Z¡)n, en donde:
- n es 1 a 5 e i aumenta de 1 a n con cada repetición;
- cada uno de X2Í-1 y X2¡ se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P;
- cada Y¡ es una secuencia beta agregante seleccionada independientemente de entre una serie de 6 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que está presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E y en donde al menos un Yi es una serie idéntica o que difiere en no más de una sustitución de aminoácidos respecto de una serie contigua de aminoácidos que se encuentran de manera natural en una proteína; y
- cada Z¡ es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada;
en donde la molécula es capaz de unirse a, inducir la agregación de o regular a la baja la función de dicha proteína y en donde la unión de la molécula a dicha proteína, la agregación de dicha proteína o la regulación a la de la función biológica en un sujeto es terapéuticamente útil; para su uso como medicamento.
(4) La molécula de (3), en donde la expresión o sobreexpresión de dicha proteína se asocia con o es causante de una enfermedad, para su uso en el tratamiento o prevención de dicha enfermedad.
(5) La molécula de (3), en donde la unión de la molécula a dicha proteína, la agregación de dicha proteína o la regulación a la baja de la función biológica en un sujeto es terapéuticamente útil en el cáncer, tal como en donde la expresión o sobreexpresión de dicha proteína se asocia con o es causante del cáncer, para su uso en el tratamiento del cáncer.
(6) La molécula de (3), en donde la unión de la molécula a dicha proteína, la agregación de dicha proteína o la regulación a la baja de la función biológica en un sujeto es terapéuticamente útil en la AMD, tal como en donde la expresión o sobreexpresión de dicha proteína se asocia con o es causante de la AMD, para su uso en el tratamiento de la AMD.
(7) La molécula de (3), en donde la unión de la molécula a dicha proteína, la agregación de dicha proteína o la regulación a la baja de la función biológica en un sujeto es terapéuticamente útil en una enfermedad inflamatoria, tal como en donde la expresión o sobreexpresión de dicha proteína se asocia con o es causante de una enfermedad inflamatoria, para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad inflamatoria.
(8) Una molécula de la siguiente estructura: (X2¡-1-Y¡-X2¡-Z¡)n, en donde:
- n es 1 a 5 e i aumenta de 1 a n con cada repetición;
- cada uno de X2Í-1 y X2¡ se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, A, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P;
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- cada Yi es una secuencia beta agregante seleccionada independientemente de entre una serie de 6 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que está presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E y en donde al menos un Yi es una serie idéntica o que difiere en no más de una sustitución de aminoácidos respecto de una serie contigua de aminoácidos que se encuentran de manera natural en una proteína de un organismo patógeno; y
- cada Zi es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada;
en donde la molécula es capaz de unirse a, inducir la agregación de o regular a la baja la función de dicha proteína y en donde la unión de la molécula a dicha proteína, la agregación de dicha proteína o la regulación a la baja de la función biológica de dicha proteína en el organismo patógeno elimina el organismo patógeno o inhibe el crecimiento y/o la reproducción del organismo patógeno;
para su uso como compuesto antipatógenos en el tratamiento de una enfermedad infecciosa causada por el organismo patógeno.
(9) Un método para eliminar un organismo patógeno o inhibir el crecimiento y/o la reproducción de un organismo patógeno que comprende poner en contacto el organismo patógeno con una molécula de la siguiente estructura: (X2i-i-Yi-X2i-Zi)n, en donde:
- n es 1 a 5 e i aumenta de 1 a n con cada repetición;
- cada uno de X2i-1 y X2i se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, A, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P;
- cada Yi es una secuencia beta agregante seleccionada independientemente de entre una serie de 6 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que está presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E y en donde al menos un Yi es una serie idéntica o que difiere en no más de una sustitución de aminoácidos respecto de una serie contigua de aminoácidos que se encuentran de manera natural en una proteína del organismo patógeno; y
- cada Zi es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada;
en donde la molécula es capaz de unirse a, inducir la agregación de o regular a la baja la función de dicha proteína y en donde la unión de la molécula a dicha proteína, la agregación de dicha proteína o la regulación a la baja de la función biológica de dicha proteína en el organismo patógeno elimina el organismo patógeno o inhibe el crecimiento y/o la reproducción del organismo patógeno; y en donde el método no se practica en el cuerpo de un ser humano o un animal.
(10) La molécula para su uso de (8) o el método de (9), en donde el patógeno es un organismo vírico.
(11) La molécula para su uso de (8) o el método de (9), en donde el patógeno es un organismo microbiano seleccionado de entre bacterias grampositivas, bacterias gramnegativas, micobacterias, hongos, levaduras y mohos.
(12) La molécula para su uso de uno cualquiera de (3)-(8) o el método de (9), en donde la molécula se proporciona en un dispositivo implantable recubierto al menos parcialmente con la molécula.
(13) Un dispositivo implantable recubierto al menos parcialmente con moléculas de la estructura (Xa-1-Yi-X2i-Zi)n, en donde:
- n es un número entero de 1 a 5 e i aumenta de 1 a n con cada repetición;
- cada uno de X2i-1 y X2i se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos
seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados
de entre R, K, E, D y P;
- cada Yi es una secuencia beta agregante seleccionada independientemente de entre una serie de 6 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que está presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E y en donde al menos un Yi es una serie idéntica o que difiere en no más de una sustitución de aminoácidos respecto de una serie contigua de aminoácidos que se encuentran de manera natural en una proteína de un organismo patógeno; y
- cada Zi es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada;
en donde la molécula es capaz de unirse a, inducir la agregación de o regular a la baja la función de dicha proteína y en donde la unión de la molécula a dicha proteína, la agregación de dicha proteína o la regulación a la
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baja de la función biológica de dicha proteína en el organismo patógeno elimina el organismo patógeno o inhibe el crecimiento y/o la reproducción del organismo patógeno.
(14) Un método para seleccionar nuevos compuestos inhibidores y/o de detección, que comprende las etapas de:
a) identificar en al menos una proteína al menos una región de 6 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que está presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E;
b) sintetizar una molécula de la siguiente estructura: (X2¡-1 -Y¡-X2¡-Zi)n, en donde:
- n es 1 a 5 e i aumenta de 1 a n con cada repetición;
- cada uno de X2i-1 y X2¡ se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, A, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P;
- cada Y¡ es una secuencia beta agregante seleccionada independientemente de entre 6 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que está presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E y en donde al menos un Yi es una serie idéntica o que difiere en no más de una sustitución de aminoácidos respecto de una serie contigua de aminoácidos que se encuentran de manera natural en la proteína identificada en la etapa a); y
- cada Z¡ es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada;
c) poner en contacto la molécula preparada en la etapa b) con la proteína de la etapa a); y
d) evaluar la función y/o la agregación de la proteína.
(15) Un método para identificar nuevas dianas para compuestos inhibidores, comprendiendo el método de (14), en donde la proteína en la etapa a) no es una diana conocida para compuestos inhibidores.
(16) Un método para detectar una proteína en una muestra, que comprende las etapas de:
a) poner en contacto una muestra sospechosa de contener la proteína con una molécula de la siguiente estructura: (X2¡-1-Y¡-X2¡-Z¡)n, en donde:
- n es 1 a 5 e i aumenta de 1 a n con cada repetición;
- cada uno de X2Í-1 y X2¡ se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, A, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P;
- cada Y¡ es una secuencia beta agregante seleccionada independientemente de entre una serie de 6 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que está presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E y en donde al menos un Y¡ es una serie idéntica o que difiere en no más de una sustitución de aminoácidos respecto de una serie contigua de aminoácidos que se encuentran de manera natural en la proteína que se va a detectar; y
- cada Z¡ es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada;
en donde la molécula es capaz de unirse a, inducir la agregación de o regular a la baja la función biológica de
dicha proteína;
b) detectar la presencia de las moléculas que han reaccionado con la proteína.
(17) El método de (16), en donde el al menos un Y¡ que es idéntico a o difiere en no más de una sustitución de aminoácidos respecto de la serie contigua de aminoácidos que se encuentran de manera natural en la proteína que se va a detecta es único para dicha proteína en dicha muestra.
(18) El método de (16) o (17), en donde la molécula comprende un marcador detectable y la detección en la etapa b) es mediante la detección del marcador detectable.
(19) El método de uno cualquiera de (16) a (18), en donde la molécula se proporciona sobre un soporte sólido.
(20) El método de (19), en donde al menos dos moléculas diferentes son capaces de unirse a, inducir la agregación de o regular a la baja la función biológica de dos proteínas diferentes que se van a detectar se
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proporcionan sobre el soporte sólido.
(21) Un método in vitro para el diagnóstico de una enfermedad que comprende detectar una proteína que es indicativa de la enfermedad en una muestra de un sujeto, en donde la proteína se detecta mediante un método que comprende las etapas de:
a) poner en contacto una muestra sospechosa de contener la proteína con una molécula de la siguiente estructura: (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, en donde:
- n es 1 a 5 e i aumenta de 1 a n con cada repetición;
- cada uno de X2i-1 y X2i se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, A, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P;
- cada Yi es una secuencia beta agregante seleccionada independientemente de entre una serie de 6 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que está presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E y en donde al menos un Yi es una serie idéntica o que difiere en no más de una sustitución de aminoácidos respecto de una serie contigua de aminoácidos que se encuentran de manera natural en la proteína que se va a detectar; y
- cada Zi es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada;
en donde la molécula es capaz de unirse a, inducir la agregación de o regular a la baja la función biológica de
la proteína que se va a detectar;
b) detectar la presencia de las moléculas que han reaccionado con la proteína.
(22) Un método para regular a la baja la función biológica de una proteína en una planta, una célula vegetal o una semilla de planta, que comprende poner en contacto dicha proteína con una molécula de la siguiente estructura: (Xa-1-Yi-X2i-Zi)n, en donde:
- n es un número entero de 1 a 5 e i aumenta de 1 a n con cada repetición;
- cada uno de X2i-1 y X2i se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P;
- cada Yi es una secuencia beta agregante seleccionada independientemente de entre una serie de 6 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que esté presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E y en donde al menos un Yi es una serie idéntica o que difiere en no más de una sustitución de aminoácidos respecto de una serie contigua de aminoácidos que se encuentran de manera natural en dicha proteína en dicha planta, célula vegetal o semilla de planta; y
- cada Zi es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada; en donde la molécula se capaz de regular a la baja la función biológica de dicha proteína.
(23) El método de acuerdo con (22), en donde la molécula es un polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos presente en un vector recombinante y que, tras su introducción en la célula vegetal, la semilla de planta o la planta, produce dicho polipéptido en dicha célula vegetal, la semilla de planta o la planta.
(24) El método de uno cualquiera de (1)-(2), (9)-(12), (14)-(20) o (21)-(23), la molécula para su uso de uno cualquiera de (3)-(8) o (10)-(12) o el dispositivo implantable de (13), en donde dichos X2-1 y X2i son 1 o 2 aminoácidos.
(25) El método de uno cualquiera de (1)-(2), (9)-(12), (14)-(20), (21)-(24), la molécula para su uso de uno cualquiera de (3)-(8), (10)-(12) o (24) o el dispositivo implantable de (13) o (24), en donde al menos uno y más particularmente todos, Yi es una serie de 6 a 13 aminoácidos, particularmente de 6 a 9 aminoácidos, más particularmente de 6 o 7 aminoácidos.
(26) El método de uno cualquiera de (1)-(2), (9)-(12), (14)-(20), (21)-(25), la molécula para su uso de uno cualquiera de (3)-(8), (10)-(12) o (24)-(25) o el dispositivo implantable de (13) o (24)-(25), en donde al menos dos y en particular cada uno de, Yi son cada uno independientemente idénticos a o difieren en no más de una sustitución de aminoácidos respecto de una serie de 6 a 16 aminoácidos contiguos que se encuentran de manera natural en una proteína.
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(27) El método de uno cualquiera de (1)-(2), (9)-(12), (14)-(20), (21)-(26), la molécula para su uso de uno cualquiera de (3)-(8), (10)-(12) o (24)-(26) o el dispositivo implantable de (13) o (24)-(26), en donde cada Zi se selecciona independientemente de una serie de entre 0 y 20 unidades, en donde una unidad es un aminoácido, un monosacárido, un nucleótido, ácido trioxadecan-succínico (Ttds) o PEG.
(28) El método de uno cualquiera de (1)-(2), (9)-(12), (14)-(20), (21)-(26), la molécula para su uso de uno cualquiera de (3)-(8), (10)-(12) o (24)-(26) o el dispositivo implantable de (13) o (24)-(26), en donde cada Zi se selecciona independientemente de una serie de entre 0 y 20 unidades, en donde una unidad es un aminoácido.
(29) El método de uno cualquiera de (1)-(2), (9)-(12), (14)-(20), (21)-(26), la molécula para su uso de uno cualquiera de (3)-(8), (10)-(12) o (24)-(26) o el dispositivo implantable de (13) o (24)-(26), en donde cada Zi se selecciona independientemente de una serie de entre 0 y 10 unidades, en donde una unidad es un aminoácido o PEG.
(30) El método de uno cualquiera de (1)-(2), (9)-(12), (14)-(20), (21)-(29), la molécula para su uso de uno cualquiera de (3)-(8), (10)-(12) o (24)-(29) o el dispositivo implantable de (13) o (24)-(29), en donde n es 1, X1 y X2 son en total no más de 5 aminoácidos, Y1 es una serie de entre 6 y 10 aminoácidos y Z1 es una serie de 0 unidades.
(31) El método de uno cualquiera de (1)-(2), (9)-(12), (14)-(20), (21)-(29), la molécula para su uso de uno cualquiera de (3)-(8), (10)-(12) o (24)-(29) o el dispositivo implantable de (13) o (24)-(29), en donde n es 2, Z1 es un enlazador Z2 es nada.
(32) El método de uno cualquiera de (1)-(2), (9)-(12), (14)-(20), (21)-(31), la molécula para su uso de uno cualquiera de (3)-(8), (10)-(12) o (24)-(31) o el dispositivo implantable de (13) o (24)-(31), que además comprende un resto que aumenta la solubilidad de la molécula.
La materia objeto proporcionada por la invención pertenece de manera específica a la divulgación, la descripción y la enseñanza de la presente memoria descriptiva.
La memoria descriptiva describe moléculas (que incluyen moléculas de acuerdo con los aspectos y realizaciones de la invención) que tienen la siguiente estructura:
(X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, en donde n es un número entero de 1 a 5 e i aumenta de 1 a n con cada repetición; y en donde
- cada uno de X2M y X2i se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P; lo más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, D y P;
- cada Yi se selecciona independientemente de entre una serie de 4 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que está presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E; y
- cada Zi es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada.
En particular, para las moléculas donde n=1, pueden aplicarse limitaciónes adicionales. Por ejemplo, un conjunto de limitaciónes que está previsto para moléculas donde n es 1, es el siguiente:
- X1 y X2 son 1 o 2 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P; y
- Y1 es una serie de 6 a 11 aminoácidos contiguos,
- de los cuales, al menos un 75% son aminoácidos hidrofóbicos,
- en la que al menos un 50% de los aminoácidos son restos alifáticos o de F,
- en la que no hay restos de P, R, K, D, E o H presentes,
- en la que no hay más de un resto de C, M, N, Q, W, G, S, A o T presente,
- en la que no hay más de 3 restos de Y o F presentes,
- en la que no hay más de dos restos no alifáticos idénticos contiguos presentes,
- en la que no hay más de 2 restos alifáticos idénticos contiguos presentes,
- en la que no hay más de dos restos polares no aromáticos consecutivos presentes,
- en donde no hay más de un 50% de restos idénticos presentes,
- en donde el 1er y/o el último resto es un resto alifático o de F,
- en donde la suma de restos de A y G no es mayor de 2,
- en donde el porcentaje total de restos de A, G y S es de no más del 25%,
- en donde el porcentaje total de restos de C, M, N, Q y W es de no más del 25%,
- y en donde el porcentaje total de restos pequeños distintos de V (es decir, seleccionados de entre A, C, G, S, N, T) es de no más del 25%.
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El experto en la materia entenderá que, ya que Zi es un enlazador entre las unidades de X2i-i-Yi-X2i individuales y Zn es un enlazador opcional en un extremo de la molécula, la fórmula (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n es equivalente a la fórmula (Zi-Xa- 1-Yi-X2i)n, en donde cada Z2 a Zn es un enlazador y Z1 se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada. En lugar de indicar que Zn (o el Z1 N-terminal equivalente) es nada, puede decirse que este resto está ausente - es decir, Zn es un enlazador o está ausente (o dicho de manera completa: cada Zi es un enlazador seleccionado independientemente y Zn (o el Z1 N-terminal equivalente) es un enlazador o está ausente.
Una fórmula alternativa también podría ser: (X2i-1-Yi-X2i)n - siendo X2i-1 y X2i, Yh i y n como se han definido anteriormente - en donde las n unidades están fusionadas entre sí con enlazadores seleccionados independientemente. Las moléculas pueden comprender en el extremo N y/o C-terminal un enlazador adicional. De acuerdo con esta fórmula, los enlazadores están presentes entre el resto X2i de la unidad i-ésima y el resto Xa-1 de la unidad (i+1)-ésima siguiente y hay un total de (n-1) enlazadores en la molécula (es decir, Zi a Zn-1 o Z2 a Zn); el último enlazador (Zn o Z1 respectivamente) es un enlazador o está ausente. Otra forma más de reformular la fórmula es Z0- (X2i-1 -Yi-X2i-Zi)n, en donde X2i-1 y Xa, Yi, i y n son como se han definido anteriormente, cada Zi es un enlazador y tanto Z0 como Zn se seleccionan independientemente de entre un enlazador o nada (es decir, las moléculas tienen un enlazador C o N-terminal, ninguno o ambos).
Aunque la molécula consiste normalmente en la estructura descrita anteriormente, también se prevé que las moléculas consisten esencialmente en esa estructura. Por esto se entiende que, de acuerdo con realizaciones particulares, las moléculas pueden contener en N o C-terminal aminoácidos adicionales (es decir, están fusionadas en el extremo N o C-terminal a aminoácidos adicionales), en particular de 1 a 10 aminoácidos, más particularmente, de 1 a 5 aminoácidos. Dichos aminoácidos adicionales se prevén en particular para realizaciones donde n es al menos dos. Los aminoácidos adicionales en particular no tienen un perfil específico, es decir, no son una serie hidrófoba, tal como el o los restos Yi - en otras palabras, contienen menos de un 50% de restos hidrofóbicos - o simplemente no se seleccionan de entre los restos que forman un resto X numerado. Sin embargo, en algunos casos, en particular donde un resto X no contiene aminoácidos cargados, se prevé que este esté flanqueado adicionalmente por uno o dos aminoácidos hidrofóbicos (en el lado del resto X que no flanquea al resto Y). Este es el caso particularmente donde el resto X (no cargado) y los aminoácidos hidrofóbicos son idénticos a la secuencia de proteína que flanquea la secuencia correspondiente al resto Yi en la proteína; en otras palabras, donde la parte en la molécula correspondiente en secuencia a la secuencia de proteína comprende al menos un resto X además del resto Yi. Sin embargo, más particularmente, las moléculas terminan tanto en N como en C-terminal con un resto de X.
Como se ha mencionado, en la fórmula anterior, n es un número entero de 1 a 5 e i aumenta de 1 a n con cada repetición. En otras palabras, i comienza en 1 y aumenta en 1 con cada repetición hasta que se alcanza n; o i es el número de la repetición (y es un número entero de 1 a n).
Por lo tanto, la fórmula abarca las siguientes estructuras:
X1-Y1-X2-Z1 (es decir, n=1),
X1-Y1-X2-Z1-X3-Y2-X4-Z2 (es decir, n=2),
X1-Y1-X2-Z1-X3-Y2-X4-Z2-X5-Y3-X6-Z3 (es decir, n=3),
X1-Y1-X2-Z1-X3-Y2-X4-Z2-X5-Y3-X6-Z3-X7-Y4-X8-Z4 (es decir, n=4) y
X1-Y1-X2-Z1-X3-Y2-X4-Z2-X5-Y3-X6-Z3-X7-Y4-X8-Z4-X9-Y5-X10-Z5 (es decir, n=5), en donde cada X, Y y Z numerado es como se ha definido anteriormente.
Cabe destacar que las moléculas son lineales, para asegurar que los restos de Yi puedan ponerse en contacto con las proteínas que se van a usar como diana. Solo se prevén moléculas ramificadas lineales (donde al menos dos unidades repetitivas X2i-1-Yi-X2i están unidas independientemente a través de un enlazador a otra unidad X2i-1-Yi-X2i) y moléculas cíclicas en la medida que los restos Yi sean accesibles a otras moléculas.
Los Yi en la fórmula anterior son secuencias inductoras de la agregación, por lo que se entienden secuencias inductoras de agregación beta. Más particularmente, las secuencias son secuencias de agregación beta no amiloides (en ocasiones citadas como secuencias de agregación beta amorfas). La agregación beta amiloide y no amiloide difiere en la estructura de orden mayor, en la cinética de agregación y en las secuencias de proteínas adecuadas para agregación (Rousseau et al., Current Opinion in Structural Biology 16:118-126, 2006). De hecho, las preferencias de aminoácidos serán mucho más específicas de la posición en una fibra de amiloide que en los agregados p cruzados amorfos. Por ejemplo, en los hexapéptidos de amiloide, las posiciones 3 y 4 son extremadamente selectivas, ya que solo son compatibles algunos tipos de aminoácidos con una estructura de amiloide altamente ordenada. Por otro lado, las posiciones 1, 2 y 6 son mucho más tolerantes, ya que prácticamente cualquier tipo de resto permite la formación del amiloide (Lopez de la Paz et al., PNAS 101:87-92, 2004). Por el contrario, puede acomodarse prácticamente cualquier resto en cualquier posición de un hexapéptido para que se produzca la agregación p, en tanto que la secuencia en conjunto tenga propensión a encontrarse en una conformación p extendida y es lo suficientemente hidrófoba y/o neutra en cuanto a la carga (Fernandez-Escamilla et al., Nat Biotechnol 22:1302-1306, 2004). Por lo tanto, las posiciones amilogénicas son mucho más específicas en cuanto a la posición, pero también mucho más tolerantes a restos polares y cargados que las secuencias agregantes
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p. Esto también tiene consecuencias en la cinética de ambos procesos. Debido a sus requisitos conformacionales menos rigurosos, la p agregación es generalmente mucho más rápida que la amiloidosis. Obsérvese, sin embargo, que hay una fina línea que divide las secuencias compatibles con las estructuras de p amiloide cruzadas altamente ordenadas que forman agregados p cruzados amorfos (Lopez de la Paz et al., PNAS 101:87-92, 2004; Rousseau et al., Current Opinion in Structural Biology 16:118-126, 2006). Aunque en el presente documento se prevé principalmente la agregación amorfa, ya que en algunas situaciones no es deseable la agregación de amiloide (y por lo tanto debe excluirse), para muchas aplicaciones carece de importancia la naturaleza de los agregados. Por lo tanto, también se prevén agregados de amiloide.
Se observó que las secuencias definidas anteriormente tienen una alta tendencia a la agregación beta (esto puede determinarse usando, por ejemplo, algoritmos tales como TANGO, Zyggregator, ...), en particular, una tendencia a la agregación beta no amiloide, en vista de las restricciones en los restos polares y cargados.
Es específico para las moléculas descritas en el presente documento que las secuencias inductoras de la agregación (con un alto potencial de formación de beta-lámina) estén flanqueadas por restos que tienen un bajo potencial formador de beta-lámina o incluso de "romper" las beta-láminas, los denominados restos constitutivos. Estos son los restos X numerados en la fórmula. Sorprendentemente, se observó que las secuencias inductoras de la agregación que están demarcadas por dichos restos específicos, no solo son más solubles que las secuencias que no están flanqueadas por dichos restos constitutivos, sino que a la vez, conservan propiedades inductoras de la agregación muy buenas y específicas. Especialmente, esto último es sorprendente, ya que generalmente se asume que en las proteínas, las secuencias hidrófobas están intercaladas con restos polares o cargados para prevenir la agregación. En las moléculas descritas en el presente documento, los restos constitutivos flanqueantes como sean aseguran que la secuencia inductora de la agregación se presente de manera adecuada a la proteína de interés. Sin quedar ligados a un mecanismo particular, esto puede estar ayudado por interacciones estabilizantes (por ejemplo, enlaces de H o complementariedad de carga) entre los restos constitutivos y la proteína de interés. Esto también puede dar lugar a una especificidad de la interacción aumentada. Obsérvese que la tendencia a la agregación se determina en parte por el ambiente, las propiedades listadas anteriormente se prevén particularmente en condiciones fisiológicas, por ejemplo, a intervalos de pH fisiológicos. Esto no implica que los métodos se limiten a las condiciones fisiológicas, ya que, por ejemplo, la detección de proteínas puede producirse en condiciones no fisiológicas.
Los X2i-1 y X2i son series contiguas de 1 a 4 aminoácidos específicos seleccionados de manera independiente: R, K, E, D, P, N, S, A, H, G y Q. Aunque pueden usarse todos estos aminoácidos, se obtienen los mejores resultados cuando se usan restos que están raramente o incluso en absoluto presentes en las series Yi hidrófobas, en particular, restos cargados y/o no hidrofóbicos, en particular, R, K, E, D, P, N, S, H, Q y G (obsérvese que aunque normalmente se considera G como un resto hidrofóbico, la ausencia de cadenas laterales y su diminuto tamaño significa que no favorece particularmente la agregación de beta lámina), más particularmente, R, K, E, D, P y H (es decir, restos cargados, incluyendo H o prolina), aún más particularmente, R, K, E, D y P (es decir, restos cargados o prolina, que debido a su cadena lateral particular induce un doblez y es un buen péptido rompedor), lo más particularmente, R, K y P (restos positivos o prolina) o R y P (resto positivo no hidrofóbico o prolina). Como alternativa, R, D y P se prevén como restos constitutivos: R es un resto más voluminoso y no hidrofóbico que K (hidrofóbico) y por lo tanto, es mucho más rompedor para la formación de beta-lámina. Aunque D es más pequeño, su carga es más próxima a la cadena principal del péptido o proteína y más difícil de negar. De acuerdo con realizaciones muy particulares, más particularmente cuando n es 1, no se prevé que K sea un resto constitutivo - por lo tanto, los aminoácidos del resto X se seleccionan de entre R, E, D, P, N, S, A, H, G y Q o un subconjunto de los mismos.
Tal como se explicará con más detalle, para las realizaciones donde n=1, pueden aplicarse limitaciónes adicionales a las moléculas. Esto no se debe a que estas moléculas sean no funcionales, sino porque la técnica anterior puede haber descrito moléculas de naturaleza peptídica (con un fin distinto) que tienen la misma estructura general a la descrita en el presente documento. Las limitaciónes son en particular en cuanto a la longitud, a la naturaleza de los restos previstos en restos específicos, tal como se describe en la descripción detallada. Aunque estas limitaciónes más estrictas se necesitarán únicamente para moléculas donde n=1, también se prevén para n=2 (o un n incluso mayor).
De acuerdo con realizaciones particulares, cada X2i-1 y X2i tiene 1 o 2 aminoácidos. Los restos adicionales a los de la secuencia agregante desempeñan un papel secundario a la hora de mantener la molécula en solución. De acuerdo con realizaciones alternativas, pero no excluyentes, cada X2i-1 y X2i tiene una carga total de no más de 2. Como alternativa, el número total de aminoácidos en ambos restos X es de 5 o menor, particularmente de 4 o menor. Algunas realizaciones alternativas prevén que la carga total de ambos restos X que rodean a la región Y hidrófoba sea menor de 5, particularmente de 4 o menor. Las realizaciones en este párrafo se prevén más particularmente para moléculas donde n es 1 o moléculas donde n es dos.
El Yi tal como se ha descrito en la fórmula en el presente documento, es una secuencia agregante beta. Más particularmente, es una serie seleccionada independientemente de 4 a 17, en particular de 4 a 16 o de 4 a 15 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y
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preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T. En particular, está presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E en la secuencia. Sin embargo, de acuerdo con realizaciones muy particulares, pueden estar presentes dos restos seleccionados de entre R, K; D y E, en tanto que la carga neta sea cero (es decir, si sus cargas son opuestas). Ya que se prevé más K que R en una serie hidrófoba, pueden estar presentes dos restos seleccionados de entre K; D y E en el resto Yi. Ya que en estas realizaciones es necesario que la carga sea cero, esto equivale a decir que están presentes dos restos cargados, uno de los cuales es un resto de K y el otro se selecciona de entre un resto de D y E. De acuerdo con realizaciones específicas adicionales, o bien no hay restos de P, R, K, D o E en el resto Yi o hay dos restos cargados presentes que tienen una carga complementaria (de tal forma que la carga neta es cero).
La longitud de la secuencia agregante estará normalmente influenciada por la especificidad deseada, la facilidad de síntesis y la secuencia de la proteína de interés. La presente memoria descriptiva describe que al menos uno y en particular todos los Yi pueden ser una serie de 4 a 17 aminoácidos, de 4 a 16 aminoácidos, de 4 a 15 aminoácidos, de 4 a 14 aminoácidos, de 4 a 13 aminoácidos, particularmente de 4 a 11 aminoácidos, de 4 a 10 aminoácidos, de 4 a 9 aminoácidos o de 4 a 8 aminoácidos. La presente memoria descriptiva describe que la longitud de la serie Yi puede ser de al menos 5 aminoácidos. Por consiguiente, al menos uno y particularmente todos los Yi pueden ser una serie de 5 a 13 aminoácidos, particularmente de 5 a 11 aminoácidos, de 5 a 10 aminoácidos, de 5 a 9 aminoácidos o de 5 a 8 aminoácidos. De acuerdo con realizaciones específicas adicionales, la longitud de la serie Yi es de al menos 6 aminoácidos. Por consiguiente, al menos uno y particularmente todos los Yi son una serie de 6 a 13 aminoácidos, particularmente de 6 a 11 aminoácidos, de 6 a 10 aminoácidos, de 6 a 9 aminoácidos o de 6 a 8 aminoácidos. Más particularmente, al menos uno y particularmente todos los Yi son series de 6 o 7 aminoácidos. Se prevén particularmente dichas series más cortas que de 16 aminoácidos en realizaciones donde n es 1.
Obsérvese que son posibles series más largas de 16 aminoácidos (por ejemplo, hasta 20 aminoácidos), pero apenas aportan especificidad de cara a una proteína de interés (véase la figura 2) mientras que aumentan la dificultad y el coste de la síntesis, así como reducen la solubilidad de las moléculas. Otro motivo por el que se prevén particularmente en el presente documento moléculas donde n es 1 o 2 es su facilidad de síntesis y manipulación. Sin embargo, para estrategias transgénicas o cuando las moléculas se producen de manera recombinante, la longitud apenas es un factor limitante (del coste) y en particular en estas estrategias, también se prevé que funcione con moléculas más largas.
Un objetivo es proporcionar moléculas que sean capaces de regular a la baja de manera específica a proteínas, en particular, de una manera específica de secuencia. La presente memoria descriptiva describe que al menos uno de los Yi en la molécula es una serie de 4 a 16 aminoácidos o de acuerdo con aspectos o realizaciones de la invención, una serie de 6 a 16 aminoácidos, que es idéntica a una serie contigua de origen natural en una proteína. De acuerdo con aspectos específicos adicionales, esta es la causa para más de un Yi en la molécula, en particular, para dos Yi o al menos dos Yi en la molécula, lo más particularmente, para todos los Yi en la molécula. Las diferentes longitudes previstas también se aplican a esta realización.
Esto se basa en la sorprendente observación de que la beta agregación no amiloide es específica de secuencia. De hecho, generalmente se aceptó que ya que, a diferencia de la agregación de amiloide, puede acomodarse prácticamente cualquier resto en cualquier posición para que se produzca la agregación p, en tanto que la secuencia en conjunto tenga propensión a encontrarse en una conformación p extendida y es lo suficientemente hidrófoba y/o neutra en cuanto a la carga, la agregación beta no fue específica de secuencia, sino que dependió de interacciones hidrófobas y de enlace de H. Sorprendentemente, la tendencia a la agregación para una secuencia dada es mucho mayor con una serie de secuencia idéntica que con otra secuencia hidrófoba, hasta el punto que puede usarse para la agregación específica (inhibición y/o detección) de proteínas en mezclas complejas.
La presente memoria descriptiva describe que la al menos una serie de 4 a 16 aminoácidos contiguos o de acuerdo con aspectos o realizaciones de la invención, la al menos una serie de 6 a 16 aminoácidos contiguos, de origen natural en una proteína es única para dicha proteína en el organismo (o especie) en cuyo genoma se codifica la proteína. En otras palabras, la secuencia corresponde o es idéntica a solo una secuencia de proteína distinta en el proteoma de dicho organismo/especie. El resultado es que, en caso de que se administre dicha molécula a un organismo de dicha especie, solo se regulará a la baja esa proteína.
De acuerdo con realizaciones alternativas, la secuencia no es necesariamente única para la proteína, sino que es única para el organismo o especie. Esto puede preverse cuando las moléculas descritas en el presente documento se administren a más de una especie diferente de manera simultánea (por ejemplo, una mezcla de microorganismos), mientras que solo se necesita regular a la baja una especie de proteína (por ejemplo, para una especie patógena diana, mientras que no se interfiere con organismos beneficiosos). De acuerdo con realizaciones particulares adicionales, la secuencia es única para la proteína y única para el organismo/especie.
En lugar de especie, las consideraciones anteriores también se aplican a un género, una familia, un orden o una clase de organismos, aunque la probabilidad de conservación de secuencia y de hallar una secuencia única, se reduce a medida que aumenta la clasificación taxonómica.
La presente memoria descriptiva describe que la al menos una serie de 4 a 16 aminoácidos contiguos o de acuerdo
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con aspectos o realizaciones de la invención, la al menos una serie de 6 a 16 aminoácidos contiguos, de origen natural en una proteína está presente en más de una proteína del organismo o especie en cuyo genoma se codifica dicha proteína. Es decir, la secuencia corresponde o es idéntica a más de una secuencia de proteína distinta en el proteoma de dicho organismo/especie. Esto permite que se regule a la baja más de una proteína. Otra alternativa más (no excluyente) es que la serie de secuencia esté presente en una proteína de más de un organismo/especie. Por lo tanto, la secuencia corresponde o es idéntica a al menos una secuencia de proteína diferente en el proteoma de al menos dos organismos/especies diferentes. Esto permite la regulación a la baja de una proteína en más de un organismo. Esto puede ser útil para la reactividad cruzada (por ejemplo, para permitir el uso de una molécula en sujetos de especies diferentes). Sin embargo, también se prevé de manera particular la regulación a la bajasimultánea de proteínas en organismos (en particular, infecciosos) mientras que se administra solo una molécula a un sujeto. Evidentemente, también se prevén combinaciones de ambos, es decir, la serie está presente en más de una proteína y en más de un organismo/especie. Asimismo, en este caso, la especie puede reemplazarse por un género, familia, orden o clase de organismos.
Cabe destacar que el uso como diana de más de una proteína o de más de un organismo/especie también puede lograrse usando moléculas con al menos dos regiones Yi, en donde al menos una de las regiones Yi corresponde a una serie en al menos dos proteínas diferentes y/o a una serie en al menos dos organismos/especies/etc. diferentes. Las al menos dos regiones Yi pueden ser (cada una independientemente) únicas para una proteína u organismo o pueden aparecer en más de una proteína u organismo.
Típicamente, la serie Yi que es idéntica a una serie de origen natural en una proteína será completamente idéntica a la de la proteína. Sin embargo, en algunos casos, se prevé que puedan usarse secuencias no idénticas, pero estrechamente relacionadas, es decir, secuencias que tienen una o dos sustituciones. A fin de mantener la especificidad, se prevé que para las sustituciones no conservativas, para las series Yi de menos de 6 aminoácidos, solo se tolere una diferencia de aminoácidos. Para secuencias de al menos 6 aminoácidos (en particular, al menos 7 o al menos 8 aminoácidos), pueden sustituirse uno o dos aminoácidos. Por lo tanto, la presente memoria descriptiva describe que al menos una Yi difiere en no más de una sustitución de aminoácidos respecto de una serie en una proteína de origen natural si la longitud de esa Yi es menor de 6 aminoácidos o al menos una Yi difiere en una o dos sustituciones de aminoácidos respecto de una serie en una proteína de origen natural si la longitud de esa Yi es de al menos 6 aminoácidos. De acuerdo con aspectos o realizaciones de la invención, al menos una Yi es una serie idéntica a o que difiere en no más de una sustitución de aminoácidos respecto de una serie contigua de aminoácidos que aparece en una proteína de interés. En dichos casos, las sustituciones son normalmente en comparación con la serie presente en la proteína de interés (es decir, la serie Yi es idéntica a la serie presente en la proteína de interés salvo por una sustitución de aminoácidos (o dos). Tal como será evidente para un experto en la materia, la realización de una sustitución (en particular, no conservativa) puede dar como resultado una especificidad alterada (es decir, hacer idéntica la serie a una de otra proteína en el organismo), por lo que debe comprobarse si esto sucede en caso de que no se desee un direccionamiento alterado. (En algunos casos, puede ser deseable dirigirse de manera específica a más de una proteína, véase también más adelante). Para asegurarse de que la sustitución no da como resultado una pérdida de especificidad demasiado elevada, la sustitución preferentemente se efectúa únicamente en una o dos de las regiones Yi. De acuerdo con realizaciones específicas, en caso de que esté presente una región Yi con un aminoácido sustituido, hay presente al menos una región Yi diferente en donde no se han producido sustituciones.
De acuerdo con realizaciones particulares, la sustitución es con un resto constitutivo, en particular, con uno seleccionado de entre R, K, E, D, P, N, S, A, H, G, Q, más particularmente seleccionado de entre R, K, E, D y P, lo más particularmente seleccionado de entre restos de R, K y P.
De acuerdo con realizaciones alternativas, la sustitución es una sustitución conservativa. Esto se prevé cuando se prevé regular a la baja una familia de proteínas y las proteínas comparten un motivo de secuencia conservado, pero no idéntico. En dichos casos, puede lograrse la agregación de estas proteínas estrechamente relacionadas usando un motivo de secuencia consenso (es decir, una secuencia similar pero ni idéntica, donde "similar" se usa en el contexto del alineamiento de secuencias). Sin embargo, es posible que la agregación sea menos eficaz cuando la coincidencia de secuencias no sea del 100%.
De acuerdo con otras realizaciones alternativas adicionales, la sustitución es sustitución de un resto con una propensión a formar beta láminas relativamente baja por un resto con una mayor propensión a formar beta láminas; para potenciar la agregación. Típicamente, puede reemplazarse un resto con una puntuación P(b-lámina) de Chou- Fasman menor de 100 por un resto con una puntuación P(b-lámina) > 100.
Cabe destacar que, la sustitución es siempre con el mismo número de restos, las eliminaciones o inserciones anularán la beta-agregación específica.
De acuerdo con realizaciones específicas, n es mayor de uno (es decir, de dos a cinco), lo que significa que hay más de una región Yi presente en la molécula (al menos dos y hasta cinco). Para una proteína diana, solo es necesario que esté presente en la molécula una región Yi idéntica a una serie en esa proteína. Además, las regiones Yi pueden ser, por ejemplo, secuencias inductoras de la beta-agregación sintéticas. Sin embargo, normalmente, la presente
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memoria descriptiva describe que para detectar o regular a la baja proteínas, cuando n es mayor de uno, al menos dos y particularmente cada uno de las Yi son una serie de 4 a 16 o de acuerdo con aspectos o realizaciones de la invención, una serie de 6 a 16 aminoácidos contiguos de origen natural en una proteína. (De manera independiente, para cada serie, se aplican las consideraciones anteriores). De acuerdo con realizaciones particulares adicionales, las al menos dos Yi aparecen en la misma proteína. Esto aumenta la probabilidad de provocar la agregación de la proteína. De acuerdo con realizaciones particulares adicionales, dichas al menos dos Yi son parcialmente solapantes. Este puede ser el caso cuando la proteína de interés tiene una serie larga que cumple los criterios para la región Yi de la molécula. En este caso, una Yi de la molécula puede corresponder a una parte de la serie en la proteína, mientras que otra Yi corresponde a otra parte parcialmente solapante de la misma serie. De acuerdo con otras realizaciones particulares adicionales, las al menos dos Yi son idénticas. Por lo tanto, cuando dos regiones Yi corresponden a series en la misma proteína, pueden ser iguales o diferentes.
En realizaciones alternativas, sin embargo, se prevé que puedan usarse al menos dos Yi para lograr el direccionamiento a más de una proteína. Por lo tanto, en estas realizaciones, las al menos dos Yi proceden de (al menos dos) proteínas diferentes, es decir, a lo largo de su longitud, la secuencia de las al menos dos Yi corresponde o es idéntica a al menos dos secuencias de proteína diferentes. El número de proteínas puede ser tan alto como el número de regiones Yi, pero obviamente, también es posible usar, por ejemplo, 4 regiones Yi para dirigirse de manera específica a dos proteínas diferentes.
De manera similar, de acuerdo con realizaciones alternativas, pueden usarse las al menos dos Yi para lograr el direccionamiento a más de un organismo/especie. Por lo tanto, en estas realizaciones, las al menos dos Yi proceden de (al menos dos) organismos/especies diferentes, es decir, la secuencia de las al menos dos Yi corresponde o es idéntica a al menos una secuencia de proteína diferente en el proteoma de al menos dos organismos/especies diferentes. Asimismo, en este caso, la especie puede reemplazarse por un género, familia, orden o clase de organismos.
Tal como se ha mencionado anteriormente, las secuencias p agregantes son menos tolerantes a la presencia de restos polares y cargados de manera particular que las secuencias amilogénicas. Por consiguiente, en realizaciones específicas, la carga total de al menos una Yi, en particular de al menos dos Yi, más particularmente de cada Yi no es mayor de 1. De acuerdo con realizaciones específicas adicionales, el número de restos cargados en al menos una Yi, en particular de al menos dos Yi, más particularmente de cada Yi no es mayor de 1. Sin embargo, más particularmente, el número de restos cargados o de prolinas en un resto Yi es cero.
Tal como se ha indicado en la fórmula anterior, las moléculas descritas en el presente documento también contienen restos enlazadores, Zi. De acuerdo con realizaciones particulares, las moléculas solo contienen enlazadores internos y ningún enlazador N o C-terminal. Por lo tanto, en realizaciones específicas, Zn es nada (o es un enlazador de cero unidades enlazadoras).
La naturaleza de los restos enlazadores no es vital para la invención, aunque preferentemente no se usan enlazadores flexibles. De acuerdo con realizaciones particulares, cada Zi se selecciona independientemente de entre una serie de de entre 0 y 20 unidades idénticas o no idénticas, en donde una unidad es un aminoácido, un monosacárido, un nucleótido o un monómero. Las unidades no idénticas pueden ser unidades no idénticas de la misma naturaleza (por ejemplo, aminoácidos diferentes o algunos copolímeros). También pueden ser unidades no idénticas de una naturaleza diferente, por ejemplo, un enlazador con unidades de aminoácidos y nucleótidos o un heteropolímero (copolímero) que comprende dos o más especies monoméricas diferentes. De acuerdo con realizaciones particulares, la longitud de al menos uno y particularmente cada uno de Zi distinto de Zn, es de al menos 1 unidad. De acuerdo con otras realizaciones particulares, Zn es 0 unidades. De acuerdo con realizaciones particulares, todos los enlazadores Zi distintos de Zn son idénticos. De acuerdo con realizaciones adicionales, todos los restos Zi son idénticos.
De acuerdo con realizaciones específicas, al menos uno y particularmente todos los Zi tienen entre 0 y 10 unidades de la misma naturaleza, en particular, entre 0 y 5 unidades de la misma naturaleza. De acuerdo con realizaciones particulares, al menos un resto Zi y en particular, todos los restos Zi a excepción de Zn, es un enlazador peptídico o polipeptídico. Algunas secuencias particularmente previstas de dichos enlazadores incluyen, pero sin limitación, PPP, PP o GS. El enlazador también puede ser de naturaleza química. Algunos enlazadores particularmente previstos incluyen PEG y Ttds (también conocido como ácido 4,7,10-trioxadecan-13-succinámico).
Típicamente, no se usan enlazadores largos. Sin embargo, de acuerdo con las realizaciones particulares donde los restos Yi corresponden a regiones inductoras de la agregación de más de una proteína, se prevé que puedan usarse enlazadores largos. De hecho, para asegurarse de que la molécula pueda interactuar (por ejemplo, simultáneamente) con más de una proteína, puede ser beneficioso aumentar la distancia entre los diferentes restos Yi de direccionamiento, de tal forma que no se previene la interacción causada por impedancia estérica. En estos casos, el enlazador Zi puede ser una serie de entre 0 y 100 unidades idénticas o no idénticas, en donde una unidad es un aminoácido, un monosacárido, un nucleótido o un monómero; o de entre 0 y 90, 0 y 80, 0 y 70, 0 y 60, 0 y 50, 0 y 40, 0 y 30 o 0 y 20. En particular, la longitud mínima del enlazador Zi es de al menos 1 unidad, al menos 2 unidades, al menos 3 unidades, al menos 4 unidades o al menos 5 unidades.
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En el caso de que los restos Yi sean idénticos a regiones agregantes de dos proteínas diferentes, las moléculas se denominan biespecíficas (para tres proteínas, triespecíficas, y así sucesivamente).
De acuerdo con realizaciones específicas, la longitud total de las moléculas descritas en el presente documento no supera los 60, 55 o 50 aminoácidos. Más particularmente, la longitud no supera los 40 aminoácidos, 30 aminoácidos, 25 aminoácidos o 20 aminoácidos.
Las moléculas particularmente previstas son aquellas donde n=1 o n=2, por ejemplo, aquellas con la siguiente estructura: X1-Y1-X2-Z1 (es decir, n es 1), en donde X1 y X2 tienen en total no más de 5 aminoácidos; Y1 es una serie de entre 4 y 10 aminoácidos y Z1 es una serie de 0 unidades; y X1-Y1-X2-Z1-X3-Y2-X4-Z2 (es decir, n es 2), en donde Z1 es un enlazador y Z2 es nada.
La molécula puede comprender además (o puede estar además fusionada a) otros restos. Se prevé particularmente que la molécula comprende además un marcador detectable. El marcador detectable puede encontrarse en N o C- terminal o incluso puede estar fusionado a la molécula (por ejemplo, a través del enlazador o el enlazador puede usarse como marcador detectable). Como alternativa, el marcador detectable puede referirse al uso de uno o más aminoácidos marcados en uno o más de los restos X-Y-Z de la molécula (por ejemplo, aminoácidos marcados fluorescente o radiactivamente).
Ya que los restos Yi idénticos a una región en una proteína pueden dirigirse de manera específica a la proteína (a condición de que la secuencia sea única parala proteína en el organismo en cuyo genoma se codifica dicha proteína), otro resto que puede unirse a las moléculas es una molécula pequeña o un fármaco, de tal forma que esta molécula pequeña o fármaco puede dirigirse a la proteína, compartimento celular, tipo celular, etc. correcto donde es necesario que se suministre. En estos casos, al menos una de las regiones Yi será idéntica a una secuencia de una proteína que está presente, donde es necesario suministrar el fármaco o la molécula pequeña.
Otro resto que puede unirse a la molécula es un resto que aumenta la solubilidad de la molécula. Dichos restos se conocen bien en la técnica y algunos ejemplos incluyen, pero sin limitación, PEG (polietilenglicol) o derivados de PEG, un péptido, una proteína o un dominio de proteína. La naturaleza del resto dependerá de la aplicación, tal como puede determinarse por la persona experta.
Obsérvese que, para realizaciones donde está presente Zn, el marcador detectable (u otro resto, tal como un marcador de solubilización) puede fusionarse al resto enlazador Zn. (Aunque esta notación implicaría que el marcador se añada al extremo C-terminal, también se prevén marcadores N-terminales - esto corresponde a la notación equivalente de (Z¡-X2i-1 -Yi-X2¡)n, en donde cada Z2 a Zn es un enlazador y Z1 es el enlazador al que se fusiona el marcador).
En estos casos donde se fusionan otros restos a las moléculas, se prevé en realizaciones particulares que estos restos pueden eliminarse de la molécula. Típicamente, esto se efectuará incorporando un sitio de escisión de proteasas específico o una estrategia equivalente. El sitio de escisión puede incorporarse por separado o puede ser una parte integral del enlazador Zn externo (o un enlazador Z1 externo en caso de que el resto sea N-terminal). De acuerdo con realizaciones muy específicas, el resto puede formar parte de un enlazador Zi interno o puede ser incluso el enlazador Zi completo.
En muchas aplicaciones típicas, las moléculas interferidoras descritas en el presente documento pueden usarse o añadirse tal cual. Sin embargo, de acuerdo con un aspecto muy particular, se prevé que estas moléculas se proporcionen en forma de ácidos nucleicos que codifican las moléculas. Huelga decir que las moléculas interferidoras de acuerdo con estas realizaciones son de naturaleza completamente polipeptídica, ya que es necesario que puedan codificarse. Es decir, todos los restos X, Y y Z presentes en las moléculas interferidoras son de naturaleza polipeptídica.
Por lo tanto, la presente memoria descriptiva también describe una molécula de ácido nucleico que codifica (o cuya secuencia codifica) una molécula que tiene la estructura descrita anteriormente, en particular, la siguiente estructura: (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, en donde n es un número entero de 1 a 5 e i aumenta de 1 a n con cada repetición; y en donde
- cada uno de X2i-1 y X2¡ se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P; lo más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, D y P;
- cada Y¡ se selecciona independientemente de entre una serie de 4 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que está presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E; y
- cada Z¡ es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada.
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Se prevé particularmente que las secuencias de ácido nucleico codifiquen las moléculas con todas las limitaciónes y variaciones descritas en el presente documento, mutatis mutandis. Por lo tanto, el polipéptido codificado es esencialmente como se ha descrito en el presente documento, es decir, las variaciones mencionadas para las moléculas interferidoras que sean compatibles con este aspecto también se prevén como variaciones para los polipéptidos codificados por las secuencias de ácido nucleico. A modo de ejemplo, las realizaciones que especifican la secuencia o la longitud de los restos X o Y son compatibles con estar codificadas en ácidos nucleicos, las realizaciones en donde el resto Z es de naturaleza no aminoacídica no lo son.
De acuerdo con realizaciones específicas, la secuencia de polipéptido codificada es un polipéptido de origen no natural. De acuerdo con realizaciones particulares adicionales, la molécula de ácido nucleico es un gen artificial. Ya que el aspecto del ácido nucleico es particularmente adecuado en aplicaciones que emplean expresión transgénica, las realizaciones particularmente previstas son aquellas donde la molécula de ácido nucleico (o el gen artificial) se fusiona a otro resto, en particular, a ácidos nucleicos adicionales que codifican un resto que aumenta la solubilidad y/o la estabilidad del producto génico. De hecho, en ocasiones, la expresión transgénica de péptidos puede ser difícil, debido a la rápida degradación del producto.
La presente memoria descriptiva también describe vectores recombinantes que comprenden dicha molécula de ácido nucleico que codifica (o con una secuencia que codifica) una molécula como se ha descrito en el presente documento. Estos vectores recombinantes son idealmente adecuados como vehículos para portar la secuencia de ácido nucleico de interés al interior de una célula donde se expresa la proteína que se vaya a regular a la baja y dirigir la expresión del ácido nucleico en dicha célula. El vector recombinante puede permanecer en forma de una entidad separada en la célula (por ejemplo, en forma de un plásmido o un portador vírico o no vírico) o puede integrarse en el genoma de la célula.
Por consiguiente, la presente memoria descriptiva también describe células que comprenden una molécula de ácido nucleico que codifica (o con una secuencia que codifica) una molécula como se ha descrito en el presente documento o que comprenden un vector recombinante que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica dicha molécula interferidora. La célula puede ser una célula procariota o eucariota. En este último caso, puede ser una célula de levadura, alga, vegetal o animal (por ejemplo, una célula de insecto, mamífero o humana). La célula puede proporcionarse en forma de una línea celular.
Sin embargo, la célula también puede formar parte de un organismo (o ser, por ejemplo, una célula madre). Por consiguiente, la presente memoria descriptiva también describe organismos transgénicos no humanos que comprenden una molécula de ácido nucleico que codifica (o con una secuencia que codifica) una molécula como se ha descrito en el presente documento o que comprenden un vector recombinante que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica dicha molécula interferidora. El organismo puede ser cualquier organismo (incluyendo un microorganismo). Se prevé particularmente que el organismo transgénico sea un organismo mamífero no humano. De acuerdo con otras realizaciones alternativas más, la estrategia transgénica se usa en animales no humanos, por ejemplo, para la validación de la diana en modelos animales de enfermedad. Esto puede ser en mamíferos (por ejemplo, ratones transgénicos) u otros vertebrados o incluso en animales invertebrados, por ejemplo, nematodos (tales como C. elegans) o moscas de la fruta (tales como D. melanogaster).
De acuerdo con realizaciones particulares alternativas, la estrategia transgénica (es decir, proporcionar las moléculas interferidoras codificadas en ácido nucleico en lugar de directamente en forma de polipéptidos) es particularmente adecuada para su uso en plantas. Por consiguiente, la presente memoria descriptiva también describe plantas o células vegetales o semilla de plantas que contienen una molécula de ácido nucleico, un gen artificial o un vector recombinante como se ha descrito en el presente documento. O las células u organismos transgénicos proporcionados en el presente documento son plantas, células vegetales o semillas de plantas.
De acuerdo con un aspecto adicional, las moléculas descritas en el presente documento pueden usarse para regular a la baja o inhibir la función de una proteína. Típicamente, esto se logra induciendo la agregación de dicha proteína. La presente memoria descriptiva describe métodos para regular a la baja la función de una proteína que comprenden poner en contacto dicha proteína con una molécula de la siguiente estructura: (X2i-1 -Yi-X2i-Zi)n, en donde:
- n es un número entero de 1 a 5 e i aumenta de 1 a n con cada repetición;
- cada uno de X2i-1 y X2i se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P; lo más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, D y P;
- cada Yi se selecciona independientemente de entre una serie de 4 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos
un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de
que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que esté presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E y en donde al menos un Yi es una serie de origen natural en una proteína; y
- cada Zi es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada.
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En particular, para las moléculas donde n es 1, podrían aplicarse limitaciónes adicionales. Por ejemplo, X1 y X2 pueden ser cada uno 1 o 2 aminoácidos en lugar de 1 a 4. X1 y X2 también pueden seleccionarse de entre P, R, K, D, E. La longitud del resto Y1 puede adaptarse.
No es necesario que ninguna de estas limitaciónes den como resultado la regulación a la baja de moléculas, pero describen realizaciones que funcionan particularmente bien. Una limitación particular que también se prevé para métodos para regular a la baja la proteína donde n es 1, es que Y1 es una serie de 4 a 11 aminoácidos contiguos. Otra limitación particular (que, al igual que la mayoría de limitaciónes en el presente documento, puede combinarse) es que Z1 no sea un enlazador de aminoácidos. De acuerdo con otras realizaciones particulares adicionales más, Z1 es nada (es decir, un enlazador de 0 unidades).
Para las moléculas, se aplican las mismas consideraciones y limitaciónes anteriores. En particular, cabe destacar que, en tanto que se logre la regulación a la baja de la función, pueden tolerarse una o dos sustituciones en la Yi que se produce en la proteína, tal como se ha descrito anteriormente.
De acuerdo con realizaciones particulares adicionales, estos métodos se proporcionan para regular a la baja una proteína en una situación de enfermedad o para efectuar un diagnóstico. La memoria descriptiva describe una molécula de la siguiente estructura: (X2i-1-Y¡-X2i-Zi)n, en donde:
- n es 1 a 5 e i va de 1 a n (o i aumenta de 1 a n con cada repetición);
- cada uno de X2Í-1 y X2¡ se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P; lo más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, D y P;
- cada Y¡ se selecciona independientemente de entre una serie de 4 a 15 aminoácidos contiguos, siendo al menos
un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de
que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que esté presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E y en donde al menos un Y¡ es una serie de origen natural en una proteína; y
- cada Z¡ es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada;
para su uso como medicamento o en diagnósticos.
Asimismo, en este caso, se prevé particularmente que si n es 1, Y1 es una serie de 4 a 11 aminoácidos contiguos. Además, si n es 1, se prevé particularmente que Z1 no sea un enlazador de aminoácidos. De acuerdo con realizaciones adicionales, Z1 es nada.
Tal como se usa en el presente documento, los métodos y usos son a menudo intercambiables, es decir, una molécula para su uso como medicamento o más particularmente, una molécula para su uso en el tratamiento de una enfermedad específica equivale a un método para tratar la enfermedad que comprende el uso de (por ejemplo, la puesta en contacto con) la molécula, es equivalente al uso de las moléculas para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la enfermedad. Por lo tanto, las reivindicaciones de "segundo uso médico", las reivindicaciones de "método de tratamiento" y las denominadas reivindicaciones de "estilo suizo" se usan de manera indistinta en el presente documento y cuando se lista una de estas, también se infieren las otras.
Ya que las moléculas se proporcionan para su uso como medicamento o en diagnósticos o en métodos de tratamiento o de diagnóstico, también se prevé que puedan proporcionarse en forma de agentes farmacéuticos. Por consiguiente, la presente memoria descriptiva describe composiciones farmacéuticas que comprenden las moléculas descritas en el presente documento. En particular, las composiciones farmacéuticas comprenden al menos una molécula que tiene la siguiente estructura:
(X2i-1-Y¡-X2i-Z¡)n, en donde n es un número entero de 1 a 5 e i aumenta de 1 a n con cada repetición; y en donde
- cada uno de X2Í-1 y X2¡ se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P; lo más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, D y P;
- cada Y¡ se selecciona independientemente de entre una serie de 4 a 15 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que está presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E; y
- cada Z¡ es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada; y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Más particularmente, se describen composiciones farmacéuticas que comprenden al menos una molécula que tiene la siguiente estructura: (X2Í-1 -Y¡-X2¡-Z¡)n, en donde n es un número entero de 1 a 5 e i aumenta de 1 a n con cada repetición; y en donde
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- cada uno de X2Í-1 y X2i se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P; lo más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, D y P;
- cada Yi se selecciona independientemente de entre una serie de 4 a 15 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que está presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E; en donde al menos una Yi es una serie de 4 a 15 aminoácidos contiguos de origen natural en una proteína; y
- cada Zi es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada; y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Más particularmente, en las composiciones farmacéuticas, al menos una Yi de las moléculas está presente en una proteína que se vaya a regular a la baja en el sujeto al que se administrará la composición. Obsérvese que esto no implica que esta proteína esté codificada en el genoma de dicho sujeto. De hecho, para sujetos que padecen una infección, se prevé que se administren moléculas que se dirijan específicamente a proteínas del organismo infeccioso y no del sujeto en sí.
De acuerdo con realizaciones particulares, la molécula puede proporcionarse en forma liofilizada con un tampón fisiológico. De acuerdo con realizaciones particulares, las composiciones farmacéuticas, en caso de ser líquidas, se proporcionan a pH fisiológico, en particular entre pH 5 y 9, más en particular entre pH 6 y pH 8.
En realizaciones específicas, las moléculas pueden usarse para regular a la baja una proteína (una o más) que necesita ser regulada a la baja en una situación de enfermedad.
Por consiguiente, la presente memoria descriptiva describe moléculas de la estructura (X2i-1 -Y¡-X2i-Zi)n para su uso en el tratamiento o la prevención de una enfermedad, en donde:
- n es 1 a 5 e i va de 1 a n (o i aumenta de 1 a n con cada repetición);
- cada uno de X2Í-1 y X2¡ se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de
entre : R, K, E, D, P, N, S, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P; lo más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, D y P;
- cada Y¡ se selecciona independientemente de entre una serie de 4 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos
un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de
que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que esté presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E y en donde al menos un Y¡ es una serie de origen natural en una proteína cuya expresión o sobreexpresión se asocia con la enfermedad; y
- cada Z¡ es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada.
Tal como se ha mencionado anteriormente, las moléculas descritas para su uso en el tratamiento o la prevención de una enfermedad es equivalente a decir que se describen métodos para tratar o prevenir enfermedades en un sujeto que lo necesite, que comprenden: administrar al sujeto una molécula que tiene la estructura (X2¡-1-Y¡-X2¡-Z¡)n, en donde:
- n es 1 a 5 e i va de 1 a n (o i aumenta de 1 a n con cada repetición);
- cada uno de X2Í-1 y X2¡ se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P; lo más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, D y P;
- cada Y¡ se selecciona independientemente de entre una serie de 4 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que esté presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E y en donde al menos un Y¡ es una serie de origen natural en una proteína cuya expresión o sobreexpresión se asocia con la enfermedad; y
- cada Z¡ es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada.
Otra forma equivalente de exponer esto es que se proporcionan usos de moléculas que tienen esta estructura para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad.
El sujeto es, en particular, un animal, más particularmente un mamífero (por ejemplo, gato, perro, conejo, caballo, vaca, cerdo, oveja, cabra, llama, ratón, rata, mono, otro primate, etc.), más en particular, un ser humano.
Las enfermedades particularmente previstas incluyen, pero sin limitación, cáncer, degeneración macular asociada a la edad (AMD) e inflamación. Por lo tanto, las moléculas pueden proporcionarse para el tratamiento de estas
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enfermedades (o se proporcionan métodos para tratar estas enfermedades; o usos de moléculas para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de estas enfermedades), en donde al menos una Yi es una serie de origen natural en una proteína cuya expresión o sobreexpresión está asociada con el cáncer, la AMD o la inflamación/una enfermedad inflamatoria, respectivamente.
Más particularmente, la proteína que se va a regular a la baja en el cáncer es VEGFR-2 o EGFR. También más particularmente, la proteína que se va a regular a la baja en la AMD es VEGFR-2. Las proteínas más particularmente previstas para su regulación a la baja en las enfermedades inflamatorias incluyen TNF-a e IL-1p.
De acuerdo con un aspecto adicional, las moléculas se usan como medicamento en enfermedades infecciosas. Es decir, se usan para regular a la baja la función de proteínas en organismos que causan infecciones en un sujeto, siendo dichos organismos virus, bacterias, hongos o macroparásitos, tales como garrapatas, ácaros, nematodos, platelmintos, etc. La presente memoria descriptiva describe moléculas de la siguiente estructura: (X2¡-i-Yi-X2¡-Zi)n, en donde:
- n es 1 a 5 e i aumenta de 1 a n con cada repetición;
- cada uno de X2¡-i y X2¡ se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, A, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P;
- cada Y¡ se selecciona independientemente de entre una serie de 4 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que esté presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E y en donde al menos un Y¡ es una serie de origen natural en una proteína de un organismo patógeno; y
- cada Z¡ es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada; para su uso como un compuesto contra patógenos.
Esto equivale a decir que se describen métodos para prevenir o tratar una infección patógena en un sujeto que lo necesite, que comprenden:
administrar al sujeto una molécula que tiene la siguiente estructura: (X2¡-1 - Y¡-X2¡-Z¡)n, en donde:
- n es 1 a 5 e i va de 1 a n;
- cada uno de X2Í-1 y X2¡ se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, A, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P;
- cada Y¡ se selecciona independientemente de entre una serie de 4 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que esté presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E y en donde al menos un Y¡ es una serie de origen natural en una proteína de un organismo patógeno; y
- cada Z¡ es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada.
Otra forma equivalente de exponer esto es que se proporcionan usos de moléculas que tienen esta estructura para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una infección por un organismo patógeno.
De acuerdo con realizaciones muy específicas, la región Y¡ puede contener exactamente 2 restos cargados (seleccionados de entre R, K, D, E), en tanto que la carga neta de la región Y¡ sea cero. Sin embargo, más particularmente, la región Yi no contiene ningún resto cargado (o para esa materia, prolina).
Los patógenos pueden ser organismos víricos. Por consiguiente, la memoria descriptiva describe moléculas de la siguiente estructura: (X2¡-1 -Y¡-X2¡-Z¡)n, en donde:
- n es 1 a 5 e i aumenta de 1 a n con cada repetición;
- cada uno de X2Í-1 y X2¡ se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, A, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P;
- cada Y¡ se selecciona independientemente de entre una serie de 4 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que esté presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E y en donde al menos un Y¡ es una serie de origen natural en una proteína de un organismo vírico; y
- cada Z¡ es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada;
para su uso como antivírico.
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Esto equivale a decir que se describen métodos para prevenir o tratar una infección vírica en un sujeto que lo necesite, que comprenden:
administrar al sujeto una molécula que tiene la siguiente estructura: (X2i-1 - Y¡-X2í-Zí)n, en donde:
- n es 1 a 5 e i va de 1 a n;
- cada uno de X2¡-i y X2¡ se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, A, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P;
- cada Y¡ se selecciona independientemente de entre una serie de 4 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que esté presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E y en donde al menos un Y¡ es una serie de origen natural en una proteína de un organismo vírico; y
- cada Z¡ es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada.
Otra forma equivalente de exponer esto es que se proporcionan usos de moléculas que tienen esta estructura para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una infección por un organismo vírico.
En particular, las moléculas se usan como agentes antimicrobianos. Por lo tanto, la memoria descriptiva describe moléculas de la siguiente estructura: (X2¡-1 - Y¡-X2¡-Z¡)n, en donde:
- n es 1 a 5 e i va de 1 a n (o i aumenta de 1 a n con cada repetición);
- cada uno de X2¡-1 y X2¡ se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, A, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P;
- cada Y¡ se selecciona independientemente de entre una serie de 4 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que esté presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E y en donde al menos un Y¡ es una serie de origen natural en una proteína de un organismo microbiano; y
- cada Z¡ es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada; para su uso como antimicrobiano.
Esto equivale a decir que se describen métodos para prevenir o tratar una infección microbiana en un sujeto que lo necesite, que comprenden:
administrar al sujeto una molécula que tiene la siguiente estructura: (X2¡-1 - Y¡-X2¡-Z¡)n, en donde:
- n es 1 a 5 e i va de 1 a n;
- cada uno de X2¡-1 y X2¡ se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, A, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P;
- cada Y¡ se selecciona independientemente de entre una serie de 4 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que esté presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E y en donde al menos un Y¡ es una serie de origen natural en una proteína de un organismo microbiano; y
- cada Z¡ es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada.
Otra forma equivalente de exponer esto es que se proporcionan usos de moléculas que tienen esta estructura para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una infección por un organismo microbiano.
Algunas etapas adicionales de estos métodos pueden incluir la evaluación (o la medición) de la presencia del organismo patógeno, vírico o microbiano.
De acuerdo con realizaciones particulares donde el patógeno es un organismo microbiano, la proteína de un organismo microbiano es una proteína de un organismo microbiano seleccionado de entre bacterias grampositivas, bacterias gramnegativas, micobacterias, protozoos, arqueas, hongos (tales como levaduras y mohos). Más particularmente, es una proteína de bacterias grampositivas, bacterias gramnegativas, micobacterias y hongos.
De acuerdo con realizaciones particulares, el organismo patógeno es un organismo, cepa o variante resistente a fármacos. Por lo tanto, la proteína del organismo patógeno es una proteína de un organismo, cepa o variante resistente a fármacos. La administración de moléculas dirigidas a estos organismos seguirá teniendo efecto en estos
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organismos, tal como se muestra en la sección de ejemplos.
Un ejemplo particular de resistencia a fármacos es la resistencia a los antibióticos. De acuerdo con realizaciones particulares, la proteína de un organismo microbiano es una proteína de un organismo, cepa o variante resistente a los antibióticos. La administración de moléculas dirigidas a estos organismos seguirá teniendo efecto en estos organismos, tal como se muestra en la sección de ejemplos. Más particularmente, se proporcionan métodos de administración, en donde se administran las moléculas como se describen en el presente documento al menos una vez al día durante al menos diez días. En particular, este régimen de tratamiento no va acompañado del desarrollo de resistencia a antibióticos. Por lo tanto, estas realizaciones prevén que los valores de CIM a lo largo de este intervalo en el tiempo no aumentan más de cuatro veces o no se duplican. Más particularmente, se prevé que, durante una administración prolongada, el valor de CIM de la molécula interferidora para el organismo microbiano específico permanezca por debajo del punto de corte clínico de la molécula interferidora para el organismo microbiano específico.
De acuerdo con realizaciones específicas, las moléculas pueden usarse para eliminar el organismo patógeno (por ejemplo, microbiano) o los métodos dan como resultado la eliminación del organismo patógeno (por ejemplo, microbiano). De acuerdo con otras realizaciones específicas adicionales, las moléculas tienen éxito en eliminar rápidamente el organismo patógeno (por ejemplo, microbiano), en particular, en una hora o menos o en 30 minutos o menos. De acuerdo con realizaciones alternativas, los métodos que usan las moléculas inhiben el crecimiento y/o la reproducción del organismo patógeno (por ejemplo, microbiano) sin eliminarlo. En este contexto, los virus también se consideran organismos "vivos", por ejemplo, una reducción en la carga vírica es indicativa de la eliminación del organismo vírico, mientras que una estabilización de la carga vírica es indicativa de la inhibición de la reproducción.
De acuerdo con realizaciones particulares, la proteína del organismo patógeno/vírico/microbiano es una proteína esencial, es decir, el organismo no puede sobrevivir si está desprovisto de la proteína. De acuerdo con otras realizaciones particulares (no excluyentes), la proteína del organismo patógeno (por ejemplo, microbiano) está implicada en la formación de biofilms. De acuerdo con realizaciones adicionales, se proporcionan métodos para tratar o prevenir la formación de biofilms, en donde la proteína del organismo patógeno (por ejemplo, microbiano) está implicada en la formación de biofilms. De acuerdo con otras realizaciones adicionales, la formación del biofilm es sobre un objeto, en particular, un dispositivo implantable, tal como un catéter o un estent.
Por lo tanto, la presente memoria descriptiva también describe métodos para prevenir, inhibir o revertir el crecimiento de biofilms microbianos sobre una superficie, que comprenden poner en contacto la superficie con una molécula de la estructura (X2i-1 -Yi-X2i-Zi)n, en donde:
- n es un número entero de 1 a 5 e i aumenta de 1 a n con cada repetición;
- cada uno de X2i-1 y X2i se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P; lo más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, D y P;
- cada Yi se selecciona independientemente de entre una serie de 4 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que está presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E; en donde al menos una Yi es una serie presente en una proteína de un organismo microbiano; y
- cada Zi es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada.
Más particularmente, la proteína del organismo microbiano es una proteína implicada en la formación de biofilms. La superficie sobre la que se previene, inhibe o revierte la formación del biofilm puede ser una superficie biótica o abiótica. Las superficies particularmente previstas son aquellas de dispositivos implantables, tales como catéteres o estents.
En referencia a las superficies abióticas, también se prevén dentro del alcance de la invención dispositivos recubiertos con las moléculas descritas en el presente documento. El recubrimiento de los dispositivos puede efectuarse directamente, aplicando las moléculas al dispositivo. Como alternativa, pueden recubrirse sobre el dispositivo usando enlazadores (reticulantes). Los dispositivos pueden estar completamente recubiertos (por ejemplo, mediante inmersión del dispositivo en una solución de las molécula) o pueden recubrirse solo partes del dispositivo. Se prevé particularmente que los dispositivos estén recubiertos con moléculas contra una proteína presente en un organismo microbiano, en particular, una proteína implicada en la formación de biofilms.
Por lo tanto, la presente memoria descriptiva describe dispositivos implantables recubiertos al menos parcialmente con moléculas de la estructura (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, en donde:
- n es un número entero de 1 a 5 e i aumenta de 1 a n con cada repetición;
- cada uno de X2i-1 y X2i se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P; lo más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, D y P;
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- cada Yi se selecciona independientemente de entre una serie de 4 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que está presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E; y
- cada Zi es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada.
De acuerdo con un aspecto adicional, se proporcionan métodos para seleccionar nuevos compuestos. Estos compuestos son las moléculas descritas en el presente documento y pueden usarse como compuestos inhibidores o compuestos de detección. La presente memoria descriptiva describe métodos de selección que comprenden las etapas de:
a) identificar en al menos una proteína al menos una región de 4 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que está presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E;
b) sintetizar una molécula de la siguiente estructura: (X2¡-1 -Y¡-X2¡-Zi)n, en donde:
- n es 1 a 5 e i aumenta de 1 a n con cada repetición;
- cada uno de X2i-1 y X2¡ se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, A, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P;
- cada Y¡ se selecciona independientemente de entre 4 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50%
de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que esté presente no más de 1 y preferentemente ningún resto
de P, R, K, D o E y en donde al menos un Y¡ es una serie de origen natural en una proteína identificada en la
etapa a); y
- cada Z¡ es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada;
c) poner en contacto la molécula preparada en la etapa b) con la proteína de la etapa a); y
d) evaluar la función y/o la agregación de la proteína.
Estos métodos tienen ventajas particulares: pueden usarse para una selección no sesgada, ya que puede usarse cualquier proteína del proteoma de un organismo. Como alternativa, pueden usarse para una selección selectiva, por ejemplo, para hallar nuevas dianas (es decir, proteínas que aún no se usan como diana por compuestos inhibidores). De acuerdo con estas realizaciones, la proteína en la etapa a) no es una diana conocida para compuestos inhibidores.
La puesta en contacto de la molécula y la proteína en la etapa c) puede ser totalmente in vitro, por ejemplo, con proteína purificada en un tubo de ensayo o una placa. Sin embargo, los métodos también pueden usarse en sistemas celulares: las moléculas preparadas en la etapa b) pueden ponerse en contacto, por ejemplo, con la proteína, añadiendo las moléculas a una línea celular. El modo mediante el cual se pondrán en contacto las moléculas con la proteína depende del organismo o la célula en la que está presente la célula, y esto determinará la disponibilidad de la proteína en condiciones naturales o in vitro.
La función puede evaluarse, por ejemplo, usando lecturas indicadoras adecuadas. En caso de que la selección sea para compuestos de detección en lugar de compuestos inhibidores, la detección de la presencia o agregación de los compuestos será normalmente la lectura, en lugar de una funcional. Sin embargo, se prevé que pueda usarse el mismo compuesto tanto para la inhibición como para la detección (véase, por ejemplo, el ejemplo 4).
Estos métodos también pueden usarse para seleccionar compuestos mejorados (en lugar de solo seleccionar los nuevos). Por ejemplo, cuando se conoce un compuesto inhibidor, pueden seleccionarse variaciones de este compuesto, por ejemplo, variando los restos usados para los restos X, probando diferentes enlazadores, acortando o alargando el resto Y¡ y similares.
Para una selección de compuestos anti-patógenos (es decir, en donde la proteína en la etapa a) es una proteína de un organismo patógeno), se prevé particularmente que la puesta en contacto pueda efectuarse añadiendo o administrando la molécula al organismo patógeno, especialmente para microorganismos patógenos. También se prevé particularmente que, en caso de que la al menos una proteína sea una proteína de un organismo patógeno, la evaluación de la función y/o agregación de la proteína en la etapa d) puede efectuarse evaluando la supervivencia, la reproducción y/o el crecimiento del organismo patógeno.
Asimismo, en este caso, la al menos una región de 4 a 16 aminoácidos contiguos o de acuerdo con aspectos o realizaciones de la invención, la al menos una región de 6 a 16 aminoácidos contiguos, identificada en la etapa a) puede producirse en más de una proteína de un organismo patógeno. Esto probablemente aumentará las
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probabilidades de éxito, ya que de este modo se usa más de una proteína como diana.
Asimismo, la al menos una región de 4 a 16 aminoácidos contiguos o de acuerdo con aspectos o realizaciones de la invención, la al menos una región de 6 a 16 aminoácidos contiguos, identificada en la etapa a) puede producirse en al menos una proteína de más de un organismo patógeno. Esto permite el uso como diana de más de un organismo patógeno con el mismo compuesto, de manera similar, por ejemplo, a los antibióticos de amplio espectro.
La memoria descriptiva describe métodos para seleccionar nuevos compuestos antimicrobianos. Estos métodos comprenden las etapas de:
a) identificar en al menos una proteína microbiana al menos una región de 4 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que está presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E;
b) sintetizar al menos una molécula de la siguiente estructura: (X2i-1-Y¡-X2i-Zi)n, en donde:
- n es 1 a 5 e i va de 1 a n (o i aumenta de 1 a n con cada repetición);
- cada uno de X2i-1 y X2¡ se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, A, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P;
- cada Yi se selecciona independientemente de entre una serie de 4 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que esté presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E y en donde al menos un Yi es una serie de origen natural en una proteína de un organismo microbiano identificado en la etapa a); y
- cada Zi es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada;
c) añadir la al menos una molécula preparada en la etapa b) al organismo microbiano en cuyo genoma se codifica la proteína de la etapa a); y
d) evaluar la supervivencia y/o el crecimiento o la reproducción del organismo microbiano.
Al evaluar la supervivencia, pueden determinarse los valores de CIM. Para identificar un compuesto con actividad antimicrobiana, es decir, para clasificar una molécula como un acierto, la CIM debe ser en particular menor de 100 |jg/ml.
En las realizaciones que abarcan métodos para identificar nuevas dianas para compuestos antimicrobianos, se prevé particularmente que la proteína microbiana en la etapa a) no sea una diana conocida para antibióticos. Esto hará que los compuestos identificados sean particularmente útiles en terapia combinada, ya que se abordan diferentes dianas.
Otra ventaja particular es que los métodos de selección pueden llevarse a cabo sin sesgo de selección para una proteína particular como diana de interés. De hecho, puede analizarse el proteoma completo del organismo microbiano y pueden usarse las secuencias adecuadas en moléculas descritas en el presente documento y comprobarse su eficacia. Esto tiene altas probabilidades de proporcionar nuevas dianas. Además, cuando se efectúa dicho análisis, se prevé que las regiones identificadas en la etapa a) sean regiones que aparecen más de una vez en el proteoma. Más particularmente, la al menos una región de 4 a 16 aminoácidos contiguos o de acuerdo con aspectos o realizaciones de la invención, la al menos una región de 6 a 16 aminoácidos contiguos, identificada en la etapa a) aparece en más de una proteína del organismo microbiano.
Ya que, en muchos casos, es deseable usar como diana más de un organismo microbiano (por ejemplo, antimicrobianos de amplio espectro), también se puede asegurar que la al menos una región de 4 a 15 aminoácido contiguos o, de acuerdo con aspectos o realizaciones de la invención, la al menos una región de 6 a 16 aminoácidos contiguos, identificada en la etapa a) se produce en una proteína o en al menos una proteína, de más de un organismo microbiano.
Más particularmente, los organismos microbianos usados como diana en el presente documento son organismos microbianos patógenos. Para asegurarse de que no se eliminan organismos microbianos beneficiosos (por ejemplo, microorganismos beneficiosos en la flora intestinal de un sujeto), puede comprobarse si la serie identificada en el organismo microbiano es específica para organismos patógenos y no aparece en microorganismos beneficiosos.
De acuerdo con un aspecto adicional, la molécula se usa en detección o como agente de diagnóstico. Por consiguiente, se proporcionan métodos de detección y de diagnóstico. La presente memoria descriptiva describe métodos para detectar una proteína en una muestra, que comprende las etapas de:
a) poner en contacto una muestra sospechosa de contener la proteína con una (es decir, al menos una) molécula
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de la siguiente estructura: (X2Í-1 -Y¡-X2í-Zi)n, en donde:
- n es 1 a 5 e i va de 1 a n (o i aumenta de 1 a n con cada repetición);
- cada uno de X2Í-1 y X2¡ se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos
seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, A, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P;
- cada Y¡ se selecciona independientemente de entre una serie de 4 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al
menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos,
restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que esté presente no más de 1 y
preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E y en donde al menos un Y¡ es una serie de origen natural en la proteína que se vaya a detectar; y
- cada Z¡ es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada;
b) detectar la presencia de moléculas que han reaccionado con la proteína.
La muestra puede proporcionarse tal cual o puede procesarse previamente. La detección puede ser directa o indirecta (es decir, se detecta la fracción que ha reaccionado o la que no ha reaccionado) y puede efectuarse mediante detección de las moléculas (por ejemplo, moléculas marcadas) o de la proteína (por ejemplo, detección de la fracción que no ha reaccionado). La naturaleza del método de detección no es vital para la invención, puede usarse cualquier método adecuado conocido por un experto en la materia (por ejemplo, basado en anticuerpos, basado en masa, basado en adsorción, ...).
De acuerdo con realizaciones particulares, la al menos una Yi de origen natural en la proteína que se va a detectar es única para dicha proteína en dicha muestra. Por lo tanto, por ejemplo, en una muestra de origen humano, la secuencia que también aparece en la proteína que se va a detectar está codificada solo una vez en el genoma humano (o se produce solo una vez en el proteoma humano), a saber, en la (secuencia que codifica la) proteína que se va a detectar. Aunque esta unicidad no es siempre necesaria - por ejemplo, cuando proteínas diferentes tienen una secuencia agregante idéntica y se detectan juntas, siguen pudiéndose discriminar adicionalmente, por ejemplo, basándose en el tamaño - se prevé particularmente que facilita la detección. La parte "en dicha muestra" es importante para determinar la unicidad de la serie de proteína: por ejemplo, en caso de que se procese previamente la muestra, es probable que contenga menos proteínas diferentes que la detección en mezclas complejas o en muestras de diferentes (microorganismos.
De acuerdo con realizaciones muy específicas, la región Y¡ puede contener exactamente 2 restos cargados (seleccionados de entre R, K, D, E), en tanto que la carga neta de la región Y¡ sea cero. Sin embargo, más particularmente, la región Y¡ no contiene ningún resto cargado (o para esa materia, prolina).
Cabe destacar que los presentes métodos de detección son altamente similares a los métodos establecidos, normalmente métodos de detección a base de anticuerpos. La diferencia significativa es el uso de las moléculas particulares. De hecho, cabe destacar que en los métodos de detección descritos en el presente documento, las moléculas, tal como se han definido en el presente documento, cumplen un papel similar al de los anticuerpos. Por lo tanto, en los métodos de detección que normalmente están basados en anticuerpos, las moléculas descritas en el presente documento pueden reemplazar a al menos un anticuerpo. Por ejemplo, las moléculas donde al menos una Y¡ es una serie de origen natural en la proteína que se va a detectar pueden reemplazar a un anticuerpo primario en ensayos de detección (y pueden marcarse como "interferidores primarios"), las moléculas donde Y¡ es una serie de origen natural en un anticuerpo primario usado para la detección pueden reemplazar a un anticuerpo secundario. Como alternativa, la molécula interferidora secundaria puede dirigirse a una etiqueta o marcador condensado a un anticuerpo primario o puede dirigirse a un "interferidor primario" o a un resto condensado al mismo. Al igual que con los anticuerpos, un "interferidor primario" también puede servir como anticuerpo de captura, donde el resto de la detección se produce con anticuerpos (o por ejemplo, con otro interferidor primario y con anticuerpo). Esta configuración se cita normalmente como un ensayo en sándwich.
De acuerdo con realizaciones específicas, la molécula usada para la detección comprende un marcador detectable. De acuerdo con realizaciones específicas adicionales, la detección en la etapa b) es mediante la detección del marcador detectable.
De acuerdo con realizaciones particulares, los métodos comprenden adicionalmente una separación de moléculas que han reaccionado con la proteína y moléculas que no han reaccionado con la proteína antes de la detección en la etapa b). Como alternativa, los métodos pueden comprender una separación de la proteína que ha reaccionado con las moléculas y la proteína que no ha reaccionado con las moléculas antes de la detección en la etapa b).
La detección en la etapa b) puede ser directa o indirecta, por ejemplo, mediante detección de la fracción de moléculas que no ha reaccionado. La detección puede ser cualitativa, semicuantitativa o cuantitativa.
De acuerdo con realizaciones particulares, la muestra es de un sujeto, en particular, de un sujeto animal o vegetal,
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más particularmente, de un sujeto mamífero, lo más particularmente, de un sujeto humano.
Sin embargo, puede usarse cualquier muestra que contenga proteínas y de acuerdo con realizaciones particulares, la muestra no es de un organismo. Este es el caso, particularmente, para aplicaciones en biotecnología blanca, donde, por ejemplo, el análisis se efectúa respecto de la pureza de los productos o para la detección de proteínas en alimentos y piensos o para detectar proteínas contaminantes en el agua y similares.
Aunque la detección de la proteína puede ser la última etapa del método, normalmente puede ir seguida de una etapa posterior de correlacionar la presencia (o ausencia o cantidad) de la proteína detectada con un estado particular. Por ejemplo, en las aplicaciones de biotecnología blanca mencionadas, la presencia de la proteína puede proporcionar una indicación de la contaminación o de la pureza. Por ejemplo, en muestras de material vegetal, la cantidad de una proteína detectada puede indicar qué línea produce más cantidad de un producto concreto, información que puede usarse, por ejemplo, para seleccionar plantas para su fitomejoramiento posterior.
De acuerdo con realizaciones específicas, la presencia, ausencia o cantidad de proteína detectada es indicativa de un estado de enfermedad. Dicho estado de enfermedad puede ser, por ejemplo, la presencia de enfermedad, la ausencia de enfermedad, la progresión de la enfermedad (por ejemplo, neoplasia maligna, metástasis, respuesta a la terapia farmacológica, recidiva). Algunos ejemplos de proteínas asociadas con estados de enfermedad, por ejemplo, biomarcadores, se encuentran bien documentados en la técnica. Algunos ejemplos no limitantes de dichas proteínas incluyen CRP (normalmente usada para monitorizar la inflamación) y PSA (usado en la detección temprana de cáncer de próstata), así como IL-1p y TNF-a, que también son marcadores de la inflamación. De acuerdo con realizaciones específicas adicionales, estos métodos comprenden adicionalmente una etapa c) que correlaciona la presencia, ausencia o cantidad de proteína detectada en la muestra con un estado de enfermedad en un sujeto. Como también se observa a partir de estos marcadores, son enfermedades cuyo diagnóstico se prevé de manera particular el cáncer y las enfermedades inflamatorias.
La presente memoria descriptiva también describe moléculas de la siguiente estructura: (X2i-i-Y¡-X2i-Zi)n, en donde:
- n es 1 a 5 e i va de 1 a n;
- cada uno de X2¡-i y X2¡ se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, A, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P;
- cada Y¡ se selecciona independientemente de entre una serie de 4 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que esté presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E y en donde al menos un Y¡ es una serie de origen natural en una proteína que es indicativa de un estado de enfermedad; y
- cada Z¡ es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada; para su uso en el diagnóstico de dicho estado de enfermedad.
Asimismo, en este caso, el cáncer y las enfermedades inflamatorias son dos tipos de enfermedades que se prevén particularmente (o de manera similar, se proporciona el uso de las moléculas para la fabricación de un diagnóstico para enfermedades (por ejemplo, cáncer, enfermedades inflamatorias)).
Ya que en el presente documento se prevén, por ejemplo, diagnósticos in vitro, también se proporcionan kits que comprenden al menos una molécula como se ha descrito en el presente documento (incluyendo una molécula de ácido nucleico que codifica dicha molécula o un vector recombinante como se ha descrito en el presente documento) y al menos un tampón adecuado.
La presente memoria descriptiva también describe, como una forma especial de kit, soportes sólidos que contienen al menos dos moléculas de la siguiente estructura: (X2¡-1 -Y¡-X2¡-Z¡)n, en donde:
- n es 1 a 5 e i aumenta de 1 a n con cada repetición;
- cada uno de X2Í-1 y X2¡ se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P; lo más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, D y P;
- cada Y¡ se selecciona independientemente de entre una serie de 4 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos
un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de
que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que esté presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E y en donde al menos un Y¡ es una serie de origen natural en una proteína; y
- cada Z¡ es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada.
De acuerdo con realizaciones particulares, las moléculas se unen al soporte sólido mediante un enlazador. Las al menos dos moléculas serán normalmente al menos dos moléculas diferentes. Algunos ejemplos de soportes sólidos
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particulares incluyen, pero sin limitación, micromatrices, placas precubiertas, nanopartículas y dispositivos de laboratorio sobre un chip. Ya que muchos de estos dispositivos se usan para detectar más de una proteína (a menudo hasta decenas o cientos de proteínas a la vez), se prevé que se proporcionen soportes sólidos que comprendan al menos 5 moléculas, al menos 10 moléculas, al menos 20 moléculas, al menos 50 moléculas, al menos 100 moléculas, al menos 200 moléculas, al menos 500 moléculas o al menos 1000 moléculas.
De acuerdo con un aspecto específico adicional, las moléculas se usan para regular a la baja las funciones de proteínas en plantas, células vegetales o semillas de plantas. Por consiguiente, la presente memoria descriptiva describe métodos para regular a la baja la función biológica de una proteína en una planta o célula vegetal o semilla de planta, que comprende poner en contacto dicha proteína con una molécula de la siguiente estructura: (X2¡-1-Yi-X2i- Zi)n, en donde:
- n es un número entero de 1 a 5 e i aumenta de 1 a n con cada repetición;
- cada uno de X2i-1 y X2¡ se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P; lo más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, D y P;
- cada Y¡ se selecciona independientemente de entre una serie de 4 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que esté presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E y en donde al menos un Y¡ es una serie de origen natural en una proteína en dicha planta, célula vegetal o semilla de planta; y
- cada Z¡ es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada.
Más particularmente, la molécula es un polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos presente en un vector recombinante y que, tras su introducción en la célula vegetal, la semilla de planta o la planta, produce dicho polipéptido en dicha célula vegetal, la semilla de planta o la planta.
De acuerdo con realizaciones muy específicas, la región Y¡ puede contener exactamente 2 restos cargados (seleccionados de entre R, K, D, E), en tanto que la carga neta de la región Y¡ sea cero. Sin embargo, más particularmente, la región Yi no contiene ningún resto cargado (o para esa materia, prolina).
La memoria descriptiva también describe composiciones agroquímicas. Estas composiciones comprenden al menos una molécula con la siguiente estructura: (X2¡-1 - Y¡-X2¡-Z¡)n, en donde:
- n es un número entero de 1 a 5 e i aumenta de 1 a n con cada repetición;
- cada uno de X2Í-1 y X2¡ se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P; lo más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, D y P;
- cada Y¡ se selecciona independientemente de entre una serie de 4 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que está presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E; y
- cada Z¡ es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada; y un vehículo agronómicamente aceptable.
Para composiciones agroquímicas, la al menos una Y¡ será particularmente una serie de origen natural en una proteína en o sobre una planta, célula vegetal o semilla de planta. Estas pueden ser proteínas de una planta (típicamente la planta sobre o junto a la que se aplica la composición agroquímica) o proteínas de plagas de plantas que pueden aparecer sobre las plantas.
Breve descripción de las figuras
Figura 1: Diagrama de Venn que agrupa aminoácidos según sus propiedades. Adaptado de Livingstone y Barton, CABIOS, 9, 745-756, 1993.
Figura 2: Porcentaje de secuencias únicas para una longitud de péptido dada en el proteoma de diferentes organismos. Para generar la figura, se tomó la secuencia genómica de un organismo, se generaron todos los péptidos de una longitud X codificados en el genoma, después se contó con qué frecuencia se producía cada péptido y se representó la fracción que es única (es decir, secuencias únicas frente a todas las secuencias de esta longitud).
Figura 3: Cuantificación de biofilms maduros de cepas que expresan la construcción agregadora Als3 en condiciones inductoras y represoras. Los biofilms maduros se cultivaron sobre discos cuadrados de silicona durante 48 h en succinato (barras blancas) o en YNB, D-glucosa al 4% (barras negras). Como control, se usó C. albicans SC5314. Las cepas recombinantes que expresaban los interferidores Als3p mostraron una capacidad
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formadora de biofilms significativamente reducida cuando se indujeron, en comparación con el control (*p < 0,001). La cuantificación se efectuó mediante recuento de UFC y los datos se representan como el porcentaje de las células viables comparado con el control (100%). Se calcularon las desviaciones estándar a partir de dos experimentos diferentes.
Figura 4: Las construcciones interferidoras de Candida albicans demostraron una adhesión (panel A) y una invasión (panel B) reducidas respecto de la línea celular epitelial TR-146.
Figura 5: El péptido candidato F9 da como resultado una fuerte inhibición de la formación de biofilms. Formación de biofilms por Candida albicans SC5314 en una placa de poliestireno de 96 pocillos en presencia de diferentes concentraciones (250 pM, 50 pM y 10 pM) de péptido E1 (RNGIVIVATTR (SEQ ID NO: 7)), péptido E2 (RLQQYTLLLIYLSVATAK (SEQ ID NO: 8)) y péptido F9 (RKLLFNLGSRNGIVIVATTR (SEQ ID NO: (9)). (A) Los péptidos se añadieron únicamente durante la fase de adhesión de Candida y el desarrollo de un biofilm maduro continuó en RPMI1640-MOPS fresco, mientras que en (B), los péptido estuvieron presentes durante el desarrollo completo del biofilm, incluyendo el periodo de adhesión. Los biofilms se cuantificaron mediante un ensayo de reducción de XTT. El control (100%) contenía únicamente medio fresco con la concentración final de DMSO al 1%. La presencia de péptido E1 y F9, dio como resultado una reducción significativa en la formación de biofilms (*p < 0,001). Los datos representan el porcentaje de la actividad metabólica de las células de Candida tratadas con péptido en comparación con el control (100%). Se calcularon las desviaciones estándar a partir de tres experimentos diferentes. Cada concentración del péptido se ensayó por triplicado.
Figura 6: El péptido F9 redujo la adhesión de Candida albicans SC5314 y la formación de biofilm sobre poliestireno. (A) Adhesión de C. albicans SC5314 en placas de poliestireno de 96 pocillos en presencia de péptido F9 (50 pM, 10 pM y 2,5 pM). Se llevó a cabo el ensayo de reducción de XTT después de 90 min de adhesión a 37 °C. (B) Formación de biofilm maduro in vitro de células de Candida pretratadas con diferentes concentraciones de péptido durante el periodo de adhesión. El desarrollo de biofilm adicional (48 h) continuó en RPMI1640-MOPS. La muestra de control se trató con DMSO al 1% (100%). Se usó C. albicans als3Aals3A como control. El péptido F9 redujo significativamente la adhesión y el desarrollo adicional de biofilm maduro (*p < 0,001). Los datos representan el porcentaje de la actividad metabólica de las células de Candida tratadas con péptido, después de la adhesión (90 min) o de 48 h de formación de biofilm, en comparación con el control (100%). Se calcularon las desviaciones estándar a partir de cinco experimentos diferentes. Cada concentración del péptido se ensayó por triplicado.
Figura 7: Las células de Candida albicans SC5314 tratadas con péptido vieron reducida su capacidad para formar biofilms sobre catéteres de poliuretano in vivo. Se incubaron células de C. albicans SC5314 en presencia de péptido F9 (50 pM) durante el periodo de adhesión (90 min) a 37 °C. Posteriormente, se lavaron los catéteres y se implantaron por vía subcutánea. Los biofilms se formaron durante 6 días. Se usó C. albicans alslAalslA als3A/als3A como control. C. albicans als3A/als3A formaron biofilms de manera similar al tipo silvestre. El tratamiento de células de Candida durante el periodo de adhesión con el péptido F9 dio como resultado una menor formación de biofilm maduro in vivo (*p < 0,001). Los datos se presentan como la media de Log-iü de UFC obtenidas por dispositivo. En total, se estudiaron 20 dispositivos. En cada experimento, se usaron dos animales por cada cepa o condición.
Figura 8: El péptido F9 redujo la capacidad de Candida albicans SC5314 para adherirse a catéteres de poliuretano. Se trataron células de C. albicans SC5314 con péptido F9 (50 pM) durante el periodo de adhesión (90 min a 37 °C). Se lavaron los dispositivos y se llevó a cabo la cuantificación de células de Candida adheridas mediante recuento de las UFC. C. albicans als3Aals3A y C. albicans als1Aals1Aals3Aals3A se adhirieron significativamente menos en comparación con el control (*p < 0,001). Las células de Candida de tipo silvestre tratadas con péptido F9 demostraron propiedades de adhesión reducidas en comparación con las células no tratadas (*p < 0,001). Los datos se presentan como la media de Log-iü de UFC obtenidas por dispositivo después del periodo de adhesión. En total, se usaron 9 catéteres por cepa o condición ensayada.
Figura 9: El péptido F9 reduce la capacidad de Candida albicans SC5314 para adherirse y para invadir células epiteliales. Se administraron tres concentraciones de péptido F9 diferentes (50 pM, 10 pM y 2,5 pM) durante la adhesión de C. albicans SC5314 (1 h) (A) y la invasión (3 h) (B) a la línea celular epitelial TR-146. Las partes adherentes e invasoras de células fúngicas en las células epiteliales se tiñeron con blanco de calcoflúor y se contratiñeron con anticuerpo secundario Alexa Fluor 488. Los cubreobjetos se observaron mediante epifluorescencia. Se calculó el porcentaje de células adheridas como la media de células de Candida unidas sobre cien áreas dispersas a lo largo de toda la superficie del cubreobjetos. Se redujeron significativamente la adherencia y las capacidades invasoras de C. albicans als3Aals3A (*p < 0,001). Se determinó el porcentaje de células de C. albicans invasoras dividiendo el número de células internalizadas entre el número total de células adherentes. Se contaron al menos 100 células fúngicas sobre cada portaobjetos. Se calcularon las desviaciones estándar a partir de tres experimentos diferentes y cada concentración del péptido se ensayó por duplicado. Figura 10: El tipo silvestre, el mutante de eliminación homocigoto y el transformante de Cnb1 tienen un fenotipo similar en las condiciones inductoras/represoras del promotor normales. Cuando se induce estrés añadiendo SDS (0,01%) al medio, el transformante muestra un fenotipo que es similar al tipo silvestre en condiciones represoras del promotor (medio SD), mientras que el fenotipo en condiciones inductoras del promotor (medio SCAA) muestra una mayor semejanza con el mutante de eliminación homocigoto. Los datos mostrados son representativos para las 4 construcciones.
Figura 11: La cinética de eliminación para S. epidermidis y S. aureus, tratadas con diferentes moléculas interferidoras, a su concentración inhibidora mínima (CIM) y 2xCIM.
Figura 12: Monitorización del desarrollo de resistencia en S. aureus ATCC.
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Figura 13: Estudios de desarrollo de resistencia a largo plazo en MRSA. La línea roja y la flecha representan una reducción de factor 2 en la resistencia para C30 debido a la privación de péptido del medio durante 1 día.
Figura 14: Propiedades hemolíticas de los péptidos interferidores.
Figura 15: Curva de resistencia para S.aureus cultivadas a sub-CIM durante 15 días.
Figura 16: Liberación de lactato deshidrogenasa de células de riñón embrionario humano a diferentes concentraciones de los péptidos interferidores C30 y Hit50.
Figura 17: Porcentaje de recuperación de la línea celular de riñón embrionario humano después de un periodo de incubación de 24 horas en presencia de dos péptidos interferidores antibacterianos (compuesto30 y Hit50). La figura muestra una recuperación del 90 por ciento de células HEK tratadas con 100 pg/ml de Hit50. La inhibición del crecimiento se debe a la presencia de DMSO como tampón en lugar de deberse al péptido interferidor (el tampón usado para la solubilización del péptido interferidor fue DMSO al 50% en agua ultrapura).
Figura 18: Medición de la intensidad de fluorescencia verde de células tratadas con diversos péptidos interferidores con el tiempo. La lisostafina (línea superior en la figura) representa en este caso el control lítico, ya que se sabe que rompe la pared celular estafilocócica muy rápidamente y da lugar a una rápida liberación del contenido celular. La línea inferior en la figura representa el tampón.
Figura 19: Medición de la intensidad de fluorescencia verde (verde Sytox) de células tratadas con diversas concentraciones de péptido interferidor C30.
Figura 20: Potencial de membrana (gráfica de puntos de fluorescencia roja/verde de DOC2) de bacterias no tratadas (A), tratadas con DMSO (B), despolarizadas con control de CCCP (C), tratadas con lisostafina (G), tratadas con C30 (25 pg/ml) medida en los puntos de tiempo de 0 (D), 5 (E) y 15 (F) minutos.
Figura 21: Unión del colorante diagnóstico de amiloide, tioflavina T, a S. aureus tratadas con diferentes concentraciones de compuesto C30. Obsérvese que el péptido interferidor C30 solubilizado en el medio también proporciona cierta fluorescencia de fondo.
Figura 22: Unión del colorante diagnóstico de amiloide, rojo Congo, a células bacterianas tratadas con concentraciones crecientes del compuesto C30.
Figura 23: Micrografías SEM de Bacillus cereus no tratadas (panel izquierdo) y tratadas con compuesto C30 a 3xCIM durante 5 minutos (panel derecho, parte superior) o durante 20 minutos (panel derecho, parte inferior). Se produce una evidente reducción de la pared celular de las células tratadas, con una aparente liberación del contenido. Además, las células parecen más cortas, lo que indica una división celular alterada. No hay poros visibles, ni cráteres presentes en la superficie celular.
Figura 24: Micrografías SEM de Staphylococcus aureus ATCC no tratadas (A) y tratadas con C30 (B). Existe una evidente diferencia en una serie de células que contiene septos de división, lo que sugiere una división alterada en células tratadas con C30. Después de una hora de tratamiento, algunas células bacterianas comienzan a perder su contenido.
Figura 25: Micrografías electrónicas de transmisión de Straphylococcus aureus tratadas con C30 (panel derecho) y tratadas con DMSO (panel izquierdo), fijadas después de 20 minutos de tratamiento. Las células son redondas y están intactas, con una membrana celular bien definida. Pueden observarse algunas estructuras similares a mesosoma en la población de células tratadas (flecha que apunta).
Figura 26: Micrografía TEM de estafilococos tratados con C30 durante 20 minutos a 4xCIM. El contenido citoplasmático comienza a reducirse, aunque no puede observarse una lisis celular evidente. La región de ADN tiene una densidad a los electrones muy alta, lo que sugiere condensación del ADN, que es un signo de etapa tardía de la apoptosis.
Figura 27: Micrografías electrónicas de transmisión de secciones ultrafinas marcadas inmunológicamente de Staphylococcus aureus expuestas a C30 marcado con FITC (dos filas superiores, imágenes A a F) y secciones inmunomarcadas, no expuestas a péptido (fila inferior, imágenes no marcadas). Las flechas rojas muestran agregados de péptido. Los septos de las células tratadas con péptido muestran una forma irregular y la división celular es asimétrica. Los péptidos son captados por la célula y los agregados residen en el citoplasma.
Figura 28: El péptido Hit1 (secuencia: RWVSMLLRRGSRWVSMLLRR (SEQ ID NO: 31)) y Hit57A (secuencia: RFFIGLSRRGSRIQAYLYRR (SEQ ID NO: 78)) redujeron eficazmente el número de bacterias en monocapas celulares infectadas. Todos los compuestos se usaron a 100 pg/ml.
Figura 29: Transferencias sondadas con péptido anti-CipC.
Figura 30: Intensidad de señal de estreptavidina-HRP de puntos que contienen diferentes concentraciones de péptidos.
Figura 31: Eficacias en vancomicina frente al compuesto C30 suministrado por vía intravenosa e intraperitoneal contra Staphylococcus aureus MRSA 326 en el modelo de muslo de ratón neutropénico.
Figura 32: Curvas de crecimiento de virus en múltiples etapas en células tratadas con interferidores antivíricos a 10 pM (paneles A, B) o 1 pM (paneles C, D), Tamiflu o PBS. Hdi, horas después de la infección.
Figura 33: Actividad relativa de luciferasa después de la transfección de todos o de un subconjunto de componentes de minirreplicón. "Mx1": además de todos los componentes de minirreplicón, también se transfectó un vector de expresión para Mx1.
Figura 34: Actividad relativa de luciferasa en presencia de interferidores dirigidos contra diferentes proteínas víricas. R-GS, R-PP, D-PP, R-PS indican la naturaleza del resto constitutivo (antes del guion) y el enlazador interno (después del guion) usado.
Figura 35: Actividad relativa de luciferasa en presencia de interferidores dirigidos contra diferentes proteínas víricas internas (M1 y NS1) que no están implicadas en el ensayo de minirreplicón. Valor de control = 1. R-PP, D- PP, R-PS indican la naturaleza del resto constitutivo (antes del guion) y el enlazador interno (después del guion)
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Figura 36: Descripción general esquemática de la tecnología de detección mediante interferidores específicos. Figura 37: Análisis de transferencia de Western y de PepBlot de p-Gal de lisados celulares completos bacterianos BL21. El carril 1 muestra la detección con anticuerpo anti-p-Gal policlonal de conejo; El carril 2 muestra la detección con el péptido interferidor, Tango 1 (6~RLAWLQR (SEQ iD NO: 79)); El carril 3 muestra la detección con el péptido interferidor, Tango 2 (6~RVIlWSLGNR (SEQ ID NO: 80)); y el carril 4 muestra la interacción con el interferidor de péptido fuera de la diana (£)~RPITVNPPFR (SEQ ID NO: 81)). Las membranas se expusieron con sustrato de hRp de quimioluminiscencia durante 100 s. La flecha superior muestra la posición predicha de la proteína p-Cal en la transferencia. La flecha inferior representa el producto de unión específico, que probablemente es SRP libre.
Figura 38: Análisis PepBlot de la especificidad de unión del péptido Tango 2 de ts y mutante a p-Gal de lisados celulares completos bL21: Carril 1 - péptido de ts (6~RVIIwSlGNR (SEQ ID NO: 8o)); Carril 2 - péptido mut_1 (6~RVPIWSLGNR (SEQ ID NO: 82)); Carril 3 - péptido mut_2 (6~RVIPWSLGNR (SEQ ID NO: 83)); y Carril 4 - péptido mut_3 (£)~RvIPESLGNR (SeQ ID NO: 84)). Las membranas se expusieron con sustrato de HRP de quimioluminiscencia durante 100 s. La flecha indica la posición de p-Gal sobre las tiras de membrana.
Figura 39: Análisis PepBlot de la cinética de unión del péptido Tango 2 (6-RVIIWSLGNR (SEQ ID NO: 80)) a p- Gal de lisados celulares completos BL21. Las proteínas separadas en la membrana se expusieron al péptido interferidor Tango 2 en el tampón de unión durante diferentes puntos de tiempo: Carril 1 - Sin exposición al péptido; Carril 2 - 30 s; Carril 3 - 5 min; Carril 4 - 10 min; Carril 5 - 15 min; Carril 6 - 30 min; Carril 7 - 45 min; y Carril 8 - 60 min de incubación. Las membranas se expusieron con sustrato de HRP de quimioluminiscencia durante 100 s. La flecha indica la posición de p-Gal sobre las tiras de membrana.
Figura 40: Análisis de diferentes niveles de proteína p-Gal añadidas en losados celulares completos BL21 no inducidos. La detección se logró usando (A) PepBlot con péptido interferidor Tango 2 (b~RVIIWSLGNR (SEQ ID NO: 80)) y (B) WB con anticuerpo anti-p-Gal policlonal de conejo. Carril 1 - Sin p-Gal; Carril 2 -11,6 ng de p-Gal; Carril 3 - 58 ng de p-Gal; Carril 4 -116 ng de p-Gal; Carril 5 - 290 ng de p-Gal; Carril 6 - 580 ng de p-Gal; Carril 7 - 870 ng de p-Gal; y Carril 8 - 1160 ng de p-Gal. Las membranas se expusieron con sustrato de HRP de quimioluminiscencia durante 100 s. La flecha muestra la posición de p-Gal sobre la membrana.
Figura 41: Comparación de la densidad de señal de detección WB del péptido interferidor Tango 2 (6-RVIIWSLGNR (SEQ ID NO: 80)) (línea negra con círculos) y anticuerpo anti-p-Gal (línea roja con triángulos) de diferentes niveles de proteína p-gal añadida en lisados celulares completos BL21 no inducidos.
Figura 42: influencia de restos constitutivos en la especificidad de la detección de péptido interferidor basada en PepBlot de p-gal en lisado completo de E. coli en presencia de proteínas séricas en el carril adyacente. La detección se llevó a cabo en una plataforma competitiva con el carril 1 de cada membrana conteniendo suero clínico al 7% y el carril 2 es la p-gal en lisado celular completo de E. coli BL21. Los péptidos se marcaron con biotina en ambos extremos y se unieron mediante enlazador Ttds. Las membranas que contenían suero separado y proteínas de E. coli se incubaron con péptidos interferidores 25 nM durante 15 min, seguido de conjugado SRP-HRP y se expusieron a sustrato de HRP de quimioluminiscencia durante 120 s. Obsérvese que la banda de alto PM observada para suero se debe a la reacción cruzada del conjugado SRP-HRP.
Figura 43: Sensograma experimental que compara la afinidad de diversos péptidos por la unión a p-Gal: Tango 1 (rojo), Tango 2 (verde, curva mayor), péptido fuera de la diana (amarillo) y la referencia de tampón (negro). Obsérvese que los péptidos (1 pM) fluyeron sobre la misma microplaca con una etapa de regeneración de la superficie después de cada contacto.
Figura 44: Sensograma experimental que compara la afinidad de diversos péptidos Tango 2 de ts y mutantes por la unión a p-Gal: Tango 2 ts (rojo, curva mayor), Tango 2 Mut_1 (verde), Tango 2 Mut_2 (amarillo), Tango 2 Mut_3 (azul) y la referencia de tampón (negro). Obsérvese que los péptidos (1 pM) fluyeron sobre la misma microplaca con una etapa de regeneración de la superficie después de cada contacto.
Figura 45: Sensograma representativo de datos ajustados a partir del análisis cinético del péptido, (His)6~RVIIWSLGNR (SEQ iD NO: 80), que se une a p-Gal inmovilizado sobre la placa sensora. La línea continua es el sensograma experimental y la línea de puntos superpuesta sobre la respuesta es la curva ajustada. Las concentraciones de analito fueron, de la parte inferior a la superior, 0,5 pM, 1,0 pM, 1,5 pM, 2,0 pM, 2,5 pM, 3,0 pM, 3,5 pM y 4,0 pM. La curva de en medio (2 pM) se ejecutó por duplicado. Obsérvese que los péptidos fluyeron sobre la misma placa con una etapa de regeneración de la superficie después de cada contacto.
Figura 46: Sensograma experimental que compara la afinidad de péptidos Tango 2 individuales (línea continua) y Tango 2 en tándem (línea discontinua) por la unión a p-Gal. La referencia de tampón se muestra como línea de puntos. Obsérvese que los péptidos (1 pM) fluyeron sobre la misma microplaca con una etapa de regeneración de la superficie después de cada contacto.
Figura 47: Comparación de la cinética de co-agregación del péptido Tango 1 (triángulo) y el péptido Tango 2 (cuadrado) con p-gal. Las concentraciones de péptidos interferidores y de p-gal fueron 10 pM. Los círculos negros representan la p-gal en ausencia del péptido. Las flechas apuntan al radio hidrodinámico (RH) de las partículas medido usando DLS en el punto de tiempo respectivo.
Figura 48: Comparación de la cinética de co-agregación de péptido Tango 2 individual (cuadrado) y péptido Tango 2 de repetición en tándem (triángulo) con p-gal. La cantidad de péptidos interferidores y de p-gal fueron de 10 pM. Los círculos negros representan p-gal en ausencia del péptido. Las flechas apuntan al radio hidrodinámico (RH) de las partículas medido usando DLS en el punto de tiempo respectivo.
Figura 49: Efecto de la concentración de péptido en la cinética de co-agregación del péptido Tango 2 con p-gal.
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La relación molar de péptido a p-gal fue: 1:5 (triángulo), 1:2 (cuadrado) y 1:1 (rombo). Los círculos negros representan la p-gal en ausencia del péptido. Las flechas apuntan al radio hidrodinámico (RH) de las partículas medido usando DLS en el punto de tiempo respectivo.
Figura 50: Efecto del péptido interferidor Tango 2 en la actividad enzimática de p-gal para escindir el sustrato no fluorescente FDG en fluoresceína fluorescente. La máxima intensidad de fluorescencia se obtiene con beta-Gal nativa 10 pM sin interferidor, seguido de p-Gal 10 pM + péptido interferidor 1 pM, seguido de beta-Gal 10 pM + péptido interferidor 5 pM. No se observó fluorescencia en la condición de p-Gal 10 pM + péptido interferidor 10 pM.
Figura 51: Espectro de FT-IR de reflectancia total atenuada de p-Gal nativa (línea sólida) y suspensión de coagregado de p-Gal-péptido interferidor Tango 2 (línea de puntos) en PB 20 mM, pH 6,8.
Figura 52: Espectro de CD de p-Gal nativa (línea sólida) y suspensión de coagregado de p-Gal-péptido interferidor Tango 2 (línea de puntos) en PB 20 mM, pH 6,8.
Figura 53: EM de (A) p-Gal nativa y (B) coagregado de p-Gal-péptido interferidor Tango 2.
Figura 54: Análisis PepBlot y WB de PsA usando péptido interferidor, brRQWVLTAAR (SEQ ID NO: 85) (panel A) y anticuerpo monoclonal de conejo anti-PSA (panel B). La membrana contiene 1,55 pg de PSA añadido en suero humano al 5%. La flecha indica la posición del PSA en las transferencias. Las membranas con péptido interferidor y anticuerpo anti-PSA se expusieron a sustrato de HRP de quimioluminiscencia durante 180 s y 10 s, respectivamente. La banda de alto peso molecular perceptible en PepBlot y WB se debe a la unión no específica del conjugado SRP-HRP y al anticuerpo secundario-HRP, respectivamente.
Figura 55: Análisis PepBlot y WB de 1,25 pg de CRP añadido en suero humano al 5% usando péptido interferidor, 6~RILIFWsR (SeQ ID NO: 86) (panel A) y anticuerpo monoclonal de conejo anti-CRP (panel B). Las membranas con péptido interferidor y anticuerpo anti-CRP se expusieron a sustrato de HRP de quimioluminiscencia durante 60 s y 10 s, respectivamente. La flecha indica la posición del CRP en las transferencias. La banda de alto peso molecular perceptible en la transferencia de interferidor y anticuerpo se debe a la unión no específica del conjugado SRP-HRP y al anticuerpo secundario-HRP, respectivamente.
Figura 56: Análisis PepBlot y WB de 0,6 pg de p-2M añadido en suero humano al 5% usando péptido interferidor, 6~RWSFYlLyYTR (SEQ ID NO: 87) (panel A) y anticuerpo anti-p-2M (panel B). Las membranas con péptido interferidor y anticuerpo anti-p-2M se expusieron a sustrato de HRP de quimioluminiscencia durante 180 s y 10 s, respectivamente. La flecha indica las posiciones de p-2M en las transferencias.
Figura 57: Detección de CRP en muestras clínicas de suero mediante WB usando anticuerpo monoclonal de conejo anti-CRP y PepBlot usando péptido interferidor b~RILIFWSR (SEQ ID NO: 86).
Figura 58: Detección de CRP en muestras clínicas de suero de 20 pacientes mediante PepBlot usando el péptido interferidor ó-RILIFWSR (SEQ ID NO: 86) (panel superior). Las concentraciones de CRP en suero clínico determinadas mediante ensayo inmunoturbidimétrico se encontraron en el intervalo de 1 pg ml-1 a 317 pg ml-1. El panel inferior muestra la representación de la densidad de señal de la banda de CRP detectada por el péptido b~RILIFWSR (SEQ ID NO: 86) frente a la concentración determinada de manera independiente con un ensayo inmunoturbidimétrico en un laboratorio clínico.
Figura 59: (A) Detección de PSA secretado en plasma seminal humano mediante PepBlot usando los péptidos ó-RWQVLASD (SEQ ID NO: 88) (carril 2) y 6-RQWVLTAAR (SEQ ID NO: 85) (carril 3). La WB del anticuerpo monoclonal (EP1588Y) específico para la secuencia C-terminal de PSA se muestra en el carril 1. (B) Detección de PSA usando el péptido interferidor de repetición en tándem b~RQWVLT AARGSGSAPAARQWVLTAAR (SEQ ID NO: 89). La biotina (b) se une al péptido mediante el enlazador 'Ttds-APAA' (SEQ ID NO: 77) y las dos secuencias agregantes se unieron mediante el enlazador 'GSGSAPAA' (SEQ ID NO: 90). Obsérvese que la concentración del péptido individual y de repetición en tándem fue de 250 nM y 250 pM, respectivamente. Las membranas se expusieron a sustrato de HRP de quimioluminiscencia durante 36 s.
Figura 60: Detección por PepBlot (es decir, basada en interferidor) de 5 pg de IL1p añadida en suero humano al 5%.
Figura 61: Detección por PepBlot de 5 pg de TNFa añadido en suero humano al 5%.
Figura 62: Detección cuantitativa de diferentes niveles de p-gal añadida en lisados celulares completos de E. coli usando el péptido b'RVIlWSLGNRGSGSAPAARVIlWSLGNR (SEQ ID NO: 91). La biotina (b) se une al péptido mediante el enlazador 'Ttds-APAA' (SEQ ID NO: 77) y las dos secuencias agregantes se unieron mediante el enlazador 'GSGSAPAA' (SEQ ID NO: 90).
Figura 63: Caracterización cinética de la interacción del péptido b~RVllWSLGNRGSGSAPAARVllWSLGNR (SEQ ID NO: 91) con p-Gal. Las concentraciones de la proteína diana p-Gal se encontraron en el intervalo de 31 pM a 1 pM.
Figura 64: Caracterización cinética de la interacción del péptido b~RlLlFWSRGSGSAPAARlLlFWSR (SEQ ID NO: 92) con CRP. Las concentraciones de la proteína diana CRP se encontraron en el intervalo de 37 pM a 582 mM.
Figura 65: Detección de CRP en suero clínico usando micromatriz de péptido interferido individual flanqueado por "R" (panel superior) o de péptido interferidor de repetición en tándem flanqueado por "R" (panel inferior). El eje X muestra los péptidos punteados, el eje Y indica la relación de señal a ruido. La concentración de CRP en el suero fue de 317 pg ml-1.
Figura 66: A, análisis de transferencia de Western de fosfo-ERK1/2 y total de células Hek293 transfectadas con mVEGFR2, seguido de una privación de alimento durante una noche en presencia o ausencia de péptidos de diferentes fuentes y estimuladas durante 5 minutos con VEGF (25ng/ml). B, cuantificación de la relación de niveles de ERK1/2 fosforilado frente al total para algunos de los péptidos mostrados en A.
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Figura 67: Especificidad del péptido B8 frente al receptor de VEGFR2. Análisis de transferencia de Western para ERK1/2 fosforilado en células HeLa que se estimularon durante 5 min con EGF (25ng/ml) después de una privación de alimento durante una noche en presencia de DMSO o péptido B8 a la concentración indicada. No pudo observarse una reducción en la fosforilación de ERK1/2 inducida por los péptidos dirigidos contra VEGFR2. Figura 68: Tinción inmunohistoquímica para mVEGFR2, expresado en células HEK293 tratadas con DMSO (panel superior) o con péptido B8 10 pM (panel inferior).
Figura 69: Neovascularización de vasos en el ojo de ratones tratados con control, péptidos interferidores anti- VEGFR2 o mAb anti-VEGFR2. El eje Y indica el % de área positiva a TRITC frente al borde del área total de la lesión.
Figura 70: Niveles de ERK1/2 fosforilado en células HeLa tras estimulación con EGF, en presencia o ausencia de péptidos dirigidos contra EGFR. El eje Y muestra los niveles de fosfo-ERK corregidos respecto del control negativo. Secuencia de A5, RWGLLLALRPPRWGLLLALR (SEQ ID NO: 93); A11, RTGYLYISRPPRTGYLYISR (SEQ ID NO: 94); A12, RIISAWGRPPRNSAWGR (SEQ ID NO: 95); B9, DVWSYGVTDPPDVWSYGVTD (SEQ ID NO: 96); B10, DITGYLYIDPPDITGYLYID (SEQ ID NO: 97); B11, DLLGISLTDPPDLLGISLTD (SEQ ID NO: 98); B12, DWGLLLALDPPDWGLLLALD (SEQ ID NO: 99)
Figura 71: Inducción de A20 (transferencia de Western en el panel superior) e IL-8 (ELISA en el panel intermedio) o IL-6 (bioensayo en el panel inferior) en diferentes puntos de tiempo tras estimulación con hTNF. Figura 72: Inducción relativa de niveles de IL-8 de células A549 tratadas con diferentes interferidores tras su estimulación con TNF, en comparación con el tratamiento con medio asérico y DMSO al 2% (DMSO en la figura). A y B muestran los resultados de 2 experimentos independientes.
Figura 73: Inducción relativa de niveles de IL-6 de células A549 tratadas con diferentes interferidores tras su estimulación con TNF, en comparación con el tratamiento con medio asérico y DMSO al 2% (DMSO en la figura). Figura 74. (a) Diagrama de gráfica TANGO para BIN2; los picos representan las secuencias peptídicas con la mayor propensión a la agregación dentro de la proteína BIN2. (b) Representación esquemática de los vectores de expresión de bait249 que contienen un reforzador de la agregación fusionado en N-terminal a GFP. (c) Representación de vectores de expresión de bait249 que incluyen diferentes secuencias enlazadoras y flanqueantes (se indican las secuencias de aa) pero que no contienen ningún reforzador de la agregación.
Figura 75. (a-e) Evaluación CLSM de la formación de agregados en hojas agro-infiltradas con N. benthamiana transformadas transitoriamente con las construcciones de expresión de GFP indicadas sobre cada panel. Las células epidérmicas son positivas a GFP pero muestran diferentes patrones de localización, principalmente en el área perinuclear. La flecha blanca indica un cuerpo de inclusión insoluble. Barras de tamaño: 10 pm.
Figura 76. Panel superior: Imágenes de CLSM de células epidérmicas de N. benthamiana después de 4,5 días desde la inyección conjunta de 35SBIN2GFP y pMDCbait249NF_T y cepas de expresión. Panel inferior: imágenes correspondientes que representan la cuantificación de la colocalización llevada a cabo mediante el programa informático ImageJ MBF. Se indican los coeficientes de solapamiento de Mander (0<R<1) para cada imagen; las barras de tamaño representan 50 pm.
Figura 77. Co-inmunoprecipitación de variantes de 35S::bait249-GFP expresadas conjuntamente en N. benthamiana con 35S::BIN2:HA. En el panel izquierdo, la detección de transferencia de Western de las fracciones no unidas de los extractos de proteínas vegetales después de 4 horas de incubación con perlas anti- GFP y detección con anticuerpo anti-HA (panel superior izquierdo) o con anticuerpos anti-GFP (panel inferior izquierdo). En el panel derecho, la detección de las perlas inmunoprecipitadas (IP) con anticuerpo anti-HA (panel superior derecho) o anti-GFP (panel inferior derecho).
Figura 78. (a-d) Imágenes CLSM de plántulas de Arabidopsis 8 D.A.S. T3 que expresan la construcción 35S::bait249R-GFP. Las células epidérmicas en los cotiledones (a), el hipocótilo (b) y las células radiculares (c) muestran agregación perinuclear (flechas blancas). La punta radicular muestra una agregación citosólica no clara y una señal débil de GFP (d). (e-h) Imágenes CLSM de plántulas de Arabidopsis 8 D.A.S. T3 que expresan la construcción 35S::bait249NF_Tand-GFP. Las células epidérmicas en los cotiledones (e), el hipocótilo (f) y las células radiculares (g) muestran agregación citosólica. La punta radicular muestra una intensidad de GFP más débil (h). Se indican las barras de tamaño.
Figura 79. (a-d) Imágenes CLSM de plántulas de Arabidopsis 8 D.A.S. T3 que expresan la construcción 35S::bait249-GFP. No es visible una agregación evidente en los tejidos vegetales, pero solo es visible una débil expresión de GFP en las células en los cotiledones (a), hipocótilos (b) y la punta radicular (d). En las células radiculares (c), se evidencia la presencia de agregados insolubles en forma de cuerpos de forma redonda (flecha blanca). (e-h) Imágenes CLSM de plántulas de Arabidopsis 8 D.A.S. T3 que expresan la construcción 35S::bait249NF-GFP. El señuelo se expresa en cualquier tejido vegetal que muestre agregación perinuclear únicamente en las células de la raíz (g). Se indican las barras de tamaño.
Figura 80. Evaluación TEM de secciones ultrafinas marcadas con inmuno-oro de plántulas de Arabidopsis 8 D.A.S. incubadas con un anticuerpo anti-GFP. (a) Células parenquimales vasculares del hipocótilo que expresan 35S::bait249R-GFP que muestran material fibrilar citosólico marcado (a) agrandado en el recuadro. (b-c) Detalles de las células del área de alargamiento de la raíz que muestran marcaje acumulado debait249NF_Tand-GFP en el citosol (b) y próximo a la pila de Golgi (c). (d) Célula de empalizada del cotiledón que expresa bait249NF_Tand-GFP que evidencia el marcaje perinuclear, agrandado en el recuadro. (e) Célula del área de elongación de la raíz que muestra marcaje citoplasmático de bait249NF_T y en el citosol. Se indican las barras de tamaño.
Figura 81. (a) Detección de PAGE nativo y anti-GFP de complejos de alto peso molecular (recuadrados) en extractos de proteínas de plantas de Arabidopsis transgénicas que expresan de manera estable las líneas BIN2
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bait249 con respecto a extractos de plantas de tipo silvestre (Col-0). (b,c) Espectroscopia de FT-IR en material inmunoprecipitado de plantas transgénicas que expresan 35S::bait249-GFP, 35S::bait249R-GFP, 35S::bait249NF_Tand-GFP y 35S::bait249NF-GFP. El aumento de la absorbancia a valores de 1616 y a 1680 (flechas negras) indica la presencia de agregados de lámina p.
Figura 82. (a) Fenotipo de 35S::bait249R-GFP y 35S::bait249NF_Tand-GFP de plántulas de Arabidopsis en comparación con Col-0 cultivadas verticalmente in vitro durante 8 días sometidas a un fotoperiodo de día largo y en suelo durante 1,5 meses. También se representa la cuantificación de la longitud de las raíces y los hipocótilos en una media de 50 plántulas de 8 D.A.S. por línea. (b) Ensayo de respuesta a la dosis de resistencia a brassinazol para líneas de plántulas de Arabidopsis 4 D.A.S. de 35S::bait249R-GFP y 35S::bait249NF_Tand- GFP en comparación con Col-0 y triple mutante GSKs grupo II T-ADN (trGSKsII_k.o.). Se representa en la gráfica la cuantificación correspondiente de las longitudes de los hipocótilos en una media de 50 plántulas por línea.
Figura 83: a) Niveles de expresión relativos de los genes biosintéticos de BR DWF4 y CPD y del gen para el factor de transcripción NAC que responde a BR (At5g46590) en plántulas de Arabidopsis 8 D.O. cultivadas in vitro en condiciones de día largo. b) Niveles de expresión de los genes de chaperona (HSP70, HSP90-1, HSP101, HSC70-1, HSC70-2 y HSC70-3) medidos en las mismas condiciones experimentales. En cada caso, se normalizó la cantidad de ARNm al nivel de CDKA1 como gen de referencia.
Figura 84. Evaluación ultraestructural TEM de la citotoxicidad de 35S::bait249R-GFP en plantas de Arabidopsis. Se muestra una comparación a bajo aumento entre los hipocótilos y las células de la raíz en Col-0 (a,c) y el mutante (e,g). Micrografías de alto aumento de las mismas áreas en Col-0 (b,d) y mutante (f,h). Se indican las barras de tamaño.
Figura 85. Panel superior: Imágenes de CLSM de plántulas de Arabidopsis 8 D.A.S. que expresan 35S::BIN2- GFP y pMDC::bait249NF_Tand_RFP después de 24 horas de la inducción. Panel inferior: imágenes correspondientes que representan la cuantificación de la colocalización llevada a cabo mediante el programa informático ImageJ MBF. Se indican los coeficientes de solapamiento de Mander (0<R<1) para cada imagen.
Descripción detallada
Definiciones
La presente invención se describirá respecto de realizaciones particulares y con referencia a ciertos dibujos, pero la invención no se limita a los mismos, sino únicamente por las reivindicaciones. No ha de interpretarse cualquier signo de referencia en las reivindicaciones como limitante del alcance. Las figuras descritas son solo esquemáticas y no limitantes. En los dibujos, puede exagerarse el tamaño de algunos de los elementos y no dibujarse a escala con fines ilustrativos. En los casos donde se usa el término "comprende" en la presente descripción y las reivindicaciones, esto no excluye otros elementos o etapas. En los casos donde se usa un artículo definido o indefinido cuando se hace referencia a un nombre en singular, por ejemplo, "un" o "una", "el" o "la", esto incluye un plural de ese nombre, a menos que se indique específicamente otra cosa.
Además, los términos primero, segundo, tercero y similares en la descripción y en las reivindicaciones, se usan para distinguir entre elementos similares y no necesariamente para describir un orden secuencial o cronológico. Ha de entenderse que los términos usados de este modo son intercambiables en las condiciones adecuadas y que las realizaciones de la invención descritas en el presente documento pueden funcionar en otras secuencias a las descritas o ilustradas en el presente documento.
Se proporcionan los siguientes términos o definiciones únicamente para ayudar a comprender la invención. A menos que se definan específicamente en el presente documento, todos los términos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entendería un experto en la materia de la presente invención. Remítase a los expertos, en particular, a Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Press, Plainsview, Nueva York (1989); y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Suplemento 47), John Wiley & Sons, Nueva York (1999), para definiciones y términos de la especialidad. No debe interpretarse que las definiciones proporcionadas en el presente documento tengan un alcance menor que el entendido por un experto habitual en la materia.
Las moléculas de inducción de agregación beta o de agregación-nucleación descritas en el presente documento se citan en ocasiones como "interferidores" o "moléculas interferidoras". Con este término, se entienden las moléculas que contienen restos constitutivos como se han descrito en el presente documento (es decir, las moléculas con restos X2i-1 y X2i), por lo tanto, el término no es sinónimo a los "interferidores" usados en el documento WO2007071789. Tal como se usa en el presente documento, los "interferidores" deben interpretarse, por lo tanto, como moléculas con la estructura (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n. En ocasiones se usa la expresión "péptidos interferidores", en caso de que sean de naturaleza completamente peptídica. El término "señuelo" también se usa en ocasiones como sinónimo, aunque este también puede referirse a la región de agregación en sí. Las moléculas interferidoras, tal como se describen en el presente documento, son moléculas de origen no natural. Son sintéticas (en tanto que son producidas por el hombre) y no se pretende que abarquen fragmentos de proteína (debido a los requisitos de secuencia específicos y es improbable que los fragmentos de proteína naturales hallados en organismos se ajusten a esta definición).
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Tal como se usa en el presente documento, la expresión "aminoácidos hidrofóbicos" se refiere a los 13 aminoácidos siguientes: isoleucina (I), leucina (L), valina (V), fenilalanina (F), tirosina (Y), triptófano (W), histidina (H), metionina (M), treonina (T), lisina (K), alanina (A), cisteína (C) y glicina (G). La expresión "aminoácidos alifáticos" se refiere a restos de I, Lo V. La expresión "aminoácidos cargados" se refiere a arginina (R), lisina (K) - ambos con carga positiva; y ácido aspártico (D), ácido glutámico (E) - ambos con carga negativa. Aunque en ocasiones la histidina se cita como con carga positiva, ya que el nitrógeno en su cadena lateral puede protonarse en condiciones ácidas, en el presente documento no se prevé entre los aminoácidos cargados, a menos que se indique explícitamente otra cosa. Esto se debe a que la carga positiva en condiciones fisiológicas no es comparable con la de los restos de R o K y la carga en condiciones fisiológicas es la que cobra importancia en el presente documento.
A lo largo de la solicitud, se usará la notación de una letra convencional de los aminoácidos. Típicamente, el término "aminoácido" se referirá a "aminoácido proteinogénico", es decir, aquellos aminoácidos que están presentes de manera natural en las proteínas. Más particularmente, los aminoácidos se encuentran en la forma isomérica L. También se prevén D-aminoácidos, pero normalmente tienen diferentes propensiones a la agregación.
La expresión "una serie de X aminoácidos contiguos de origen natural en una proteína", en donde X es un número, tal como se usa en el presente documento, se refiere al hecho de que estos X aminoácidos están presentes como una serie no interrumpida, en el mismo orden, en una proteína de un organismo. En otras palabras, la serie corresponde a la secuencia exacta de la proteína a lo largo de X restos.
La "carga total" de una serie de aminoácidos es la suma del número de aminoácidos cargados positivamente menos la suma del número de aminoácidos cargados negativamente o viceversa. Tal como se usa en el presente documento, siempre es un valor absoluto. Por lo tanto, en caso de que una serie contenga, por ejemplo, un resto cargado positivamente y tres aminoácidos cargados negativamente, la carga total de esa serie es dos.
El término "monómero", tal como se usa en la solicitud, es un átomo o una molécula pequeña que puede unirse químicamente a otros monómeros para formar un polímero. Esto puede hacer referencia a monómeros naturales, tales como aminoácidos (cuyos polímeros son polipéptidos o proteínas), nucleótidos (cuyos polímeros son ácidos nucleicos) o monosacáridos, por ejemplo, glucosa, cuyos polímeros son almidones, glucógeno o glucosa; o xilosa, cuyo polímero es el xilano). Más particularmente, sin embargo, en el presente documento se usa el término monómero para referirse a moléculas orgánicas que no pertenecen a estas tres categorías, que pueden formar polímeros sintéticos o naturales diferentes, tales como, por ejemplo, cloruro de vinilo o isopreno. Un monómero particularmente previsto es el óxido de etileno, cuyo oligómero o polímero es el polietilenglicol (PEG), también citado en ocasiones como óxido de polietileno (PEO) o polioxietileno (POE).
En el contexto de los monómeros, se usa una "unidad de la misma naturaleza" para referirse a monómeros con la misma estructura general, pero no necesariamente idénticos. Por ejemplo, dos aminoácidos diferentes son unidades de la misma naturaleza, mientras que un aminoácido y un monosacárido son unidades de naturaleza diferente.
Un "sujeto", tal como se usa en el presente documento, se refiere normalmente tanto a "sujetos animales" como a "sujetos vegetales". Se usa un "sujeto animal" para referirse a un organismo vertebrado, más en particular, un mamífero, más en particular, un ser humano. Los sujetos mamíferos particularmente previstos son aquellos que se tienen como mascotas, tales como perros, gatos, conejos, gerbos, hámsteres, chinchillas, ratones, ratas, cobayas, burros, mulas, hurones, cabras pigmeas, cerdos vietnamitas, mascotas aviares, tales como canarios, periquitos, loros, pollos, pavos; reptiles mascotas, tales como lagartos, serpientes, galápagos y tortugas; y mascotas acuáticas, tales como peces, salamandras y ranas. Otros animales particularmente previstos son especies usadas para análisis toxicológicos, tales como ratones, ratas, cobayas, conejos, perros, cerdos, monos, hurones y ovejas. También se prevén animales de granja, tales como alpaca, banteng, bisonte, camello, ganado bovino (vacas), ciervo, burro, gayal, cabra, caballo, llama, mula, cerdo, pony, reno, oveja, búfalo y yak. Un "sujeto vegetal", tal como se usa en el presente documento, se refiere a organismos vivos del reino Plantae. Las plantas particularmente previstas incluyen cultivos comerciales (es decir, cultivos cultivados para obtener un beneficio), tales como, pero sin limitación, maíz, arroz, trigo, soja, cebada, sorgo, mijo, avena, centeno, tritical, alforfón, quinoa, fonio, einkorn, trigo duro, patata, café, cacao, mandioca, té, árbol del caucho, palmera de cocos, palma de aceite, caña de azúcar, remolacha azucarera, banano, naranjo, árbol de la piña, manzano, peral, limonero, olivo, árbol del cacahuete, judía verde, lechuga, tomate, zanahoria, calabacín, coliflor, colza, jatropha, mostaza, jojoba, lino, girasol, algas verdes, yute, algodón, cáñamo (u otras variedades de Cannabis sativa), colza o tabaco. Un "organismo", tal como se usa a lo largo de la solicitud, se refiere a cualquier sistema viviente contiguo (tal como un animal, hongo, microorganismo o planta), así como virus (ya que estos también son entidades separadas ("sistema contiguo") que contienen proteínas). Los organismos particularmente previstos son sujetos (véase lo anterior), los organismos previstos que no son sujetos incluyen organismos invertebrados, tales como especies de Drosophila o especies de Caenorhabditis. También se prevén particularmente microorganismos y/u organismos patógenos.
Una "infección", tal como se usa en el presente documento, se refiere a la colonización de un organismo hospedador (normalmente un sujeto) por un parásito o especie patógena (organismos). Los patógenos o parásitos infecciosos pretenden usar los recursos del hospedador para reproducirse, normalmente causando una enfermedad infecciosa. En el presente documento, "enfermedad infecciosa" se usa para referirse a cualquier tipo de enfermedad causada por la presencia de un organismo externo (patógeno) en o sobre el sujeto u organismo con la enfermedad. Normalmente, se considera que las infecciones están causadas por microorganismos o microparásitos, tales como
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virus, priones, bacterias y viroides, aunque también pueden causar infecciones organismos mayores, tales como macroparásitos y hongos. Los organismos que causan infección se citan en el presente documento como "patógenos" (en caso de que provoquen enfermedades) y "parásitos" (en caso de que se beneficien a expensas del organismo hospedador, reduciendo de este modo la salud biológica del organismo hospedador, incluso si no hay presente una enfermedad manifiesta) e incluyen, pero sin limitación, virus, bacterias, hongos, protistas (por ejemplo, Plasmodium, Phytophthora) y protozoos (por ejemplo, Plasmodium, Entamoeba, Giardia, Toxoplasma, Cryptosporidium, Trichomonas, Leishmania, Trypanosoma) (microparásitos) y macroparásitos, tales como gusanos (por ejemplo, nematodos tales como ascáridos, filarias, anquilostomas, oxiuros y tricocéfalos o platelmintos, tales como tenias y duelas), pero también ectoparásitos, tales como garrapatas y ácaros. Los parasitoides, es decir, organismos parásitos que esterilizan o matan al organismo hospedador, también se prevén dentro del término parásitos. De acuerdo con realizaciones particulares donde las moléculas pueden administrarse directamente a ectoparásitos en lugar de a través del organismo hospedador, se prevé que no se incluyan los ectoparásitos en el sentido de parásitos que causan una infección.
Obsérvese que aunque normalmente se usa enfermedad infecciosa para sujetos que son animales, en particular, mamíferos, lo más en particular, seres humanos, se prevé en el presente documento que se aplique enfermedades infecciosas también a plantas (especialmente cuando se refiere a enfermedades en un organismo). De hecho, los patógenos de plantas también pueden causar infecciones en plantas e incluyen, pero sin limitación, hongos (por ejemplo, Ascomycetes, Basidiomycetes, Oomycetes), bacterias, Phytoplasma, Spiroplasma, virus, nematodos, protozoos y plantas parásitas.
Una "plaga" o "plaga de plantas", tal como se usa en la solicitud, se refiere a organismo que causan daño a las plantas, en particular, plantas usadas en agricultura. Obsérvese que la expresión "plaga de plantas" se usa en el sentido de que la plaga ataca a plantas, no siendo necesariamente el caso de que la plaga sea una especie vegetal. De hecho, las plagas son particularmente animales (vertebrados que comen o destruyen las plantas o invertebrados), otras plantas (malas hierbas del cultivo y plantas parásitas), microorganismos y virus. Más particularmente, las plagas son animales invertebrados (por ejemplo, insectos (incluyendo plagas agrícolas de insectos, plagas de insectos de plantas ornamentales, plagas de insectos silvícolas, insectos vectores de patógenos en humanos, animales o vegetales. Algunos ejemplos incluyen, pero sin limitación, áfidos, orugas, moscas, avispas y similares), nematodos (que viven libres en el suelo o en particular, especies que parasitan raíces de plantas, tales como el nematodo de la anguilulosis, nematodo del quiste de la soja y nematodo del quiste de la patata), ácaros (tales como arañuela roja común, ácaros con patas de hilo y ácaro de las agallas) y gasterópodos (incluyendo babosas, tales como Deroceras spp., Milax spp., Tandonia sp., Limax spp., Arion spp. y Veronicella spp. y caracoles, tales como Helix spp., Cernuella spp., Theba spp., Cochlicella spp., Achatina spp., Succinea spp., Ovachlamys spp., Amphibulima spp., Zachrysia spp., Bradybaena spp. y Pomacea spp.), hongos patógenos (incluyendo Ascomycetes (tales como Fusarium spp., Thielaviopsis spp., Verticillium spp., Magnaporthe spp.), Basidiomycetes (tales como Rhizoctonia spp., Phakospora spp., Puccinia spp.) y Oomycetes similares a hongos (tales como Pythium spp. y Phytophthora spp.), bacterias (tales como Burkholderia spp. y proteobacterias, tales como Xanthomonas spp. y Pseudomonas spp.), Phytoplasma, Spiroplasma, virus (tales como el virus del mosaico del tabaco y el virus del mosaico de la coliflor) y protozoos. El término "plaga" se solapa significativamente con los "patógenos" y "parásitos" relacionados con infecciones, en particular para microorganismos y virus. Sin embargo, para plagas de plantas, siempre se incluyen en la definición ectoparásitos y animales (invertebrados) que se alimentan de las plantas.
Las "enfermedades no infecciosas" son todas las enfermedades que no son enfermedades infecciosas, es decir, son aquellas enfermedades que no están causadas por un patógeno y que no pueden transmitirse de una persona a otra. Las enfermedades no infecciosas pueden estar causadas por el ambiente, deficiencias nutricionales, elecciones de estilo de vida o herencia genética e incluyen, por ejemplo, la mayoría de las formas de cáncer, asma y enfermedad cardíaca. Una clase particularmente prevista de enfermedades no infecciosas es los trastornos fisiológicos que están causados por las propias proteínas del organismo con la enfermedad (por ejemplo, mediante expresión aberrante o mediante mutación).
Tal como se usa en la solicitud, la expresión "resistencia a fármacos" se refiere a una reducción en la eficacia de un fármaco para curar una enfermedad o afección. En particular, se aplica en el contexto de resistencia adquirida por los patógenos. Cuando un organismo es resistente a más de un fármaco, se dice que es resistente a múltiples fármacos. La expresión "resistencia a antibióticos", tal como se usa en el presente documento, es un tipo de resistencia a fármacos, donde un microorganismo es capaz de sobrevivir a la exposición a un antibiótico. Para determinar, en la práctica, la resistencia a antibióticos, puede usarse el punto de corte clínico. Un punto de corte para antibióticos es un umbral máximo de CIM (concentración inhibidora mínima, la menor concentración de un antimicrobiano que inhibirá el crecimiento visible de un microorganismo tras su incubación) para predecir una terapia exitosa con antibióticos. Durante el intervalo de dosificación con el anticuerpo, se espera que se inhiban (al menos parcialmente) o se eliminen los organismos con una CIM en este o por debajo de este umbral. En otras palabras, en caso de que el valor de CIM de un antibiótico para un organismo dado sea mayor que el valor de punto de corte de este antibiótico para el microorganismo dado, se dice que el microorganismo es resistente. Los puntos de corte clínicos se evalúan y monitorizan por el Comité Europeo de Pruebas de Sensibilidad Antimicrobiana (EUCAST, por sus siglas en inglés) en Europa y en su página web pueden encontrarse valores de punto de corte. Los puntos de corte clínicos también se determinan independientemente por el Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio
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(CLSI, por sus siglas en inglés) en los Estados Unidos, estos son reconocidos por la FDA.
La resistencia a fármacos y en particular, a antibióticos, puede ser resistencia natural (por ejemplo, debido a que la proteína usada como diana por el fármaco no está presente en el organismo) o puede ser resistencia adquirida (por ejemplo, mediante mutaciones, que pueden ser en el gen usado como diana por el fármaco o mediante mutaciones que, por ejemplo, aumentan la actividad de bombas de eflujo, de tal forma que el fármaco (por ejemplo, antibiótico) se elimina del organismo microbiano. Como alternativa, la resistencia puede adquirirse mediante transferencia génica horizontal, lo que significa que (para antibióticos), los organismos microbianos que son resistentes a un antibiótico concreto intercambian información genética con organismos microbianos (de la misma especie o de otra diferente) que son sensibles a ese antibiótico, haciendo de este modo que el organismo sensible sea resistente).
Un "biofilm", tal como se usa en el presente documento, es un agregado de microrganismos en el que las células se adhieren entre sí y/o a una superficie. Estas células adherentes se incluyen frecuentemente en una matriz producida por ellas mismas compuesta generalmente de ADN extracelular, proteínas y polisacáridos en diversas configuraciones. Los biofilms pueden contener muchos tipos diferentes de microorganismos, por ejemplo, bacterias, arqueas, protozoos, hongos y algas. Sin embargo, también se producen biofilms de una sola especie. Los microorganismos que viven en un biofilm tienen normalmente propiedades significativamente diferentes a las de los microorganismos flotantes (planctónicos) de la misma especie, a consecuencia del ambiente denso y protegido de la película. Por ejemplo, a menudo se observa un aumento de la resistencia a los detergentes y antibióticos, ya que la densa matriz extracelular y la membrana externa de las células protegen al interior de la comunidad. La formación de biofilms es un problema frecuentemente observado en la cirugía de implantes, ya que pueden formarse biofilms sobre las superficies inertes de los dispositivos implantados, tales como catéteres, estents, prótesis de válvulas cardíacas y dispositivos intrauterinos.
La expresión "identidad de secuencia", tal como se usa en el presente documento, se refiere al grado en que las secuencias son, basándose en sus nucleótidos o basándose en sus aminoácidos, idénticas a lo largo de una ventana de comparación. Por lo tanto, se calcula un "porcentaje de identidad de secuencia" comparando dos secuencias alineadas de manera óptima a lo largo de la ventana de comparación, determinando el número de posiciones en las que se produce la base de ácido nucleico idéntica (por ejemplo, A, T, C, G, I) o el resto de aminoácido idéntico (por ejemplo, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gin, Cys y Met) en ambas secuencias para dar el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes entre el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de la ventana) y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia. A efectos de la presente invención, se entenderá que "identidad de secuencia" significa el "porcentaje de coincidencia" calculado mediante el programa informático DNASIS (versión 2.5 para Windows; disponible de Hitachi Software engineering Co., Ltd., South San Francisco, Calif., EE. UU.) usando los valores por defecto, tal como se usan en el manual de referencia que acompaña al programa. "Similitud" se refiere al porcentaje del número de aminoácidos que son idénticos o que constituyen sustituciones conservativas. La similitud puede determinarse usando programas de comparación de secuencia tales como GAP (Deveraux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12, 387-395). De este modo, pueden compararse secuencias de una longitud similar o sustancialmente diferente respecto de las citadas en el presente documento mediante inserción de huecos en el alineamiento, determinándose dichos huecos, por ejemplo, mediante el algoritmo de comparación usado por GAP.
Una "micromatriz", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una matriz en 2D sobre un sustrato sólido. Puede servir como ensayo multiplexado, es decir, medir simultáneamente múltiples analitos (hasta docenas o más) en un solo ensayo. Puede usarse en un dispositivo de laboratorio sobre una placa, que emplea microfluidos. Como sustrato sólido, normalmente se usan portaobjetos de vidrio o geles de lámina fina de silicio, pero también pueden usarse otros materiales (por ejemplo, nitrocelulosa, plásticos, ...). Ya que las moléculas presentadas en el presente documento se unen a proteínas, una micromatriz recubierta con moléculas también puede citarse como una micromatriz de proteínas, micromatriz de unión a proteínas o placa de proteínas. Las micromatrices de proteínas se usan generalmente en aplicaciones biomédicas para determinar la presencia y/o cantidad (citada como cuantificación relativa) de proteínas en muestras biológicas. Típicamente, en las micromatrices descritas en el presente documento, se usan las moléculas de la solicitud como moléculas de captura punteadas o sintetizadas sobre la micromatriz.
Estructura de las moléculas
Estructura general
La presente memoria descriptiva describe moléculas (que incluyen moléculas de acuerdo con los aspectos y realizaciones de la invención) que pueden describirse con la siguiente fórmula:
(X2i-1 -Yi-X2i-Zi)n, en donde n es un número entero de 1 a 5 e i aumenta de 1 a n con cada repetición; y en donde
- cada uno de X2i-1 y X2i se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P; lo más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K y P;
- cada Yi se selecciona independientemente de entre una serie de 4 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos
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un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que está presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E; y
- cada Zi es un enlazador seleccionado independientemente y Zn es un enlazador o está ausente.
Por lo tanto, esta fórmula abarca las siguientes estructuras:
X1-Y1-X2-Z1 (es decir, n=1),
X1-Y1-X2-Z1X3-Y2-X4-Z2 (es decir, n=2),
X1-Y1-X2-Z1-X3-Y2-X4-Z2-X5-Y3-X6-Z3 (es decir, n=3),
X1-Y1-X2-Z1-X3-Y2-X4-Z2-X5-Y3-X6-Z3-X7-Y4-X8-Z4 (es decir, n=4) y
X1-Y1-X2-Z1-X3-Y2-X4-Z2-X5-Y3-X6-Z3-X7-Y4-X8-Z4-X9-Y5-X10-Z5 (es decir, n=5), en donde cada X, Y y Z numerado es como se ha definido anteriormente.
Restos Y: Regiones de agregadón-nudeación
Los restos Yi numerados en estas moléculas son regiones inductoras de agregación beta. Es decir, estas regiones son responsables de inducir la agregación de las moléculas, en particular, cuando se ponen en contacto con una proteína diana. En el presente caso, se explicará con más detalle las restricciones de secuencia de estas regiones.
Los estudios mutacionales de la cinética de agregación de proteínas de longitud completa revelaron correlaciones sencillas entre las propiedades de agregación y fisicoquímicas, tales como la propensión a formar p láminas, hidrofobia y carga. Esto propició el desarrollo de algoritmos informáticos que identifican regiones propensas a la agregación en la secuencia de aminoácidos de una proteína. Uno de estos es el algoritmo Zyggregator de Dobson et al. (Pawar et al., J Mol Biol 350: 379-392 (2005)), que identifica secuencias propensas a la agregación comparando la puntuación de propensión a la agregación de una secuencia de aminoácidos concreta con una propensión media calculada para una serie de secuencias de longitud similar. El algoritmo de mecánica estadística TANGO (Fernandez-Escamilla et al., Nat Biotechnol 22:1302-1306 (2004)), por otro lado, equilibra los parámetros fisicoquímicos mencionados anteriormente, complementados con la asunción de que un aminoácido se encuentra completamente enterrado en el estado agregado: esto significa que se desolvata completamente y se restringe entrópicamente. A partir de una secuencia inicial, TANGO genera una extensa muestra de fragmentos para los que se toman en consideración las propensiones estructurales que compiten, tales como la formación de hélices u horquillas. Después, se equilibran todos los fragmentos en una suma repartida global, que permite la identificación de regiones de secuencia que forman predominantemente agregados. El algoritmo TANGO tiene una precisión de más del 90% para un conjunto de 176 péptidos validados experimentalmente (Fernandez-Escamilla et al., Nat Biotechnol 22:1302-1306 (2004)). De manera importante, tanto el algoritmo Zyggregator como TANGO tienen buen rendimiento para péptidos y proteínas desnaturalizadas.
Para proteínas globulares, una molécula parcialmente plegada puede o bien volverse a plegar en su estado nativo o plegarse mal, dando un estado agregado. Como resultado, ambas reacciones se encuentran en competición y es esencial un conocimiento preciso de la cinética para predecir el resultado final en cuanto al plegamiento o mal plegamiento/agregación. Por lo tanto, en el contexto de la presente invención, es importante identificar secuencias que favorezcan cinéticamente la inducción de la agregación.
Más particularmente, las secuencias son secuencias de agregación beta no amiloides (en ocasiones citadas como secuencias de agregación beta amorfas). La agregación beta amiloide y no amiloide difiere en la estructura de orden mayor, en la cinética de agregación y en las secuencias de proteínas adecuadas para agregación (Rousseau et al., Current Opinion in Structural Biology 16:118-126, 2006). Comparando el espacio de secuencia de p agregación predicho por TANGO o Zyggregator con el espacio de secuencia de la amiloidosis (por ejemplo, procedentes de estudios experimentales, tales como Lopez de la Paz y Serrano, PNAS 101: 87-92, 2004) revela las similitudes, pero también diferentes interesantes entre ambos procesos. De hecho, ya que tanto la formación de amiloide como la p agregación cruzada amorfa requieren composiciones de aminoácidos que sean compatibles con una conformación de cadena p, cabe esperar un solapamiento en el espacio de secuencia. Sin embargo, la estructura de los agregados p cruzados amorfos no está claramente definida y parece que está caracterizada por un alto grado de flexibilidad. Por otro lado, la estructura de las fibras de amiloide es prácticamente cristalina. Como consecuencia, las preferencias de aminoácidos serán mucho más específicas de la posición en una fibra de amiloide que en los agregados p cruzados amorfos. Tomando en consideración el solapamiento en el espacio de secuencia, las realizaciones específicas prevén que la secuencia de agregación beta del al menos un resto Yi sea adecuada al menos para la beta-agregación amorfa. De acuerdo con estas realizaciones, se prevé la beta agregación amorfa y además puede producirse o no la agregación de amiloide - esto no es crucial, en tanto que haya presencia de al menos beta agregación no amiloide.
Debido a sus requisitos conformacionales menos rigurosos, la p agregación es generalmente mucho más rápida que la amiloidosis, aunque también se ha observado una rápida amiloidosis. Ya que normalmente se observan agregados p como precursores en la vía de formación de fibra, la estabilidad de estos agregados precursores tendrá una fuerte influencia en la cinética de la amiloidosis. Las secuencias amilogenicas polares, observadas en las proteínas priónicas de levaduras, tendrán una propensión a la p agregación mucho menor y por lo tanto, serán mucho más favorables para la cinética de la amiloidosis. En resumen, la p agregación cruzada amorfa y la
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amiloidosis pueden producirse en común y la estabilidad y la cinética de ambos procesos se determinará por el grado de cumplimiento de los requisitos estructurales de ambos procesos.
Por lo tanto, para favorecer cinéticamente la inducción de la agregación, es deseable usar no solo secuencias de beta agregación, sino también secuencias de beta agregación no amiloide. Por consiguiente, en realizaciones particulares, la al menos una región Yi no es una secuencia de beta agregación amiloide. De esta manera, puede lograrse una rápida agregación de una proteína diana. En general, las secuencias altamente hidrófobas tienen una fuerte tendencia a formar p agregados cruzados amorfos, pero no forman fibras amiloides, debido a las restricciones estéricas. Por otro lado, las secuencias generalmente más polares tienen más probabilidades de formar fibras de amiloide. Entre estos dos extremos, probablemente se observará un amplio espectro de comportamientos. El algoritmo Tango, en particular, es muy adecuado para identificar secuencias de beta agregación con una alta propensión a la agregación y una baja propensión amiloide. De hecho, el algoritmo ofrece puntuaciones independientes para la propensión amiloide y la propensión a la beta agregación. El algoritmo Tango se ha descrito detalladamente en otras partes (en particular, en Fernandez-Escamilla et al., Nat. Biotechnol. 22:1302-1306, 2004, en concreto, la sección de Métodos en las páginas 1305 y 1306 se incorpora al presente documento específicamente por referencia. Véanse también las notas complementarias 1 y 2 del mismo artículo para detalles adicionales acerca de los métodos y los conjuntos de datos usados para la calibración y prueba del algoritmo TANGO; también puede encontrarse más información de base en el documento WO2007071789). Brevemente, para predecir regiones de auto-asociación de un péptido, TANGO calcula sencillamente la función de partición de la fase- espacio. Para estimar la tendencia a la agregación de una secuencia de aminoácidos particular, se hacen las siguientes suposiciones: (i) en un agregado de beta-lámina ordenado, la principal estructura secundaria es la cadena beta. (ii) las regiones implicadas en el proceso de agregación están completamente enterradas, con los consiguientes costes y ganancias de solvatación completa, entropía completa y optimización de su potencial de enlaces de H (es decir, el número de enlaces de H formados en el agregado está relacionado con el número de grupos donantes que están compensados por los aceptores. Un exceso de donantes o aceptores queda no satisfecho). (iii) las cargas complementarias en la ventana seleccionada establecen interacciones electrostáticas favorables y la carga neta general del péptido dentro pero también fuera de la ventana desfavorece la agregación. Puede tenerse acceso a TANGO a través de la World Wide Web.
Una alta puntuación de Tango en una serie de secuencia corresponde normalmente con una secuencia con alta (y cinéticamente favorable) propensión a la beta-agregación. Por lo tanto, el espacio de secuencia de "secuencias con alta puntuación de Tango" que no son demasiado polares y bastante hidrófobas define los restos Yi ideales (o inductores de beta-agregación, agregación-nucleación).
Las mejores propiedades de agregación se obtienen cuando, en una molécula de acuerdo con la fórmula indicada anteriormente, cada Yi se selecciona independientemente de entre una serie de 4 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que está presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E. (Aunque cabe mencionar que también pueden estar presentes 2 restos de R, K, D, E en caso de que sean uno un resto cargado positivamente y uno cargado negativamente). De acuerdo con realizaciones muy específicas, la región Yi puede contener exactamente 2 restos cargados (seleccionados de entre R, K, D, E), en tanto que la carga neta de la región Yi sea cero. Sin embargo, más particularmente, la región Yi no contiene ningún resto cargado (o para esa materia, prolina).
Según este requisito, al menos un 50% de los aminoácidos en la serie Yi son aminoácidos hidrofóbicos, es decir, son aminoácidos seleccionados de entre I, L, V, F, Y, W, H, M, T, K, A, C y G. De acuerdo con realizaciones particulares adicionales, al menos un 60% de los aminoácidos son aminoácidos hidrofóbicos, al menos un 2/3 de los aminoácidos son aminoácidos hidrofóbicos, al menos un 70% son aminoácidos hidrofóbicos, al menos un 75% son aminoácidos hidrofóbicos, al menos un 80% son aminoácidos hidrofóbicos, al menos un 85% son aminoácidos hidrofóbicos, al menos un 90% son aminoácidos hidrofóbicos, al menos un 95% son aminoácidos hidrofóbicos o incluso todos los aminoácidos son aminoácidos hidrofóbicos. Como alternativa, puede decirse que al menos 3 aminoácidos en la serie Yi son aminoácidos hidrofóbicos, en particular, al menos 4 son aminoácidos hidrofóbicos, más particularmente, al menos 5 son aminoácidos hidrofóbicos, al menos 6 o incluso más de 6 son aminoácidos hidrofóbicos.
Algunos de los aminoácidos hidrofóbicos listados tienen mejores propiedades para inducir beta agregación (lo cual es el motivo por el que hay requisitos adicionales para la secuencia). De acuerdo con realizaciones particulares, los aminoácidos hidrofóbicos no abarcan G (ya que las cadenas laterales son demasiado pequeñas). De acuerdo con otras realizaciones particulares, los aminoácidos hidrofóbicos no abarcan C (ya que esto puede causar complicaciones como resultado de la posible formación de puentes disulfuro). De acuerdo con otras realizaciones particulares más, los aminoácidos hidrofóbicos no abarcan K (en vista de la carga positiva de este resto). De acuerdo con otras realizaciones particulares más, los aminoácidos hidrofóbicos no abarcan H (en vista de la carga parcialmente positiva de este resto). Por consiguiente, las realizaciones específicas prevén que los aminoácidos hidrofóbicos en la serie Yi se seleccionan de entre I, L, V, F, Y, W, M, T y A.
En cada serie Yi, está presente al menos un resto seleccionado de entre I, L, V y F (resto alifático o F), más
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particularmente, está presente más de uno de estos restos. En caso de que solo uno de los restos de la serie Yi sea un resto de I, L, V o F, al menos un resto en la serie se selecciona de entre Y, W, M, T o A. Más particularmente, en estas realizaciones, al menos dos restos se seleccionan de entre Y, W, M, T o A. De acuerdo con realizaciones muy específicas, al menos dos restos en la serie Yi se seleccionan de entre I, L, V, F, Y y W (es decir, de entre restos alifáticos o aromáticos no cargados). De acuerdo con otras realizaciones específicas, al menos tres restos en la serie Yi se seleccionan de entre I, L, V, F, Y, W, M, T y A. De acuerdo con realizaciones específicas adicionales, al menos cuatro restos en la serie Yi se seleccionan de entre I, L, V, F, Y, W, M, T y A. De acuerdo con otras realizaciones específicas, al menos un 40% de los restos en la serie Yi se seleccionan de entre I, L, V, F, Y, W, M, T y A. De acuerdo con realizaciones específicas adicionales, al menos un 50% de los restos en la serie Yi se seleccionan de entre I, L, V, F, Y, W, M, T y A. De acuerdo con otras realizaciones específicas adicionales, al menos un 50% de los restos en la serie Yi se seleccionan de entre I, L, V, F e Y (es decir, son restos alifáticos o F o Y). De acuerdo con otras realizaciones específicas adicionales, al menos un 50% de los restos en la serie Yi se seleccionan de entre I, L, V y F (es decir, son restos alifáticos o de F). De acuerdo con otras realizaciones específicas adicionales más, al menos un 50% de los restos en la serie Yi se seleccionan de entre restos alifáticos, es decir, se seleccionan de entre I, L y V. De acuerdo con realizaciones específicas alternativas, al menos un 60% de los restos en la serie Yi se seleccionan de entre I, L, V, F, Y, W, M, T y A. De acuerdo con otras realizaciones específicas adicionales, al menos un 60% de los restos en la serie Yi se seleccionan de entre I, L, V, F e Y (es decir, son restos alifáticos o F o Y). De acuerdo con otras realizaciones específicas adicionales, al menos un 60% de los restos en la serie Yi se seleccionan de entre I, L, V y F (es decir, son restos alifáticos o de F). De acuerdo con otras realizaciones específicas adicionales más, al menos un 60% de los restos en la serie Yi se seleccionan de entre restos alifáticos, es decir, se seleccionan de entre I, L y V. De acuerdo con otras realizaciones alternativas adicionales, al menos dos tercios de los restos se seleccionan de entre I, L, V, F, Y, W, M, T y A; o se seleccionan particularmente de entre I, L, V, F e Yi o más particularmente, se seleccionan de entre I, L, V y F (es decir, son restos alifáticos o de F); o al menos dos tercios de los restos en la serie Yi son restos alifáticos (es decir, seleccionados de entre I, L y V). Como alternativa, puede decirse que al menos 3 aminoácidos en la serie Yi se seleccionan de entre los restos anteriores, en particular, al menos 4 aminoácidos, más en particular, al menos 5 aminoácidos, al menos 6 o incluso más de 6 aminoácidos. De acuerdo con realizaciones particulares adicionales, al menos 3 aminoácidos en la serie Yi se seleccionan de entre I, L, V o F, en particular, al menos 4 aminoácidos son restos alifáticos o F, más en particular, al menos 5 aminoácidos son restos de I, L, V o F. De acuerdo con otras realizaciones adicionales más, al menos 3 aminoácidos en la serie Yi son restos alifáticos, al menos 4 aminoácidos en la serie Yi son restos alifáticos o al menos 5 aminoácidos en la serie Yi son restos alifáticos.
De acuerdo con otras realizaciones específicas, el número de ciertos restos alifáticos está limitado en la serie Yi. Por ejemplo, en una (es decir, al menos una, hasta cada una) serie Yi, no hay más de un resto de C. De acuerdo con otras realizaciones específicas, no hay más de un resto de H en una serie Yi. De acuerdo con realizaciones alternativas, no hay presente más de uno o dos restos de G en la serie Yi, en particular, no hay presente más de un resto de G. De acuerdo con realizaciones alternativas, no hay presente más de uno o dos restos de T en la serie Yi, en particular, no hay presente más de un resto de T. De acuerdo con realizaciones alternativas, no hay presente más de uno o dos restos de M en la serie Yi, en particular, no hay presente más de un resto de M. De acuerdo con realizaciones alternativas, no hay presente más de uno o dos restos de W en la serie Yi, en particular, no hay presente más de un resto de W. De acuerdo con realizaciones alternativas, no hay presente más de uno o dos restos de A en la serie Yi, en particular, no hay presente más de un resto de A. De acuerdo con realizaciones alternativas, no hay presente más de uno o dos restos de Y en la serie Yi, en particular, no hay presente más de un resto de Y. Obsérvese que, al igual que para otras realizaciones, estas realizaciones no son excluyentes. Es decir, puede aplicarse una combinación de 2 o más de estas restricciones a una serie Yi dada.
Huelga decir que cuando hay presente no más de un cierto número de restos particulares, siempre es posible que ninguno de estos restos particulares esté presente.
Los aminoácidos cargados, así como prolina, reducen normalmente el potencial de beta agregación de una serie Yi dada. Aunque normalmente puede tolerarse un resto cargado o de prolina o dos aminoácidos cargados en caso de que tengan cargas opuestas, de acuerdo con realizaciones particulares, la serie Yi carece de restos de P, R, K, D y E. Como alternativa, la serie contiene no más de un resto de P, R, K, D o E (es decir, no más de un resto seleccionado de entre P, R, K, D y E). De acuerdo con realizaciones muy específicas, la serie puede contener un resto de K, pero ningún resto de P, R, D o E (en vista de la naturaleza hidrófoba de los restos de lisina). De acuerdo con realizaciones particulares, no hay restos de P, R, K, D, E presentes en la región Yi. De acuerdo con realizaciones particulares adicionales, no hay restos de P, R, K, D, E o H presentes en la serie Yi. Esto se debe a que los restos de H pueden estar parcialmente cargados positivamente y generalmente se prefieren regiones Yi neutras.
Se prevé particularmente que al menos una región (y hasta cada una de las regiones) Yi porte una carga máxima de 1 y más particularmente, no porta una carga. Aún más particularmente, se prevé que el número de restos cargados no sea mayor de uno, lo más particularmente, no hay restos cargados presentes en al menos una (y particularmente en cada una de las regiones) Yi.
De acuerdo con otras realizaciones no excluyentes, la serie Yi, incluso cuando no contiene restos cargados, tampoco
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contiene más de un 75% de restos polares no cargados, es decir, restos seleccionados de entre Y, W, T, Q, S, N y H (C no se considera un resto polar en este caso y H no se considera un resto cargado). Más particularmente, no contiene más de un 67% de restos polares no cargados, aún más particularmente, no contiene más de un 60% de restos polares no cargados (o incluso menos de un 60% de restos polares no cargados). En otras palabras, incluso si las series tienen gran cantidad de restos de Y, W o T (que son polares, no cargados e hidrofóbicos), siguen necesitando que haya suficientes restos apolares. De acuerdo con realizaciones particulares adicionales, la serie Yi no contiene más de un 50% de restos polares no cargados. De acuerdo con otras realizaciones particulares adicionales más, la serie Yi no contiene más de un 40% de restos polares no cargados. De acuerdo con otras realizaciones particulares adicionales más, la serie Yi no contiene más de un tercio de restos polares no cargados. De acuerdo con otras realizaciones particulares adicionales más, la serie Yi no contiene más de un 25% de restos polares no cargados.
Puede haber restos no hidrofóbicos, polares no cargados (es decir, S, N y Q) en una región Yi, pero su número es preferentemente limitado. De acuerdo con otras realizaciones específicas, no hay más de un resto de Q. De acuerdo con otras realizaciones específicas, no hay más de un resto de N. De acuerdo con realizaciones alternativas, no hay presente más de uno o dos restos de S en la serie Yi, en particular, no hay presente más de un resto de S.
Puede haber restos no aromáticos, polares no cargados (es decir, S, N, T y Q) en una región Yi, pero se prevé particularmente que no sean adyacentes entre sí (es decir, no hay presentes 2 restos no aromáticos, polares no cargados contiguos).
Tal como resulta evidente a partir de lo anterior, puede ser beneficioso limitar la presencia de restos específicos por motivos particulares. También puede ser beneficioso limitar la suma de grupos de restos. De acuerdo con realizaciones particulares, los restos en una serie Yi no contienen más de un 60% de restos seleccionados de entre C, M, N, Q y W. De acuerdo con realizaciones particulares adicionales, los restos en una serie Yi no contienen más de un 50% de restos seleccionados de entre C, M, N, Q y W. De acuerdo con realizaciones particulares adicionales, los restos en una serie Yi no contienen más de un 40% de restos seleccionados de entre C, M, N, Q y W. De acuerdo con realizaciones particulares adicionales más, los restos en una serie Yi no contienen más de un tercio de los restos seleccionados de entre C, M, N, Q y W. De acuerdo con realizaciones particulares, los restos en una serie Yi no contienen más de un 25% de restos seleccionados de entre C, M, N, Q y W.
De acuerdo con otras realizaciones particulares más, la serie Yi, incluso cuando no contiene restos cargados o prolina, también contiene menos de un 75% de restos pequeños distintos de V (es decir, seleccionados de entre A, T, C, G, S, N), más particularmente, menos de un 67% de restos pequeños distintos de V, aún más particularmente, menos de un 60% de restos pequeños distintos de V. En otras palabras, incluso si las series tienen gran cantidad de restos de T y A, siguen necesitando que haya suficientes restos hidrofóbicos grandes. De acuerdo con otras realizaciones particulares adicionales más, no más de un 50% (pero incluyendo un 50) de los restos en la región Yi son restos pequeños distintos de V. De acuerdo con otras realizaciones particulares adicionales más, no más de un 40% de los restos en la región Yi son restos pequeños distintos de V. De acuerdo con otras realizaciones particulares adicionales más, no más de un tercio (pero incluyendo un 33,33...%) de los restos en la región Yi son restos pequeños distintos de V. De acuerdo con otras realizaciones particulares adicionales más, no más de un 25% de los restos en la región Yi son restos pequeños distintos de V. En particular, se prevé que el número de restos diminutos esté limitado en la serie Yi. Aunque puede considerarse que C es un resto diminuto cuando no está implicado en la formación de puentes disulfuro, se prevé particularmente que los restos diminutos sean restos de A, G y S. De acuerdo con realizaciones particulares, no más de un 50% de los restos en la serie Yi son restos de A, G y S. De acuerdo con realizaciones particulares adicionales, no más de un 40% de los restos en la serie Yi se seleccionan de entre A, G y S. De acuerdo con otras realizaciones particulares adicionales más, no más de un tercio de los restos en la serie Yi se seleccionan de entre A, G y S. De acuerdo con otras realizaciones particulares adicionales más, no más de un 25% de los restos en la serie Yi se seleccionan de entre restos de A, G y S.
Como alternativa o además, el número de restos diminutos puede ser limitado. Esto es particularmente cierto para los restos no polares de A y G. De acuerdo con realizaciones particulares, el número total de restos de A y G en una serie Yi es de no más de 4. De acuerdo con realizaciones particulares adicionales, el número total de restos de A y G en una serie Yi es de no más de 3. De acuerdo con otras realizaciones particulares adicionales más, la suma total de restos de A y G en una serie Yi es de no más de 2. De acuerdo con otras realizaciones particulares adicionales más, la suma total de restos de A y G en una serie Yi es de no más de uno.
Para lograr agregación específica de secuencia, se prevé que los restos Yi seleccionados para inducir la agregación tengan una suficiente complejidad de secuencia. Por esto, se entiende que las secuencias que tienen exceso de un aminoácido particular no son particularmente adecuadas para la agregación específica de secuencia. Por ejemplo, una serie de polileucina normalmente no logrará una agregación específica de secuencia (a pesar de que es suficientemente hidrófoba y podría agregarse). Por lo tanto, de acuerdo con realizaciones particulares, no hay más de 3 aminoácidos contiguos idénticos presentes en una serie Yi. De acuerdo con otras realizaciones aún más particulares, no hay más de 2 aminoácidos contiguos idénticos presentes en una serie Yi. De acuerdo con realizaciones específicas, solo puede haber un aminoácido alifático adyacente al mismo aminoácido en una serie Yi. Es decir, de acuerdo con estas realizaciones, solo puede haber 2 aminoácidos I, L o V contiguos (consecutivos) en una serie Yi. De acuerdo con realizaciones particulares adicionales, no puede haber más de 3 aminoácidos alifáticos
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idénticos consecutivos en una región Yi. De acuerdo con otras realizaciones particulares adicionales más, no puede haber más de 2 aminoácidos alifáticos idénticos consecutivos en una región Yi. Por lo tanto, de acuerdo con estas realizaciones, solo puede haber dos aminoácidos alifáticos idénticos adyacentes entre sí en una serie Yi.
De acuerdo con realizaciones alternativas, pero no excluyentes, ningún aminoácido alifático individual está presente más de 3 veces en una serie Yi (es decir, el número de aminoácidos idénticos para un resto no alifático está limitado a 3 en una serie Yi). De acuerdo con realizaciones particulares adicionales, ningún aminoácido no alifático individual está presente más de 2 veces en una serie Yi. De acuerdo con realizaciones particulares adicionales, ningún aminoácido no alifático individual está presente más de 1 vez en una serie Yi. De acuerdo con realizaciones alternativas, ningún aminoácido alifático individual está presente más de 3 veces en una serie Yi. De acuerdo con realizaciones adicionales, ningún aminoácido alifático individual está presente más de 2 veces en una serie Yi. De acuerdo con otras realizaciones particulares, ningún aminoácido particular forma más del 50% de los restos en una serie Yi (es decir, no más de la mitad de la serie Yi está compuesta por un aminoácido particular). De acuerdo con realizaciones particulares adicionales, ningún aminoácido individual forma más del 40% de los restos en una serie Yi. De acuerdo con otras realizaciones particulares adicionales más, ningún aminoácido forma más de un tercio de los restos en una serie Yi.
De acuerdo con otras realizaciones particulares más, la serie Yi no está compuesta de o incluso no contiene, repeticiones de dos aminoácidos. Por repeticiones de dos aminoácidos se entiende tres o más o incluso dos o más, repeticiones de dos restos no idénticos. De acuerdo con realizaciones particulares adicionales, la serie Yi no está compuesta de o incluso no contiene, repeticiones de tres aminoácidos. Por repeticiones de tres aminoácidos se entiende tres o más o incluso dos o más, repeticiones de tres restos, de los cuales al menos dos no son idénticos. A modo de ejemplo, aunque la isoleucina y el triptófano son perfectamente aceptables en una región Yi, tampoco será particularmente adecuada una región Yi que esté formada exclusivamente por repeticiones de IW o IIW para la agregación específica de secuencia. Obsérvese que la agregación específica de secuencia no se descarta para cualquiera de estas secuencias, pero se prefiere el uso de secuencias más complejas para lograr la agregación específica.
La longitud de la serie agregante normalmente está compensada entre la especificidad deseada y el coste y la facilidad de síntesis de secuencias hidrófobas. Tal como se muestra en la figura 2, no es necesario que las secuencias sean muy largas para que sean únicas dentro del genoma de un organismo dado. Por ejemplo, un 60% de las secuencias con una longitud de 5 aminoácidos que están presentes en las proteínas son únicas en seres humanos (es decir, solo el 40% de dichas secuencias aparecen más de una vez). Para organismos con genomas menos complejos, tales como E. coli, más de un 80% de las secuencias de 5 aminoácidos codificadas por el genoma son únicas. A partir de la figura, puede observarse que el aumento de la especificidad se nivela, por lo que rara vez es necesario usar secuencias muy largas para lograr especificidad. La memoria descriptiva describe la región Yi que contiene al menos 5 restos. De acuerdo con realizaciones particulares, la región Yi contiene al menos 6 restos. De acuerdo con otras realizaciones particulares no excluyentes, la región Yi contiene como máximo 12 restos. De acuerdo con otras realizaciones adicionales, la región Yi contiene como máximo 11 restos. De acuerdo con otras realizaciones específicas adicionales, la región Yi contiene como máximo 10 restos.
En algunos casos, puede ser deseable trabajar con secuencias que no sean únicas en un organismo dado. Este es el caso, por ejemplo, en aplicaciones dirigidas contra patógenos (no propios), donde es más importante la inhibición del crecimiento y/o la eliminación del organismo patógeno que el uso como diana de solamente una proteína específica. Tal como puede verse a partir de la figura, las series beta agregantes serán normalmente más cortas en estas realizaciones, de tal forma que puede dirigirse a más proteínas.
Para evitar una extensión no necesaria de la serie Yi, de acuerdo con realizaciones particulares, se prevé que el resto N y/o C-terminal de la serie Yi sea un resto que sea particularmente susceptible a la p-agregación, en particular, un resto seleccionado de entre I, L, V, F, Y, W, A, M y T. De acuerdo con realizaciones particulares adicionales, el resto N y/o C-terminal (es decir, al menos uno seleccionado de entre el resto N y C-terminal o el primer y/o el último resto) de una serie Yi se selecciona de entre I, L, V, F, Y y W.
De acuerdo con realizaciones particulares adicionales, el resto N y/o C-terminal de una serie Yi se selecciona de entre I, L, V, F e Y. De acuerdo con otras realizaciones particulares adicionales más, el resto N y/o C-terminal de una serie Yi se selecciona de entre I, L, V y F. De acuerdo con otras realizaciones particulares adicionales más, el resto N y/o C-terminal de una serie Yi se selecciona de entre I, L y V (es decir, es un resto alifático). De acuerdo con realizaciones particulares adicionales, estas limitaciónes se aplican al resto tanto N como C-terminal de la serie Yi.
Ya que un objetivo es proporcionar moléculas que sean capaces de regular a la baja de manera específica a proteínas, en particular, de una manera específica de secuencia, se describen particularmente aquellas moléculas donde al menos una de Yi en la molécula es una serie de 4 a 17 (en particular, de 4 a 16 o de 4 a 15) o de acuerdo con aspectos o realizaciones de la invención, una serie de 6 a 16, aminoácidos que es idéntica a una serie contigua de origen natural en una proteína. Puede decirse que esta serie contigua en la proteína es la región afín del resto Yi. De acuerdo con aspectos específicos adicionales, esta es la causa para más de un Yi en la molécula, en particular, para dos Yi o al menos dos Yi en la molécula, lo más particularmente, para todos los Yi en la molécula. De acuerdo con realizaciones muy específicas, sin embargo, Yi no es idéntico a una serie de origen natural en una proteína. Esto se prevé, por ejemplo, para proteínas con un marcador artificial, donde Yi es idéntica a una secuencia en el marcador artificial. Dichos marcadores pueden ser útiles, ya que el diseño de secuencias artificiales permite más
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libertad a la hora de determinar la propensión a la agregación de la secuencia. De esta manera, se hace factible dirigirse a proteínas que no tienen una región de agregación central evidente.
Ya que al menos una serie Yi confiere especificidad, se prevé particularmente en algunas realizaciones que esta serie no corresponda a (una parte de) una serie repetitiva de uno o dos aminoácidos (por ejemplo, una serie de polileucina o de leucinas y valinas alternas). Este es el caso, particularmente, para aquellas realizaciones donde n=1. De acuerdo con realizaciones particulares adicionales, la serie Yi contiene al menos 3 aminoácidos diferentes en su secuencia.
Sin embargo, de acuerdo con realizaciones particulares, al menos una Yi es idéntica a una serie contigua de origen natural en una proteína, mientras que al menos una Yi distinta en la misma molécula no es idéntica a una serie en una proteína en el organismo en cuyo genoma se codifica la proteína diana. La última Yi es normalmente una secuencia "potenciadora", es decir, una secuencia que se sabe que tiene una elevada tendencia a la agregación. Esta secuencia puede mejorar la cinética de agregación o asegurar que se produzca/se inicie la agregación de la proteína diana a concentraciones menores. Dichas secuencias pueden ser sintéticas o pueden proceder de una secuencia (es decir, idéntica o altamente similar a una serie de secuencia) presente en otro organismo/especie.
En caso de que se prevea el uso como diana específica de una proteína, la al menos una serie de 4 a 15 o de acuerdo con aspectos o realizaciones de la invención, la al menos una serie de 6 a 16, aminoácidos contiguos de origen natural en una proteína debe ser única para dicha proteína en el organismo (o especie) en cuyo genoma se codifica la proteína (es decir, debe ser única en el proteoma de dicho organismo/especie), para asegurarse de que, de hecho, solo se usa como diana una proteína en el organismo. Esta unicidad normalmente solo es necesaria en un genoma específico (es decir, el genoma del organismo en donde está presente la proteína que se va a regular a la baja). De hecho, en caso de que la secuencia esté presente en otro organismo al que no se administra el interferidor (o en el que este no puede alcanzar su diana), esto carece de importancia. Esto se aplica también en los casos donde carece de importancia que se sea diana una proteína en un organismo diferente, normalmente un microorganismo u organismo patógeno.
En ocasiones, en particular cuando la diana son patógenos o se tratan o estabilizan infecciones, se prevé que puede usarse como diana más de una proteína. En estos casos, la secuencia de proteína no es necesariamente única en el genoma del organismo. Sin embargo, puede seguir siendo única para el organismo o especie. Esto puede preverse cuando las moléculas descritas en el presente documento se administren a más de una especie diferente de manera simultánea (por ejemplo, una mezcla de microorganismos), mientras que solo se necesita regular a la baja una especie de proteína (por ejemplo, para una especie patógena diana, mientras que no se interfiere con organismos no patógenos o beneficiosos. Obsérvese que esto también se aplica, por ejemplo, cuando se administra, por ejemplo, una molécula interferidora que usa como diana una proteína antimicrobiana a un sujeto humano: en dichos casos, la secuencia del resto Yi no debe ser idéntica a la de una proteína humana o al menos no idéntica a una proteína humana con la que pueda entrar en contacto el interferidor). De acuerdo con realizaciones particulares adicionales, la secuencia es única para la proteína y única para el organismo/especie.
En lugar de especie, las consideraciones anteriores también se aplican a un género, una familia, un orden o una clase de organismos, aunque la probabilidad de conservación de secuencia y de hallar una secuencia única, se reduce a medida que aumenta la clasificación taxonómica.
Los al menos dos restos Yi presentes (en realizaciones donde n es al menos dos) pueden ser idénticos (es decir, se dirigen a las mismas proteínas, en ocasiones citados en el presente documento como "péptidos de repetición en tándem"), pueden ser diferentes pero estar presentes en la misma proteína (se dirigen a la misma proteína de diferentes maneras, es decir, interferidores "biagretópicos", en donde se usan como diana dos "agretopos" o regiones de agregación), pueden ser diferentes y estar presentes en diferentes proteínas (para usar como diana más de una proteína en un organismo (es decir, auténticos interferidores específicos) o para dirigirse a proteínas en diferentes organismos, en caso de que el interferidor se administre o se ponga en contacto con más de un (micro)organismo). Obsérvese que la "administración a un organismo" puede ser administración indirecta. Por ejemplo, en el caso de patógenos, se prevé que el interferidor se administre al organismo hospedador (normalmente un sujeto, ya sea un sujeto vegetal o animal) para que se dirija al organismo patógeno. Ya que en estos casos la molécula interferidora contendrá al menos una secuencia de agregación presente en el organismo patógeno y tiene como objetivo agregar la proteína en la que está presente esta secuencia, será evidente para el experto en la materia que esto ha de interpretarse como "administrar la molécula al organismo patógeno" - a este respecto, lo que cuenta es la puesta en contacto (alcanzar la diana).
En general, para lograr un direccionamiento específico, se prevé una coincidencia perfecta entre la región Yi y la serie de secuencia en la proteína de interés. Sin embargo, en algunos casos, se prevé que puedan usarse secuencias no idénticas, pero estrechamente relacionadas, es decir, secuencias que tienen una o dos sustituciones. A fin de mantener la especificidad, la memoria descriptiva describe que para sustituciones no conservativas, para las series Yi de menos de 6 aminoácidos, solo se tolere una diferencia de aminoácidos. Para secuencias de al menos 6 aminoácidos (en particular, al menos 7 o al menos 8 aminoácidos), pueden sustituirse uno o dos aminoácidos. De acuerdo con aspectos o realizaciones de la invención, Yi es una serie idéntica a o que difiere en no más de una
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sustitución de aminoácidos respecto de una serie contigua de aminoácidos que aparece en una proteína de interés. Como alternativa, la memoria descriptiva describe que la identidad de secuencia entre la Yi y la serie agregante en la proteína de interés es de al menos el 70%, al menos el 75%, en particular, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90% o incluso mayor. En caso de sustituciones conservativas, la similitud de secuencia entre la Yi y la serie agregante en la proteína de interés es de al menos el 70%, al menos el 75%, en particular, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90% o incluso mayor.
Tal como será evidente para un experto en la materia, la realización de una sustitución (en particular, no conservativa) puede dar como resultado una especificidad alterada (es decir, hacer idéntica la serie a una de otra proteína en el organismo o a una de una proteína en otro organismo con el que el interferidor puede entrar en contacto), por lo que debe comprobarse si esto sucede en caso de que no se desee un direccionamiento alterado. (En algunos casos, puede ser deseable dirigirse de manera específica a más de una proteína, véase también más adelante).
Una sustitución conservativa es la sustitución de aminoácidos por otros aminoácidos cuyas cadenas laterales tienen propiedades bioquímicas similares (por ejemplo, son alifáticos, son aromáticos, tienen carga positiva, ...) tal como es de sobra conocido por un experto en la materia. Por lo tanto, una sustitución no conservativa es la sustitución de aminoácidos por otros aminoácidos cuyas cadenas laterales no tengan propiedades bioquímicas similares (por ejemplo, reemplazo de un resto hidrofóbico por uno polar). Las sustituciones conservativas normalmente proporcionarán secuencias que dejan de ser idénticas, pero que siguen siendo altamente similares.
Los motivos para introducir una sustitución pueden variar. De acuerdo con realizaciones particulares, la sustitución es con un resto constitutivo, en particular, con uno seleccionado de entre R, K, E, D, P, N, S, A, H, G, Q, más particularmente seleccionado de entre R, K, E, D y P, lo más particularmente seleccionado de entre restos de R, K y P. Esto puede preverse para mejorar la solubilidad o reducir la auto-agregación (mediante la "ruptura" del potencial de formación de beta-lámina de la región Yi hidrófoba) o para reducir la especificidad a la vez que se mantiene la agregación (esto se ilustra en el ejemplo 3). Aunque dichas sustituciones reducen generalmente la especificidad, en algunas realizaciones, puede preverse que proporcione un más fácil acceso a la secuencia inductora de la agregación (mediante la "apertura" de la región hidrófoba). Este es el caso, en particular, para realizaciones donde se favorece la agregación frente a la especificidad (por ejemplo, en aplicaciones antimicrobianas).
De acuerdo con realizaciones alternativas, la sustitución es una sustitución conservativa. Esto se prevé cuando se prevé regular a la baja una familia de proteínas y las proteínas comparten un motivo de secuencia conservado, pero no idéntico. En dichos casos, puede lograrse la agregación de estas proteínas estrechamente relacionadas usando un motivo de secuencia consenso (es decir, una secuencia similar pero ni idéntica, donde "similar" se usa en el contexto del alineamiento de secuencias). Sin embargo, es posible que la agregación sea menos eficaz cuando la coincidencia de secuencias no sea del 100%.
Otro motivo para considerar la sustitución es para aumentar la propensión inherente a la agregación de la secuencia. Por ejemplo, se puede considerar el reemplazo de un resto particular por un resto con una mayor propensión a beta- láminas o un mayor potencial de agregación. Esta no es necesariamente una sustitución conservativa. Los métodos para determinar la propensión a beta-láminas o el potencial de agregación se conocen bien en la técnica. A modo de ejemplo, la propensión a formar beta-láminas de un resto particular puede determinarse tomando en consideración los parámetros de Chou-Fasman (Chen et al., BMC Bioinformatics 7 (Supl 4): S14, 2006). Se puede reemplazar uno o más restos con una puntuación P(b-lámina) menor de 100 por restos con una puntuación P(b-lámina) > 100. Los restos con alta puntuación de beta-lámina en el método de Chou-Fasman son (en orden descendente): valina, isoleucina, tirosina, fenilalanina, triptófano, leucina, treonina, cisteína, glutamina y metionina. En particular, se prevé la sustitución con valina o isoleucina para aumentar el potencial de formación de beta-láminas. Obviamente, siempre ha de comprobarse la especificidad y de nuevo en este caso, se prevé particularmente la sustitución para aplicaciones donde se favorece la agregación frente a la especificidad.
En caso de que el resto Yi necesite ser idéntico a una serie que se produzca en una proteína, las secuencias inductoras de la agregación específicas pueden identificarse a la vista de la secuencia de proteína (usando las orientaciones anteriores) o usando algoritmos específicos para identificar series de secuencia que cumplen estos requisitos. Usando el mismo u otros métodos o algoritmos, puede comprobarse si la secuencia también se produce en otras proteínas (o está codificada en genomas de otros organismos).
Una forma particularmente fácil de identificar dichas secuencias en una proteína es mediante el uso en primer lugar de un algoritmo de predicción de la beta-agregación (preferentemente uno que tenga en cuenta parámetros biofísicos) y seleccionando las secuencias más adecuadas basándose en las limitaciónes de secuencia anteriores. Como ejemplos de dichos algoritmos ya se citaron Tango y Zyggregator, pero se han descrito en la técnica muchos más, incluyendo, pero sin limitación, los descritos por Bryan et al., PLoS Comput Biol. 5(3):e1000333, 2009; Caflish, Curr Opin Chem Biol. 10(5):437-44, 2006; Conchillo-Sole et al., BMC Bioinformatics 8:65, 2007; Galzitskaya et al., PLoS Comput Biol. 29;2(12):e177, 2006; Goldschmidt et al., PNAS 107(8):3487-92, 2010; Maurer-Stroh et al., Nat Methods 7(3):237-42, 2010; Rojas Quijano et al., Biochemistry 45(14):4638-52, 2006; Saiki et al., Biochem Biophys Res Commun 343(4):1262-71, 2006; Sanchez de Groot et al., BMC Struct Biol 5:18, 2005; Tartaglia et al., Protein
Sci. 14(10):2723-34, 2005; Tartaglia et al., J Mol Biol. 380(2):425-36, 2008; Thompson et al., PNAS 103(11):4074-8, 2006; Trovato et al., Protein Eng Des Sel. 20(10):521-3, 2007; Yoon y Welsh, Protein Sci. 13(8):2149-60, 2004; Zibaee et al., Protein Sci. 16(5):906-18, 2007. Obsérvese que muchos de estos están implicados principalmente en secuencias de agregación de amiloide y no solo con la beta-agregación amorfa. Tal como se ha explicado 5 anteriormente, el espacio de secuencia de ambas formas de agregación se solapa (Rousseau et al., Current Opinion in Structural Biology 16:118-126, 2006) y se prevén ambas formas de agregación, en tanto que la cinética y las condiciones de la reacción favorezcan la agregación de la proteína de interés. Sin embargo, normalmente, dichos algoritmos también pueden identificar series polares (tales como aquellas presentes en proteínas priónicas de levadura) que no satisfacen las limitaciónes de secuencia de Yi definidas en el presente documento.
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Restos X2-1 y X2: Restos constitutivos
En las moléculas interferidoras descritas en el presente documento, las secuencias inductoras de agregación están flanqueadas en ambos lados por 1 a 4 aminoácidos específicos (los restos Xi) que tienen un bajo potencial de beta- agregación. Estos se citan en ocasiones como restos constitutivos (Pedersen et al., J Mol Biol 341: 575-588, 2004), y son esenciales para prevenir la auto-agregación de las moléculas interferidoras (en particular, antes de entrar en contacto con una proteína diana).
En el estado nativo de las proteínas, la agregación normalmente se contiene u opone mediante restos cargados de origen natural pero también, por ejemplo, mediante prolinas y glicinas en los flancos de los segmento de secuencia de agregación. Estos actúan de manera eficaz como restos constitutivos, es decir, restos que no necesariamente estabilizan el estado nativo, pero que bloquean la formación de estados mal plegados o agregados no deseados mediante, por ejemplo, choques estéricos o electrostáticos. También se ha comunicado en varias ocasiones que la introducción de restos cargados, prolinas o glicinas en secuencias propensas a la agregación reduce la agregación. Las propiedades de oposición a la agregación de la prolina y la glicina se deben principalmente a sus propiedades de ruptura de la estructura. También son muy eficaces restos con carga idéntica para oponerse a la agregación, debido a la enorme fuerza de repulsión generada tras el auto-ensamblaje. Curiosamente, en la naturaleza, se prefieren arginina y lisina frente a glutamato y aspartato en los flancos que las secuencias con fuerte agregación (Rousseau et al., J Mol Biol 355:1037-1047, 2006). El motivo para esta preferencia puede ser que, además de la carga, la arginina y la lisina también tienen una entropía conformacional mucho mayor, haciendo que sea muy costoso inmovilizarlas en agregados densamente empaquetados.
En la solicitud WO2007071789, se afirmó que dichos restos constitutivos reducen la propensión a la agregación. Para optimizar la co-agregación de los interferidores con una proteína diana dada, la región de auto-asociación de la proteína diana que se incluye en el interferidor puede mutarse, de tal forma que los restos constitutivos se reemplazan por restos promotores de la agregación. En otras palabras, se consideró no deseable la presencia de restos constitutivos.
Ahora, se ha demostrado sorprendentemente que, para las regiones de fuerte beta-agregación que forman los restos Yi, flanquearlos con restos constitutivos (es decir, los dos restos X numerados) de hecho reduce su propensión a la auto-agregación, pero no interfiere sustancialmente con su capacidad para inducir la agregación de la proteína de longitud completa. Por un lado, es sorprendente que a pesar de la alta hidrofobia y la propensión intrínseca a la agregación, estas moléculas se mantienen en solución; por otro, el efecto de los restos constitutivos proporcionados en las moléculas no impide la co-agregación de la proteína (de longitud completa) con la molécula. Esta combinación única de características hace que las moléculas proporcionadas en el presente documento sean particularmente adecuadas para lograr la agregación inducida de proteínas.
Estos restos constitutivos se seleccionan en particular de entre restos de R, K, E, D, P, N, S, H, G y Q. También podrían usarse restos de alanina, pero ya que estos también pueden estar en los restos Yi, se prevé particularmente que un resto X, tal como se usa en el presente documento, no esté solo compuesto de restos de A. De manera más específica, se prevé que solo se usen restos de A como restos constitutivos en caso de que otra parte del resto X sea al menos un resto seleccionado de entre R, K, P, D o E.
Obsérvese que, con la excepción de G y P, estos son todos restos polares. Los restos de G y P son buenos restos constitutivos debido a su estructura específica de la cadena lateral (prolina) o a la ausencia de la misma (glicina). Aunque S, H, N y Q son restos polares, pueden tolerarse en una serie beta-agregante en bajos números (véase lo anterior). Se aplica una consideración similar para los restos de G.
De acuerdo con realizaciones particulares, los restos en los restos flanqueantes X son restos que no están presentes en el resto Yi entre estos restos flanqueantes.
En estos casos, los restos X son normalmente de 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D, P y H. Más en particular, son de 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P. Aún más en particular, se seleccionan de entre R, D y P. Obsérvese que P se mantiene en esta selección de restos constitutivos ya que es un rompedor muy eficaz de la estructura de beta-lámina. Sin embargo, de acuerdo con realizaciones particulares, especialmente donde n es 1, no se prevé que P sea un resto constitutivo.
Normalmente, son suficientes uno o dos aminoácidos para romper la beta-lámina y mantener las moléculas en solución. Los restos X más cortos son beneficiosos en términos de facilitad y coste de síntesis, mientras que son eficaces en su función "constitutiva", es decir, en demarcar y/o presentar los restos Y hidrofóbicos. Por consiguiente, en algunas realizaciones particulares, cada X2M y X2i es de 1 o 2 aminoácidos (que pueden seleccionarse independientemente entre sí).
De manera similar, los péptidos que están limitados en cuanto a su carga pueden facilitar la interacción con proteínas de interés: mientras que siguen proporcionado la posibilidad de enlaces de H, se reduce el riesgo de repulsión electrostática. Por lo tanto, de acuerdo con realizaciones alternativas, pero no excluyentes, cada X2M y X2i tiene una carga total de no más de 2. Como alternativa, el número total de aminoácidos en ambos restos X es de 5 o menor, particularmente de 4 o menor. Algunas realizaciones alternativas prevén que la carga total de ambos restos X que rodean a la región Y hidrófoba sea menor de 5, particularmente de 4 o menor. Las realizaciones en este párrafo se prevén más particularmente para moléculas donde n es 1 o moléculas donde n es dos.
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Ya que se prevé en particular que los restos Yi no contengan restos cargados, la carga total de las moléculas normalmente no será mayor de 5 cuando n es 1 y no mayor de 10 cuando n es 2. Para moléculas donde n es 2, se prevé particularmente que la carga total de la molécula sea entre 2 y 10, más en particular entre 2 y 8, más en particular entre 4 y 8, aún más en particular, entre 2 y 6 (por ejemplo, 3, 4, 5), entre 4 y 6, tal como 4, 5 o 6. Se prevé particularmente que la carga esté distribuida de una manera más o menos uniforme por toda la molécula, es decir, todos los restos X tienen una carga similar (dicho de otro modo: la diferencia de carga entre los restos X contenidos en una molécula es, en particular, de no más de uno). De acuerdo con realizaciones específicas, la molécula no es neutra, es decir, contiene cierta carga. Esto se debe a que los restos cargados normalmente ayudarán a obtener especificidad, es decir, a hacer que el resto Yi de las moléculas interactúe solamente con series de polipéptido casi completamente idénticas o completamente idénticas. Además, la carga puede ayudar a prevenir la auto-asociación y la agregación prematura de las moléculas (es decir, sin co-agregación de la diana). Por lo tanto, en realizaciones específicas, al menos uno y hasta cada uno de los restos X numerados tiene una carga de 1 o 2. Para que sea económico, los restos X están formados predominantemente o exclusivamente de restos con carga idéntica dentro del resto. Es posible que un resto X2-1 tenga una carga con signo distinto a la del resto X2i correspondiente.
De acuerdo con realizaciones particulares, los X2-1 y X2i que rodean a una región Yi son idénticos. De acuerdo con realizaciones adicionales, cada uno de los X2M en la molécula es idéntico a cada uno de los X2i. De acuerdo con otras realizaciones adicionales, todos los X2M y X2i en la molécula son idénticos. De acuerdo con otras realizaciones específicas, los restos de al menos uno, y en particular todos los X2-1 imitan a modo de espejo el orden de secuencia de los restos en el X2i correspondiente. Es decir, en caso de que los restos constitutivos de X2M sean, por ejemplo, N-P (es decir, un aminoácido de asparagina N-terminal de un aminoácido de prolina), los restos en X2i son P-N (la asparagina C-terminal del resto de prolina).
De acuerdo con realizaciones alternativas, la carga de al menos uno y en particular de todos, X2M tiene el mismo signo que su X2i correspondiente. De acuerdo con realizaciones específicas adicionales, la carga de al menos uno y en particular de todos, X2-1 es idéntica a la del X2i correspondiente. Los restos con carga idéntica se oponen con más fuerza a la agregación mediante auto-asociación. De acuerdo con otras realizaciones, la carga de todos los restos X en la molécula es neutra o tiene el mismo signo. Esto puede ayudar a prevenir la atracción electrostática entre las moléculas.
De acuerdo con algunas realizaciones muy específicas, al menos una parte de al menos un resto X que flanquea a la región Yi también está presente en la proteína de interés. De hecho, las secuencias hidrófobas en las proteínas normalmente están flanqueadas por restos constitutivos, para prevenir la agregación. De acuerdo con realizaciones específicas donde al menos una Yi es idéntica a una secuencia de origen natural en una proteína, al menos un resto constitutivo que flanquea a la Yi en los restos X de las moléculas es idéntico a un resto constitutivo que se produce en la proteína. Este es el caso particularmente en los casos donde la secuencia Yi corresponde a la secuencia completa entre los restos constitutivos en la proteína, de tal forma que la secuencia de la molécula corresponde a la secuencia de la proteína para al menos una serie Yi y al menos parte de al menos una serie X adyacente a la serie Yi. Esto se aplica también, en particular, para proteínas donde los restos constitutivos naturalmente flanqueantes no son tan fuertes, es decir, son restos que también pueden formar parte de una serie Yi, tales como, por ejemplo, N o S. Por lo tanto, la secuencia de la molécula y la proteína de interés es correspondiente a lo largo de una región contigua de al menos un aminoácido más largo que la serie Yi de la molécula (es decir, al menos un resto constitutivo flanqueante de la secuencia agregante en la proteína está incluido en la molécula).
De acuerdo con realizaciones particulares alternativas, se prevé que los restos constitutivos faciliten o estabilicen la interacción del resto Yi con su región afín en la proteína. Este puede ser el caso cuando los restos que flanquean la región de agregación en la proteína (en el lado N y/o C-terminal) portan una carga. Para reducir las probabilidades de repulsión por cargas similares y de este modo maximizar las probabilidades de interacción, la carga de los restos constitutivos X2i-1 y/o X2i puede seleccionarse para que sea complementario a la carga de la secuencia flanqueante en la proteína. Para ilustrar esto con un ejemplo, la proteína calcineurina en levaduras (véase el ejemplo 1.5) tiene dos regiones inductoras de la agregación que están flanqueadas por restos cargados en la secuencia de proteína. Las dos regiones de proteína son como sigue: NKLR FAFNIY DIDRD (SEQ ID NO: 100), y GNGE LFIVM KMMV (SEQ ID NO: 101) (se muestran las dos regiones de agregación (subrayadas) con 4 o 5 restos flanqueantes en N o C-terminal a las mismas). NKLR (SEQ ID NO: 102) tiene dos aminoácidos cargados positivamente, mientras que la carga neta de DIDRD (SEQ ID NO: 103) es menos 2 (tres restos de D cargados negativamente, 1 resto de R positivo). Por lo tanto, para las realizaciones donde los restos constitutivos tienen cargas complementarias, el resto X en el extremo N-terminal de FAFNIY (SEQ ID NO: 104) debe estar cargado negativamente, mientras que el resto X en el lado C-terminal debe estar cargado positivamente. Para la secuencia LFIVM (SEQ ID NO: 105), se aplica lo contrario: esta está flanqueada en la proteína calcineurina por una carga negativa en su lado N-terminal y por un resto de K positivo en su extremo carboxilo terminal. Por lo tanto, las moléculas con restos constitutivos complementarios tienen una carga positiva en el extremo N-terminal y una carga negativa en el otro extremo. En el ejemplo 1.5, este es el caso para las construcciones 6 y 7.
Tal como resulta evidente a partir del ejemplo DIDRD (SEQ ID NO: 103), puede haber cargas opuestas presentes en regiones flanqueantes. Para determinar la carga neta, normalmente se toman en consideración no más de 7 aminoácidos que flanquean la secuencia, preferentemente incluso menos, tal como 5, 4 o 3. Por lo tanto, la carga
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neta es la suma de la carga de los restos en esta serie. Los restos inmediatamente adyacentes a la serie inductora de la agregación tienen normalmente una contribución más importante a la carga real. Por lo tanto, por ejemplo, en caso de que un resto cargado positivamente flanquee inmediatamente a la secuencia de agregación, mientras que un resto negativo se encuentre, por ejemplo, a cuatro aminoácidos de distancia cadena arriba o abajo, entonces el flanco puede considerarse cargado positivamente en lugar de ser neutro, ya que el efecto de la carga procedente del resto inmediatamente adyacente será mucho más fuerte. De acuerdo con realizaciones más particulares, solo se toma en consideración el resto que flanquea inmediatamente la secuencia propensa a la agregación para determinar la carga de la secuencia natural.
Restos Z: Enlazadores
Tal como se ha indicado en la fórmula anterior, las moléculas descritas en el presente documento también contienen restos enlazadores, Zi. De acuerdo con realizaciones particulares, las moléculas solo contienen enlazadores internos y ningún enlazador N o C-terminal (recuérdese: la fórmula (X2¡-1 -Y ¡-X2i-Zi)n tal como se usa en el presente documento es equivalente a la fórmula (Xa-i-Yi-Xa-Z^n, en donde cada Z2 a Zn es un enlazador y Zi se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada). En otras palabras, las moléculas tienen restos constitutivos (es decir, los restos X) en ambos de sus extremos N y C-terminales. Esto corresponde a moléculas de la siguiente fórmula: (X2¡-i-Yi-X2Í)n en donde n, i, X2¡-i y X2¡ e Yi son como se han definido anteriormente, en donde los restos están condensados entre sí mediante el uso de restos enlazadores opcionales. Ya que puede usarse un enlazador externo (N y/o C-terminal) para, por ejemplo, fusionar otros restos a las moléculas, esto también puede escribirse como Zo-(X2i-i-Yi-X2i-Z¡)n, siendo X2Í-1 y X2Í, Y¡, i y n como se han definido anteriormente, en donde Zo es un resto enlazador N-terminal opcional, Zi a Zn-i es un enlazador y Zn es un resto enlazador C-terminal opcional.
Por lo tanto, en realizaciones específicas, Zn es nada (o es un enlazador de cero unidades enlazadoras).
La naturaleza de los restos enlazadores no es vital para la invención, aunque normalmente no se usan enlazadores flexibles largos. De acuerdo con realizaciones particulares, cada Z¡ se selecciona independientemente de entre una serie de entre 0 y 20 unidades idénticas o no idénticas, en donde una unidad es un aminoácido, un monosacárido, un nucleótido o un monómero. Las unidades no idénticas pueden ser unidades no idénticas de la misma naturaleza (por ejemplo, aminoácidos diferentes o algunos copolímeros). También pueden ser unidades no idénticas de una naturaleza diferente, por ejemplo, un enlazador con unidades de aminoácidos y nucleótidos o un heteropolímero (copolímero) que comprende dos o más especies monoméricas diferentes. De acuerdo con realizaciones particulares, la longitud de al menos uno y particularmente cada uno de Z¡ distinto de Zn, es de al menos i unidad. De acuerdo con otras realizaciones particulares, Zn es 0 unidades. De acuerdo con realizaciones particulares, todos los enlazadores Z¡ distintos de Zn son idénticos. De acuerdo con realizaciones adicionales, todos los restos Z¡ son idénticos.
Los aminoácidos, monosacáridos y nucleótidos y monómeros tienen el mismo significado que en la técnica. Obsérvese que algunos ejemplos particulares de monómeros incluyen miméticos de monómeros naturales, por ejemplo, aminoácidos no proteinogénicos o de origen no natural (por ejemplo, carnitina, GABA y L-DOpA, hidroxiprolina y selenometionina), monómeros de ácidos nucleicos peptídicos y similares. Algunos ejemplos de otros monómeros adecuados incluyen, pero sin limitación, óxido de etileno, cloruro de vinilo, isopreno, ácido láctico, olefinas, tales como etileno, propileno, amidas que se encuentran en polímeros (por ejemplo, acrilamida), monómeros de acrilonitrilo-butadieno-estireno, acetato de etilenvinilo y otras moléculas orgánicas que son capaces de formar polímeros.
De acuerdo con realizaciones alternativas, las unidades enlazadoras son enlazadores químicos, tales como los generados mediante acoplamiento de carbodiimida. Algunos ejemplos de carbodiimidas adecuadas incluyen, pero sin limitación, i-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC), N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIC) y diciclohexilcarbodiimida (DCC). Otro enlazador químico particularmente previsto es el ácido 4,7,i0-trioxatridecano- succínico (también denominado en ocasiones ácido 4,7,i0-trioxatridecano-succinámico) o Ttds.
De acuerdo con realizaciones específicas, al menos uno y particularmente todos los Z¡ tienen entre 0 y i0 unidades de la misma naturaleza, en particular, entre 0 y 5 unidades de la misma naturaleza. En caso de que los enlazadores sean flexibles, se prevé particularmente el uso de enlazadores cortos. El uso de enlazadores cortos impide que dos series Y¡ de la misma molécula se plieguen sobre sí mismas, ya que esto podría hacerlas menos accesibles para las proteínas de interés. Además, al asegurarse de que las diferentes series Y¡ de una molécula no puedan interactuar entre sí, se aumenta la solubilidad de la molécula. De acuerdo con realizaciones particulares, los enlazadores son tan cortos que no permiten el plegamiento de las series Y¡ de manera antiparalela. Por ejemplo, para aminoácidos, se necesitan al menos tres o cuatro aminoácidos para formar un giro completo, por lo que se prevén particularmente enlazadores de no más de cuatro o de no más de tres aminoácidos. Esto también depende de la naturaleza de los aminoácidos, por lo que se prevé particularmente el uso de aminoácidos que no tienen una propensión estructural concreta o una propensión a una estructura retorcida, tales como G, S y P. De acuerdo con realizaciones particulares, al menos un resto Z¡ y en particular, todos los restos Z¡ a excepción de Zn, es un enlazador peptídico o polipeptídico. Algunas secuencias particularmente previstas de dichos enlazadores incluyen, pero sin limitación, PPP, PP o GS. Para restos Zi que están formados por aminoácidos, se puede tener en cuenta la estructura primaria
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(por ejemplo, en la secuencia del enlazador se incluyen muchos aminoácidos sin una inclinación por cualquier estructura particular), pero también la estructura secundaria o la terciaria. Por ejemplo, se puede elegir aminoácidos que no forman una estructura secundaria particular o que forman una hélice alfa (lineal). O, pueden seleccionarse aminoácidos de tal forma que no forman una estructura terciaria estable, ya que esto podría ocasionar que los restos Yi quedasen inaccesibles. Los enlazadores de aminoácidos pueden formar un bucle al azar. Otro enlazador particularmente previsto es polietilenglicol (PEG), es decir, un oligómero o polímero de grupos monoméricos de óxido de etileno. Normalmente los oligómeros de PEG se abrevian, mientras que se indica el número de unidades monoméricas, por ejemplo, PEG2, PEG3 o (PEG)4. De acuerdo con realizaciones particulares, al menos un resto Zi es un oligómero de PEG (PEG, de manera abreviada). De acuerdo con realizaciones particulares adicionales, todos los restos Zi son restos de PEG. De acuerdo con otras realizaciones alternativas, al menos un resto Zi y en particular, todos los restos Zi a excepción de Zn, es un enlazador de PEG.
El enlazador es preferentemente corto, para prevenir interacciones antiparalelas de los restos Yi de la misma molécula. Sin embargo, obsérvese que en muchos casos, no se favorece la formación de una beta lámina antiparalela, a pesar de que la longitud del enlazador haría que esto fuese posible. Por ejemplo, para moléculas donde Yi tiene la misma secuencia que la siguiente Yi (es decir, Yi+1) y esta secuencia no es simétrica, no se formará beta-lámina. Para dichas moléculas, el enlazador debe ser lo suficientemente corto como para impedir el plegamiento de las series Yi de manera paralela - la longitud de dichos enlazadores depende de la longitud de la serie Yi y la cantidad de unidades necesarias para formar dos giros de horquilla (es decir, longitud mínima necesaria para permitir que las Yi se dispongan en paralelo). Cabe destacar que, esto se aplica a enlazadores flexibles que permiten el plegamiento de las moléculas. En caso de poder asegurarse de que los enlazadores sean rígidos y de que las diferentes regiones Yi de una molécula no puedan ponerse en contacto entre sí (es decir, que no puedan interactuar entre sí), la longitud del enlazador no es realmente importante. En dichos casos, puede ser de más de 20 unidades, aunque por motivos prácticos, la longitud normalmente se limitará.
Un ejemplo particular donde se favorece el uso de enlazadores largos frente a otros enlazadores son los casos donde se usan como diana al menos dos proteínas diferentes, en particular, dos proteínas diferentes en el mismo organismo (es decir, los restos Yi corresponden a regiones inductoras de la agregación de más de una proteína). Para asegurarse de que la molécula pueda interactuar (por ejemplo, simultáneamente) con más de una proteína, puede ser beneficioso aumentar la distancia entre los diferentes restos Yi de direccionamiento, de tal forma que no se previene la interacción causada por impedancia estérica. En estos casos, el enlazador Zi puede ser una serie de entre 0 y 100 unidades idénticas o no idénticas, en donde una unidad es un aminoácido, un monosacárido, un nucleótido o un monómero; o de entre 0 y 90, 0 y 80, 0 y 70, 0 y 60, 0 y 50, 0 y 40, 0 y 30 o 0 y 20. En particular, la longitud mínima del enlazador Zi es de al menos 1 unidad, al menos 2 unidades, al menos 3 unidades, al menos 4 unidades o al menos 5 unidades.
Cuando se usan enlazadores más largos, preferentemente no son idénticos a secuencias de las proteínas de las que procede al menos una región Yi. De acuerdo con realizaciones muy particulares, un enlazador de más de 20 unidades no es un enlazador peptídico, es decir, las unidades no son aminoácidos. De acuerdo con realizaciones alternativas, los enlazadores más largos pueden ser enlazadores peptídicos, pero los enlazadores peptídicos contienen motivos repetidos (por ejemplo, enlazadores GS, GGS, PP u otros enlazadores que contienen repeticiones de uno, dos o tres aminoácidos). En particular, el enlazador está esencialmente libre de estructura secundaria de polipéptido, por ejemplo, de series de alfa hélice o beta lámina. Cualquier predisposición del enlazador polipeptídico hacia un motivo de estructura secundaria de polipéptido limitará necesariamente el grado de libertad espacial disfrutado por los extremos del enlazador.
Observaciones generales acerca de la estructura de la molécula
Ya que hasta la fecha se han descrito miles de péptidos en la técnica, es posible que ya se hayan descrito en la técnica algunas moléculas con una estructura peptídica que se asemeje a la fórmula general (con un fin distinto), en particular, aquellas donde n es 1 (aunque hasta donde alcanza el conocimiento de los presentes inventores, no es el caso). Esto es por lo que se prevé que el ámbito de la reivindicación de producto referida a las moléculas, en particular, cuando n es 1, sea diferente al ámbito de los usos y métodos en los que pueden aplicarse estas moléculas. Por consiguiente, la memoria descriptiva describe que cuando n es 1, se prevé que los restos X se seleccionen de manera más restrictiva (por ejemplo, solo entre R, K, E, D, P; o, por ejemplo, excluyendo K, véase lo anterior), que los restos X sean más cortos (por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos) y que no existan de exclusivamente restos de K, que los restos Y sean más cortos (por ejemplo, una longitud no mayor de 13, 11 o 10 aminoácidos), se seleccionen de entre un intervalo de diferentes longitudes (por ejemplo, de 5 a 12 aminoácidos o de 5 a 10 aminoácidos) o se seleccionen de un modo más riguroso (por ejemplo, ausencia de restos específicos, tales como P, R, K, D, E, por ejemplo, más de un 60% hidrofóbicos, ...) que en caso de que n sea al menos dos.
Las moléculas descritas particularmente son aquellas con la siguiente estructura: X1-Y1-X2-Z1 (es decir, n es 1), en donde X1 y X2 tienen en total no más de 5 aminoácidos; Y1 es una serie de entre 4 y 10 aminoácidos y Z1 es una serie de 0 unidades; y X1-Y1-X2-Z1-X3-Y2-X4-Z2 (es decir, n es 2), en donde Z1 es un enlazador y Z2 es nada.
Las combinaciones de limitaciónes que se prevén para realizaciones donde n=1 incluyen:
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- Xi y X2 son iguales entre sí y tienen 1 o 2 aminoácidos seleccionados de entre R,, K, E, D y P; y
- Y1 es una serie de 6 a 10 aminoácidos contiguos, de los que al menos 3 son hidrofóbicos, en la que no hay restos de P, R, K, D, E o H presentes, en la que la suma total de restos de C, M, N, Q y W es de no más de 1, de los cuales, menos de un 60% son aminoácidos pequeños distintos de V (es decir, seleccionados de entre A, C, G, S, P, N, T, D), en la que hay presentes no más de 2 aminoácidos idénticos consecutivos, en la que ningún resto no alifático está presente más de dos veces y en la que el primer y el último resto son alifáticos o se seleccionan de entre F, Y, W, A, M y T.
Otra combinación particular, donde n = 1, es
- X1 y X2 son 1 o 2 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P; y
- Y1 es una serie de 6 a 11 aminoácidos contiguos, de los cuales, al menos un 75% son aminoácidos hidrofóbicos, en la que al menos un 50% de los aminoácidos son restos alifáticos o de F, en la que no hay restos de P, R, K, D, E o H presentes, en la que no hay más de un resto de C, M, N, Q, W, G, S, A o T presente, en la que no hay más de 3 restos de Y o F presentes, en la que no hay más de dos restos no alifáticos idénticos contiguos presentes (es decir, no hay presentes 2 restos contiguos de Y o F, o únicamente I, L y V pueden ser restos contiguos idénticos) y no hay presentes más de 2 restos alifáticos idénticos contiguos, - en la que no hay más de dos restos polares no aromáticos (es decir, seleccionados de entre s, N, T y Q) consecutivos presentes, en donde no hay más de un 50% de restos idénticos presentes, en donde el 1er y/o el último resto es un resto alifático o de F, en donde la suma de restos de A y G no es mayor de 2, en donde el porcentaje total de restos de A, G y S es de no más del 25%, en donde el porcentaje total de restos de C, M, N, Q y W es de no más del 25% y en donde el porcentaje total de restos pequeños distintos de V (es decir, seleccionados de entre A, C, G, S, N, T) es de no más del 25%.
De acuerdo con algunas realizaciones particulares, Z1 no está presente (es decir, Z1 es cero unidades). De acuerdo con otras realizaciones, Z1 también está presente y puede ser N o C-terminal.
Cabe destacar que, aunque se prevén particularmente estas combinaciones y de hecho, describen un espacio de secuencia de compuestos que funcionan bien, estas limitaciónes pretenden asegurar principalmente que no hay solapamiento entre los compuestos reivindicados en el presente documento y lo que se ha descrito en la técnica anterior. También puede darse el caso de que estas limitaciónes sean demasiado rigurosas o que algunas sean demasiado rigurosas y otras no lo suficientemente rigurosas. Por lo tanto, se prevé que puede variarse uno cualquiera de estos criterios de acuerdo con los límites descritos anteriormente para los restos individuales y/o que puedan omitirse algunos de los criterios o reemplazarse por otras limitaciónes y/o que puedan añadirse otras limitaciónes.
Otros restos
La molécula puede comprender además (o puede estar además fusionada a) otros restos. Para todos los restos, no es vital para la invención la naturaleza de la fusión o del enlazador, en tanto que el resto y la molécula agregadora puedan ejercer su función específica. De acuerdo con realizaciones particulares, los restos que están fusionados a las moléculas pueden escindirse (por ejemplo, usando un resto enlazador que tiene un sitio de reconocimiento por proteasas). De esta manera, pueden separarse la función del resto y de la molécula, lo que puede ser particularmente interesante para restos más grandes o para realizaciones donde el resto deja de ser necesario transcurrido punto de tiempo específico (por ejemplo, un marcador que se escinde después de una etapa de separación usando el marcador).
Se prevé particularmente que la molécula comprende además un marcador detectable. El marcador detectable puede encontrarse en N o C-terminal o incluso puede estar fusionado a la molécula (por ejemplo, a través del enlazador o el enlazador puede usarse como marcador detectable). Como alternativa, el marcador detectable puede referirse al uso de uno o más aminoácidos marcados en uno o más de los restos X-Y-Z de la molécula (por ejemplo, aminoácidos marcados fluorescente o radiactivamente).
Obsérvese que, para realizaciones donde está presente Zn, el marcador detectable puede fusionarse al resto enlazador Zn. (Aunque esta notación implicaría que el marcador se añada al extremo C-terminal, también se prevén marcadores N-terminales - esto corresponde a la notación equivalente de (Zi-Xa-1-Yi-X2i)n, en donde cada Z2 a Zn es un enlazador y Z1 es el enlazador al que se fusiona el marcador).
Sin embargo, ya que la naturaleza del enlazador al que se fusiona el marcador detectable puede diferir significativamente de la usada en la molécula, en particular respecto de las restricciones de longitud, puede ser preferible referirse a las moléculas marcadas de este modo como moléculas donde el resto Zn está ausente y donde se fusiona un marcador detectable a la molécula usando un enlazador separado. De hecho, los enlazadores usados para añadir el marcador a las moléculas pueden ser tanto largo como flexible. Sin embargo, el modo real de acoplamiento del marcador detectable a las moléculas no es vital para la invención y normalmente dependerá de la naturaleza del marcador usado y/o del propósito del marcaje (que puede determinar la proximidad requerida). Obsérvese que, en principio, puede usarse cualquier marcador conocido para moléculas de naturaleza proteica, en
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tanto que el marcador pueda detectarse. Los marcadores particularmente previstos incluyen, pero sin limitación, marcadores, marcadores fluorescentes, sustratos enzimáticos, enzimas, puntos cuánticos, nanopartículas que pueden ser (para)magnéticas, radiomarcadores, marcadores ópticos y similares.
Al igual que con otros restos, ya que las moléculas tienen dos extremos, se prevé que las moléculas se fusionarán a otro resto (por ejemplo, un marcador) tanto en su extremo N como en su extremo C-terminal. Estos dos marcadores pueden ser idénticos (proporcionando una señal más fuerte) o diferentes (para diferentes fines de la detección). Los restos, tales como marcadores, pueden fusionarse a través de los enlazadores Z0 y/o Zn o mediante enlazadores largos.
De acuerdo con realizaciones particulares, el marcador detectable no es GFP o biotina. De acuerdo con otras realizaciones particulares, el marcador detectable puede ser biotina o GFP.
De acuerdo con otras realizaciones particulares, las moléculas pueden fusionarse a otros restos, por ejemplo, para prolongar su semivida in vivo. Aparte de aumentar la estabilidad, dichos restos también pueden aumentar la solubilidad de la molécula a la que están fusionados. Aunque la presencia de restos constitutivos (los restos X numerados) es, en principio, suficiente para impedir la agregación prematura de las moléculas y las mantienen en solución, la adición complementaria de un resto que aumenta la solubilidad (es decir, previene la agregación) puede proporcionar un manejo más fácil de las moléculas y en particular, mejora la estabilidad y la vida útil. Un ejemplo de sobra conocido de dicho resto es PEG (polietilenglicol). Esto se prevé particularmente, ya que puede usarse como enlazador y como resto solubilizante. Otros ejemplos incluyen péptidos y proteínas o dominios de proteínas o incluso proteínas completas (por ejemplo, GFP). A este respecto, cabe destacar que, al igual que PEG, un resto puede tener diferentes funciones o efectos. Por ejemplo, un marcador flag (secuencia, DYKDDDDK (SEQ ID NO: 106)) es un resto peptídico que puede usarse como marcador, pero debido a su densidad de carga, también potenciará la solubilización. Ya se ha demostrado en numerosas ocasiones que la PEGilación aumenta la solubilidad de agentes biofarmacéuticos (por ejemplo, Veronese y Mero, BioDrugs. 2008; 22(5):315-29). La adición de un péptido, polipéptido, proteína o marcador de dominio de proteína a una molécula de interés se ha descrito exhaustivamente en la técnica. Algunos ejemplos incluyen, pero sin limitación, péptidos derivados de sinucleína (por ejemplo, Park et al., Protein Eng. Des. Sel. 2004; 17:251-260), SET (marcador potenciador de la solubilidad, Zhang et al., Protein Expr Purif2004; 36:207-216), tiorredoxina (TRX), glutatión-S-transferasa (GST), proteína de unión a maltosa (MBP), sustancia de utilización de N (NusA), modificador similar a ubiquitina pequeño (SUMO), ubiquitina (Ub), enlace disulfuro C (DsbC), proteína de diecisiete kilodalton (Skp), fragmento de proteína cinasa de fago T7 (T7PK), dominio B1 de proteína G, dominio de repetición ZZ de IgG de proteína A y dominios de unión a inmunoglobulina bacterianos (Hutt et al., J Biol Chem; 287(7):4462-9, 2012). La naturaleza del marcador dependerá de la aplicación, tal como puede determinarse por la persona experta. Por ejemplo, para la expresión transgénica de las moléculas descritas en el presente documento, puede preverse fusionar las moléculas a un dominio mayor, para prevenir la degradación prematura por la maquinaria celular. Otras aplicaciones pueden prever la fusión a un marcador de solubilización más pequeño (por ejemplo, menos de 30 aminoácidos o menos de 20 aminoácidos o incluso menos de 10 aminoácidos) para no alterar demasiado las propiedades de las moléculas.
Aparte de prolongar la semivida, las moléculas pueden fusionarse a restos que alteran otras propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas adicionales. Por ejemplo, se sabe que la fusión con albúmina (por ejemplo, albúmina sérica humana), el dominio de unión a albúmina o un péptido de unión a albúmina sintético mejora la farmacocinética y la farmacodinámica de diferentes proteínas terapéuticas (Langenheim y Chen, Endocrinol.; 203(3):375-87, 2009). Otro resto que suele usarse es un fragmento de región cristalizable (Fc) de un anticuerpo. La naturaleza de estos restos no es vital para la invención y puede determinarse por el experto en la materia dependiendo de la aplicación.
De acuerdo con realizaciones particulares, las moléculas no se fusionan a una perla de agarosa, una perla de látex, una perla de celulosa, una perla magnética, una perla de sílice, una perla de poliacrilamida, una microesfera, una perla de vidrio o cualquier soporte sólido (por ejemplo, poliestireno, plástico, membrana de nitrocelulosa, vidrio) o la proteína NusA. (Obsérvese, sin embargo, que estas fusiones son posibles y en realizaciones específicas, también se prevén).
Otros restos que también se prevén en combinación con las moléculas descritas en el presente documento son restos de direccionamiento. Por ejemplo, las moléculas pueden fusionarse a, por ejemplo, un anticuerpo, un péptido o una molécula pequeña con especificidad por una diana dada y la molécula inicia la agregación en el sitio de la diana (en este caso, las regiones Yi tendrán una secuencia idéntica a una presente en la misma proteína diana u otra diferente o la secuencia será una con una alta propensión a la agregación). Esto es similar a la estrategia que se indica en el documento WO2008148751. En la página 3 (a partir de la línea 26) y la página 4 (terminando en la línea 34) del documento WO2008148751 se describe una lista exhaustiva de los demás restos diana (también denominados "regiones de unión" o "dominios de unión" en el documento WO2008148751) que pueden combinarse con las moléculas de la invención: la expresión "región de unión" o "dominio de unión" se refiere normalmente a una molécula que interactúa con la proteína diana. En ciertos casos, un dominio de unión es un compuesto químico (por ejemplo, un compuesto pequeño con afinidad por al menos una proteína diana) y en otros casos concretos, un dominio de unión es un polipéptido, en otros casos concretos, un dominio de unión es un dominio de proteína. Un
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dominio de unión de proteína es un elemento de estructura general de proteína que se estabiliza por sí mismo y a menudo se pliega de manera independientemente del resto de la cadena de proteína. Los dominios de unión varían en cuanto a su longitud, de entre aproximadamente 25 aminoácidos hasta 500 aminoácidos y más. Muchos dominios de unión pueden clasificarse en pliegues y son estructuras en 3-D reconocibles e identificables. Algunos pliegues son tan comunes en muchas proteínas distintas que se les otorgan nombres especiales. Algunos ejemplos no limitantes son pliegues de Rossman, barriles TIM, repeticiones armadillo, cremalleras de leucina, dominios de cadherina, dominios efectores de muerte, dominios similares a inmunoglobulina, dominio de unión a fosfotirosina, dominio de homología de plecstrina, dominio 2 de homología con src, el dominio BRCT de BRCA1, dominios de unión a proteína G, el dominio de homología Eps 15 (EH) y el dominio de unión a proteína de p53. Los anticuerpos son el prototipo natural de proteínas de unión específica con especificidad mediada a través de las regiones de bucle hipervariable, las denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR). Aunque en general, se ha demostrado que los armazones de anticuerpo funcionan bien como moléculas de unión específicas, se ha evidenciado que no es obligatorio ceñirse al paradigma de un armazón rígido que presente bucles similares a las CDR. Además de anticuerpos, muchas otras proteínas naturales median interacciones específicas de alta afinidad entre dominios. Las alternativas a las inmunoglobulinas han proporcionado puntos de partida atractivos para el diseño de nuevas moléculas de unión (reconocimiento). El término armazón, tal como se usa en la presente invención, se refiere a una cadena principal de proteína que porta aminoácidos alterados o inserciones de secuencia que confieren unión a proteínas diana específicas. El diseño por ingeniería de armazones y el diseño de bibliotecas son procesos mutuamente interdependientes. Para obtener moléculas de unión específicas, ha de generare una biblioteca combinatoria del armazón. Esto se efectúa normalmente a nivel de ADN aleatorizando los codones en posiciones de aminoácidos adecuadas, usando codones o trinucleótidos degenerados. En la actualidad se usan para la presentación en bibliotecas combinatorias una gran variedad de diferentes armazones no de inmunoglobulina con orígenes y características muy diversos. Algunos de estos son comparables en cuanto a su tamaño a un scFv de un anticuerpo (aproximadamente 30kDa), aunque en su mayoría son mucho más pequeños. Los armazones modulares basados en proteínas de repetición varían en cuanto a su tamaño dependiendo del número de unidades repetitivas. Una lista no limitante de ejemplos comprende moléculas de unión basadas en el 10° dominio de fibronectina de tipo II, moléculas de unión basadas en lipocalinas, moléculas de unión basadas en dominios SH3, moléculas de unión basadas en miembros de la familia de knottina, moléculas de unión basadas en CTLA-4, receptores de linfocitos T, neocarcinostatina, módulo 4-2 de unión a carbohidratos, tendamistat, inhibidores de dominio kunitz, dominios PDZ, dominio de homología a Src (SH2), toxinas de escorpión, defensina A de insecto, proteínas de dedo de homeodominio de plantas, enzima TEM-1 beta-lactamasa bacteriana, dominio de unión a Ig de proteína A de Staphylococcus aureus, proteína de inmunidad colicina E7 de E. coli, citocromo b562 de E. coli, dominios de repetición de anquirina. También se incluyen como dominios de unión compuestos con especificidad por una proteína diana dada, moléculas de unión peptídicas cíclicas y lineales, aptámeros peptídicos, proteínas de avímero multivalentes o fármacos inmunofarmacéuticos modulares pequeños, ligandos con especificidad por un receptor o un co-receptor, compañeros de unión a proteína identificados en un análisis de dos híbridos, dominios de unión basados en la especificidad de la interacción de alta afinidad de biotina-avidina, dominios de unión basados en la especificidad de las proteínas de unión a ciclofilina-FK506. También se incluyen lectinas con afinidad por una estructura de carbohidrato específica.
Cabe destacar que, para aquellas realizaciones donde las moléculas se fusionan a un resto de direccionamiento, se prevé específicamente que al menos uno, pero hasta cada uno de los restos Yi sean una secuencia sintética, más particularmente, una secuencia que no esté presente en una proteína del organismo al que se administra la molécula. De hecho, en dichos casos, puede preverse la nucleación de la agregación in situ (tras alcanzar la proteína diana) mediante la agregación nucleada de las moléculas interferidoras fusionadas al resto de direccionamiento.
Sin embargo, obsérvese que los restos de direccionamiento no son necesarios, ya que las moléculas son en sí mismas capaces de hallar su diana mediante reconocimiento específico de secuencia. Por lo tanto, de acuerdo con realizaciones alternativas, las moléculas pueden usarse de manera eficaz como resto de direccionamiento y pueden fusionarse además a otros restos, tales como fármacos, toxinas o moléculas pequeñas. Al dirigir las moléculas a proteínas específicas (por ejemplo, proteínas que se producen únicamente en un tipo celular o un compartimento celular particular), estos compuestos pueden dirigirse al tipo/compartimento celular especifico. Por lo tanto, por ejemplo, pueden suministrarse toxinas de manera selectiva a células de cáncer o pueden suministrarse fármacos en el citoplasma.
De acuerdo con otras realizaciones alternativas, las moléculas pueden comprender además una secuencia que media la penetración en la célula (o la traslocación celular), es decir, las moléculas se modifican adicionalmente mediante el acoplamiento recombinante o sintético de una secuencia de penetración en células. La molécula interferidora (por ejemplo, en forma de un polipéptido) puede además fusionarse o acoplarse químicamente a una secuencia que facilita la transducción de las proteínas de fusión o acopladas químicamente al interior de células procariotas o eucariotas. Las secuencias de péptidos de penetración en células (CPP) o de dominios de transducción de proteínas (PTD) se conocen bien en la técnica e incluyen, pero in limitación, la proteína TAT del VIH, una secuencia de poliarginina, penetratina y pep-1. Otros péptidos permeables a la membrana comúnmente usados (péptidos tanto naturales como artificiales) se divulgan, por ejemplo, en Sawant y Torchilin, Mol Biosyst. 6(4):628-40, 2010; Noguchi et al., Cell Transplant. 19(6):649-54, 2010 y Lindgren y Langel, Methods Mol Biol. 683:3-
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Para CPP, lo típico es su carga, por lo que es posible que algunas moléculas cargadas descritas en el presente documento no necesiten un CPP para entrar en una célula. De hecho, tal como se demostrará en los ejemplos, es posible dirigirse a péptidos de señal o a regiones intracelulares, que requieren que las moléculas sean captadas por la célula y esto se produce sin fusión a un CPP.
En estos casos donde se fusionan otros restos a las moléculas, se prevé en realizaciones particulares que estos restos pueden eliminarse de la molécula. Típicamente, esto se efectuará incorporando un sitio de escisión de proteasas específico o una estrategia equivalente. Este es particularmente el caso donde el resto es una proteína grande: en dichos casos, el resto puede escindirse antes de usar la molécula en cualquiera de los métodos descritos en el presente documento (por ejemplo, durante la purificación de las moléculas). El sitio de escisión puede incorporarse por separado o puede ser una parte integral del enlazador Zn externo (o un enlazador Z1 externo en caso de que el resto sea N-terminal). De acuerdo con realizaciones muy específicas, el resto puede formar parte de un enlazador Zi interno o puede ser incluso el enlazador Zi completo. A modo de ejemplo, una molécula con n=2 podría tener la siguiente estructura: X1-Y1-X2-Z1-X3-Y2-X4, en donde Z1 (en su totalidad o en parte) es una secuencia de hexahistidina: por lo tanto, esta es tanto el enlazador como la secuencia de detección. Aunque es posible, en estos casos normalmente no se incorporará un sitio de escisión, ya que esto podría ocasionar la escisión de la molécula en sí. Obsérvese que, de acuerdo con las realizaciones donde el resto adicional está fusionado de manera interna, solo se prevén como restos de solubilización secuencias no proteicas (por ejemplo, PEG) o peptídicas con una longitud limitada (menos de 30, 20 o 10 aminoácidos, véase lo anterior). De lo contrario, el dominio de proteína podría interferir con la inducción de la agregación.
De acuerdo con realizaciones específicas, la longitud total de las moléculas descritas en el presente documento no supera los 50 aminoácidos. Más particularmente, la longitud no supera los 40 aminoácidos, 30 aminoácidos, 25 aminoácidos o incluso 20 aminoácidos. De acuerdo con realizaciones específicas adicionales donde las moléculas se fusionan a restos adicionales, la limitación de la longitud solo se aplica a la parte (X2M -Yi-X2i-Zi)n de la molécula total (y por lo tanto, por ejemplo, no al marcador). Por lo tanto, en caso de que se haya incorporado un sitio de escisión en la molécula, la restricción de longitud se aplica normalmente a la longitud después de la escisión.
Para moléculas que son completamente proteicas, se prevé que puedan proporcionarse en forma de ácidos nucleicos, por ejemplo, en forma de un vector recombinante que incluye una secuencia que codifica al menos una molécula descrita en el presente documento.
Aplicaciones particulares de las moléculas
De acuerdo con un aspecto adicional, las moléculas descritas en el presente documento pueden usarse para regular a la baja o inhibir la función de una proteína. Típicamente, esto se logra induciendo la agregación de dicha proteína. La presente memoria descriptiva describe métodos para regular a la baja la función de una proteína que comprenden poner en contacto dicha proteína con una molécula de la siguiente estructura: (X2i-1 -Yi-X2i-Zi)n, en donde:
- n es un número entero de 1 a 5 e i aumenta de 1 a n con cada repetición;
- cada uno de X2M y X2i se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P; lo más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K y P;
- cada Yi se selecciona independientemente de entre una serie de 4 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que esté presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E y en donde al menos un Yi es una serie de origen natural en una proteína; y
- cada Zi es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada.
Más particularmente, la memoria descriptiva describe que cuando n es 1, Y1 puede ser una serie de 4 a 11 aminoácidos contiguos. De acuerdo con estos ejemplos, Z1 puede ser nada (es decir, una serie de 0 unidades) o un enlazador distinto de un enlazador de aminoácidos o cualquier enlazador previsto en el presente documento (es decir, no se aplican limitaciónes adicionales a Z1).
Para las moléculas, se aplican las mismas consideraciones y limitaciónes anteriores. En particular, cabe destacar que, en tanto que se logre la regulación a la baja de la función, pueden tolerarse una o dos sustituciones en la Yi que se produce en la proteína, tal como se ha descrito anteriormente. Típicamente, sin embargo, Yi será idéntico.
Las moléculas pueden usarse en una gran variedad de campos, incluyendo biotecnología blanca (o biotecnología industrial), biotecnología roja o médica, biotecnología verde o agrícola, biotecnología azul (o acuática). También pueden usarse para inhibir proteínas, así como para detectar proteínas y esto en todos estos campos. Tal como se verá, las aplicaciones en las que se administran las moléculas a un sujeto muestran similitudes significativas en los
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campos, es decir, en aplicaciones tanto médicas (sujetos animales) como agrícolas (sujetos vegetales), puede hacerse una subdivisión para aplicaciones infecciosas y no infecciosas.
Aplicaciones médicas para los interferidores
Existen dos campos amplios de aplicaciones médicas para las moléculas descritas en el presente documento, a saber, enfermedades infecciosas y enfermedades no infecciosas. La gran diferencia entre las aplicaciones es que, en situaciones de enfermedades infecciosas, la molécula interferidora se dirigirá normalmente a al menos una proteína del patógeno (o los patógenos) que causa(n) la infección, mientras que normalmente se administra a un sujeto cuyo proteoma no sea la diana (es decir, la serie Yi corresponde a una en el proteoma de un patógeno, pero no se produce en el proteoma del sujeto con la infección). Sin embargo, también se prevé el direccionamiento directo al patógeno (por ejemplo, cuando se tratan infecciones con ectoparásitos).
En los trastornos no infecciosos, la molécula interferidora se dirigirá normalmente a al menos una proteína presente en el sujeto al que se administra el interferidor.
Se aplica la misma consideración (administración a un organismo y presencia en el proteoma de la serie Yi en dicho organismo) de enfermedad no infecciosa e infecciosa para la aplicación de interferidores en plantas, pero estas normalmente no se consideran aplicaciones médicas. Por lo tanto, aunque pueden ponerse en prácticas métodos similares en plantas (véase más adelante), los métodos descritos en esta sección se consideran métodos médicos, ya que normalmente implican un sujeto animal en lugar de un sujeto vegetal.
De acuerdo con realizaciones particulares adicionales, estos métodos se proporcionan para regular a la baja una proteína en una situación de enfermedad o para efectuar un diagnóstico. La memoria descriptiva describe una molécula de la siguiente estructura: (X2i-1-Y¡-X2i-Zi)n, en donde:
- n es 1 a 5 e i aumenta de 1 a n con cada repetición;
- cada uno de X2¡-i y X2¡ se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P; lo más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, D y P;
- cada Y¡ se selecciona independientemente de entre una serie de 4 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos
un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de
que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que esté presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E y en donde al menos un Y¡ es una serie de origen natural en una proteína; y
- cada Z¡ es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada;
en donde si n es 1, Y1 es una serie de 4 a 11 aminoácidos contiguos (y de acuerdo con realizaciones particulares adicionales, Z1 no es un enlazador de aminoácidos); para su uso como medicamento o en diagnósticos.
Tal como se usa en el presente documento, los métodos y usos son a menudo intercambiables, es decir, una molécula para su uso como medicamento o una molécula para su uso en el tratamiento de una enfermedad específica equivale a un método para tratar la enfermedad que comprende el uso de (por ejemplo, la puesta en contacto con) la molécula.
De acuerdo con realizaciones particulares, en caso de que la molécula se use como medicamento o agente diagnóstico, se prevé que se usen como moléculas exógenas que se administran y no como transgén. Esto también se aplica para moléculas no usadas como medicamento. De acuerdo con realizaciones alternativas, las moléculas pueden administrarse como transgén, así como una molécula exógena.
En caso de que las moléculas se administren como transgenes (es decir, como ácidos nucleicos que codifican las moléculas), huelga decir que las moléculas interferidoras de acuerdo con estas realizaciones son de naturaleza completamente polipeptídica, ya que es necesario que puedan codificarse. Es decir, todos los restos X, Y y Z presentes en las moléculas interferidoras son de naturaleza polipeptídica. Las aplicaciones médicas en las que se prevé el suministro transgénico incluyen, pero sin limitación, métodos de terapia génica (por ejemplo, usando lentivirus) o aplicaciones en células madre.
Por lo tanto, la presente memoria descriptiva describe una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula que tiene la siguiente estructura:
(X2i-1-Y¡-X2i-Z¡)n, en donde n es un número entero de 1 a 5 e i aumenta de 1 a n con cada repetición; y en donde
- cada uno de X2Í-1 y X2¡ se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P; lo más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, D y P;
- cada Y¡ se selecciona independientemente de entre una serie de 4 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de
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que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que está presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E; y
- cada Zi es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada.
Se prevé particularmente que las secuencias de ácido nucleico codifiquen las moléculas con todas las limitaciónes y variaciones descritas en el presente documento, mutatis mutandis. Por lo tanto, el polipéptido codificado es esencialmente como se ha descrito en el presente documento, es decir, las variaciones mencionadas para las moléculas interferidoras que sean compatibles con este aspecto también se prevén como variaciones para los polipéptidos codificados por las secuencias de ácido nucleico. A modo de ejemplo, las realizaciones que especifican la secuencia o la longitud de los restos X o Y son compatibles con estar codificadas en ácidos nucleicos, las realizaciones en donde el resto Z es de naturaleza no aminoacídica no lo son.
De acuerdo con realizaciones específicas, la secuencia de polipéptido codificada es un polipéptido de origen no natural. De acuerdo con realizaciones particulares adicionales, la secuencia de ácido nucleico es un gen artificial. Ya que el aspecto del ácido nucleico es particularmente adecuado en aplicaciones que emplean expresión transgénica, las realizaciones particularmente previstas son aquellas donde la secuencia de ácido nucleico (o el gen artificial) se fusiona a otro resto, en particular, un resto que aumenta la solubilidad y/o la estabilidad del producto génico. De hecho, en ocasiones, la expresión transgénica de péptidos puede ser difícil, debido a la rápida degradación del producto.
Cabe destacar que todos los métodos y usos que implican las moléculas de la solicitud también abarcan, por tanto, métodos y usos donde las moléculas se proporcionan en forma de la secuencia de ácido nucleico que las codifica y las moléculas se expresan a partir de la secuencia de ácido nucleico.
La memoria descriptiva también describe vectores recombinantes que comprenden dicha secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula como se ha descrito en el presente documento. Estos vectores recombinantes son idealmente adecuados como vehículos para portar la secuencia de ácido nucleico de interés al interior de una célula donde se expresa la proteína que se vaya a regular a la baja y dirigir la expresión del ácido nucleico en dicha célula. El vector recombinante puede permanecer en forma de una entidad separada en la célula (por ejemplo, en forma de un plásmido) o puede integrarse en el genoma de la célula. Los vectores recombinantes incluyen, entre otros, vectores plasmídicos, vectores binarios, vectores de clonación, vectores de expresión, vectores lanzadera y vectores víricos. Por lo tanto, en el presente documento también se abarcan métodos y usos donde las moléculas se proporcionan en forma de vectores recombinantes con una secuencia de ácido nucleico que codifica las moléculas y las moléculas se expresan a partir de la secuencia de ácido nucleico proporcionada en el vector recombinante.
La memoria descriptiva también describe células que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula, tal como se ha descrito en el presente documento o que comprenden un vector recombinante que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica dicha molécula interferidora. La célula puede ser una célula procariota o eucariota. En este último caso, puede ser una célula de levadura, alga, vegetal o animal (por ejemplo, una célula de insecto, mamífero o humana). Por lo tanto, en el presente documento también se abarcan métodos y usos donde las moléculas se proporcionan en forma de células con una secuencia de ácido nucleico que codifica las moléculas y las moléculas se expresan a partir de la secuencia de ácido nucleico proporcionada en las células. Este puede ser el caso, por ejemplo, en la terapia con células madre.
Obsérvese que la estrategia transgénica no se limita a aplicaciones médicas. De acuerdo con realizaciones muy particulares, proporcionar las moléculas interferidoras codificadas en ácido nucleico en lugar de directamente en forma de polipéptidos es particularmente adecuado para su uso en plantas, como se describirá más adelante.
Por consiguiente, la memoria descriptiva describe plantas o células vegetales o semillas de plantas, que contienen una secuencia de ácido nucleico, un gen artificial o un vector recombinante como se ha descrito en el presente documento.
En realizaciones específicas, la invención proporciona un método para la producción o fabricación de un medicamento o una composición farmacéutica que comprende al menos una molécula interferidora y además mezcla dicha al menos una molécula interferidora con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Es decir, el interferidor se proporciona para su uso como medicamento o se proporcionan composiciones farmacéuticas que contienen interferidores.
En una realización preferida, la molécula interferidora es un polipéptido (lo que significa que todos los restos enlazadores Zh presentes son de naturaleza polipeptídica) y pueden prepararse mediante síntesis química o como alternativa, en forma de una proteína recombinante. (Obsérvese que las características de las moléculas interferidoras para uso médico también se prevén para uso no médico, en los casos donde sea aplicable).
Un "polipéptido" se refiere a un polímero en el que los monómeros son aminoácidos y están unidos entre sí mediante enlaces de amida, como alternativa, citados como un péptido. Cuando los aminoácidos son alfa-aminoácidos, puede usarse el isómero óptico L o el isómero óptico D. Además, también se incluyen aminoácidos no naturales, por ejemplo, beta-alanina, fenilglicina y homoarginina. También pueden usarse en la presente invención aminoácidos
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encontrados comúnmente que no están codificados por genes. Todos o parte de los aminoácidos usados en los interferidores pueden ser el isómero D o L. Además, también son útiles otros peptidomiméticos en la presente invención. Los presentes inventores hacen referencia e incorporan en el presente documento de manera específica la revisión acerca del desarrollo y uso de peptidomiméticos como antagonistas para interacciones proteína-proteína de Sillerud LO y Larson RS (2005) Curr Protein Pept Sci. 6(2):151-69. Además, Pueden añadirse D-aminoácidos a la secuencia de péptido para estabilizar las características de giro (especialmente en el caso de la glicina). En otra estrategia, pueden usarse miméticos de giro alfa, beta, gamma o delta (tales como alfa, beta, gamma o delta di- péptidos) para imitar motivos estructurales y características de giros en un péptido y simultáneamente, proporcionan estabilidad frente a la proteólisis y potencian otras propiedades, tales como, por ejemplo, estabilidad conformacional y solubilidad.
Puede fabricarse un interferidor recombinante usando sistemas de expresión adecuados que comprenden células bacterianas, células de levadura, células animales, células de insecto, células vegetales o animales o plantas transgénicos. El interferidor recombinante puede purificarse mediante cualquier procedimiento de purificación de proteínas o péptidos convencional hasta prácticamente la homogeneidad y/o mezclarse con aditivos. En otra realización más, dicho interferidor es un polipéptido modificado químicamente. La síntesis química permite la conjugación de otras moléculas pequeñas o la incorporación de aminoácidos no naturales mediante diseño. En una realización particular, la conjugación de moléculas pequeñas a un péptido interferidor podría dar lugar a una aplicación potencial de estas moléculas en el área de crecimiento de agentes citotóxicos dirigidos para terapia antitumoral. La incorporación de aminoácidos no naturales en el péptido abre la posibilidad de una mayor diversidad química, análoga a estrategias de química médica de molécula pequeña para desarrollar un reconocimiento molecular de alta afinidad y alta especificidad. Los aminoácidos no naturales también pueden prevenir una rápida degradación del péptido interferidor haciendo que el péptido no sea reconocible para las proteasas (por ejemplo, séricas o del estómago). En otra realización más, las moléculas interferidoras de la invención comprenden aminoácidos modificados, tales como un D-aminoácido o un aminoácido modificado químicamente. En otra realización más, dicho interferidor consiste en una mezcla de aminoácidos naturales y aminoácidos no naturales. En otra realización más, la puede prolongarse la semivida de un péptido mediante modificaciones, tales como glucosilación (Haubner R. et al (2001) J. Nucl. Med. 42, 326-336), conjugación con polietilenglicol (PEGilación, véase Kim TH et al (2002) Biomaterials 23, 2311-2317) o diseño del péptido por ingeniería para que se asocie con albúmina sérica (véase Koehler MF et al (2002) Bioorg. Med. Chem. Lett. 12, 2883-2886). La administración de una composición farmacéutica que comprende una molécula interferidora puede ser mediante administración oral, inhalada, transdérmica o parenteral (incluyendo intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intracavidad, intratecal y subcutánea). Los ejemplos particularmente preferidos de métodos de suministro para interferidores son un parche transdérmico (Henry S et al (1998) J. Pharm. Sci. 87, 922-925), iontoforesis (Suzuki Y et al (2002) J. Pharm. Sci. 91, 350-361), sonoforesis (Boucaud A et al (2002) J. Control. Release 81, 113-119), aerosoles (Duddu SP et al (2002) Pharm. Res. 19, 689-695), transferosomas o liposomas (Guo J et al (2000) Drug Deliv. 7, 113-116). El interferidor puede administrarse solo o se formula preferentemente en forma de una composición farmacéutica. (Esto significa que se proporcionan métodos que comprenden la administración del interferidor solo o se formulan en forma de una composición farmacéutica).
Se prefiere que el interferidor o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo se administre en forma de una composición de dosis unitaria, tal como una composición en dosis unitaria oral, parenteral, transdérmica o inhalada. Dichas composiciones se preparan mediante mezclado y están adaptadas de manera adecuada para administración oral, inhalada, transdérmica o parenteral y como tales, pueden estar en forma de comprimidos, cápsulas, preparaciones líquidas orales, polvos, gránulos, pastillas para chupar, polvos reconstituibles, soluciones o suspensiones inyectables e infusibles o supositorios o aerosoles.
Ya que las moléculas se proporcionan para su uso como medicamento o en diagnósticos o en métodos de tratamiento o de diagnóstico, también se prevé que puedan proporcionarse en forma de agentes farmacéuticos. Por consiguiente, la memoria descriptiva describe composiciones farmacéuticas que comprenden las moléculas descritas en el presente documento. En particular, las composiciones farmacéuticas comprenden al menos una molécula que tiene la siguiente estructura:
(X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, en donde n es un número entero de 1 a 5 e i aumenta de 1 a n con cada repetición; y en donde
- cada uno de X2i-1 y X2i se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P; lo más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, D y P;
- cada Yi se selecciona independientemente de entre una serie de 4 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que está presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E; y
- cada Zi es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada; y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Más particularmente, se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden al menos una molécula que
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tiene la siguiente estructura: (X2Í-1 -Yi-X2¡-Zi)n, en donde n es un número entero de 1 a 5 e i aumenta de 1 a n con cada repetición; y en donde
- cada uno de X2M y X2¡ se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P; lo más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, D y P;
- cada Y¡ se selecciona independientemente de entre una serie de 4 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que está presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E; en donde al menos una Yi es una serie de 4 a 16 aminoácidos contiguos de origen natural en una proteína; y
- cada Zi es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada; y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La memoria descriptiva describe que en donde n es 1, Y1 será normalmente una serie de 4 a 11 aminoácidos contiguos y Z1 no es un enlazador de aminoácidos (o puede ser incluso nada).
Más particularmente, en las composiciones farmacéuticas, al menos una Yi de las moléculas está presente en una proteína que se vaya a regular a la baja en el sujeto al que se administrará la composición. Obsérvese que esto no implica que esta proteína esté codificada en el genoma de dicho sujeto. De hecho, para sujetos que padecen una infección, se prevé que se administren moléculas que se dirijan específicamente a proteínas del organismo infeccioso y no del sujeto en sí. (Nuevamente, obsérvese que se aplican consideraciones similares para composiciones que se vayan a administrar a sujetos vegetales, es decir, composiciones agroquímicas. Estas pueden dirigirse a proteínas vegetales o a proteínas de organismos infecciosos).
La presente invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que contienen uno o más interferidores de la presente invención. Estas composiciones pueden usarse para lograr el efecto farmacológico deseado mediante su administración a un paciente que lo necesite. Un paciente, a efectos de la presente invención, es un mamífero, incluyendo un ser humano, que necesite tratamiento para la afección o enfermedad particular. Por lo tanto, la presente invención incluye composiciones farmacéuticas que están formadas por un vehículo farmacéuticamente aceptable y una cantidad farmacéuticamente eficaz de un interferidor o una sal del mismo, de la presente invención. Un vehículo farmacéuticamente aceptable es, preferentemente, un vehículo que es relativamente no tóxico e inocuo para un paciente a concentraciones consistentes con una actividad eficaz del principio activo, de tal forma que cualquier efecto secundario atribuible al vehículo no vicia los efectos beneficiosos del principio activo. Una cantidad farmacéuticamente eficaz de interferidor es preferentemente aquella cantidad que produce un resultado o ejerce una influencia en la afección concreta que se vaya a tratar. Los interferidores de la presente invención pueden administrarse con vehículos farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica usando cualquier forma farmacéutica unitaria convencional, incluyendo preparaciones de liberación inmediata, lenta y controlada, por vía oral, por vía parenteral, por vía tópica, por vía nasal, por vía oftálmica, por vía óptica, por vía sublingual, por vía rectal, por vía vaginal y similares.
Para administración oral, pueden formularse los interferidores en preparaciones sólidas o líquidas, tales como cápsulas, píldoras, comprimidos, trociscos, pastillas para chupar, fundidos, polvos, soluciones, suspensiones o emulsiones y pueden prepararse de acuerdo con métodos conocidos en la técnica para la fabricación de composiciones farmacéuticas. Las formas farmacéuticas unitarias pueden ser una cápsula que puede ser de tipo convencional de gelatina dura o blanda que contienen, por ejemplo, tensioactivos, lubricantes y cargas inertes, tales como lactosa, sacarosa, fosfato de calcio y almidón de maíz.
En otra realización, los interferidores de la presente invención pueden comprimirse con bases para comprimidos convencionales, tales como lactosa, sacarosa y almidón de maíz en combinación con aglutinantes, tales como goma arábiga, almidón de maíz o gelatina, agentes disgregantes previstos para ayudar en la rotura y la disolución del comprimido después de su administración, tales como almidón de maíz, ácido algínico, almidón de maíz y goma guar, goma de tragacanto, goma arábiga, lubricantes pensados para mejorar el flujo de la granulación del comprimido y para prevenir la adhesión del material del comprimido a las superficies de los moldes para comprimidos, por ejemplo, talco, ácido esteárico o estearato de magnesio, calcio o cinc, colorantes, agentes colorantes y agentes aromatizantes, tales como menta, aceite de gaulteria o aroma de cereza, pensados para mejorar las cualidades estéticas de los comprimidos y hacerlos más aceptables para el paciente. Los excipientes adecuados para su uso en formas farmacéuticas orales incluyen fosfato dicálcico y diluyentes, tales como agua y alcoholes, por ejemplo, etanol, alcohol bencílico y alcoholes de polietileno, ya sea con o sin la adición de un tensioactivo, agente de suspensión o agente emulsionante farmacéuticamente aceptable. Pueden estar presentes varios materiales diferentes en forma de recubrimientos o para de otro modo modificar la forma física de la forma farmacéutica. Por ejemplo, los comprimidos, píldoras o cápsulas pueden recubrirse con goma laca, azúcar o ambos.
Los polvos y gránulos dispersables son adecuados para la preparación de una suspensión acuosa. Estos
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proporcionan el principio activo (es decir, el al menos un interferidor) mezclado con un agente dispersante o humectante, un agente de suspensión y uno o más conservantes. Los agentes dispersantes o humectantes y los agentes de suspensión adecuados se ejemplifican por aquellos ya mencionados anteriormente. También puede haber presentes excipientes adicionales, por ejemplo, agentes edulcorantes, aromátizantes y colorantes descritos anteriormente.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden estar también en forma de emulsiones de aceite en agua. La fase oleosa puede ser un aceite vegetal, tal como parafina líquida o una mezcla de aceites vegetales. Los agentes emulsionantes adecuados pueden ser (1) gomas de origen natural, tales como goma arábiga y goma de tragacanto, (2) fosfáticas de origen natural, tales como soja y lecitina, (3) ésteres o ésteres parciales procedentes de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, por ejemplo, monooleato de sorbitán, (4) productos de condensación de dichos ésteres parciales con óxido de etileno, por ejemplo, monooleato de polioxietileno sorbitán. Las emulsiones también pueden contener agentes edulcorantes y aromatizantes.
Las suspensiones oleosas pueden formularse suspendiendo el principio activo en un aceite vegetal, tal como, por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de oliva, aceite de sésamo o aceite de coco o en un aceite mineral, tal como parafina líquida. Las suspensiones oleosas pueden contener un agente espesante, tal como, por ejemplo, cera de abejas, parafina dura o alcohol cetílico. Las suspensiones también pueden contener uno o más conservantes, por ejemplo, p-hidroxibenzoato de etilo o n-propilo; uno o más agentes colorantes; uno o más agentes aromatizantes; y uno o más agentes edulcorantes, tales como sacarosa o sacarina. Los jarabes y elixires pueden formularse con agentes edulcorantes, tales como, por ejemplo, glicerol, propilenglicol, sorbitol o sacarosa. Dichas formulaciones también pueden contener un emoliente y un conservante, tal como metil y propil parabenos y agentes aromatizantes y colorantes. Los interferidores de la presente invención también pueden administrarse por vía parenteral, es decir, por vía subcutánea, por vía intravenosa, por vía intraocular, por vía intrasinovial, por vía intramuscular o por vía intraperitoneal, en forma de dosis inyectables del interferidor, preferentemente, en un diluyente fisiológicamente aceptable con un vehículo líquido, que puede ser un líquido estéril o una mezcla de líquidos, tales como agua, solución salina, solución acuosa de dextrosa y soluciones de azúcar relacionadas, un alcohol, tal como etanol, isopropanol o alcohol hexadecílico, glicoles, tales como propilenglicol o polietilenglicol, glicerol cetales, tales como 2,2-dimetil-1,1-dioxolano-4-metanol, éteres, tales como poli(etilenglicol) 400, un aceite, un ácido graso, un éster de ácido graso o, un glicérido de ácido graso o un glicérido de ácido graso acetilado, con o sin la adición de un tensioactivo farmacéuticamente aceptable, tal como un jabón o un detergente, un agente de suspensión, tal como pectina, carbómeros, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa o carboximetilcelulosa o un agente emulsionante y otros adyuvantes farmacéuticos.
Son ejemplos ilustrativos de aceites que pueden usarse en las formulaciones parenterales de la presente invención los de petróleo, animales, vegetales o de origen sintético, por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite de sésamo, aceite de algodón, aceite de maíz, aceite de oliva, vaselina y aceite mineral. Los ácidos grasos adecuados incluyen ácido oleico, ácido esteárico, ácido isoesteárico y ácido mirístico. Los ésteres de ácido graso son, por ejemplo, oleato de etilo y miristato de isopropilo. Los jabones adecuados incluyen sales de metales alcalinos, amonio y trietanolamina de ácidos grasos y los detergentes adecuados incluyen detergentes catiónicos, por ejemplo, haluros de dimetil dialquilamonio, haluros de alquil piridinio y acetatos de alquilamina; detergentes aniónicos, por ejemplo, sulfonatos de alquilo, arilo y olefina, sulfatos de alquilo, olefina, éter y monoglicéridos y sulfosuccinatos; detergentes no iónicos, por ejemplo, óxidos de aminas grasas, alcanolamidas de ácidos grasos y copolímeros de poli(oxietileno- oxipropileno) un óxido de etileno u óxido de propileno; y detergentes anfóteros, por ejemplo, alquil-beta- aminopropinatos y sales de amonio cuaternario de 2-alquilimidazolina, así como mezclas.
Las composiciones parenterales de la presente invención contendrán normalmente de aproximadamente un 0,5% a aproximadamente un 25% en peso del principio activo en solución. También pueden usarse, ventajosamente, conservantes y tampones. Para minimizar o eliminar la irritación en el sitio de inyección, dichas composiciones pueden contener un tensioactivo no iónico que tiene un equilibrio hidrófilo-lipófilo (HLB) preferentemente de aproximadamente 12 a aproximadamente 17. La cantidad de tensioactivo en dicha formulación varía preferentemente de aproximadamente el 5% a aproximadamente el 15% en peso. El tensioactivo puede ser un solo componente que tiene el HLB anterior o puede ser una mezcla de dos o más componentes que tienen el HLB deseado. Son ejemplos ilustrativos de tensioactivos usados en formulaciones parenterales la clase de éteres de ácidos grasos de polioxietileno sorbitán, por ejemplo, monooleato de sorbitán y los aductos de elevado peso molecular de óxido de etileno con una base hidrófoba, formada por la condensación de óxido de propileno con propilenglicol.
Las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de suspensiones acuosas inyectables estériles. Dichas suspensiones pueden formularse de acuerdo con métodos conocidos usando agentes de dispersión o humectantes adecuados y agentes de suspensión, tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma de tragacanto y goma arábiga; agentes dispersantes o humectantes que pueden ser una fosfática de origen natural, tal como lecitina, un producto de condensación de un óxido de alquileno con un ácido graso, por ejemplo, estearato de polioxietileno, un producto de condensación de óxido de etileno con un alcohol alifático de cadena larga, por ejemplo, heptadeca-etilenoxicetanol, un producto de condensación de óxido de etileno con un éster parcial procedente de un ácido graso y un hexitol, tal
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como monooleato de polioxietileno sorbitol o un producto de condensación de un óxido de etileno con un éster parcial derivado de un ácido graso y un anhídrido de hexitol, por ejemplo, monooleato de polioxietileno sorbitán.
La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente no tóxico, parenteralmente aceptable. Los diluyentes y disolventes que pueden emplearse son, por ejemplo, agua, solución de Ringer, soluciones isotónicas de cloruro de sodio y soluciones isotónicas de glucosa. Además, normalmente se emplean aceites no volátiles estériles como disolventes o medios de suspensión. Para este fin, puede usarse cualquier aceite suave no volátil, incluyendo mono o diglicéridos sintéticos. Además, pueden usarse ácidos grasos, tales como ácido oleico, en la preparación de inyectables.
Una composición de la invención también puede administrarse en forma de supositorios para la administración rectal del fármaco. Estas composiciones pueden prepararse mezclando el fármaco con un excipiente no irritante adecuado que es sólido a temperaturas normales pero líquido a la temperatura rectal y por lo tanto, se derretirá en el recto para liberar el fármaco. Dichos materiales son, por ejemplo, manteca de cacao y polietilenglicol.
Otra formulación empleada en los métodos de la presente invención emplea dispositivos de suministro transdérmico ("parches"). Dichos parches transdérmicos también pueden usarse para proporcionar infusión continua o discontinua de los interferidores de la presente invención en cantidades controladas. La construcción y el uso de parches transdérmicos para el suministro de agentes farmacéuticos se conoce bien en la técnica (véase, por ejemplo, el documento US 5.023.252). Dichos partes pueden construirse para suministro continuo, pulsátil o bajo demanda de agentes farmacéuticos. Las formulaciones de liberación controlada para administración parenteral incluyen formulaciones liposómicas, en microesferas poliméricas y poliméricas en gel que se conocen en la técnica. Puede ser deseable o necesario introducir la composición farmacéutica en el paciente mediante un dispositivo de suministro mecánico. La construcción y el uso de dispositivos de suministro mecánico para el suministro de agentes farmacéuticos se conoce bien en la técnica. Las técnicas directas para, por ejemplo, administrar un fármaco directamente al cerebro implican normalmente implantar un catéter para suministro de fármacos en el sistema ventricular del paciente para esquivar la barrera hematoencefálica. Uno de dichos sistemas de suministro implantables, usado para el transporte de agentes a regiones anatómicas específicas del organismo, se describe en el documento US 5.011.472.
Las composiciones de la invención también pueden contener otros ingredientes de formulación farmacéuticamente aceptables convencionales, citados generalmente como vehículos o diluyentes, según sea necesario o se desee. Pueden utilizarse procedimientos convencionales para preparar dichas composiciones en formas farmacéuticas adecuadas. Dichos ingredientes y procedimientos incluyen aquellos descritos en las siguientes referencias, cada una de las cuales se incorpora al presente documento por referencia: Powell, M. F. et al., "Compendium of Excipients for Parenteral Formulations" PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 1998, 52(5), 238-311; Strickley, R.G "Parenteral Formulations of Small Molecule Therapeutics Marketed in the United States (1999)-Part-1" PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 1999, 53(6), 324-349; y Nema, S. et al., "Excipients and Their Use in Injectable Products" PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 1997, 51 (4), 166-171.
Los ingredientes farmacéuticos usados comúnmente que pueden usarse como adecuados para formular la composición para su vía de administración prevista incluyen:
- agentes acidificantes (algunos ejemplos incluyen, pero sin limitación, ácido acético, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido clorhídrico, ácido nítrico); agentes alcalinizantes (algunos ejemplos incluyen, pero sin limitación, solución de amoniaco, carbonato de amonio, dietanolamina, monoetanolamina, hidróxido de potasio, borato de sodio, carbonato de sodio, hidróxido de sodio, trietanolamina, trolamina); adsorbentes (algunos ejemplos incluyen, pero sin limitación, celulosa en polvo y carbón activado); propulsores de aerosol (algunos ejemplos incluyen, pero sin limitación, dióxido de carbono, CCl2F2, F2ClC-CClF2 y CCF3) agentes desplazantes del aire (algunos ejemplos incluyen, pero sin limitación, nitrógeno y argón); conservantes antifúngicos (algunos ejemplos incluyen, pero sin limitación, ácido benzoico, butilparabeno, etilparabeno, metilparabeno, propilparabeno, benzoato de sodio); conservantes antimicrobianos (algunos ejemplos incluyen, pero sin limitación, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, alcohol bencílico, cloruro de cetilpiridinio, clorobutanol, fenol, alcohol feniletílico, nitrato fenilmercúrico y timerosal); antioxidantes (algunos ejemplos incluyen, pero sin limitación, ácido ascórbico, palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, ácido hipofosforoso, monotioglicerol, galato de propilo, ascorbato de sodio, bisulfito de sodio, formaldehído sulfoxilato de sodio, metabisulfito de sodio); materiales aglutinantes (algunos ejemplos incluyen, pero sin limitación, polímeros de bloque, goma natural y sintética, poliacrilatos, poliuretanos, siliconas, polisiloxanos y copolímeros de estireno-butadieno); agentes tamponadores (algunos ejemplos incluyen, pero sin limitación, metafosfato de sodio, fosfato dipotásico, acetato de sodio, citrato de sodio anhidro y dihidrato de citrato de sodio), agentes portadores (algunos ejemplos incluyen, pero sin limitación, jarabe de acacia, jarabe aromático, elixir aromático, jarabe de cereza, jarabe de cacao, jarabe de naranja, jarabe, aceite de maíz, aceite mineral, aceite de cacahuete, aceite de sésamo, inyección de cloruro de sodio bacteriostático y agua bacteriostática para inyección), agentes quelantes (algunos ejemplos incluyen, pero sin limitación, edetato disódico y ácido edético), colorantes (algunos ejemplos incluyen, pero sin limitación, Rojo FD&C n.° 3, rojo FD&C n.° 20, amarillo FD&C n.° 6, azul fD&C n.° 2, verde D&C n.° 5, naranja D&C n.° 5, rojo D&C n.° 8, caramelo o rojo de óxido de hierro);
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- agentes clarificantes (algunos ejemplos incluyen, pero sin limitación, bentonita);
- agentes emulsionantes (algunos ejemplos incluyen, pero sin limitación, goma arábiga, cetomacrogol, alcohol cetílico, monoestearato de glicerilo, lecitina, monooleato de sorbitán, monoestearato de polioxietileno 50);
- agentes encapsulantes (algunos ejemplos incluyen, pero sin limitación, gelatina y ftalato de acetato de celulosa);
- aromatizantes (algunos ejemplos incluyen, pero sin limitación, aceite de anís, aceite de canela, cacao, mentol, aceite de naranja, aceite de menta y vanillina);
- humectantes (algunos ejemplos incluyen, pero sin limitación, glicerol, propilenglicol y sorbitol);
- agentes de levigación (algunos ejemplos incluyen, pero sin limitación, aceite mineral y glicerina);
- aceites (algunos ejemplos incluyen, pero sin limitación, aceite de cacahuete, aceite mineral, aceite de oliva, aceite de cacahuete, aceite de sésamo y aceite vegetal);
- bases para pomadas (algunos ejemplos incluyen, pero sin limitación, lanolina, pomada hidrófila, pomada de polietilenglicol, vaselina, vaselina hidrófila, pomada blanca, pomada amarilla y pomada de agua de rosas);
- potenciadores de la penetración (suministro transdérmico) (algunos ejemplos incluyen, pero sin limitación monohidroxi o polihidroxi alcoholes, alcoholes mono o polivalentes, alcoholes grasos saturados o insaturados, ésteres grasos saturados o insaturados, ácidos dicarboxílicos saturados o insaturados, aceites esenciales, derivados de fosfatidilo, cefalina, terpenos, amidas, éteres, cetonas y ureas);
- plastificantes (algunos ejemplos incluyen, pero sin limitación, ftalato de dietilo y glicerol);
- disolventes (algunos ejemplos incluyen, pero sin limitación, etanol, aceite de maíz, aceite de algodón, glicerol, isopropanol, aceite mineral, ácido oleico, aceite de cacahuete, agua purificada, agua para inyección, agua estéril para inyección y agua estéril para irrigación);
- agentes de rigidez (algunos ejemplos incluyen, pero sin limitación, alcohol cetílico, ésteres de cetilo, cera, cera microcristalina, parafina, alcohol estearílico, cera blanca y cera amarilla);
- bases para supositorios (algunos ejemplos incluyen, pero sin limitación, manteca de cacao y polietilenglicoles (mezclas);
- tensioactivos (algunos ejemplos incluyen, pero sin limitación, cloruro de benzalconio, nonoxinol 10, oxtoxinol 9, polisorbato 80, lauril sulfato de sodio y monopalmitato de sorbitán);
- agentes de suspensión (algunos ejemplos incluyen, pero sin limitación agar, bentonita, carbómeros, carboximetilcelulosa de sodio, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, caolín, metilcelulosa, tragacanto y veegum);
- agentes edulcorantes (algunos ejemplos incluyen, pero sin limitación, aspartamo, dextrosa, glicerol, manitol, propilenglicol, sacarina sódica, sorbitol y sacarosa);
- antiadherentes para comprimidos (algunos ejemplos incluyen, pero sin limitación, estearato de magnesio y talco);
- aglutinantes para comprimidos (algunos ejemplos incluyen, pero sin limitación, goma arábiga, ácido algínico, carboximetilcelulosa de sodio, azúcar comprimible, etilcelulosa, gelatina, glucosa líquida, metilcelulosa, polivinil pirrolidona no reticulada y almidón pregelatinizado);
- diluyentes para comprimidos y cápsulas (algunos ejemplos incluyen, pero sin limitación, fosfato de calcio dibásico, caolín, lactosa, manitol, celulosa microcristalina, celulosa en polvo, carbonato de calcio precipitado, carbonato de sodio, fosfato de sodio, sorbitol y almidón);
- agentes de recubrimiento de comprimidos (algunos ejemplos incluyen, pero sin limitación, glucosa líquida, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, metilcelulosa, etilcelulosa, ftalato de acetato de celulosa y goma laca);
- excipientes de compresión directa de comprimidos (algunos ejemplos incluyen, pero sin limitación, fosfato de calcio dibásico);
- disgregantes para comprimidos (algunos ejemplos incluyen, pero sin limitación, ácido algínico,
carboximetilcelulosa de sodio, celulosa microcristalina, polacrilina de potasio, polivinilpirrolidona reticulada,
alginato de sodio, glicolato sódico de almidón y almidón);
- emolientes para comprimidos (algunos ejemplos incluyen, pero sin limitación, sílice coloidal, almidón de maíz y talco);
- lubricantes para comprimidos (algunos ejemplos incluyen, pero sin limitación, estearato de calcio, estearato de magnesio, aceite mineral, ácido esteárico y estearato de cinc);
- opacificantes para comprimidos/cápsulas (algunos ejemplos incluyen, pero sin limitación, dióxido de titanio);
- agentes de pulido de comprimidos (algunos ejemplos incluyen, pero sin limitación, cera de carnauba y cera blanca);
- agentes espesantes (algunos ejemplos incluyen, pero sin limitación, cera de abejas, alcohol cetílico y parafina);
- agentes de tonicidad (algunos ejemplos incluyen, pero sin limitación, dextrosa y cloruro de sodio);
- agentes aumentadores de la viscosidad (algunos ejemplos incluyen, pero sin limitación, ácido algínico, bentonita,
carbómeros, carboximetilcelulosa de sodio, metilcelulosa, polivinilpirrolidona, alginato de sodio y tragacanto); y
- agentes humectantes (algunos ejemplos incluyen, pero sin limitación, heptadecaetilen oxicetanol, lecitinas, monooleato de sorbitol, monooleato de polioxietileno sorbitol y estearato de polioxietileno).
Algunos ejemplos no limitantes de composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención pueden
ilustrarse del siguiente modo:
- Solución IV estéril: Puede prepararse una solución de 5 mg/ml del interferidor deseado de la presente invención usando agua inyectable estéril y el pH se ajusta en caso necesario. La solución se diluye para su administración a 1 - 2 mg/ml con dextrosa estéril al 5% y se administra en forma de una infusión IV a lo largo de
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aproximadamente 60 minutos.
- Polvo liofilizado para administración IV: Puede prepararse una preparación estéril con (i) 100 - 1000 mg del interferidor deseado de la presente invención en forma de un polvo liofilizado, (ii) 32-327 mg/ml de citrato de sodio y (iii) 300 - 3000 mg de Dextran 40. La formulación se reconstituye con suero salino estéril inyectable o dextrosa al 5% hasta una concentración de 10 a 20 mg/ml, que después se diluye con suero salino o dextrosa al 5% hasta 0,2 - 0,4 mg/ml y se administra en forma de bolo IV o mediante infusión IV a lo largo de 15 - 60 minutos.
- Suspensión intramuscular: Puede prepararse la siguiente solución o suspensión, para inyección intramuscular:
50 mg/ml del interferidor deseado insoluble en agua (o soluble en agua) de la presente invención 5 mg/ml de carboximetilcelulosa de sodio 4 mg/ml de TWEEN 80 9 mg/ml de cloruro de sodio 9 mg/ml de alcohol bencílico
Cápsulas duras: Se prepara un gran número de cápsulas unitarias rellenando cápsulas de gelatina dura convencionales en dos piezas cada una con 100 mg de principio activo en polvo, 150 mg de lactosa, 50 mg de celulosa y 6 mg de estearato de magnesio.
Cápsulas de gelatina blanda: Se prepara una mezcla de principio activo en un aceite digerible, tal como aceite de soja, aceite de algodón o aceite de oliva y se inyecta mediante una bomba de desplazamiento positivo al interior de gelatina fundida para formar cápsulas de gelatina blanda que contienen 100 mg del principio activo. Las cápsulas se lavan y se secan. El principio activo puede disolverse en una mezcla de polietilenglicol, glicerina y sorbitol para preparar una mezcla medicinal miscible en agua.
Comprimidos: Se prepara un gran número de comprimidos por procedimientos convencionales de tal forma que la forma farmacéutica contiene 100 mg de principio activo, 0,2 mg de dióxido de silicio coloidal, 5 mg de estearato de magnesio, 275 mg de celulosa microcristalina, 11 mg de almidón y 98,8 mg de lactosa. Pueden aplicarse recubrimientos acuosos y no acuosos adecuados para aumentar la palatabilidad, mejorar la elegancia y la estabilidad o retrasar la absorción.
Comprimidos/cápsulas de liberación inmediata: Estas son formas farmacéuticas sólidas preparadas mediante procesos convencionales y novedosos. Estas unidades se toman por vía oral sin agua para su disolución y suministro de la medicación de manera inmediata. El principio activo se mezcla en un líquido que contiene ingredientes tales como azúcar, gelatina, pectina y edulcorantes. Estos líquidos se solidifican en comprimidos o comprimidos recubiertos mediante técnicas de liofilización y de extracción en estado sólido. Los fármacos interferidores pueden comprimirse con azúcares y polímeros viscoelásticos y termoelásticos o componentes efervescentes para producir matrices porosas previstas para liberación inmediata, sin necesidad de agua.
En una realización particular, los interferidores se formulan en formulaciones parenterales de liberación controlada. Una lista no limitante de dichos sistemas de suministro parenteral de liberación controlada que puede aplicarse para la administración de interferidores incluyen inyecciones a base de aceite, implantes, liposomas, nanopartículas, PEGilación, microesferas y bombas. En una realización particular, las nanopartículas sólidas pueden desarrollarse como sistemas portadores para interferidores. En otra realización particular, los interferidores pueden estar microencapsulados. Las microesferas son polvos de flujo libre, con un diámetro idealmente menor de 125 pm, que pueden suspenderse en vehículos acuosos adecuados para inyección con una jeringuilla convencional usando una aguja del calibre 18 o 20. Los polímeros más prometedores para dicho uso son los copolímeros de lactida/glicólido, poli(orto ésteres) y polianhídridos. El poli (D,L-lactida-co-glicólido) (PLGA) es un polímero biodegradable que se hidroliza con una reacción catalizada por un ácido o una base para formar los metabolitos naturales de ácido glicólico y ácido láctico. El PLGA está aprobado por la FDA.
De acuerdo con realizaciones particulares, la molécula puede proporcionarse en forma liofilizada con un tampón fisiológico. De acuerdo con realizaciones particulares, las composiciones farmacéuticas, en caso de ser líquidas, se proporcionan a pH fisiológico, en particular entre pH 5 y 9, más en particular entre pH 6 y pH 8.
El término "administración", tal como se usa en el presente documento, tiene el objetivo de poner en contacto las proteínas de interés con las moléculas. Obsérvese que, por ejemplo, en el caso de una enfermedad infecciosa, la administración puede ser a un organismo diferente a aquel en donde deben agregarse las proteínas. La administración intracelular puede ser mediante suministro mediado por vehículo, por ejemplo, mediante vehículos liposómicos o nanopartículas o mediante inyección. En otra realización alternativa más, la molécula agregadora puede entrar en un célula a través de una secuencia que media la penetración celular (o la traslocación celular). En este último caso, la molécula agregadora se modifica adicionalmente mediante acoplamiento recombinante o sintético de una secuencia de penetración celular.
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Terapias combinadas
En una realización particular, los interferidores de la presente invención pueden administrarse como agente farmacéutico único o en combinación con uno o más agentes farmacéuticos diferentes, donde la combinación no provoca efectos adversos no aceptables. La presente invención también se refiere a dichas combinaciones. Por ejemplo, los interferidores de la presente invención pueden combinarse con agentes antimicrobianos conocidos (por ejemplo, antifúngicos o antibióticos) u otros agentes de indicación y similares, así como con mezclas y combinaciones de los mismos.
El término "tratar" o "tratamiento", tal como se indica a lo largo del presente documento se usa de manera convencional, por ejemplo, la gestión o el cuidado de un sujeto con el fin de combatir, aliviar, reducir, mitigar, mejorar el estado de, etc., de una enfermedad o trastorno, tal como un carcinoma. El tratamiento puede aplicarse tanto para enfermedades infecciosas como para trastornos no infecciosos.
Dosis y administración:
Basándose en técnicas de laboratorio convencionales conocidas para evaluar los interferidores útiles para el tratamiento de enfermedades infecciosas (tal como se muestra en los ejemplos, en particular, infecciones fúngicas, infecciones bacterianas o infecciones víricas, en particular, infecciones por Candida albicans, infecciones por Staphylococcus sp. e infecciones por el virus de la gripe), o para el tratamiento de enfermedades no infecciosas (tales como cáncer, AMD e inflamación, tal como se muestra en los ejemplos) mediante pruebas de toxicidad convencionales y mediante ensayos farmacológicos convencionales para determinar el tratamiento de las afecciones identificadas anteriormente en mamíferos y mediante la comparación de estos resultados con los resultados de medicamentos conocidos que se usan para tratar estas afecciones, puede determinarse fácilmente la dosis eficaz de los interferidores de la presente invención para el tratamiento de cada una de las indicaciones deseadas. La cantidad de principio activo que se vaya a administrar en el tratamiento de una de estas afecciones puede variar ampliamente de acuerdo con consideraciones tales como el interferidor concreto y la forma farmacéutica empleada, el modo de administración, el periodo de tratamiento, la edad y el sexo del paciente a tratar y la naturaleza y alcance de la afección tratada.
La cantidad total del principio activo que se vaya a administrar variará generalmente de aproximadamente 0,001 mg/kg a aproximadamente 200 mg/kg de peso corporal por día y preferentemente, de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal por día. Las pautas posológicas clínicamente útiles variarán de una dosificación de una a tres veces al día hasta una vez cada cuatro semanas. Además, pueden ser beneficiosos los "periodos de descanso farmacológico", en los que no se administra el fármaco a un paciente durante un periodo de tiempo determinado para el equilibrio general entre efecto farmacológico y tolerabilidad. Una forma farmacéutica puede contener de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 1500 mg de principio activo y puede administrarse una o más veces al día o menos de una vez al día. La dosis diaria media para administración por inyección, incluyendo inyección intravenosa, intramuscular, subcutánea y parenteral y el uso de técnicas de infusión será preferentemente de 0,01 a 200 mg/kg de peso corporal total. La pauta posológica rectal diaria media será
preferentemente de 0,01 a 200 mg/kg de peso corporal total. La pauta posológica vaginal diaria media será
preferentemente de 0,01 a 200 mg/kg de peso corporal total. La pauta posológica tópica diaria media será
preferentemente de 0,1 a 200 mg, administrados entre una a cuatro veces al día. La concentración transdérmica
será preferentemente la necesaria para mantener una dosis diaria de 0,01 a 200 mg/kg. La pauta posológica inhalatoria diaria media será preferentemente de 0,01 a 100 mg/kg de peso corporal total. Preferentemente, las composiciones para inhalación se presentan para su administración al tracto respiratorio en forma de un polvo rápidamente inhalado por la nariz o un aerosol o solución para un nebulizador o en forma de un polvo microfino para insuflación, solo o en combinación con un vehículo inerte, tal como lactosa. En dicho caso, las partículas de interferidor activo tienen de manera adecuada diámetros de menos de 50 micrómetros, preferentemente menos de 10 micrómetros, por ejemplo, entre 1 y 5 micrómetros, tal como entre 2 y 5 micrómetros. Como alternativa, pueden usarse nanopartículas recubiertas, con un tamaño de partícula entre 30 y 500 nm. Una dosis inhalada favorita se encontrará en el intervalo de 0,05 a 2 mg, por ejemplo, de 0,05 a 0,5 mg, de 0,1 a 1 mg o de 0,5 a 2 mg.
Resulta evidente para un experto en la materia que la pauta posológica inicial y de continuación para cada paciente variará según la naturaleza y la gravedad de la afección, según se determine por el diagnosticador que lo atienda, la actividad del interferidor específico empleado, la edad y el estado general del paciente, el tiempo de administración, la vía de administración, la velocidad de excreción del fármaco, combinaciones de fármacos y similares. El modo de tratamiento y el número de dosis deseado de un interferidor de la presente invención o de una sal o éster o composición farmacéuticamente aceptable del mismo puede determinarse por los expertos en la materia usando pruebas de tratamiento convencionales.
En ciertas realizaciones, los medicamentos de la invención se administran a la clase de los mamíferos, incluyendo el orden de los carnívoros (por ejemplo, perros y gatos), roedores (por ejemplo, ratones, cobayas y ratas), lagomorfos (por ejemplo, conejos) y primates (por ejemplo, seres humanos, chimpancés y monos).
Tal como es práctica común, los compuestos irán acompañados normalmente de instrucciones escritas o impresas
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para el uso del tratamiento médico respectivo.
La presente invención también incluye interferidores marcados isotópicamente, que son idénticos a los descritos en el presente documento, salvo por el hecho de que se reemplazan uno o más átomos por un átomo que tiene una masa atómica o un número másico diferente a la masa atómica o el número másico normalmente encontrado en la naturaleza. Algunos ejemplos de isótopos que pueden incorporarse en los interferidores de la presente invención incluyen isótopos de hidrógeno, carbono, nitrógeno, oxígeno, fósforo, azufre, flúor y cloro, tales como 2H, 3H, 13C, 11C, 14C, 15N, 18O, 17O, 31P, 32P, 35S, 18F y 36Cl, respectivamente. Los interferidores de la presente invención y las sales farmacéuticamente aceptables de dichos interferidores que contienen los isótopos y/u otros isótopos de otros átomos se encuentran dentro del alcance de la presente invención. Ciertos interferidores marcados isotópicamente de la presente invención, por ejemplo, aquellos en los que se incorporan isótopos radiactivos, tales como 3H y 14C, son útiles en ensayos farmacológicos y/o de distribución en sustrato de tejido. Se prefieren particularmente los isótopos de tritio, es decir, 3H y carbono-14, es decir, 14C, por su facilidad de preparación y detección. Además, la sustitución con isótopos más pesados, tales como deuterio, es decir, 2H, puede proporcionar ciertas ventajas terapéuticas a consecuencia de su mayor estabilidad metabólica, por ejemplo, una semivida in vivo aumentada o requisitos de dosis reducidos y, por lo tanto, pueden preferirse en algunas circunstancias. Los interferidores marcados isotópicamente de fórmula I de la presente invención pueden prepararse normalmente llevando a cabo los procedimientos descritos en los ejemplos más adelante, sustituyendo un reactivo no marcado isotópicamente por un reactivo marcado isotópicamente fácilmente disponible.
Como se ha mencionado, las moléculas pueden aplicarse para tratar enfermedades tanto no infecciosas como infecciosas. De acuerdo con una primera realización, las moléculas de la invención pueden usarse para el tratamiento de enfermedades (no infecciosas) (como alternativa, para la fabricación de un medicamento para tratar enfermedades (no infecciosas), tales como cáncer, y enfermedades inflamatorias o un trastorno relacionado con la inmunidad, asociadas con la expresión de una proteína particular (por ejemplo, mediante la sobreexpresión de una proteína particular o la (sobre)expresión de una variante de corte y empalme de una proteína particular o una versión mutante de una proteína particular, la (sobre)expresión de una proteína anclada a la membrana, la (sobre)expresión de una proteína transmembrana (mutante), la (sobre)expresión de una proteína secretada (por ejemplo, una proteasa, un anticuerpo o una citocina presente en la sangre o el plasma), la (sobre)expresión de un proteína en la matriz extracelular (por ejemplo, una metaloproteína de matriz) o una proteína transmembrana (por ejemplo, un receptor de factor de crecimiento). La expresión "expresión aberrante" se refiere a, por ejemplo, la (sobre)expresión de un factor de crecimiento oncogénico en el caso del cáncer, también incluye la expresión de un receptor negativo dominante o un receptor mutante o la aparición de un receptor vertido en la sangre o la expresión (o sobreexpresión) de una citocina o un factor de crecimiento en un fluido corporal. En una realización particular, la "expresión aberrante" se refiere a la presencia no deseada de una proteína modificada postraduccionalmente o a la presencia no deseada de una proteína modificada no postraduccionalmente. Las modificaciones postraduccionales alteran las propiedades fisicoquímicas de los aminoácidos modificados y como tales, tienen el potencial de alterar la tendencia a la agregación de un segmento de polipéptido dado, lo que puede aprovecharse para dirigirse específicamente a la forma que tiene la tendencia a la agregación más fuerte. Por lo tanto, en caso de que una modificación postraduccional reduzca significativamente la tendencia a la agregación de la región de beta agregación, la interferencia será más eficaz con la proteína no modificada. Por el contrario, en caso de haber modificaciones postraduccionales que aumentan la tendencia a la agregación de la región de beta agregación, la interferencia será más eficaz con la proteína modificada. Basándose únicamente en la hidrofobia, se asume que las modificaciones, tales como fosforilación y glucosilación, reducirán la tendencia a la agregación, mientras que el acoplamiento de lípidos aumentará la tendencia a la agregación.
En realizaciones específicas, las moléculas pueden usarse para regular a la baja una proteína (una o más) que necesita ser regulada a la baja en una situación de enfermedad. Dicha proteína es normalmente una proteína cuya sobreexpresión se asocia con y preferentemente causa, la enfermedad (por ejemplo, VEGFR-2 es una proteína cuya sobreexpresión se ha relacionado causalmente con el cáncer y la AMD, EGFR es una proteína cuya sobreexpresión se ha relacionado causalmente con el cáncer, TNF es una proteína cuya sobreexpresión se ha relacionado causalmente con la inflamación). Sin embargo, también puede ser una proteína que solo se exprese en situaciones de enfermedad y normalmente no se expresa en las células/tejido/sujeto diana cuando las células/tejido/sujeto están sanos (por ejemplo, PIGF es una proteína que normalmente no se expresa en tejidos adultos, pero se expresa en tumores). Una proteína que se vaya a regular a la baja también puede ser una proteína que se encuentra normalmente en la misma vía de señalización (normalmente aguas abajo) de una proteína que causa la enfermedad (por ejemplo, un receptor cuando el ligando está asociado con enfermedades), de tal forma que puede detenerse la señal aberrante.
Por consiguiente, la memoria descriptiva describe moléculas de la estructura (X2i-1 -Yi-X2¡-Zi)n para su uso en el tratamiento, la estabilización o la prevención de una enfermedad, en donde:
- n es 1 a 5 e i va de 1 a n;
- cada uno de X2¡-i y X2¡ se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P; lo más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, D y P;
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- cada Yi se selecciona independientemente de entre una serie de 4 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que esté presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E y en donde al menos un Yi es una serie de origen natural en una proteína cuya expresión o sobreexpresión se asocia con dicha enfermedad; y
- cada Zi es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada.
Las enfermedades particularmente previstas que se van a tratar incluyen, pero sin limitación, cáncer, AMD y enfermedades inflamatorias. Por lo tanto, la memoria descriptiva describe moléculas de la estructura (X2i-i-Y i-X2i-Zi)n, para su uso en el tratamiento, la estabilización o la prevención del cáncer, en donde:
- n es 1 a 5 e i va de 1 a n;
- cada uno de X2i-1 y X2i se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P; lo más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, D y P;
- cada Yi se selecciona independientemente de entre una serie de 4 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que esté presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E y en donde al menos un Yi es una serie de origen natural en una proteína cuya expresión o sobreexpresión se asocia con el cáncer; y
- cada Zi es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada.
De manera similar, la memoria descriptiva describe moléculas de la estructura (X2i-1-Yi-Xa-Zi)n, para su uso en el tratamiento, la estabilización o la prevención de la degeneración macular relacionada con la edad (AMD), en donde:
- n es 1 a 5 e i va de 1 a n;
- cada uno de X2i-1 y X2i se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P; lo más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, D y P;
- cada Yi se selecciona independientemente de entre una serie de 4 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que esté presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E y en donde al menos un Yi es una serie de origen natural en una proteína cuya expresión o sobreexpresión se asocia con la AMD; y
- cada Zi es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada.
Asimismo, la memoria descriptiva describe moléculas de la estructura (Xa-1-Yi-X2i-Zi)n, para su uso en el tratamiento, la estabilización o la prevención de enfermedades inflamatorias, en donde:
- n es 1 a 5 e i va de 1 a n;
- cada uno de X2i-1 y X2i se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P; lo más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, D y P;
- cada Yi se selecciona independientemente de entre una serie de 4 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que esté presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E y en donde al menos un Yi es una serie de origen natural en una proteína cuya expresión o sobreexpresión se asocia con enfermedades inflamatorias; y
- cada Zi es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada.
Más particularmente, la proteína que se va a regular a la baja en el cáncer o la AMD es VEGFR-2. Como alternativa, la proteína que se va a regular a la baja en el cáncer es EGFR2. Las proteínas particulares que pueden regularse a la baja en las enfermedades inflamatorias incluyen TNF-a e IL-1 p.
Tal como se ha mencionado anteriormente, esto equivale a decir que se describen métodos para tratar, estabilizar o prevenir una enfermedad (en particular, cáncer, aMd o enfermedades inflamatorias, respectivamente) en un sujeto que lo necesite, que comprenden: administrar al sujeto una molécula que tiene la estructura (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, en donde:
- n es 1 a 5 e i va de 1 a n;
- cada uno de X2i-1 y X2i se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y
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P; lo más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K y P;
- cada Yi se selecciona independientemente de entre una serie de 4 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que esté presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E y en donde al menos un Yi es una serie de origen natural en una proteína cuya expresión o sobreexpresión se asocia con la enfermedad (particularmente cáncer, AMD o enfermedades inflamatorias, respectivamente); y
- cada Zi es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada.
O, en formato suizo, se describe el uso de moléculas de la estructura (X2i-i-Y¡-X2i-Z¡)n para la fabricación de un medicamento para el tratamiento, la estabilización o la prevención de enfermedades (particularmente cáncer, AMD o enfermedades inflamatorias, respectivamente), en donde:
n es 1 a 5 e i va de 1 a n;
- cada uno de X2i-1 y X2¡ se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P; lo más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K y P;
- cada Y¡ se selecciona independientemente de entre una serie de 4 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que esté presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E y en donde al menos un Y¡ es una serie de origen natural en una proteína cuya expresión o sobreexpresión se asocia con la enfermedad (particularmente cáncer, AMD o enfermedades inflamatorias, respectivamente); y
- cada Zi es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada.
Se incluyen estas tres formulaciones equivalentes para satisfacer los diferentes requisitos nacionales de leyes de patentes.
El sujeto es, en particular, un animal, más particularmente un mamífero (por ejemplo, gato, perro, conejo, caballo, vaca, cerdo, oveja, cabra, llama, ratón, rata, ...), más en particular, un ser humano. También se prevén otros sujetos (véanse las definiciones).
Sin embargo, obsérvese que estos métodos también pueden aplicarse a organismos distintos de mamíferos, en particular, para tratar enfermedades en plantas (véase más adelante).
En una realización particular, la molécula interferidora se dirige contra un factor de crecimiento o un receptor de factor de crecimiento o una cinasa receptora transmembrana (por ejemplo, una tirosina cinasa receptora). Una lista de ejemplos no limitantes comprende la proteína PDGF-beta (y pueden usarse interferidores específicos para tratar a un sujeto que tenga un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de PDGF-beta, por ejemplo, cánceres de testículos y pulmón), la proteína Erb-B (y pueden usarse interferidores específicos para tratar a un sujeto que tenga un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de Erb-B, por ejemplo, cáncer de mama), la proteína VEGF (y pueden usarse interferidores específicos para tratar a un sujeto que tenga expresión no deseada de VEGF, por ejemplo, cánceres de esófago o colon o angiogénesis patológica), la proteína EGFR (y pueden usarse interferidores específicos para tratar a un sujeto que tenga un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de EGFR, por ejemplo, cáncer de mama), la proteína WNT-1 (y pueden usarse interferidores específicos para tratar a un sujeto que tenga expresión no deseada de WNT-1, por ejemplo, carcinoma de células basales), la proteína Her2/neu (y pueden usarse interferidores para tratar a un sujeto que tenga un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de Her2/neu, por ejemplo, cáncer de mama), la proteína alfa v-integrina (y pueden usarse interferidores para tratar a un sujeto que tenga un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de alfa v- integrina, por ejemplo, tumores cerebrales o tumores de origen epitelial), la proteína receptora FIt-1 (y pueden usarse interferidores para tratar a un sujeto que tenga un trastorno caracterizado por receptores FIt-1 no deseados, por ejemplo, cáncer y artritis reumatoide). Pueden diseñarse otros ejemplos más de interferidores específicos con especificidad por co-lingandos de integrinas, por ejemplo, VLA4, vCaM, ICAM, selectina o un co-ligando de las mismas, por ejemplo, P-selectina, E-selectina (ELAM), L-selectina o P-selectina glucoproteína-(PSGLl), un componente del sistema de complemento, por ejemplo, C3, C5, C3aR, C5aR, convertasa C3, convertasa C5, la función de una quimiocina o un receptor de la misma, por ejemplo, TNF-a, IL-1a, IL-1, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-6, IL-8, TNFRI, TNFRII, IgE, SCYA11 o CCR3, un componente de un canal iónico, un componente de un receptor acoplado a proteína G o con la función de un receptor de neurotransmisores o un ligando del mismo.
De acuerdo con otro aspecto, algunas aplicaciones médicas particularmente previstas son el uso de las moléculas proporcionadas en el presente documento como medicamento en enfermedades infecciosas.
Por lo tanto, la memoria descriptiva describe moléculas de la siguiente estructura: (X2¡-1 - Y¡-X2¡-Z¡)n, en donde:
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- n es 1 a 5 e i va de 1 a n;
- cada uno de X2Í-1 y X2i se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, A, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P;
- cada Yi se selecciona independientemente de entre una serie de 4 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que esté presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E y en donde al menos un Yi es una serie de origen natural en una proteína de un organismo patógeno; y
- cada Zi es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada; para su uso como fármaco anti-patógeno (o antiinfeccioso).
De acuerdo con una realización particular, las moléculas se usan como agentes antimicrobianos. Por lo tanto, la memoria descriptiva describe moléculas de la siguiente estructura: (X2i-1-Y¡-X2i-Zi)n, en donde:
- n es 1 a 5 e i va de 1 a n;
- cada uno de X2Í-1 y X2¡ se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, A, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P;
- cada Y¡ se selecciona independientemente de entre una serie de 4 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que esté presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E y en donde al menos un Y¡ es una serie de origen natural en una proteína de un organismo microbiano; y
- cada Z¡ es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada; para su uso como antimicrobiano.
Por lo tanto, se contempla el uso de interferidores para el tratamiento de infecciones por patógenos bacterianos en animales y seres humanos, por patógenos fúngicos en animales y seres humanos y por patógenos parasíticos en animales y seres humanos. Puede encontrarse una lista no excluyente de patógenos animales y humanos en la tabla 1A de la Patente de los Estados Unidos 8.088.888 (que comienza en la página 8 y termina en la página 15). Puede encontrarse una lista no excluyente de patógenos animales y fúngicos en la tabla 1B de la Patente de los Estados Unidos 8.088.888 (que comienza en la página 15 y termina en la página 18). Puede encontrarse una lista no excluyente de patógenos parasíticos de animales y humanos en la tabla 1C de la Patente de los Estados Unidos 8.088.888 (que comienza en la página 18 y termina en la página 20). Las tablas 1A, 1B y 1C de la Patente de los Estados Unidos 8.088.000 se incorporan al presente documento por referencia en su totalidad.
De acuerdo con otra realización particular, las moléculas se usan como agentes antivíricos. Por lo tanto, la memoria descriptiva describe moléculas de la siguiente estructura: (X2Í-1 -Y¡-X2¡-Z¡)n, en donde:
- n es 1 a 5 e i va de 1 a n;
- cada uno de X2Í-1 y X2¡ se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, A, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P;
- cada Y¡ se selecciona independientemente de entre una serie de 4 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que esté presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E y en donde al menos un Y¡ es una serie de origen natural en una proteína de un organismo vírico; y
- cada Z¡ es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada;
para su uso como antivírico.
Otra formulación equivalente es que se proporciona el uso de estas moléculas para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una infección por patógenos (o una infección microbiana o vírica, respectivamente), es decir, una reivindicación de tipo suizo.
Esto también equivale a decir que se describen métodos para prevenir o tratar infecciones por patógenos en un sujeto que lo necesite, que comprenden:
administrar al sujeto una molécula que tiene la siguiente estructura: (X2Í-1 - Y¡-X2¡-Z¡)n, en donde:
- n es 1 a 5 e i va de 1 a n;
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- cada uno de X2Í-1 y X2i se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, A, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P;
- cada Yi se selecciona independientemente de entre una serie de 4 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que esté presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E y en donde al menos un Yi es una serie de origen natural en una proteína de un patógeno; y
- cada Zi es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada.
O, en el caso de antimicrobianos, es equivalente a métodos descritos para tratar infecciones microbianas en un sujeto que lo necesite, que comprenden:
administrar al sujeto una molécula que tiene la siguiente estructura: (X2i-1 - Y¡-X2i-Zi)n, en donde:
- n es 1 a 5 e i va de 1 a n;
- cada uno de X2Í-1 y X2¡ se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, A, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P;
- cada Y¡ se selecciona independientemente de entre una serie de 4 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que esté presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E y en donde al menos un Y¡ es una serie de origen natural en una proteína de un organismo microbiano; y
- cada Z¡ es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada.
O, en el caso de antivíricos, es equivalente a métodos descritos para tratar infecciones víricas en un sujeto que lo necesite, que comprenden:
administrar al sujeto una molécula que tiene la siguiente estructura: (X2Í-1 - Y¡-X2¡-Z¡)n, en donde:
- n es 1 a 5 e i va de 1 a n;
- cada uno de X2Í-1 y X2¡ se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, A, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P;
- cada Y¡ se selecciona independientemente de entre una serie de 4 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que esté presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E y en donde al menos un Y¡ es una serie de origen natural en una proteína de un organismo vírico; y
- cada Z¡ es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada.
Algunas etapas adicionales de los métodos pueden incluir la evaluación (o la medición) de la presencia del organismo patógeno (por ejemplo, microbiano, vírico) (por ejemplo, el control del crecimiento, la reproducción o la supervivencia del organismo patógeno).
"Organismo microbiano", tal como se usa en el presente documento, puede referirse a bacterias, tales como bacterias grampositivas (por ejemplo, cocos, tales como Staphylococcus sp., Enterococcus sp., bacilos, tales como Bacillus sp.), bacterias gramnegativas (por ejemplo, Escherichia sp., Yersinia sp.), espiroquetas (por ejemplo, Treponema sp, tales como Treponema pallidum, Leptospira sp., Borrelia sp., tales como Borrelia burgdorferi), mollicutes (es decir, bacterias sin pared celular, tales como Mycoplasma sp.), bacterias resistentes a ácidos (por ejemplo, Mycobacterium sp., tales como Mycobacterium tuberculosum, Nocardia sp.). Los "organismos microbacterianos" también abarcan hongos (tales como levaduras y mohos, por ejemplo, Candida sp., Aspergillus sp., Coccidioides sp., Cryptococcus sp., Histoplasma sp., Pneumocystis sp. o Trichophyton sp.), protozoos (por ejemplo, Plasmodium sp., Entamoeba sp., Giardia sp., Toxoplasma sp., Cryptosporidium sp., Trichomonas sp., Leishmania sp., Trypanosoma sp.) y arqueas. De acuerdo con realizaciones particulares, la proteína de un organismo microbiano es una proteína de un organismo microbiano seleccionado entre bacterias, hongos o protozoos. Más particularmente, la proteína es de bacterias grampositivas, bacterias gramnegativas, micobacterias, mollicutes, protozoos u hongos. Más particularmente, es una proteína de bacterias grampositivas, bacterias gramnegativas, micobacterias u hongos, tales como levaduras y mohos.
"Organismo vírico" o "virus", que se usan como equivalentes en el presente documento, son agentes infecciosos pequeños que pueden replicarse únicamente dentro de las células vivas de los organismos. Estos incluyen virus de ADNbc (por ejemplo, adenovirus, herpesvirus, poxvirus), virus de ADNmc (por ejemplo, parvovirus), virus de ARNbc (por ejemplo, reovirus), virus de ARNbc(+) (por ejemplo, picornavirus, togavirus), virus de ARNbc(-) (por ejemplo, ortomixovirus, rabdovirus), virus de ARNbc-RT (retrotranscripción), es decir, virus con ARN en sentido (+) con un intermedio de ADN en el ciclo vital (por ejemplo, retrovirus) y virus de ADNbc-RT (por ejemplo, hepadnavirus). Los
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bacteriófagos (o de forma abreviada, fagos) son una clase particular de virus, que son virus que infectan a bacterias e inyectan su material genético (ARNmc, ARNbc, ADNmc o ADNbc). Los fagos son particularmente abundantes en el agua de mar y muchas bacterias marinas se infectan con fagos. Los bacteriófagos podrían representar un problema en procesos industriales en los que se usan bacterias (por ejemplo, en la producción de alimentos, tales como yogur, queso y similares).
En los métodos dirigidos al tratamiento de una infección vírica o a la inhibición de la infectividad vírica en un animal no humano, el virus animal se selecciona preferentemente de entre un picornavirus, tal como un enterovirus bovino, un enterovirus B porcino, un virus de la fiebre aftosa, un virus de la rinitis equina A, un virus de la rinitis bovina B, un virus Ijungan, virus de la rinitis equina B, un virus aichi, un kobuvirus bovino, un tescovirus porcino, un sapelovirus porcino, un sapelovirus de simio, un sapelovirus aviar, un virus de la encefalomielitis aviar, un virus de la hepatitis A de patos o un enterovirus A de simio; un pestivirus, tal como el virus de la enfermedad de la frontera, un virus de la diarrea bovina o un virus de la fiebre porcina clásica; un arterivirus, tal como un virus de la arteritis equina, un virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino, un virus elevador de lactato deshidrogenasa o un virus de la fiebre hemorrágica de simios; un coronavirus, tal como un coronavirus bovino, un coronavirus porcino, un coronavirus felino o un coronavirus canino; un paramixovirus, tal como un virus de hendra, un virus de nipah, un virus del moquillo canino, un virus de la peste bovina, un virus de la enfermedad de Newcastle y un virus sincitial respiratorio bovino; un ortomixovirus, tal como un virus de la gripe A, un virus de la gripe B o un virus de la gripe C; un reovirus, tal como un virus de la lengua azul; un circovirus porcino, un herpesvirus, tal como un virus de la seudorrabia o un herpesvirus 1 bovino; un asfavirus, tal como un virus de la fiebre porcina africana; un retrovirus, tal como un virus de la inmunodeficiencia de simios, un virus de la inmunodeficiencia felina, un virus de la inmunodeficiencia bovina, un virus de la leucemia bovina, un virus de la leucemia felina, un retrovirus de ovejas Jaagsiekte o un virus de la artritis- encefalitis caprina; un flavivirus, tal como el virus de la fiebre amarilla, un virus del Nilo occidental, un virus de la fiebre del dengue, un virus de la encefalitis transmitida por garrapatas o un virus de la diarrea bovina; o un rabdovirus, tal como un virus de la rabia.
En los métodos dirigidos al tratamiento de una infección vírica o a la inhibición de la infectividad vírica en un ser humano, el virus humano se selecciona preferentemente de entre un adenovirus, un astrovirus, un hepadnavirus, un herpesvirus, un papovavirus, un poxvirus, un arenavirus, un buniavirus, un calcivirus, un coronavirus, un filovirus, un flavivirus, un ortomixovirus, un paramixovirus, un picornavirus, un reovirus, un retrovirus, un rabdovirus o un togavirus. En realizaciones preferidas, el adenovirus incluye, pero sin limitación, un adenovirus humano. En realizaciones preferidas, el astrovirus incluye, pero sin limitación, un mamastrovirus. En realizaciones preferidas, el hepadnavirus incluye, pero sin limitación, el virus de la hepatitis B. En realizaciones preferidas, el herpesvirus incluye, pero sin limitación, el virus del herpes simple de tipo I, el virus del herpes simple de tipo 2, un citomegalovirus humano, un virus de Epstein-Barr, un virus varicela zóster, un roseolovirus y un herpesvirus asociado con el sarcoma de Kaposi. En realizaciones preferidas, el papoavirus incluye, pero sin limitación, el virus
del papiloma humano y un virus de polioma humano. En realizaciones preferidas, el poxvirus incluye, pero sin
limitación, un virus variola, un virus vaccinia, un virus de la viruela bovina, un virus de la viruela de mono, un virus de la viruela, un virus de la seudovaricela bovina, un virus de la estomatitis papular, un virus tanapox, un virus del tumor del mono de yaba y un virus del molusco contagioso. En realizaciones preferidas, el arenavirus incluye, pero sin limitación, el virus de la coriomeningitis linfocítica, un virus de lassa, un virus de machupo y un virus de junin. En realizaciones preferidas, el buniavirus incluye, pero sin limitación, un virus de hanta, un nairovirus, un ortobuniavirus y un flebovirus. En realizaciones preferidas, el calcivirus incluye, pero sin limitación, un vesivirus, un norovirus, tal como el virus de Norwalk y un sapovirus. En realizaciones preferidas, el coronavirus incluye, pero sin limitación, un coronavirus humano (agente etiológico del síndrome respiratorio agudo severo (SARS, por sus siglas en inglés)). En realizaciones preferidas, el filovirus incluye, pero sin limitación, un virus del Ébola y un virus de Marburgo. En
realizaciones preferidas, el flavivirus incluye, pero sin limitación, un virus de la fiebre amarilla, un virus del Nilo
occidental, un virus de la fiebre del dengue, un virus de la hepatitis C, un virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, un virus de la encefalitis japonesa, un virus de la encefalitis del valle de Murray, un virus de la encefalitis de St. Louis, un virus de la encefalitis vernoestival rusa, un virus de la fiebre hemorrágica de Omsk, un virus de la diarrea vírica bovina, un virus de la enfermedad del bosque de Kyasanus y un virus de la encefalitis de Powassan. En realizaciones preferidas, el ortomixovirus incluye, pero sin limitación, virus de la gripe de tipo A, virus de la gripe de tipo B y virus de la gripe de tipo C. En realizaciones preferidas, el paramixovirus incluye, pero sin limitación, un virus parainfluenza, un rubulavirus (paperas), un morbilivirus (sarampión), un pneumovirus, tal como un virus sincitial respiratorio humano y un virus de la panencefalitis esclerosante subaguda. En realizaciones preferidas, el picornavirus incluye, pero sin limitación, un poliovirus, un rinovirus, un virus coxackie A, un virus coxackie B, un virus de la hepatitis A, un ecovirus y un enterovirus. En realizaciones preferidas, el reovirus incluye, pero sin limitación, un virus de la fiebre por garrapatas de Colorado y un rotavirus. En realizaciones preferidas, el retrovirus incluye, pero sin limitación, un lentivirus, tal como un virus de la inmunodeficiencia humana y un virus linfotrófico T humano (HTLV). En realizaciones preferidas, el rabdovirus incluye, pero sin limitación, un lisavirus, tal como el virus de la rabia, el virus de la estomatitis vesicular y el virus de la necrosis hematopoyética infecciosa. En realizaciones preferidas, el togavirus incluye, pero sin limitación, un alfavirus, tal como un virus del río Ross, un virus de O'nyong'nyong, un virus de Sindbis, un virus de la encefalitis equina venezolana, un virus de la encefalitis equina oriental y un virus de la encefalitis equina occidental y un virus de la rubéola.
De acuerdo con realizaciones particulares, la proteína de un organismo patógeno es una proteína de un patógeno,
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cepa o variante resistente a fármacos. Se sabe que la resistencia a fármacos surge en varios patógenos, particularmente en virus y microorganismos.
Un ejemplo particular de resistencia a fármacos es la resistencia a los antibióticos, por lo tanto, de acuerdo con realizaciones particulares adicionales, la proteína de un organismo microbiano es una proteína de un organismo, cepa o variante resistente a los antibióticos o que también se produce en un organismo resistente a los antibióticos. Véase también la sección de ejemplos. Debido a que las presentes moléculas tienen un mecanismo de acción completamente diferente al de los antibióticos conocidos (es decir, agregan una proteína diana del organismo microbiano), se prevé que los organismos resistentes a antibióticos no sean resistentes a estas moléculas. Además, ya que la mayor parte de las regiones hidrófobas de las proteínas se encuentran en partes conservadas de la proteína, se prevé que la resistencia antibiótica (o la resistencia antimicrobiana) se desarrollará más lentamente contra estas moléculas que contra los antibióticos convencionales. De hecho, de acuerdo con realizaciones particulares, los métodos comprenden la administración prolongada de las moléculas sin un aumento significativo en los valores de CIM. Por lo tanto, se proporcionan métodos de administración, en donde se administran las moléculas como se describen en el presente documento al menos una vez al día durante al menos diez días o al menos una vez al día durante catorce días. En particular, este régimen de tratamiento no va acompañado del desarrollo de resistencia a antibióticos. Por lo tanto, estas realizaciones prevén que los valores de CIM a lo largo de este intervalo en el tiempo no aumentan más de cuatro veces o no se duplican. Más particularmente, se prevé que, durante una administración prolongada, el valor de CIM de la molécula interferidora para el organismo microbiano específico permanezca por debajo del punto de corte clínico de la molécula interferidora para el organismo microbiano específico.
De acuerdo con realizaciones específicas, las moléculas pueden usarse para eliminar el organismo patógeno (por ejemplo, microbiano) o los métodos dan como resultado la eliminación del organismo patógeno (por ejemplo, microbiano). De acuerdo con otras realizaciones específicas adicionales, las moléculas tienen éxito en eliminar rápidamente el organismo patógeno (microbiano), en particular, en una hora o menos o en 30 minutos o menos. Un rápido efecto bactericida (o un rápido efecto de eliminación de microorganismos) no solo proporciona mejores resultados clínicos, incluso en monoterapia (Finch et al, Antimicrob Agents Chemother; 46(6):1746-54, 2002), sino que también puede acortar la duración de la terapia antimicrobiana y la duración del ingreso hospitalario, así como contribuir a la reducción en el desarrollo de resistencia. Esto se demostró, por ejemplo, para los antibióticos de fluoroquinolona de rápida eliminación (Albertson et al., Int J Clin Pract.;64(3):378-88, 2010).
De acuerdo con realizaciones alternativas, los métodos que usan las moléculas inhiben el crecimiento y/o la reproducción del organismo patógeno (por ejemplo, microbiano o vírico) sin eliminarlo.
De acuerdo con realizaciones particulares, la proteína del organismo microbiano es una proteína esencial, es decir, el organismo no puede sobrevivir si está desprovisto de la proteína. De acuerdo con otras realizaciones particulares (no excluyentes), la proteína del organismo microbiano está implicada en la formación de biofilms. La formación de biofilms es un fenómeno bien caracterizado y se han identificado y/o caracterizado numerosas proteínas implicadas en la formación de biofilms, algo de lo que será consciente un experto en la materia. Estas proteínas pueden diferir entre las especies microbianas (o pueden ser homólogas, pero tener un nombre diferente). Algunos ejemplos de dichas proteínas incluyen, pero sin limitación, Hwp1, la familia de proteínas Als (en particular, en C. albicans), proteínas codificadas por la familia de genes EPA, la familia de genes AWP1-4 y el gen PWP (en particular, en C. glabrata), en proteínas de Yersinia codificadas por lo genes hmsHFRS, gmhA, yrbH, waaAE-coaD, hmsT, hmsP, speA, speC, nghA, rcsA, rcsC, rcsDB, phoPQ (véase la tabla 1 de Zhou y Yang, Protein Cell 2011), en proteínas de Staphylococcus codificadas por los genes icaADBC, icaR, sar, agr, rbf, sigma(B).
De acuerdo con realizaciones adicionales, se proporcionan métodos para tratar o prevenir la formación de biofilms, en donde la proteína del organismo microbiano está implicada en la formación de biofilms. De acuerdo con otras realizaciones adicionales, la formación del biofilm es sobre un objeto, en particular, un dispositivo implantable, tal como un catéter o un estent.
Por lo tanto, la memoria descriptiva describe métodos para prevenir, inhibir o revertir el crecimiento de biofilms microbianos sobre una superficie, que comprenden poner en contacto la superficie con una molécula de la estructura (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, en donde:
- n es un número entero de 1 a 5 e i aumenta de 1 a n con cada repetición;
- cada uno de X2i-1 y X2i se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P; lo más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, D y P;
- cada Yi se selecciona independientemente de entre una serie de 4 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que está presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E; en donde al menos una Yi es una serie presente en una proteína de un organismo microbiano; y
- cada Zi es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada.
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Más particularmente, la proteína del organismo microbiano es una proteína implicada en la formación de biofilms. La superficie sobre la que se previene, inhibe o revierte la formación del biofilm puede ser una superficie biótica o abiótica. En particular, la superficie puede encontrarse sobre o dentro del organismo del sujeto, ya sea propia del organismo o de un objeto exógeno dentro del organismo, tal como de un dispositivo implantado.
Aunque se prevé principalmente prevenir o tratar infecciones microbianas en sujetos, cabe destacar que las moléculas podrían usarse como agente antimicrobiano para prevenir o remediar la presencia de microorganismos (patógenos) sobre superficies u objetos también fuera del organismo del sujeto. La presente solicitud está prevista principalmente para el recubrimiento de materiales de alto valor o estériles, por ejemplo, materiales usados para dispositivos implantables. Por consiguiente, se proporcionan métodos para prevenir, inhibir o revertir el crecimiento de biofilms microbianos sobre una superficie de un dispositivo implantable, tal como un catéter o un estent.
Por consiguiente, también se prevén dispositivos recubiertos dentro del ámbito de la invención. El recubrimiento de los dispositivos puede efectuarse directamente, aplicando las moléculas al dispositivo. Como alternativa, pueden recubrirse sobre el dispositivo usando enlazadores (reticulantes). Los dispositivos pueden estar completamente recubiertos (por ejemplo, mediante inmersión del dispositivo en una solución de las molécula) o pueden recubrirse solo partes del dispositivo. Se prevé particularmente que los dispositivos estén recubiertos con moléculas contra una proteína presente en un organismo microbiano, en particular, una proteína implicada en la formación de biofilms. Sin embargo, también se prevé que los dispositivos se recubran con moléculas dirigidas contra otras proteínas (o con moléculas que sean biespecíficas y se dirijan a una proteína de un organismo microbiano y otra proteína por medio de restos Yi diferentes). Por ejemplo, el implante de dispositivos a menudo puede causar reacciones inmunitarias adversas localizadas. Estas pueden contrarrestarse recubriendo al menos una parte del dispositivo con moléculas dirigidas contra proteínas implicadas en estas reacciones inmunitarias (o, por ejemplo, con moléculas biespecíficas contra las dos diferentes proteínas). A modo de otro ejemplo, para contrarrestar la infección conjunta (en particular, formadora de biofilms) de hongos y bacterias, puede recubrirse al menos una parte del dispositivo con moléculas dirigidas contra proteínas fúngicas y otra parte con moléculas dirigidas contra proteínas bacterianas (o con moléculas que son (al menos bi)específicas para una proteína fúngica y una proteína bacteriana).
Por lo tanto, la memoria descriptiva describe dispositivos (en particular, dispositivos implantables) que están al menos parcialmente recubiertos con moléculas de la estructura (X2i-1 -Yi-X2i-Zi)n, en donde:
- n es un número entero de 1 a 5 e i aumenta de 1 a n con cada repetición;
- cada uno de X2i-1 y X2i se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P; lo más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, D y P;
- cada Yi se selecciona independientemente de entre una serie de 4 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que está presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E; y
- cada Zi es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada.
Más particularmente, al menos una Yi es una serie de origen natural en una proteína de un organismo microbiano, específicamente, una proteína implicada en la formación de biofilms.
Métodos de selección
De acuerdo con un aspecto adicional, se proporcionan métodos para seleccionar nuevos compuestos en líneas celulares (incluyendo, pero sin limitación, líneas celulares humanas, de mamífero, de insecto y vegetales), patógenos u organismos microbianos. Estos métodos permiten una rápida identificación de compuestos que tienen efecto en el crecimiento, la reproducción o la supervivencia de la línea celular u organismo que se esté estudiando o de compuestos que inhiben la función de proteínas y/o que agregan proteínas en dicha línea celular o proteína, incluso sin conocer previamente la diana. Ya que la regulación a la baja por agregación es específica de secuencia, no obstante, la secuencia de los compuestos de trabajo permitirá una rápida identificación de la diana. Por lo tanto, no solo pueden obtenerse nuevos compuestos usados estos métodos de selección, sino que también permiten la identificación de nuevas dianas farmacológicas. Por este motivo, también puede ser particularmente interesante usar líneas celulares que sirven como modelo de enfermedad (tales como, por ejemplo, líneas celulares de cáncer o incluso células aisladas directamente de un tumor).
La memoria descriptiva describe métodos de selección que comprenden las etapas de:
a) identificar en al menos una proteína al menos una región de 4 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que está presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P,
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R, K, D o E;
b) sintetizar al menos una molécula de la siguiente estructura: (X2i-i-Yi-X2i-Zi)n, en donde:
- n es 1 a 5 e i va de 1 a n;
- cada uno de X2i-1 y X2i se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, A, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P, lo más particularmente seleccionado de entre R, K y P;
- cada Yi se selecciona independientemente de entre una serie de 4 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que esté presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E y en donde al menos un Yi es una serie de origen natural en la al menos una proteína identificada en la etapa a); y
- cada Zi es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada;
c) añadir la al menos una molécula preparada en la etapa b) a la proteína de la etapa a); y
d) evaluar la función y/o la agregación de la proteína.
En particular, los métodos de selección se llevarán a cabo en sistemas celulares o directamente sobre patógenos. La memoria descriptiva describe dichos métodos que incluyen las etapas de:
a) identificar en al menos una proteína de la línea celular, el patógeno o el organismo microbiano al menos una región de 4 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que está presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E;
b) sintetizar al menos una molécula de la siguiente estructura: (X2i-1-Y¡-X2i-Zi)n, en donde:
- n es 1 a 5 e i va de 1 a n;
- cada uno de X2i-1 y X2¡ se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, A, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P, lo más particularmente seleccionado de entre R, K y P;
- cada Y¡ se selecciona independientemente de entre una serie de 4 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que esté presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E y en donde al menos un Yi es una serie de origen natural en la al menos una proteína de la línea celular, el patógeno o el organismo microbiano identificada en la etapa
a); y
- cada Zi es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada;
c) añadir la al menos una molécula preparada en la etapa b) a la línea celular, patógeno u organismo microbiano en cuyo genoma se codifica la proteína de la etapa a); y
d) evaluar la supervivencia y/o el crecimiento o la reproducción de la línea celular, el patógeno o el organismo microbiano.
Como se ha mencionado anteriormente, si se desea, los métodos pueden comprender además una etapa de correlacionar la secuencia Yi de una molécula (sintetizada en la etapa b) que afecta a la supervivencia, el crecimiento y/o la reproducción de la línea celular, el patógeno o el organismo microbiano con una proteína identificada en la etapa a) para identificar la proteína diana. Sin embargo, esta etapa de correlación no es necesaria - para compuestos antipatógenos, puede ser más importante que tenga éxito para inhibir la supervivencia, la reproducción o el crecimiento del patógeno que saber la proteína diana exacta.
Ya que la inhibición de la supervivencia, el crecimiento o la reproducción del organismo diana se prevé principalmente para organismos patógenos (por ejemplo, organismos microbianos o víricos), estos métodos son particularmente adecuados para seleccionar nuevos compuestos antipatógenos (por ejemplo, antimicrobianos o antivíricos).
Por lo tanto, de acuerdo con realizaciones específicas, se proporcionan métodos para seleccionar nuevos compuestos antipatógenos. La memoria descriptiva describe dichos métodos que comprenden las etapas de:
a) identificar en al menos una proteína de un patógeno al menos una región de 4 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que está presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E;
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b) sintetizar al menos una molécula de la siguiente estructura: (X2i-i-Y¡-X2í-Zi)n, en donde:
- n es 1 a 5 e i va de 1 a n;
- cada uno de X2¡-i y X2¡ se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, A, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P, lo más particularmente seleccionado de entre R, D y P;
- cada Y¡ se selecciona independientemente de entre una serie de 4 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que esté presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E y en donde al menos un Yi es una serie de origen natural en una proteína de un organismo patógeno identificado en la etapa a); y
- cada Zi es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada;
c) añadir la al menos una molécula preparada en la etapa b) al organismo patógeno en cuyo genoma se codifica la proteína de la etapa a); y
d) evaluar la supervivencia y/o el crecimiento o la reproducción del organismo patógeno.
De acuerdo con realizaciones específicas, se proporcionan métodos para seleccionar nuevos compuestos antimicrobianos. La memoria descriptiva describe dichos métodos que comprenden las etapas de:
a) identificar en al menos una proteína microbiana al menos una región de 4 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que está presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E;
b) sintetizar al menos una molécula de la siguiente estructura: (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, en donde:
- n es 1 a 5 e i va de 1 a n;
- cada uno de X2M y X2¡ se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, A, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P, lo más particularmente seleccionado de entre R, D y P;
- cada Yi se selecciona independientemente de entre una serie de 4 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que esté presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E y en donde al menos un Yi es una serie de origen natural en una proteína de un organismo microbiano identificado en la etapa a); y
- cada Zi es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada;
c) añadir la al menos una molécula preparada en la etapa b) al organismo microbiano en cuyo genoma se codifica la proteína de la etapa a); y
d) evaluar la supervivencia y/o el crecimiento o la reproducción del organismo microbiano.
Al evaluar la supervivencia, pueden determinarse los valores de CIM. Para identificar un compuesto con actividad antimicrobiana, es decir, para clasificar una molécula como un acierto, la CIM debe ser, en particular, menor de 100 |jg/ml, más en particular, menor de 50 jg/ml, 20 jg/ml o más en particular, menor de 10 jg/ml (tal como, por ejemplo, 5 jg/ml, 2 jg/ml o 1 jg/ml).
Aunque los valores de CIM normalmente se expresan en jg/ml, cabe destacar que el peso molecular de los compuestos es de media significativamente mayor que el de los compuestos antibióticos clásicos. De hecho, mientras que un antibiótico tiene normalmente una masa molecular en el intervalo de 200-700 Dalton, debido a la presencia de aminoácidos en al menos los restos X e Y, y debido al hecho de que puede haber más de una "unidad" presente en las moléculas (es decir, n puede ser mayor de uno), el peso molecular será normalmente (mucho) mayor de 1000 Dalton. Como resultado, una concentración molar similar proporcionará masas moleculares mucho mayores y por tanto, valores de CIM mucho mayores. En otras palabras, para determinar el efecto antimicrobiano eficaz, puede ser interesante calcular el equivalente molar de los valores en jg/ml (y, por ejemplo, comparar estos con valores molares para otros antibióticos).
De acuerdo con realizaciones específicas adicionales, se proporcionan métodos para seleccionar nuevos compuestos antivíricos. La memoria descriptiva describe dichos métodos que comprenden las etapas de:
a) identificar en al menos una proteína vírica al menos una región de 4 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que está presente no más de 1 y preferentemente
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ningún resto de P, R, K, D o E;
b) sintetizar al menos una molécula de la siguiente estructura: (X2i-i-Y¡-X2í-Zi)n, en donde:
- n es 1 a 5 e i va de 1 a n;
- cada uno de X2¡-i y X2¡ se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, A, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P, lo más particularmente seleccionado de entre R, D y P;
- cada Y¡ se selecciona independientemente de entre una serie de 4 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que esté presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E y en donde al menos un Yi es una serie de origen natural en una proteína de un organismo vírico identificado en la etapa a); y
- cada Zi es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada;
c) añadir la al menos una molécula preparada en la etapa b) al organismo vírico en cuyo genoma se codifica la
proteína de la etapa a); y
d) evaluar la supervivencia y/o el crecimiento o la reproducción del organismo vírico.
Típicamente, para virus, la supervivencia puede medirse de manera indirecta evaluando el efecto (por ejemplo, supervivencia) en células infectadas. También puede aplicarse este método indirecto para otros organismos patógenos. Sin embargo, normalmente se prefieren métodos directos, ya que son más cuantitativos. Para virus, puede determinarse el título vírico. Como alternativa, puede establecerse un sistema de minirreplicón en el que solo están presentes proteínas víricas específicas y donde una proteína indicadora es una indicación del efecto en la reproducción o "supervivencia" del virus.
Cabe destacar que, aunque los métodos de selección se describen en el presente documento como métodos para identificar nuevos compuestos antipatógenos, el experto en la materia apreciará fácilmente que estos métodos también pueden usarse para identificar nuevos compuestos dirigidos contra proteínas no patogénicas para seleccionar el compuesto más eficaz. Por ejemplo, las moléculas previstas para tratar una enfermedad mediante la regulación a la baja de una proteína pueden seleccionarse en primer lugar respecto de su eficacia en un modelo celular o animal con una lectura adecuada (a condición de que la conservación de secuencia de la región correspondiente a la al menos una serie Yi sea suficiente para usar el mismo compuesto en el modelo celular o animal y el organismo al que deba administrarse el compuesto). Esto puede efectuarse, por ejemplo, para proteínas que contienen diferentes regiones de beta-agregación o para identificar la mejor combinación de regiones de beta- agregación.
De hecho, de manera similar a los métodos de selección para moléculas que afectan al crecimiento, la reproducción y/o la supervivencia de organismos patógenos (y que como consecuencia, pueden usarse en el tratamiento de enfermedades infecciosas), los métodos pueden usarse para seleccionar moléculas que pueden usarse en enfermedades no infecciosas. Los métodos pueden usarse para identificar el compuesto más eficaz frente a una diana conocida (por ejemplo, seleccionando en una línea celular que tiene un indicador unido vinculado con la actividad de la diana o que depende de la presencia de la diana para su supervivencia) o para identificar nuevas dianas. Esto último es particularmente cierto para aplicaciones donde la lectura puede ser la muerte celular, ya que no dependen de un ensayo indicador. Sin embargo, los métodos pueden usarse para identificar nuevas dianas en una vía para la que también hay disponible un ensayo indicador.
Los métodos de selección presentados en el presente documento proporcionan ventajas considerables frente a los métodos de selección existentes. Por un lado, no son selecciones aleatorias y por lo tanto, tienen más probabilidades de proporcionar compuestos exitosos. Por otro lado, no requieren tener disponibles estructuras 3D de las proteínas diana para una selección eficaz, ya que el direccionamiento está enteramente basado en la secuencia. Se sabe que la identificación de nuevas dianas es un problema particular para antimicrobianos o antibióticos.
Para asegurarse de que el compuesto identificado es eficaz y no tiene efectos secundarios, debe probarse la toxicidad del compuesto, en particular en vertebrados, lo más particularmente, en sistemas de mamíferos. Además, para evitar dirigirse a proteínas no relevantes (por ejemplo, proteínas no microbianas en caso de que se identifique una nueva molécula antibiótica), debe probarse la reactividad cruzada. Esto puede efectuarse en primera instancia fácilmente comparando la secuencia identificada en la etapa a) con secuencias de organismos/especies a las cuales se va a administrar el compuesto (por ejemplo, compuesto antimicrobiano o antivírico), por ejemplo, mediante programas de alineamiento de secuencias, tales como BLAST. Para moléculas dirigidas contra patógenos (que se van a usar en aplicaciones antiinfecciosas), se prevé particularmente que los uno o más restos Yi que son idénticos a series en proteínas de patógenos (por ejemplo, microbianas) presentes en las moléculas no estén codificadas en el genoma del organismo/sujeto (normalmente mamífero, en particular, ser humano) al que se administran las moléculas.
En las realizaciones que abarcan métodos para identificar nuevas dianas para compuestos antipatógenos (por ejemplo, antimicrobianos), se prevé particularmente que la proteína del patógeno (por ejemplo, microbiana) en la
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etapa a) no sea una diana conocida para fármacos (por ejemplo, antibióticos). Esto hará que los compuestos identificados sean particularmente útiles en terapia combinada, ya que se abordan diferentes dianas. Además, en caso de que la diana no sea una diana conocida para fármacos (tales como antibióticos), aún no se ha desarrollado resistencia farmacológica (a antibióticos).
Otra ventaja particular es que los métodos de selección pueden llevarse a cabo sin sesgo de selección para una proteína particular como diana de interés. De hecho, puede analizarse el proteoma completo del organismo (o línea celular) y pueden usarse las secuencias adecuadas en moléculas descritas en el presente documento y comprobarse su eficacia. Esto tiene altas probabilidades de proporcionar nuevas dianas. Además, cuando se efectúa dicho análisis, en particular para aplicaciones antipatógenos, se prevé que las regiones identificadas en la etapa a) sean regiones que aparecen más de una vez en el proteoma. Más particularmente, la al menos una región de 4 a 16 aminoácidos contiguos identificada en la etapa a) aparece en más de una proteína del organismo patógeno (por ejemplo, microbiano o vírico).
De hecho, cuando se afronta una infección, en muchos casos, es deseable usar como diana más de un organismo patógeno. Esto es evidente, por ejemplo, en infecciones con organismos microbianos, donde normalmente se usan antimicrobianos de amplio espectro. Esto permite combatir la infección incluso sin saber la identidad concreta del organismo infeccioso. En los presentes métodos, también puede asegurarse que la al menos una región de 4 a 16 aminoácidos contiguos identificada en la etapa a) se produce en una proteína o en al menos una proteína, de más de un organismo microbiano.
Más particularmente, los organismos microbianos usados como diana en el presente documento son organismos microbianos patógenos. Para asegurarse de que no se eliminan organismos microbianos beneficiosos (por ejemplo, microorganismos beneficiosos en la flora intestinal de un sujeto), puede comprobarse si la serie identificada en el organismo microbiano es específica para organismos patógenos y no aparece en microorganismos beneficiosos.
Aislamiento, eliminación, detección y diagnóstico
La memoria descriptiva describe un método para aislar una proteína específica de una muestra que comprende poner en contacto dicha muestra con al menos una molécula interferidora y aislar el complejo co-agregado de interferidor-proteína resultante de dicha muestra. Es decir, la molécula interferidora actúa como agente de unión que captura la proteína diana. Esto puede usarse en todos los campos donde sea necesaria la detección (por ejemplo, en biotecnología blanca para medir niveles de contaminantes, en biotecnología roja o verde para medir, por ejemplo, niveles de biomarcadores o metabolitos, etc.).
El método para el aislamiento de una proteína específica de una muestra puede comprender además la separación de dicha al menos una proteína de la muestra. Una aplicación de la separación de al menos una proteína de una muestra es la retirada (o eliminación) de proteínas altamente abundantes de una muestra. De hecho, un gran problema en el descubrimiento y validación de dianas proteicas es cómo analizar exhaustivamente muestras de proteínas complejas (por ejemplo, plasma, orina, fluido cefalorraquídeo) y medir dianas traza (es decir, dianas muy poco abundantes). Típicamente, las proteínas abundantes tienen a menudo una concentración 6-10 órdenes de magnitud mayor que la de las proteínas poco abundantes. Por lo tanto, en ciertas ocasiones, deben eliminarse las proteínas altamente abundantes para detectar y medir proteínas traza de importancia médica. Ya que la albúmina, IgG, antitripsina, IgA, transferrina y haptoglobina suponen hasta aproximadamente un 90% del contenido total de proteína en suero humano, existe una necesidad crítica de herramientas de diagnóstico para eliminar rápidamente estas proteínas abundantes no deseadas y desenmascarar las menos abundantes, los biomarcadores proteicos de bajo peso molecular. En la actualidad se usan en la técnica varios métodos: 1) inmunoglobulina G (IgG) como reactivos de afinidad para capturar y separar proteínas diana abundantes, 2) inmunoglobulina de yema de huevo (IgY), que son anticuerpos similares a IgG aislados de la yema de huevo de aves inmunizadas, 3) se usa prefraccionamiento para separar una mezcla de proteínas en diferentes fracciones para retirar ciertas proteínas en la mezcla original y 4) la proteína A y la proteína G son proteínas de la pared celular bacteriana con especificidad por los anticuerpos IgG, por lo tanto, las resinas de afinidad de proteína A y G posibilitan la eliminación de IgG y 5) microperlas de IgG e IgY se usan para la detección de proteínas.
El método para el aislamiento de al menos una proteína puede comprender además la detección de al menos una proteína en dicho complejo de molécula-proteína. La detección puede llevarse a cabo separando los complejos de molécula interferidora-proteína diana mediante, por ejemplo, electroforesis, cromatografía en columna, filtración, atracción electrostática, atracción magnética o paramagnética, espectrometría de masas y similares.
De acuerdo con un aspecto adicional, las moléculas interferidoras, tal como se definen adicionalmente en las reivindicaciones, se usan en la detección o como agentes diagnósticos. Por lo tanto, las moléculas interferidoras, tal como se definen adicionalmente en las reivindicaciones, pueden usarse en un método de diagnóstico. Por consiguiente, se proporcionan métodos de detección y de diagnóstico.
La memoria descriptiva describe métodos para detectar una proteína en una muestra, que comprende las etapas de:
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a) poner en contacto una muestra sospechosa de contener la proteína con una molécula de la siguiente
estructura: (X2i-i-Yi-X2i-Zi)n, en donde:
- n es 1 a 5 e i va de 1 a n;
- cada uno de X2i-1 y X2i se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, A, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P;
- cada Yi se selecciona independientemente de entre una serie de 4 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que esté presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E y en donde al menos un Yi es una serie de origen natural en la proteína que se vaya a detectar; y
- cada Zi es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada;
b) detectar la presencia de moléculas que han reaccionado con la proteína.
La muestra puede proporcionarse tal cual o puede procesarse previamente. Las "moléculas que han reaccionado con la proteína" en la etapa b) prevé tanto moléculas que están reaccionando con la proteína (es decir, detección en tiempo real) como moléculas que han reaccionado con la proteína. Estas moléculas pueden seguir en contacto con la proteína o pueden no estar ya en contacto. Esta detección también puede efectuarse mediante la proteína, es decir, detectando la presencia de proteína que ha reaccionado con las moléculas. La detección puede ser, en ambos casos, directa (midiendo las moléculas o proteínas que han reaccionado) o indirecta (midiendo la fracción que no ha reaccionado).
De acuerdo con realizaciones particulares, la al menos una Yi de origen natural en la proteína que se va a detectar es única para dicha proteína en dicha muestra. Por lo tanto, por ejemplo, en una muestra de origen humano, la secuencia que también aparece en la proteína que se va a detectar está codificada solo una vez en el genoma humano (o se produce solo una vez en el proteoma humano), a saber, en la (secuencia que codifica la) proteína que se va a detectar. Aunque esta unicidad no es siempre necesaria - por ejemplo, cuando proteínas diferentes tienen la misma secuencia y se detectan juntas, siguen pudiéndose discriminar adicionalmente, por ejemplo, basándose en el tamaño - se prevé particularmente que facilita la detección. La parte "en dicha muestra" es importante para determinar la unicidad de la serie de proteína: por ejemplo, en caso de que se procese previamente la muestra, es probable que contenga menos proteínas diferentes que la detección en mezclas complejas o en muestras de diferentes (micro)organismos.
Cabe destacar que los presentes métodos de detección son altamente similares a los métodos establecidos, normalmente métodos de detección a base de anticuerpos. La diferencia significativa es el uso de las moléculas particulares. De hecho, cabe destacar que en los métodos de detección descritos en el presente documento, las moléculas, tal como se han definido en el presente documento, cumplen un papel similar al de los anticuerpos. Por lo tanto, en los métodos de detección que normalmente están basados en anticuerpos, las moléculas descritas en el presente documento pueden reemplazar a al menos un anticuerpo. Por ejemplo, las moléculas donde al menos una Yi es una serie de origen natural en la proteína que se va a detectar pueden reemplazar a un anticuerpo primario en ensayos de detección (y pueden marcarse como "interferidores primarios"), las moléculas donde Yi es una serie de origen natural en un anticuerpo primario usado para la detección pueden reemplazar a un anticuerpo secundario. Como alternativa, la molécula interferidora secundaria puede dirigirse a una etiqueta o marcador condensado a un anticuerpo primario o puede dirigirse a un "interferidor primario" o a un resto condensado al mismo.
De acuerdo con realizaciones específicas, la molécula usada para la detección comprende un marcador detectable. De acuerdo con realizaciones específicas adicionales, la detección en la etapa b) es mediante la detección del marcador detectable.
De acuerdo con realizaciones particulares, los métodos comprenden adicionalmente una separación de moléculas que han reaccionado con la proteína y moléculas que no han reaccionado con la proteína antes de la detección en la etapa b). También puede hacerse lo contrario: separando las proteínas que han reaccionado con las moléculas de las proteínas que no han reaccionado con las moléculas antes de la detección. Cuál de las dos se separa depende normalmente de la configuración del experimento y, por ejemplo, si se inmovilizan proteínas o moléculas.
La detección en la etapa b) puede ser directa o indirecta, por ejemplo, mediante detección de la fracción de moléculas que no ha reaccionado. La detección puede ser cualitativa (por ejemplo, la proteína está presente o no), semicuantitativa (por ejemplo, si hay más o menos cantidad de la proteína presente) o cuantitativa (por ejemplo, qué cantidad hay presente de la proteína).
De acuerdo con realizaciones particulares, la muestra es de un sujeto, particularmente, de un sujeto mamífero, lo más particularmente, de un sujeto humano. Sin embargo, en principio, puede detectarse cualquier proteína que contenga una región de agregación-nucleación, por lo que la fuente de la muestra puede ser de cualquier organismo (por ejemplo, plantas, insectos, patógenos, mamíferos). No es siquiera necesario que la muestra sea de un organismo, en tanto que contenga proteínas. Por ejemplo, puede ser una muestra de fluido (por ejemplo, agua, cerveza) donde se mide la presencia de proteínas (por ejemplo, hormonas, estrógenos) o puede ser una muestra de
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alimento o de pienso. Es importante destacar que, para las muestras que proceden de un organismo, no es necesario que la muestra y la proteína que se va a detectar sean de la misma especie. Por ejemplo, en caso de detectar la presencia de un patógeno, se prevé que se tome una muestra de un sujeto o una planta, mientras que la proteína que se va a detectar es de un patógeno (por ejemplo, virus o microorganismo).
Dicho de manera general, un método de diagnóstico incluye las siguientes etapas: i) una etapa de examen (la recogida de datos, es decir, la detección cualitativa o cuantitativa de un biomarcador de proteína en una muestra), ii) la comparación de los datos obtenidos con valores estándar (por ejemplo, de muestras procedentes de sujetos no enfermos), iii) el hallazgo de cualquier desviación significativa entre los datos obtenidos y los datos de referencia (es decir, comparando los datos) y iv) atribuir la desviación a una imagen clínica (sujeto animal) o estado (sujeto vegetal). Obsérvese que estas etapas también pueden efectuarse para métodos de detección normales. En este caso, el estado obtenido en l etapa iv) no es para un estado de enfermedad, sino, por ejemplo, para la presencia de contaminantes.
Por consiguiente, en realizaciones específicas, la presencia, ausencia o cantidad de proteína detectada es indicativa de un estado de enfermedad (o de salud). Dicho estado de enfermedad puede ser, por ejemplo, la presencia de enfermedad, la ausencia de enfermedad (es decir, el hallazgo de salud), la progresión de la enfermedad (por ejemplo, neoplasia maligna, metástasis, respuesta a la terapia). Algunos ejemplos de proteínas asociadas con estados de enfermedad, por ejemplo, biomarcadores, se encuentran bien documentados en la técnica. Por lo tanto, se proporcionan métodos para la detección de un biomarcador de proteína (es decir, una proteína que indica el estado de enfermedad) en una muestra que comprenden poner en contacto dicha muestra con al menos un interferidor, con especificidad por dicho biomarcador de proteína, opcionalmente aislando el complejo coagregado de interferidor-biomarcador de proteína de dicha muestra y detectar dicho interferidor-biomarcador de proteína. Los biomarcadores de proteínas se usan cada vez más en la clínica para predecir la aparición de enfermedades, diagnosticarlas, controlar su progresión y proporcionar un pronóstico en cuanto a su sensibilidad a agentes terapéuticos (es decir, para predecir la respuesta a agentes terapéuticos, eventos adversos e interacciones farmacológicas y para establecer riesgos iniciales). Algunos ejemplos bien conocidos de biomarcadores para sujetos humanos incluyen el antígeno específico de próstata (PSA) para (la detección temprana de) el cáncer de próstata, el antígeno carcinoembrionario para el cáncer gastrointestinal, la proteína C-reactiva (CRP) para la inflamación sistémica, el factor reumatoide, anticuerpo para el péptido anti-cíclico citrulinado (anti-CCP) para la artritis reumatoide, MMP-3 para el daño articular y anticuerpos para beta amiloide para la enfermedad de Alzheimer. En teoría, los biomarcadores de proteínas son mejores que los marcadores de ARNm debido a su mayor estabilidad y una gama más amplia de tecnologías para estudiarlos. El gran aumento del interés en la investigación sobre biomarcadores está impulsando el desarrollo de nuevos productos predictivos, de diagnóstico y pronósticos en la práctica médica moderna y los biomarcadores también están desempeñando un papel cada vez más importante en el descubrimiento y desarrollo de nuevos fármacos. Los biomarcadores de proteínas pueden identificarse en fluidos corporales (por ejemplo, suero, orina, sangre, saliva, lágrimas, FCR, fluido sinovial, sangre, fluido de aspiración del pezón, ascitis, esperma, sudor, biopsia tumoral). Los biomarcadores pueden dividirse en las categorías de predictivos o pronósticos. Un biomarcador pronóstico se asocia con la probabilidad de un resultado, tal como supervivencia, respuesta (por ejemplo, a una terapia concreta) y recurrencia. Un biomarcador predictivo es un biomarcador que está presente antes de que se produzca un evento y que predice ese resultado. Un biomarcador predictivo puede ser tanto positivo como negativo. Los biomarcadores pueden no solo usarse para diagnosticar una enfermedad, sino también para la selección o el seguimiento de pacientes. A medida que avanza la investigación, la compresión acerca del papel de los biomarcadores puede desempeñar en la gestión de áreas de enfermedad, tales como el cáncer, la cardiología, la neurología, y enfermedades metabólicas, autoinmunitarias e inflamatorias ha evolucionado.
Una lista no limitante de biomarcadores de proteínas que pueden detectarse con las moléculas interferidoras y los métodos de la presente invención comprende el diagnóstico de biomarcadores de cáncer de pulmón (como en el documento WO2005098445), el diagnóstico de carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (como en el documento WO2005034727), el diagnóstico del aneurisma de aorta abdominal (como en el documento WO2009046267), el diagnóstico de enfermedades mediadas por HTLV (como en el documento WO2004029575), el diagnóstico del carcinoma ductal de mama (como en el documento WO2009039023), el diagnóstico del cáncer de próstata (como en el documento WO2004030511), el diagnóstico de la apnea obstructiva del sueño (como en el documento WO2006020567), el pronóstico de pacientes de GBM tratados con Gefitinib (como en el documento WO2010033993), el diagnóstico de la aparición y/o progresión de la esclerosis lateral amiotrófica (como en el documento WO2006060799), el diagnóstico del deterioro cognitivo leve y la enfermedad de Alzheimer (como en el documento WO2008014314), el diagnóstico de la fibrosis hepática (como en el documento US20100323374), el diagnóstico de lesiones del sistema nervioso (como en el documento EP2207033), la detección del daño en músculos esqueléticos (como en el documento WO2007066129), el diagnóstico de la apnea obstructiva del sueño (como en el documento WO2006020567), el diagnóstico de carcinomas malignos de mama (como en el documento WO20052463), el diagnóstico de trastornos urológicos (como en el documento WO2010078403), la evaluación in vitro de la toxicidad en el desarrollo y la embriotoxicidad (como en el documento WO2009146915), el pronóstico y el resultado del tratamiento del glioblastoma (como en el documento WO2009102729), la evaluación de la lesión y exposición a la radiación (como en el documento WO2008140463), la detección del cáncer de hígado (como en el documento US20050202485), la detección del carcinoma nasofaríngeo (como en el documento US20050158745), la
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detección del cáncer de ovario (como en el documento WO2003057014), la predicción de la respuesta clínica a anticuerpos anti-TNF-alfa en pacientes con artritis psoriásica (como en el documento WO2011014349), la detección de biomarcadores salivales para la identificación del cáncer oral y la enfermedad periodontal (como en el documento US20110021370), el diagnóstico del esófago de Barrett y el adenocarcinoma de esófago (como en el documento WO2010115077), el diagnóstico de la fibrilación auricular y el infarto (como en el documento WO2010113185), la predicción del rechazo de aloinjertos (como en el documento WO2010093869), la predicción de la respuesta clínica a anticuerpos anti-TNF en pacientes con espondilitis anquilosante (como en el documento WO2010077722), el diagnóstico de cistitis intersticial (como en el documento WO2010068747), el diagnóstico y pronóstico de la septicemia (como en el documento US20100292131), el pronóstico para el cáncer colorrectal metacrónico (como en el documento US20090155842), el control del tratamiento de la ELA con nimesulida (como en el documento WO2004043444).
De acuerdo con realizaciones específicas adicionales donde se detecta un biomarcador de proteína (es decir, al menos una Yi en las moléculas es una serie de origen natural en una proteína que es indicativa de un estado de enfermedad), estos métodos comprenden además de las etapas a) y b) indicadas anteriormente una etapa c) que correlaciona la presencia, ausencia o cantidad de proteína detectada en la muestra con un estado de enfermedad en un sujeto.
La memoria descriptiva describe moléculas de la siguiente estructura: (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, en donde:
- n es 1 a 5 e i va de 1 a n;
- cada uno de X2i-1 y X2i se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, A, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P;
- cada Yi se selecciona independientemente de entre una serie de 4 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que esté presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E y en donde al menos un Yi es una serie de origen natural en una proteína que es indicativa de un estado de enfermedad; y
- cada Zi es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada; para su uso en el diagnóstico de dicho estado de enfermedad.
Obsérvese que dichos métodos pueden usarse en plantas, para determinar el estado de enfermedad de la planta.
Una realización específica de los métodos anteriores es el diagnóstico de la presencia de infecciones. De acuerdo con esta realización, la proteína indicativa del estado de enfermedad (es decir, infección) es una proteína de un patógeno (causa de la infección y por lo tanto, indicativa de infección). Por consiguiente, la memoria descriptiva describe moléculas de la siguiente estructura: (X2¡-1 -Yi-X2¡-Zi)n, en donde:
- n es 1 a 5 e i va de 1 a n;
- cada uno de X2M y X2¡ se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, A, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P;
- cada Y¡ se selecciona independientemente de entre una serie de 4 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos
un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de
que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que esté presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E y en donde al menos un Y¡ es una serie de origen natural en un patógeno; y
- cada Z¡ es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada;
para su uso en el diagnóstico de la infección por dicho patógeno.
De nuevo, estos métodos diagnósticos pueden aplicarse a sujetos, así como a plantas (u otros organismos en los que puede haber presencia de una infección).
Sin embargo, el diagnóstico no tiene por qué ser siempre de un estado de enfermedad. Como se ha mencionado, los métodos de detección pueden usarse para determinar niveles de proteínas en muestras no procedentes de un sujeto (como normalmente se encuentran en biotecnología industrial) o pueden usarse para determinar niveles de proteína (por ejemplo, metabolitos) en muestras de organismos sin que esto esté vinculado a enfermedades. Este es el caso particular de la biotecnología de plantas, más particularmente para plantas transgénicas. De hecho, puede ser útil medir niveles de proteínas aumentados o reducidos, por ejemplo, para evaluar qué plantas tienen los mayores niveles de expresión de una proteína útil o qué plantas tienen menos expresión de proteínas nocivas o proteínas que hacen que la planta no sea sabrosa o qué plantas tienen una mejor respuesta a condiciones de estrés.
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Ya que en el presente documento se prevén diagnósticos in vitro, también se proporcionan kits que comprenden al menos una molécula como se ha descrito en el presente documento y al menos un tampón adecuado. Dicho kit estará idealmente adaptado para el protocolo de detección específico usado. Los kits pueden contener cualquiera de las composiciones farmacéuticas o las composiciones agroquímicas descritas en el presente documento. Además, el kit puede contener uno o más dispositivos, normalmente, dispositivos usados para la detección de la proteína, tales como soportes sólidos (por ejemplo, placas, micromatrices, nanopartículas, ...), opcionalmente precubiertas con las moléculas descritas en el presente documento. El kit puede contener además instrucciones de uso. Obviamente, los kits no se limitan necesariamente a aplicaciones de diagnóstico o detección. Sin embargo, en el caso de los kits proporcionados para el tratamiento de plantas o sujetos animales, los kits contendrán opcionalmente dispositivos con fines de administración (por ejemplo, una jeringuilla, un recipiente con una boquilla pulverizadora) en lugar de dispositivos de laboratorio.
Se conocen de la técnica anterior una serie de modos diferentes para evaluar los niveles de proteínas (o biomarcadores de proteínas), siendo el ELISA un tipo de protocolo representativo y conveniente para ensayar niveles de proteínas. En el ELISA y los ensayos basados en ELISA, pueden inmovilizarse uno o más anticuerpos específicos para las proteínas de interés (o biomarcadores de proteínas) sobre una superficie sólida seleccionada, preferentemente una superficie que muestre una afinidad por las proteínas, tal como los pocillos de una placa de microtitulación de poliestireno. Después de lavar para eliminar el material no completamente adsorbido, se recubren los pocillos de la placa de ensayo con una proteína "bloqueante" no específica que se sabe que es antigénicamente neutra respecto de la muestra de ensayo, tal como albúmina sérica bovina (BSA), caseína o soluciones de leche en polvo. Esto permite el bloqueo de sitios de adsorción no específica sobre la superficie de inmovilización, reduciendo de este modo el fondo generado por la unión no específica de antígeno sobre la superficie. Después de lavar para eliminar la proteína de bloqueo no específica, se pone en contacto la superficie de inmovilización con la muestra que se vaya a ensayar en condiciones que propician la formación de complejos inmunitarios (antígeno/anticuerpo). Dichas condiciones incluyen diluir la muestra con diluyentes, tales como BsA o gamma globulina bovina (BGG) en suero salino tamponado con fosfato (PBS)/Tween o PBS/Triton-X 100, que también suelen ayudar a reducir el fondo no específico y dejar incubar la muestra durante aproximadamente 2-4 horas a temperaturas del orden de aproximadamente 25-27°C (aunque pueden usarse otras temperaturas). Después de la incubación, se lava la superficie en contacto con el antisuero para eliminar el material que no ha formado inmunocomplejos. Un procedimiento de lavado ilustrativo incluye lavar con una solución, tal como PBS/Tween, PBS/Triton-X 100 o tampón borato. Después, puede determinarse la aparición y cantidad de formación de inmunocomplejos sometiendo a los inmunocomplejos unidos a un segundo anticuerpo que tiene especificidad por la diana que difiere del primer anticuerpo y detectar la unión del segundo anticuerpo. En ciertas realizaciones, el segundo anticuerpo tendrá una enzima asociada, por ejemplo, ureasa, peroxidasa o fosfatasa alcalina, que generará un precipitado de color tras incubar con un sustrato cromogénico adecuado. Por ejemplo, puede emplearse anti-IgG humana conjugado a ureasa o peroxidasa, durante un periodo de tiempo y en condiciones que favorecen el desarrollo de la formación de inmunocomplejos (por ejemplo, incubación durante 2 h a temperatura ambiente en una solución que contiene PBS, tal como PBS/Tween). Después de dicha incubación con el segundo anticuerpo y de lavar para eliminar el material no unido, se cuantifica la cantidad de marcador, por ejemplo, mediante incubación con un sustrato cromogénico, tal como urea y púrpura de bromocresol en el caso de un marcador de ureasa o ácido 2,2'-azino-di-(3-etil-benzotiazol)- 6-sulfónico (ABTS) y H2O2, en el caso de un marcador de peroxidasa. Después, se logra la cuantificación midiendo el grado degeneración de color, por ejemplo, usando un espectrofotómetro de espectro visible. Como alternativa, puede alterarse el formato anterior uniendo en primer lugar la muestra a la placa de ensayo. Después, se incuba el anticuerpo primario con la placa de ensayo, seguido de la detección del anticuerpo primario unido usando un segundo anticuerpo marcado con especificidad por el primer anticuerpo. Como alternativa, pueden emplearse métodos no basados en ELISA para medir los niveles de uno o más biomarcadores de proteína en una muestra. Algunos ejemplos representativos incluyen, pero sin limitación, espectrometría de masas, matrices de proteómica, tecnología de microesferas xMAP™, citometría de flujo, transferencia de Western e inmunohistoquímica. De acuerdo con los métodos de la invención y como además se ilustra en la sección de ejemplos, el anticuerpo primario se reemplaza por un interferidor específico que se une al biomarcador de proteína. En una realización específica, dicho interferidor está marcado con una molécula de detección.
En una realización específica, el sustrato sólido sobre el que se inmoviliza el interferidor o los interferidores específicos puede estar hecho de una gran variedad de materiales y con una gran variedad de formas, por ejemplo, placa de microtitulación, microperlas, varilla graduada, partícula de resina, etc. El sustrato puede seleccionarse para maximizar las relaciones de señal a ruido, para minimizar la unión de fondo, así como para facilitar la separación y el coste. Los lavados pueden efectuarse de una manera lo más adecuada para el sustrato que se esté usando, por ejemplo, eliminando una perla o varilla graduada de un depósito, vaciando o diluyendo un depósito, tal como un pocillo de placa de microtitulación o enjuagando una perla, partícula, columna de cromatografía o filtro con una solución de lavado o con disolvente.
En una realización particular, la detección de un biomarcador de proteína específico es cuantitativa. En otra realización particular, la detección de un biomarcador de proteína específico es cualitativa. Como tal, cuando la detección es cualitativa, los métodos proporcionan una lectura o evaluación, por ejemplo, determinación, de si el biomarcador de proteína está presente o no en la muestra que se esté ensayando. En otras realizaciones más, los métodos proporcionan una detección cuantitativa de si está presente el biomarcador de proteína en la muestra que
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se está ensayando, es decir, una evaluación o determinación de la cantidad real o la abundancia relativa del analito diana. En dichas realizaciones, la detección cuantitativa puede ser absoluta o, en caso de que el método sea un método para detectar dos o más biomarcadores de proteína diferentes en una muestra, relativa. Como tal, el término "cuantificar", cuando se usa en el contexto de la cuantificación de un biomarcador de proteína en una muestra, puede referirse a una cuantificación absoluta o relativa. La cuantificación absoluta puede efectuarse mediante la inclusión de concentraciones conocidas de uno o más biomarcadores de proteína de control y referenciando el nivel detectado del biomarcador de proteína a los biomarcadores de proteínas de control conocidos (por ejemplo, mediante la generación de una curva patrón). Como alternativa, puede lograrse una cuantificación relativa mediante comparación de los niveles o cantidades detectados entre dos o más biomarcadores de proteínas diferentes para proporcionar una cuantificación relativa de cada uno de los dos o más biomarcadores de proteína diferentes, por ejemplo, en relación uno con el otro.
En ciertas realizaciones, se evalúa la detección de solo un biomarcador de proteína. En otras realizaciones más, se evalúa la expresión de dos o más, por ejemplo, aproximadamente 3 o más, aproximadamente 10 o más, aproximadamente 15 o más biomarcadores de proteína. Una forma habitual para hacer esto es usando una micromatriz de unión a proteínas (véase más adelante).
En dichas realizaciones, la predicción, el diagnóstico o la caracterización pueden obtenerse proporcionando, es decir, generando, un informe por escrito que incluye la evaluación de control del experto, es decir, la predicción del experto acerca de la aparición de una enfermedad particular, el diagnóstico del experto de la enfermedad del sujeto o la caracterización del experto del pronóstico de la enfermedad del sujeto. Por lo tanto, un método específico puede incluir además una etapa de generar o producir un informe que proporcione los resultados de una evaluación de control, pudiéndose proporcionar dicho informe en forma de un medio electrónico (por ejemplo, una presentación electrónica en un monitor informático) o en forma de un medio tangible (por ejemplo, un informe impreso en papel u otro medio tangible). Un "informe", tal como se describe en el presente documento, es un documento electrónico o tangible que incluye elementos informativos que proporcionan información de interés relativa a la evaluación de control de un sujeto y sus resultados. Un informe concreto puede generarse completa o parcialmente de manera electrónica. Un informe concreto puede incluir además uno o más de: 1) información acerca de la instalación a cargo de la prueba; 2) información del proveedor del servicio; 3) datos del paciente; 4) datos de la muestra; 5) un informe de evaluación, que puede incluir diversas informaciones que incluyen: a) valores de referencia empleados y b) datos de prueba, donde los datos de prueba pueden incluir, por ejemplo, la determinación de un nivel de proteína; 6) otras características.
El informe puede incluir información acerca de la instalación a cargo de la prueba, siendo dicha información relevante para el hospital, clínica o laboratorio en el que se efectuó la toma de la muestra y/o la generación de los datos. La recogida de la muestra puede incluir obtener una muestra de fluido, por ejemplo, sangre, saliva, orina, etc., una muestra de tejido, por ejemplo, una biopsia de tejido, etc. de un sujeto. La generación de los datos puede incluir medir el nivel de concentración de biomarcador de polipéptido para uno o más biomarcadores que se expresan diferencialmente o están presentes a diferentes niveles en diferentes sujetos.
En muchas realizaciones, los sujetos pertenecen a la clase de los mamíferos, incluyendo el orden de los carnívoros (por ejemplo, perros y gatos), roedores (por ejemplo, ratones, cobayas y ratas), lagomorfos (por ejemplo, conejos) y primates (por ejemplo, seres humanos, chimpancés y monos). En ciertas realizaciones, los animales u hospedadores, es decir, sujetos (también citados en el presente documento como pacientes) son seres humanos.
Tal como se ha explicado anteriormente en el presente documento, las tecnologías de biodetección más ampliamente usadas están basadas en el uso de anticuerpos. Los anticuerpos reconocen y se unen a otras moléculas basándose en su forma y propiedades fisicoquímicas. Los anticuerpos son ideales para detectar cantidades pequeñas de proteínas diana en presencia de mezclas complejas de proteínas. La presente invención muestra que el uso de moléculas interferidoras es una alternativa al uso de anticuerpos (como elemento de reconocimiento) para la captura específica de proteínas diana. De hecho, las moléculas interferidoras pueden usarse en numerosas aplicaciones en las que normalmente se usan anticuerpos. Por nombrar solo algunas, se prevén aplicaciones en diagnósticos, microanalíticas, ciencias forenses y en la detección específica de patógenos. Para las aplicaciones de detección y separación de la invención, puede ser conveniente que la molécula interferidora esté unida a un vehículo (o un soporte). Un soporte puede ser una superficie plana, tal como un plástico o nitrocelulosa o una columna de cromatografía, pero es preferible una perla, tal como perlas microesféricas. Una descripción general acerca de varios tipos de perlas y microesferas, que cumplen el fin de unirse a moléculas interferidoras, se describe en las páginas 9 y 10 del documento US6682940 y se incorpora al presente documento específicamente por referencia. En una realización particular, la molécula interferidora está unida a un vehículo de tipo carbohidrato, por ejemplo, celulosa o agarosa. Puede unirse un interferidor a dicho vehículo de carbohidrato con un agente reticulante, tal como glutaraldehído. En otra realización particular, el vehículo puede ser celulosa, vidrio o un polímero sintético. La unión covalente entre el interferidor y el vehículo puede llevarse a cabo mediante restos de aminoácidos del interferidor y una azida, carbodiimida, isocianato u otros derivados químicos presentes sobre el interferidor.
En otra realización particular más, el vehículo es una microperla de vidrio silanada porosa. El interferidor puede unirse covalentemente al vehículo mediante sus grupos amina de péptido (mediante la reacción de Schiff, seguida
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de reducción con borohidruro de sodio) a grupos aldehido formados por oxidación con peryodato de los grupos glicidoxipropilsilano unidos químicamente a los átomos de silicio (este acoplamiento se describe en Sportsman y Wilson (1980) Anal. Chem. 52, 2013-2018).
En una realización específica, el vehículo está recubierto de una película proteica con la que se reticula el interferidor (véanse las reivindicaciones 1-50 y los ejemplos relativos al vehículo en el documento US4478946).
En otra realización específica, el soporte es una perla fluorescente, tal como una partícula de látex fluorescente. La patente US4550017 y en especial la página 4 de la misma, describe compuestos fluorescentes que pueden usarse para la fabricación de perlas fluorescentes.
En otra realización específica, las perlas son de diversos tamaños y también pueden contener o estar impregnados de colorantes fluorescentes. Debido a los diversos tamaños y colorantes de las perlas, pueden detectarse y cuantificarse múltiples proteínas en una sola reacción. Los procedimientos para el revelado de dichas perlas se describen en el documento US6159748.
En otra realización particular más, el acoplamiento entre la perla y el interferidor es mediante una poli(treonina), una poli(serina), dextrano o poli(etilenglicol). Los ejemplos 6, 7, 8 y 9 del documento US6399317 ilustran cómo puede llevarse a cabo este acoplamiento.
En otra realización particular más, el soporte es una perla magnética. Las perlas magnéticas, el acoplamiento entre perlas magnéticas y un agente proteico y sus usos se describen en la página 8 de la solicitud US6489092.
De acuerdo con un aspecto adicional, el soporte es una micromatriz. Estas se prevén particularmente para la detección multiplexada de proteínas. Por consiguiente, se proporcionan micromatrices que comprenden moléculas descritas en el presente documento. La memoria descriptiva describe micromatrices que comprenden al menos dos moléculas de la siguiente estructura: (X2i-1 -Yi-X2i-Zi)n, en donde:
- n es 1 a 5 e i va de 1 a n;
- cada uno de X2i-1 y X2i se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P; lo más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, D y P;
- cada Yi se selecciona independientemente de entre una serie de 4 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que esté presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E y en donde al menos un Yi es una serie de origen natural en una proteína; y
- cada Zi es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada.
De acuerdo con realizaciones particulares, las moléculas se unen a la micromatriz mediante un enlazador (por ejemplo, un resto Z0 como se describe en el presente documento). La micromatriz puede ser una matriz, chip, perla, placa, transferencia o similar.
De acuerdo con otras realizaciones particulares, las al menos dos moléculas son al menos dos moléculas diferentes. En particular, al menos una región Yi de las moléculas difiere entre las al menos dos moléculas. Más particularmente, al menos una región Yi de una primera de las moléculas es idéntica a una serie en una proteína que es una proteína diferente a la proteína correspondiente a al menos una región Yi diferente de una segunda de las moléculas.
Aplicación en plantas
Las moléculas descritas en el presente documento también pueden usarse para regular a la baja las funciones de proteínas en plantas, células vegetales o semillas de plantas. Obsérvese en este caso también que, esto se aplica a situaciones no infecciosas e infecciosas, es decir, dirigirse a proteínas de plantas o dirigirse a proteínas de patógenos o a patógenos dentro o sobre la planta. Por consiguiente, la memoria descriptiva describe métodos para regular a la baja la función biológica de una proteína en una planta o célula vegetal o semilla de planta, que comprende poner en contacto dicha proteína con una molécula de la siguiente estructura: (X2¡-1 -Yi-X2i-Zi)n, en donde:
- n es un número entero de 1 a 5 e i aumenta de 1 a n con cada repetición;
- cada uno de X2Í-1 y X2¡ se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P; lo más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, D y P;
- cada Y¡ se selecciona independientemente de entre una serie de 4 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que esté presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P,
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R, K, D o E y en donde al menos un Yi es una serie de origen natural en una proteína dentro de o sobre dicha planta, célula vegetal o semilla de planta; y
- cada Zi es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada.
Las etapas adicionales del método pueden incluir beta-agregación intermolecular que se produce entre la proteína y la molécula de origen no natural, de este modo regulando a la baja la función biológica de la proteína. Ya que los sujetos vegetales, al contrario de los sujetos animales, son inmóviles, son particularmente vulnerables a las infecciones por ectoparásitos y patógenos (es decir, plagas). De hecho, muchas especies infecciosas no entran necesariamente en una planta para ejercer su efecto patógeno o no entran durante las etapas iniciales de la infección (por ejemplo, también debido a que las plantas no tienen un sistema digestivo y una pared celular, lo que dificulta que los patógenos accedan al interior de la planta). Por lo tanto, una "proteína en una planta, célula vegetal o semilla de planta" se refiere generalmente a una proteína de otro organismo que está presente en la planta, célula vegetal o semilla de planta. Algunos ejemplos incluyen, pero sin limitación, proteínas de nematodos, áfidos, ácaros, orugas, babosas, mohos y similares. Obsérvese que estos organismos pueden estar presentes en cualquier parte de la planta (por ejemplo, los nematodos normalmente infectan a través de las raíces de la planta, mientras que los áfidos estarán presentes generalmente en las partes verdes de la planta, tales como el tallo y las hojas).
Por lo tanto, los métodos pueden subdividirse en métodos para regular a la baja la función biológica de una proteína vegetal en una planta (por ejemplo, para obtener una propiedad particular, tal como rendimiento aumentado o tolerancia al estrés o en situaciones de enfermedad no infecciosa) y en métodos para regular a la baja la función biológica de una proteína de un organismo de plaga en o sobre una planta (como es el caso en una enfermedad infecciosa).
La memoria descriptiva describe dichos métodos anteriores (para regular a la baja la función biológica de una proteína vegetal en una planta o célula vegetal o semilla de planta), que incluyen la etapa de poner en contacto dicha proteína con una molécula de la siguiente estructura: (X2i-i-Yi-X2i-Zi)n, en donde:
- n es un número entero de 1 a 5 e i aumenta de 1 a n con cada repetición;
- cada uno de X2i-i y X2i se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P; lo más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, D y P;
- cada Yi se selecciona independientemente de entre una serie de 4 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que esté presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E y en donde al menos un Yi es una serie de origen natural en una proteína de dicha planta, célula vegetal o semilla de planta; y
- cada Zi es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada.
La memoria descriptiva describe dichos últimos métodos (para regular a la baja la función biológica de una proteína de un organismo de plaga vegetal en una planta o célula vegetal o semilla de planta), que comprenden poner en contacto dicha proteína con una molécula de la siguiente estructura: (X2i-1-Yi-Xa-Zi)n, en donde:
- n es un número entero de 1 a 5 e i aumenta de 1 a n con cada repetición;
- cada uno de X2i-1 y X2i se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P; lo más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, D y P;
- cada Yi se selecciona independientemente de entre una serie de 4 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que esté presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E y en donde al menos un Yi es una serie de origen natural en una proteína de un organismo de planga presente dentro de o sobre dicha planta, célula vegetal o semilla de planta; y
- cada Zi es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada.
El término "planta", tal como se usa en el presente documento, abarca plantas completas, ancestros y descendencia de las plantas y partes de plantas, incluyendo semillas, brotes, tallos, hojas, raíces (incluyendo tubérculos), flores y tejidos y órganos, en donde cada uno de los anteriores comprende el gen/ácido nucleico de interés. El término "planta" también abarca células vegetales, cultivos en suspensión, tejido de callo, embriones, regiones meristémicas, gametofitos, esporofitos, polen y microesporas, nuevamente en donde cada uno de los anteriores comprende el gen/ácido nucleico de interés.
Las plantas que son particularmente útiles en los métodos de la invención incluyen, en particular, plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas, incluyendo forraje o legumbres forrajeras, plantas ornamentales, cultivos alimentarios, árboles o arbustos seleccionados de la lista que comprende Acer spp., Actinidia spp., Abelmoschus spp., Agave sisalana, Agropyron spp., Agrostis stolonifera, Allium spp., Amaranthus spp., Ammophila arenaria, Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens, Arachis spp, Artocarpus spp., Asparagus officinalis, Avena spp.
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(por ejemplo, Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida), Averrhoa carambola, Bambusa sp., Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris, Brassica spp. (por ejemplo, Brassica napus, Brassica rapa ssp. [colza, colza oleaginosa, nabo]), Cadaba farinosa, Camela sinensis, Canna indica, Cannabis sativa, Capsicum spp., Carex elata, Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carya spp., Carthamus tinctorius, Castanea spp., Ceiba pentandra, Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Colocasia esculenta, Cola spp., Corchorus sp., Coriandrum sativum, Corylus spp., Crataegus spp., Crocus sativus, Cucurbita spp., Cucumis spp., Cynara spp., Daucus carota, Desmodium spp., Dimocarpus longan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp., Elaeis (por ejemplo, Elaeis guineensis, Elaeis oleifera), Eleusine coracana, Eragrostis tef, Erianthus sp., Eriobotrya japonica, Eucalyptus sp., Eugenia uniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Festuca arundinacea, Ficus carica, Fortunella spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glycine spp. (por ejemplo, Glycine max, Soja hispida o Soja max), Gossypium hirsutum, Helianthus spp. (por ejemplo, Helianthus annuus), Hemerocallis fulva, Hibiscus spp., Hordeum spp. (por ejemplo, Hordeum vulgare), Ipomoea batatas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp., Lens culinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Luffa acutangula, Lupinus spp., Luzula sylvatica, Lycopersicon spp. (por ejemplo, Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme), Macrotyloma spp., Malus spp., Malpighia emarginata, Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp., Manilkara zapota, Medicago sativa, Melilotus spp., Mentha spp., Miscanthus sinensis, Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., Ornithopus spp., Oryza spp. (por ejemplo, Oryza sativa, Oryza latifolia), Panicum miliaceum, Panicum virgatum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Pennisetum sp., Persea spp., Petroselinum crispum, Phalaris arundinacea, Phaseolus spp., Phleum pratense, Phoenix spp., Phragmites australis, Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Punica granatum, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Ricinus communis, Rubus spp., Saccharum spp., Salix sp., Sambucus spp., Secale cereale, Sesamum spp., Sinapis sp., Solanum spp. (por ejemplo, Solanum tuberosum, Solanum integrifolium o Solanum lycopersicum), Sorghum bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp., Tagetes spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp., Tripsacum dactyloides, Triticosecale rimpaui, Triticum spp. (por ejemplo, Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum, Triticum monococcum o Triticum vulgare), Tropaeolum minus, Tropaeolum majus, Vaccinium spp., Vicia spp., Vigna spp., Viola odorata, Vitis spp., Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus spp., entre otros.
Las plagas de plantas, tal como se usan en el presente documento, son en particular insectos, arácnidos, helmintos, hongos, virus, bacterias, nematodos y moluscos encontrados en agricultura, en horticultura, en bosques, en jardines y en instalaciones de recreo. Las composiciones de acuerdo con la invención son activas contra especies normalmente sensibles y resistentes y contra todas o algunas etapas del desarrollo. Etas plagas de plantas incluyen: plagas del filo: Arthropoda, en particular de la clase de los arácnidos, por ejemplo, Acarus spp., Aceria sheldoni, Aculops spp., Aculus spp., Amblyomma spp., Amphitetranychus viennensis, Argas spp., Boophilus spp., Brevipalpus spp., Bryobia praetiosa, Centruroides spp., Chorioptes spp., Dermanyssus gallinae, Dermatophagoides pteronyssius, Dermatophagoides farinae, Dermacentor spp., Eotetranychus spp., Epitrimerus pyri, Eutetranychus spp., Eriophyes spp., Halotydeus destructor, Hemitarsonemus spp., Hyalomma spp., Ixodes spp., Latrodectus spp., Loxosceles spp., Metatetranychus spp., Nuphersa spp., Oligonychus spp., Ornithodorus spp., Ornithonyssus spp., Panonychus spp., Phyllocoptruta oleivora, Polyphagotarsonemus latus, Psoroptes spp., Rhipicephalus spp., Rhizoglyphus spp., Sarcoptes spp., Scorpio maurus, Stenotarsonemus spp., Tarsonemus spp., Tetranychus spp., Vaejovis spp., Vasates lycopersici.
Otros ejemplos son del orden de los Anoplura (Phthiraptera), por ejemplo, Damalinia spp., Haematopinus spp., Linognathus spp., Pediculus spp., Ptiruspubis, Trichodectes spp.
Otros ejemplos más son del orden de los Chilopoda, por ejemplo, Geophilus spp., Scutigera spp. Otros ejemplos más son del orden de los coleópteros, por ejemplo, Acalymma vittatum, Acanthoscelides obtectus, Adoretus spp., Agelastica alni, Agriotes spp., Alphitobius diaperinus, Amphimallon solstitialis, Anobium punctatum, Anoplophora spp., Anthonomus spp., Anthrenus spp., Apion spp., Apogonia spp., Atomaria spp., Attagenus spp., Bruchidius obtectus, Bruchus spp., Cassida spp., Cerotoma trifurcata, Ceutorrhynchus spp., Chaetocnema spp., Cleonus mendicus, Conoderus spp., Cosmopolites spp., Costelytra zealandica, Ctenicera spp., Curculio spp., Cryptorhynchus lapathi, Cylindrocopturus spp., Dermestes spp., Diabrotica spp., Dichocrocis spp., Diloboderus spp., Epilachna spp., Epitrix spp., Faustinus spp., Gibbium psylloides, Hellula undalis, Heteronychus arator, Heteronyx spp., Hylamorpha elegans, Hylotrupes bajulus, Hypera postica, Hypothenemus spp., Lachnosterna consanguinea, Lema spp., Leptinotarsa decemlineata, Leucoptera spp., Lissorhoptrus oryzophilus, Lixus spp., Luperodes spp., Lyctus spp., Megascelis spp., Melanotus spp., Meligethes aeneus, Melolontha spp., Migdolus spp., Monochamus spp., Naupactus xanthographus, Niptus hololeucus, Oryctes rhinoceros, Oryzaephilus surinamensis, Oryzaphagus oryzae, Otiorrhynchus spp., Oxycetonia jucunda, Phaedon cochleariae, Phyllophaga spp., Phyllotreta spp., Popillia japonica, Premnotrypes spp., Prostephanus truncatus, Psylliodes spp., Ptinus spp., Rhizobius ventralis, Rhizopertha dominica, Sitophilus spp., Sphenophorus spp., Stegobium paniceum, Sternechus spp., Symphyletes spp., Tanymecus spp., Tenebrio molitor, Tribolium spp., Trogoderma spp., Tychius spp., Xylotrechus spp., Zabrus spp.
Otros ejemplos más son del orden de los colémbolos, por ejemplo, Onychiurus armatus.
Otros ejemplos más son del orden de los Diplopoda, por ejemplo, Blaniulus guttulatus.
Otros ejemplos más son del orden de los dípteros, por ejemplo, Aedes spp., Agromyza spp., Anastrepha spp., Anopheles spp., Asphondylia spp., Bactrocera spp., Bibio hortulanus, Calliphora erythrocephala, Ceratitis capitata, Chironomus spp., Chrysomyia spp., Chrysops spp., Cochliomyia spp., Contarinia spp., Cordylobia anthropophaga, Culex spp., Culicoides spp., Culiseta spp., Cuterebra spp., Dacus oleae, Dasyneura spp., Delia spp., Dermatobia
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hominis, Drosophila spp., Echinocnemus spp., Fannia spp., Gasterophilus spp., Glossina spp., Haematopota spp., Hydrellia spp., Hylemyia spp., Hyppobosca spp., Hypoderma spp., Liriomyza spp., Lucilia spp., Lutzomia spp., Mansonia spp., Musca spp., Nezara spp., Oestrus spp., Oscinella frit, Pegomyia spp., Phlebotomus spp., Phorbia spp., Phormia spp., Prodiplosis spp., Psila rosae, Rhagoletis spp., Sarcophaga spp., Simulium spp., Stomoxys spp., Tabanus spp., Tannia spp., Tetanops spp., Tipula spp.
Otros ejemplos más son del orden de los Heteroptera, por ejemplo, Anasa tristis, Antestiopsis spp., Boisea spp., Blissus spp., Calocoris spp., Campylomma livida, Cavelerius spp., Cimex spp., Collaria spp., Creontiades dilutus, Dasynus piperis, Dichelops furcatus, Diconocoris hewetti, Dysdercus spp., Euschistus spp., Eurygaster spp., Heliopeltis spp., Horcias nobilellus, Leptocorisa spp., Leptoglossus phyllopus, Lygus spp., Macropes excavatus, Miridae, Monalonion atratum, Nezara spp., Oebalus spp., Pentomidae, Piesma quadrata, Piezodorus spp., Psallus spp., Pseudacysta persea, Rhodnius spp., Sahlbergella singularis, Scaptocoris castanea, Scotinophora spp., Stephanitis nashi, Tibraca spp., Triatoma spp.
Otros ejemplos más son del orden de los Homoptera, por ejemplo, Acyrthosipon spp., Acrogonia spp., Aeneolamia spp., Agonoscena spp., Aleurodes spp., Aleurolobus barodensis, Aleurothrixus spp., Amrasca spp., Anuraphis cardui, Aonidiella spp., Aphanostigma pin, Aphis spp., Arboridia apicalis, Aspidiella spp., Aspidiotus spp., Atanus spp., Aulacorthum solani, Bemisia spp., Brachycaudus helichrysii, Brachycolus spp., Brevicoryne brassicae, Calligypona marginata, Carneocephala fulgida, Ceratovacuna lanigera, Cercopidae, Ceroplastes spp., Chaetosiphon fragaefolii, Chionaspis tegalensis, Chlorita onukii, Chromaphis juglandicola, Chrysomphalus ficus, Cicadulina mbila, Coccomytilus halli, Coccus spp., Cryptomyzus ribis, Dalbulus spp., Dialeurodes spp., Diaphorina spp., Diaspis spp., Drosicha spp., Dysaphis spp., Dysmicoccus spp., Empoasca spp., Eriosoma spp., Erythroneura spp., Euscelis bilobatus, Ferrisia spp., Geococcus coffeae, Hieroglyphus spp., Homalodisca coagulata, Hyalopterus arundinis, Icerya spp., Idiocerus spp., Idioscopus spp., Laodelphax striatellus, Lecanium spp., Lepidosaphes spp., Lipaphis erysimi, Macrosiphum spp., Mahanarva spp., Melanaphis sacchari, Metcalfiella spp., Metopolophium dirhodum, Monellia costalis, Monelliopsis pecanis, Myzus spp., Nasonovia ribisnigri, Nephotettix spp., Nilaparvata lugens, Oncometopia spp., Orthezia praelonga, Parabemisia myricae, Paratrioza spp., Parlatoria spp., Pemphigus spp., Peregrinus maidis, Phenacoccus spp., Phloeomyzus passerinii, Phorodon humuli, Phylloxera spp., Pinnaspis aspidistrae, Planococcus spp., Protopulvinaria pyriformis, Pseudaulacaspis pentagona, Pseudococcus spp., Psylla spp., Pteromalus spp., Pyrilla spp., Quadraspidiotus spp., Quesada gigas, Rastrococcus spp., Rhopalosiphum spp., Saissetia spp., Scaphoides titanus, Schizaphis graminum, Selenaspidus articulatus, Sogata spp., Sogatella furcifera, Sogatodes spp., Stictocephala festina, Tenalaphara malayensis, Tinocallis caryaefoliae, Tomaspis spp., Toxoptera spp., Trialeurodes spp., Trioza spp., Typhlocyba spp., Unaspis spp., Viteus vitifolii, Zygina spp.
Otros ejemplos más son del orden de los himenópteros, por ejemplo, Acromyrmex spp., Athalia spp., Atta spp., Diprion spp., Hoplocampa spp., Lasius spp., Monomorium pharaonis, Solenopsis invicta, Tapinoma spp., Vespa spp. Otros ejemplos más son del orden de los Isopoda, por ejemplo, Armadillidium vulgare, Oniscus asellus, Porcellio scaber.
Otros ejemplos más son del orden de los Isoptera, por ejemplo, Coptotermes spp., Cornitermes cumulans, Cryptotermes spp., Incisitermes spp., Microtermes obesi, Odontotermes spp., Reticulitermes spp.
Otros ejemplos más son del orden de los lepidópteros, por ejemplo, Acronicta major, Adoxophyes spp., Aedia leucomelas, Agrotis spp., Alabama spp., Amyelois transitella, Anarsia spp., Anticarsia spp., Argyroploce spp., Barathra brassicae, Borbo cinnara, Bucculatrix thurberiella, Bupalus piniarius, Busseola spp., Cacoecia spp., Caloptilia theivora, Capua reticulana, Carpocapsa pomonella, Carposina niponensis, Chematobia brumata, Chilo spp., Choristoneura spp., Clysia ambiguella, Cnaphalocerus spp., Cnephasia spp., Conopomorpha spp., Conotrachelus spp., Copitarsia spp., Cydia spp., Dalaca noctuides, Diaphania spp., Diatraea saccharalis, Earias spp., Ecdytolopha aurantium, Elasmopalpus lignosellus, Eldana saccharina, Ephestia spp., Epinotia spp., Epiphyas postvittana, Etiella spp., Eulia spp., Eupoecilia ambiguella, Euproctis spp., Euxoa spp., Feltia spp., Galleria mellonella, Gracillaria spp., Grapholitha spp., Hedylepta spp., Helicoverpa spp., Heliothis spp., Hofmannophila pseudospretella, Homoeosoma spp., Homona spp., Hyponomeuta padella, Kakivoria flavofasciata, Laphygma spp., Laspeyresia molesta, Leucinodes orbonalis, Leucoptera spp., Lithocolletis spp., Lithophane antennata, Lobesia spp., Loxagrotis albicosta, Lymantria spp., Lyonetia spp., Malacosoma neustria, Maruca testulalis, Mamestra brassicae, Mocis spp., Mythimna separata, Nymphula spp., Oiketicus spp., Oria spp., Orthaga spp., Ostrinia spp., Oulema oryzae, Panolis flammea, Parnara spp., Pectinophora spp., Perileucoptera spp., Phthorimaea spp., Phyllocnistis citrella, Phyllonorycter spp., Pieris spp., Platynota stultana, Plodia interpunctella, Plusia spp., Plutella xylostella, Prays spp., Prodenia spp., Protoparce spp., Pseudaletia spp., Pseudoplusia includens, Pyrausta nubilalis, Rachiplusia nu, Schoenobius spp., Scirpophaga spp., Scotia segetum, Sesamia spp., Sparganothis spp., Spodoptera spp., Stathmopoda spp., Stomopteryx subsecivella, Synanthedon spp., Tecia solanivora, Thermesia gemmatalis, Tinea pellionella, Tineola bisselliella, Tortrix spp., Trichophaga tapetzella, Trichoplusia spp., Tuta absoluta, Virachola spp.
Otros ejemplos más son del orden de los Orthoptera, por ejemplo, Acheta domesticus, Blatta orientalis, Blattella germanica, Dichroplus spp., Gryllotalpa spp., Leucophaea maderae, Locusta spp., Melanoplus spp., Periplaneta spp., Pulexirritans, Schistocerca gregaria, Supella longipalpa.
Otros ejemplos más son del orden de los Siphonaptera, por ejemplo, Ceratophyllus spp., Ctenocephalides spp., Tunga penetrans, Xenopsylla cheopis.
Otros ejemplos más son del orden de los Symphyla, por ejemplo, Scutigerella spp.
Otros ejemplos más son del orden de los Thysanoptera, por ejemplo, Anaphothrips obscurus, Baliothrips biformis, Drepanothris reuteri, Enneothrips flavens, Frankliniella spp., Heliothrips spp., Hercinothrips femoralis, Rhipiphorothrips cruentatus, Scirtothrips spp., Taeniothrips cardamoni, Thrips spp.
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Otros ejemplos más son del orden de los Zygentoma (=Thysanura), por ejemplo, Lepisma saccharina, Thermobia domestica.
En otra realización, las plagas del filo Mollusca, en particular de la clase de los Bivalvia, por ejemplo, Dreissena spp. también son plagas de plantas importantes.
En otra realización, las plagas de la clase de los Gastropoda son plagas de plantas importantes, por ejemplo, Anion spp., Biomphalaria spp., Bulinus spp., Deroceras spp., Galba spp., Lymnaea spp., Oncomelania spp., Pomacea spp., Succinea spp.
En otra realización más, las plagas de plantas son del filo Nematoda y son plagas de plantas importantes, es decir, nematodos fitoparasíticos, lo que significa nematodos parásitos de plantas que causan daño a las plantas. Los nematodos de plantas abarcan nematodos parásitos de plantas y nematodos que viven en el suelo. Los nematodos parásitos de plantas incluyen, pero sin limitación, ectoparásitos, tales como Xiphinema spp., Longidorus spp. y Trichodorus spp.; semiparásitos, tales como Tylenchulus spp.; endoparásitos migratorios, tales como Pratylenchus spp., Radopholus spp. y Scutellonerna spp.; parásitos sedentarios, tales como Heterodera spp., Globodera spp. y Meloidogyne spp. y endoparásitos del tallo y las hojas, tales como Ditylenchus spp., Aphelenchoides spp. y Hirshmaniella spp. Además, los nematodos del suelo parásitos de las raíces dañinos son nematodos formadores de quistes de los géneros Heterodera o Globodera y/o nematodos del nudo de la raíz del género Meloidogyne. Las especies dañinas de estos géneros son, por ejemplo, Meloidogyne incognata, Heterodera glycines (nematodo del quiste de la soja), Globodera pallida y Globodera rostochiensis (nematodo del quiste de la patata). Otros géneros importantes más relevantes como plagas de plantas comprenden Rotylenchulus spp., Paratriclodorus spp., Pratylenchus penetrans, Radolophus simuli, Ditylenchus dispaci, Tylenchulus semipenetrans, Xiphinema spp., Bursaphelenchus spp. y similares. En particular Aphelenchoides spp., Bursaphelenchus spp., Ditylenchus spp., Globodera spp., Heterodera spp., Longidorus spp., Meloidogyne spp., Pratylenchus spp., Radopholus similis, Trichodorus spp., Tylenchulus semipenetrans, Xiphinema spp.
En otra realización más, las plagas de plantas son virus y los métodos de la invención se dirigen al tratamiento de una infección vírica o a la inhibición de la infectividad vírica en una planta, seleccionándose el virus de plantas entre un alfamovirus, un allexivirus, un alfacriptovirus, un anulavirus, un apscaviroide, un aureusvirus, un avenavirus, un aisunviroide, un badnavirus, un begomovirus, un benivirus, un betacriptovirus, un betaflexiviridae, un bromovirus, un bimovirus, un capilovirus, un carlavirus, un carmovirus, un caulimovirus, un cavemovirus, un cheravirus, un closterovirus, un cocadviroide, un coleviroide, un comovirus, un crinivirus, un cucumovirus, un curtovirus, un citorabdovirus, un diantovirus, un enamovirus, un umbravirus y virus satélite de tipo B, un fabavirus, un fijivirus, un furovirus, un hordeivirus, un hostuviroide, un idaeovirus, un ilarvirus, un ipomovirus, un luteovirus, un maclomovirus, un macluravirus, un marafivirus, un mastrevirus, un nanovirus, un necrovirus, un nepovirus, un nucleorabdovirus, un oleavirus, un ofiovirus, un orizavirus, un panicovirus, un pecluvirus, un petuvirus, un fitoreovirus, un polerovirus, un pomovirus, un pospiviroide, un potexvirus, un potivirus, un reovirus, un rabdovirus, un rimovirus, un sadwavirus, un virus smilar a SbCMV, un sequivirus, un sobemovirus, un tenuivirus, un virus satélite similar a TNsatV, un tobamovirus, un topocuvirus, un tospovirus, un tricovirus, un tritimovirus, un tungrovirus, un timovirus, un umbravirus, un varicosavirus, un vitivirus o un waikavirus.
En otra realización más, las plagas de plantas pueden ser hongos patógenos de plantas. Dichos hongos de plantas incluyen, pero sin limitación, aquellos seleccionados del grupo que consiste en los géneros: Alternaría; Ascochyta; Botrytis; Cercospora; Colletotrichum; Diplodia; Erysiphe; Fusarium; Leptosphaeria; Gaeumanomyces;
Helminthosporium; Macrophomina; Nectria; Peronospora; Phoma; Phymatotrichum; Phytophthora; Plasmopara; Podosphaera; Puccinia; Puthium; Pyrenophora; Pyricularia; Pythium; Rhizoctonia; Scerotium; Sclerotinia; Septoria; Thielaviopsis; Uncinula; Venturia; y Verticillium. Algunos ejemplos específicos de infecciones por hongos en plantas que pueden tratarse con los interferidores de la presente invención incluyen, Erysiphe graminis en cereales, Erysiphe cichoracearum y Sphaerotheca fuliginea en curcubitáceas, Podosphaera leucotricha en manzanas, Uncinula necator en vides, Puccinia sp. en cereales, Rhizoctonia sp. en algodón, patatas, arroz y campos, Ustilago sp. en cereales y caña de azúcar, Venturia inaequalis (costra) en manzanas, Helminthosporium sp. en cereales, Septoria nodorum en el trigo, Septoria tritici en el trigo, Rhynchosporium secalis en la cebada, Botrytis cinerea (moho gris) en las fresas, tomates y uvas, Cercospora arachidicola en cacahuetes, Peronospora tabacina en el tabaco u otros Peronospora en diversos cultivos, Pseudocercosporella herpotrichoides en el trigo y la cebada, Pyrenophera teres en la cebada, Pyricularia oryzae en el arroz, Phytophthora infestans en patatas y tomates, Fusarium sp. (tales como Fusarium oxysporum) y Verticillium sp. en diversas plantas, Plasmopara viticola en las uvas, Alternaría sp. en frutas y hortalizas, Pseudoperonospora cubensis en el pepino, Mycosphaerella fijiensis en el plátano, Ascochyta sp. en guisantes, Leptosphaeria sp. en la colza y Colleotrichum sp. en diversos cultivos.
En otra realización particular, las plagas de plantas son bacterias patógenas de plantas incluyendo, pero sin limitación, Acidovorax avenae subsp. avenae (que causa la raya parda bacteriana del arroz), Acidovorax avenae subsp. cattleyae (que causa la mancha marrón bacteriana de la cattleya), Acidovorax konjaci Konnyaku (que causa la plaga bacteriana de la hoja), Agrobacterium rhizogenes (que causa la raíz peluda del melón), Agrobacterium tumefaciens (que causa la agalla de la corona), Burkholderia andropogonis (que causa la mancha bacteriana del clavel), Burkholderia caryophylli (que causa la marchitez bacteriana del clavel), Burkholderia cepacia (que causa la macha marrón bacteriana del cymbidium), Burkholderia gladioli pv. gladioli (que causa la putrefacción del cuello del gladiolo), Burkholderia glumae (que causa la podredumbre del grano bacteriana del arroz), Burkholderia plantarii (que causa la marchitez bacteriana de la plántula del arroz), Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (que causa el cancro bacteriano del tomate), Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (que causa la podredumbre
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anillada de la patata), Clostridium spp. (que causa la podredumbre fangosa de la patata), Curtobacterium flaccumfaciens (que causa el cancro bacteriano de la cebolla), Erwinia amylovora (que causa la niebla del peral), Erwinia ananas (que causa pardeamiento bacteriano de la palea del arroz), Erwinia carotovora subsp. atroseptica (que causa el tallo negro de la patata), Erwinia carotovora subsp. carotovora (que causa la podredumbre blanda de las hortalizas), Erwinia chrysanthemi (que causa la plaga bacteriana de las plántulas de taro), Erwinia chrysanthemi pv. zeae (que causa la podredumbre bacteriana del tallo del arroz), Erwinia herbicola pv. millettiae (que causa las agallas bacteriana de glicinas), Pseudomonas cichorii (que causa la mancha bacteriana del crisantemo), Pseudomonas corrugate Pith (que causa la necrosis del tomate), Pseudomonas fuscovaginae (que causa la podredumbre parda de la vaina del arroz), Pseudomonas marginalis pv. marginalis (que causa la podredumbre blanda de la col), Pseudomonas rubrisubalbicans (que causa rayas moteadas de la caña de azúcar), Pseudomonas syringae pv. aptata (que causa la plaga bacteriana de la remolacha azucarera), Pseudomonas syringae pv. atropurpurea (que causa el añublo de halo del raigrás), Pseudomonas syringae pv. castaneae (que causa el cancro bacteriano de la castaña), Pseudomonas syringae pv. glycinea (que causa el tizón bacteriano de soja), Pseudomonas syringae pv. lachrymans (que causa la mancha bacteriana del pepino), Pseudomonas syringae pv. maculicola (que causa la mancha negra bacteriana de la col), Pseudomonas syringae pv. mori (que causa el tizón bacteriano de la morera), Pseudomonas syringae pv. morsprunorum (que causa el cancro bacteriano de la ciruela), Pseudomonas syringae pv. oryzae (que causa el añublo de halo del arroz), Pseudomonas syringae pv. phaseolicola (que causa el añublo de halo de la alubia), Pseudomonas syringae pv. pisi (que causa la plaga bacteriana del guisante), Pseudomonas syringae pv. sesame (que causa la mancha bacteriana del sésamo), Pseudomonas syringae pv. striafaciens (que causa la marchitez a rayas de la avena), Pseudomonas syringae pv. syringae (que causa la mancha marrón bacteriana de la perla roja pequeña), Pseudomonas syringae pv. tabaci (que causa el fuego salvaje del tabaco), Pseudomonas syringae pv. theae (que causa la plaga bacteriana del té), Pseudomonas syringae pv. tomato (que causa la mancha foliar bacteriana del tomate), Pseudomonas viridiflava (que causa la mancha marrón bacteriana de la alubia), Ralstonia solanacearum (que causa marchitamiento bacteriano), Rathayibacter rathayi (que causa la plaga bacteriana de la hierba orchard), Streptomyces scabies (que causa la costra común de la patata), Streptomyces ipomoea (que causa la podredumbre del suelo de la batata), Xanthomonas albilineans (que causa la raya blanca de la caña de azúcar), Xanthomonas campestris pv. cerealis (que causa la raya bacteriana del centeno), Xanthomonas campestris pv. campestris (que causa la podredumbre negra), Xanthomonas campestris pv. citri (que causa el cancro de los cítricos), Xanthomonas campestris pv. cucurbitae (que causa la mancha marrón bacteriana del pepino), Xanthomonas campestris pv. glycines (que causa la pústula bacteriana de la soja), Xanthomonas campestris pv. incanae (que causa la podredumbre negra del mango), Xanthomonas campestris pv. (que causa la mancha foliar angular del algodón malvacearum), Xanthomonas campestris pv. (que causa el cancro bacteriano del mango), Mangiferaeindicae Xanthomonas campestris pv. mellea (que causa la mancha foliar bacteriana del tabaco de Wisconsin), Xanthomonas campestris pv. (que causa la mancha bacteriana de grandes nigromaculans bardana), Xanthomonas campestris pv. phaseoli (que causa la pústula bacteriana de la alubia), Xanthomonas campestris pv. pisi (que causa la podredumbre del tallo de la alubia), Xanthomonas campestris pv. pruni (que causa el agujero de bala bacteriano del melocotón), Xanthomonas campestris pv. raphani (que causa la mancha bacteriana del nabo japonés), Xanthomonas campestris pv. ricini (que causa la mancha bacteriana de la planta de la colza), Xanthomonas campestris pv. theicola (que causa el cancro del té), Xanthomonas campestris pv. translucens (que causa la plaga bacteriana de la hierba orchard), Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (que causa la mancha bacteriana del tomate), Xanthomonas oryzae pv. oryzae (que causa el marchitamiento foliar bacteriano del arroz). Aunque la molécula puede administrarse tal cual, en plantas, se prevé particularmente usar una estrategia transgénica. En estos casos, los métodos hacen uso de secuencias de ácido nucleico de origen no natural que codifican una molécula que tiene la siguiente estructura:
(X2i-1 Yi-X2i-Zi)n, en donde n es un número entero de 1 a 5 e i aumenta de 1 a n con cada repetición; y en donde
- cada uno de X2i-1 y X2i se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P; lo más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, D y P;
- cada Yi se selecciona independientemente de entre una serie de 4 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que esté presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E y en donde al menos un Yi es una serie de origen natural en una proteína en una planta, célula vegetal o semilla de planta (o en una proteína de un patógeno de plantas); y
- cada Zi es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada.
Por lo tanto, los métodos anteriores pueden reformularse como métodos para regular a la baja la función biológica de una proteína vegetal en una planta o célula vegetal o semilla de planta (o para regular a la baja la función biológica de una proteína de un organismo de plaga en una planta o célula vegetal o semilla de planta, respectivamente), que comprenden transformar dicha planta, célula vegetal o semilla de planta, con una (es decir, al menos una) secuencia de ácido nucleico de origen no natural que codifica una molécula que tiene la estructura indicada anteriormente.
Como alternativa, los métodos pueden reformularse como métodos para regular a la baja la función biológica de una proteína vegetal en una planta o célula vegetal o semilla de planta (o para regular a la baja la función biológica de
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una proteína de un organismo de plaga en una planta o célula vegetal o semilla de planta, respectivamente), que comprenden expresar, en dicha planta, célula vegetal o semilla de planta, secuencias de ácido nucleico de origen no natural que codifican una molécula que tiene la estructura indicada anteriormente.
De acuerdo con realizaciones específicas, la secuencia de polipéptido codificada es un polipéptido de origen no natural. De acuerdo con realizaciones particulares adicionales, la secuencia de ácido nucleico es un gen artificial. Un gen artificial comprende normalmente los siguientes elementos de ADN unidos operativamente: a) un promotor expresable en plantas, b) una secuencia de ácido nucleico (en particular, ADN) que codifica la molécula descrita anteriormente y c) una región 3' terminal que comprende señales de terminación de la transcripción y de poliadenilación que funcionan en las células de dicha planta.
Ya que el aspecto del ácido nucleico es particularmente adecuado en aplicaciones que emplean expresión transgénica, las realizaciones particularmente previstas son aquellas donde la secuencia de ácido nucleico (o el gen artificial) se fusiona a otro resto, en particular, un resto que aumenta la solubilidad y/o la estabilidad del producto génico. De hecho, en ocasiones, la expresión transgénica de péptidos puede ser difícil, debido a la rápida degradación del producto. Por lo tanto, un gen artificial comprende los siguientes elementos de ADN unidos operativamente: a) un promotor expresable en plantas, b) un ácido nucleico que codifica una molécula interferidora fusionado a un resto que potencia la solubilidad (impide la agregación) de la molécula interferidora y c) una región 3' terminal que comprende señales de terminación de la transcripción y de poliadenilación que funcionan en células de dicha planta.
La memoria descriptiva describe vectores recombinantes que comprenden dicha secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula como se ha descrito en el presente documento. Estos vectores recombinantes son idealmente adecuados como vehículos para portar la secuencia de ácido nucleico de interés al interior de una célula donde se expresa la proteína que se vaya a regular a la baja y dirigir la expresión del ácido nucleico en dicha célula. El vector recombinante puede permanecer en forma de una entidad separada en la célula (por ejemplo, en forma de un plásmido) o puede integrarse en el genoma de la célula.
Más particularmente, la molécula es un polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos presente en un vector recombinante y que, tras su introducción en la célula vegetal, la semilla de planta o la planta, produce dicho polipéptido en dicha célula vegetal, la semilla de planta o la planta. En estos casos, la puesta en contacto entre la proteína y la molécula de origen no natural se produce mediante la expresión de dicha molécula de origen no natural en dicha planta o célula vegetal. La función biológica de la proteína, por lo tanto, se regula a la baja mediante la expresión de la molécula interferidora.
Por consiguiente, la memoria descriptiva describe plantas o células vegetales o semillas de plantas, que contienen una secuencia de ácido nucleico, un gen artificial o un vector recombinante como se ha descrito en el presente documento. También se prevén en el presente documento protoplastos de plantas que contienen dichas secuencias.
En la presente invención, un "promotor expresable en plantas" comprende elementos reguladores, que median la expresión de un segmento de secuencia codificante en células vegetales. Para la expresión en plantas, la molécula de ácido nucleico ha de estar unida operativamente a o comprender un promotor adecuado que expresa el gen en el instante correcto y con el patrón de expresión espacial necesario. Para la identificación de promotores funcionalmente equivalentes, puede analizarse la fuerza del promotor y/o el patrón de expresión de un promotor candidato, por ejemplo, uniendo operativamente el promotor a un gen indicador y evaluando el nivel y el patrón de expresión del gen indicador en diversos tejidos de la planta. Los genes indicadores adecuados bien conocidos incluyen, por ejemplo, beta-glucuronidasa o beta-galactosidasa. La actividad del promotor se evalúa midiendo la actividad enzimática de la beta-glucuronidasa o la beta-galctosidasa. La fuerza del promotor y/o el patrón de expresión pueden compararse entonces con los de un promotor de referencia (tal como el usado en los métodos de la presente invención). Como alternativa, la fuerza del promotor puede evaluarse cuantificando los niveles de ARNm o comparando los niveles de ARNm del ácido nucleico usado en los métodos de la presente invención, con los niveles de ARNm de genes constitutivos, tales como ARNr 18S, usando métodos conocidos en la técnica, tales como transferencia de Northern con análisis densitométrico de los autorradiogramas, PCR cuantitativa en tiempo real o RT-PCR (Heid et al., 1996 Genome Methods 6: 986-994). Por "promotor débil" se entiende normalmente un promotor que dirige la expresión de una secuencia codificante a bajo nivel. Por "bajo nivel" se entiende niveles de aproximadamente 1/10.000 transcritos a aproximadamente 1/100.000 transcritos, hasta aproximadamente 1/500.000 transcritos por célula. Por el contrario, un "promotor fuerte" dirige la expresión de una secuencia codificante a alto nivel o a de aproximadamente 1/10 transcritos a aproximadamente 1/100 transcritos hasta aproximadamente 1/1000 transcritos por célula. En general, por "promotor de fuerza intermedia" se entiende un promotor que dirige la expresión de una secuencia codificante a un nivel menor que un promotor fuerte, en particular a un nivel que es, en todos los casos, menores que el obtenido cuando está bajo el control del promotor 35S de CaMV.
La expresión "unido operativamente", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un enlace funcional entre la secuencia promotora y el gen de interés, de tal forma que la secuencia del promotor es capaz de iniciar la transcripción del gen de interés.
Un "promotor constitutivo" se refiere a un promotor que es transcripcionalmente activo durante la mayor parte, pero no necesariamente todas, las fases del crecimiento y desarrollo y en la mayor parte de las condiciones ambientales,
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en al menos una célula, tejido u órgano. Un promotor "ubicuo" está activo en sustancialmente todos los tejidos o células de un organismo. Un promotor regulado por el desarrollo está activo durante ciertas etapas del desarrollo o en partes de la planta que sufren cambios de desarrollo. Un promotor inducible tiene un inicio de la transcripción inducido o aumentado en respuesta a un estímulo químico (para una revisión, véase Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48:89-108), ambiental o físico o puede ser "inducible por estrés", es decir, se activa cuando se expone a una planta a diversas condiciones de estrés o uno "inducible por patógenos", es decir, se activa cuando se expone a una planta a varios patógenos. Un promotor específico de órgano o tejido es uno que es capaz de iniciar la transcripción preferencialmente en ciertos órganos o tejidos, tales como las hojas, raíces, tejido de semilla, etc. Por ejemplo, un "promotor específico de raíz" es un promotor que está transcripcionalmente activo predominantemente en las raíces de la planta, sustancialmente hasta su exclusión en cualquier otra parte de una planta, aunque se permite cualquier expresión residual en estas otras partes de plantas. Los promotores capaces de iniciar la transcripción en ciertas células únicamente se citan en el presente documento como "específicos de células". Un promotor específico de semillas está transcripcionalmente activo predominantemente en el tejido de las semillas, pero no necesariamente de manera exclusiva en el tejido de las semillas (en los casos de expresión residual). El promotor específico de semillas puede estar activo durante el desarrollo de la semilla y/o durante la germinación. El promotor específico de semillas puede ser específico de endospermo/aleurona/embrión. Se proporcionan ejemplos de promotores específicos de semillas en Qing Qu y Takaiwa (Plant Biotechnol. J. 2, 1 13125, 2004), cuya divulgación se incorpora al presente documento por referencia como si se expusiese en su totalidad. Un promotor específico de tejidos verdes, tal como se define en el presente documento, es un promotor que está transcripcionalmente activo predominantemente en los tejidos verdes, sustancialmente hasta su exclusión en cualquier otra parte de una planta, aunque se permite cualquier expresión residual en estas otras partes de plantas.
El término "terminador" abarca una secuencia de control que es una secuencia de ADN al final de una unidad transcripcional que señaliza el procesamiento 3' y la poliadenilación de un transcrito primario y la terminación de la transcripción. El terminador puede proceder de un gen natural, procedente de una serie de diferentes genes de plantas o de ADN-T. El terminador que se vaya a añadir puede proceder, por ejemplo, de los genes de nopalina sintasa o de octopina sintasa o como alternativa de otro gen de planta o menos preferentemente, de cualquier otro gen de eucariota.
"Marcador de selección", "gen marcador de selección" o "gen indicador" incluye cualquier gen que confiere un fenotipo a una célula en la que se expresa para facilitar la identificación y/o selección de células que están transfectadas o transformadas con una construcción de ácido nucleico de la invención. Estos genes marcadores permiten la identificación de una transferencia exitosa de las moléculas de ácido nucleico a través de una serie de principios diferentes. Pueden seleccionarse marcadores adecuados de entre los marcadores que confieren resistencia a antibióticos o herbicidas, que introducen un nuevo rasgo metabólico o que permiten la selección visual. Algunos ejemplos de genes marcadores de selección incluyen genes que confieren resistencia a antibióticos (tales como nptll, que fosforila la neomicina y la kanamicina o hpt, que fosforila la higromicina o genes que confieren resistencia a, por ejemplo, bleomicina, estreptomicina, tetraciclina, cloranfenicol, ampicilina, gentamicina, geneticina (G418), espectinomicina o blasticidina), a herbicidas (por ejemplo, bar que proporciona resistencia a Basta®; aroA o gox que proporcionan resistencia contra el glifosato o los genes que confieren resistencia a, por ejemplo, imidazolinona, fosfinotricina o sulfonilurea) o genes que proporcionan un rasgo metabólico (tal como manA, que permite a las plantas usar manosa como única fuente de carbono o xilosa isomerasa, para la utilización de la xilosa o marcadores antinutritivos, tales como la resistencia a 2-desoxiglucosa). La expresión de genes marcadores visuales da como resultado la formación de color (por ejemplo p-glucuronidasa, GUS o p-galactosidasa con sus sustratos coloreados, por ejemplo X-Gal), luminiscencia (tal como el sistema de luciferina/luciferasa) o fluorescencia (proteína verde fluorescente, GFP y derivados de la misma). Esta lista representa únicamente un pequeño número de los posibles marcadores. El experto estará familiarizado con dichos marcadores. Se prefieren marcadores distintos, dependiendo del organismo y del método de selección.
Se sabe que tras la integración estable o transitoria de ácidos nucleicos en células vegetales, solo una minoría de las células capta el ADN extraño y, si se desea, se integra en su genoma, dependiendo del vector de expresión usado y de la técnica de transfección usada. Para identificar y seleccionar estos integrantes, normalmente se introduce un gen marcador de selección (tal como los descritos anteriormente) en las células hospedadoras junto con el gen de interés. Estos marcadores pueden usarse, por ejemplo, en mutantes en los que estos genes no son funcionales mediante, por ejemplo, eliminación por métodos convencionales. Además, las moléculas de ácido nucleico que codifican un marcador de selección pueden introducirse en una célula hospedadora en el mismo vector que comprende la secuencia que codifica los polipéptidos de la invención o usados en los métodos de la invención o si no, en un vector separado. Las células que se han transfectado de manera estable con el ácido nucleico introducido pueden identificarse, por ejemplo, mediante selección (por ejemplo, las células que han integrado el marcador de selección sobreviven, mientras que las demás células mueren).
Ya que los genes marcadores, en particular los genes para la resistencia a antibióticos y herbicidas, dejan de ser necesarios o deseados en la célula hospedadora transgénica una vez que se han introducido con éxito los ácidos nucleicos, el proceso de acuerdo con la invención para introducir los ácidos nucleicos emplea ventajosamente técnicas que permiten la eliminación o escisión de estos genes marcadores. Uno de estos métodos es lo que se conoce como co-transformación. El método de la co-transformación emplea dos vectores simultáneamente para la transformación, un vector que porta el ácido nucleico de acuerdo con la invención y un segundo que porta los genes marcadores. Una gran proporción de los transformantes recibe o, en el caso de las plantas, comprende (hasta un 40% o más de los transformantes), ambos vectores. En el caso de transformación con Agrobacterium, los
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transformantes reciben normalmente solo una parte del vector, es decir, la secuencia flanqueada por el ADN-T, que normalmente representa el casete de expresión. Después, pueden eliminarse los genes marcadores de la planta transformada efectuando cruces. En otro método, se usan genes marcadores integrados en un transposón para la transformación junto con el ácido nucleico deseado (conocido como tecnología Ac/Ds). Los transformantes pueden cruzarse con una fuente de transposasa o los transformantes se transforman con una construcción de ácido nucleico que confiere expresión de una transposasa, transitoria o estable. En algunos casos (aproximadamente un 10%), el transposón sale del genoma de la célula hospedadora una vez que se ha producido con éxito la transformación y se pierde. En un número de casos adicionales, el transposón salta a una ubicación distinta. En estos casos, el gen marcador ha de eliminarse efectuando cruzamientos. En microbiología, se desarrollaron técnicas que hacen posible o facilitan, la detección de dichos eventos. Un método ventajoso adicional se basa en lo que se conoce como sistemas de recombinación; su ventaja es que la eliminación por cruzamiento puede evitarse. El sistema de este tipo mejor conocido es lo que se conoce por el sistema Cre/lox. Cre1 es una recombinasa que elimina las secuencias ubicadas entre las secuencias de loxP. En caso de que el gen marcador se integre entre las secuencias de loxP, se elimina una vez que se ha producido la transformación con éxito, mediante la expresión de la recombinasa. Algunos sistemas de recombinación adicionales son los sistemas HIN/HIX, FLP/FRT y REP/STB (Tribble et al., J. Biol. Chem., 275, 2000: 22255-22267; Velmurugan et al., J. Cell Biol., 149, 2000: 553-566). Es posible una integración de sitio específico en el genoma de una planta de las secuencias de ácido nucleico de acuerdo con la invención.
A efectos de la presente invención, "transgénico", "transgén" o "recombinante" significan con respecto a, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico, un casete de expresión, una construcción génica o un vector que comprende la secuencia de ácido nucleico o un organismo transformado con las secuencias de ácido nucleico, los casetes de expresión o los vectores de acuerdo con la invención.
A efectos de la presente invención, se entiende que una planta transgénica significa, como antes, que los ácidos nucleicos usados en el método de la invención (por ejemplo, los genes artificiales) no están presentes en o se originan en, el genoma de dicha planta o están presentes en el genoma de dicha planta pero no en su locus natural en el genoma de dicha planta, siendo posible que los ácidos nucleicos se expresen de manera homóloga o heteróloga. Sin embargo, como se ha mencionado, transgénico también significa que, aunque los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención o usados en el método de la invención se encuentran en su posición natural en el genoma de una planta, la secuencia se ha modificado respecto de la secuencia natural y/o que las secuencias reguladoras de las secuencias naturales se han modificado. Preferentemente, transgénico se interpreta como la expresión de los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención en un locus no natural en el genoma, es decir, se produce la expresión homóloga o heteróloga de los ácidos nucleicos. En el presente documento se mencionan las plantas transgénicas preferidas.
El término "expresión" o "expresión génica" significa la transcripción de un gen específico o de genes específicos o de una construcción génica específica. En particular, el término "expresión" o "expresión génica" significa la transcripción de un gen o genes o una construcción genética en ARN estructural (ARNr, ARNt) o ARNm con o sin la traducción posterior del último en una proteína. El proceso incluye la transcripción del ADN y el procesamiento del producto de ARNm resultante.
La expresión "expresión aumentada" o "sobreexpresión", tal como se usa en el presente documento, significa cualquier forma de expresión que sea adicional al nivel de expresión de tipo silvestre original. A efectos de la presente invención, el nivel de expresión de tipo silvestre original también podría ser cero, es decir, ausencia de expresión o expresión no medible.
Los métodos para aumentar la expresión de genes o de productos génicos se encuentran bien documentados en la técnica e incluyen, por ejemplo, sobreexpresión dirigida por promotores adecuados (tal como se ha descrito anteriormente en el presente documento), el uso de potenciadores de la transcripción o potenciadores de la traducción. Pueden introducirse ácidos nucleicos aislados que sirven como promotor o potenciador en una posición adecuada (normalmente cadena arriba) de una forma no heteróloga de un polinucleótido a fin de regular positivamente la expresión de un ácido nucleico que codifica el polipéptido de interés. En caso de que se desee la expresión de polipéptido, generalmente es deseable incluir una región de poliadenilación en el extremo 3' de una región codificante de polinucleótido. La región de poliadenilación puede proceder de un gen natural, procedente de una serie de diferentes genes de plantas o de ADN-T. La secuencia 3' terminal que se vaya a añadir puede proceder, por ejemplo, de los genes de nopalina sintasa o de octopina sintasa o como alternativa de otro gen de planta o menos preferentemente, de cualquier otro gen de eucariota.
También puede añadirse una secuencia intrónica a la región 5' no traducida (UTR) o a la secuencia codificante de la secuencia codificante parcial para aumentar la cantidad de mensaje maduro que se acumula en el citosol. La inclusión de un intrón cortable y empalmable en la unidad de transcripción en construcciones de expresión tanto en plantes como en animales ha mostrado aumentar la expresión génica a nivel tanto de ARNm como de proteína hasta 1000 veces (Buchman y Berg (1988) Mol. Cell biol. 8: 4395-4405; Callis et al. (1987) Genes Dev 1:1 183-1200). Dicho potenciamiento intrónico de la expresión génica es generalmente mayor cuando se sitúa próximo al extremo 5' de la unidad de transcripción. El uso de los intrones de maíz Adh1 -S, intrón 1,2 y 6, el intrón Bronce-1, se conoce en la técnica. Para información general, véase: The Maize Handbook, Capítulo 1 16, Freeling y Walbot, Eds., Springer, N.Y. (1994).
El término "introducción" o "transformación", tal como se cita en el presente documento, abarca la transferencia de un polinucleótido exógeno en una célula hospedadora, independientemente del método usado para la transferencia. El tejido vegetal capaz de propagarse posteriormente de manera clonal, ya sea mediante organogénesis o embriogénesis, puede transformarse con una construcción genética de la presente invención y regenerarse una planta completa a partir del mismo. El tejido concreto seleccionado variará dependiendo de los sistemas de
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propagación clonal disponibles y más adecuados para la especie particular que se esté transformando. Algunos tejidos diana ejemplares incluyen discos foliares, polen, embriones, cotiledones, hipocótilos, megagametofitos, tejido de callo, tejido meristemático existente (por ejemplo, meristemo apical, brotes axilares y meristemos radiculares) y tejido de meristemo inducido (por ejemplo, meristemo de cotiledón y meristemo de hipocótilo). El polinucleótido puede introducirse de manera transitoria o estable en una célula hospedadora y puede mantenerse no integrado, por ejemplo, en forma de un plásmido. Como alternativa, puede integrarse en el genoma del hospedador. La célula vegetal transformada resultante puede usarse después para regenerar una planta transformada de un modo conocido por los expertos en la materia.
La transferencia de genes exógenos al genoma de una planta se denomina transformación. La transformación de especies de plantas es en la actualidad una técnica prácticamente rutinaria. De manera ventajosa, puede usarse cualquiera de diversos métodos de transformación para introducir el gen de interés en una célula ancestral adecuada. Los métodos descritos para la transformación y regeneración de plantas a partir de tejidos vegetales o de células vegetales pueden utilizarse para transformación transitoria o estable. Los métodos de transformación incluyen el uso de liposomas, electroporación, agentes químicos que aumentan la captación de ADN libre, inyección de ADN directamente en la planta, bombardeo con pistolas de partículas, transformación usando virus o polen y microproyectiles. Los métodos pueden seleccionarse de entre el método de calcio/polietilenglicol para protoplastos (Krens, F.A. et al., (1982) Nature 296, 72-74; Negrutiu I et al. (1987) Plant Mol Biol 8: 363-373); electroporación de protoplastos (Shillito R.D. et al. (1985) Bio/Technol 3, 1099-1 102); microinyección en material vegetal (Crossway A et al., (1986) Mol. Gen Genet 202: 179-185); bombardeo con partículas recubiertas de ADN o ARN (Klein TM et al., (1987) Nature 327: 70) infección con virus (no integrativos) y similares. Las plantas transgénicas, incluyendo plantas de cultivo transgénicas, se producen preferentemente mediante transformación mediada por Agrobacterium. Un método de transformación ventajoso es la transformación en la planta. Para este fin, es posible, por ejemplo, permitir que las agrobacterias actúen sobre semillas de plantas o inocular el meristemo de la planta con agrobacterias. Ha demostrado ser bastante rápido de acuerdo con la invención dejar que una suspensión de agrobacterias transformadas actúe sobre la planta intacta o al menos sobre las flores principales. Posteriormente, se cultiva la planta hasta que se obtienen las semillas de la planta tratada (Clough y Bent, Plant J. (1998) 16, 735-743). Los métodos para la transformación mediada por Agrobacterium de arroz incluyen métodos bien conocidos para la transformación del arroz, tales como aquellos descritos en cualquiera de los siguientes: Solicitud de Patente Europea EP1198985, Aldemita y Hodges (Planta 199: 612-617, 1996); Chan et al. (Plant Mol Biol 22 (3): 491 -506, 1993), Hiei et al. (Plant J 6 (2): 271 -282, 1994) cuyas divulgaciones se incorporan al presente documento por referencia como si se hubiesen expuesto en su totalidad. En el caso de la transformación del maíz, el método preferido es como el descrito en Ishida et al. (Nat. Biotechnol 14(6): 745-50, 1996) o en Frame et al. (Plant Physiol 129(1): 13-22, 2002) cuyas divulgaciones se incorporan al presente documento por referencia como si se hubiesen expuesto en su totalidad. Dichos métodos se describen adicionalmente, a modo de ejemplo, en B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, en: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung y R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 y en Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225). Los ácidos nucleicos o la construcción que se va a expresar se clona preferentemente en un vector, que es adecuado para transformar Agrobacterium tumefaciens, por ejemplo pBin19 (Bevan et al (1984) Nucl. Acids Res. 12-8711). Las agrobacterias transformadas mediante dicho vector pueden usarse a continuación de un modo conocido para la transformación de plantas, tales como plantas usadas como modelo, tales como Arabidopsis o plantas de cultivo tales como, a modo de ejemplo, plantas de tabaco, por ejemplo, sumergiendo hojas raspadas u hojas cortadas en una solución de agrobacterias y después cultivándolas en un medio adecuado. La transformación de plantas mediante Agrobacterium tumefaciens se describe, por ejemplo, por Hofgen y Willmitzer en Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877 o se conoce, entre otras cosas, a partir de F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; en Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung y R. Wu, Academic Press, 1993, págs. 15-38.
Además de la transformación de células somáticas, que después se tienen que regenerar en plantas intactas, también es posible transformar las células de meristemos vegetales y en particular, aquellas células que se desarrollan en gametos. En este caso, los gametos transformados siguen el desarrollo natural de la planta, dando lugar a plantas transgénicas. Por lo tanto, por ejemplo, las semillas de Arabidopsis se tratan con agrobacterias y se obtienen semillas a partir de las plantas en desarrollo, de las cuales una cierta proporción se ha transformado y es, por tanto, transgénica [Feldman, KA y Marks MD (1987). Mol Gen Genet 208:1 -9; Feldmann K (1992). en: C Koncz, N-H Chua y J Shell, eds, Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Singapur, págs. 274-289]. Algunos métodos alternativos están basados en la eliminación repetida de inflorescencias y la incubación del sitio de escisión en el centro de la roseta con agrobacterias transformadas, mediante lo cual, las semillas transformadas pueden igualmente obtenerse en un momento posterior (Chang (1994). Plant J. 5: 551 -558; Katavic (1994). Mol Gen Genet, 245: 363-370). Sin embargo, un método especialmente eficaz es el método de infiltración al vacío con sus modificaciones, tales como el método de la "inmersión floral". En el caso de la infiltración al vacío de Arabidopsis, se trata a las plantas intactas a presión reducida con una suspensión de agrobacterias [Bechthold, N (1993). CR Acad Sci Paris Life Sci, 316: 1 194-1 199], mientras que en el caso del método de "inmersión floral", el tejido floral en desarrollo se incuba brevemente con una suspensión de agrobacterias tratada con tensioactivo [Clough, SJ y Bent AF (1998) The Plant J. 16, 735-743]. En ambos casos, se recoge una cierta proporción de semillas transgénicas y estas semillas pueden distinguirse de las semillas no transgénicas por crecer en las condiciones selectivas anteriormente descritas. Además, la transformación estable de plastidios es ventajosa debido a que los plastidios se heredan por vía maternal en la mayoría de cultivos, reduciendo o eliminando el riesgo de flujo de transgenes a través del polen. La transformación del genoma de los cloroplastos se logra generalmente mediante un proceso que se ha presentado esquemáticamente en Klaus et al., 2004 [Nature Biotechnology 22 (2), 225-229]. Brevemente, las
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secuencias que se van a transformar se clonan junto con un gen marcador de selección de entre secuencias flanqueantes homólogas al genoma del cloroplasto. Estas secuencias homólogas flanqueantes dirigen la integración de sitio específico en el plastoma. La transformación de plastidios se ha descrito para muchas especies de plantas distintas y se proporciona una descripción general en Bock (2001), Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology. J Mol Biol. 21 de septiembre de 2001; 312 (3):425-38 o Maliga, P (2003) Progress towards commercialization of plastid transformation technology. Trends Biotechnol. 21, 20-28. Recientemente se ha publicado un avance biotecnológico adicional en forma de plastidios transformantes sin marcador, que pueden producirse mediante un gen marcador co-integrado (Klaus et al., 2004, Nature Biotechnology 22(2), 225-229).
Las células vegetales modificadas genéticamente pueden regenerarse mediante todos los métodos familiares para un experto en la materia. Los métodos adecuados pueden incorporarse en las publicaciones anteriormente mencionadas de S.D. Kung y R. Wu, Potrykus o Hofgen y Willmitzer. Generalmente, después de la transformación, las células vegetales o los agrupamientos celulares se seleccionan respecto de la presencia de uno o más marcadores que están codificados por genes expresables en plantas transferidos junto con el gen de interés, tras lo cual el material transformado se regenera en una planta completa. Para seleccionar plantas transformadas, el material vegetal obtenido en la transformación, por norma general, se somete a condiciones selectivas de tal forma que puedan distinguirse las plantas transformadas de las plantas no transformadas. Por ejemplo, las semillas obtenidas del modo anteriormente descrito pueden plantarse y, después de un periodo de crecimiento inicial, someterse a una selección adecuada por rociado. Una posibilidad adicional es cultivar las semillas, en caso adecuado después de la esterilización, sobre placas de agar usando un agente de selección adecuado, de tal forma que solo puedan crecer y convertirse en plantas las semillas transformadas. Como alternativa, las plantas transformadas se seleccionan respecto de la presencia de un marcador de selección, tal como aquellos descritos anteriormente. Después de la transferencia de ADN y de la regeneración, también pueden evaluarse las plantas supuestamente transformadas, por ejemplo, usando análisis de Southern, respecto de la presencia del gen de interés, el número de copias y/o la organización genómica. Como alternativa o además, pueden controlarse los niveles de expresión del ADN recién introducido usando análisis de Northern y/o de Western, siendo ambas técnicas ampliamente conocidas por los expertos habituales en la materia.
Las plantas transformadas generadas pueden propagarse mediante diversos medios, tales como propagación clonal o técnicas de fitomejoramiento convencionales. Por ejemplo, puede autocruzarse una planta transformada de primera generación (o T1) y seleccionarse los transformantes homocigotos de segunda generación (o T2) y después, pueden propagarse adicionalmente las plantas de T2 mediante técnicas de fitomejoramiento convencionales. Los organismos transformados generados pueden adoptar diversas formas. Por ejemplo, pueden ser quimeras de células transformadas y células no transformadas; transformantes clonales (por ejemplo, todas las células transformadas para que contengan el casete de expresión); injertos de tejidos transformados y no transformados (por ejemplo, en plantas, un esqueje de raíz transformado injertado en un vástago no transformado).
La selección de plantas de control adecuadas es una parte rutinaria de una situación experimental y puede incluir plantas de tipo silvestre correspondientes o plantas correspondientes sin el gen de interés. La planta de control es normalmente de la misma especie de planta o incluso de la misma variedad que la planta que se vaya a evaluar. La planta de control también puede usar un nulicigoto de la planta que se vaya a evaluar. Los nulicigotos son individuos que carecen del transgén por segregación. Una "planta de control", tal como se usa en el presente documento, se refiere no solo a plantas completas, sino también a partes de planta, incluyendo semillas y partes de semillas.
La expresión "casete de expresión" se refiere a cualquier sistema de expresión recombinante con el fin de expresar una secuencia de ácido nucleico de la invención in vitro o in vivo, de manera constitutiva o inducible, en cualquier célula, incluyendo, además de células vegetales, células procariotas, de levadura, fúngicas, de insecto o de mamífero. El término incluye sistemas de expresión lineales y circulares. El término incluye todos los vectores. Los casetes pueden permanecer episómicos o integrarse en el genoma de la célula hospedadora. Los casetes de expresión pueden tener la capacidad de auto-replicarse o no (es decir, impulsan únicamente la expresión transitoria en una célula). El término incluye casetes de expresión recombinantes que contienen únicamente los elementos mínimos necesarios para la transcripción del ácido nucleico recombinante.
De acuerdo con realizaciones alternativas, las moléculas se administran a las plantas tal cual y no en forma de un transgén. Ya que las plantas no tienen un sistema digestivo, el término administración, en este caso particular, también prevé aplicaciones tópicas de las moléculas (proporcionar las moléculas sobre la planta en lugar de dentro de la planta) o vías de administración indirectas (por ejemplo, proporcionar las moléculas en el suelo, de tal forma que puedan captarse por las raíces de la planta). Aunque esta vía de administración es particularmente adecuada para abordar infecciones en plantas, también puede aplicarse para regular a la baja proteínas vegetales.
Las moléculas pueden proporcionarse tal cual, en forma de una composición agroquímica. Sin embargo, normalmente, las moléculas para su uso en plantas (o los ácidos nucleicos que los codifican) pueden proporcionarse en forma de una composición junto con un vehículo agrícolamente aceptable (en lugar de un vehículo farmacéuticamente aceptable). Por "vehículo agrícolamente aceptable" se entiende una carga sólida o líquida, diluyente o sustancia de encapsulación que pueda usarse de manera segura en la administración tópica o sistémica de una molécula interferidora a una planta, semilla de planta, célula vegetal o protoplasto de planta. Las moléculas para aplicaciones en plantas descritas en el presente documento, combinadas con un vehículo agrícolamente aceptable, también se refieren a una formulación agroquímica o una composición agroquímica. Una "formulación agroquímica", tal como se usa en el presente documento, significa una composición para uso agrícola u hortícola, que comprende un principio activo (es decir, al menos una molécula, tal como se describe en el presente
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documento), opcionalmente con uno o más aditivos que favorezcan una óptima dispersión, atomización, humectación de la hoja, distribución, retención y/o captación de agentes agroquímicos. A modo de ejemplo no limitante, dichos aditivos son diluyentes, disolventes, adyuvantes, tensioactivos, agentes humectantes, agentes dispersantes, aceites, adherentes, penetrantes, agentes tamponadores, acidificantes, agentes desespumantes o agentes de control de la acumulación. Un "agroquímico", tal como se usa en el presente documento, incluye no solo compuestos o formulaciones de compuestos que sean fáciles de usar, sino también precursores en forma inactiva, que pueden activarse mediante factores externos. A modo de ejemplo no limitante, el precursor puede activarse por cambios de pH, causados por heridas en las plantas tras un daño causado por insectos, mediante acción enzimática causada por un ataque fúngico o mediante cambios de temperatura o cambios de humedad. Los agroquímicos, tal como se usa en el presente documento, no solo incluyen agentes (por ejemplo, plaguicidas, reguladores del crecimiento, nutrientes/fertilizantes, repelentes, exfoliantes, etc.) que son adecuados y/o están pensados para su uso en campos de cultivo (agricultura), pero también incluye agentes (por ejemplo, plaguicidas, reguladores del crecimiento, nutrientes/fertilizantes, repelentes, exfoliantes, etc.) que están pensados para su uso en cultivos de invernadero (horticultura/floricultura) e incluso agentes que son adecuados y/o están pensados para usos no de cultivo, tales como usos en jardines privados, usos domésticos (por ejemplo, herbicidas o insecticidas para uso doméstico) o usos por operarios de control de plagas (por ejemplo, control de malas hierbas, etc.). Preferentemente, dicho agroquímico o combinación de agroquímicos se selecciona de entre el grupo que consiste en herbicidas (por ejemplo, una molécula con una región Yi dirigida contra proteínas de malas hierbas), insecticidas (por ejemplo, una molécula con una región Yi dirigida contra proteínas de insectos), fungicidas (por ejemplo, una molécula con una región Yi dirigida contra proteínas de mohos), nematicidas (por ejemplo, una molécula con una región Yi dirigida contra proteínas de nematodos), biocidas (por ejemplo, una molécula con una región Yi dirigida contra proteínas de patógenos) o compuestos reguladores del crecimiento de plantas (por ejemplo, una molécula con una región Yi dirigida contra proteínas de la planta a la que se administra). Los principios activos adicionales (que no son moléculas descritas en el presente documento) se seleccionan particularmente de entre herbicidas, insecticidas, fungicidas, nematicidas, biocidas, fertilizantes, micronutrientes o compuestos reguladores del crecimiento de plantas. En particular, dicha composición agroquímica de la invención puede comprender una microcápsula, microesfera, nanocápsula, nanoesfera, liposomas o vesículas, etc. en los que uno o más agroquímicos, de manera adecuada, se encapsulan, atrapan, insertan, incorporan o de otro modo incluyen; y uno o más agentes de direccionamiento, comprendiendo cada uno de estos uno o más dominios de unión para unirse a uno o más antígenos presentes en o sobre dicho sitio de unión o que forma dichos uno o más sitios de unión en dicha planta o partes de una planta, tal como una hoja, tallo, flor, fruto, bulbo o tubérculo de una planta). El vehículo con los uno o más agentes de direccionamiento unidos, acoplado o de otro modo unido al mismo o asociado con el mismo puede disolverse, emulsionarse, suspenderse o dispersarse o de otro modo incluirse en un medio líquido adecuado (tal como agua u otro medio acuoso, orgánico u oleoso) para proporcionar una solución (concentrada), suspensión, dispersión o emulsión que pueda almacenarse y (en caso necesario, tras una dilución adicional) aplicarse a una planta, a una o más partes de una planta (tales como hojas, tallo, raíces, frutos, conos, flores, bulbos o tubérculos) o a las cercanías de una planta (por ejemplo, al suelo en el que crece la planta), por ejemplo, mediante rociado, vertido, goteo, cepillado, recubrimiento por goteo o cualquier otra técnica adecuada. Posteriormente, la composición puede unirse a o sobre el sitio de unión (o a uno o más antígenos presentes en o sobre dicho sitio de unión o que forman dicho sitio de unión, tales como tricomas, estomas, cutícula, lenticelas, acículas, espinas o capa de cera) a través de uno o más dominios de unión que forman parte de los agentes de direccionamiento comprendidos en la composición, preferentemente de una manera dirigida. Posteriormente, los agroquímicos se liberan del vehículo (por ejemplo, debido a la degradación del vehículo o al transporte pasivo a través de la pared de la microcápsula, microesfera, nanocápsula, nanoesfera, liposoma o vesícula, etc.) de tal forma que pueden proporcionar las acciones agroquímicas deseadas. Como alternativa al uso de un vehículo, el agroquímico o la combinación de agroquímicos también puede proporcionarse en forma de partículas (pequeñas) que se proporcionan con un recubrimiento adecuado o una capa (externa) a la que se acopla o puede unirse el agente de acoplamiento y que también puede servir para estabilizar o mejorar la integridad física o la estabilidad de las partículas. Como otra alternativa, el agroquímico o la combinación de agroquímicos puede mezclarse de manera adecuada con un excipiente o aglutinante al que puede unirse o acoplarse el agente de direccionamiento y que nuevamente puede servir también para estabilizar o mejorar la integridad física o la estabilidad de las partículas. Dichas partículas recubiertas o compuestas se encuentran preferentemente en forma de una suspensión, torta húmeda o polvo de flujo libre, comprimido, cápsula o líquido concentrado (tal como una emulsión, suspensión, dispersión).
Cabe destacar que aunque se han descrito en el presente documento realizaciones particulares, configuraciones específicas, así como materiales y/o moléculas, para células y métodos de acuerdo con la presente invención, pueden efectuarse diversos cambios o modificaciones en cuanto a la forma y detalle sin desviarse del alcance de la presente invención. Los ejemplos siguientes se proporcionan a fin de ilustrar mejor realizaciones particulares y no deben considerarse limitantes de la solicitud. La solicitud solo se limita por las reivindicaciones.
Ejemplos
En los siguientes ejemplos, se resaltan diferentes aplicaciones de la tecnología de interferidores. La utilidad de las presentes moléculas en el tratamiento de enfermedades infecciosas se ilustra en los ejemplos 1 a 3, relacionados con aplicaciones antifúngicas, antibacterianas y antivíricas, respectivamente. El ejemplo 1 detalla cómo puede tratarse o prevenirse el crecimiento de biofilms y también demuestra la regulación a la baja de la resistencia al estrés
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en levaduras. El ejemplo 2 muestra que múltiples especies bacterianas, incluyendo especies resistentes a antibióticos, pueden eliminarse de manera eficaz sin ser tóxico para células de mamífero. Además, El ejemplo 2 muestra la viabilidad de la administración in vivo de los péptidos para tratar infecciones. El ejemplo 3 caracteriza la identificación de moléculas interferidoras dirigidas contra diferentes proteínas víricas de la gripe.
En el ejemplo 4 se ilustran diferentes formas en las que pueden usarse las presentes moléculas en la detección de proteínas (variando desde proteínas bacterianas hasta humanas) y cómo puede aplicarse esto al diagnóstico de enfermedades mediante detección de biomarcadores en muestras complejas.
El ejemplo 5 detalla aplicaciones para enfermedades no infecciosas, mostrando la agregación específica de dos tirosina cinasas receptoras bien conocidas, implicadas en el cáncer y la AMD. También demuestra el concepto de modulación de la función inmunitaria usando las moléculas interferidoras descritas en el presente documento.
Finalmente, el ejemplo 6 demuestra que las presente moléculas también pueden aplicarse para lograr la regulación a la baja de proteínas en plantas.
1. Aplicaciones antifúngicas
1.1 Introducción
Candida albicans forma parte de la flora humana normal y crece en las superficies mucosas en individuos sanos. En hospedadores susceptibles, este organismo fúngico puede provocar enfermedad diseminada tanto mucosa como hematógena. Para que C. albicans persista en el hospedador e induzca enfermedades, ha de ser capaz de adherirse a superficies bióticas y abióticas, invadir células hospedadoras y obtener hierro. La proteína Als3 específica de la superficie de la hifa de C. albicans es un miembro de la familia de proteínas similar a la secuencia de aglutinina (Als) y es importante en todos estos procesos (Hoyer LL et al (1998) Curr. Genet. 33(6): 451-9) y Liu Y et al (2011) Eukaryotic Cell. 10(2):168-73. Funcionando como adhesina, Als3 media el acoplamiento a células epiteliales, células endoteliales y proteínas de la matriz extracelular. También desempeña un papel importante en la formación de biofilms en superficies protésicas. Als3 es una de las dos invasinas conocidas de C. albicans. Se une a receptores de células hospedadoras, tales como E-cadherina y N-cadherina y de este modo, induce a las células hospedadoras a endocitar el organismo. Als3 también se une a la ferritina de la célula hospedadora y le permite a C. albicans utilizar esta proteína como fuente de hierro. Debido a sus múltiples funciones y su alto nivel de expresión in vivo, Als3 se considera una diana prometedora para combatir infecciones por Candida. En el presente ejemplo, se aplicaron los productos y los métodos de la invención para dirigirse específicamente a la proteína Als3.
1.2 Expresión intracelular de interferidores específicos de Als3
Se usó el algoritmo de predicción de la beta-agregación, TANGO, para identificar la secuencia, LQQYTLLLIYLSVATAK (SEQ ID NO: 1) derivada de Als3 (ilustrada en la SEQ ID NO: 2), como secuencia con un alto potencial de formación de agregación. Este resto de 17 aminoácidos (SEQ ID NO: 1), correspondiente a los aminoácidos 2-18 en la SEQ ID NO: 2, se empleó como secuencia señuelo en las construcciones de interferidor intracelular. QQ y K actúan como restos constitutivos naturales (restos X1 y X2), YTLLLIYLSVATA (SEQ ID NO: 107) es, en este caso, la región Y1. La secuencia de ADN, que codifica la SEQ ID NO: 1, se clonó en el vector de expresión en C. albicans pPCK1-GFP (Barelle et al., (2004) Yeast 21(4): 333-40) en fase con el gen de GFP (proteína verde fluorescente) optimizado para C. albicans y una secuencia de polienlazador, acoplado genéticamente además a una secuencia de ADN que codifica un reforzador de la agregación y un marcador de HA. Esta secuencia denominada reforzadora (RKLLFNL (SEQ ID NO: 68)) se una secuencia artificial con una alta propensión a la agregación. La secuencia RKLLFNL (SEQ ID NO: 68) muestra unión a DnaK y es una secuencia adaptada (la secuencia de tipo silvestre es RKLFFNL (SEQ ID NO: 69)) procedente del factor sigma 32 (véase McCarty J. et al (1996) J. Mol. Bio. 256, 829-837). La expresión de la construcción de fusión completa se encontraba bajo el control del promotor PCK1. El gen PCK1 se reprime mediante glucosa y codifica PEP carboxicinasa mediante fuentes de carbono gluconeogénicas, tales como ácidos o succinato (Leuker et al (1997) Gene 192: 235-240).
SEQ ID NO: 2: secuencia de aminoácidos de Als3 de Candida albicans
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1 mlqqytllli ylsvatakti tgvfnsfnsl twsnaatyny kgpgtptwna vlgwsldgts 61 aspgdtftln mpcvfkftts qtsvdltahg vkyatcqfqa geefmtfstl tctvsntltp 121 sikalgtvtl plafnvggtg ssvdledskc ftagtntvtf ndggkkisin vdfersnvdp 181 kgyltdsrvi pslnkvstlf vapqcangyt sgtmgfanty gdvqidcsni hvgitkglnd 241 wnypvssesf sytktcssng ¡fityknvpa gyrpfvdayi satdvnsytl syaneytcag 301 gywqrapftl rwtgyrnsda gsngivivat trtvtdstta vttlpfdpnr dktktieilk 361 piptttitts yvgvttsyst ktapigetat vivdipyhtt ttvtskwtgt itsttthtnp 421 tdsidtvivq vpspnptvtt teywsqsfat tttitgppgn tdtvlirepp nhtvttteyw 481 sesytttstf tappggtdsv ¡ikeppnptv ttteywsesy tttttvtapp ggtdtviire 541 ppnhtvttte ywsqsytttt tviappggtd sviireppnp tvttteywsq syattttita 601 ppgetdtvli reppnhtvtt teywsqsyat tttitappge tdtvlirepp nhtvttteyw 661 sqsytttttv iappggtdsv ¡ikeppnptv ttteywsqsy attttitapp getdtvlire 721 ppnhtvttte ywsqsyattt titappgetd tvlireppnh tvttteywsq sfattttvta 781 ppggtdtvii reppnhtvtt teywsqsfat tttvtappgg tdtvlirepp nptvttteyw 841 sqpytttttv iappggtdtv iiydtmssse issfsrphyt nht
El plásmido, que comprende el casete de expresión, se linealizó en el locus RPS10 antes de la transformación de la cepa CAI4 de C. albicans (Fonzi e Irwin (1993) Genetics 134: 717-728). Los transformantes se generaron y se confirmó mediante análisis PCR que comprendían el casete de expresión. Tres transformantes independientes, AFA16a, AFA16b y AFA16c (que expresan GFP + reforzadores + secuencia señuelo) se usaron en los experimentos posteriores. Como control negativo, se usó un recombinante que comprendía el mismo plásmido, pero que carecía de la secuencia señuelo específica. Esto dio como resultado la cepa de control, AFA15a (que expresaba GFP + reforzadores). Para identificar la localización del péptido señuelo, se usó la expresión de GFP. Todas las cepas se cultivaron una noche en condiciones represoras. A continuación, las células se transfirieron a medio YNB, pH 6,5 complementado con D-glucosa al 4% (condiciones represoras del promotor) o al mismo medio complementado con casaminoácidos (condiciones inductoras del promotor). Se efectuó un seguimiento de la expresión de la construcción interferidora mediante un ensayo de fluorescencia de GFP tras 1 h, 2 h, 3 h y 5 h. En condiciones represoras, no pudo detectarse fluorescencia de GFP (datos no mostrados).
C. albicans AFA15a mostró la presencia de una señal intracelular, difusa de GFP, en lugar de una localización directa dentro del compartimento celular. Sin embargo, las cepas recombinantes de C. albicans que comprendían las construcciones interferidoras presentaron loci puntuales, especificados como agregados de anti-proteína Als3 dentro del citosol. Este fenómeno se mostró ya a las 2h después de la inducción y proliferó en los puntos de tiempo posteriores. Con el paso del tiempo, la cantidad de puntos aumentó en un intervalo de 1 a 3 por célula. Los puntos de tiempo posteriores indicaron la misma proporción de focos, de manera similar a la obtenida después de 5 h (datos no mostrados). Esto indicó, que la presencia de las secuencias señuelo interferidoras cortas da como resultado una agregación inducida.
1.2.1 Formación de biofilms in vitro
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Ya que se sabe que Als3 es importante para la adhesión y la formación de biofilms, también se usaron cepas recombinantes en experimentos de biofilms que se efectuaron in vitro. La hipótesis de partida fue que las cepas de C. albicans que expresan la construcción interferidora tenían fenotipos similares en cuanto a la adhesión y la formación de biofilms respecto de los obtenidos con el mutante de eliminación C. albicans ALS3. Las cepas recombinantes que expresaban los interferidores se evaluaron respecto de su capacidad para formar biofilms in vitro sobre discos de silicona cuadrados. Se obtuvieron biofilms maduros (48 h) después de su crecimiento en YNB, pH 6,5 con succinato o D-glucosa al 4% como fuente de carbono. Posteriormente, se determinó la arquitectura del biofilm mediante microscopía de fluorescencia. Se observó que C. albicans AFA15a proliferó en 48 h, dando como resultado una unión robusta y una arquitectura de biofilm madura por toda la superficie de silicona, independientemente del crecimiento en condiciones inducidas o reprimidas. De manera importante, C. albicans SC5314 (tipo silvestre de C. albicans, citado por Gillum et al (1984) Mol Gen Genet 198:179-182) desarrolló un biofilm maduro equivalente al de AFA15a (datos no mostrados). Por otro lado, la inducción de la expresión de construcciones interferidoras de Als3 dio como resultado una adhesión fuertemente reducida y una formación de biofilms caracterizados por áreas negras sin células unidas. Dicho desarrollo rudimentario de biofilms es similar al producido por el mutante homocigoto para Als3 de C. albicans als3A/als3A. Los tres transformantes independientes fueron capaces de formar biofilms maduros de manera similar a AFA15a, cuando se cultivaron en YNB, D-glucosa al 4%. Además de microscopía de fluorescencia, los biofilms se cuantificaron por las unidades formadoras de colonias (UFC). Los datos se presentan en la figura 3.
La cuantificación de biofilms era claramente acorde a las observaciones obtenidas a partir de la microscopía de fluorescencia de GFP. Tal como se esperaba, las cepas de control (C. albicans SC5314 y AFA15a) produjeron biofilms maduros en las dos condiciones de cultivo. Por el contrario, los recombinantes que expresaban los interferidores de Als3 de C. albicans, de manera significativa, no lograron formar biofilms (p < 0,001) (se observó una inhibición de prácticamente el 80%) en comparación con la cepa de tipo silvestre, mientras que cuando se cultivaron en condiciones represoras, recuperaron su función y produjeron biofilms similares a los de las cepas de control (formación de biofilms prácticamente del 100%). Estos resultados apoyan el hecho, de que la agregación de proteínas inducida de Als3 dio como resultado una pérdida de su función y los recombinantes que expresan los interferidores tienen un fenotipo similar al obtenido con la cepa C. albicansals3A/als3A.
1.2.2 Adherencia e invasión de células epiteliales humanas
Además de tener un papel en la adhesión, Als3 también está implicado en la invasión de células epiteliales y endoteliales humanas. Por lo tanto, en una etapa posterior, se estudió la capacidad de las cepas recombinantes de C. albicans para adherirse e invadir células epiteliales humanas de cepas de control de C. albicans (SC5314 y AFA15a) y cepas recombinantes que expresan los interferidores (AFA16a, AFA16b and AFA16c) se cultivaron en condiciones inductoras/represoras durante una noche. C. albicans als3A/als3A se usó como control. La puesta en contacto de Candida con células epiteliales se evaluó tras 1 h, mientras que la invasión se monitorizó después de 3 h. El porcentaje de células fúngicas adheridas e invadidas se muestra en la figura 4A y B.
La capacidad de cepas de Candida albicans que expresan la construcción interferidora de Als3 para (A) adherirse y (B) para invadir la línea celular epitelial TR-146. Las cepas se incubaron durante una noche en YNB, pH 6,5 complementado con succinato, (barras blancas) o en YNB, pH 6,5, D-glucosa al 4% (barras negras). Ambos ensayos se realizaron en DMEM que contenía NaHCO3, D-glucosa, piruvato de sodio y glutamina sin FCS. La adherencia se llevó a cabo durante 1 h, mientras que la invasión durante 3 h, ambas a 37 °C, CO2 al 5%. Después, se tiñeron las células de Candida adheridas con blanco de calcoflúor y se calculó el porcentaje de células adheridas como la media de células de Candida unidas sobre cien áreas dispersas a lo largo de toda la superficie del cubreobjetos. Se determinó el porcentaje de células de C. albicans invasoras dividiendo el número de células internalizadas entre el número total de células adherentes. Se contaron al menos 100 células fúngicas sobre cada portaobjetos. Como cepa de control, se usó C. albicans SC5314 (100%) y C. albicans als3A/als3A como control negativo. Se determinó una diferencia significativa entre la adhesión/invasión de las cepas que expresan la construcción interferidora a células epiteliales, en comparación con el control, mediante p<0,001(*). Las desviaciones estándar se calcularon a partir de dos experimentos independientes.
La inducción del interferidor específico de Als3 en C. albicans dio lugar a una adhesión reducida a las células epiteliales en un intervalo del 40% al 50%, tal como se muestra en la figura 4A. Esta diferencia es estadísticamente significativa (p < 0,001). Es sorprendente que la cepa recombinante AFA16a se adhiriese al mismo bajo nivel que als3A/als3A (véase la fig. 3A). Tal como se esperaba, el crecimiento recombinante en condiciones reprimidas (es decir, sin producción de interferidores de la proteína Als3) se comportó de manera similar a las cepas de control. La cepa AFA15a mostró una capacidad de adhesión comparable a C. albicans SC5314, independientemente de las condiciones usadas. A continuación, los recombinantes que portaban las construcciones interferidoras de Als3, mostraron una reducción de la invasión de aproximadamente el 40%, cuando se cultivaron en condiciones de inducción, mientras que el cultivo en condiciones represoras recuperaró su función (véase la figura 4B). Tal como se esperaba, C. albicans als3A/als3A no logró invadir células epiteliales (p < 0,001).
En el presente ejemplo, se demuestra que la estrategia recombinante resulta ser un sistema fiable que puede usarse además para estudiar la agregación dirigida de proteínas de proteínas de interés particulares.
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1.3 La aplicación externa de péptidos interferidores de Als3 a C. albicans reduce la adhesión y la formación de biofilms
Ya que la proteína Als3 está ubicada en la pared celular, se investigó la posibilidad de inducir la agregación específica de Als3 mediante la aplicación exógena de interferidores específicos de Als3 a las células de Candida. Además de la secuencia usada en el casete de expresión recombinante (YTLLLIYLSV (SEQ ID NO: 70)), el algoritmo TANGO reveló secuencias de aminoácidos adicionales con una fuerte propensión a la agregación en Als3. Por lo tanto, también se predijo que el nonapéptido NGIVIVATT (SEQ ID NO: 71) y el péptido TWLCGLITLLSLF (SEQ ID NO: 72) tenían altos potenciales de agregación (intervalo del 50% al 99% de propensión a la agregación). Se diseñaron varios derivados de estas secuencias de TANGO, se sintetizaron y se probaron. La tabla 1 representa los 23 péptidos diferentes usados.
Para aclarar los diseños de las moléculas haciendo referencia a la fórmula general propuesta en la solicitud, las moléculas E1 y E2 tenían n=1. Para E1, X1 y X2 son cada uno un resto de arginina, Y1 es una serie de 9 restos presentes en la proteína Als3 y Z1 está ausente. Obsérvese que esto puede decirse de manera equivalente como X1 es RNG, X2 es R e Y1 es una secuencia de heptapéptido contigua presente en la proteína Als3. Sin embargo, ya que NG son los restos vecinos en la secuencia de Als3 (véase la SEQ ID NO: 2) y el nonapéptido cumple los requisitos de una serie Yi, se prefiere la notación anterior. Para E2, X1 es R y X2 es K, Y1 es una serie de 16 restos presentes en la proteína Als3 y Z1 está ausente.
F9 es una molécula donde n=2. X1 es RK y X2 es G, Y1 es una secuencia sintética, Z1 es S, X3 y X4 son cada uno un resto de arginina, Y2 es una serie de 9 restos presentes en la proteína Als3 y Z2 está ausente (es decir, la segunda parte de la molécula es idéntica a E1). Obsérvese que en esta molécula, X1 e Y1 forman juntos una secuencia artificial derivada del factor sigma 32 (véase McCarty J. et al (1996) J. Mol. Bio. 256, 829-837) con una alta propensión a la agregación.
Los siguientes 20 péptidos tienen un diseño similar, donde n=2, todos los restos X son un solo resto, tanto Y1 como Y2 son una secuencia que se produce en la proteína Als3, Z1 es un enlazador de GS y Z2 está ausente.
Tabla 1: Secuencias de los 23 péptidos interferidores que se probaron. Todas las secuencias se diseñaron mediante
TANGO.
Marcador
Secuencia del péptido Concentración probada
E1
RNGIVIVATTR (SEQ ID NO: 7) 50 |JM 10 jM 2,5 jM
E2
RLQQYTLLLIYLSVATAK (SEQ ID NO: 8) 50 jM 10 jM 2,5 jM
F9
RKLLFNLGSRNGIVIVATTR (SEQ ID NO: 9) 50 jM 10 jM 2,5 jM
p_i
RNGIVIVATRGSRNGIVIVATR (SEQ ID NO: 10) 50 jM 10 jM 2,5 jM
p_2
RVIQHSTWLRGSRVIQHSTWLR (SEQ ID NO: 11) 50 jM 10 jM 2,5 jM
P_3
RLITLLSLFRGSRLITLLSLFR (SEQ ID NO: 12) 50 jM 10 jM 2,5 jM
P_4
RQYTLLLIYRGSRQYTLLLIYR (SEQ ID NO: 13) 50 jM 10 jM 2,5 jM
P_5
KNGIVIVATKGSKNGIVIVATK (SEQ ID NO: 14) 50 jM 10 jM 2,5 jM
P_6
KVIQHSTWLKGSKVIQHSTWLK (SEQ ID NO: 15) 50 jM 10 jM 2,5 jM
P_7
KLITLLSLFKGSKLITLLSLFK (SEQ ID NO: 16) 50 jM 10 jM 2,5 jM
P_8
KQYTLLLIYKGSKQYTLLLIYK (SEQ ID NO: 17) 50 jM 10 jM 2,5 jM
P_9
DNGIVIVATDGSDNGIVIVATD (SEQ ID NO: 18) 50 jM 10 jM 2,5 jM
p_ 10
DVIQHSTWLDGSDVIQHSTWLD (SEQ ID NO: 19) 50 jM 10 jM 2,5 jM
p_11
DLITLLSLFDGSDLITLLSLFD (SEQ ID NO: 20) 50 jM 10 jM 2,5 jM
p_ 12
DQYTLLLIYDGSDQYTLLLIYD (SEQ ID NO: 21) 50 jM 10 jM 2,5 jM
p_ 13
ENGIVIVATEGSENGIVIVATE (SEQ ID NO: 22) 50 jM 10 jM 2,5 jM
p_ 14
EVIQHSTWLEGSEVIQHSTWLE (SEQ ID NO: 23) 50 jM 10 jM 2,5 jM
p_ 15
ELITLLSLFEGSELITLLSLFE (SEQ ID NO: 24) 50 jM 10 jM 2,5 jM
p_ 16
EQYTLLLIYEGSEQYTLLLIYE (SEQ ID NO: 25) 50 jM 10 jM 2,5 jM
p_ 17
PNGIVIVATPGSPNGIVIVATP (SEQ ID NO: 26) 50 jM 10 jM 2,5 jM
p_ 18
PVIQHSTWLPGSPVIQHSTWLP (SEQ ID NO: 27) 50 jM 10 jM 2,5 jM
p_ 19
PLITLLSLFPGSPLITLLSLFP (SEQ ID NO: 28) 50 jM 10 jM 2,5 jM
p_20
PQYTLLLIYPGSPQYTLLLYP (SEQ ID NO: 29) 50 jM 10 jM 2,5 jM
La exploración inicial y la búsqueda de candidatos a interferidores de Als3 se basó en el ensayo de adhesión de C.
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albicans SC5314 en placas de poliestirerno de 96 pocilios tras la administración de todos los péptidos a tres concentraciones diferentes (250 jM, 50 jM y 10 jM). Basándose en los resultados obtenidos con este ensayo de adhesión, también se probó el efecto de los péptidos en el desarrollo de biofilms maduros. La elección final de los candidatos a péptidos interferidores óptimos se basó en los resultados que mostraron una reducción en la adhesión y la formación de biofilms maduros causada por la menor concentración del péptido ensayada (10 jM o 2,5 jM). Un ejemplo de tres péptidos interferidores adecuados se muestra en la figura 5A y 5B.
Entre los 23 péptidos interferidores diferentes ensayados, el péptido F9 mostró la mejor actividad contra el desarrollo de biofilms maduros in vitro, incluso cuando se usaron concentraciones muy bajas (p < 0,001) (véase la figura 5). Basándose en los datos representados en la figura 5, el péptido F9 (RKLLFNLGSRNGlVIVATTR (SEQ ID NO: 9)) se seleccionó para experimentos adicionales. La principal secuencia agregadora del péptido F9 es NGIVIVATT (SEQ ID NO: 71) con un elevado potencial de agregación. Aparte del péptido F9, también el péptido E1 (RNGIVIVATTR (SEQ ID NO: 7)) manifestó una actividad significativa contra el desarrollo de biofilms maduros in vitro, cuando se usaron concentraciones mayores (250 jM y 50 jM).
1.3.1 Determinación de la concentración óptima del interferidor F9 en la adhesión y el desarrollo de biofilms
Los resultados iniciales (véase la figura 5) mostraron una actividad prometedora del péptido interferidor F9 contra biofilms de C. albicans maduros in vitro cuando se usa en las condiciones de exploración iniciales (250 jM, 50 jM, 10 jM). En una etapa posterior, también se probaron concentraciones menores del péptido F9 (50 jM, 10 jM y 2,5 jM). En primer lugar, se aclaró el efecto del péptido F9 durante el periodo de adhesión (90 min a 37 °C). Después, se probó su efecto en el desarrollo adicional de biofilms, cambiando el medio por RPMI1640-MOPS fresco, en ausencia de péptido durante 48 h. Ambos ensayos se efectuaron en placas de poliestireno de 96 pocillos y se cuantificaron mediante el ensayo de reducción xTt (véase la sección de materiales y métodos). Los resultados se muestran en la figura 6A y B.
Tal como se muestra en la figura 6A, incluso la concentración más baja (2,5 jM) del péptido interferidor F9 redujo dramáticamente las propiedades de adhesión de células de Candida (p < 0,001). Y las concentraciones más altas de péptido interferidor F9 (50 jM y 10 jM) suprimieron prácticamente por completo la unión de Candida. C. albicans als3Aals3A se usó como control. Sorprendentemente, se observó que la cepa con supresión génica de ALS3 seguía manifestando mejores propiedades de adherencia que las células de tipo silvestre tratadas con péptido interferidor F9. Sin limitarse a un posible mecanismo, una explicación posible puede ser que el péptido interferidor F9 causa beta-agregación no solo de Als3, sino también además de las proteínas homólogas Als1 y Als5 de Candida albicans.
Tal como se mostró anteriormente en la figura 5B, la administración continua de péptido F9 durante el periodo de desarrollo completo de biofilms de C. albicans (es decir, durante un periodo de 48 h), incluyendo la adhesión, dio como resultado una fuerte reducción de la formación de biofilms maduros. Mientras tanto, en este caso representado en la figura 6B, se demuestra que las células de C. albicans se trataron con péptido F9 solo durante el periodo de adhesión. Se dejó que se formasen biofilms maduros en RPMI1640-MOPS fresco sin péptido. De manera importante, el péptido interferidor F9 redujo la capacidad de las células de Candida para formar un biofilm de manera similar a la cepa de C. albicans als3Aals3A. Las concentraciones mayores probadas (50 jM), provocaron prácticamente un 90% de inhibición de biofilms, mientras que las concentraciones menores (10 jM y 2,5 jM), provocaron una reducción del biofilm del 40% al 50% (p < 0,001). Se llegó a la conclusión de que el péptido interferidor F9 era capaz de interferir de manera eficaz con dos condiciones experimentales de desarrollo de biofilms de C. albicans.
En una etapa posterior, también se investigó un potencial papel inhibidor del péptido interferidor F9 durante el desarrollo de biofilms de C. albicans in vivo. Se usó el modelo in vivo de biofilm subcutáneo de C. albicans en ratas (es decir, se formaron biofilms in vivo dentro de trozos de catéter de poliuretano de triple lumen) tal como se indica adicionalmente en la sección de materiales y métodos. Solo una concentración de péptido F9 (es decir, 50 jM) se probó en las condiciones experimentales. El péptido se administró ex vivo, durante el acoplamiento inicial de Candida al sustrato (90 min, 37 °C). Después, se lavaron los catéteres y se implantaron por vía subcutánea en ratas. Los biofilms se estudiaron seis días después del implante y se cuantificaron mediante las UFC. Los resultados de estos análisis se muestran en la figura 7.
Las UFC medias ± SD obtenidas por cada fragmento de catéter de catéteres tratados con péptido (2,25 ±1,08 log-10 UFC/fragmento de catéter) fueron significativamente diferentes a la cantidad de células de Candida obtenidas de catéteres del control (3,69 ± 0,42 log-10 UFC/fragmento de catéter) (p < 0,001). De manera importante, cuatro catéteres tratados con péptido (20%) de los 20 contenían menos de 2,0 log-10 UFC/fragmento de catéter, que es el umbral para la determinación de infección por Candida en la práctica clínica (Mermel et al (2001) Clin. Infect. Dis. 32:1249-1272. C. albicans als3A/als3A manifestó una capacidad de formación de biofilms similar (3,30 ± 0,55 log-10 UFC/fragmento de catéter) a las células de tipo silvestre no tratadas, pero C. albicans als1A/als1A als3A/als3A no lograron de manera significativa formar biofilms en el modelo de biofilm subcutáneo in vivo, tal como se evidenció por los bajos valores de UFC (1,46 ± 1,24 log-10 UFC/fragmento de catéter) (p < 0,001). La potente actividad del péptido F9 podría provenir del efecto del péptido durante el periodo de adhesión. Por lo tanto, también se probó la actividad del péptido F9 durante la adhesión de C. albicans sobre sustrato de poliuretano (figura 8).
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El tratamiento de células de Candida con péptido F9 redujo significativamente la unión a dispositivos de poliuretano (2,18 ± 0,12 log10 UFC/fragmento de catéter) en comparación con el control (3,06 ± 0,39 log-i0 UFC/fragmento de catéter) (p < 0,001). Estos resultados están en consonancia con los datos obtenidos durante la evaluación de las propiedades de adhesión de Candida sobre poliestireno. Esto sugiere que la agregación de proteína de Als3 apareció durante las etapas tempranas del desarrollo del biofilm. Tal como se esperaba, C. albicans als3A/als3A y C. albicans als1A/als1A als3A/als3A mostraron capacidades de adherencia significativamente menores sobre poliuretano que la cepa de tipo silvestre (p < 0,001).
1.3.2 Especificidad del interferidor F9 por Candida albicans
Se investigó la especificidad del péptido interferidor F9 por C. albicans en comparación con una Candida spp. distante, es decir, Candida glabrata ATCC2001, para la inhibición de la formación de biofilms in vitro. La secuencia de beta agregación del péptido F9 (NGIVIVATT (SEQ ID NO: 71)) no está presente en C. glabrata - la secuencia más estrechamente relacionada en C. glabrata es NGVVIVAAT (SEQ ID NO: 73). Se demostró que Candida glabrata forma un biofilm eficaz in vitro sobre poliestireno y poliuretano. Se probó el efecto de F9 contra la adhesión y formación de biofilms de C. glabrata en placas de poliestireno de 96 pocillos in vitro. Los biofilms se cuantificaron mediante el ensayo de reducción XTT y los resultados indicaron que el péptido F9 no interfirió con la adhesión y el desarrollo de biofilms de C. glabrata. Estos datos apoyan el hecho de que la eficacia del péptido F9 contra la adhesión y el desarrollo de biofilms maduros es dependiente de la secuencia y altamente específica.
1.3.3 Aplicación del péptido interferidor F9 también reduce la capacidad de C. albicans para adherirse e invadir células epiteliales
Tal como se ha descrito anteriormente en el presente documento, Als3 de C. albicans también desempeña un papel en la adherencia e invasión a células epiteliales y endoteliales. Se demostró (en el ejemplo 1.2.2) que las cepas recombinantes que expresan un interferidor específico de Als3 redujo significativamente la capacidad para adherirse e invadir a líneas celulares epiteliales en condiciones inducidas por el interferidor. En este caso, se investigó el efecto de la aplicación externa del péptido interferidor F9 en la adherencia e invasión a células epiteliales de C. albicans SC5314. Para esto, se incubaron las células de Candida junto con las células humanas (línea celular epitelial TR-146) en presencia del péptido F9 durante la adhesión (1 h) o la invasión (3 h). Se determinó la cantidad de células adheridas e internalizadas mediante recuento usando epifluorescencia. Los resultados se presentan en la figura 9.
Tal como se esperaba, C. albicans als3Aals3A mostró una capacidad significativamente reducida (60%) para adherirse y para invadir células epiteliales (p < 0,001). Se observó que el efecto del péptido F9 en la adherencia y la invasión de C. albicans SC5314 era dependiente de la concentración (figura 9). La mayor concentración (50 pM) redujo la adhesión de Candida en un 40% en comparación con el control (sin péptido). Las concentraciones menores (10 pM y 2,5 pM) provocaron un efecto de aproximadamente el 20% -15%, respectivamente. Aparte de la adhesión, también se determinó el efecto del péptido F9 en la invasión. Las concentraciones mayores (50 pM) del péptido F9 redujo la invasión en un 34%, mientras que las concentraciones intermedias (10 pM) redujeron la invasión en un 15%. La concentración más baja (2,5 pM) no tuvo efecto sobre la invasión (100%). Aunque la adhesión se vio claramente afectada por la adición de F9, el efecto en la invasión fue menos evidente. Sin desear quedar ligados a una teoría particular, se sabe que la invasión puede producirse mediante mecanismos diferentes y adicionales, de los cuales, algunos pueden ser menos dependientes de Als3.
1.3.4 Especificidad del péptido interferidor F9 por Als3
En lo que se ha descrito anteriormente se ha demostrado que el péptido F9 causa un efecto significativo en la adhesión de C. albicans a biomateriales (discos cuadrados de silicona, poliestireno y poliuretano), también durante la formación de biofilms in vitro e in vivo y también en la adhesión y la invasión a células epiteliales. Sin embargo, estos resultados apuntan al hecho de que Als3 se usa como diana, queda por demostrar si Als3 es una diana específica o no. Para demostrar la especificidad, se decidió detectar la presencia de Als3 en la superficie de células de C. albicans tras la administración del péptido F9 mediante microscopía de fluorescencia en competición con anticuerpos específicos de Als3 disponibles. Als3 se expresa principalmente en células hifales y por lo tanto, se indujo en primer lugar la formación de hifas durante 20 min. Diferentes concentraciones de péptido F9 (50 pM, 10 pM y 2,5 pM) se administraron a las células hifales durante 45 min. Posteriormente, se lavaron las células y se incubaron en presencia de antisuero para ALS3 durante 60 min a 30 °C y se contratiñó con anti-IgG de conejo conjugado con Alexa Fluor 488. Las células de Candida tratadas con DMSO al 1% se usaron como control. Las células teñidas se visualizaron con epifluorescencia usando un filtro ajustado para detectar Alexa Fluor 488. Se observó que las células de Candida tratadas con el péptido interferidor eran capaces de competir de manera eficaz con la unión del anticuerpo anti-ALS3 de una manera dependiente de la concentración. Por lo tanto, las células de Candida tratadas con la concentración más elevada (50 pM) de péptido F9 demostró una reducción de aproximadamente el 50 % en la unión al antisuero de ALS3 en comparación con el control (sin péptido, solo se añadió DMSO al 1%). Además, las concentraciones intermedias (10 pM) también redujeron la capacidad de las células de Candida para unirse al anticuerpo para Als3. Estos datos también se cuantificaron determinando la capacidad de las células de C. albicans
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SC5314 tratadas con péptido interferidor para unirse al anticuerpo anti-ALS3 en una estrategia de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). En comparación con la microscopía de fluorescencia, este método permitió detectar la señal de fluorescencia a partir de tan solo 10 000 células de Candida. Los datos de FACS soportaron claramente la observación obtenida a partir de imágenes de microscopía. Las células hifales de C. albicans tratadas con péptido F9 (50 jM), presentaron una cantidad significativamente reducida de señal fluorescente (54%) en comparación con el control (p < 0,001). Además, la concentración intermedia (10 jM) también causó una reducción sorprendente en la unión al antisuero de ALS3 (45%), mientras que la concentración más baja (2,5 jM) también provocó una reducción del 10%. Por lo tanto, los datos demuestran que el péptido F9 se dirige específicamente a Als3 e induce su agregación, lo que da como resultado una cantidad significativamente reducida de Als3 en las células hifales, lo que se caracterizó por una unión reducida al anticuerpo anti-ALS3 en una manera dependiente de la concentración de F9.
1.4 Los dispositivos médicos recubiertos con interferidor impiden la formación de biofilms de C. albicans
Normalmente se diagnostica Candida albicans en catéteres recubiertos de biofilm. Candida sp. puede formar biofilms en una gran variedad de dispositivos médicos de catéteres urinarios y vasculares, en prótesis dentales, de cadera, de rodilla y de voz e incluso de marcapasos. Esta gran cantidad de biomateriales implantados que pueden infectarse por Candida se refleja en la capacidad para adherirse a muchos tipos de sustrato, incluyendo materiales de plástico, tales como silicona, poliestireno y poliuretano. La infección de estos dispositivos médicos con frecuencia ocasiona la pérdida de su función y pueden constituir una fuente de infección sistémica. La que los biofilms de C. albicans son normalmente extremadamente resistentes a la terapia antifúngica común, con frecuencia es necesario retirar los dispositivos infectados. Los mecanismos de resistencia no están bien establecidos pero la limitación de acceso del fármaco a las células fúngicas es una explicación posible. En los ejemplos anteriores se demostró que una estrategia alternativa es interferir con la adhesión de C. albicans al sustrato (por ejemplo, silicona (ejemplo 1.2.1), poliestireno (ejemplo 1.3.2) y poliuretano (ejemplo 1.3.2), es decir, para prevenir la formación del biofilm en lugar de combatir un biofilm maduro. En la estrategia actual, se preparó un material de catéteres que está recubierto covalentemente con el interferidor peptídico F9. Los métodos para unir covalentemente los péptidos a un soporte sólido se han descrito en la técnica. El rendimiento de estos catéteres acoplados al interferidor se evaluaron en un modelo de rata in vivo, tal como se describe en el ejemplo 1.3.2 de acuerdo con la sección de materiales y métodos
1.6.7.2.
1.5 Regulación a la baja de calcineurina usando moléculas transgénicas
En Candida albicans, Hsp90 es una chaperona esencial altamente conservada implicada en la patogenicidad y en la resistencia a antifúngicos. La fosfatasa específica de serina/treonina, calcineurina (CNB1) es una diana de Hsp90 y un mutante de eliminación homocigoto para cnb1 es sensible al estrés. Por lo tanto, se decidió usar como diana la proteína calcineurina usando las moléculas presentadas en el presente documento.
Diseño de moléculas inductoras de la agregación de Cnb1
El análisis TANGO de la subunidad reguladora de calcineurina reveló dos regiones propensas a la agregación. Las secuencias de proteína predichas FAFNIY (SEQ ID NO: 104) y LFIVM (SEQ ID NO: 105) mostraron una propensión a la p-agregación del 40% y el 96%, respectivamente. Estas dos secuencias cortas se usaron para diseñar varias construcciones diferentes para regular a la baja CNB1 usando una estrategia transgénica. Las construcciones tenían la siguiente estructura:
Promotor - yEGFP - marcador de HA (secuencia YPYDVPDYA (SEQ ID NO: 108)) - enlazador de aminoácidos (secuencia MaQW (SEQ ID NO: 109)) - molécula con la estructura (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, con n=5 y
X1 = QN
Y1 = STLIVL (SEQ ID NO: 110)
X2 = Q
Z1 = 0 Xa = N
Y 2 = STVIF (SEQ ID NO: 111)
X4 = E Z2 = Q X5 = N
Y3 = STVIF (SEQ ID NO: 111)
Xa = EQN
Z3 = KPAGAAKPGAAG (SEQ ID NO: 112)
X7, Y4, Xa, Z4, Xg, Y5, X10 se varían de acuerdo a lo que se muestra en la tabla 2; y Z5 es nada.
Tabla 2. Estructura de las construcciones usadas para regular a la baja la calcineurina.
Construcción
X7 Y4 Xa Z4 Xg Y5 X10
n.° 1
R FAFNIY (SEQ ID NO: 104) R GS R LFIVM (SEQ ID NO: 105) R
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50
Construcción
X7 Y4 Xa Z4 Xg Y5 X10
n.° 2
R FAFNIY (SEQ ID NO: 104) D GS E LFIVM (SEQ ID NO: 105) R
n.° 3
R FAFNIY (SEQ ID NO: 104) D PPP E LFIVM (SEQ ID NO: 105) R
n.° 4
R FAFNIY (SEQ ID NO: 104) R PPP R LFIVM (SEQ ID NO: 105) R
Escrita de manera contigua, la secuencia codificada por la construcción número 1 tiene el siguiente aspecto: Promotor - yEGFP - YPYDVPDYA MAQW QNSTLIVLQNSTVIFEQNSTVIFEQNKPAGAAKPGAAGRFAFNIYRG- SRLFIVMR (SEQ ID NO: 113)
Las moléculas usadas en estas construcciones contienen esencialmente dos tipos de regiones inductoras de la agregación: Y1, Y2 e Y3 sirven como secuencias sintéticas (es decir, de origen no natural en Candida/no parte de CNB1) que refuerzan la agregación, mientras que Y4 e Y5 son las dos regiones propensas a la agregación identificadas en la proteína CNB1 que aseguran la especificidad.
Propiedades de transformantes
La caracterización inicial de los transformantes que portan estas construcciones se efectuó mediante pruebas in vivo para la resistencia a diversos tipos de estrés (a los que son sensibles los mutantes cnblA). Las construcciones se colocaron bajo el control de un promotor PCK1 que está reprimido en medio que contiene glucosa (medio de dextrosa sintético (SD)) y se indujo en condiciones gluconeogénicas (medio de casaminoácidos sintéticos (SCAA)). Tal como se muestra en la FIG. 10, los transformantes son de hecho más sensibles a la presencia de SDS en el medio y esto solo para cuando se induce la proteína agregadora. No se observa efecto en el crecimiento cuando no hay presente estrés, lo que indica que el fenotipo observado no se debe a efectos específicos o tóxicos relacionados con la expresión de las construcciones.
Los cuatro transformantes diferentes difieren y solo difieren, en la naturaleza (y carga) de los restos constitutivos Xa y Xg y el enlazador Z4. Sin embargo, todos comparten el mismo fenotipo típico para la regulación a la baja de calcineurina. Por lo tanto, en esta situación experimental, la carga de los restos constitutivos y la naturaleza del enlazador tiene únicamente una importancia secundaria - el sistema es lo suficientemente robusto como para lograr la regulación a la baja de la proteína diana, independientemente de estas variantes.
Ya que las cuatro construcciones comparten las mismas regiones inductoras de la agregación CNB1 en el mismo orden (es decir, FAFNIY (SEQ ID NO: 104) y LFIVM (SEQ ID NO: 105)), que también es el mismo orden de N a C- terminal, estas regiones se producen en la proteína de calcineurina, se decidió probar si el orden de estas regiones determinantes de la agregación podría ser importante.
Esto se ha evaluado creando construcciones donde solo se intercambian las regiones Y4 e Y5, tal como se muestra en la tabla 3.
Tabla 3. Estructura de las construcciones usadas para regular a la baja la calcineurina, con regiones agregantes
intercambiadas.
Construc ción
X7 Y4 Xa Z4 Xg Y5 X10
n.° 5
R LFIVM (SEQ ID NO: 105) R GS R FAFNIY (SEQ ID NO: 104) R
n.° 6
R LFIVM (SEQ ID NO: 105) D GS E FAFNIY (SEQ ID NO: 104) R
n.° 7
R LFIVM (SEQ ID NO: 105) D PPP E FAFNIY (SEQ ID NO: 104) R
n.° 8
R LFIVM (SEQ ID NO: 105) R PPP R FAFNIY (SEQ ID NO: 104) R
También se probaron los transformantes 5 a 8 respecto de su sensibilidad a SDS usando el mismo ensayo. Todos los transformantes se comportaron de manera similar a aquellos con las construcciones 1 a 4, es decir, el fenotipo se asemeja al de levaduras de tipo silvestre en condiciones represoras del promotor y se asemeja al mutante de eliminación cnb1 homocigoto en condiciones inductoras del promotor. Esto permite concluir que, al menos en esta situación experimental, el orden de las regiones inductoras de la agregación no es vital para lograr la regulación a la baja específica y no necesita ser idéntico al orden en el que las regiones aparecen en la proteína diana.
Para comprobar si ambas regiones contribuyen a la agregación específica, las construcciones donde Y4 e Y5 son idénticas (y por lo tanto, corresponden a LFIVM (SEQ ID NO: 1O5) o FAFNIY (SEQ ID NO: 104)) también se evaluaron. Estos transformantes mostraron el mismo fenotipo (es decir, la presencia de cualquiera de las regiones sola es suficiente para lograr la regulación a la baja de la calcineurina), pero en menor medida (es decir, no se observó el fenotipo en todos los transformantes ensayados, posiblemente debido a los mayores niveles de umbral de expresión necesarios para inducir la agregación específica). Por consiguiente, puede ser beneficiosa la combinación de dos regiones inductoras de la agregación en la misma proteína para dirigirse a la proteína.
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1.6 Materiales y métodos para las aplicaciones antifúngicas 1.6.1. Animales e inmunosupresión
Los animales usados para los experimentos in vivo fueron ratas Sprague Dawley libres de patógenos específicos de 200g (Janvier, Francia). Se administró a todos los animales dieta convencional a voluntad y se les inmunosuprimió con 1mg/l de dexametasona (Organon, Países Bajos) en el agua de bebida hasta 24 horas antes y durante todo el procedimiento experimental. Se añadió tetraciclina (1g/l) o ampicilina (0,5g/l) al agua para minimizar las infecciones bacterianas. Todos los experimentos animales se efectuaron de acuerdo con los reglamentos europeos referentes a la protección y al bienestar de los animales de laboratorio y fueron aprobados por el comité de ética animal de la Katholieke Universiteit Leuven.
1.6.2. Agentes terapéuticos a base de péptidos con alta propensión a agregar la proteína de interés - Als3
Los agentes terapéuticos a base de péptidos específicos para C. albicans con alta propensión a causar beta- agregación cruzada de Als3p se sintetizaron por jPt Peptide Technologies GmbH (Berlín, Alemania). Los péptidos altamente purificados (>90%, pureza detectada por HPLC) se suministraron en forma liofilizada y se mantuvieron a - 20 °C antes de su uso. Se prepararon soluciones madre de cada péptido en DMSO al 50% en agua ultrapura (Invitrogen) a una concentración final de 10 mM - 20 mM. Tres concentraciones diferentes (50 jM, 10 jM y 2,5 jM) del péptido F9 positivo se probaron en cada ensayo. Los experimentos que incluían péptidos se llevaron a cabo en material de plástico de baja adhesión (Bioplastics, Países Bajos) para reducir la auto-agregación.
1.6.3. Condiciones de cultivo de levaduras
En general, las células de levadura se cultivaron durante una noche en agitación continua a 30 °C en medio YP rico que contenía un 1% (p/v) de extracto de levadura, un 2% (p/v) de Bactopeptona y un 2% (p/v) de D-glucosa (YPD) a menos que se indique lo contrario. Antes de los experimentos de biofilms in vitro e in vivo de C. albicans, las células se cultivaron sobre medio YPD sólido (que contenía un 1,5% (p/v) de agar) durante una noche a 37 °C. Las cepas que portaban las construcciones de agregador se cultivaron en Levadura Nitrógeno Base (YNB, por sus siglas en inglés) con aminoácidos y sulfato de amonio, pH 6,5, (Difco, EE. UU.) complementado con succinato, cisaminoácidos (condiciones inductoras del promotor) o complementado con un 4% de D-glucosa (condiciones represoras del promotor). Para estudiar el efecto potencial de los péptidos agregadores en el crecimiento fúngico, las células se incubaron en presencia de una concentración 50 jM de cada péptido a 30 °C. La concentración final de DMSO en la muestra de control no superó el 1%. Se recogieron muestras cada hora y se midió la densidad celular usando un espectrofotómetro (BioPhotometer, Eppendorf) a 600 nm.
1.6.4. Transición de levadura a hifa
Se cultivaron células de Candida durante una noche en medio YPD, se lavaron dos veces y se incubaron adicionalmente en agua estéril durante 2 h adicionales a 30 °C (periodo de privación). A continuación, se ajustó la concentración de células hasta 1 x 106 células/ml y las células se incubaron en medio YP que contenía un 10% de suero fetal bovino (FBS) (F7524, Sigma, EE. UU.) o en RPMI1640-MOPS, pH 7,0 con/sin péptidos (50 jM). Los cultivos se incubaron durante 1,5 h - 2 h a 37 °C. Se determinó la proporción de hifas auténticas frente a levaduras en gemación mediante microscopía óptica (Axiostar plus, Carl Zeiss, Alemania) a una ampliación de 40x.
1.6.5. Determinación de la concentración inhibidora mínima (CIM)
Se determinó la concentración inhibidora mínima (CIM) de células planctónicas para antifúngicos de acuerdo con NCCLS M27-A3 (2008). Brevemente, se cultivaron cepas de C. albicans durante una noche a 30 °C en una placa de YPD. La suspensión de células de Candida (1-5 x 106 células/ml) se preparó en medio RPMI1640-MOPS. Las células se diluyeron adicionalmente a 1:50 y a partir de dicha suspensión, se aplicaron 100 jl de células de Candida a cada pocillo de una placa de poliestireno de 96 pocillos. Posteriormente, se añadieron 100 jl, que contenían diferentes concentraciones de antifúngicos a ensayar. Los pocillos de control incluyeron células de Candida en los casos donde solo se añadió RPMI1640-MOPS. Se dejó crecer las células durante dos días y se determinó la eficacia de los antifúngicos midiendo la densidad óptica (DO) de las células usando un espectrofotómetro (Spectra max Plus 384) a 490 nm. Los datos se determinaron como CIM50 y CIM95, que representa la concentración inhibidora mínima del fármaco que inhibe el crecimiento fúngico en un 50% o 95%, respectivamente.
1.6.6. Determinación de la actividad fungicida mínima (CFM)
Se determinó la actividad fungicida mínima (MFC) tal como se describe por Canton et al (2009) Antimicrob Agents Chemother. Jul;53(7):3108-11. La CFM se determinó solo para anidulafungina, ya que este es el único fármaco con actividad fungicida en nuestro estudio. Brevemente, se sembraron 100 jl de suspensión celular de Candida pretratada con diferentes concentraciones de fármaco antifúngico en placas de YPD y se incubaron adicionalmente a 37 °C durante 24 h. La CFM se determinó como resultado de una inhibición del crecimiento del 99%.
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1.6.7. Modelos de biofilm de C. albicans
1.6.7.1 Sistema de biofilm de C. albicans in vitro
Se estudiaron biofilms de C. albicans in vitro en tres tipos diferentes de biomateriales, a saber, placas de poliestireno de 96 pocillos de fondo plano (Greiner Bio-One, Alemania), silicona (CS Hyde, EE. UU.) y catéteres intravenosos de poliuretano de triple lumen (diámetro de 2,4mm) (Arrow International Reading, EE. UU.). Antes de iniciar el biofilm, la silicona se cortó en pequeños trozos cuadrados (1cm x 1cm) y el poliuretano en trozos de 1 cm.
Se incubaron dispositivos de silicona o poliuretano en FBS al 99% (F7524, Sigma) durante una noche a 37 °C. Las células se lavaron y se resuspendieron en suero salino tamponado con fosfato (PBS) 1x, pH 7,4. Se preparó una suspensión de Candida de 1 x 107 células/ml o 5 x 104 células/ml en medio RPMI1640-MOPS, succinato, pH 6,5 o en medio YNB, D-glucosa al 4%. En total, se añadió 1 ml de la suspensión celular a los discos de silicona o catéteres de poliuretano colocados en una placa de 24 pocillos y se inocularon 100 pl de suspensión celular en una placa de poliestireno de 96 pocillos. La unión de las células a un sustrato se logró por incubación a 37 °C, durante 90 min en condiciones estáticas (periodo de adhesión). Después, se retiraron las células de Candida no unidas mediante dos rondas de etapas de lavado con 1 x PBS y se sumergieron en medio fresco durante 48 h a 144 h a 37 °C (biofilm maduro). Después de ello, los biofilms se lavaron dos veces con 1 x PBS y se cuantificaron.
1.6.7.2 Sistema de biofilm de C. albicans subcutáneo in vivo
La línea temporal experimental del desarrollo de biofilms de C. albicans in vivo en un nuevo modelo subcutáneo se ilustra en el esquema 1.
imagen1
Esquema 1: Línea temporal experimental del modelo de biofilm de Candida albicans. Línea temporal experimental del desarrollo de biofilms de C. albicans in vivo en un nuevo modelo subcutáneo.
Se cultivaron células de C. albicans durante una noche a 37 °C en placas YPD, se lavaron y se resuspendieron en 1 x PBS. La suspensión de células de Candida (5 x 104 células/ml) se preparó en medio RPMI1640-MOPS mediante conteo. Se incubaron catéteres intravenosos de triple lumen de poliuretano (2,4 mm de diámetro) cortados en segmentos de 1 cm (Arrow International in FBS a 37 °C. Los catéteres recubiertos de suero se incubaron durante 90 min a 37 °C en 1 ml de suspensión celular de Candida (periodo de adhesión). Después del periodo de adhesión, los catéteres se lavaron dos veces con 1 x PBS antes de implantarse bajo la piel de ratas, tal como se ha descrito (Van Wijngaerden et al. (1999) J Antimicrob Chemoth 44:669-674). La anestesia se llevó a cabo mediante una inhalación corta de gas de eflurano (Alyrane™, Pharmacia). Se mantuvo dormidas a las ratas durante el procedimiento de implante mediante una mezcla gaseosa de eflurano (20 %) y oxígeno (80 %). Se rasuró la parte baja del lomo de la rata y se desinfectó con clorhexidina al 0,5 % en alcohol al 70 %. Se practicó una incisión de 10 mm longitudinalmente y se diseccionó cuidadosamente la subcutis para crear 3 túneles subcutáneos. Se implantaron hasta diez fragmentos de catéter. La incisión se cerró con grapas quirúrgicas (Precise™, EE. UU.) y se desinfectó con clorhexidina al 0,5% en alcohol al 70%. Los biofilms se formaron durante 48 h y 144 h. Para el explante del catéter, se sacrificó a las ratas mediante inhalación de CO2. Se desinfectó la piel y se retiraron los fragmentos de catéter de debajo del tejido subcutáneo, se lavaron dos veces con PBS 1 x y se cuantificaron o visualizaron. Se caracterizó el efecto de los péptidos que promueven la agregación de Als3p durante el desarrollo de biofilms de Candida in vivo, también. Se incubaron fragmentos de poliuretano recubiertos con suero con células de Candida (5 x 104 células/ml) en presencia de una concentración 50 pM de péptido F9 positivo y péptido F9_negativo,, p13 y p20 durante el periodo de adhesión (90 min, 37 °C). Después, las células no adheridas se retiraron mediante dos rondas de etapas de lavado. Los catéteres se implantaron por vía subcutánea en el lado trasero de ratas inmunosuprimidas como se ha descrito anteriormente. Los biofilms se estudiaron tras seis días después del implante mediante conteo de UFC.
1.6.8. Métodos de cuantificación de biofilms
1.6.8.1 Ensayo de reducción de XTT
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Se estudió la actividad metabólica de células de Candida en biofilms in vitro usando el ensayo de reducción de XTT. Este método se basa en el cambio colorimétrico de un sustrato específico - XTT (2,3-bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfo- fenil)-2H-tetrazolio-5-carboxanilida) (Sigma, EE. UU.) que se reduce a XTT formazano por las deshidrogenasas mitocondriales de células metabólicas activas, medido mediante un espectrofotómetro a 490 nm. La solución de trabajo de XTT (Sigma, EE. UU.) se preparó en 1 x PBS estéril con la concentración final de 1 mg/ml. Antes de su uso, se añadió menadiona a la solución de XTT a una concentración final de 1 pM. La solución se agitó vorticialmente y se aplicaron 100 pl en cada pocillo que contenía biofilm y se incubó durante 3-5 h a 37 °C en la oscuridad. La intensidad del cambio colorimétrico se midió mediante un espectrofotómetro (Spectra max Plus 384) a 490 nm. Como blanco, se usó la solución de XTT-menadiona sin células de Candida.
1.6.8.2 Cuantificación de la biomasa de biofilms fúngicos
La cantidad de biomasa de biofilm fúngico formado dentro del lumen del catéter de catéteres explantados in vitro e in vivo se determinó mediante las unidades formadoras de colonias (UFC). Brevemente, se sometieron a ultrasonidos sustratos in vitro y catéteres de biofilms in vivo durante 10min a 40000Hz en un sonicador de baño de agua (Branson 2210) y además se agitaron vorticialmente durante 30s en 1 x PBS. Las muestras originales y una dilución 1:10 se sembraron en placas de YPD siempre por duplicado. Las UFC se contaron después de dos días a 37 °C.
1.6.9. Visualización de biofilms de Candida por microscopía
1.6.9.1 Microscopía de fluorescencia
Antes de la microscopía de fluorescencia, se cortaron longitudinalmente los catéteres in vitro e in vivo con biofilms unidos y se incubaron en tampón 1 x PBS con 50 pg/ml de blanco de calcoflúor (Sigma, EE. UU.) durante 20 min. Estos dispositivos se observaron con un microscopio de fluorescencia Zeiss Axioplan 2. Las imágenes se grabaron mediante una cámara Zeiss Axiocam HRm usando el programa informático Axiovision 3.0 (Carl Zeiss, Thornwood, NY).
1.6.9.2 Microscopía de barrido de electrones
Los catéteres (cortados longitudinalmente) se fijaron en glutaraldehído al 3% en tampón de calcodilato de sodio 0,1 M (pH 7,4) antes de la microscopía. Los catéteres se retiraron de la solución de fijación y se secaron durante una noche. Las muestras mostradas se recubrieron con una lámina de oro y se vieron en un microscopio electrónico de barrido XL30 ESEM FEG (Philips).
1.6.9.3 Microscopía láser confocal de barrido
Los catéteres cortados longitudinalmente y fijados se incubaron con 50 pg/ml concanavalina A durante una hora a 37 °C (concanavalina A, conjugado con Alexa Fluor®488, Invitrogen). Las imágenes confocales se adquirieron y analizaron con un sistema LSM510/ConfoCor2 (Carl Zeiss, Jena, Alemania). El láser de argón (6 A, filtro sintonizable acousto-óptico ajustado al 50%) proporcionó la luz de excitación de 488 nm (para la fluorescencia de ConcanavalinA-Alexa488). La luz de excitación se reflejó por un espejo dicroico (HFT 488) y se enfocó a través de un objetivo Plan-NeoFluar 20x NA0.5. La luz de emisión de fluorescencia pasó a través de un filtro de pase largo de 505-nm y una unidad de agujeros de alfiler 1-Airy. Antes, se evaluó el espesor del biofilm, en primer lugar, se tomaron las imágenes en 3 dimensiones (3-D) de los biofilms maduros. Se efectuaron aproximadamente 200 secciones por toda la arquitectura del biofilm. Después, se estimó el espesor del biofilm a partir de los bordes externos del área donde la señal de fluorescencia gana intensidad por encima de la mitad de su máximo, hasta que se determinó el área donde ya no puede detectarse la señal fluorescente.
1.6.10. Microscopía de fluorescencia de proteína fluorescente verde (GFP)
Se usaron células sin fijar directamente y se visualizaron usando un microscopio de fluorescencia Zeiss Axioplan 2. La GFP se visualizó con una fuente de luz UV y un filtro de GFP de pase largo. Las imágenes se tomaron mediante la cámara acoplada al dispositivo Quantix charge usando el programa informático Axiovision 3.0 (Carl Zeiss, Thornwood, NY).
1.6.11. Absorción del antisuero para ALS3 de conejo con tubos germinales de C. albicans als3Aals3A
Se reconstituyó la forma liofilizada del anticuerpo para ALS3 en 500 pl de agua estéril. El anticuerpo se absorbió con tubos germinales de C. albicans als3A/als3A antes de usarlos para microscopía de fluorescencia y FACS. Se germinaron tres matraces que contenían 1 x 106 células/ml en medio RPMI1640 con L-glutamina y con HEPES (PAA, Austria) durante 90 min a 37 °C. Los tubos germinales se dividieron en tubos de micro-centrifugación, mezclados con antisuero para ALS3 y se incubaron durante 1 h sobre hielo con agitación suave. Después, se centrifugaron las células y se transfirió el sobrenadante a otro matraz que contenía tubos de C. albicansals3A/als3Agerm frescos. Este procedimiento se repitió tres veces en total. El antisuero para ALS3se separó en alícuotas en un volumen menor (20 pl) y se almacenó a -80 °C. La especificidad del anticuerpo se confirmó
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mediante microscopía de fluorescencia (Leica DFC350 FX, Mannheim, Alemania).
1.6.12. Crecimiento y diferenciación de células epiteliales
Originariamente, se obtuvo la línea celular TR-146 de células epiteliales procedentes de la mucosa bucal de carcinoma escamoso de Cancer Research Technology, Londres. Las células TR-146 son capaces de formar capas estratificadas de células que muestran muchas similitudes en comparación con la mucosa bucal humana normal (Rupniak et al., (1985) J Natl Cancer Inst 75:621-35. Las células TR-146 se cultivaron de manera rutinaria (pases 4 - 20) en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) que contenía NaHCO3, D-glucosa, piruvato de sodio y glutamina estable con suero de ternero fetal (FCS) al 10% (Sigma, EE. UU.), sin antibióticos o agentes antifúngicos. Las células se mantuvieron en un incubador humidificado a 37 °C en CO2 al 5%. Para los experimentos de adherencia e invasión, se sembraron 1 x 105 células TR-146 en portaobjetos de vidrio de 12 mm de diámetro colocados previamente en placas de 24 pocillos.
1.6.13. Ensayo de adherencia
Se cultivaron cepas de C. albicans en YPD líquido, succinato, pH 6,5 o YNB (D-glucosa al 4%) a 30 °C en un incubador con agitación durante una noche. Las células de Candida se lavaron tres veces con 1 x PBS y se determinaron hasta una concentración final de 1 x 105 células/ml en DMEM que contenía NaHCO3, D-glucosa, piruvato de sodio y glutamina estable sin FCS. Las células TR-146 se cultivaron sobre portaobjetos de vidrio de 12 mm y se inocularon con células de Candida. Se probaron diferentes concentraciones de péptido F9 positivo (50 pM, 10 pM y 2,5 pM) y péptidos negativos F9_negat, 13 y 20 (50 pM) sobre la adhesión de Candida a células epiteliales. Los ensayos de adhesión se efectuaron durante 1 h a 37 °C, CO2 al 5%. Después de la adhesión, se lavaron las células tres veces con 1 x PBS para eliminar células no adherentes y después se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 30 min a temperatura ambiente. Después de un enjuagado exhaustivo con 1 x PBS, se permeabilizaron las células con Triton X-100 al 0,5% en agua durante 5 min y posteriormente se tiñeron con blanco de calcoflúor (dilución 1:100) durante 15 min y de lavaron adicionalmente con agua, tres veces durante 10 min, a 30 °C, 180 rpm. Los portaobjetos se montaron en posición invertida sobre un portaobjetos de microscopio y se cuantificaron con epifluorescencia usando un conjunto de filtro para detectar el blanco de calcoflúor (filtro para DAPI) (Leica DFC350 FX, Mannheim, Alemania). Se calculó el porcentaje de células adheridas como la media de células de Candida unidas sobre cien áreas dispersas a lo largo de toda la superficie del cubreobjetos.
1.6.14. Ensayo de invasión
Se infectaron las monocapas de líneas celulares TR-146 con células de Candida como se ha descrito anteriormente en 6.2.15. Después de un periodo de incubación de 3 h de las monocapas con células de Candida a 37 °C, CO2 al 5%, se aspiró el medio por encima de las células epiteliales y se enjuagaron tres veces las monocapas con 1 x PBS para eliminar las células fúngicas que no se habían asociad a células epiteliales. A continuación, se fijaron las células epiteliales con Histofix al 4% (Roth) durante 20 min a 37 °C. Todas las células fúngicas que permanecían adherentes a la superficie se tiñeron durante 1 h con un anticuerpo policlonal de conejo anti-C. albicans (Acris Antibodies, Alemania) (dilución 1:2000) y se contratiñeron con un anticuerpo secundario anti-IgG de conejo conjugado con Alexa Fluor 488 (Invitrogen) (dilución 1:5000). Después de un enjuagado exhaustivo con 1 x PBS, las células se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,5% en agua durante 5 min. Además, las partes adherentes e invasoras de células fúngicas en las células epiteliales se tiñeron con blanco de calcoflúor (dilución 1:100) durante 15 min y se lavaron tres veces con agua, durante 10 min a 30 °C, 180 rpm. Los portaobjetos se montaron en posición invertida sobre portaobjetos de vidrio y las células teñidas se visualizaron con epifluorescencia usando un filtro ajustado para detectar el blanco de calcoflúor (filtro para DAPI) y Alexa Fluor 488 (Leica DFC350 FX, Mannheim, Alemania). Se determinó el porcentaje de células de C. albicans invasoras dividiendo el número de células internalizadas entre el número total de células adherentes. Se contaron al menos 100 células fúngicas sobre cada portaobjetos.
1.6.15. Detección de la unión del anticuerpo para ALS3 a C. albicans mediante microscopía de fluorescencia y mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS)
Se recogieron cultivos de una noche de células de C. albicans y se lavaron tres veces con 1 x PBS. Se prepararon células de Candida (2,5 x 106 células/ml) en medio RPM 11640 con L-glutamina y con HEPES (PAA, Austria) con/sin péptido F9 (50 pM, 10 pM y 2,5 pM) o los péptidos negativos F9_negat, 13 y 20 (50 pM). Se llevó a cabo la adhesión y la inducción de hifas de Candida sobre portaobjetos de vidrio de 12 mm o placas de Petri de vidrio (0 5 cm) durante 45, 60 o 90 min a 37 °C, CO2 al 5%. Las células no adheridas se lavaron con 1 x PBS y se fijaron inmediatamente con Histofix al 4% (Roth) durante 20 min a 37 °C. Después de un enjuagado exhaustivo con 1 x PBS, se permeabilizaron las células en Triton X-100 al 0,5% durante 5 min, se lavaron y se incubaron en albúmina sérica bovina (BSA) al 1% durante 20 min a TA. Además, las células adheridas se incubaron en presencia de antisuero para ALS3 (dilución 1:500) durante 60 min a 30 °C y se contratiñeron con anticuerpo secundario anti-IgG de ratón conjugado con Alexa Fluor 488 (Invitrogen) (dilución 1:2000). Después de la etapa final de lavado, se montaron los portaobjetos en posición invertida sobre portaobjetos de vidrio y las células teñidas se visualizaron con epifluorescencia usando un filtro ajustado para detectar el Alexa Fluor 488 (Leica DFC350 FX, Mannheim,
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Alemania). Finalmente, se desprendieron las células de los portaobjetos usando un rascador de células y se resuspendieron en 0,5 ml de 1 x PBS. La intensidad de fluorescencia de las hifas se midió usando un citómetro de flujo LSRII (Becton Dickinson,
http://www.bd.com). Se recogieron datos de fluorescencia para 10.000 células de cada cepa.
1.6.16. Aislamiento de esferoplastos y tinción de Coomassie de geles de poliacrilamida
Se incubaron células de Candida (1 x 107 células/ml) en medio YPD en presencia de péptido F9, F9_negat, 13 y 20 (50 |jM) a 37 °C. Se recogieron las células a los 5 min, 30 min y 60 min tras la adición de péptidos, se centrifugaron a 4500 rpm, 5 min a temperatura ambiente. Los sedimentos se lavaron dos veces con un volumen igual de tampón de digestión (sorbitol 2 M, KH2PO4 1 M, pH 7,5, EDTA 0,5 M) sin zimolasa, se pesaron y se disolvieron adicionalmente en tampón de digestión que contenía 10 mg de zimolasa 20T (MP Biomedicals, EE. UU.) (5 ml de tampón/1 g de células). La reacción se complementó con 10 jl de p-mercaptoetanol por 1 ml de tampón de digestión. Las células se incubaron durante 30 min - 45 min a 37 °C. Se determinaron los esferoplastos frente a células intactas en un pequeño volumen de SDS al 0,5% y se observaron bajo el microscopio. Las células intactas no se vieron influenciadas por la presencia de SDS al 0,5% mientras que los esferoplastos solo dejan "fantasmas". Los esferoplastos se recogieron por centrifugación a 2000 rpm, 2 min, TA y se lavaron dos veces con sorbitol frío 1,2 M. De manera importante, todas las soluciones usadas para el aislamiento de esferoplastos contenían mezclas de inhibidor de proteasa (completo sin EDTA, Roche). Finalmente, los esferoplastos se disolvieron en tampón de muestra NuPAGE® LDS (Invitrogen) complementado con p-mercaptoetanol al 4%, se coció durante 5 min a 65 °C. Antes de cargar en el gel, se centrifugaron brevemente las muestras. Las proteínas se separaron mediante SDS- PAGE (gel NuPAGE® de Bis-Tris al 4-12%, Invitrogen) en tampón de ejecución NuPAGE® MES SDS (Invitrogen) a un voltaje continuo de 120 V. Después de la electroforesis, los geles se transfirieron a una bandeja de plástico y se tiñeron las proteínas con azul brillante de Coomassie al 0,25% en metanol al 30% (v/v) y ácido acético al 10% (v/v) durante una noche con agitación suave. Los geles se destiñeron en metanol al 30% (v/v) y ácido acético al 10% hasta que las bandas de proteína se volvieron claramente visibles.
1.6.17. Análisis estadístico
Para los análisis estadísticos, se usó la prueba de la t de Student. Los resultados se consideraron estadísticamente significativos cuando p < 0,001. El significado estadístico del tratamiento antifúngico se analizó con una prueba de Mann-Whitney (programa informático Analyse-it).
Todos los experimentos se repitieron al menos tres veces por duplicado. Cada ensayo de adhesión de C. albicans in vitro o ensayo de biofilms se repitió cinco veces por triplicado. Los biofilms de C. albicans in vivo se repitieron cuatro veces, incluyendo siempre dos animales por cepa. Durante la determinación de la susceptibilidad a formar biofilms de C. albicans, se probó cada concentración del fármaco por cuadruplicado. Todos los procedimientos experimentales que incluían células TR-146 se efectuaron por duplicado en cinco ocasiones separadas. Los análisis FACS y la determinación de la unión del anticuerpo para ALS3 se repitieron cinco veces.
2. Aplicaciones antibacterianas
2.1 Introducción
La creciente resistencia a antibióticos es un proceso evolutivo inevitable. Hasta ahora, aproximadamente un 90% de las bacterias que provocan infecciones graves son resistentes a la mayoría de los anticuerpos disponibles. La mayoría de los nuevos antibióticos son derivados de los compuestos anteriores o de compuestos que pertenecen a clases bien conocidas. Por lo tanto, hay necesidad de antibacterianos con nuevos mecanismos de acción.
En el presente ejemplo se ha diseñado una biblioteca de péptidos interferidores basados en las secuencias propensas a la agregación presentes en proteínas diana de los genomas disponibles al público de Staphylococcus epidermidis y Staphylococcus aureus (cepa de MRSA). Estos genomas se seleccionaron basándose en la relevancia clínica de estas cepas bacterianas; especialmente en el contexto de enfermedades hospitalarias. En el presente ejemplo se ha demostrado que los interferidores diseñados tienen una fuerte actividad antibacteriana in vitro e in vivo contra una gran variedad de bacterias grampositivas, incluyendo Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (MRSA) y enterococos resistentes a la vancomicina (VRE) y también bacterias gramnegativas. Los presentes resultados demuestran de manera convincente que la agregación puede servir como una estrategia antimicrobiana exitosa. Este es un gran avance para el tratamiento de enfermedades nosocomiales, especialmente a la luz de las cepas emergentes resistentes a múltiples fármacos y pan-resistentes.
2.2 Exploración primaria de la biblioteca de péptido interferidor, determinación de la concentración inhibidora mínima (CIM)
Se diseñó un total de 50 péptidos interferidores diferentes basándose en la aparición de regiones propensas a la agregación presentes en múltiples proteínas codificadas por los genomas de Staphylococcus epidermidis y Staphylococcus aureus. Debido al diseño de estos péptidos interferidores, es probable que algunas de estas
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regiones también estén presentes en proteínas de otras especies bacterianas (distantes). En el esfuerzo de selección, se llevó a cabo un procedimiento en dos etapas: 1) selección inicial de todos los péptidos a mayores concentraciones (75-300 |jg/ml) seguida de 2) una selección a concentraciones menores (<75 |jg/ml) para un conjunto seleccionado de compuestos con una actividad demostrada en la etapa 1). Las bacterias se cultivaron en un incubador con agitación a 37°C y 160rpm en 50 ml de BHI, usando colonias individuales recogidas de una placa de placa fresca de una noche de TSA-sangre de oveja. Los cultivos se cultivaron hasta una densidad de aproximadamente 1x108 células/ml y después se diluyeron a 5x105 células/ml en CAMHB (Mc Farland 0,5). Cada pocillo contenía 100 jl (50 jl de péptido que contenía MHB más 50 jl de inóculo). La densidad celular final fue de 1x105 a 5x105/ml. Después de la adición de la suspensión de células, las placas se incubaron a 37°C durante 18 a 24 horas. La densidad óptica a 590nm (DO590) de cada pocillo se midió después de 5 segundos de agitación de la placa usando un espectrofotómetro Perkin Elmer (Contador Multimarcador 1420 Victor 3). El valor de CIM se leyó como la concentración mínima que se necesitó para inhibir completamente el crecimiento de bacterias en un pocillo. Cada pocillo, donde no se observó crecimiento, también se sembró en placas de agar de TSA-sangre de oveja, se incubó a 37°C durante una noche y se inspeccionó visualmente.
Esto proporcionó varias moléculas con alta actividad contra estafilococos y otras especies bacterianas (véase la tabla 4). Además de los compuestos mostrados en la tabla, que se diseñaron principalmente para que fuesen activos contra S. aureus, dos moléculas que vale la pena mencionar y que se diseñaron para que fuesen activas contra S. epidermidis son C29 (secuencia: RLFNFLKrGsRLFNFLKR (SeQ ID NO: 32), es decir, idéntica a Hit11 en la tabla 4) y C30 (RILLGLIRRGSRILLGLIRR (SEQ ID NO: 115)).
Tabla 4: Resumen de la potencia in vitro de péptidos diseñados contra S. aureus. Los resultados mostrados son para _________________________péptidos sintetizados en formato de microescala.__________________________
Nombre del péptido
Secuencia Valores de CIM en pg/ml) contra diferentes especies
S.aureus ATCC 29213
S.epidermidis ATCC 12228 B.cereus ATCC
Hit50
RFFIALSRRGSRVQAYLYRR (SEQ ID NO: 30) 50 25 >100
Hit1
RWVSMLLRRGSRWVSMLLRR (SEQ ID NO: 31) 100 50 6
C29 / Hit11
RLFNFLKRGSRLFNFLKR (SEQ ID NO: 32) 12,5-25 12,5 6-12,5
Hit14
RRWVSMLLRRGSRWVSMLLRR (SEQ ID NO: 33) 25 50 100
Hit57A
RFFIGLSRRGSRLFNFLKR (SEQ ID NO: 34) 100 25 No probado
Hit50A
RFFIGLSRRGSRIQAYLYRR (SEQ ID NO: 78) 100 12,5 50
Hit37
RWVSMLLRRGSRVGYVIARR (SEQ ID NO: 114) 100 50 >100
2.2.1. Espectro de los compuestos antibacterianos
En la tabla 4 se muestra la actividad CIM (en jg/ml) de seis péptidos interferidores diferentes que se han seleccionado después de la selección inicial. La estructura de estas moléculas corresponde a la fórmula indicada en la solicitud, donde n es dos, X1 es 1 aminoácido (Hit50, Hit1, Hit11, Hit57A, Hit50A) o 2 aminoácidos (Hit14), Y1 es 5 (Hit11) o 6 aminoácidos (los demás), X2 es dos aminoácidos, Z1 es un enlazador de dos aminoácidos, X3 es 1 aminoácido, Y2 es 5 (Hit11 y Hit 57A) o 6 aminoácidos, X4 es dos aminoácidos y Z2 está ausente. Obsérvese que Y1 e Y2 pueden ser iguales o diferentes. Cabe destacar que, en los restos Y con una secuencia de 5 aminoácidos, el resto flanqueante K también está presente en proteínas de S. aureus, por lo que estas secuencias son idénticas a lo largo de 6 aminoácidos en lugar de 5.
Estos péptidos interferidores se diseñaron originalmente para que se dirigiesen de manera específica a la cepa MRSA de Staphylococcus aureus. Debido a la presencia de la misma secuencia propensa a la agregación (es decir, la secuencia TANGO) en los genomas de otras bacterias grampositivas, también hubo actividad de los péptidos interferidores frente a otras especies bacterianas. El péptido interferidor Hit1 ha demostrado ser un interferidor de amplio espectro. Hit14 parece más específico para la cepa bacteriana para la que se diseñó (es decir, Staphylococcus aureus MRSA). Hit11, aunque es eficaz contra ambas cepas de estafilococos, es más activo contra S. epidermidis, lo que concuerda con el hecho de que la secuencia exacta de las regiones Y está presente con más frecuencia en el genoma de S. epidermidis. El valor de CIM (o de concentración inhibidora mínima) es la concentración más baja de un antibacteriano que inhibirá el crecimiento visible de la bacteria tras la incubación. La concentración bactericida mínima (CBM) se consideró como la concentración más baja de péptido que impidió el crecimiento y redujo el inóculo en un 99,90% en 24 h. Las CBM se determinaron sembrando el contenido de cada pocillo en una placa de agar sangre para comprobar su viabilidad. Además, también se usó el contenido del pocillo
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como inóculo para una nueva placa de micropocillos (en la que no se añadió péptido) y se anotó el cambio progresivo de la turbidez durante otras 24 h. Los valores de CBM fueron o iguales o 2 veces mayores que los valores de CIM, lo que sugiere que estos son agentes bactericidas.
En una etapa posterior, se reorganizaron los péptidos que mantuvieron una alta actividad (CIM baja) a lo largo de selecciones repetidas en forma escalada altamente purificada y se sometieron a pruebas adicionales en varias bacterias grampositivas y gramnegativas. La tabla 5 presenta los valores de CIM del compuesto 30 (C30) para una serie de especies bacterianas. Tal como puede observarse en la tabla 5, el compuesto 30 no solo es muy eficaz contra Staphylococcus epidemidis, en cuyo genoma se codifica la secuencia inductora de la agregación, habiéndose usado dicha secuencia para diseñar el compuesto 30, sino también contra otros patógenos clínicamente significativos, tales como S. aureus resistente a meticilina (MRSA) y enterococos resistentes a vancomicina (VRE), el patógeno nosocomial Enterococcus faecalis, un grupo de patógenos alimentarios: Bacillus subtilis, B.cereus, Listeria monocytogenes. Es muy prometedor ver que la actividad contra cepas resistentes a los antibióticos es igual de elevada que contra cepas sensibles a los antibióticos. Esto es indicativo del nuevo mecanismo de acción completo de estos compuestos antimicrobianos. Ya que la resistencia a antibióticos es un gran problema en los hospitales, las moléculas completamente diferentes ofrecen una gran perspectiva en aplicaciones clínicas.
Recientemente, se descubrió que C30, al igual que algunos de los compuestos mostrados en la tabla 4, es también activo contra el género Corynebacterium (no mostrado en la tabla 5). La actividad contra Corynebacteriae es prometedora en vista del nuevo diseño de péptidos contra la tuberculosis, ya que la composición de la pared de Corynebacterium imita a la de Mycobacteriae. La estructura de la pared celular de Mycobacterium tuberculosis requiere una atención especial ya que es única entre los procariotas y es un determinante importante de la virulencia para la bacteria. El complejo de la pared celular contiene peptidoglucano, pero por lo demás está compuesto de lípidos complejos. Más del 60% de la pared celular micobacteriana es lípido. La fracción de lípido de la pared celular de MTB consiste en tres componentes importantes, ácidos micólicos, factor de cordón y cera-D. La baja permeabilidad de la pared celular micobacteriana, con su estructura no habitual, se sabe que es un factor importante en esta resistencia. Por lo tanto, los agentes hidrófilos cruzan la pared celular lentamente debido a que la porina micobacteriana no es eficaz para permitir la permeación de solutos y existe a baja concentración. Probablemente, los agentes lipófilos se frenan por la bicapa lipídica que tiene una fluidez infrecuentemente baja y un espesor anormal.
El mayor valor de CIM de C30 para bacterias gramnegativas puede reflejar el hecho de que la estructura de C30 es un péptido interferidor en tándem (es decir, un péptido con dos series inductoras de la agregación idénticas (2 restos Y idénticos)). Las pruebas recientes han demostrado que los péptidos interferidores individuales también muestran bajos valores de CIM para bacterias gramnegativas. Sin limitar la invención a un mecanismo de acción particular, esto puede indicar al hecho de que las bacterias gramnegativas tienen poros más pequeños en su pared celular bacteriana que podría limitar la entrada de interferidores en tándem en comparación con péptidos interferidores individuales. Sin embargo, obsérvese también que hay varias proteínas que contienen las series inductoras de la agregación y estos grupos de proteínas no son idénticos en bacterias grampositivas y gramnegativas. Por lo tanto, puede darse el caso de que una o más proteínas diana se agreguen en bacterias grampositivas que en las gramnegativas.
Resultados en bacterias planctónicas: Valores de CIM para el compuesto 30
Tabla 5: Valores de CIM para el compuesto 30 (C30) frente a una gran variedad de especies grampositivas y gramnegativas. Además, la tabla también incluye 7 cepas MRSA y 7 VRE. La lectura para los valores de CIM se
efectuó después de 18 horas de crecimiento.
Gramnegativas
E. coli ATCC25922: 100 pg/ml
Ps. aeruginosa ATCC27853: > 100 pg/ml
Grampositivas
S. aureus ATCC29213: 3 pg/ml MRSA 204 MRSA 418 MRSA 274 MRSA 165 MRSA 351 MRSA 115 MRSA 651
6 pg/ml 6 pg/ml 3 pg/ml 3 pg/ml 3 pg/ml 6 pg/ml 3 pg/ml
E. faecalis ATCC 19433: 6 pg/ml VRE 8: 3 pg/ml
• VRE 11
• VRE 12
• VRE 40
• VRE 60
1.5 pg/ml
12.5 pg/ml 3 pg/ml
3 pg/ml
1 Grampositivas
1 S. epidermidis ATCC 13228: 1,5 pg/ml
■ S101: 1,5 pg/ml
■ S103: 1,5 pg/ml
■ S104: 1,5 pg/ml 1 S109: 3 pg/ml
1 S. capitis: 1,5 pg/ml 1 S.hominis:3 pg/ml 1 S.haemolyticus:1,5 pg/ml 1 Nocardia asteroides ATCC 3308: 1,5 pg/ml 1 Micrococcus luteus ATCC 9341: 3 pg/ml 1 Listeria monocytogenes ATCC 11994: 1,5 pg/ml
1 Bacillus subtilis ATCC 6051:1,5 pg/ml 1 Bacillus subtilis IP 5832: 6 pg/ml 1 Bacillus cereus 1: 6 pg/ml 1 Bacillus cereus 2: 6 pg/ml
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• Gramnegativas • Grampositivas
• VRE 70: 1,5 pg/ml
• VRE 54: 3 pg/ml
2.2.2. Efecto de la pureza y las modificaciones en la actividad peptídica
Se ha observado una mejora significativa (de hasta 5 veces) de la actividad de los péptidos interferidores cuando se sintetizaron en una forma altamente pura. Los resultados de esta actividad mejorada se muestran en la tabla 6. De manera importante, esta mejora de la actividad no aumenta la toxicidad contra células de mamífero (datos no mostrados). Además, se ha descubierto que los péptidos interferidores marcados con biotina fueron tan activos como los péptidos interferidores no marcados. Esto significa que pueden usarse diferentes métodos de detección.
Tabla 6: Resumen de la concentración inhibidora mínima in vitro contra diferentes bacterias de los péptidos con una ________ pureza de > 95% (HPLC-220nm-C18-gradiente lineal) diseñados contra S. aureus MRsA.__________
Nombre del péptido
Secuencia Valores de MIC (pg/ml) contra diferentes especies
S.aureus ATCC 29213
MRSA 326 S.epidermidis ATCC 12228 Corynebacterium
Hit50
rffialsrrgsrvqaylyrr (SEQ ID NO: 30) 25 50 3 12,5
Hit1
rwvsmllrrgsrwvsmllrr (SEQ ID NO: 31) 3 6 1,5 3
C29/ Hit11
RLFNFLKRGSRLFNFLKR (SEQ ID NO: 32) 12,5-25 12,5 0,6-3 6
Hit14
rrwvsmllrrgsrwvsmllrr (SEQ ID NO: 33) 12,5 No probado 50 No probado
Hit57A
rffiglsrrgsrlfnflkr (SEQ ID NO: 34) 50 6 3-6 No activo
Hit50A
rffiglsrrgsriqaylyrr (SEQ ID NO: 78) 100 50 6 No probado
Hit37
rwvsmllrrgsrvgyviarr (SEQ ID NO: 114) 100 100 6 No probado
En la tabla no se muestra Hit24. La secuencia de Hit24 (es decir, RRLFNFLKRGSRLFNFLKR (SEQ ID NO: 74)) es una secuencia modificada de Hit 11 (véase la tabla 4), en donde Hit24 tiene un doble resto constitutivo en la parte delantera. Aunque no se probó contra todas las bacterias, tiene una actividad considerable contra S. aureus ATCC 29213 (valor de CIM 12,5 pg/ml), S.epidermidis ATCC 12228 (CIM 1,5 pg/ml) y la gramnegativa E. cloacae (25 pg/ml).
Aparte de biotinilación, se probaron varias otras modificaciones de los interferidores. Estos se basaron en C30 e incluyen una versión de D-aminoácidos de C30.
Otra modificación que se probó es la PEGilación del péptido C30. Se probó la unión covalente de PEG en una posición diferente del péptido C30. Se usó como un resto tanto interno (es decir, como el resto enlazador Zi) como N-terminal. El objetivo de la introducción de PEG fue principalmente proporcionar una mejor estabilidad del compuesto in vivo, así como una mejor solubilidad.
Los siguientes compuestos, basados en la secuencia de C30 (SEQ ID NO: 115), se han sintetizado:
P2170: Ac-RILLGLIRRGSRILLGLIRR-CONH2, una versión acetilada y amidada de C30.
P2175: NH2-RILLGLIRR(Peg)2RILLGLIRR-CONH2, una versión amidada de C30 en donde el enlazador Z1 entre las regiones agregantes consta de dos unidades de EPG (es decir, dos unidades de óxido de etileno unidas mediante un enlace éter) en lugar de la secuencia de aminoácidos GS.
P2151: NH2-RILLGLIRRGSRILLGLIRR-OH, C30 normal pero preparado usando diferentes síntesis químicas de péptido.
P2153: NH2-(Peg)2RILLGLIRRGSRILLGLIRR-OH, C30 que está fusionado en N-terminal a dos unidades de PEG. Esto puede formularse como C30 con un resto Z0 adicional que consta de dos unidades de PEG.
P2154: NH2-Peg3RILLGLIRRGSRILLGLIRR-OH, C30 que está fusionado en N-terminal a tres unidades de PEG. Esto puede formularse como C30 con un resto Z0 adicional que consta de tres unidades de PEG.
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DAA: una versión de D-aminoácidos de C30 en donde todos los aminoácidos son D-aminoácidos.
Estos péptidos se probaron del mismo modo que para las selecciones originales. Se usó un método de dilución de microcaldo con diluciones de factor dos en CAMHB (de acuerdo con las guías de la EMEA) para la evaluación de la actividad del péptido, con concentraciones en el intervalo de 03 pg/ml a 200 pg/ml.
Los resultados se muestran en la tabla 7. Para P2170 y P2175, se probaron dos fracciones correspondientes a dos picos obtenidos durante la síntesis de péptido. Estos se indican como P1 y P2, respectivamente.
Tabla 7. Valores de CIM para cepas bacterianas seleccionadas para péptidos C30 modificados.
Tipo de bacteria
Concentraciones inhibidoras mínimas CIMso(pg/ml)
P2170/P1 P2170/P2 P2175/P1 P2175/P2 DAA P2151 P2153 P2154
S. aureus ATCC
12,5 12,5 100 100 25 50 25 25
S. epidermidis ATCC12228
6 12,5 12,5 6 1,5 12,5 12,5 12,5
B. cereus
6 6 12,5 12,5 6 12,5 6 12,5
MRSA 326
12,5 12,5 25 25 6 12,5 12,5 12,5
E. coli ATCC
25 25 25 50 25 25 25 50
Corynebacterium
>200 100 >200 >200 >200
E. faecalis ATCC 1943
12,5 12,5 12,5 6 6 25 25 12,5
Klebsiella pneumoniae
>200 >200 50 100 25 25 50 100
Nocardia asteroides 3908
6 3 3 6 >200 12,5 6 6
S. hominis DSM20328
3 3 3 1,5 1,5 3 3 3
Salmonella typhi ATCC14028
100 100 50 25 100 100 >200 >200
Tal como puede observarse a partir de la tabla, todos los péptidos modificados conservan una actividad antibacteriana que es comparable a la de C30 no modificado. Por lo tanto, las modificaciones, tales como D- aminoácidos y pEGilación no tienen un efecto negativo en la actividad de las moléculas presentadas en el presente documento. Es particularmente alentador que los valores de CIM (y por lo tanto, la actividad antibacteriana) no se vieron afectados por la PEGilación.
2.2.3 Péptidos de control no agregantes
Para validar el principio de diseño de los agregadores se construyeron péptidos de control, denominados en el presente documento como "desordenados". Estos están compuestos por los mismos aminoácidos que los agregadores originales (y por lo tanto, tienen la misma carga), pero se desordena el orden de tal forma que dejan de cumplir con los principios de diseño presentados en el presente documento. Estos péptidos no dan como resultado la inhibición del crecimiento o la supervivencia bacteriana.
2.2.4. Uso como diana de más de una proteína bacteriana
Como se ha mencionado, una primera exploración se basó en la identificación de regiones propensas a la agregación en proteínas codificadas por los genomas de Staphylococcus epidermidis y Staphylococcus aureus. Como un compuesto altamente prometedor, C30, contiene secuencias inductoras de la agregación que están presentes en más de una proteína en estos genomas, se barajó la hipótesis de que esto podría usarse en el diseño de nuevos compuestos. Por lo tanto, en una etapa posterior, se diseñaron péptidos interferidores para los que había disponible más de una diana prevista en las células bacterianas de S. epidermidis y S. aureus (es decir, que contienen secuencias beta-agregantes que están presentes en más de una proteína codificada por cualquiera de estas bacterias). Esta selección de péptido interferidor denominada "mtop" mostró una alta tasa de acierto, lo que indica que el diseño de péptidos interferidores antibacterianos puede estar basado en una serie de dianas disponibles en la célula bacteriana (es decir, cuantas más proteínas diana que contengan una región TANGO concreta, mayores posibilidades habrá de obtener un efecto bactericida con el interferidor). Esto es lógico, ya que cuantas más proteínas se usen como diana, mayores probabilidades habrá de que al inhibir una o más de estas se inhiba una función esencial. La tabla 8 muestra la actividad CIM de péptidos interferidores biespecíficos que se diseñaron basándose en el hallazgo de más de una proteína diana en la bacteria. Es importante mencionar que los interferidores usados en la tabla 5 se sintetizaron en formato de microescala; esto significa que se espera una mejora considerable de la actividad del interferidor para los péptidos interferidores de alta pureza.
Las moléculas listadas en la tabla 5 corresponden a la fórmula indicada en la solicitud, donde n es 2, Xi y X4 son dos aminoácidos, Y. e Y2 son 6 aminoácidos, X2 y X3 son 1 aminoácido, Z. es un enlazador de dos aminoácidos y Z2 está ausente.
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Tabla 8: Valores de CIM de varios péptidos interferidores multidiana
Nombre
Secuencia Cepa bacteriana Valor de MIC (pg/ml)
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RRIILFILRPPRLILFLGRR (SEQ ID NO: 35) S. epidermidis 50
S. aureus 200
mtop_4
RRIILSLIRPPRLLGVVLRR (SEQ ID NO: 36) S. epidermidis 3
S. aureus 100
mtop_5
RRVLSLILRPPRIALLGLRR (SEQ ID NO: 37) S. epidermidis 25
S. aureus 100
mtop_6
RRIALLLIRPPRLLAIAVRR (SEQ ID NO: 38) S. epidermidis 50
S. aureus >200
mtop_11
RRILLGLIRPPRTIIGLVRR (SEQ ID NO: 39) S. epidermidis 12,5
S. aureus >200
mtop_12
RRILLLIARPPRILLGAIRR (SEQ ID NO: 40) S. epidermidis 12,5
S. aureus >200
mtop_17
RRLLGLIIRPPRAIALTLRR (SEQ ID NO: 41) S. epidermidis 100
S. aureus 50
mtop_18
RRILGLIARPPRIAFVILRR (SEQ ID NO: 42) S. epidermidis 50
S. aureus >200
mtop_22
RRIIGIIARPPRVLVTLLRR (SEQ ID NO: 43) S. epidermidis 50
S. aureus >200
2.3 Cinética de eliminación antimicrobiana de las moléculas interferidoras
Se obtuvieron curvas de tiempo-eliminación para estudiar la cinética de la actividad bactericida. Los compuestos C30, Hit50 y C29 (véase lo anterior para sus secuencias) se probaron contra la cepa de S. epidermidis ATCC 12228 y S. aureus ATCC a la CIM de los compuestos y dos veces el valor de CIM. Se demostró que el compuesto C30 redujo los recuentos viables en un 100% en 5 min, mientras que Hit50 redujo los recuentos viables en ~3 log unidades después del mismo periodo de incubación, ambos a una concentración que igualaron su valor de CIM (véase la figura 11). Todos los péptidos mostraron una actividad dependiente de la concentración, ya que al duplicar la concentración al doble del valor de CIM se obtuvo como resultado una eliminación más rápida. Por ejemplo, el tiempo necesario para reducir a la mitad el número de UFC/ml para C29 fue de 60 minutos (a la concentración inhibidora mínima) y solo 10 minutos para 2xCIM. Este es un efecto importante, ya que generalmente se cree que los antibióticos que tienen un efecto bactericida más rápido son más eficaces y se desarrolla más lentamente la resistencia a dichos compuestos.
2.4 Control del desarrollo de resistencia bacteriana contra interferidores antibacterianos
Se evaluó la capacidad de la cepa clínica de S. aureus MRSA 204 para desarrollar resistencia al interferidor C30 mediante pases repetidos y determinación de CIM. Se usaron células de S. aureus que crecieron en presencia de C30 a la mitad de la CIM en el día uno al día siguiente en un ensayo de CIM del mismo compuesto. De este modo, se expuso de manera continua a las células a un solo compuesto (es decir, C30) a la mitad del valor de CIM sin pases durante 15 días. Se pudo demostrar que la exposición continua al péptido interferidor C30 dio como resultado una tendencia mínima al desarrollo de resistencia ya que se necesitaron diez pases a la mitad de la CIM inicial para elevar la CIM al doble. Se necesitaron nueve pases a menos de la CIM antes de que se elevase 2 veces la CIM, aunque esta resistencia no se mantuvo con el tiempo y tras 12 pases, la CIM volvió a su valor original. Véase la fig. 15. Se obtuvieron resultados similares con otros de los péptidos listados anteriormente. Cuando se controló la resistencia a lo largo de un periodo de tiempo más largo (31 en lugar de 15 días) no se observó un aumento adicional del valor de CIM (véase más adelante).
Sin embargo, la CIM de la rifampina aumenta significativamente durante el mismo periodo de tiempo (hasta 512 veces a lo largo de 15 días) - la rifampina es un agente contra el que se sabe que surge fácilmente resistencia debido a mutaciones puntuales cromosómicas espontáneas. De manera similar a los péptidos probados, la CIM de la vancomicina en estas condiciones solo aumentó dos veces; la vancomicina se considera generalmente un antibiótico contra el que es improbable que se desarrolle resistencia espontánea en condiciones donde se excluye la transferencia genética horizontal entre especies. Cabe mencionar que los compuestos se dirigen a regiones hidrófobas enterradas dentro de las proteínas. Se cree que estas regiones se encuentran generalmente bien conservadas y no pueden mutarse fácilmente, ya que esto ocasionaría proteínas mal plegadas (no funcionales). Sin quedar ligados a un mecanismo particular, esto puede contribuir al lento desarrollo de resistencia observado.
Ya que el desarrollo de resistencia es un proceso estocástico, se repitió el experimento anterior usando el mismo
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método de microdilución de caldo (siempre 4 duplicados) y también añadiendo antibióticos comunes, tales como ampicilina y gentamicina. Puede observarse que tanto C30 como C29 muestran una aparición mucho más lenta de resistencia que la ampicilina y que los valores de CIM aumentan considerablemente menos que los de gentamicina y ampicilina (fig. 12). Obsérvese que, ya que los valores de CIM iniciales de la gentamicina son menores que los de los compuestos, el múltiplo de aumento es mucho más pronunciado que el mostrado en la figura.
Una segunda serie de experimentos consistió en la inoculación de 2 ml de caldo BHI complementado con concentraciones definidas del péptido C30 con una cepa MRSA 326. Cada día, se evaluó la CIM como se ha descrito anteriormente. La concentración del péptido en el medio se ajustó de acuerdo con la CIM del día anterior, de tal forma que el medio de crecimiento soportó la selección de resistencia. Esto se repitió 3 veces durante 31 días. La CIM para C30 mostró fluctuaciones similares a las del experimento anterior y nunca aumentó más de 4 veces. En el último día del experimento, la CIM fue de 12,5 pg/ml. En comparación, el nivel de CIM para las células tratadas con ampicilina fluctuó ampliamente, aumentando hasta 7 veces (CIM al final del experimento = 100 pg/ml). El aumento de las concentraciones de ampicilina durante las incubaciones durante una noche dio lugar a la selección de bacterias resistentes y un aumento adicional en el nivel de CIM, mientras que el aumento de la concentración de C30 no aceleró el desarrollo de resistencia. Los resultados se muestran en la fig. 13.
De manera interesante, la supresión de C30 del cultivo provocó una reducción del nivel de CIM del 50% o no tuvo efecto alguno en la susceptibilidad de la cepa.
2.5 Permeabilidad de membrana causada por interferidores antibacterianos
Se estudió el efecto de los péptidos interferidores en las membranas de células microbianas vivas con el colorante Sytox Green (Invitrogen) de unión a ADN no permeable a membrana. La permeabilización permite la entrada del colorante, que se controla por un aumento en la fluorescencia. La tinción del ácido nucleico con Sytox Green se usó para controlar la permeabilidad de la membrana bacteriana con el tiempo (a una concentración constante del péptido interferidor de 25 pg/ml (véase la figura 18) y a diversas concentraciones de péptidos (véase la figura 19) con un tiempo constante de 15 minutos). Se observó un pronunciado aumento en la unión de Sytox Green en los primeros 5 minutos, que se estabilizó transcurrido este punto de tiempo, con un pequeño aumento adicional menor tras 5 minutos. Este pequeño aumento adicional podría atribuirse a la rápida inserción de los péptidos interferidores anfífilos en la bicapa lipídica bacteriana, que induce defectos locales en el empaquetado de lípidos y provoca una permeabilidad mejorada adicionalmente. En comparación con el agente de control lítico (lisostafina), que lisa de manera muy eficaz a Staphylococcus, la señal de Sytox Green fue ligeramente menor para las bacterias tratadas con interferidores antibacterianos. La figura 11 muestra que la curva de eliminación de S. aureus tratadas con compuesto 30 a 3 pg/ml (que es aproximadamente su valor de CIM) pudo destruir estas bacterias muy rápidamente (ya que la eliminación era dependiente de la concentración); por lo tanto, podría esperarse que se produzca un aumento igualmente rápido en la unión de Sytox Green en caso de que la lisis de la membrana sea el mecanismo de acción. Sin embargo, no es el caso. Para apoyar la hipótesis de que la lisis de membrana no es una causa principal de muerte celular, se ha progresado con estrategias proteómicas para verificar la diana intracelular que está implicada en la interacción péptido primario-diana, así como con análisis de microscopía electrónica para mostrar células intactas.
En una etapa posterior, se estudió el potencial de carga de membrana (MP) para el péptido interferidor C30. Para esto, se usó el kit BacLight (Invitrogen). La figura 20 muestra que en las células bacterianas tratadas con el compuesto C30, hubo una reducción significativa en la fluorescencia roja tras solo 5 minutos, presentando una relación de rojo a verde igual, que indica una despolarización completa de MP. En comparación, el control lítico (lisostafina) mostró una despolarización de la membrana mucho más lenta. El patrón de la gráfica de puntos de células tratadas con C30 es muy similar al control despolarizado. Cuando se combinan estos datos, se puede asumir que tras 5 minutos de tratamiento con C30 se produce un colapso en la MP, que da lugar a un flujo de entrada del colorante de ácido nucleico Sytox Green, que indica hasta cierto punto permeabilización de la membrana. La despolarización causada por estos interferidores mostró ser dependiente del tiempo en lugar de dependiente de la concentración (datos no mostrados). Estos resultados demuestran además el rápido mecanismo de acción bactericida de los interferidores antibacterianos.
2.6 Detección de agregados en bacterias
Los agregados se visualizaron en bacterias tratadas con interferidor antibacteriano con dos colorantes para el diagnóstico de amiloide diferentes (tioflavina T (Th-T) y rojo Congo). La fluorescencia de tioflavina T se ha descrito como un marcador específico para la conformación de lámina extendida de las estructuras beta-agregadas. Cuando este colorante se une a las fibrillas de amiloide, se produce un gran aumento en la fluorescencia de Th-T en relación con el colorante libre. Se usó Th-T en los ensayos bacterianos para investigar si los péptidos interferidores inducen la agregación en estas células bacterianas. Como control, se usaron diluciones de factor dos del péptido interferidor solo en agua fisiológica, para asegurarse de que los péptidos autoagregantes externos no dan lugar a una señal falsa. Se observó claramente un aumento dependiente de la concentración significativo en la unión del colorante Th- T en células bacterianas tratadas con péptidos interferidores (véase la figura 21), lo que indica la presencia de más estructuras de p-lámina en las células bacterianas tratadas con péptidos interferidores. Además, también se
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demostró que el rojo Congo (CR) se une a las estructuras beta agregadas (véase la figura 22) y esta unión induce un cambio característico en la absorbancia óptica máxima de CR de 490 nm a 540 nm. Este experimento confirma el experimento de unión dependiente de la concentración de Th-T, confirmando de manera independiente el aumento en la formación de p-estructura durante el tratamiento con el péptido.
2.7 Cambios morfológicos inducidos por los interferidores en bacterias
Se usó microscopía electrónica de barrido (SEM) y microscopía electrónica de transmisión (TEM) para examinar los cambios ultra estructurales en bacterias inducidos por los péptidos interferidores. Se usaron tanto estafilococos como bacilos por comparación. Pudo observarse que tanto Bacillus cereus como Staphylococcus aureus presentaron una superficie lisa e intacta tras 5 minutos de tratamiento con el interferidor antibacteriano C30, sin mostrar evidencias de cráteres, agujeros o poros en su envuelta. Sin embargo, tras 20 minutos, la superficie de los bacilos comenzó a arrugarse y encoger tras el tratamiento, lo que no fue evidente en los estafilococos probablemente debido a su pequeño tamaño redondo. En ambas especies bacterianas el contenido celular empezó a liberarse, en los bacilos tan solo tras 20 minutos (véase la figura 23, panel derecho, parte inferior) de tratamiento y en S. aureus tan solo tras 1 hora (véase la figura 24). Durante la división celular sana, Bacillus cereus forma cadenas muy largas, que no se separan de las células madre. Sin embargo, se registró que en las poblaciones de células bacterianas de Bacillus cereus tratadas con péptido C30 estas cadenas largas son menos comunes, lo que indica una división celular alterada. Se pudo extraer una conclusión similar por el hecho de que una cantidad significativamente menor de los estafilococos tratados contenían septos de división en comparación con células bacterianas sanas no tratadas. Finalmente, se puede concluir que los datos de SEM ilustran la ausencia de una rápida lisis. Además, sabiendo que el compuesto 30 necesita tan solo 5-10 minutos para eliminar a los estafilococos, podría esperarse una ruptura de las células bacterianas muy rápida, lo que evidentemente no era el caso incluso tras una hora de tratamiento con el interferidor antibacteriano. Para apoyar adicionalmente esta hipótesis, también se observaron secciones ultrafinas de estafilococos tratados con C30. La microscopía electrónica de transmisión de estas células tratadas también confirma la ausencia de lisis, aunque hay una reducción evidente del citoplasma (véanse las figuras 25 y 26). Además, hay un aumento en la densidad electrónica en una región de ácido nucleico, lo que sugiere su condensación. La condensación del ADN es una de las etapas tardías de las respuestas apoptóticas. La muerte celular apoptótica podría soportarse por el análisis en gel en dos dimensiones efectuado, que reveló un aumento de 3 veces en la expresión de la familia del regulador transcripcional MarR, implicado en la actividad autolítica. El análisis por microscopía electrónica de transmisión de las secciones ultrafinas de Staphylococcus aureus tratadas con compuesto 30 mostró estructuras membranosas (véase la flecha en la figura 25) que previamente se habían descrito como mesosomas.
Análisis por microscopía inmunoelectrónica
Se estudió la localización del agregador inmunomarcado usando microscopía electrónica de transmisión. A tal efecto, se marcó el péptido C30 con 5(6)carboxifluoresceína en su extremo N-terminal (marcador de FITC).
Se trataron células en fase de crecimiento exponencial con péptido marcado con FITC (valor de 2xCIM) durante 30 minutos seguido de fijado con fijativo de doble fuerza (paraformaldehído al 4% + glutaraldehído al 0,4% en tampón P 0,1 M, pH 7,4) durante 10 minutos y fijativo de fuerza sencilla (la mitad de la anterior) durante 1 hora. Después de varias etapas de lavado (tampón P y tampón P/glicina) se resuspendió el sedimento en gelatina al 12%/tampón p, se incubó sobre hielo, se cortó en cubos pequeños y se dejó incubar durante una noche en sacarosa 2,3 M. Las muestras se montaron sobre soportes para especímenes, se congelaron en nitrógeno líquido y se seccionaron con un cuchillo de diamante a -100°C con un ultramicrotomo Ultracut S/FCScryou (Leica). Las secciones ultrafinas descongeladas se colocaron en rejillas de cobre (malla 400) recubiertas con Formavarcarbon, se sometieron las secciones a flotación seis veces durante 10 minutos cada vez sobre gotas con glicina-PBS. Después, se lavaron las rejillas en tampón PBS 10 mM durante 5 minutos, se bloquearon con PBS/BSA (0,1%) y se incubaron durante 30 minutos en una gota de anticuerpo primario de cabra anti-FITC (Abcam) (diluido a 1:1000 en tampón de PBS), se lavaron 5 veces en tampón PBS, se incubaron durante 30 min con conjugado de conejo anti-proteína A de cabra-oro (5 nm; BBInternational EM Rag5) diluido a 1:50 en tampón PBS. Después, se lavó la sección 6 veces durante 5 minutos en PBS y 3 veces en ddH2O. Las rejillas se tiñeron durante 5 minutos con acetato de uranilo-metilcelulosa (1%) sobre hielo, se secaron cuidadosamente y se observaron usando un microscopio electrónico de transmisión JEOL JEM 2100, funcionando con un voltaje de aceleración de 80kV. No se detectó unión no específica importante de los anticuerpos en los diferentes procedimientos de control, el marcaje de fondo fue un problema mínimo y la mayoría de las veces, relacionado con etapas de lavado insuficientes después de la incubación con proteína A-oro, que se había optimizado.
Después de 30 minutos de exposición, los péptidos FITC-C30 estaban presentes predominantemente en el citoplasma bacteriano, agrupados en una forma de agregados (figura 27, flechas rojas). Debido a que no se observó unión específica, las partículas marcadas con inmunooro representan la presencia de péptidos. Estos resultados confirman la actividad intracelular de los péptidos. Además, las células tratadas con péptido tienen un proceso de división claramente alterado. La división de las células tratadas con péptido es asimétrica cuando se comparó con los estafilococos no tratados; los septos también son mucho más gruesos y pierden su margen. Curiosamente, los cúmulos agregados solo pudieron verse en una parte de la célula, lo que sugiere presión evolutiva contra la herencia
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de agregados, un proceso previamente descrito en E. col/(Rokney, A., M. Shagan, et al. (2009). "E. coli Transports Aggregated Proteins to the Poles by a Specific and Energy-Dependent Process." Journal of Molecular Biology 392(3): 589-601; Lindner, A. B., R. Madden, et al. (2008). "Asymmetric segregation of protein aggregates is associated with cellular aging and rejuvenation." Proceedings of the National Academy of Sciences 105(8): 30763081).
El análisis morfológico y los estudios de permeabilidad de membrana en bacterias tratadas parece sugerir que los péptidos interferidores se insertan en la membrana citoplasmática bacteriana, ocasionando una rápida despolarización de la membrana y la pérdida de su integridad. Sin quedar ligados a un mecanismo particular, este no parece ser su modo de acción bactericida, sino más bien un "efecto secundario". Los péptidos interferidores son activos únicamente en bacterias que codifican en su genoma la región p-agregante también presente en la molécula interferidora. Los interferidores son capaces de inducir la agregación de sus dianas, ocasionando la muerte celular. Por lo tanto, se baraja la hipótesis de que la combinación de la agregación de la diana intracelular y el efecto de membrana dé lugar a la rápida muerte celular de las bacterias.
2.8 Toxicidad de interferidores antibacterianos en células de mamífero
2.8.1 Ensayo de hemolisis
Para distinguir entre actividad antimicrobiana selectiva de la actividad lítica no selectiva en células eucariotas, se midieron las capacidades líticas de los péptidos interferidores más activos usando eritrocitos humanos. Tal como se muestra en la figura 14, los compuestos: C29, Hit57A, Hit 50 y Hit24 no mostraron una actividad hemolítica significativa a concentraciones clínicamente relevantes, mientras que los péptidos C30 y Hit1 tenían HD50 (concentración a la cual se lisan un 50% de los glóbulos rojos) en el intervalo de entre 25 pg/ml y 50 pg/ml. Como control positivo se usó el detergente Tween, que provoca una lisis del 100% de los RBC. Se pudo demostrar que los péptidos interferidores no muestran una hemólisis importante a sus valores de CIM (véase la tabla 4) y algunos péptidos interferidores no son siquiera hemolíticos a concentraciones tan altas como de 100 pg/ml.
2.8.2 Ensayo de Alamar Blue y ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) en células de mamífero
Las células de riñón embrionario humano (HEK293T) tratadas con diferentes concentraciones de péptido interferidor antimicrobiano C30 dieron como resultado mayores niveles de liberación de LDH cuando se comparó con el péptido interferidor Hit50. Se observó un aumento dependiente de la concentración en la LDH extracelular, lo que indica que estos péptidos causaron cierta pérdida de la integridad de la membrana plasmática. La figura 16 muestra que el péptido interferidor C30 provoca una liberación de LDH mayor del 50% cuando se usó a 50 pg/ml o mayor, mientras que el péptido interferidor hit 50 provocó una liberación de LDH de tan solo el 5% a la misma concentración (véase la tabla 4).
El ensayo de Alamar blue permitió el control del porcentaje total de recuperación del crecimiento celular con el tiempo en presencia de péptidos. Para la mayoría de los péptidos interferidores (a una concentración tan alta como 100 pg/ml) se observó que un 80-100% de las células de mamífero mostró una recuperación completa del crecimiento en 3-24 horas. La figura 17 muestra la citotoxicidad de Alamar blue en células de riñón embrionario humano (línea celular HEK293T) para dos péptidos interferidores diferentes. A pesar de la liberación de LDH provocada por las altas concentraciones de C30, puede observarse que con concentraciones menores de 100 pg/ml, la viabilidad de las células de mamífero no se ve afectada significativamente por la administración de este compuesto. Los datos indican la especificidad de los péptidos interferidores antibacterianos para bacterias, con un efecto tan solo mínimo en las células de mamífero.
2.8.3 Ensayo de invasión
En este ensayo, se cultivaron monocapas de células HCT116 (una línea celular de tumor de colon humano) en el fondo de una placa de micropocillos. Al día siguiente, se añadieron bacterias frescas de S. aureus ATCC 27853 (aproximadamente 106 UFC/ml) y se incluyó un control negativo no infectado. Después de 90 minutos de infección, se añadieron diferentes diluciones de péptido y los cultivos se incubaron durante otra hora. Como control positivo se usó gentamicina, dado que tiene una buena actividad intracelular. Cada pocillo se lavó con agua fisiológica precalentada para eliminar cualquier bacteria extracelular, seguido de tratamiento con Triton al 1% para liberar todas las bacterias atrapadas de las células de mamífero. El contenido de los pocillos se diluyó en serie y se sembró sobre placas de TSA agar para el conteo de las UFC. Los resultados de este ensayo se muestran en la figura 28.
Cabe destacar que, la concentración de péptido puede reducirse adicionalmente a tan solo 12,5 pg/ml mientras que se mantiene una actividad antibacteriana similar. Esto es interesante para evitar los efectos secundarios tóxicos que pueden surgir con altas concentraciones de los péptidos. De cualquier modo, estos resultados demuestran que los péptidos agregadores son tolerados por las células de mamífero a concentraciones relevantes para el efecto bactericida y pueden atacar de manera selectiva a S. aureus que residan en las células de tumor de colon humano (HCT-116) cultivadas (es decir, son captados por las células y muestran un efecto bactericida).
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2.9 Análisis proteómico de proteínas diana
La tecnología de agregación se basa en la suposición de que series cortas de aminoácidos, con una alta propensión a la agregación (por ejemplo, evaluada mediante la puntuación TANGO) y que proceden de una proteína diana, pueden inducir la agregación de esa proteína. Esta hipótesis se ha confirmado mediante un análisis proteómico masivo de la fracción insoluble. Si se asume que los presentes péptidos agregadores funcionan mediante la interacción específica con su diana y causa agregación, se espera que la diana entre en la fracción insoluble. Por este motivo, se decidió separar el lisado en 2 fracciones: insoluble y soluble y comparar estas con fracciones celulares no tratadas. Se asumió que las proteínas presentes en las fracciones insolubles tanto tratadas (TC30) como no tratadas (NT) presentaban un fondo de proteínas no específicas naturalmente no solubles. Además, se examinaron fracciones solubles de bacterias tanto tratadas como no tratadas y tal como se esperaba, la proteína de interés estaba presente únicamente en la fracción no tratada. Esto significa que se usaron los siguientes criterios para buscar la diana:
1) las dianas de agregación potenciales son proteínas obtenidas de la lista de proteínas en la fracción insoluble de células tratadas con C30 menos las proteínas en la fracción insoluble de células no tratadas
2) las proteínas en la fracción de células tratadas con C30 menos las proteínas en la fracción soluble de células tratadas con C30 son dianas potenciales solo si están ausentes en la fracción de NT insoluble, Y si están presentes en la fracción de NT soluble y solo cuando contiene la secuencia tanto o una parte de la misma en su secuencia de aminoácidos.
Mediante el método SOSPA (por sus siglas en inglés, análisis proteómico masivo recortado) se puede confirmar la proteína diana para cada uno de los agregadores. De este modo, se ha confirmado hasta ahora la diana para el compuesto 30 en dos cepas bacterianas diferentes: S. aureus y B. cereus. Las fracciones insolubles de ambas especies tratadas contenían la proteína predicha in silico; es decir, el regulador negativo de competencia genética ClpC/mecB que de hecho, contiene la serie Tango en su secuencia FASTA (Número de referencia de Uniprot: Q63HB8). Tal como se esperaba, la proteína diana de C30 cambió de la fracción soluble a la insoluble tras el tratamiento con el péptido.
Además, se transfirieron diferentes fracciones y se usaron estas transferencias para detectar la diana con péptidos de reconocimiento específicos. Nuevamente, se pudo confirmar la presencia de la proteína diana, ClpC/MecB (90kDa) en la fracción insoluble de Bacillus cereus tratadas con C30 (fig. 29).
En conjunto, estos resultados confirman la hipótesis de que los agregadores poseen la capacidad de interactuar con las membranas bacterianas (actividad interfacial), penetran en el citoplasma de las bacterias y si la diana tiene la región tango accesible, el agregador se une a esta, agregándola y de este modo iniciando una reacción en cadena posterior. Tal como se ha mencionado en la bibliografía, los agregados provocan reorganizaciones de lípidos y la permeabilización de la membrana. Un análisis por microscopía electrónica exhaustivo demuestra que los agregadores actúan en la membrana desde el interior de la célula y no desde el exterior. Se concluye que los agregadores actúan tanto en proteína diana citoplasmática y en la etapa tardía, en la propia membrana, ocasionando una rápida muerte celular.
Los datos obtenidos mediante SOSPA también pudieron confirmarse usando electroforesis en gel en dos dimensiones (datos no mostrados).
2.10 Estabilidad sérica de los interferidores antibacterianos y detección en suero
Para evaluar la actividad del interferidor en presencia de suero, se determinaron valores de CIM para S. aureus (como se ha descrito anteriormente) para varios péptidos interferidores antibacterianos en un medio que contenía suero bovino fetal al 50%. Tal como se esperaba, la tabla 9 demuestra que los valores de CIM fueron hasta cierto punto mayores en presencia de suero, pero de manera importante, los péptidos interferidores conservaron su actividad antimicrobiana, lo que indica un posible uso in vivo de los péptidos interferidores antibacterianos.
Tabla 9: Valores de CIM para varios interferidores antibacterianos con y sin suero al 50%.
Nombre del péptido interferidor
CIM CIM en presencia de FBS al 50%
C30
6 pg/ml 50 pg/ml
Hit1
3 pg/ml 25 pg/ml
Hit50
25 pg/ml 100 pg/ml
Hit57A
50 pg/ml 100 pg/ml
Para detectar los péptidos en suero, se usó un ensayo de transferencia por puntos. Los péptidos también se diluyeron en PBS, se transfirieron y se usaron como guía de cuantificación. Partiendo de 100 pg/ml, se transfirieron los puntos sobre una membrana de nitrocelulosa después de diluciones de factor 2 del péptido.
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Ya que el péptido se marcó con biotina, para el sondado se usó estreptavidina-HRP. Hubo una respuesta lineal, lo que sugiere que este método tiene éxito para la detección en suero en un intervalo entre 300 pg/ml y 6 pg/ml (figura 30). Para más información acerca de la detección de péptidos, véase el ejemplo 4.
2.11 Evaluación preliminar de la toxicidad in vivo de interferidores antibacterianos en ratas y ratones
Para evaluar la toxicidad de los péptidos interferidores antibacterianos in vivo, se inyectó a ocho ratas Fisher macho libres de gérmenes que pesaban aproximadamente ±350 el péptido interferidor C30 en tampón A: histidina-acetato (pH 6,5) y tampón B: tampón fosfato (pH 6,5). Se inyectó a dos ratas una concentración de 1,5mg/kg y a dos una concentración de 3mg/kg. Estas fueron inyecciones únicas no repetibles en la vena caudal. Se observó a las ratas durante varios días pero no hubo evidencias aparentes de mortalidad u otros efectos secundarios.
Además, se inyectó a tres grupos de ratones Swiss hembra de 6 semanas de edad dosis crecientes de C30 a lo largo de un periodo de 1 semana. C30 se disolvió en agua fisiológica y se administró 1 inyección al día. En los primeros 3 días se administraron inyecciones en la vena caudal (150 pl por inyección) y durante los 2 días siguientes inyecciones IP (300 pl por inyección). La dosis primaria comenzó por 3mg/kg y se aumentó la dosis gradualmente cada día. El grupo de control recibió el mismo volumen de suero salino. La dosis más alta analizada para las inyecciones IV fue de 50mg/kg y para las inyecciones IP de 100mg/kg. Los ratones a los que se inyectó por vía IV no mostraron signos de mortalidad ni cualquier otro efecto secundario visible. Sin embargo, los ratones a los que se inyectó por vía IP desarrollaron una lesión subcutánea en forma de bulto después de la dosis más alta de 100mg/kg, lo que sugiere que la solución de péptido era demasiado densa y formó agregados insolubles. Los órganos de los ratones tratados y de control se sometieron a un análisis histológico adicional. Después de administrar las 5 inyecciones, se extrajo sangre mediante punción retro-orbital y se analizó. No se observaron anomalías en la sangre.
2.12 Eficacia in vivo del compuesto C30 Animales:
Para todos los estudios, se usaron ratones Swiss NIH hembra libres de patógenos específicos de seis semanas de edad (Harlan Sprague-Dawley, Indianápolis, IN) con un peso de 21 a 24 g. Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité Ético local de Experimentos en Animales.
Modelo de muslo neutropénico de ratón de cepa MRSA 326 de S. aureus.
Se hicieron neutropénicos los ratones inyectando ciclofosfamida (Sigma) por vía intraperitoneal 4 días (150 mg/kg de peso corporal) y 1 día (100 mg/kg) antes de la infección experimental. Los estudios previos han demostrado que este régimen produce neutropenia en este modelo durante 5 días. Se cultivaron cultivos de caldo de S. aureus MRSA 326 recién sembradas durante una noche en caldo Mueller-Hinton (MHB). Después de una dilución 1:4.000 en PBS, los recuentos bacterianos del inóculo variaron entre 106 y 2 x 106 UFC/ml. Se anestesió brevemente a los ratones con isoflurano aproximadamente al 4% justo antes de la inoculación. La suspensión bacteriana (0,05 ml) se inyectó por vía intramuscular en cada muslo (aproximadamente 5x104 UFC). El tratamiento se inició 2 h después de la inoculación bacteriana por vía i.v. (intravenosa) o i.p. (intraperitoneal). En este estudio, se usaron cuatro grupos de 3 animales por grupo:
• el grupo A recibió solo tampón y se sacrificó 4 h después de la infección,
• el grupo B se trató por vía i.v. con 15mg/kg de C30 (volumen total de 150 ul) y se le sacrificó 4 horas después de la infección,
• el grupo C recibió dos inyecciones i.p. de 30mg/kg después de 2 horas y 4 horas después de la infección y se le sacrificó 6 horas después de la infección.
• al grupo D se le inyectó por vía i.v. con 15mg/kg de vancomicina y se le sacrificó 4 horas después de la inyección.
En varios puntos de tiempo después del tratamiento, se sacrificó compasivamente a grupos de tres ratones mediante asfixia con CO2. Se homogeneizó el músculo del muslo y se diluyó decimalmente en PBS helado y se sembraron alícuotas de 10 pl de cinco diluciones seriadas en sangre agar (en 3 repeticiones de dilución independientes por homogeneizado de muslo). Después de incubar durante una noche a 37°C, se numeraron las UFC para cada muslo y se expresaron como el log-10 UFC/muslo.
Tal como se muestra en la figura 31, se demostró que el compuesto C30 redujo la expansión del inóculo inicial en 6,9 log-10 UFC/ml cuando se le inyectó una dosis i.v. embolada de 15 mg/kg. En comparación, la misma dosis de vancomicina redujo el crecimiento en 8,7 Log10 UFC/ml. Una doble dosis intraperitoneal de C30 no mostró un rápido efecto en la reducción de las UFC en el muslo (lo que de hecho es de esperar dada la vía de administración). Se necesita una evaluación de dependencia de tiempo adicional de esta vía de administración. Asimismo, el experimento carece de un grupo de control de animales sacrificados a las 6 horas después de la infección. Sin embargo, teniendo en cuenta que las bacterias se expandieron hasta 4,7 log-i0 UFC/ml 4 horas después de la
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inoculación en ratones no tratados (1,7 veces) se podría argüir que a las 6 horas después de la infección, debería aumentar logarítmicamente de manera adicional la cantidad de UFC. Por este motivo, aún no debería descartarse el suministro i.p.
3. Aplicaciones antivíricas
El brote de enfermedad provocado por la gripe estacional, el brote pandémico de 2009 de H1N1 y la diseminación aumentada de virus de la gripe resistentes a fármacos (adamantanos e inhibidores de neuraminidasa) demuestran que existe una necesidad médica de nuevos fármacos que puedan inhibir muchos tipos o variantes de los virus de la gripe y sean menos sensibles a la variabilidad estacional del virus. En la actualidad, Tamiflu® de Roche y Relenza® de GSK son los fármacos prescritos con más frecuencia para el tratamiento de la gripe. Ambos fármacos actúan de manera selectiva sobre la proteína neuraminidasa. Los virus de gripe circulantes están desarrollando rápidamente resistencia contra el Tamiflu® y en la actualidad hay un número muy limitado de fármacos antigripales en desarrollo clínico.
Por lo tanto, se decidió diseñar interferidores contra regiones conservadas de proteínas de la gripe, para asegurar una amplia especificidad de diana. De manera importante, el mecanismo de acción de la tecnología de interferidores es fundamentalmente diferente al de las vacunas dirigidas contra enfermedades infecciosas y todas las demás estrategias de intervención antivíricas usadas en la actualidad, es decir, se dirige al proceso elemental del plegamiento de proteínas y por lo tanto, representa una intervención molecular completamente nueva y de presión de selección en la capacidad vírica. Además, permite la identificación de nuevas dianas víricas que hasta ahora no eran susceptibles a la inhibición. Además, ya que los interferidores antivíricos muestran un comportamiento de alta estabilidad, el suministro de los interferidores mediante pulverizadores o aerosoles intranasales o intratraqueales podría ser posible para administración local en el sitio de infección y por lo tanto, pueden revelar una ventaja adicional de los interferidores en comparación con los fármacos prescritos en la actualidad.
Para el diseño de los interferidores, se prestó especial atención a las subunidades de polimerasa vírica (PA, PB1, PB2) y en nucleoproteína (NP). Estas proteínas están altamente conservadas y la última proteína vírica se identificó recientemente como una diana para un compuesto de molécula pequeña que ejerce su efecto antivírico desencadenando la agregación de NP, aunque existen virus de la gripe que son naturalmente resistentes contra este fármaco experimental (Kao et al., Nat Biotechnol. 2010; 28(6):600-5). En resumen, los interferidores que se dirigen a estas proteínas conservadas podrían proporcionar una respuesta a la creciente resistencia de los virus de la gripe contra antivíricos disponibles en la actualidad.
En un experimento preliminar se evaluó un panel de 36 péptidos dirigidos contra diferentes proteínas del virus de la gripe A. Se cultivaron hasta la confluencia células de riñón canino Madin Darby (MDCK) y se preincubaron durante 1 hora a 37°C con interferidores en medio asérico. Después, se infectó a las células durante 16 horas con virus NIBRG-14 (una cepa de H5N1) o PR8 (una cepa de H1N1). Se seleccionaron los péptidos más prometedores para cada una de las proteínas seleccionadas para su evaluación adicional. Estos péptidos se muestran en la tabla 10.
Tabla 10. Secuencias de interferidores antivíricos seleccionados para evaluación adicional
N.° de interferidor
Secuencia del péptido interferidor Proteína diana Secuencia idéntica en la proteína diana
1
O Z RLIQLIVSRGSRLIQLIVSR (SEQ ID NO: 116) PB2 R LIQLIVS (SEQ ID NO: 120)
2
O Z RTTIM AAFRG SRTTIMAAFR (SEQ ID NO: 117) NP TTIMAAF (SEQ ID NO: 121)
3
O Z RTMAWTWRGSRTMAWTWR (SEQ ID NO: 118) PA TMAWTVV (SEQ ID NO: 122)
4
O Z RGVSILNLRGSRGVSILNLR (SEQ ID NO: 119) PB1 GVSILNL (SEQ ID NO: 123)
La O y la Z delante de la secuencia hacen referencia a un marcador óptico y a un enlazador, respectivamente. O representa 5(6)-carboxifluoresceína. El enlazador usado es el ácido N-(3-{2-[2-(3-amino-propoxi)-etoxi]-etoxi}-propil)- succinámico], en ocasiones también citado como ácido 4,7,10-trioxatridecan-succin(ám)ico o Ttds. Por lo tanto, la estructura de las moléculas corresponde a la fórmula:
Marcador - Z1-X1-Y1-X2-Z2-X3-Y2-X4, es decir, n=2, el marcador y Z1 son como se han definido anteriormente, los 4 restos X equivalen a un solo resto de R, Z2 es un enlazador GS, Y-i=Y2 y es igual a la secuencia listada en la última columna de la tabla, salvo para el interferidor 1, donde el resto Y es LIQLIVS (SEQ ID NO: 124). Para esta región de agregación, el resto constitutivo N-terminal es igual al resto flanqueante en la proteína. Todas las regiones de agregación son únicas para la proteína de gripe A a la que se dirigen.
Como experimento de seguimiento, se cultivaron células MDCK en monocapas confluentes en un formato de 24 pocillos. Los interferidores (200 mg) se disolvieron en 45 microlitros de DMSO para obtener una solución madre 2
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mM. Se añadieron 7 microlitros de la solución madre del interferidor a 400 microlitros de PBS para obtener una solución 35 micromolar. Las células se lavaron con medio asérico, tras lo cual se añadieron 250 microlitros de medio asérico fresco y 100 microlitros de interferidor. Los interferidores se diluyeron de tal forma que se aplicaron a las células a concentraciones de 1 o 10 pM. Posteriormente, las células se incubaron durante 4 horas a 37°C y CO2 al 5%. Después de 4 h de preincubación con los péptidos interferidores, se inoculó a las células con 10 unidades formadoras de placas (ufp) de virus PR8. Se retiró el inóculo y se añadió medio que contenía tripsina. Se tomaron muestras a las 0, 8, 12, 16, 24 y 36 horas para la cuantificación del virus. Como control positivo, Se trató a las células con 1 pM o 10 nM de Tamiflu. En la figura 32 se muestran los resultados de experimentos duplicados.
Tal como puede verse a partir de la figura, a 10 pM todos los péptidos inhiben la replicación del virus. A 1 pM, los interferidores 1 y 4 siguen inhibiendo de manera reproducible la replicación vírica, mientras que el efecto de los interferidores 2 y 3 es menos fuerte. Obsérvese, sin embargo, que el tamiflu tampoco inhibió completamente la replicación vírica en una situación.
También se usó un ensayo de minireplicón de gripe A más sensible para evaluar el potencial de los interferidores candidatos. Este sistema requiere la presencia de las proteínas PA, PB1, PB2 y NP funcionales. Como indicador, se usó una construcción antisentido de luciferasa de luciérnaga, que se transfectó en células de mamífero junto con plásmidos de expresión para PB1, PB2, PA y NP. La normalización para la transfección se llevó a cabo usando un indicador de luciferasa de renilla. Un experimento de control confirmó que el minirreplicón de luciferasa de luciérnaga produjo actividad de luciferasa cuando estaban presentes los 4 componentes, pero no cuando faltaba uno de ellos o cuando se cotransfectó un vector de expresión que codifica la proteína Mx1 de ratón, que confiere resistencia selectiva al virus de la gripe inhibiendo la síntesis de ARNm vírico en el núcleo de células infectadas por el virus de la gripe (fig. 33).
Usando como lectura este sistema, se pudo confirmar la actividad antivírica de las construcciones de interferidor. También se probaron variaciones de estos interferidores con diferentes restos constitutivos (R o D) y/o diferentes restos enlazadores Z2 (GS, PP o PS), al igual que interferidores con otras secuencias de agregación (véase la figura 34). Las secuencias de estas construcciones se muestran en la tabla 11.
Tabla 11. Secuencias de interferidores adicionales dirigidos contra proteínas víricas.
Interferidor
Secuencia del péptido interferidor Proteína diana Secuencia idéntica en la proteína diana
PA-1
O Z RTMAWTVVRGSRTMAWTVVR (=n.° 3 en la tabla 10) (SEQ ID NO: 118) PA TMAWTVV (SEQ ID NO: 122)
O Z RTMAWTWRPPRTMAWTWR (SEQ ID NO: 125)
O Z DTMAWTWDPPDTMAWTWD (SEQ ID NO: 126)
O Z RTMAWTWRPSRTMAWTWR (SEQ ID NO: 127)
PA-2
O Z DVHIYYLDPPDVHIYYLD (SEQ ID NO: 128) PA VHIYYL (SEQ ID NO: 164)
O Z RVHIYYLRPSRVHIYYLR (SEQ ID NO: 129)
PA-3
O Z DNLYGFIIDPPDNLYGFIID (SEQ ID NO: 130) PA NLYGFII (SEQ ID NO: 165)
O Z RNLYGFIIRPSRNLYGFIIR (SEQ ID NO: 131)
PB1-1
O Z RGVSILNLRPPRGVSILNLR (SEQ ID NO: 132) PB1 GVSILNL (SEQ ID NO: 123)
O Z DGVSILNLDPPDGVSILNLD (SEQ ID NO: 133)
O Z RGVSILNLRPSRGVSILNLR (SEQ ID NO: 134)
PB1-2
O Z RGFVYFVRPPRGFVYFVR (SEQ ID NO: 135) PB1 R GFVYFV (SEQ ID NO: 166)
O Z DGFVYFVDPPDGFVYFVD (SEQ ID NO: 136)
PB1-3
O Z RMALQLFIRPPRMALQLFIR (SEQ ID NO: 137) PB1 MALQLFI (SEQ ID NO: 167)
O Z DMALQLFIDPPDMALQLFID (SEQ ID NO: 138)
PB2-1
O Z RLIQLIVSRGSRLIQLIVSR (=n.° 1 en la tabla 10) (SEQ ID NO: 116) PB2 R LIQLIVS (SEQ ID NO: 120)
O Z RLIQLIVSRPPRLIQLIVSR (SEQ ID NO: 139)
O Z DLIQLIVSDPPDLIQLIVSD (SEQ ID NO: 140)
O Z RLIQLIVSRPSRLIQLIVSR (SEQ ID NO: 141)
PB2-2
O Z RLAVTWWNRPPRLAVTWWNR (SEQ ID NO: 142) PB2 LAVTWWN R (SEQ ID NO: 168)
Interferidor
Secuencia del péptido interferidor Proteína diana Secuencia idéntica en la proteína diana
O Z DLAVTWWNDPPDLAVTWWND (SEQ ID NO: 143)
PB2-3
O Z RQSLIIAARPPRQSUIAAR (SEQ ID NO: 144) PB2 R QSLIIAA R (SEQ ID NO: 169)
O Z DQSLIIAADPPDQSUIAAD (SEQ ID NO: 145)
PB2-4
O Z RGFLILGRPPRGFLILGR (SEQ ID NO: 146) PB2 GFLILG R (SEQ ID NO: 170)
O Z DGFLILGDPPDGFLILGD (SEQ ID NO: 147)
O Z RGFLILGRPSRGFLILGR (SEQ ID NO: 148)
PB2-5
O Z DLMVAYMLDPPDLMVAYMLD (SEQ ID NO: 149) PB2 LMVAYML (SEQ ID NO: 171)
NP-1
O Z RTTIMAAFRGSRTTIMAAFR (=n.° 2 en la tabla 10) (SEQ ID NO: 117) NP TTIMAAF (SEQ ID NO: 121)
O Z RTTIMAAFRPPRTTIMAAFR (SEQ ID NO: 150)
O Z DTTIMAAFDPPDTTIMAAFD (SEQ ID NO: 151)
O Z RTTIMAAFRPSRTTIMAAFR (SEQ ID NO: 152)
NP-2
O Z RLVWMACHRPPRLVWMACHR (SEQ ID NO: 153) NP LVWMACH (SEQ ID NO: 172)
O Z DLVWMACHDPPDLVWMACHD (SEQ ID NO: 154)
O Z RLVWMACHRPSRLVWMACHR (SEQ ID NO: 155)
M1-A
O Z RVAFGLVCRPPRVAFGLVCR (SEQ ID NO: 156) M1 VAFGLVC (SEQ ID NO: 173)
O Z DVAFGLVCDPPDVAFGLVCD (SEQ ID NO: 157)
O Z RVAFGLVCRPSRVAFGLVCR (SEQ ID NO: 158)
M1-B
O Z RLGFVFTLRPPRLGFVFTLR (SEQ ID NO: 159) M1 LGFVFTL (SEQ ID NO: 174)
O Z DLGFVFTLDPPDLGFVFTLD (SEQ ID NO: 160)
O Z RLGFVFTLRPSRLGFVFTLR (SEQ ID NO: 161)
NS1-C
O Z RAVGVLIGRPPRAVGVLIGR (SEQ ID NO: 162) NS1 AVGVLIG (SEQ ID NO: 67)
O Z DAVGVLIGDPPDAVGVLIGD (SEQ ID NO: 66)
O Z RAVGVLIGRPSRAVGVLIGR (SEQ ID NO: 163)
O y Z son marcadores y enlazadores idénticos a los especificados para la tabla 10 anterior.
Como control, también se probaron interferidores diseñados contra proteínas víricas internas (M1 y NS1) que no estaban implicadas en el ensayo de minirreplicón y estos, de hecho, no mostraron reducción en la actividad de luciferasa (fig. 35). El diseño de estos interferidores irrelevantes es idéntico al de los 4 interferidores contra las 5 proteínas polimerasas y contra NP, con restos constitutivos y enlazadores Z2 (es decir, enlazadores internos, la fórmula en este caso es Z1-X1-Y1-X2-Z2-X3-Y2-X4) tal como se indica en la figura. En la tabla 11 también se muestran la secuencia agregante y secuencias peptídicas para péptidos contra la proteína de matriz 1 y la proteína no estructural 1.
10 Por lo tanto, los péptidos interferidores pueden diseñarse contra cada una de las proteínas polimerasas del virus de la gripe, así como contra nucleoproteínas. Estos interferidores tienen éxito en reducir la replicación del ARN de la gripe, un efecto que es específico y dependiente de la regulación a la baja de la diana, ya que los interferidores contra dianas no relevantes no dieron como resultado la consecución de la regulación a la baja.
15 4. Detección y diagnóstico
4.1 Detección de B-galactosidasa (B-gal) con interferidores específicos
4.1.1 Diseño y síntesis de péptidos interferidores específicos
Los segmentos de agregación-nucleación de la diana que iba a detectarse, es decir, p-galactosidasa, se detectaron usando el algoritmo Tango, un algoritmo estadístico-mecánico para predecir regiones propensas a la p-agregación
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en proteínas basándose en tres parámetros fisicoquímicos, a saber, baja carga neta, alta hidrofobia y propensión a formar p-láminas. Posteriormente, estas se verificaron respecto de los requisitos para los restos Yi indicados en la solicitud, para asegurarse de que estas secuencias poseen una alta propensión a la agregación. Tango compara la propensión de una secuencia de aminoácidos dada contra un conjunto de secuencias similares a formar diversos elementos estructurales secundarios y asigna una puntuación (0-100) proporcional a su capacidad para formar agregados de p-lámina. Se considera que una serie de secuencia con una puntuación total <5 tiene una baja propensión a la agregación y aquellas con > 50 como fuertemente agregantes. A partir de la secuencia de proteína de p-gal (representada en la SEQ ID NO: 3, sin el resto iniciador de M), se seleccionaron dos series de secuencias de aminoácidos con una puntuación total de tango >50, es decir, los restos 7 a 12 en la SEQ ID NO: 3 (LAVVLQ (SEQ ID NO: 75, Tango 1) y los restos 453 a 460 en la SEQ ID NO: 3 (VIIWSLGN (SEQ ID NO: 76), Tango 2) y se sintetizó una colección de péptidos de alta pureza (>95%) que comprendían la secuencia de tipo silvestre flanqueada por uno o más restos constitutivos (Arg, Lys, Asp, Glu y Pro) mediante síntesis en fase sólida. Como control negativo, se seleccionó una serie de secuencia que comprende los restos 106 a 113 de la SEQ ID NO: 3 que muestra una puntuación total de Tango < 5 para establecer la baja propensión a la agregación de este segmento, tal como se predijo mediante el algoritmo Tango. Además, se sintetizaron tres versiones de interferidor mutantes que comprendían VIIWSLGN (SEQ ID NO: 76) (región Tango 2). Las secuencias de los 6 péptidos interferidores (que comprenden las regiones Tango identificadas, que comprenden la secuencia de control negativo o que comprenden la región 2 de Tango variante (o mutada)) se representan en la tabla 12. El extremo C-terminal de estos 6 péptidos se acetilaron y marcaron con marcador de biotina o polihistidina (His)6 en el extremo N-terminal para su detección por transferencia de Western (WB) y su selección in vitro, respectivamente (véase el ejemplo 2).
SEQ ID NO: 3, secuencia de aminoácidos de p-galactosidasa. Las regiones de Tango identificadas se representan en negrita
1TMITDSLAV VLQRRDWENP GVTQLNRLAA HPPFASWRNS EEARTDRPSQ QLRSLNGEWR 60 FAWFPAPEAV PESWLECDLP DADTVVVPSN WQMHGYDAPI YTNVTYPITV NPPFVPAENP 120 TGCYSLTFNI DESWLQ.EGQ.T RIIFDGVNSA FHLWCNGRWV GYGQDSRLPS EFDLSAFLRA
180 GENRLAVMVL RWSDGSYLED QDMWRMSGIF RDVSLLHKPT TQISDFQVTT LFNDDFSRAV 240 LEAEVQMYGE LRDELRVTVS LWQGETQVAS GTAPFGGEII DERGGYADRV TLRLNVENPE 300 LWSAEIPNLY RAVVELHTAD GTLIEAEACD VGFREVRIEN GLLLLNGKPL URGVNRHEH 360 HPLHGQ.VMDE QTMVQDILLM KQNNFNAVRC SHYPNHPLWY TLCDRYGLYV VDEANIETHG 420 MVPMNRLTDD PRWLPAMSER VTRMVQRDRN HPSVIIWSLG NESGHGANHD ALYRWIKSVD 480 PSRPVQYEGG GADTTATDII CPMYARVDED QPFPAVPKWS IKKWLSLPGE MRPULCEYA 540 HAMGNSLGGF AKYWQAFRQY PRLQGGFVWD WVDQSLIKYD ENGNPWSAYG GDFGDTPNDR 600 QFCMNGLVFA DRTPHPALTE AKHQQQYFQF RLSGRTIEVT SEYLFRHSDN EFLHWMVALD 660 GKPLASGEVP LDVGPQGKQL IELPELPQPE SAGQLWLTVR VVQPNATAWS EAGHISAWQQ 720 WRLAENLSVT LPSASHAIPQ LTTSGTDFCI ELGNKRWQFN RQSGFLSQ.MW IGDEKQLLTP 780 LRDQFTRAPL DNDIGVSEAT RIDPNAWVER WKAAGHYQAE AALLQCTADT LADAVUTTA 840 HAWQHQGKTL FISRKTYRID GHGEMVINVD VAVASDTPHP ARIGLTCQLA QVSERVNWLG 900 LGPQENYPDR LTAACFDRWD LPLSDMYTPY VFPSENGLRC GTRELNYGPH QWRGDFQFNI 960 SRYSQ.QQLME TSHRHLLHAE EGTWLNIDGF HMGIGGDDSW SPSVSAEFQL SAGRYHYQLV 1020 WCQK
Tabla 12: Lista de los 6 péptidos interferidores diferentes usados para la detección de p-Gal en lisado celular _________________________________completo de E. coli BL21.__________________________________
Péptidos interferidores
Secuencia de interferido^ Secuencia de tipo silvestreA
Tango 1
b~ RLAVVLQR (SEQ ID NO: 44) DSLAVVLQRR (SEQ ID NO: 50)
Tango 2
b~ RVIIWSLGNR (SEQ ID NO: 45) PSVIIWSLGNES (SEQ ID NO: 51)
Fuera de la diana
b~ RPITVNPPFR (SEQ ID NO: 46) TYPITVNPPFVP (SEQ ID NO: 52)
Tango 2 Mut_1
b~ RVPIWSLGNR (SEQ ID NO: 47) PSVIIWSLGNES (SEQ ID NO: 51)
Tango 2 Mut_2
b~ RVIPWSLGNR (SEQ ID NO: 48) PSVIIWSLGNES (SEQ ID NO: 51)
Tango 2 Mut_3
b~ RVIPESLGNR (SEQ ID NO: 49) PSVIIWSLGNES (SEQ ID NO: 51)
# La anotación b~ tal como se usa en el presente documento, indica que el péptido está biotinilado en N- terminal y fusionado a un enlazador. p Las secuencias de tipo silvestre se muestran con sus restos flanqueantes naturales.
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Los nombres de los interferidores, tal como se usan en la explicación de los ejemplos siguientes, se representan en la columna 1, las secuencias se representan en la columna 2. En estas moléculas interferidoras, n es 1, Xi y X2 son restos de R, Y1 es una serie de 6 ("Tango 1") u 8 ("Tango 2") restos de la proteína diana, Z. es un enlazador de aminoácidos N-terminal APAA (SEQ ID NO: 77) y las moléculas están fusionadas a un marcador detectable - en este 10 caso, biotina (b). Para experimentos adicionales, también se han usado otros enlazadores, tales como Ttds y PEG, así como diferentes marcadores, tales como marcador de HA (YPYDVPDYA (SEQ ID NO: 108)), marcador Flag (DYKDDDDK (SEQ ID NO: 106)) y marcador His (polihistidina) - se muestran experimentos representativos. Los péptidos mutantes comprenden una región Y1 con 1 o 2 sustituciones no conservativas en relación con la secuencia de la proteína diana, p-gal.
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En la figura 36 se muestra una descripción esquemática del método de detección general de proteínas mediante el uso de interferidores, al que en lo sucesivo se hace referencia como PepBlot.
4.1.2. Detección de p-galactosidasa mediante transferencia de Western y análisis PepBlot con interferidores específicos para p-galactosidasa
La p-galactosidasa se expresó en primer lugar en E. coli. Para esto, se cultivaron células E. coli BL21 con la construcción de expresión pBad_pgal_WT (vector pBad obtenido de Invitrogen) en medio LB a 37°C. Cuando el cultivo alcanzó una DO600 nm ~0,6, se indujeron las células con arabinosa al 0,2% y se las dejó crecer durante una noche a 37°C. En paralelo, se cultivaron células BL21 que no expresaban p-gal para experimentos de control y valoración.
Se centrifugó una suspensión de 0,4 ml de células BL21 (DO600nm ~1,2) que expresaban p-Gal (cultivadas en condiciones inducidas) a 5000 g durante 10 min a temperatura ambiente. Se desechó el sobrenadante y se añadieron 0,8 ml de reactivo de extracción de proteínas bacterianas (B-PER, Thermo Scientific) que contenía inhibidor de proteasa al sedimento bacteriano y se mezcló vorticialmente durante 30 s para lisar las células. A 21 pl del lisado completo de células BL21 se le añadieron 5 pl de tampón de carga de muestra de 5x SDS (Fermentas) y se calentó a 99°C durante 3 min. Esta mezcla (26 pl por pocillo) se cargó en un gel de 10 pocillos NuPage con Bis- Tris al 4-12% y las proteínas se separaron en condiciones desnaturalizantes. Las proteínas separadas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se bloquearon durante una noche con BSA al 1% en suero salino tamponado con fosfato, Tween 20 al 0,05%, pH 7,4 (PBS-T) a 4°C. Cada carril de la membrana se cortó y se incubó por separado con anticuerpo de conejo anti-p-Gal, Tango 1 biotinilado, Tango 2 biotinilado o el péptido fuera de la diana biotinilado o un péptido Tango 2 mutante biotinilado.
El procedimiento seguido para la detección por transferencia de Western (WB) de p-gal con anticuerpo anti-p-Gal fue el siguiente. Se cortó el primer carril de la membrana y se incubó con anticuerpo policlonal de conejo anti-p-Gal (dilución 1:1000) durante 1 h con agitación suave en PBS-T. Esto fue seguido por lavados de 3x 10 min con PBS-T. Después del lavado final, se incubó la membrana con anticuerpo policlonal de cabra anti-conejo conjugado a peroxidasa de rábano picante (HRP, dilución 1:5000) durante 1 h en PBS-T. Después, se lavó este carril de la membrana con PBS-T 3x 10 min y finalmente se enjuagó en agua desionizada durante 10 min. El carril de la membrana se expuso a reactivo de sustrato de HRP de quimioluminiscencia (Sustrato de máxima sensibilidad SuperSignal West Femto, Thermo Fischer Scientific) y la proteína diana se visualizó usando el sistema de obtención de imágenes Chemi-Doc XRS de Bio-Rad (véase la figura 37, carril 1).
El procedimiento para la detección PepBlot (es decir, un protocolo similar a la transferencia de Western, pero con interferidores en lugar de anticuerpo como agente de detección) de p-gal con péptidos interferidores biotinilados fue del siguiente modo. Se preparó una solución madre (10 pM) de cada uno de los péptidos biotinilados (Tango 1, Tango 2, fuera de la diana y mutantes de tango 2 (véase la tabla 12) en DMSO al 100%. La solución madre del péptido se diluyó (1/40) en tampón MES 10 mM, Trehalosa 100 mM, Tween 20 al 0,02%, pH 5,5 para obtener una concentración final del péptido de 250 nM. La solución de péptido recién preparada se añadió inmediatamente a la tira de membrana y se agitó suavemente a temperatura ambiente. Después de 1 h, se decantó la solución de péptido y la tira de membrana se lavó 4x 10 min con tampón MES 10 mM, Tween 20 al 0,05%, pH 5,5. Después, se incubó la tira de membrana con reactivo de afinidad de biotina (dilución 1:100.000) de estreptavidina (SRP) conjugada a HRP en PBS-T durante 1 h a temperatura ambiente. Esto fue seguido de un lavado de 3x 10 min con PBS-T y finalmente se enjuagó en agua desionizada durante 10 min. La tira de membrana se expuso a reactivo de sustrato de HRP de quimioluminiscencia (Sustrato de máxima sensibilidad SuperSignal West Femto, Thermo Fisher Scientific) y la proteína diana se visualizó usando el sistema de obtención de imágenes Bio-Rad ChemiDoc XRS.
4.1.2.1 Selectividad de los diferentes interferidores usados
En la figura 37 se muestra una comparación de la detección por WB de p-gal procedentes de lisados celulares bacterianos completos usando anticuerpo policlonal de conejo anti-p-Gal y también la detección usando PepBlot con tres interferidores diferentes: Péptido Tango 1 (6~RLAWLqR (SEQ ID nO:44)) y péptido Tango 2 (b~RVIlWSLGNR (SEQ ID NO: 45)) y un péptido fuera de la diana (b~RPITVNPPFR (SEQ ID NO: 46)). Asimismo, en este caso, se usó biotina como marcador y APAA (SEQ ID NO: 77) como enlazador de aminoácidos. Se observó (véase la figura 37) que los interferidores Tango 1 y Tango 2 se unen a p-gal con alta especificidad. Aunque se ha predicho que el péptido Tango 1 muestra la mayor propensión a agregarse con p-gal, muestra una unión más débil (véase el carril 2) que el péptido interferidor Tango 2. Sin quedar ligados a un mecanismo de acción particular, una explicación es que el péptido Tango 1 interactúa de manera menos eficaz con el extremo N-terminal de la p-gal debido a que este extremo N-terminal se encuentra menos disponible en el estado inmovilizado de p-gal sobre la tira de membrana. Esta explicación no limitante está apoyada además por el hecho de que la adición del mismo péptido interferidor (es decir, el péptido Tango 1) a p-gal libre in vitro da como resultado una cinética de agregación más rápida en comparación con el péptido Tango 2 (véase más adelante). la figura 37 muestra claramente que el péptido Tango 2 presenta una fuerte afinidad por la p-Gal con una señal comparable a la detección con un anticuerpo específico para p-gal (compárense el carril 1 y el carril 3). Aunque el péptido interferidor fuera de la diana está poblado por aminoácidos hidrofóbicos, la presencia de más de un resto de P rompedor de p-lámina en el centro de la secuencia
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detiene de manera eficaz la p-agregación. La banda en el carril 4 en la posición de ~20 kDa no es un efecto de la reactividad cruzada del péptido sino causada por la unión no específica de estreptavidina (SRP) en ausencia (o baja disponibilidad) de biotina. Los experimentos descritos en las siguientes secciones estarán basados principalmente en la secuencia de Tango 2.
4.1.2.2 Especificidad de la unión de sondas interferidoras
Para evaluar la especificidad de la interacción del péptido interferidor Tango 2 con p-gal, se llevaron a cabo experimentos de detección usando péptidos adicionales. En primer lugar, se sondó la p-Gal con un péptido de p-Gal no agregante pero hidrofóbico (P106ITVNPPF113) y no se observó interacción con el péptido sonda correspondiente 6~RPITVNPpFr (SEQ ID NO: 46) con la p-Gal (véase lo anterior, Fig. 37, carril 4). En segundo lugar, se emplearon cuatro péptidos sonda cuyas secuencias corresponden a regiones de agregación identificadas usando TANGO en proteínas bacterianas y humanas no relacionadas. Esto se efectuó usando péptidos marcados con biotina procedentes del inhibidor B de cinasa 4 dependiente de ciclina humano (secuencia b~FLDTLWLHRA (SEQ ID NO: 175)), el antígeno específico de próstata (PSA, secuencia b~RQWvLTAAR (SEQ ID NO: 85)) y prolina deshidrogenasa (PD, b~RFFIALSR (SEQ ID NO: 176)) y ClpB ATPasa (b~RILLGUR (SEQ ID NO: 177)), ambos tomados de Staphylococcus epidermidis. El diseño de estas tres últimas sondas corresponde a moléculas con n=1, X1=X2= un resto de Arg, con la secuencia Y1 entre medias. En la primera sonda, FLD y RA son secuencias flanqueantes naturales del resto TLVVLH (SEQ ID NO: 178) que corresponde a Y1. En estas secuencias flanqueantes, D corresponde al resto constitutivo X1, R al resto constitutivo X2.
Todos estos péptidos fracasaron a la hora de proporcionar una tinción específica de la banda correspondiente a p- Gal (datos no mostrados), lo que demuestra que es necesaria la propensión a la agregación pero no es suficiente para una interacción específica. Finalmente, para probar si las regiones con alta puntuación de Tango toleraban la sustitución con otros restos y mantener sus propiedades, se generaron mutantes. En el primer caso, el resto de "I" se reemplazó por el resto de "P" rompedor de la p-lámina y se generaron 2 péptidos mutantes diferentes con un cambio de "I" a "P" (véase la tabla 12 para las secuencias específicas). Además, se usó el efecto de un péptido doble mutante que reemplaza "IW" por "PE" para estudiar la influencia del resto constitutivo cargado en la propensión a la p-agregación. Se espera que se suprima la agregación mediante la introducción de una carga repulsiva. El análisis PepBlot de los dos péptidos mutantes en un solo punto (b~RVPIWSLGNR (SEQ ID NO: 47) y b~RVIPWSLGNR (SEQ ID NO: 48)) ilustrado en la figura 38 muestra que estos péptidos mutantes siguen uniéndose de manera eficaz a p-Gal. Sin embargo, es evidente que mediante la introducción de sustituciones puede observarse unión fuera de la diana. Esto no es ilógico, ya que el resto de la serie inductora de la agregación corta no es único para la proteína p-Gal en E. coli. Además, la introducción adicional de un resto cargado da lugar a una pérdida prácticamente completa de la interacción. Esto demuestra la alta especificidad de secuencia de la unión de la sonda, ya que es suficiente una sola mutación puntual para suprimir la especificidad de unión, mientras que es suficiente la supresión de la propensión a la agregación para anular totalmente la unión, a pesar de su 80% de identidad de secuencia. Estos datos confirman la hipótesis de que la propensión a la agregación y la coincidencia de secuencia sean requisitos previos para la especificidad de la interacción mediada por péptidos y concuerdan con un estudio reciente (Sabate, R., et al. J. Mol. Biol. 404: 337-352, 2010) que demuestra que las versiones desordenadas o invertidas del polipéptido amiloide de islote no forma una siembra cruzada entre sí con la secuencia de tipo silvestre, lo que confirma la dependencia de la posición más allá de la composición de secuencia.
4.1.2.3 Cinética de los interferidores en la unión
Para estudiar la cinética del péptido interferidor Tango 2 a p-Gal (es decir, el tiempo de contacto entre el interferidor y la diana) en lisado celular completo de BL21, se incubó el péptido con la membrana desde 30 s hasta 1 h. Se retiró la membrana del tampón de incubación a intervalos de tiempo selectivos y se procesó adicionalmente como se ha descrito anteriormente.
La figura 39 ilustra que la detección de p-Gal a partir de lisado celular bacteriano completo de BL21 puede lograrse en un breve espacio de tiempo (tan bajo como 30 segundos) de incubación con el péptido.
4.1.2.4 Sensibilidad del método de detección PepBlot basado en el uso de interferidores
Se determinó la sensibilidad del péptido interferidor basándose en la detección PepBlot. Para esto, se añadió p-Gal en el intervalo de concentración de 0,1 pmol (11,6 ng) a 10 pmol (1160 ng) a un lisado celular completo de BL21 no inducido (DO600 nm ~0,6). A 21 |jl del lisado completo de células BL21 se le añadieron 5 jl de tampón de carga 5x SDS (Fermentas) y se calentó a 99°C durante 3 min. Se cargaron 26 jl de esta mezcla que contenía diferentes concentraciones de p-Gal en un gel de 10 pocillos NuPage con Bis-Tris al 4-12% y las proteínas se separaron en condiciones desnaturalizantes. Posteriormente, las proteínas separadas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se bloquearon durante una noche con BSA al 1% en PBS-T a 4°C. Las incubaciones y el manejo con los interferidores fueron como se ha descrito anteriormente en el presente documento. La figura 40 muestra el resultado de este experimento. A partir de estos datos, resulta evidente que pueden detectarse cantidades subpicomolares de p-Gal (tan bajas como 58 ng) (véase la detección de p-Gal en el carril 2 de la figura 40A), lo que es comparable al límite de detección de un anticuerpo. Además, la señal obtenida también es comparable a la
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detección con anticuerpo anti-p-Gal (figura 41).
4.1.2.5 Especificidad de la detección PepBlot
Para determinar la influencia de los restos constitutivos en la especificidad de la detección PepBlot, se generaron péptidos interferidores contra la proteína diana p-gal con la secuencia Tango central "VNWSLGN" (SEQ ID NO: 76). Para esto, se generaron 3 péptidos interferidores: 1) Sin resto constitutivo, con la secuencia VIIWSLGN (SEQ ID NO: 76) unida a un marcador Flag (DYKDDDDK (SEQ ID NO: 106)) en el extremo C-terminal mediante el enlazador de aminoácidos GSGS (VIIWSLGNGSGSDYKDDDDK (SEQ ID NO: 179)). 2) secuencia Tango flanqueada por restos constitutivos naturales (RDRNHPSVIIWSLGNESgHg (SEQ ID nO: 180)). 3) Restos constitutivos cargados complementarios con los restos "D" y "R" posicionados para complementar a los restos polares "S" y "E" (DVIIWSLGNR (SEQ ID NO: 181)). Los primeros dos péptidos cumplen con las definiciones de péptidos interferidores proporcionadas en el documento WO2007/071789, mientras que el tercer péptido es una molécula interferidora de acuerdo con la definición estructural proporcionada en el presente documento. Todos los péptidos listados en la tabla 13 se biotinilaron por partida doble (tanto en el extremo N-terminal como en el C-terminal) y se unieron a los péptidos interferidores mediante un enlazador de Ttds.
Tabla 13: Lista de los 3 péptidos interferidores diferentes usados para estudiar la influencia de los restos constitutivos en la especificidad de la detección de p-gal en una plataforma de PepBlot competitiva.
Péptidos interferidores
Secuencias de interferidor p Secuencia natural
Sin resto constitutivo
£>~VIIWSLGNGSGSDYKDDDDK~£i (SEQ ID NO: 179) rdrnhpsviiwslgnesghg
Flancos naturales
£>~RDRNHPSVIIWSLGNESGHG~£i (SEQ ID NO: 180)
Carga complementaria
¿>~DVIIWSLGNR~£i (SEQ ID NO: 181)
^Los péptidos interferidores se unieron a biotina tanto en el extremo C-terminal (indicado por ~b) como en el extremo N-terminal (b~) con el enlazador Ttds. Obsérvese que la secuencia Tango está subrayada en cada péptido.
Se probó el rendimiento de los péptidos para unirse a p-gal en una plataforma PepBlot competitiva, donde se tomó suero clínico al 7% en un carril y p-gal en lisado completo de E. coli en el otro carril. Se preparó una solución madre (10 |jM) de cada uno de los péptidos biotinilados en DMSO al 100%. La solución madre del péptido se diluyó (1/400) en tampón MES 10 mM, Trehalosa 100 mM, Tween 20 al 0,05%, pH 5,5 para obtener una concentración final del péptido de 25 nM. La solución de péptido recién preparada se añadió inmediatamente a la tira de membrana y se agitó suavemente a temperatura ambiente. Después de 15 min, se decantó la solución de péptido y la tira de membrana se lavó 3x 10 min con tampón MES 10 mM, Tween 20 al 0,05%, pH 5,5 y se procesó adicionalmente tal como se ha descrito anteriormente en el presente documento.
La figura 42 muestra la influencia de los restos constitutivos en la especificidad del péptido interferidor basándose en la detección PepBlot. Los tres péptidos se unen a p-gal, pero por mucho, la mejor sonda fue el péptido interferidor con restos constitutivos cargados complementarios. Este péptido muestra una fuerte interacción con p-gal en comparación con los otros dos péptidos y no reacciona de manera cruzada con proteínas en el suero. La complementación de la carga, junto con la propensión a formar p-láminas de la secuencia de Tango contribuye a una asociación intermolecular favorable que parece ser altamente específica. Por otro lado, el péptido con los flancos naturales presenta una baja especificidad, lo que es evidente por las bandas específicas en el suero clínico. Los datos sugieren que no son absolutamente necesarios los restos constitutivos para la interacción del péptido interferidor con la proteína diana - tal como se mostró también en el documento WO2007/071789. Sin embargo, puede refinarse la detección para lograr una alta especificidad, diseñando péptidos con restos flanqueantes complementarios que pueden incluir aminoácidos polares tales como R, D, E, K, H y el rompedor de p-láminas, P.
4.2. Interacciones de interferidor-diana estudiadas con resonancia de plasmón superficial
En este experimento in vitro, se midió la afinidad de diferentes péptidos interferidores por la unión a p-gal mediante resonancia de plasmón superficial (SPR). Los experimentos de SpR se llevaron a cabo a 25°C usando un dispositivo Biacore T100 equipado con una placa sensora CM5 (GE Healthcare). Los reactivos de acoplamiento (N-etil-N'-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC), N-hidroxisuccinimida (NHS) y etanolamina-HCI) se adquirieron de GE Healthcare. La BSA y la p-gal se adquirieron de Sigma-Aldrich y Roche Diagnostics, respectivamente. Los péptidos se sintetizaron en JPT, GmbH y tenían una pureza >95%. Las proteínas, BSA y p-gal se inmovilizaron, respectivamente, en los canales de referencia y de muestra sobre una placa sensora CM5 mediante química de acoplamiento de amina convencional a un caudal de 10 jl min-1. La superficie de carboximetil dextrano se activó mediante la inyección de EDC y NHS a una relación 1:1 durante 7 minutos. Las proteínas se diluyeron en tampón de acetato de sodio 10 mM, pH 4,5 a una concentración final de 0,2 mg ml-1 y se inyectaron en pulsos cortos sobre la superficie activada hasta que los niveles de inmovilización alcanzaron 4000 uR u 8000 uR, para BSA y p-Gal, respectivamente. Los grupos reactivos restantes se bloquearon con etanolamina 1 M, pH 8. Tras completar el
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acoplamiento, se regeneró la superficie con pulsos breves de NaOH 50 mM y urea 8 M para eliminar las proteínas no unidas covalentemente. Los niveles de inmovilización tras la regeneración fueron normalmente de entre 3500 UR a 4000 UR en los canales tanto de referencia como de muestra. La afinidad de varios interferidores (véase la tabla 14 para las secuencias de los interferidores): Tango zona 1, Tango zona 2, fuera de la diana, mutantes de Tango zona 2 y la repetición en tándem de Tango zona 2 por la unión a p-Gal se investigó inyectando los péptidos marcados con hexahistidina a lo largo de las superficies de referencia (BSA) y de muestra (p-Gal) a 25°C. Los péptidos, disueltos en el tampón de ejecución (fosfato de sodio 10 mM, pH 6,8, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM y Tween 20 al 0,015%) a una concentración de 1 pM, se inyectaron durante 60 s a un caudal de 30 pl min-1 y después se dejaron disociar durante 600 s. La inyección se repitió sobre la misma superficie así como en superficies inmovilizadas de manera independiente. La superficie se regeneró entre cada ciclo mediante pulsos de 30 s de i) NaOH 50 mM y ii) urea 8 M y se dejó estabilizar durante 400 s antes del ciclo siguiente.
Tabla 14: Secuencias de los diferentes péptidos interferidores usados en el análisis de SPR y cinética de agregación
in vitro.
Péptidos interferidores
Secuencias# Secuencia de tipo silvestre^
Tango 1
(His)6~RLAVVLQR (SEQ ID NO: 53) DSLAVVLQRR (SEQ ID NO: 50)
Tango 2
(His)6~RVIIWSLGNR (SEQ ID NO: 54) PSVIIWSLGNES (SEQ ID NO: 51)
Fuera de la diana
(His)6~RPITVNPPFR (SEQ ID NO: 55) TYPITVNPPFVP (SEQ ID NO: 52)
Tango 2 Mut_1
(His)6~RVPIWSLGNR (SEQ ID NO: 56) PSVIIWSLGNES (SEQ ID NO: 51)
Tango 2 Mut_2
(His)6~RVIPWSLGNR (SEQ ID NO: 57) PSVIIWSLGNES (SEQ ID NO: 51)
Tango 2 Mut_3
(His)6~RVIPESLGNR (SEQ ID NO: 58) PSVIIWSLGNES (SEQ ID NO: 51)
Tándem de Tango 2
(His)6~RVIIWSLGNRGSGSAPAARVIIWSLGNR (SEQ ID NO: 59) PSVIIWSLGNES (SEQ ID NO: 51)
# Los péptidos se unen al marcador de His con un enlazador de aminoácidos adicional "APAA" (SEQ ID NO: 77) en el extremo N-terminal. ® Las secuencias de tipo silvestre se muestran con sus restos flanqueantes naturales.
Se investigó la cinética de co-agregación de p-gal y el péptido Tango 2 (HHHHHHAPAARVIIWSLGNR (SEQ ID NO: 54)) a 25°C. El péptido se disolvió en el tampón de ejecución y se inyectó durante 60 s a un caudal de 30 pl min"1 sobre las superficies de referencia (BSA) y de muestra (p-Gal) a un intervalo de concentraciones (0 - 4 pM, con un replicado interno) y se dejaron disociar durante 600 s. Las series de concentración se repitieron sobre la misma superficie (tres veces) así como en superficies inmovilizadas de manera independiente. La superficie se regeneró entre cada ciclo mediante pulsos de 30 s de i) NaOH 50 mM y ii) urea 8 M y se dejó estabilizar durante 400 s antes del ciclo siguiente.
A todos los sensogramas se les restó la referencia por partida doble (Myszka, D.G., et al. J. Mol. Recognit. 12: 279284, 1999) mediante i) resta de la respuesta observada sobre la superficie de referencia e ii) resta de las respuestas observadas para las inyecciones de tampón, esta última para eliminar los falsos positivos sistemáticos. Los datos se ajustaron globalmente a un modelo de tres estados, usando el programa informático del Biacore T100, asumiendo un encuentro inicial entre el péptido en solución y la proteína sobre la placa seguido de una reorganización en dos etapas antes de que se vuelva disponible un sitio de unión idéntico en la p-lámina en crecimiento.
Se muestra una complicación de los datos a partir del análisis de SPR en las figuras 43 a 46.
La proteína p-gal se inmovilizó sobre la placa sensora mediante acoplamiento de amina, lo que puede impedir la accesibilidad de Tango zona 1 (restos 7 a 12) próximos al extremo N-terminal. Es probable que la débil afinidad de unión del péptido 1 de Tango con p-gal observada en la SPR se deba a la restricción impuesta por la proteína en el estado inmovilizado para interactuar con el péptido. Sin embargo, in vitro, el péptido Tango 1 muestra una mayor afinidad por p-gal libre en solución en comparación con el péptido Tango 2 que es acorde con la predicción del algoritmo Tango.
El sensograma que representa el cambio en las unidades de respuesta (UR) del instrumento en función de la concentración del analito (péptido Tango 2) se muestra en la figura 45. Las URmáx. para una estequiometría 1:1 es ~80 UR, sin embargo, los presentes datos superan este valor y no se logra estabilidad incluso a concentraciones mayores y un tiempo de contacto prolongado (>10 min). Esto se debe a que después de que se haya unido el péptido a p-gal, se crea un nuevo sitio de unión que permite el crecimiento del agregado sobre la superficie de la placa sensora. Para modelar el crecimiento del agregado, se observó que era inadecuada una cinética en 1 estado o en 2 estados. Los datos cinéticos se representan mejor usando un proceso en múltiples etapas que implica un
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modelo en 3 estados. De acuerdo con este modelo, el péptido se acopla de manera reversible a la diana, seguido del cambio de conformación que se bloquea en posición para recibir un péptido posterior, que se une al primer péptido y bloquea el sitio de unión. Se ha informado anteriormente que este modelo describe la elongación de la fibrilla de amiloide sobre la microplaca de SPR. La ka y kd para el mecanismo en 3 etapas fueron: ka1 = 2,744E+4, ka2 = 0,02359, ka3 = 0,005491 y kd1 = 0,4123, kd2 = 0,02509 kd3 = 0,002654. Debido a la complejidad del modelo, no fue posible calcular la constante de asociación en equilibrio Ka y la constante de disociación en equilibrio Kd. La cinética se vuelve incluso más compleja en caso de usar como analito el péptido de repetición en tándem (n=2 y ambos restos Y son idénticos) (véase la figura 46). En esta molécula, todos los restos X son un solo resto de R y el enlazador Z1 es GSGsApAA (SEQ ID NO: 90) (véase la tabla 14).
4.3 Determinación de la cinética de agregación in vitro
La coagregación del péptido Tango 1, el péptido Tango 2 y el péptido de repetición en tándem de Tango 2 con p-Gal in vitro se controló mediante dispersión de luz a partir del cambio aparente en la densidad óptica (DO) a 340 nm debido al crecimiento de partículas de agregado a temperatura ambiente. La coagregación de interferidor-p-Gal se inició añadiendo una concentración equimolar (10 jM) de péptido Tango 1, péptido Tango 2, péptido de repetición en tándem de Tango 2 y p-Gal en tampón de fosfato de sodio 20 mM, pH 6,8 seguido de agitación suave de la muestra a 50 rpm. La secuencia de los interferidores se representa en la tabla 14.
Para caracterizar el tamaño de los agregados, se midió el radio hidrodinámico (RH) de p-Gal en tiempo cero y después de la incubación conjunta con péptido Tango 1, péptido Tango 2, péptido de repetición en tándem de Tango 2 (tabla 14) durante 2 h usando dispersión de luz dinámica (DLS), DynaPro DLS (Wyatt Technology Europe, Alemania).
La figura 47 muestra que el péptido Tango 1 con mayor puntuación muestra una cinética de co-agregación más rápida con la p-Gal en solución en comparación con el péptido Tango 2 in vitro. Cuando se añadió un péptido de repetición en tándem de Tango 2 a la p-Gal, se observó una rápida cinética de co-agregación y el tamaño de los agregados formados después de 2 h fueron mayores en comparación con los del péptido Tango 2 individual (figura 48).
Para evaluar el límite del péptido Tango 2 individual para iniciar la coagregación de p-Gal, se preparó una serie de muestras con una relación molar de p-gal a péptido de 1:0, 1:0,2, 1:0,5 y 1:1 en tampón fosfato 20 mM, pH 6,8. La concentración de p-Gal se mantuvo constante a 10 jM mientras que la cantidad de péptido fue de 2 jM, 5 jM y 10 jM. La coagregación de interferidor-p-Gal se inició agitando cuidadosamente la muestra a 50 rpm.
Los experimentos de dispersión de luz y DLS mostraron que fueron suficientes concentraciones por debajo de las estequiométricas del péptido para inducir la agregación de la p-Gal (véase la figura 49). Los agregados visibles formados de este modo no fueron solubles en urea 8 M o GdHCl 6 M.
4.4. Silenciamiento funcional de la enzima p-gal
Para estudiar el efecto del péptido interferidor Tango 2 en la función enzimática de p-Gal se evaluó la actividad catalítica antes y después de la incubación con este péptido. La lectura funcional de la enzima se llevó a cabo usando el sustrato fluoresceína-di-p-D-galactopiranósido (FDG), que no es fluorescente pero tras la escisión enzimática por p-Gal, se libera fluoresceína con una intensidad proporcional a la actividad catalítica. La figura 50 muestra el efecto de las concentraciones crecientes del péptido interferidor Tanto 2 en la actividad enzimática de p- galactosidasa. Resulta evidente que las concentraciones equimolares de enzima e interferidor dan lugar a una inhibición completa de la actividad enzimática (o en otras palabras, a un silenciamiento funcional mediante coagregación completa).
4.5. Estructura del coagregado de p-gal-péptido interferidor Tango 2
El coagregado de p-gal-péptido interferidor Tango 2 se aisló después de su incubación conjunta durante 2 h. Los agregados aislados se lavaron repetidas veces con tampón de fosfato de sodio 20 mM, pH 6,8 hasta que el sobrenadante mostró una absorbancia despreciable a 280 nm y se suspendió en tampón para la caracterización estructural usando espectroscopía infrarroja de transformada de Fourier (FITR), dicroísmo circular (CD) y microscopía electrónica (EM).
Los espectros de FTIR de p-gal nativa muestran un pico de amida I a 1638 cm-1 característica de elementos de estructura secundarios ricos en p-láminas, que cambia a 1628 cm-1 debido a la formación de p-lámina intermolecular tras la coagregación con el péptido interferidor Tango 2 (figura 51). Los espectros de CD de la solución de p-gal nativa muestran características de una clase de estructura a+p mientras que los espectros de suspensión de coagregado con una banda negativa de ~218 nm sugiere una pérdida completa de la estructura de proteína nativa y un cambio a p-láminas coagregadas (figura 52). Finalmente, la EM del coagregado de p-gal-péptido interferidor Tango 2 ilustra que los agregados formados son de naturaleza amorfa (y por lo tanto, no amilogénicos) (figura 53).

Claims (37)

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    1. Un método para inducir la agregación de una proteína que comprende poner en contacto dicha proteína con una molécula de la siguiente estructura: (X2i-1-Y¡-X2í-Zi)n, en donde:
    - n es un número entero de 1 a 5 e i aumenta de 1 a n con cada repetición;
    - cada uno de X2¡-i y X2¡ se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P;
    - cada Y¡ es una secuencia beta agregante seleccionada independientemente de entre una serie de 6 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que está presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E y en donde al menos un Yi es una serie idéntica o que difiere en no más de una sustitución de aminoácidos respecto de una serie contigua de aminoácidos que se encuentran en dicha proteína; y
    - cada Zi es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada;
    en donde la molécula es capaz de inducir la agregación de dicha proteína; y en donde el método no se practica en el cuerpo de un ser humano o un animal.
  2. 2. Un método para regular a la baja la función biológica de una proteína que comprende poner en contacto dicha proteína con una molécula de la siguiente estructura: (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, en donde:
    - n es un número entero de 1 a 5 e i aumenta de 1 a n con cada repetición;
    - cada uno de X2M y X2¡ se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P;
    - cada Yi es una secuencia beta agregante seleccionada independientemente de entre una serie de 6 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que está presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E y en donde al menos un Yi es una serie idéntica o que difiere en no más de una sustitución de aminoácidos respecto de una serie contigua de aminoácidos que se encuentran de manera natural en dicha proteína; y
    - cada Zi es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada;
    en donde la molécula se capaz de regular a la baja la función biológica de dicha proteína; y en donde el método no se practica en el cuerpo de un ser humano o un animal.
  3. 3. Una molécula de la siguiente estructura: (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, en donde:
    - n es 1 a 5 e i aumenta de 1 a n con cada repetición;
    - cada uno de X2M y X2¡ se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P;
    - cada Y¡ es una secuencia beta agregante seleccionada independientemente de entre una serie de 6 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que está presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E y en donde al menos un Y¡ es una serie idéntica o que difiere en no más de una sustitución de aminoácidos respecto de una serie contigua de aminoácidos que se encuentran de manera natural en una proteína; y
    - cada Zi es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada;
    en donde la molécula es capaz de unirse a, inducir la agregación de o regular a la baja la función de dicha proteína y en donde la unión de la molécula a dicha proteína, la agregación de dicha proteína o la regulación a la baja de la función biológica de dicha proteína en un sujeto es terapéuticamente útil; para su uso como medicamento.
  4. 4. La molécula de la reivindicación 3, en donde la expresión o sobreexpresión de dicha proteína se asocia con o es causante de una enfermedad, para su uso en el tratamiento o prevención de dicha enfermedad.
  5. 5. La molécula de la reivindicación 3, en donde la unión de la molécula a dicha proteína, la agregación de dicha proteína o la regulación a la baja de la función biológica en un sujeto es terapéuticamente útil en el cáncer, como en donde la expresión o sobreexpresión de dicha proteína se asocia con o es causante del cáncer, para su uso en el
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    tratamiento del cáncer.
  6. 6. La molécula de la reivindicación 3, en donde la unión de la molécula a dicha proteína, la agregación de dicha proteína o la regulación a la baja de la función biológica en un sujeto es terapéuticamente útil en la AMD, como en donde la expresión o sobreexpresión de dicha proteína se asocia con o es causante de la AMD, para su uso en el tratamiento de la AMD.
  7. 7. La molécula de la reivindicación 3, en donde la unión de la molécula a dicha proteína, la agregación de dicha proteína o la regulación a la baja de la función biológica en un sujeto es terapéuticamente útil en una enfermedad inflamatoria, como en donde la expresión o sobreexpresión de dicha proteína se asocia con o es causante de una enfermedad inflamatoria, para su uso en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria.
  8. 8. Una molécula de la siguiente estructura: (X2¡-1 -Yi-X2¡-Zi)n, en donde:
    - n es 1 a 5 e i aumenta de 1 a n con cada repetición;
    - cada uno de X2¡-i y X2¡ se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre: R, K, E, D, P, N, S, A, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P;
    - cada Y¡ es una secuencia beta agregante seleccionada independientemente de entre una serie de 6 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que está presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E y en donde al menos un Y¡ es una serie idéntica o que difiere en no más de una sustitución de aminoácidos respecto de una serie contigua de aminoácidos que se encuentran de manera natural en una proteína de un organismo patógeno; y
    - cada Z¡ es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada;
    en donde la molécula es capaz de unirse a, inducir la agregación de o regular a la baja la función de dicha proteína y en donde la unión de la molécula a dicha proteína, la agregación de dicha proteína o la regulación a la baja de la función biológica de dicha proteína en el organismo patógeno elimina el organismo patógeno o inhibe el crecimiento y/o la reproducción del organismo patógeno; para su uso como compuesto antipatógenos en el tratamiento de una enfermedad infecciosa causada por el organismo patógeno.
  9. 9. Un método para eliminar un organismo patógeno o inhibir el crecimiento y/o la reproducción de un organismo patógeno que comprende poner en contacto el organismo patógeno con una molécula de la siguiente estructura: (X2i-1-Y¡-X2i-Z¡)n, en donde:
    - n es 1 a 5 e i aumenta de 1 a n con cada repetición;
    - cada uno de X2¡-1 y X2¡ se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, A, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P;
    - cada Y¡ es una secuencia beta agregante seleccionada independientemente de entre una serie de 6 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que está presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E y en donde al menos un Y¡ es una serie idéntica o que difiere en no más de una sustitución de aminoácidos respecto de una serie contigua de aminoácidos que se encuentran de manera natural en una proteína del organismo patógeno; y
    - cada Zi es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada;
    en donde la molécula es capaz de unirse a, inducir la agregación de o regular a la baja la función de dicha proteína y en donde la unión de la molécula a dicha proteína, la agregación de dicha proteína o la regulación a la baja de la función biológica de dicha proteína en el organismo patógeno elimina el organismo patógeno o inhibe el crecimiento y/o la reproducción del organismo patógeno; y en donde el método no se practica en el cuerpo de un ser humano o un animal.
  10. 10. La molécula para su uso de la reivindicación 8 o el método de la reivindicación 9, en donde el patógeno es un organismo vírico.
  11. 11. La molécula para su uso de la reivindicación 8 o el método de la reivindicación 9, en donde el patógeno es un organismo microbiano seleccionado de entre bacterias grampositivas, bacterias gramnegativas, micobacterias, hongos, levaduras y mohos.
  12. 12. La molécula para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 3-8 o el método de la reivindicación 9, en donde la molécula se proporciona en un dispositivo implantable recubierto al menos parcialmente con la molécula.
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    50
    55
    60
    65
  13. 13. Un dispositivo implantable recubierto al menos parcialmente con moléculas de la estructura (X2i-i-Yi-X2i-Zi)n, en donde:
    - n es un número entero de 1 a 5 e i aumenta de 1 a n con cada repetición;
    - cada uno de X2i-1 y X2i se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P;
    - cada Yi es una secuencia beta agregante seleccionada independientemente de entre una serie de 6 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos adicionales se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que está presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E y en donde al menos un Yi es una serie idéntica o que difiere en no más de una sustitución de aminoácidos respecto de una serie contigua de aminoácidos que se encuentran de manera natural en una proteína de un organismo patógeno; y
    - cada Zi es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada;
    en donde la molécula es capaz de unirse a, inducir la agregación de o regular a la baja la función de dicha proteína y en donde la unión de la molécula a dicha proteína, la agregación de dicha proteína o la regulación a la baja de la función biológica de dicha proteína en el organismo patógeno elimina el organismo patógeno o inhibe el crecimiento y/o la reproducción del organismo patógeno.
  14. 14. Un método para seleccionar nuevos compuestos inhibidores y/o de detección, que comprende las etapas de:
    a) identificar en al menos una proteína al menos una región de 6 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos adicionales se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que está presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E;
    b) sintetizar una molécula de la siguiente estructura: (X2¡-1 -Y¡-X2¡-Zi)n, en donde:
    - n es 1 a 5 e i aumenta de 1 a n con cada repetición;
    - cada uno de X2i-1 y X2¡ se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, A, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P;
    - cada Y¡ es una secuencia beta agregante seleccionada independientemente de entre 6 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que está presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E y en donde al menos un Yi es una serie idéntica o que difiere en no más de una sustitución de aminoácidos respecto de una serie contigua de aminoácidos que se encuentran de manera natural en la proteína identificada en la etapa a); y
    - cada Z¡ es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada;
    c) poner en contacto la molécula preparada en la etapa b) con la proteína de la etapa a); y
    d) evaluar la función y/o la agregación de la proteína.
  15. 15. Un método para identificar nuevas dianas para compuestos inhibidores, que comprende el método de la reivindicación 14, en donde la proteína en la etapa a) no es una diana conocida para compuestos inhibidores.
  16. 16. Un método para detectar una proteína en una muestra, que comprende las etapas de:
    a) poner en contacto una muestra sospechosa de contener la proteína con una molécula de la siguiente estructura: (X2¡-1-Y¡-X2¡-Z¡)n, en donde:
    - n es 1 a 5 e i aumenta de 1 a n con cada repetición;
    - cada uno de X2Í-1 y X2¡ se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, A, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P;
    - cada Y¡ es una secuencia beta agregante seleccionada independientemente de entre una serie de 6 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos adicionales se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que está presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E y en donde al menos un Y¡ es una serie idéntica o que difiere en no más de una sustitución de aminoácidos respecto de una serie contigua de aminoácidos que se encuentran de manera natural en la proteína que se va a detectar; y
    - cada Z¡ es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada;
    5
    10
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    55
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    65
    en donde la molécula es capaz de unirse a, inducir la agregación de o regular a la baja la función biológica de dicha proteína;
    b) detectar la presencia de las moléculas que han reaccionado con la proteína.
  17. 17. El método de la reivindicación 16, en donde el al menos un Yi que es idéntico a o difiere en no más de una sustitución de aminoácidos respecto de la serie contigua de aminoácidos que se encuentran de manera natural en la proteína que se va a detectar es único para dicha proteína en dicha muestra.
  18. 18. El método de la reivindicación 16 o 17, en donde la molécula comprende un marcador detectable y la detección en la etapa b) es mediante la detección del marcador detectable.
  19. 19. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, en donde la molécula se proporciona sobre un soporte sólido.
  20. 20. El método de la reivindicación 19, en donde al menos dos moléculas diferentes son capaces de unirse a, inducir la agregación de o regular a la baja la función biológica de dos proteínas diferentes que se van a detectar se proporcionan sobre el soporte sólido.
  21. 21. Un método in vitro para el diagnóstico del estado de una enfermedad que comprende detectar una proteína que es indicativa del estado de la enfermedad en una muestra de un sujeto, en donde la proteína se detecta mediante un método que comprende las etapas de:
    a) poner en contacto una muestra sospechosa de contener la proteína con una molécula de la siguiente estructura: (X2i-1-Yi-X2i-Zi)n, en donde:
    - n es 1 a 5 e i aumenta de 1 a n con cada repetición;
    - cada uno de X2i-1 y X2i se seleccionan independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, A, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P;
    - cada Yi es una secuencia beta agregante seleccionada independientemente de entre una serie de 6 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos adicionales se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que está presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E y en donde al menos un Yi es una serie idéntica o que difiere en no más de una sustitución de aminoácidos respecto de una serie contigua de aminoácidos que se encuentran de manera natural en la proteína que se va a detectar; y
    - cada Zi es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada;
    en donde la molécula es capaz de unirse a, inducir la agregación de o regular a la baja la función biológica de la proteína que se va a detectar;
    b) detectar la presencia de las moléculas que han reaccionado con la proteína.
  22. 22. Un método para regular a la baja la función biológica de una proteína en una planta, una célula vegetal o una semilla de planta, que comprende poner en contacto dicha proteína con una molécula de la siguiente estructura: (Xa- 1-Yi-X2i-Zi)n, en donde:
    - n es un número entero de 1 a 5 e i aumenta de 1 a n con cada repetición;
    - cada uno de X2i-1 y X2i se selecciona independientemente de entre 1 a 4 aminoácidos contiguos seleccionados de entre : R, K, E, D, P, N, S, H, G y Q; más particularmente, 1 a 4 aminoácidos seleccionados de entre R, K, E, D y P;
    - cada Yi es una secuencia beta agregante seleccionada independientemente de entre una serie de 6 a 16 aminoácidos contiguos, siendo al menos un 50% de estos aminoácidos hidrofóbicos y en la que está presente al menos un resto alifático o F y en caso de que solo esté presente un resto alifático o F, al menos uno y preferentemente al menos dos, restos diferentes se seleccionan de entre Y, W, A, M y T; y en la que está presente no más de 1 y preferentemente ningún resto de P, R, K, D o E y en donde al menos un Yi es una serie idéntica o que difiere en no más de una sustitución de aminoácidos respecto de una serie contigua de aminoácidos que se encuentran de manera natural en dicha proteína en dicha planta, célula vegetal o semilla de planta; y
    - cada Zi es un enlazador y Zn se selecciona independientemente de entre un enlazador o nada; en donde la molécula se capaz de regular a la baja la función biológica de dicha proteína.
  23. 23. El método de acuerdo con la reivindicación 22, en donde la molécula es un polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos presente en un vector recombinante y que, tras su introducción en la célula vegetal, la semilla de planta o la planta, produce dicho polipéptido en dicha célula vegetal, la semilla de planta o la planta.
    5
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    30
    35
    40
  24. 24. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, 9-12, 14-20 o 21-23, la molécula para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 3-8 o 10-12 o el dispositivo implantable de la reivindicación 13, en donde cada X2i-1 y X2i tiene 1 o 2 aminoácidos.
  25. 25. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, 9-12, 14-20, 21-24, la molécula para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 3-8, 10-12 o 24 o el dispositivo implantable de la reivindicación 13 o 24, en donde al menos una y más particularmente todas, Yi es una serie de 6 a 13 aminoácidos, particularmente de 6 a 9 aminoácidos, más particularmente de 6 o 7 aminoácidos.
  26. 26. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, 9-12, 14-20, 21-25, la molécula para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 3-8, 10-12 o 24-25 o el dispositivo implantable de la reivindicación 13 o 24-25, en donde al menos dos y en particular cada, Yi son cada uno independientemente idénticos a o difieren en no más de una sustitución de aminoácidos respecto de una serie de 6 a 16 aminoácidos contiguos que se encuentran de manera natural en una proteína.
  27. 27. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, 9-12, 14-20, 21-26, la molécula para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 3-8, 10-12 o 24-26 o el dispositivo implantable de la reivindicación 13 o 24-26, en donde cada Zi se selecciona independientemente de entre una serie de de entre 0 y 20 unidades, en donde una unidad es un aminoácido, un monosacárido, un nucleótido, ácido trioxadecan-succínico (Ttds) o PEG.
  28. 28. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, 9-12, 14-20, 21-26, la molécula para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 3-8, 10-12 o 24-26 o el dispositivo implantable de la reivindicación 13 o 24-26, en donde cada Zi se selecciona independientemente de entre una serie de de entre 0 y 20 unidades, en donde una unidad es un aminoácido.
  29. 29. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, 9-12, 14-20, 21-26, la molécula para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 3-8, 10-12 o 24-26 o el dispositivo implantable de la reivindicación 13 o 24-26, en donde cada Zi se selecciona independientemente de una serie de entre 0 y 10 unidades, en donde una unidad es un aminoácido o PEG.
  30. 30. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, 9-12, 14-20, 21-29, la molécula para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 3-8, 10-12 o 24-29 o el dispositivo implantable de la reivindicación 13 o 24-29, en donde n es 1, X1 y X2 son en total no más de 5 aminoácidos, Y1 es una serie de entre 6 y 10 aminoácidos y Z1 es una serie de 0 unidades.
  31. 31. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, 9-12, 14-20, 21-29, la molécula para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 3-8, 10-12 o 24-29 o el dispositivo implantable de la reivindicación 13 o 24-29, en donde n es 2, Z1 es un enlazador y Z2 es nada.
  32. 32. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, 9-12, 14-20, 21-31, la molécula para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 3-8, 10-12 o 24-31 o el dispositivo implantable de la reivindicación 13 o 24-31, que además comprende un resto que aumenta la solubilidad de la molécula.
    Figura 1
    imagen1
    Figura 2
    imagen2
    240
    % de células de Candida adherentes
    imagen3
    Figura 4
    imagen4
    241
    Formación de biofílm (%)
    >
    o £3
    <CJ> O
    l\3
    O
    é
    imagen5
    Figura 5
    SC5314 alsM/alsM AFA 15a AFA 15a AFA 16b AFA 16c
    % de células de Candida invasoras
    imagen6
    242
    Adhesión (%)
    £ é § 8 8 &
    imagen7
    Control
    (DMSO)
    imagen8
    243
    Logio de UFC/trozo de catéter

    o fo co 4^

    o o o o o

    _________l_________I_________1_______1_
    imagen9
    (DMSOal 1%)
    imagen10
    SCS314 als30/als3ú F9 SQliM F9 10pM F9 2 SuM (DMSOalO,1%)
    % de células de Candida
    ©
    % de células de Candida adherentes
    imagen11
    SC5314 BIS3A/Hsai alslá/atslá F9 5Q)iM
    9/s3á/s/s3&
    imagen12
    imagen13
    : m i
    K 1
    SCAA
    SCAA+SDS
    Tipo silvestre
    .i.lnr
    II
    Acnbl
    Transformante
    SD+SDS
    Tipo silvestre
    Acnbl
    Transformante
    imagen14
    La cinética de eliminación de S. aureus ATCC
    tratadas con compuesto C29
    -■*- ixCIM C29 [12,5 |jg/ml]
    Log UFC/ml 3
    2xCIM C29 [25 Mg/ml]
    170
    La cinética de eliminación de Hit50 y C30
    contra S. epidermidis, cepa ATCC 12228
    ^ 6/00
    3 5/00
    -£ 4,00
    - IxCIM HitSO (1,5 pg/ml)
    ro 3,oo
    2xCIM HitSO 3 ug/ml)
    ^ 2,00
    C30 a valor de CIM
    (3 pg/ml)
    1,00
    0,00
    120
    Tiempo (minutos)
    imagen15
    Control del desarrollo de la resistencia en
    S. aureus ATCC
    Ampicilina
    C2D/hit 1 —í«r“Gentam¡cina
    LJli
    250
    200
    150
    Numero de pases (días)
    Figura 13
    Estudios de desarrollo de resistencia a largo plazo en MRSA
    12C
    100
    Patrón
    i 80
    de resistencia
    a C30
    É 60
    Patrón de
    resistencia a
    oj 40
    la ampicilina
    • an» ♦ i wt»
    V
    Numero de día
    imagen16
    imagen17
    Control del desarrollo de resistencia
    en MRSA a sub-CIM de péptido C30
    Numero de pases (días)
    Figura 16
    El efecto de los péptidos en la permeabilidad de membrana de células HEK293T
    70
    I 60
    □ Tratadas con C30
    PTratadas con HitoC
    “ 40
    ra1 20
    _ 11
    1
    100pg/ml
    50pg/ml
    25gg/ml
    Concentración
    Número medio de eventos de FIT-C
    Ensayo de citotoxicidad de Alamar Blue para la línea celular HEK293T
    imagen18
    ■ % de viabilidad con C3Q
    ■ % de viabilidad con Hit50 Efecto del DMSO
    Figura 18
    Control de la permeabilidad de membrana de S. aureus con el tiempo
  33. 45.000
    imagen19
    --------C30
    ------Hitl
    ------Hit24
    ------HitSO
    ...X...Lisostafiria
    —X—Solo tampón
    5m¡n 20min
    Tiempo (minutos)
    SOmin
    imagen20
    Permeabilidad dependiente de la concentración
    en S. aureus tratadas con C30
    ■
    F
    Figura 20
    Cambio de potencial de membrana con el tiempo para C30 [Staphylococcus epidermidis ATCC 12228]
    Especimen_002-SEPI no tratado
    FiTC-A
    imagen21
    Especimen_002-DMSO SEPI
    iin mhi i i i mui iiii i mi iiii i ii ii i
    FITC-A
    Espécimen 002-SEPI control de despolarizacion
    F1TC
    A
    imagen22
    Espécimen 002-C30 3 SEPI tiempo 0
    i muí
    r i i i mi
    FiTC-A
    Especimen_002-C30 3 SEPI tiempo 5 min
    FITC-A
    imagen23
    imagen24
    Unión a tioflavina T
    Bacterias tratadas
    con péptidos
    20
    -r
    Péptidos en solo medio
    Figura 22
    Unión de rojo Congo
    0,180
    0,160
    0,140
    0,120
    0,100
    0,080
    0,060
    0,040
    0,020
    0,000
    50jg/ml
    12,5ug/mll
    3pg/ml
    33S CR
    imagen25
    BacíJJus cereus no tratadas
    imagen26
    Tratadas con C30 (25 |jg/ml| durante 6 minutos
    Figura 24
    imagen27
    imagen28
    : ■ “
    tapas con C30, 25 pg/ml
    incubadas durante 20 min
    S, aureus ATCC tratadas con DMSO
    Figura 26
    imagen29
    Figura 28
    Número de bacterias que residen intracelularmente en la línea
    celular HCT116
    imagen30
    SU Gentamicina Q Sin tratar O Hitl E3 Hít57A
    imagen31
    1 ~B. cereus no tratadas ¡nsoluble
    2'B. cereus tratadas con C3G ¡nsoluble
    %-B. cereus tratadas con C30 soluble
    4-B. cereus no tratadas soluble
    fgf V
    : iilii
    Figura 30
    7000,00
    R‘ - 0,96794
    6000,00
    5000,00
    4000,00 ■
    jOOOOQ
    5000,00
    1000,00
    U.OO
    000
    1,000
    2,000
    3,000
  34. 4.000
    6,000
    7,000
  35. 1000.00
    La eficacia de diferentes tratamientos en la infección en el muslo en ratones
    imagen32
    a Inicio del Inoculo
    ■ Vancomicina i.v. 15 mg/kg 4 horas después de la Infección
    «Tratados con C30 IP (2x30 6 h después de la infección
    S C30 IV (4 h después de la infección)
    ■ Tratados con tarmpón
    c,n 20 J,0 E,D S,0 100 12:0
    Log10 UFC/ml
    imagen33
    imagen34
    18(1 OuM)
    30(' OuM)
    36(' OuM)
    Tamifluí'uM)
    PBS
    12(1 uM)
    18(1 ijM.p
    30(1 U Mi
    36(1 uM)
    Taminu;10nM)
    ♦--PBS
    imagen35
    imagen36
    Interferí do res específicos de PA
    2 0,9
    - 0.7
    i:R GS
    ~ 0,5
    □ R-PP
    fl> 0,4
    ■ D-PP
    ■2 0,3
    ■ R-PS
    ■u
    0,2
    0,1
    <
    PA 2
    P A - 3
    PA 1
    Interferidores específicos de PB2
    <§ 0,0
    0)
    0,8
    0,7
    □ K GS
    TD
    0,6
    :jR PP
    ■ O-PP
    R-PS
    0,2
    >
    PB2-2 PB2-3 P 82-1 P82-4 P82-5
    264
    imagen37
    •
    B □ D
    o
    -b
    tí ó
    “U L"
    Interferidores específicos de NP
    Interferidor
    "O
    OD
    *
    Ni
    p p p O P O p o o
    o W 'w b U b Vj "m Id k
    imagen38
    imagen39
    Actividad relativa de luciferasa
    imagen40
    imagen41
    Muestra
    Jy
    ' Bi
    Biomarcador de proteina
    Electroforesis en gel
    Segmento
    p-agregante
    Proteínas separadas por
    tamaño
    Generar péptidOS Tango
    marcados
    Transferencia de Western
    Proteínas transferidas sobre
    embrana de nitrocelulosa
    Péptidos Tango biotinilados
    \ Co-agrcgacion de peptido Tango Con
    biomarcador de proteina diana
    Conjugado de
    Exploración por afinidad
    estreptavidina-
    peroxidasa de rábano
    Visualización del
    picante (SRP-HRP)
    biomarcador de proteina
    Quimioluminiscencia
    imagen42
    kDa
    190 — 115 — 80 — 70 —
    50 —
    30 — 25 —
    15 —
    10 —
    imagen43
    imagen44
    p—Gal
    Figura 40 A
    imagen45
    imagen46
    p-Gal
    imagen47
    imagen48
    Figura 43
    His)B~RLAVVLQR
    (HisLHRVllWSLGNR
    (His)s~RPITVNPPFR
    lampón
    120
    180
    240
    300
    Tiempo (s)
    Respuesta (UR)
    imagen49
    Figura 45
    imagen50
    O 60 120 180 240 300
    Tiempo (s)
    imagen51
    imagen52
    274
    Absorbancia (u.a.)
    imagen53
    O
    Figura 51
    Tiempo (min)
    imagen54
    imagen55
    10000
    Figura 53
    10000
    5000
    5000
    190
    210
    230
    250
    Longitud de onda (nm)
    imagen56
    imagen57
    IgG anti-CRP b~RILlFWSR
    Densidad de la señal (x1000)
    imagen58
    imagen59
    küa
    115
    í>~RQQWFSMSFVQD b -KQQ WF S M SFVQD
    Figura
    S
    & &
    kD
    140
    115
    60
    65
    TNFa
    Ü~RGLYUY5QVLFP fr'rtGLYLlYSQVLFH
    imagen60
    imagen61
    0,20
    0,05
    0,00
    200
    400
    600
    SCO
    Tiempo (s)
    Figura 65
    R Gk con enlazador largo
    Punto de peptido
    Repetición en tándem
    imagen62
    Punto de péptido
    imagen63
    Direccionamiento a VEGFR2 con peptidos - Exp 4
    (Péptidos de diferentes fuentes)
    □ERKl/2
    * * * * *
    ERK1/2 total
    m\/E<jFR2
    VEGF (25fig/ml)
    Peptido
    Peptido conc. (pM)
    PT
    Gfivaprt I ah
    Cuantificacion
    Sin estlm.
    VEGF
    VEGF + B8 VEGF + B8
    VEGF + B12 VEGF + 812
    (25ng/m!)
    (lOpiM)
    (20pM)
    (lOpiM)
    pERKl/2
    EGF (25ng/mí) Péptido
    Péptido conc. (pM)
    imagen64
    •f
    M + + +
    68
    B8 B8 BS
    10
    20 10 20
    JPT Geaert Lab
    M = marcador
    Figura 68
    imagen65
    imagen66
    Absorbancia a 450 nm
    Niveles de ERK1/2 fosforilado en HeLa
    14,000
    12,000
    10,000
    8,000
    6,000
  36. 4.000
  37. 2.000 0,000
    imagen67
    Sin EFG EGF (25ng/ml| EGF (25ng/ml) + EGF (25ng/ml) + EGF (25ng/mi) + EGF {25ne/ml> + EGF (25ng/ml) + EGF (25ng/ml) + EGF (25ng/ml) +
    A5(20mM) A11(20(jiM) A12(20[iM) B9(20|iM) B1G(20jíM) Bll(20nM) B12(20jiM)
    Condición (péptido o control)
    Figura 70
    imagen68
    h TNF A20
    imagen69
    Bioensayo de IL-6
    0,6
    0,5
    ~0,4
    E
    S03
    — 0,2
    0,1
    0
    -x;»y
    "tjT 'i, ÍJ q.- ijiití.,; •r .... .n 11 ü
    .Í'.rí-- : , -J •*1 .* ’ V . 17 SI-
    ■ ■M» i Sil
    IB E
    r
    Oh 1h 3h 6h 8h
    h 1000 Ul/ml de TNF
    imagen70
    ELISA de IL-8
    r:
    TNF
    DMSO 1
    n.° de péptido
    ELISA de IL-8
    TNF
    DMSO
    n. de peptido
    imagen71
    Propensión a la agregación cruzada p (%)
    >
    imagen72
    Posición de AA
    Figura 74
    imagen73
    8a¡t249NF
    QLVEIIKVL
    AGSPKGAPAAKGSGA
    6NAVD....GTP1*R6E
    Bait249NF Tafid
    ENAVD.....6TPTREE
    attBl '... Linter
    Promotor 35S —
    -----------Señuelo— -----------eGFP
    NOMBRE
    SECUENCIA ENLAZADOR REFUERZO FLANCOS NATURALES
    Bait249
    QLVEIIKVL KPACAAKPGAAC QWQNSTUVIQNSTVIFEQNSTVIf tQN i
    B3!t249R
    RQLVÉIIKVLR KPAGAAKPGAAG QWQNSTUVLQNSTVIfEQNSTVIFEQN
    Linter
    attBl
    Promotor
    eGFP/tagRFP
    eñuelo
    (Señuelo)
    AGSPKGAPAAKGSGA
    QLVEIIKVLQLvEUKVL
    Figura 75
    GFP libre
    Bait249
    Bait249R
    Bait24SNF
    Bait249NF Tand
    i
    imagen74
    NO UNIDO
    IP
    anti-HA
    anti*GFP
    imagen75
    imagen76
    Figura 78
    imagen77
    Cotiledones
    Hipocótilo
    Raíz
    Punta de la raíz
    35S::baH249NF_
    imagen78
    Punta de la raíz
    Raíz
    baitíM
    35S
    Hipocotilo
    ':-A
    Cotiledones
    imagen79
    imagen80
    35KDa
    1620
    Q.
    a LL
    Q. LL a
    u_ 13 <3 i €C
    d> a> <75
    TJ-
    ü
    AS <a
    £i -O
    o
    JL
    (Ó cd ió
    O
    LO LO LO
    O
    (O {O CO
    35S: bait249-GFP
    35S: ba¡t2493 GFP
    imagen81
    35S::bait249NF Tand-GFP
    0,6
    35S::bait249NF-GFP
    60
    Figura 82
    Co-0
    35S::bait249R-GFP
    35S::l>ait249NF Tand-GFP
    imagen82
    2,00
    1,80
    1,60
    1,40
    1,20
    1,00
    0,80
    0,60
    0,40
    0,20
    0,00
    40 j 35 -30 : 25 - 20 T 15 ~r
    10 T
    5 • 0
    *Col-0
    « 35S:ba t249R:GFP
    355:ba¡t249NF Tancf
    Longitud del hipocótilo (mm)
    Co-0
    » 355:bait249R:GFP
    355:bait249NF TandrGFP
    angitud de la raíz (mm)
    wnizaa wns'oiaa oswo
    Longitud del hipocótilo (mm)
    Kt
    O
    O N> -t»
    imagen83
    Respuesta a la dosis de BRZ
    cu
    Col-0
    35S::bait249R-GFP
    35S::bait249NFJand-GFP
    trGSKsll_k.o.
    Col-0
    35S::bait249R-GFP
    35S::bait249NF_Tand-GFP
    trGSKsll_k.o.
    Col-0
    35S::bait249R-GFP 35S::bait249NF Tand-GFP
    trGSKsll k.o,
    imagen84
    u-' .
    ■ Cok)
    Sí 35S:bajt249R:GFP
    s2 35S:büit249R:GFP
    13SS:ba¡t249NF 7ami:GFP
    * J55:baiU49NF r¿nd:(sFP
    «tfGSKsllfca
    ■ trGSKsll k,o
    • ' •
    süí',,:i
    «3SS:bait249«:GFP
    Tw&m
    IttGSmk&
    “'í -1
    imagen85
    imagen86
    imagen87
    Figura 84
    imagen88
    Raíz
    Hipocotilo
    35S:caí24gp-ühP
    imagen89
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