ES2679570B1 - Variantes de la proteína no viriónica del virus de la hemorragia septicémica viral y su uso en el tratamiento de desórdenes proliferativos. - Google Patents

Description

VARIANTES DE LA PROTEINA NO VIRIÓNICA DEL VIRUS DE LA HEMORAGIA

SEPTICÉMICA VIRAL Y SU USO EN EL TRATAMIENTO DE DESÓRDENES

PROLIFERATIVOS

DESCRIPCIÓN

La presente invención se refiere a un conjunto de polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 99% con la proteína no viriónica (NV) del virus Oncorhynchus 2 novirhabdovirus, (conocido como virus de la hemorragia septicémica viral, VHSV) que comprende la SEQ ID NO: 2, y dichos polipéptidos comprenden, además, al menos una sustitución del aminoácido natural presente en cualquiera de las posiciones 33 a 41 de dicha SEQ ID NO: 2, por el aminoácido alanina (A). Dichos polipéptidos son útiles para el tratamiento de enfermedades que cursen con proliferación celular, en particular, para el tratamiento del cáncer y la metástasis. Por lo tanto, la presente invención se incluye dentro del campo de la biología, biología molecular y medicina, en particular, en el campo del tratamiento del cáncer, así como de cualquier desorden proliferativo.

ESTADO DE LA TÉCNICA

Los tumores aparecen debido a desregulaciones en los programas de proliferación celular, diferenciación y muerte, teniendo un papel determinante el sistema inmune y los procesos de inflamación crónica. Las cascadas de señalización MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinase) están implicadas en proliferación celular, diferenciación y supervivencia o muerte celular. En mamíferos se han caracterizado cuatro vías MAPK cuyas kinasas terminales son ERK1/2, JNK1/2/3, p38 kinasas y ERK5. Estas MAPKs activan sustratos que ejercen diversas funciones como la regulación de la transcripción génica y regulación del ciclo celular resultando en un aumento de la proliferación. En el estudio de la progresión de tumores, se ha establecido el papel determinante de la vía en la que participa ERK, y los señalizadores previos en la progresión del cáncer (Shields, J.M., et al., Trends Cell Biol, 2000. 10(4): 147-54) denominándose la vía RAS-RAF-MEK-ERK. Se ha estimado que ERKs pueden regular las actividades de 160 proteínas (Yoon, S. y R. Seger. Growth Factors, 2006.

24(1): 21-44) que se localizan en orgánulos, citoplasma y mayoritariamente en el núcleo. Cuando se activa ERK, éste transloca al núcleo donde regula varios factores de transcripción dando lugar a cambios de expresión génica (Zuber, J., et al., Nat Genet, 2000. 24(2): 144-52; Schulze, A., et al., Mol Biol Cell, 2004. 15(7): 3450-63).

En muchos tipos de cáncer, la vía RAS-RAF-MEK-ERK está desregulada con una actividad en exceso debido a la mutación de alguno de sus componentes, tales como por ejemplo, las proteínas EGFR, RAS y RAF, lo que conduce a una proliferación descontrolada. Las mutaciones en el gen que codifica para B-RAF (BRAF) causan el 70% de los tumores de melanoma estudiados y en menor medida otros tumores (Davies, H., et al., Nature, 2002. 417(6892): 949-54).

Uno de los objetivos principales en el tratamiento del cáncer es disminuir la desregulación de la proliferación mediante la inhibición de los señalizadores iniciales, medios y finales, y así promover la apoptosis para la eliminación de las células tumorales. Se han desarrollado diferentes inhibidores para distintos señalizadores como A-RAF, BRAFV600E o MEK quinasas (Tabla 1), pero a lo largo del tiempo las células tumorales generan resistencia a dichos tratamientos, dejando por tanto de ser útiles. En el melanoma, la resistencia al tratamiento aparece al año, mientras que en los carcinomas de colon dicha resistencia aparece desde el inicio del tratamiento porque hay una retroalimentación por la activación del receptor del factor de crecimiento epidérmico (Sun, C., et al., Nature, 2014. 508(7494): 118-22). Más recientemente, se han obtenido compuestos que inhiben ERK (Tabla 1) y que son funcionales en células con mutaciones BRAF, resistentes a otros inhibidores (Morris, E.J., et al., Cancer Discov, 2013. 3(7): 742-50). Sin embargo, el estudio con mayor número de casos ha demostrado que también muestran resistencia a la inhibición debido a mutaciones en ERK (Jha, S., et al., Mol Cancer Ther, 2016. 15(4): p. 548-59).

Tabla 1. Inhibidores utilizados en la vía RAS-RAF-MEK-ERK.

AML: Acute Myelogenous Leukemia; CRC: Colorectal cáncer, MEK: mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase kinase; NSCLC: non-small-cell lung cancer, RCC: renal cell cancer.

Como se ha comentado anteriormente, además del desbalance existente en las vías MAPK y sus kinasas efectoras, en la proliferación celular y crecimiento tumoral existe además un desbalance entre las diferentes fases del ciclo celular, sus proteínas promotores del mismo (ciclinas A, B, D y E), y los inhibidores de kinasas de las ciclinas (CDKs), propiciando una división celular descontrolada. En este sentido, se ha determinado una sobreexpresión de la ciclina B1 en tumores de mama, cáncer cervical, gástrico, colorrectal y pulmón (Banerjee, S.K., et al., Am J Pathol, 2000.

156(1): 217-25; Wang, A., et al., J Cancer Res Clin Oncol, 1997. 123(2): 124-7; Zhao, M., et al., Exp Oncol, 2006. 28(1): 44-8), siendo este incremento de ciclina B1 un factor de mal pronóstico en varios tipos de cáncer, incluido el de mama (Soria, J.C., et al., Cancer Res, 2000. 60(15): 4000-4; Suzuki, T., et al., Cancer Sci, 2007. 98(5): 644­ 51; Nozoe, T., et al., Clin Cancer Res, 2002. 8(3): 817-22). Además, la sobreexpresión de ciclina B1 está involucrada en la resistencia a radioterapia en carcinoma de cabeza y cuello (Hassan, K.A., et al., Cancer Res, 2002. 62(22): 6414-7). Estudios realizados en células de cáncer de mama y cérvix mostraron que la disminución de ciclina B1 mediante inhibición transcripcional (inhibición por siRNA) conducía a una menor proliferación celular y mayor sensibilización de las células a compuestos proapoptóticos (Androic, I., et al., BMC Cancer, 2008. 8: 391). Alternativamente a la disminución de la proliferación celular, se observó que la inhibición de ciclina B1 también induce un aumento del número de células en la fase G2/M, sugiriendo un arresto en este punto del ciclo celular (Androic, I., et al., BMC Cancer, 2008. 8: 391).

El papel de la ciclina B1 como promotor de la proliferación celular en cáncer se ha puesto de manifiesto en otros estudios. Así, se ha establecido relación inversa entre la concentración del microRNA miR-379, la concentración de ciclina B1 y el pronóstico de cáncer de mama. Los pacientes con cáncer de mama mostraban menos concentración de miR-379 que los controles, y esta concentración disminuía aún más en estadios avanzados de la enfermedad. Además, se observó que a menor concentración de miR-379 se incrementaba la concentración de ciclina B1 (Khan, S., et al., PLoS One, 2013. 8(7): e68753).

En vista de lo expuesto en los párrafos anteriores, existe en el estado de la técnica la necesidad de proporcionar nuevos compuestos alternativos a los descritos en el estado de la técnica, capaces de inhibir la proliferación celular, actuando tanto sobre las proteínas de las vías de las MAPKs, como sobre las proteínas del ciclo celular, que sean capaces de disminuir la resistencia a los tratamientos ya utilizados en desórdenes proliferativos, tales como el cáncer, y de mejorar la eficacia de tratamientos clásicos como la radioterapia.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Los inventores han descubierto que variantes (también denominadas mutantes) de la proteína no viriónica (NV) del virus Oncorhynchus 2 novirhabdovirus, (conocido como virus de la hemorragia septicémica viral, VHSV) que comprende la SEQ ID NO: 2, y que es codificada por la secuencia nucleotídica que comprende la SEQ ID NO: 1, inhibe la expresión génica y proteica de genes y proteínas implicados en la proliferación celular y en el ciclo celular, tales como proteínas de la vía MAPK, proteínas inflamatorias y ciclinas, respectivamente. Adicionalmente, las variantes de la proteína NV del virus VHSV descritas en la presente invención inducen un incremento en la muerte celular de las células que las expresan y por lo tanto, dichas variantes pueden ser útiles en el tratamiento de desórdenes proliferativos, tales como el cáncer, utilizándose en terapias antitumorales bien solas y/o en combinación con otras terapias antitumorales. Las variantes descritas en la presente invención son capaces de mejorar la efectividad de los tratamientos antitumorales, incluyendo aquellos resistentes a la radioterapia.

Para demostrar la efectividad de las variantes polipeptídicas descritas en la presente invención, los inventores transfectaron diferentes líneas celulares tumorales y notumorales con un vector conteniendo los diferentes polipéptidos aquí descritos, y observaron que la expresión de dichas variantes inhibía la actividad de proteínas de la vía MAPK, proteínas inflamatorias y ciclinas, y como consecuencia de dicha inhibición, se producía un menor proliferación celular y también se induce un incremento en la muerte celular.

El empleo de las variantes polipeptídicas descritas en la presente invención tienen la ventaja añadida de que es posible unirles secuencias de internalización celular para que, cuando son administrados a un individuo, estos puedan internalizarse en la célula para ejercer su efecto sin necesidad de emplear técnicas de terapia génica.

En base a este descubrimiento, se han desarrollado una serie de aspectos inventivos que se describen a continuación.

Polipéptidos de la invención

En un primer aspecto, la presente invención se relaciona con variantes polipeptídicas de la proteína NV del virus VHSV que comprende la SEQ ID NO: 2, y que es codificada por la secuencia nucleotídica que comprende la SEQ ID NO: 1, donde dichas variantes polipeptídicas comprenden al menos un 99% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 2, o una variante funcionalmente equivalente de las mismas.

En el contexto de la presente invención se entiende por polipéptido a aquella molécula formada por la unión, en un orden definido, de alfa-aminoácidos mediante un enlace peptídico, e incluye modificaciones o derivados del mismo, por ejemplo, glicosilación, fosforilación, acetilación, amidación, etc. Los aminoácidos del polipéptido de la invención, en función de la orientación del grupo amino que lleva el átomo de carbono alfa, pueden pertenecer a la serie L o a la serie D.

El polipéptido de la invención puede obtenerse por técnicas ampliamente conocidas en el estado de la técnica, tales como síntesis química, recombinación genética, expresión del polinucleótido que codifica el polipéptido de la invención, etc. Todas estas técnicas son práctica de rutina para el experto en la materia.

Adicionalmente, los extremos carboxilo y amino terminal del polipéptido de la invención pueden estar protegidos contra la proteólisis. Por ejemplo, el extremo amino terminal puede estar en forma de grupo acetilo y/o el extremo carboxilo terminal puede estar en forma de grupo amida. También cabe la posibilidad de llevar a cabo modificaciones internas de los péptidos para que sean resistentes a la proteólisis. Ejemplos de estas modificaciones internas incluyen, sin limitar a, modificaciones en las que al menos un puente peptídico -CONH- se modifica y reemplaza por un enlace reducido (CH2NH), un enlace retroinverso (NHCO), un enlace oximetileno (CH2-O), un enlace tiometileno (CH2-S), un enlace cetometileno (CO-CH2), un enlace hidroxietileno (CHOH-CH2), un enlace (N-N), un enlace E-alceno o un enlace -CH=CH-. Los péptidos también pueden estabilizarse por cruzamiento intramolecular, por ejemplo, mediante la modificación al menos de dos residuos de aminoácidos con cadenas laterales de oleofina, preferiblemente, cadenas alquenilo C3-C8, preferiblemente, cadenas pentel-2-il, seguidas de un entrecruzamiento de las cadenas tal como se describe en la tecnología denominada “staple” (Walensky et al., 2004, Science 205: 1466-1470). Todos estos péptidos modificados de forma química para resistir a la proteólisis también están contemplados dentro de la presente invención.

Modificaciones adicionales al polipéptido de la invención comprenden la unión covalente a una molécula de polietilenglicol (PEG) por su extremo carboxilo terminal o a un residuo de lisina, con la finalidad de disminuir su eliminación urinaria y la dosis terapéutica, y de incrementar la vida media del polipéptido en el plasma sanguíneo. La vida media del polipéptido también puede incrementarse mediante la inclusión del polipéptido en un material polimérico biodegradable y biocompatible para formar microesferas que son empleadas como un sistema de administración de fármacos. Polímeros y copolímeros incluyen, sin limitar a, poli (D, L-lactido-co-glicólico) o PLGA. Las técnicas y procedimientos de cómo fabricar microesferas o nanocápsulas lipídicas para su empleo en la administración de fármacos son ampliamente conocidas por el experto en la materia. Cualquier método de administración de fármacos dirigidos selectivamente a una población tumoral puede ser empleado en el contexto de la presente invención.

A efectos de la presente invención, el término "variante" o “mutante” utilizados indistintamente a lo largo de la presente invención y referidos a las proteínas NV de los virus VHSV y que tienen al menos una mutación, según se describe en la presente invención y que resultan en una mayor actividad en la inhibición de la proliferación celular, modificando la expresión de proteínas de la ruta MAPK y del ciclo celular, así como en un incremento de la muerte celular, respecto de la proteína NV de tipo salvaje (wild-type) del virus VHSV.

Las variantes o mutantes polipeptídicas de la proteína NV del virus VHSV descritas en la presente invención, comprenden la sustitución del aminoácido natural presente en cualquiera de las posiciones 33 a 41 de la SEQ ID NO: 2, por el aminoácido alanina (A), dando lugar a las variantes descritas en la Tabla 2.

Tabla 2.

Por lo tanto, la invención se refiere a un polipéptido, a partir de aquí polipéptido de la invención, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 99% con la SEQ ID NO: 2, y además comprende al menos una sustitución del aminoácido natural entre las posiciones 33 a 41 de la SEQ ID NO: 2 por el aminoácido alanina (A), o una variante funcionalmente equivalente de la misma.

En una realización particular, el polipéptido de la invención comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 99% con la SEQ ID NO: 2, y comprende además una sustitución del aminoácido ácido aspártico (D) original por alanina (A) en la posición 41 (D41A). En una realización más preferida el polipéptido de la invención se caracteriza por que comprende la SEQ ID NO: 20, o una variante funcionalmente equivalente de la misma.

En otra realización particular, el polipéptido de la invención comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 99% con la SEQ ID NO: 2, y comprende además una sustitución del aminoácido leucina (L) original por alanina (A) en la posición 33 (L33A). En una realización más preferida el polipéptido de la invención se caracteriza por que comprende la SEQ ID NO: 4, o una variante funcionalmente equivalente de la misma.

En otra realización particular, el polipéptido de la invención comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 99% con la SEQ ID NO: 2, y comprende además una sustitución del aminoácido asparagina (N) original por alanina (A) en la posición 34 (N34A). En una realización más preferida el polipéptido de la invención se caracteriza por que comprende la SEQ ID NO: 6, o una variante funcionalmente equivalente de la misma.

En otra realización particular, el polipéptido de la invención comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 99% con la SEQ ID NO: 2, y comprende además una sustitución del aminoácido cisteína (C) original por alanina (A) en la posición 35 (C35A). En una realización más preferida el polipéptido de la invención se caracteriza por que comprende la SEQ ID NO: 8, o una variante funcionalmente equivalente de la misma.

En otra realización particular, el polipéptido de la invención comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 99% con la SEQ ID NO: 2, y comprende además una sustitución del aminoácido ácido aspártico (D) original por alanina (A) en la posición 36 (D36A). En una realización más preferida el polipéptido de la invención se caracteriza por que comprende la SEQ ID NO: 10, o una variante funcionalmente equivalente de la misma.

En otra realización particular, el polipéptido de la invención comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 99% con la SEQ ID NO: 2, y comprende además una sustitución del aminoácido leucina (L) original por fenilalanina (F) en la posición 37 (F37A). En una realización más preferida el polipéptido de la invención se caracteriza por que comprende la SEQ ID NO: 12, o una variante funcionalmente equivalente de la misma.

En otra realización particular, el polipéptido de la invención comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 99% con la SEQ ID NO: 2, y comprende además una sustitución del aminoácido ácido aspártico (D) original por alanina (A) en la posición 38 (D38A). En una realización más preferida el polipéptido de la invención se caracteriza por que comprende la SEQ ID NO: 14, o una variante funcionalmente equivalente de la misma.

En otra realización particular, el polipéptido de la invención comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 99% con la SEQ ID NO: 2, y comprende además una sustitución del aminoácido arginina (R) original por alanina (A) en la posición 39 (R39A). En una realización más preferida el polipéptido de la invención se caracteriza por que comprende la SEQ ID NO: 16., o una variante funcionalmente equivalente de la misma

En otra realización particular, el polipéptido de la invención comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 99% con la SEQ ID NO: 2, y comprende además una sustitución del aminoácido serina (S) original por alanina (A) en la posición 40 (S40A). En una realización más preferida el polipéptido de la invención se caracteriza por que comprende la SEQ ID NO: 18, o una variante funcionalmente equivalente de la misma.

En otra realización más preferida aún, el polipéptido de la invención se selecciona de la lista que consiste en: SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 20, o una variante funcionalmente equivalente de las mismas. Más preferiblemente, el polipéptido de la invención comprende la SEQ ID NO: 20, o una variante funcionalmente equivalente de la misma.

La familia de virus Rhabdoviridae, particularmente el género Novirhabdovirus, agrupa a cuatro especies denominadas Oncorhynchus 1 novirhabdovirus (conocido como virus de la necrosis hematopoyética infecciosa, IHNV), Oncorhynchus 2 novirhabdovirus (conocido como virus de la hemorragia septicémica viral, VHSV), Hirame novirhabdovirus (HIRV) y Snakehead novirhabdovirus (SHRV). Las infecciones por virus de este género afectan a más de 50 especies de peces silvestres (Brudeseth, B.E. y O. Evensen, Dis Aquat Organ, 2002. 52(1): 21-28) y de piscifactoría (Skall, H.F., et al. J Fish Dis, 2005. 28(9): 509-529), produciendo grandes pérdidas económicas en especies comerciales. Los novirhabdovirus son virus RNA de polaridad negativa cuyo genoma codifica para cinco proteínas del virión (N, P, M, G y L) y para la proteína NV. La presencia del gen que codifica para la proteína NV es característica común a todos los virus pertenecientes a este género, y por eso se les ha clasificado con el nombre de novirhabdovirus, al contrario que otros rhabdovirus, tales como el virus SVCV (virus primaveral de la carpa) que carece de la proteína NV. La proteína NV es necesaria para una eficiente replicación de los novirhabdovirus IHNV y VHSV en trucha y platija japonesa (Paralichthys olivaceus), respectivamente. Por otro lado, la proteína NV de SHRV no es necesaria para una eficiente replicación de este virus en peces de agua caliente.

En la presente invención, se entiende por "identidad” o "identidad de secuencia” al grado de similitud entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos obtenido mediante el alineamiento de las dos secuencias. Dependiendo del número de residuos comunes entre las secuencias alineadas, se obtendrá un grado de identidad expresado en tanto por ciento. El grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos puede determinarse por métodos convencionales, por ejemplo, mediante algoritmos estándar de alineamiento de secuencias conocidos en el estado de la técnica, como por ejemplo BLAST (Altschul S.F. et al. J Mol Biol. 1990 Oct 5; 215(3):403-10). Los programas BLAST, por ejemplo, BLASTN, BLASTX, and TBLASTX, BLASTP and TBLASTN, son de dominio público en la página web de The National Center for Biotechonology Information (NCBI).

La introducción del polipéptido en la célula puede hacerse por cualquiera de los procedimientos conocidos en el estado de la técnica, tales como inyección directa, electroporación, transfección, transformación, etc. pero se trata de técnicas relativamente complejas y con limitaciones cuando se tienen que aplicar in vivo y acceder a toda la población de células tumorales o que presentan una proliferación celular descontrolada. En caso de que el polipéptido vaya a administrarse a un individuo, el polipéptido puede introducirse en la célula mediante técnicas de terapia génica gracias el empleo de vectores virales, o mediante secuencias de internalización celular que permiten a polipéptido atravesar la membrana plasmática.

Así, en una realización particular, el polipéptido de la invención se encuentra covalentemente unido a una secuencia de aminoácidos de internalización celular.

En la presente invención se entiende por "secuencia de aminoácidos de internalización celular” o "secuencia de internalización celular” o "péptidos de penetración celular” (CPPs) a las secuencias de aminoácidos que poseen la habilidad de transportar moléculas a través de la membrana plasmática, sin pérdida de su integridad. Entre las secuencias más empleadas se encuentran TAT, Antennapedia (Antp) y oligo-argininas, cuya característica en común es la presencia de grupos de aminoácidos catiónicos. Estas secuencias de internalización permiten la internalización del polipéptido directamente a la célula. Como entiende el experto en la materia, el polipéptido de internalización celular puede proceder de una fuente natural, o puede proceder de la síntesis química y ser una secuencia artificial que no existe en la naturaleza. Asimismo, el polipéptido de internalización celular puede estar unido a marcadores (por ejemplo, sin limitar a, fluoróforos) que faciliten su localización.

La secuencia de internalización celular puede estar unida al polipéptido de la invención tanto al extremo amino terminal como al extremo carboxilo terminal del polipéptido.

Tal como se ha indicado previamente, el polipéptido de la invención puede obtenerse por técnicas ampliamente conocidas en el estado de la técnica, como la expresión en una célula del polinucleótido que codifica el polipéptido de la invención, y su posterior aislamiento. Por lo tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un polinucleótido, de aquí en adelante "polinucleótido de la invención”, que codifica el polipéptido de la invención.

El término "polinucleótido", según se usa en la presente invención, se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud y formada por ribonucleótidos y/o deoxiribonucleótidos. El término incluye tanto polinucleótidos de cadena sencilla como de cadena doble, así como polinucleótidos modificados, es decir, polinucleótidos metilados, protegidos y similares. El polinucleótido de la invención puede ser ADN, ARN o ADNc.

En un segundo aspecto la presente invención se refiere por tanto al polinucleótido que codifica para el polipéptido de la invención. En una realización preferida, el polinucleótido de la invención se selecciona de la lista que consiste en: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 y/o cualquier combinación de las mismas. En otra realización más preferida aún, el polinucleótido de la invención se selecciona de la lista que consiste en SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 19. En otra realización más preferida aún, el polinucleótido de la invención es el polinucleótido de SEQ ID NO: 19.

En otro aspecto, la invención se relaciona con una construcción génica, de aquí en adelante “construcción génica de la invención”, que comprende el polinucleótido de la invención.

Preferiblemente, la construcción génica de la invención comprende el polinucleótido de la invención operativamente unido a secuencias reguladoras de la expresión del polinucleótido de la invención. En principio, cualquier promotor puede ser utilizado en las construcciones génicas de la presente invención, siempre que dicho promotor sea compatible con las células en las que se desea expresar el polinucleótido.

Un promotor, o región promotora, es una secuencia de nucleótidos que controla la transcripción de un gen determinado (secuencias nucleotídicas). En la presente invención se refiere a una secuencia de nucleótidos que controla la transcripción del polinucleótido de la invención. Las secuencias promotoras pueden ser unidireccionales o bidireccionales. Un promotor unidireccional es aquel que controla la transcripción de un gen o de más genes que se sitúan en tándem con el primero. “En tándem” se refiere a que el extremo 3’ del primer gen va seguido, bien consecutivamente o separados por una determinada secuencia nucleotídica, por el extremo 5’ del segundo gen. Un promotor bidireccional se refiere a la región promotora que controla la transcripción en dos direcciones opuestas, es decir, que un promotor bidireccional dirige la transcripción de dos genes situados de manera divergente, es decir en sentido opuesto, estando el extremo 5’ de ambas secuencias nucleotídicas más cercano entre sí que el extremo 3’. En la presente invención se utilizan los términos “promotor” y “región promotora” indistintamente. Además, los promotores en la presente invención pueden ser constitutivos o inducibles. El término “inducible”, tal y como se emplea en la presente descripción, se refiere a la posibilidad de que el promotor tenga un elemento de control que permita activar o desactivar (reprimir) la transcripción del gen que regula, en presencia de un factor externo al promotor.

Adicionalmente, la construcción génica de la invención puede contener marcadores o etiquetas que permiten el aislamiento del polipéptido de la invención una vez que es sintetizado en la célula.

Por otro lado, el polinucleótido o la construcción génica de la invención pueden estar formando parte de un vector. Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con un vector, de aquí en adelante "vector de la invención”, que comprende el polinucleótido o la construcción génica de la invención.

El experto en la materia apreciará que no existe limitación en cuanto al tipo de vector que puede ser utilizado, ya que dicho vector puede ser un vector de clonaje adecuado para la propagación o un vector de expresión. Así, vectores adecuados de acuerdo a la presente invención incluyen, sin limitar a, (i) vectores de expresión en procariotas tales como pUC18, pUC19, Bluescript y sus derivados, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColEl, pCRl, RP4, fagos y vectores "shuttle" tales como pSA3 and pAT28, (ii) vectores de expresión en levaduras tales como vectores del tipo de plásmidos de 2 micras, plásmidos de integración, vectores YEP, plásmidos centroméricos y similares, (iii) vectores de expresión en células de insectos tales como los vectores de la serie pAC y de la serie pVL, (iv) vectores de expresión en plantas tales como vectores de la serie pIBI, pEarleyGate, pAVA, pCAMBIA, pGSA, pGWB, pMDC, pMY, pORE y similares y (v) vectores de expresión en células eucariotas superiores bien basados en vectores virales, entre los que se incluyen, sin limitar a, adenovirus, virus asociados a los adenovirus así como retrovirus y lentivirus, así como vectores no virales entre los que se incluyen, sin limitar a, pSilencer 4.1-CMV (Ambion), pcDNA3, pcDNA3.1/hyg pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEFVHis, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Ze02, pTRACER HCMV, pUB6N5-His, pVAXl, pZeoSV2, pCl, pSVL and pKSV-10, pBPV-1, pML2d y pTDTl.

El vector de la invención puede ser utilizado para transformar, transfectar o infectar células susceptibles de ser transformadas, transfectadas o infectadas por dicho vector.

Dichas células pueden ser procariotas o eucariotas. A modo de ejemplo, el vector donde se introduce dicha secuencia de ADN puede ser un plásmido o un vector que, cuando se introduce en una célula hospedadora, se integra en el genoma de dicha célula y se replica junto con el cromosoma/s en el/los que se ha integrado. La obtención de dicho vector puede realizarse por métodos convencionales conocidos por los técnicos en la materia.

Por lo tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con una célula, de aquí en adelante "célula de la invención”, que comprende un polipéptido, un polinucleótido, una construcción génica o un vector según la presente invención, para lo cual dicha célula ha podido ser transformada, transfectada o infectada con la construcción o el vector proporcionados por esta invención. Células transformadas, transfectadas o infectadas pueden ser obtenidas por métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia. En una realización particular, dicha célula hospedadora es una célula animal, preferentemente una célula de mamífero y más preferentemente una célula humana, transfectada o infectada con un vector apropiado.

Células huésped adecuadas para la expresión del polipéptido de la invención incluyen, sin limitar a, células de mamíferos, células de plantas, células de insectos, células de hongos y células bacterianas. Células de mamíferos adecuadas para en la presente invención incluyen líneas celulares epiteliales (porcinas, humanas, etc.), líneas celulares de osteosarcoma (humanas, etc.), líneas celulares de neuroblastoma (humanas, etc.), carcinomas epiteliales (humanos, etc.), células gliales (murinas, humanas, etc.), líneas celulares hepáticas (de mono, etc.), células CHO (Chinese Hamster Ovary), células COS, células BHK, células HeLa, 911, AT1080, A549, 293 o PER.C6, células ECCs humana 5 NTERA-2, células D3 de la línea de mESCs, células troncales embrionarias humanas tales como HS293 y BGV01, SHEF1, SHEF2 y HS181, células NIH3T3, 293T, REH Y MCF-7 y células hMSCs (human mesenchymal stem cells), y células GliNS2 (células madre de glioma).

Usos del polipéptido de la invención

Los inventores han descubierto que la proteína NV del virus VHSV (SEQ ID NO: 2), así como las variantes o mutantes que se derivan de dicha proteína y que se describen en la presente invención, y más particularmente las variantes de SEQ ID NO: 10, 16 y 20, más particularmente la variante de SEQ ID NO: 20, son capaces de inhibir la proliferación celular, por arresto celular en la fase G2/M, en particular, de inhibir la proliferación de células tumorales, preferentemente células HeLa, y también de promover la muerte celular de las células que expresan dichas variantes, lo que permite el empleo de los polipéptidos de la invención en el tratamiento de desórdenes proliferativos, tales como tumores o cáncer, presentes en un sujeto.

Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la SEQ ID NO: 2, en elaboración de un medicamento. Alternativamente, la presente invención se refiere a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la SEQ ID NO: 2 para su uso como medicamento. Las técnicas y procedimientos para elaborar medicamentos son descritas más adelante.

Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la SEQ ID NO: 2, en elaboración de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de tumores, proliferación celular y/o metástasis. Alternativamente, la presente invención se refiere a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la SEQ ID NO: 2 para su uso como medicamento para la prevención y/o tratamiento de tumores, proliferación celular y/o metástasis. Las técnicas y procedimientos para elaborar medicamentos son descritas más adelante.

En una realización preferida de estos aspectos de la invención, el polipéptido comprende la SEQ ID NO: 2. En otra realización preferida, el polipéptido es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 99% con la SEQ ID NO: 2, y además una sustitución del aminoácido ácido aspártico (D) original por alanina (A) en la posición 41 (D41A), o una sustitución del aminoácido ácido aspártico (D) original por alanina (A) en la posición 36 (D36A), o una sustitución del aminoácido arginina (R) original por alanina (A) en la posición 39 (R39A).

En otra realización preferida de los usos de los polipéptidos de la invención, estos se caracterizan por que el polipéptido se selecciona de la lista que consiste en SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 20. En otra realización más preferida aún, el polipéptido es el polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 20.

En otra realización preferida de los usos de los polipéptidos de la invención, éstos se caracterizan por que los tumores son es benignos o malignos y/o para prevenir la proliferación celular y/o prevenir la metástasis.

En la presente invención se entiende por “tratamiento” al conjunto de medios que se utilizar para tratar, aliviar o curar una enfermedad, en particular, enfermedades que cursan con desórdenes proliferativos, tales como tumores o cáncer.

En esta memoria se entiende por “desordenes proliferativos” a todo crecimiento de un tejido por la proliferación incontrolada de células, tales como por ejemplo, hiperplasia prostática benigna, adenomatosis familiar, poliposis, neurofibromatosis, psoriasis, proliferación de células lisas vasculares asociada con aterosclerosis, fibrosis pulmonar, artritis, glomerulonefritis y estenosis y reestenosis posquirúrgicas. Los desórdenes proliferativos, también a veces denominados tumores, pueden ser benignos o malignos. Se considera que un tumor es benigno cuando las células que forman el tumor no invaden otros tejidos ni causan metástasis en otras partes del cuerpo. Normalmente, el tumor benigno está bien encapsulado y las células no presentan cambios de estructura. Por el contrario, se considera que un tumor es maligno cuando las células que forman el tumor invaden los tejidos adyacentes, lo que se conoce como metástasis, y sus células presentan anaplasia. En general, los tumores malignos se conocen como cáncer. Así, en una realización particular, “desórdenes proliferativos malignos” o “tumores malignos”, comprenden, pero sin limitar: carcinoma tal como de vejiga, mama, colon, riñón, hígado, pulmón, incluyendo cáncer de pulmón de células pequeñas, esófago, vesícula biliar, ovario, páncreas, estómago, cuello uterino, tiroides, próstata y piel, incluyendo carcinoma de células escamosas; tumores hematopoyéticos de linaje linfoide, incluyendo leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de células B, linfoma de células T, linfoma de Hodgkin, linfoma de no Hodking, linfoma de células pilosas, y linfoma de Burkett; tumores hematopoyéticos de linaje mieloide, incluyendo leucemias mielogénicas agudas y crónicas, síndrome mielodisplásico y leucemia promielocítica; tumores de origen mesenquimático, incluyendo fibrosarcoma y rabdomiosarcoma; tumores del sistema nervioso central y periférico, incluyendo astrocitoma, neuroblastoma, glioma y schwannommas; otros tumores, incluyendo melanoma, seminoma, teratocarcinoma, osteosarcoma, xeroderma pigmentario, queratoacantoma, cáncer folicular de tiroide y sarcoma de Kaposi.

Es conocido en el estado de la técnica de la existencia de células madre tumorales o cancerosas que, además de poseer las propiedades típicas de una célula madre, es decir, la autorenovación y la habilidad de diferenciarse en múltiples tipos de células, son resistentes a los tratamientos convencionales y persisten en los tumores como una población distinta, causando la recaída y la metástasis del tumor al dar crecimiento u origen a nuevos tumores. Así, en una realización particular, el tumor comprende células madre, en particular, células madre tumorales.

Además de las aplicaciones terapéuticas que pueden tener los péptidos de la invención y los aspectos inventivos derivados de él, también es posible su aplicación en ensayos experimentales in vitro. Por lo tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con uso de los polipéptidos descritos en el presente apartado como reactivo para inhibir in vitro la proliferación celular.

Así otro aspecto de la invención se refiere al uso de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% con la SEQ ID NO: 2, como reactivo para inhibir in vitro la proliferación celular. En una realización más preferida, el polipéptido comprende la SEQ ID NO: 2.

En otra realización más preferida de este aspecto de la invención el polipéptido comprende los polipéptidos, polinucleótidos, la construcción génica, el vector o la célula de la invención. En otra realización más preferida, el polipéptido comprende las secuencias de la lista que consiste en: SEQ ID NO: 10, 16 o 20. En otra realización más preferida aún, el polipéptido comprende la SEQ ID NO: 20.

En la presente invención se entiende por “inhibición de la proliferación celular” a la reducción, disminución, atenuación o bloqueo de la división o ciclo celular.

En la presente invención se entiende por "sujeto” a cualquier animal, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un primate, en particular, un ser humano, de cualquier raza, sexo o edad.

Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% con la SEQ ID NO: 2, como reactivo para inhibir in vitro la expresión de proteínas inflamatorias seleccionadas de la lista que consiste en: mx, ERK-1 e IL-8; o la actividad de proteínas reguladoras del ciclo celular seleccionada de la lista que consiste en ciclina B y A. En una realización preferida del presente aspecto de la invención, éste se caracteriza por que el polipéptido comprende la SEQ ID NO: 2. En una realización más preferida, el polipéptido de la invención se caracteriza por que inhibe la expresión de ERK-1 y de las ciclinas A y B.

En otra realización preferida, este aspecto de la invención se caracteriza por que el polipéptido comprende al menos uno de los polipéptidos de la presente invención, más preferiblemente comprende un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 99% con la SEQ ID NO: 2 y una sustitución del aminoácido ácido aspártico (D) original por alanina (A) en la posición 41 (D41A), o una sustitución del aminoácido ácido aspártico (D) original por alanina (A) en la posición 36 (D36A), o una sustitución del aminoácido arginina (R) original por alanina (A) en la posición 39 (R39A). En otra realización más preferida el polipéptido comprende la SEQ ID NO: 10, 16, 20 y/o cualquiera de sus combinaciones.

Composición farmacéutica de la invención

Tal como se ha explicado en el aspecto inventivo anterior, el polipéptido, polinucleótido, construcción génica, vector o la célula de la invención pueden emplearse en la elaboración de una composición farmacéutica.

Por lo tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con una composición farmacéutica, de aquí en adelante, composición farmacéutica de la invención, que comprende un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% con la SEQ ID NO: 2, según se describe en la presente invención, en una cantidad terapéuticamente efectiva, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En la presente invención se entiende por “composición farmacéutica” o “medicamento” a toda preparación o forma farmacéutica, cuya fórmula de composición expresada en unidades del sistema internacional, está constituida por una sustancia o mezcla de sustancias, con peso, volumen y porcentajes constantes, elaborada en laboratorios farmacéuticos legalmente establecidos, envasada o etiquetada para ser distribuida y comercializada como eficaz para diagnóstico, tratamiento, mitigación y profilaxis de una enfermedad, anomalía física o síntoma, o el restablecimiento, corrección o modificación del equilibrio de las funciones orgánicas de los seres humanos y de los animales. La elaboración de la composición farmacéutica puede llevarse por cualquiera de los métodos descritos en el estado de la técnica.

La dosificación para obtener una cantidad terapéuticamente efectiva depende de una variedad de factores, como por ejemplo, la edad, peso, sexo o tolerancia, del mamífero. En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad mínima del compuesto o de la composición farmacéutica de la invención necesaria para que produzca el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otros factores, por las características propias de dicho compuesto o dicha composición farmacéutica y el efecto terapéutico a conseguir. Los “adyuvantes” y/o “vehículos farmacéuticamente aceptables” que pueden ser utilizados en las composiciones de la invención son ampliamente conocidos en el estado de la técnica.

En la presente descripción, el término "vehículo" se refiere a un diluyente o excipiente con el que se administra el principio activo. Tales vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluyendo aquellos de origen del petróleo, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares, o puede proceder de una fuente natural o ser un diluyente o excipiente que no existe forma natural. Se emplean preferiblemente como vehículos agua o disoluciones acuosas de solución salina y disoluciones acuosas de dextrosa y glicerol, particularmente para las disoluciones inyectables. Preferiblemente, los vehículos de la invención están aprobados por la agencia reguladora de un gobierno de estado o el federal o están enumerados en la Farmacopea Estadounidense u otra farmacopea reconocida en general para su uso en animales, y más particularmente en seres humanos. Los vehículos y las sustancias auxiliares necesarios para fabricar la forma farmacéutica deseada de administración de la composición farmacéutica de la invención dependerán, entre otros factores, de la forma farmacéutica de administración elegida. Dichas formas farmacéuticas de administración de la composición farmacéutica se fabricarán según métodos convencionales conocidos por el experto en la técnica.

En una realización preferida de la composición farmacéutica de la invención, esta se caracteriza por que el polipéptido comprende la SEQ ID NO: 2.

En otra realización preferida de la composición de la invención, ésta se caracteriza por que el polipéptido tiene una identidad de secuencia de al menos un 99% con la SEQ ID NO: 2, y además una sustitución del aminoácido ácido aspártico (D) original por alanina (A) en la posición 41 (D41A), o una sustitución del aminoácido ácido aspártico (D) original por alanina (A) en la posición 36 (D36A), o una sustitución del aminoácido arginina (R) original por alanina (A) en la posición 39 (R39A). Preferiblemente, el polipéptido comprende la SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 16 y/o cualquier combinación de las mismas. En una realización más preferida, la composición farmacéutica de la invención puede comprender además al menos uno de los polipéptidos que se seleccionan de la lista que consiste en: SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26 y/o cualquiera de sus combinaciones.

Las composiciones de la presente invención pueden formularse para su administración a un animal, y más preferiblemente a un mamífero, incluyendo al hombre, en una variedad de formas conocidas en el estado de la técnica. Así, pueden estar, sin limitarse a, en soluciones acuosas o no acuosas, en emulsiones o en suspensiones. Alternativamente, las composiciones pueden prepararse para su administración en forma sólida. Las composiciones pueden combinarse con varios vehículos o excipientes inertes, incluyendo pero sin limitarse a: aglutinantes, excipientes, agentes dispersantes, lubricantes, deslizantes, agentes edulcorantes, o agentes aromatizantes. Adicionalmente, la composición de la invención puede comprender un adyuvante. Por "adyuvante" se entiende cualquier substancia que intensifica la efectividad de la composición farmacéutica de la invención.

En una realización particular, la composición farmacéutica de la invención comprende, además, un agente quimioterapéutico.

Por "agente quimioterapéutico", se entiende cualquier substancia que es capaz de inhibir la proliferación celular sin matar a la célula necesariamente, o que es capaz de inducir la muerte celular. Los agentes capaces de inhibir la proliferación celular sin provocar muerte celular se denominan de forma genérica, agentes citostáticos, mientras que aquellos que son capaces de inducir la muerte celular normalmente mediante la activación de la apoptosis se denominan de forma genérica agentes citotóxicos. Ejemplos no limitativos de agentes quimioterapéuticos adecuados para su uso en las composiciones de la invención incluyen, sin limitar a, (i) agentes estabilizantes de microtúbulos tales como taxanos, paclitaxel, docetaxel, epothilonas y laulimalides, (ii) inhibidores de quinasas tales como Iressa(R), Gleevec, Tarceva™, (Erlotinib HCl), BAY-43-9006, (iii) anticuerpos específicos para receptores con actividad quinasa incluyendo, sin limitarse a, Trastuzumab (Herceptin(R)), Cetuximab (Erbitux(R)), Bevacizumab (Avastin™), Rituximab (ritusan(R)), Pertuzumab (Omnitarg™); (iv) inhibidores de la ruta mTOR, tales como rapamicina y CCI-778; (v) Apo2L1Trail, (vi) agentes anti-angiogenicos tales como endostatina, combrestatina, angiostatina, trombospondina y el inhibidor del crecimiento endotelial vascular (VEGI); (vii) vacunas antineoplásicas incluyendo células T activadas, agentes inmunopotenciadores inespecíficos (por ejemplo interferones, interleuquinas); (viii) agentes citotóxicos antibióticos tales como doxorubicina, bleomcina, dactinomicina, daunorubicina, epirubicina, mitomicina, mitozantrona, etc; (ix) agentes alquilantes tales como Melphalan, Carmustina, Lomustina, ciclofosfamida, ifosfamide, Clorambucilo, Fotemustine, Busulfano, Temozolomida y thiotepa; (x) agentes hormonales antineoplásicos tales como Nilutamida, acetato de ciproterona, anastrozol, Exemestano, Tamoxifeno, Raloxifeno, Bicalutamida, Aminoglutetimida, acetato de leuprorelina, citrato de Toremifeno, Letrozol, Flutamida, acetato de Megestrol y acetato de goserelina; (xi) hormonas gonadales tales como acetato de ciproterona y acetato de medoxiprogesterone; (xii) antimetabolitos tales como Citarabina, Fluorouracilo, Gemcitabina, Topotecano, Hidroxyurea, Tioguanina, Metotrexato, Colaspasa, Raltitrexedo y capicitabina; (xiii) agentes anabólicos tales como nandrolone; (xiv) hormonas adrenales esteroideas tales como acetato de metilprednisolona, dexametasone, hidrocortisona, prednisolona y prednisona; (xv) agentes antineoplásicos tales como Carboplatino, Cisplatino, Oxaliplatino, Etoposido and Dacarbazina e (xvi) inhibidores de topoisomerasa tales como topotecana e irinotecano.

Tales composiciones y/o sus formulaciones pueden administrarse a un animal, incluyendo un mamífero y, por tanto, al hombre, en una variedad de formas, incluyendo, pero sin limitarse a, intraperitoneal, intravenoso, intramuscular, subcutáneo, intratecal, intraventricular, intraarticular, intratumoral, oral, enteral, parenteral, intranasal, ocular o tópica. Una vía de administración preferida de las composiciones y/o formulaciones del compuesto de la invención para la prevención o el tratamiento de un cáncer es la vía intratumoral. En una realización particular, la composición farmacéutica de la invención está formulada para su administración oral, parenteral, nasal o sublingual.

Kit de la invención

La administración del polipéptido de la invención requiere una serie de componentes que pueden disponerse juntos en forma de pack o kit.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un kit, de aquí en adelante "kit de la invención”, que comprende un polipéptido, un polinucleótido, una construcción génica, un vector o una célula de la invención descritos en los aspectos inventivos anteriores junto a sus correspondientes realizaciones particulares.

Particularmente, el kit de la invención comprende un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% con la SEQ ID NO: 2. Mas preferiblemente, el polipéptido comprende la SEQ ID NO: 2.

En otra realización particular del kit de la invención, este se caracteriza por que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 99% con la SEQ ID NO: 2 y, además, una sustitución del aminoácido ácido aspártico (D) original por alanina (A) en la posición 41 (D41A), una sustitución del aminoácido ácido aspártico (D) original por alanina (A) en la posición 36 (D36A), o una sustitución del aminoácido arginina (R) original por alanina (A) en la posición 39 (R39A). Más preferiblemente, el polipéptido se selecciona de la lista que consiste en SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 16. En una realización más preferida el kit de la invención comprende los péptidos de SEQ ID NO: 2, 20, 10 y 16. En otra realización más preferida, el kit de la invención comprende además, los péptidos que comprenden la SEQ ID NO: 22 y/o SEQ ID NO: 26.

Componentes útiles para la administración del polipéptido de la invención y que pueden estar comprendidos dentro del kit incluyen, pero no se limitan a, solución tampón, solución de lisis, material estéril (jeringuillas, hisopos, torundas, pinzas, etc.), agua destiladas, alcoholes (etanol), etc. Adicionalmente, el kit puede contener instrucciones o indicaciones que guíen al experto en la materia en la administración del polipéptido de la invención.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso del kit de la invención para la determinación del efecto de dicho polipéptido de la invención en la tumorigenicidad de una línea celular, para inhibir in vitro la proliferación celular y/o para inhibir in vitro la actividad de proteínas inflamatorias seleccionadas de la lista que consiste en: mx, ERK-1 e IL-8; preferiblemente ERK-1, o la actividad de proteínas reguladoras del ciclo celular seleccionada de la lista que consiste en ciclina B y A.

Los términos y expresiones empleados en el presente aspecto inventivo ya han sido definidos en aspectos inventivos anteriores.

Método de tratamiento de la invención

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para el tratamiento y/o la prevención de tumores en un sujeto, tanto benignos como malignos (cáncer o metástasis), que comprende la administración a dicho sujeto de una cantidad terapéuticamente efectiva del polipéptido, del polinucleótido, de la construcción génica, del vector, de la célula o de la composición farmacéutica según la invención.

La invención también se relaciona con un método para inhibir (in vitro/in vivo) la actividad de las proteínas inflamatorias seleccionadas de la lista que consiste en: mx, ERK-1 e IL-8; preferiblemente ERK-1, o la actividad de proteínas reguladoras del ciclo celular seleccionada de la lista que consiste en ciclina B y A.

Los términos y expresiones empleados en el presente aspecto inventivo ya han sido definidos en aspectos inventivos anteriores. A su vez, todas las realizaciones particulares anteriormente descritas en la presente invención son aplicables a los métodos de la invención.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

FIG. 1. Análisis de la mortalidad de células EPC que expresan la proteína NVGFP (A) o GFP (B). Cuantificación de la mortalidad de células EPC que expresan la proteína NVGFP o GFP (C), siendo la diferencia entre ellas estadísticamente significativa (p<0.05).

Fig. 2. Análisis de la expresión del gen mx en células ZF4 transfectadas con los plásmidos que codifican para la proteína NV nativa (wild-type) de VHSV y las diferentes mutantes de NV descritas en la presente invención. Los asteriscos (*) denotan diferencias estadísticamente significativas (p<0.05) con respecto a la proteína NV de VHSV nativa (wt-NV VHSV).

Fig. 3. Análisis de la expresión del gen mx en células ZF4 transfectadas con los plásmidos que codifican para la proteína NV nativa (wild-type), las diferentes mutantes de NV descritas en la presente invención y las proteínas NV de IHNV, SHRV y HIRV. Los asteriscos (*) denotan diferencias estadísticamente significativas (p<0.05) con respecto a la proteína NV de VHSV nativa (wt-NV VHSV).

Fig. 4. Análisis de la expresión del gen IL8 en células ZF4 transfectadas con plásmidos que codifican para la proteína NV nativa (wild-type) de VHSV y las diferentes mutantes de NV descritas en la presente invención. Los asteriscos (*) denotan diferencias estadísticamente significativas (p<0.05) con respecto a la proteína NV de VHSV nativa (wt-NV VHSV).

Fig. 5. Análisis de la expresión del gen ccnbl que codifica para la proteína ciclina B1 en células ZF4 transfectadas con plásmidos que codifican para la proteína NV nativa (wild-type) de VHSV y para las diferentes mutantes NV de VHSV de la invención. En la gráfica se muestra además la expresión del gen IL8 para ver la correlación existente entre ambos genes. Los asteriscos (*) denotan diferencias estadísticamente significativas (p<0.05) con respecto a la proteína NV de VHSV nativa (wt-NV VHSV).

Fig. 6. Análisis de la expresión génica de ccnal, ccndl y ccnel en células HeLa tras el tratamiento por transfección con plásmidos que expresan la proteína NV41 (SEQ ID NO: 20), NV41GFP (SEQ ID NO: 64) a 96hpt o control a 48hpt (Control48).

Fig. 7. Análisis de la expresión génica de ccnbl en células HeLa tras el tratamiento por transfección con plásmidos que expresan a 48hpt y 96hpt la proteína NV41 (SEQ ID NO: 20), NV41GFP (SEQ ID NO: 64), GFP (SEQ ID NO: 30) a 48hpt o control a 48hpt.

Fig. 8. Análisis de la expresión génica de erkl en células HeLa tras el tratamiento por transfección a 48 y 96hpt con plásmidos que expresan la proteína NV41 (SEQ ID NO: 20), NV41GFP (SEQ ID NO: 64) o control (a 48hpt).

Fig. 9. Valores de Ct obtenidos en la qPCR para los genes gadph (barras grises) y erkl (barras negras) en las muestras analizadas de células HeLa transfectadas con el plásmido NV41 (SEQ ID NO: 21) a 48hpt, 96hpt y comparadas con un control a 48h. Fig. 10. Análisis de la expresión proteica de la quinasa ERK1 en células HeLa transfectadas con plásmidos que expresan las proteínas GFP (SEQ ID NO: 30), NV41 (SEQ ID NO: 20) o control a 48hpt y 96hpt. Los datos están normalizados por GFP a 48hpt para las muestras a este tiempo, y por el control a 96hpt para las muestras a este tiempo.

Fig. 11. Análisis de la expresión proteica de ciclina B en células HeLa transfectadas con plásmidos que expresan las proteínas GFP (SEQ ID NO: 30), NV41 (SEQ ID NO: 20) a 48hpt y 96hpt o control a 48hpt y 96hpt. Los datos se han normalizado con la expresión de GFP a 48hpt.

Fig. 12. Análisis de la expresión proteica de ciclina A en células HeLa transfectadas con plásmidos que expresan las proteínas GFP (SEQ ID NO: 30), NV41 (SEQ ID NO: 20) o control a 48hpt y 96hpt. Los datos se han normalizado mediante la expresión de GFP a 48hpt.

EJEMPLOS

A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la efectividad del producto de la invención.

MATERIAL Y MÉTODOS

Líneas celulares

Las líneas celulares utilizadas fueron HeLa, de carcinoma de cérvix (ATCC® CCL-2™), la línea celular de pez cebra (Danio rerio) ZF4 (ATCC® CRL-2050™) y la línea celular de pez EPC (ATCC® CRL-2872™). Todas ellas se crecieron en atmósfera del 5% de CO2, con medio DMEM:F12 (SIGMA, España) las células ZF4 y HeLa, y las células EPC con medio RPMI 1640 (SIGMA, España). Los medios se suplementaron con 2 mM L-glutamina (Gibco, EEUU), 1mM piruvato sódico (Gibco, EEUU), penicilina/estreptomicina (Gibco, EEUU) y suero de ternera fetal (FBS) al 10%. Las células ZF4 se mantuvieron a 28°C y el resto de líneas a 37°C.

Plásmidos utilizados

Mediante técnicas estándar de PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) se obtuvo la secuencia primaria del gen NV de la cepa del virus VHSV-07.71 (GenBank n° AJ233396: SEQ ID NO: 1). Este gen se clonó en un vector de expresión denominado pMCV 1.4 que comprende el promotor de citomegalovirus. A partir de la secuencia nucleotídica de la NV natural del VHSV (SEQ ID NO: 1) se obtuvieron nueve proteínas NV mutadas donde cada una de las proteínas mutadas comprendía el cambio del aminoácido original por alanina (A) entre las posiciones 33 a 41, ambas inclusive, de la SEQ ID NO: 2. Los mutantes obtenidos son: L33A (SEQ ID NO: 4), N34A (SEQ ID NO: 6), C35A (SEQ ID NO: 8), D36A (SEQ ID NO: 10), F37A (SEQ ID NO: 12), D38A (SEQ ID NO: 14), R39A (SEQ ID NO: 16), S40A (SEQ ID NO: 18), D41A (SEQ ID NO: 20).

Las proteínas mutantes L33A (SEQ ID NO: 4), D36A (SEQ ID NO: 10) y R39A (SEQ ID NO: 16), se generaron mediante PCR usando cebadores solapantes, y se clonaron en el mismo vector que se ha utilizado anteriormente, el vector pMCV 1.4. Por otro lado, los mutantes N34A (SEQ ID NO: 6), C35A (SEQ ID NO: 8), F37A (SEQ ID NO: 12), D38A (SEQ ID NO: 14), S40A (SEQ ID NO: 18) y D41A (SEQ ID NO: 20) mediante síntesis química (Invitrogen, Thermofisher, USA), y posteriormente se clonaron en el vector de expresión mencionado anteriormente, el vector pMCV 1.4.

Para los ejemplos comparativos incluidos en el presente documento, se ha utilizado el vector pMCV 1.4, mencionado anteriormente, en el que se han clonado las secuencias nucleotídicas que codifican para la proteína NV del virus IHNV (cepa Oregon69, UniProtKB: locus NV_IHNVO, n° de acceso Q08455 SEQ ID NO: 22), NV del virus SHRV (n° de acceso NC_000903.1 SEQ ID NO: 24), NV del virus HIRV (n° de acceso U47847.1 SEQ ID NO: 26) o la proteína fluorescente GFP (SEQ ID NO: 30).

Transfección de plásmidos

Células ZF4 o HeLa se distribuyeron en placas de cultivo de 24 pocillos (SPL Life Sciences Co., Ltd) a una concentración entre 50-100 x103 células/pocillo, 24 horas antes de su uso. Para la transfección de los diferentes plásmidos, indicados anteriormente, que codifican para las diferentes proteínas NVs naturales y mutantes descritas en la presente invención, se utilizó Lipofectamina 3000 siguiendo las indicaciones del fabricante (Thermofisher, USA). Las células ZF4 y EPC transfectadas con los diferentes plásmidos que codifican para las proteínas NVs nativas y mutantes de la presente invención se recogieron a las 48h post-transfección (hpt), mientras que para el caso de las células HeLa se recogieron a las 48hpt y 96hpt.

Extracción de RNA y retrotranscripción

Después del tiempo de transfección estimado, las células se recogen de las placas de cultivo mediante el uso de tripsina (Gibco, Thermofisher). Posteriormente, se lleva a cabo la extracción del RNA mediante el uso del kit comercial E.Z.N.A.® HP Total RNA Kit (OMEGA bio-tek, USA). Se realizó un paso adicional de incubación con DNAsa para asegurarnos que eliminamos completamente el DNA de cada muestra. La cuantificación del RNA se lleva a cabo mediante Nanodrop ND1000 (Thermo Scientific, USA). Para obtener el cDNA, se realizó una retrotranscripción del RNA con el kit PrimeScript™ RT reagent Kit (Takara, Japón) siguiendo las instrucciones de fabricante.

PCR cuantitativa (qPCR)

Para la cuantificación de los distintos RNAs, estos se retrotranscribieron a cDNAs y posteriormente se realizaron qPCRs utilizando diferentes parejas de cebadores (Tabla 3) y la tecnología SYBR green del kit comercial SYBR® Premix Ex Taq ™ (Tli RNaseH Plus) (TAKARA, Japón), siguiendo las instrucciones del fabricante. Para realizar la qPCR se utilizó el equipo de PCR en tiempo real ABI 7500 Fast (ABI, Thermofisher, USA). Los genes de referencia utilizados para normalizar la expresión de los genes de interés han sido el gen RPLP0 para los cultivos de células ZF4 y el gen GADPH para los cultivos de células HeLa. La fórmula para obtener la cantidad de expresión se basa el método Delta Ct, siendo DeltaCt = CtRef-Ctgen y los genes de referencia RPLP0 (ZF4) y GADPH (HeLa), y posteriormente calculando la potencia según la fórmula Pot= 2"Del*aCt

Tabla 3. Secuencias de los cebadores usados en qPCR. n ni - Ani ni -

n n i - An i n i -

Hosa: línea celular humana HeLa. Dre: Danio rerio (Pez cebra).

En el estudio comparativo de la expresión de transcritos en ZF4 con las diferentes versiones de la proteína NV, tanto nativas como mutantes, se realizó una normalización de cada valor de potencia de mx por su Potencia relativa de expresión. Así por ejemplo, para el mutante NV41, se hizo el ratio potencia de mx/potencia NV41.

Western-Blot

Con el fin de determinar la cantidad relativa de proteínas implicadas en favorecer la progresión de los tumores, se han utilizado células HeLa transfectadas con los plásmidos que expresan GFP y el mutante NV41 (SEQ ID NO: 20), y se compararon con un control de células no transfectadas. Los ensayos se realizaron a 48hpt y 96hpt. Mediante Western-blot (WB) se determinó mediante anticuerpos monoclonales (Santa Cruz Biotechnology, Quimigen) la cantidad de las proteínas ciclina B1 (anticuerpo monoclonal sc-245), ciclina A (anticuerpo monoclonal sc-271682) y la quinasa ERK1 (anticuerpo monoclonal sc-271269). Brevemente, las células transfectadas se recogieron a los tiempos de estudio mencionados y se extrajo la proteína total soluble con PBS en presencia de inhibidores de proteasas (cOmplete™ Protease Inhibitor Cocktail, Sigma-Aldrich), mediante 3 ciclos de congelación-descongelación. Una vez cuantificada por el espectrofotómetro Nanodrop 1000 (Thermo Scientific, USA), 10 microgramos de proteína total soluble se sometieron a PAGE-SDS al 10% y posterior transferencia a membrana de nitrocelulosa. A continuación, se llevó a cabo el WB de forma estándar usando las concentraciones de los anticuerpos monoclonales sugeridos por la casa comercial. La captura de imagen de los WB se realizó con el sistema de documentación Gel DocTM XR+ (BioRad) y la cuantificación relativa de las bandas se realizó con el software Image Lab v5.2 (BioRad). El estudio por WB se repitió en tres ensayos independientes.

Citometría de flujo

La viabilidad de las células EPC (Epithelioma Papulosum Cypríni) se analizó mediante citometría de flujo con el citómetro BD FACSCANTO II (BD Biosciences, España) a 48hpt con: (a) el plásmido que expresa la proteína GFP, y (b) el plásmido que expresa la construcción NVGFP, siendo la proteína NV la proteína nativa de SEQ ID NO: 1. Los resultados se analizaron con el programa FACSDiva v6.1.3. El estudio se realizó por duplicado.

Análisis estadístico

Los resultados obtenidos se muestran como media ± el error estándar de la media (SEM). Las diferencias significativas entre las medias de dos, tres o más conjuntos de datos se calcularon mediante ANOVA (One-way ANOVA). Las diferencias entre 2 conjuntos de datos y su nivel de significación se calcularon mediante el test t de Student. El criterio de significación estadística en todos los casos se estableció en p<0,05.

Ejemplo 1. La proteína NV de VHSV (SEQ ID NO: 2) incrementa la mortalidad de células EPC.

Se determinó la viabilidad celular de las células EPC (Epithelioma Papulosum Cypríni) mediante citometría de flujo a 48h post-transfección con: (a) el plásmido que comprende la secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 29 que codifica para la proteína GFP de SEQ ID NO: 30, y (b) el plásmido que comprende la secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 27, que codifica para la proteína NVGFP de SEQ ID NO: 28. Los resultados obtenidos demuestran que existe un incremento de la mortalidad (1.65 veces) de las células EPC transfectadas con el plásmido que codifica para la construcción NVGFP (SEQ ID NO: 28) respecto a las células EPC transfectadas con el plásmido que codifica para la proteína GFP (SEQ ID NO: 30) (Figura 1).

Este resultados evidencian que la proteína NV (SEQ ID NO: 2) induce un incremento de la mortalidad en las células en las que se expresa.

Ejemplo 2. Los mutantes de la invención inhiben la expresión génica de mx e IL-8 en células de pez cebra (ZF4).

El análisis de la expresión del gen mx en células ZF4 que expresan la proteína NV nativa de VHSV, wt-NV (SEQ ID NO: 2) o cualquiera de las mutantes analizadas en la presente invención: NV33 (SEQ ID NO: 4), NV34 (SEQ ID NO: 6), NV35 (SEQ ID NO: 8), NV36 (SEQ ID NO: 10), NV37 (SEQ ID NO: 12), NV38 (SEQ ID NO: 14), NV39 (SEQ ID NO: 16), NV40 (SEQ ID NO: 18) o NV41 (SEQ ID NO: 20), han puesto de manifiesto que los mutantes NV36 (SEQ ID NO: 10), NV39 (SEQ ID NO: 16) y NV41 (SEQ ID NO: 20) disminuyen la expresión génica de mx respecto a la NV natural (wt) (Figura 2). Específicamente, dichos mutantes NV36 (SEQ ID NO: 10), NV39 (SEQ ID NO: 16) y NV41 (SEQ ID NO: 20) inducen una inhibición de la expresión génica de mx del orden de 3.3 veces, 2 veces y 5 veces respectivamente, respecto de la proteína wt-NV.

Adicionalmente, también se analizó la expresión del gen mx en células ZF4 que expresan la proteína NV de otros novirhabdovirus diferentes tales como: IHNV (SEQ ID NO: 22), snakehead rabdovirus (SHRV) (SEQ ID NO: 24) e hirame rabdovirus (HIRV) (SEQ ID NO: 26). Los resultados evidencian que la proteína NV de SHRV (SEQ ID NO: 24) induce un incremento en la expresión del gen mx (Figura 3). Estos resultados son coherentes con la información existente en el estado de la técnica donde se muestra que la proteína NV de este virus no se comporta como el resto de proteínas NV de otros novirhabdovirus (Alonso M., et al. J Virol. 2004 Jun;78(11):5875-82).

Por otro lado, las proteínas NV de IHNV (SEQ ID NO: 22) e HIRV (SEQ ID NO: 26) inhiben la expresión de mx, incluso más que la NV natural de VHSV (SEQ ID NO: 2), pero menos que el mutante NV41 (SEQ ID NO: 20) (Figura 3).

Además del análisis de la expresión del gen mx, se analizó también la expresión del gen IL8 en células ZF4 transfectadas con los distintos plásmidos de NV descritos en la presente invención y mencionados anteriormente. Los resultados obtenidos han sido similares a los mostrados para el gen mx, siendo las células que expresan los mutantes NV36 (SEQ ID NO: 10), NV39 (SEQ ID NO: 16) y NV41 (SEQ ID NO: 20) las que mayor capacidad inhibitoria muestran de la expresión del gen IL8 (Figura 4).

Ejemplo 3. Los mutantes de la invención inhiben la expresión génica de la ciclina B1 en células de pez cebra (ZF4).

Además de la expresión de los genes mx e IL8, se analizó en células ZF4 que expresan las diferentes proteínas NV (mutantes y nativas) descritas en la invención, la expresión del gen ccnbl que codifica para la ciclina B1, proteína que regula un punto de control (checkpoint) G2/M del ciclo celular y que permite la mitosis de la célula.

Los resultados demuestran que los mutantes NV35 (SEQ ID NO: 8), NV36 (SEQ ID NO: 10), NV37 (SEQ ID NO: 12), NV39 (SEQ ID NO: 16) y NV41 (SEQ ID NO: 20) son los que mayor capacidad inhibitoria de la expresión del gen ccnbl presentan (Figura 5). Además, se analiza la correlación en la misma gráfica de los niveles de expresión de IL8 y ccnbl para observar el comportamiento de cada mutante, determinándose que son los mutantes NV36 (SEQ ID NO: 10), NV39 (SEQ ID NO: 16) y NV41 (SEQ ID NO: 20) son los que muestran una mayor inhibición de la expresión de ambos genes.

Ejemplo 4. La proteína mutante NV41 (SEQ ID NO: 20) inhibe la expresión génica de ERK1 y las ciclinas A y B en células de cáncer de cérvix (HeLa).

Una vez demostrada la capacidad inhibitoria de la proteína NV41 (SEQ ID NO: 20) sobre la transcripción del gen de la ciclina B1 (gen ccnbl) en células de pez cebra ZF4, se analizó el efecto que la proteína mutante NV41 (SEQ ID NO: 20) puede causar en las células tumorales humanas HeLa. Para ello, dichas células se transfectaron con los plásmidos que codifican para la proteína mutante NV41 (SEQ ID NO: 20), la proteína control GFP (SEQ ID NO: 20) y su comparación con un control (células no transfectadas analizadas a los mismos tiempos) y se cultivaron durante 48h y 96h post-transfección. Posteriormente se determinaron los niveles de expresión de las ciclinas A, B, D, E, proteínas que participan en el ciclo celular, y de la quinasa ERK1, como una molécula señalizadora y efectora de la vía MAPK, mediante PCR cuantitativa (qPCR).

El estudio en la línea celular HeLa mostró que la proteína mutante NV41 (SEQ ID NO: 20) inhibe la expresión de transcritos del gen ccnal que codifica para la ciclina A1 y de transcritos del gen ccnbl que codifica para la ciclina B1, respecto al control (células no transfectadas) a 48hpt, y dicha inhibición es aún mayor a 96hpt (Figura 6 y 7, respectivamente). Por otro lado, la ciclina D1 (codificada por el gen ccndl) aumenta su expresión de transcritos en aquellas células HeLa que expresan la proteína mutante NV41 (SEQ ID NO: 20), mientras que la ciclina E1 (codificada por el gen ccnel) permanece invariable en dichas células expresen o no la proteína mutante NV41 (SEQ ID NO: 20) (Figura 6). De la misma manera, los niveles de expresión de transcritos la ciclina B1 también disminuyeron en células HeLa que expresan NV41 (SEQ ID NO: 20) respecto a las células HeLa que expresan GFP (SEQ ID NO: 30), y a las que expresan la construcción NV41GFP (SEQ ID NO: 64) (Figura 7). Como se observa en dicha Figura 8, la expresión de NV41GFP (SEQ ID NO: 64) en células HeLa indujo un incremento en la concentración de transcritos del gen ccnbl (ciclina B1) tanto a 48hpt como a 96hpt.

Adicionalmente se analizaron los niveles de expresión génica de erkl por su relevancia como proteína señalizadora en la ruta MAPK. Los resultados pusieron de manifiesto que la expresión génica de erkl disminuye por acción de NV41 (SEQ ID NO: 20). Esta disminución de erkl es dependiente del tiempo ya que a 48hpt se observa una disminución en su expresión muy significativa, pero a 96hpt era tan baja que no se pudo detectar la expresión de dicho gen en las células HeLa que expresan NV41 (SEQ ID NO: 20) (Figura 8). Sin embargo, a este mismo tiempo (96hpt) se detectan los transcritos del gen control interno gadph (Figura 9), indicando que dicha ausencia de expresión no es debida a la degradación del cultivo celular, sino a la ausencia de expresión génica inducida por la proteína mutante NV41 (SEQ ID NO: 20).

Ejemplo 5. La proteína mutante NV41 (SEQ ID NO: 20) inhibe la expresión proteica de ERK1 y ciclina B1, y aumenta la expresión proteica de ciclina A1 en células HeLa.

Una vez demostrado que las diferentes proteínas mutantes descritas en la presente invención, particularmente el mutante NV41 (SEQ ID NO: 20), modulan la expresión génica de erkl, mx, IL-8, ciclina b1 y ciclina a1, se analiza si dicha modulación a nivel génico se produce también a nivel proteico.

Para ello se determinó la expresión proteica mediante Western-blot (WB) con el uso de anticuerpos monoclonales (ver materiales y métodos) que detectan ERK1, ciclina B1 y ciclina A1 en extractos celulares de células HeLa tratadas a distintos tiempos, como se ha descrito anteriormente. Como se observa en la Figura 10, las células HeLa transfectadas con el plásmido que expresa la proteína mutante NV41 (SEQ ID NO: 20) muestran una reducción de la expresión de ERK1 en un 32% respecto células tratadas con GFP (SEQ ID NO: 30), y un 26% respecto al control (células no transfectadas), analizadas a las 48hpt. Por otro lado, la expresión de ERK1 a 96hpt mostró que la expresión de GFP se redujo en un 4% respecto al control (células no transfectadas), mientras que las células HeLa transfectadas con el plásmido que expresa la proteína mutante NV41 (SEQ ID NO: 20) mostró una disminución en la expresión de ERK1 en un 45% respecto al control (células no transfectadas) (Figura 10).

Estos datos se correlacionan con los mostrados para la expresión génica de erkl (Figura 8) y demuestran que la proteína mutante NV41 inhibe la expresión génica y proteica de ERK1 al interferir en la vía MAPK.

A continuación se analizó la expresión proteica de las ciclinas B y A, a 48 y 96hpt, tal y como se ha indicado anteriormente. Respecto a la ciclina B1, las células HeLa a 48 hpt muestran una expresión reducida de dicha proteína cuando están tratadas con el plásmido que expresa la proteína mutante NV41 (SEQ ID NO: 20) en un 30% respecto a las células tratadas con GFP (SEQ ID NO: 30), y muestran un nivel similar al control (células no transfectadas) (Figura 11). La expresión de la ciclina B1 a 96hpt muestra que las HeLa tratadas con GFP (SEQ ID NO: 30) disminuyeron un 24% la expresión de ciclina B respecto al control (células no transfectadas), mientras que las células HeLa transfectadas con el plásmido que expresa la proteína mutante NV41 (SEQ ID NO: 20) disminuyó la expresión de ciclina B en un 43% respecto al control (células no transfectadas) (Figura 11). Además, se observa un 25% menos de ciclina B en las células HeLa tratadas con NV41 respecto a las tratadas con GFP. Estos datos se correlacionan con los datos obtenidos para la expresión génica de ccnbl, demostrando que la proteína mutante NV41 (SEQ ID NO: 20) disminuye los niveles génicos y proteicos de ciclina B.

Cuando se analiza la expresión proteica de ciclina A mediante WB, las células HeLa tratadas con GFP (SEQ ID NO: 30) o NV41 (SE ID NO: 20) durante 48 hpt mantienen la expresión de ciclina A respecto al control (células no transfectadas), aunque disminuye respecto a las células transfectadas con GFP (Figura 12). Sin embargo, a 96hpt la expresión de ciclina A aumenta en las células HeLa tratadas con NV41 (SEQ ID NO: 20) o GFP (SE ID NO: 30) respecto al control (células no transfectadas) y respecto a sus homologas a 48hpt (Figura 12). Sin embargo, se observa que a 96hpt las células HeLa tratadas con NV41 (SEQ ID NO: 20) disminuyen la ciclina A respecto a las células tratadas con GFP (SEQ ID NO: 30), indicando que NV41 inhibe la expresión de ciclina A en un 20%-30%. Estos resultados contrastan en parte con los mostrados en el Ejemplo 4 para la ciclina A, donde la expresión génica de ccnal tanto a 48hpt como a 96hpt disminuye por el tratamiento con la proteína mutante NV41 (SEQ ID NO: 20). Una explicación posible a este hecho es que no siempre hay correlación a tiempo real entre la cantidad de transcritos de mRNA y la cantidad de proteína. Este hecho podría deberse a que la proteína ciclina A podría tener una mayor vida media, es decir, se degrada menos y para poder detectar una disminución de la misma por inhibición de la expresión de mRNA, se debería de analizar dicha expresión a tiempos mayores que los llevados a cabo en los ejemplos mostrados aquí.

Claims (21)

REIVINDICACIONES

1. Variante de la proteína no viriónica del virus Oncorhynchus 2 novirhabdovirus que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 99% con la SEQ ID NO: 2, y una sustitución del aminoácido ácido aspártico (D) original por alanina (A) en la posición 41 (D41A), o una sustitución del aminoácido ácido aspártico (D) original por alanina (A) en la posición 36 (D36A), o una sustitución del aminoácido arginina (R) original por alanina (A) en la posición 39 (R39A), y que además inhibe la proliferación celular y/o metástasis.

2. Variante según la reivindicación 1 caracterizado por que comprende la SEQ ID NO: 20, la SEQ ID NO: 10 o la SEQ ID NO: 16.

3. Polinucleótido que codifica una variante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2.

4. Construcción génica que comprende un polinucleótido según la reivindicación 3.

5. Vector que comprende un polinucleótido según la reivindicación 3 o una construcción génica según la reivindicación 4.

6. Célula que comprende una variante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, un polinucleótido según la reivindicación 3, una construcción génica según la reivindicación 4 o un vector según la reivindicación 5.

7. Uso de una variante según la reivindicación 1, en elaboración de un medicamento.

8. Uso de una variante según la reivindicación 1, en elaboración de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de tumores, proliferación celular y/o metástasis.

9. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 8 donde la variante comprende la SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 16 y/o cualquier combinación de las mismas.

10. Uso según la reivindicación 8, en el que el tumor es tumor maligno o benigno.

11. Uso según la reivindicación 10, en el que el tumor maligno es cáncer.

12. Uso de una variante según la reivindicación 1, como reactivo para inhibir in vitro la proliferación celular.

13. Uso según la reivindicación 12 donde la variante comprende la SEQ ID NO:

20, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 16 y/o cualquier combinación de las mismas.

14. Uso de una variante según la reivindicación 1, como reactivo para inhibir in vitro la expresión de la proteína ERK-1; o la actividad de proteínas reguladoras del ciclo celular seleccionada de la lista que consiste en ciclina B y A.

15. Uso según la reivindicación 14 donde el polipéptido comprende la SEQ ID NO:

20, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 16 y/o cualquier combinación de las mismas.

16. Composición farmacéutica que comprende una variante según la reivindicación 1, en una cantidad terapéuticamente efectiva, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

17. Composición farmacéutica según la reivindicación 16 caracterizada por que la variante comprende la SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 16 y/o cualquier combinación de las mismas.

18. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 17 que comprende, además, un agente quimioterapéutico.

19. Kit que comprende una variante según la reivindicación 1.

20. Kit según la reivindicación 19, donde la variante se selecciona de la lista que consiste en SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 16 y/o cualquier combinación de las mismas.

21. Uso del kit según cualquiera de las reivindicación 19 a 20, para inhibir in vitro la proliferación celular y/o para inhibir in vitro la actividad de la proteína ERK-1; o la actividad de proteínas reguladoras del ciclo celular seleccionada de la lista que consiste en ciclina B y A.