ES2674128B1 - Método para diagnosticar sensibilización alérgica en un sujeto - Google Patents

Description

DESCRIPCION

Metodo para diagnosticar sensibilizacion alergica en un sujeto

La presente invention se refiere a un metodo in vitro para diagnosticar sensibilizacion alergica (atopia) en un sujeto, que comprende cuantificar los niveles de expresion del gen PTGDR, en donde unos niveles de expresion de dicho gen incrementados con respecto a una muestra control es indicativo de que el sujeto padece sensibilidad alergica. Por lo tanto, la presente invencion se engloba dentro del campo de la medicina, en particular, dentro en el diagnostico de alergia.

ESTADO DE LA TECNICA

Las enfermedades alergicas suponen en la actualidad una de las patologlas mas frecuentes en el mundo desarrollado, habiendose observado un notable incremento de su prevalencia en las ultimas decadas. Ello supone que la demanda de atencion en investigation especializada en este campo continue incrementandose a un ritmo similar al presente o superior.

En Europa Occidental las enfermedades alergicas afectan a mas del 35 % de la poblacion y se preve que esta cifra pueda continuar aumentando a lo largo de las proximas decadas. Indudablemente, esta situation supone un enorme coste economico (costes Sanitarios directos de aproximadamente 10.000 millones de € e indirectos de aproximadamente 19.000 millones de € (European White Paper, 2000)).

Las pruebas cutaneas como metodo diagnostico empezaron a emplearse en el siglo XIX. La tecnica de las pruebas intraepidermicas fue descrita por vez primera en 1924 por Lewis y Grant, generalizandose su uso como prueba diagnostica en los anos setenta. Estas pruebas se fundamentan en reproducir la reaction de hipersensibilidad tipo I (mediada por IgE) al introducir en la epidermis un alergeno. Se trata de pruebas rapidas, de bajo coste, respuesta inmediata y con elevada sensibilidad, si bien la especificidad no es tan buena y los resultados obtenidos en las mismas no son siempre concluyentes. Por todo lo anterior, su resultado debe valorarse junto con la historia cllnica de cada paciente y muy frecuentemente ser complementado con otro metodo de diagnostico.

Actualmente, en los sujetos en los que el resultado de las pruebas cutaneas no resulta concluyente se suele realizar una determination de Inmunoglobulina E (IgE) total. La IgE se aislo por primera vez en 1968. Sus principales funciones derivan de su participation en la reaction alergica y en la defensa contra parasitos. La tecnica mas utilizada actualmente para determinar la concentration de IgE total presente en el suero se denomina ImmunoCAP Total IgE (ThermoFisher Scientific, Waltham, EEUU). Dicha prueba consiste en un enzimoinmunoanalisis en sandwich. Basicamente, en esta prueba los anticuerpos anti-IgE unidos covalentemente a los pocillos del ImmunoCAP se fijan a la IgE del suero del paciente. Se anaden anticuerpos anti-IgE marcados enzimaticamente (P-galactosidasa-anti-IgE, anticuerpos monoclonales de raton, 1pg/ml), formandose un inmunocomplejo de tipo sandwich. La fluorescencia detectada es directamente proporcional a la concentracion de IgE.

Este metodo de diagnostico presenta varias desventajas. Por ejemplo, el que la vida media de la IgE en sangre es corta y que su production no es especlfica de procesos alergicos, sino que puede deberse a otros factores como son las infecciones y los parasitos. Ademas, el metodo de detection requiere equipos de gran tamano, complejidad y coste elevado, que se ve aumentado por el coste de los reactivos necesarios para la determinacion de la IgE. Por otro lado, la determinacion de IgE total como marcador de atopia es una tecnica con una aceptable sensibilidad, pero con una baja especificidad.

Por lo tanto, existe en el estado de la tecnica la necesidad de proporcionar un biomarcador alternativo a los utilizados en la actualidad para el diagnostico de procesos alergicos de mayor sensibilidad que los actuales que permita la identificacion precoz de la enfermedad.

DESCRIPCION DE LA INVENCION

Los autores de la presente invention han observado que los niveles de expresion del gen que codifica el receptor de la prostaglandina D (gen PTGDR o, de sus iniciales en ingles, Prostaglandin D receptor) estan incrementados en la sangre de sujetos alergicos, por lo que dicho nivel de expresion puede emplearse como biomarcador para el diagnostico de la sensibilization alergica (atopia) en un sujeto. Los inventores llegaron a esta conclusion a partir de un estudio observacional, analltico, de tipo casocontrol en el que se analizo la relation entre la variable nivel de expresion del gen PTGDR en sangre periferica mediante PCR y el desarrollo de distintas manifestaciones clmicas en pacientes alergicos (ver Ejemplo 1). El analisis estadistico permitio concluir que existe una asociacion estadisticamente significativa entre el aumento de los niveles de expresion del gen PTGDR y la presencia de fenotipo alergico, conclusion que fue corroborada por la curva ROC (ver Figura 2), y que demuestra que el nivel de expresion del gen PTGDR es un biomarcador de sensibilidad alergica mas sensible que los existentes en la actualidad.

Asi, este biomarcador se basa en una tecnologia completamente distinta, y a diferencia de los anteriores, se caracteriza por no requerir un equipamiento muy espedfico ni costes elevados. Ademas, presenta gran robustez y sensibilidad y puede utilizarse a partir de muestras de sangre total, por lo que no requiere procedimientos invasivos ni toma de muestras adicionales del paciente. Asimismo, a diferencia de los niveles de IgE total, no se ve afectado por la polisensibilizacion.

En base a estos hechos, los autores de la presente invention han desarrollado una serie de aspectos inventivos que seran descritos en detalle a continuation.

Metodo in vitro para el diagnostico de sensibilidad alergica

Tal como se ha explicado previamente, los niveles de expresion del gen PTGDR pueden emplearse como biomarcador de sensibilidad alergica en un sujeto.

Por lo tanto, en un aspecto, la presente invencion se relaciona con un metodo in vitro para diagnosticar sensibilization alergica en un sujeto, de aqu en adelante "metodo de diagnostico de la invencion”, que comprende

(a) cuantificar los niveles de expresion del gen que codifica el receptor de la prostaglandina D (gen PTGDR) en una muestra biologica de dicho sujeto, y

(b) comparar el nivel de expresion previamente obtenido con la expresion de dicho gen en una muestra control,

en donde si los niveles de expresion del gen PTGDR estan incrementados con respecto a los niveles de expresion de dicho gen en la muestra control, entonces el sujeto presenta sensibilidad alergica.

En la presente invencion se entiende por "diagnostico” al proceso cognitivo que conlleva la estimation de la probabilidad de padecer una enfermedad en base a uno o mas parametros presentes en un sujeto. En el contexto de la presente invention, dicho parametro es el nivel de expresion del gen PTGDR y la enfermedad es la sensibilidad alergica a uno o mas alergenos.

Se entiende por "sensibilization alergica” al proceso asintomatico que sufre un individuo cuando entra en contacto con un alergeno (inhalado, ingerido o por contacto) y que da lugar a la production de Inmunoblobulinas de tipo E (IgE) especlficas del alergeno en cuestion.

Como entiende el experto en la materia, un alergeno es un tipo antlgeno capaz de desencadenar una respuesta de anticuerpos IgE especlficos. No obstante, en el contexto de la presente invencion, los terminos "alergeno” y "antlgeno” se consideran equivalentes y pueden usarse indistintamente a lo largo de la presente description.

Se entiende por "antlgeno” a cualquier sustancia que es capaz de inducir una respuesta inmune, tanto humoral como celular, en el organismo de un sujeto (un hombre o un animal), o que puede inducir una respuesta inmune celular (expansion, activation y/o maduracion de celulas inmunes, produccion de citoquinas, o anticuerpos) cuando entra en contacto con celulas inmunitarias. En una realization particular, el antlgeno es un alergeno.

Se entiende por "alergeno” a aquella sustancia que es capaz de provocar alergia en un sujeto, es decir, aquella sustancia que es reconocida como extrana por el sistema inmune del sujeto, provocando una reaction inmunitaria, principalmente, la produccion de inmunoglobulinas de tipo E (IgE). Dicha sustancia puede ser una protelna o una glicoprotelna capaz de unirse a la IgE. Ejemplos de alergenos incluyen, sin limitarse a, componentes presentes en plantas que inducen una reaccion de sensibilidad en un sujeto (e.g. polen), artropodos (tales como los acaros del polvo), alimentos o productos alimenticios (tales como, protelnas de la leche de vaca, huevo, frutas, frutos secos, etc.), componentes presentes en saliva, pinzas, aguijones de insectos que inducen una reaccion de sensibilidad en un sujeto (avispas, abejas, etc.), epitelios de animales y farmacos.

Ejemplos de alergenos de acaros del polvo incluyen, sin limitarse a, Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides farinae, Acarus siro, Blomia tropicalis, Euroglyphus maynei, Glyciphagus domesticus, Lepidoglyphus destructor y Tyrophagus putrescentiae.

Ejemplos de alergenos del polen incluyen, sin limitarse a, el polen de gramlneas (Lolium perenne, Poa pratense, Phleum pratense, Cynodon dactylon, Festuca pratensis, Dactylis glome rata, Secale cereale, Hordeum vulgare, Avena sativa, Triticum sativa), de otras hierbas (tales como Artemisia vulgaris, Chenopodium album, Plantago lanceolata, Taraxacum vulgare, Parietaria judaica, Salsola kali, Urtica dioica), de arboles (tales como Olea europaea, Platanus spp, Cuppresus spp).

Ejemplos de alergenos alimentarios incluyen, sin limitarse a, protelnas de leche de vaca, huevo, frutas y frutos secos.

Ejemplos de alergenos de epitelios de animales incluyen, sin limitarse a, epitelio de canidos [tales como el perro (Canis familiaris), etc.], de felinos [tales como el gato (Felis domesticus) etc.], de roedores (tales como ratones, jerbos, chinchillas, hurones, ardillas, hamsteres, cobayas, etc.), de animales de graja (tales como vacas, caballos, aves, conejos, etc.) y de reptiles (tales como la iguana etc.). Como entiende el experto en la materia, dentro del termino "epitelio” se incluye la piel y los anexos cutaneos como el pelo.

Ejemplos de alergenos procedentes de hongos incluyen, sin limitar a, hongos de los filos Chytridiomycota, Basidiomycota, Zygomycota y Ascomycota. En particular, los principales hongos alergenicos incluyen, sin limitarse a, los generos Alternaria (e.g. Alternaria alternata o A. tenuis), Aspergillus (e.g. Aspergillus fumigatus), Cladosporium (e.g. Cladosporium herbarum), Penicillium (e.g. Penicillium chrysogenum), Helminthosporium, Epicoccum, Fusarium, Rhizopus y Mucor. De todos estos generos, los cuatro primeros son los que tienen mayor importancia cllnica.

Ejemplos de alergenos de farmacos incluyen, sin limitarse a, antibioticos (tales como los beta-lactamicos), anestesicos, antiinflamatorios (pirazolonas), etc.

En una realization particular, la sensibilization alergica o alergia se selecciona del grupo que consiste en alergia a los polenes, alergia a los acaros, alergia al epitelio de los animales y alergia a los hongos.

Todas estas sustancias pueden sensibilizar al sujeto de modo que su sistema inmunitario produce una serie de anticuerpos, habitualmente del tipo inmunoglobulina E (IgE), contra estos alergenos. Estos anticuerpos de tipo IgE se fijan a la superficie de unas celulas llamadas mastocitos (localizadas en la piel y mucosas) y basofilos (circulantes en el torrente sangulneo). Cuando el sujeto vuelve a tener contacto con el alergeno se produce una interaction con la IgE fijada a dichas celulas y se efectua un cambio conformacional en la superficie de estas celulas, que liberan una serie de mediadores proinflamatorios, responsables de los diferentes slntomas y signos de las enfermedades alergicas.

En la presente invention se entiende por "sujeto” o "individuo” a todos los animales clasificados como mamlferos e incluye, pero no esta restringido a, animales domesticos y de granja, primates y humanos, por ejemplo, seres humanos, primates no humanos, vacas, caballos, cerdos, ovejas, cabras, perros, gatos o roedores. Preferiblemente, el sujeto es un humano, hombre o mujer, de cualquier edad o raza.

El metodo de diagnostico de la invencion comprende en una primera etapa cuantificar los niveles de expresion del gen PTGDR en una muestra biologica de un sujeto [etapa a)].

El gen que codifica el receptor de la prostaglandina D2 o gen PTGDR (de sus siglas en ingles prostaglandin D2 receptor) es un gen que, en humanos, esta localizado en el cromosoma 14q22.1. Nombres alternativos que pueden usarse en la literatura cientlfica para referirse al gen PGTDR incluyen, pero no se limitan a, gen DP, gen AS1, gen DPI, gen ASRT1 y gen PTGDR1. En una realization particular, el gen PTGDR comprende una secuencia de nucleotidos con una identidad de secuencia de, 100% con la secuencia de nucleotidos SEQ ID NO: 1 (numero de acceso a GeneBank U31332, version U31332.1).

SEQ ID NO: 1

1 gaattctggc tattttcctc ctgccgttcc gactcggcac cagagtctgt ctctactgag 61 aacgcagcgc gtcagggccg agctcttcac tggcctgctc cgcgctcttc aatgccagcg 121 ccaggcgctc accctgcaga gcgtcccgcc tctcaaagag gggtgtgacc cgcgagttta 181 gataggaggt tcctgccgtg gggaacaccccgccgccctc ggagcttttt ctgtggcgca 241 gcttctccgc ccgagccgcg cgcggagctgccgggggctc cttagcaccc gggcgccggg 301 gccctcgccc ttccgcagcc ttcactccag ccctctgctc ccgcacgcca tgaagtcgcc 361 gttctaccgc tgccagaaca ccacctctgt ggaaaaaggc aactcggcgg tgatgggcgg 421 ggtgctcttc agcaccggcc tcctgggcaa cctgctggcc ctggggctgc tggcgcgctc 481 ggggctgggg tggtgctcgc ggcgtccact gcgcccgctg ccctcggtct tctacatgct 541 ggtgtgtggc ctgacggtca ccgacttgct gggcaagtgc ctcctaagcc cggtggtgct 601 ggctgcctac gctcagaacc ggagtctgcg ggtgcttgcg cccgcattgg acaactcgtt 661 gtgccaagcc ttcgccttct tcatgtcctt ctttgggctc tcctcgacac tgcaactcct 721 ggccatggca ctggagtgct ggctctccct agggcaccct ttcttctacc gacggcacat 781 caccctgcgc ctgggcgcac tggtggcccc ggtggtgagc gccttctccc tggctttctg 841 cgcgctacct ttcatgggct tcgggaagtt cgtgcagtac tgccccggca cctggtgctt 901 tatccagatg gtccacgagg agggctcgct gtcggtgctg gggtactctg tgctctactc 961 cagcctcatg gcgctgctgg tcctcgccac cgtgctgtgc aacctcggcg ccatgcgcaa 1021 cctctatgcg atgcaccggc ggctgcagcg gcacccgcgc tcctgcacca gggactgtgc 1081 cgagccgcgc gcggacggga gggaagcgtc ccctcagccc ctggaggagc tggatcacct 1141 cctgctgctg gcgctgatga ccgtgctctt cactatgtgt tctctgcccg taattgtgag 1201 tccccgggcc ccgagg

En la presente invencion se entiende por "identidad de secuencia” al grado de similitud entre dos secuencias de nucleotidos (o aminoacidos) obtenido mediante el alineamiento de las dos secuencias. Dependiendo del numero de residuos comunes entre las secuencias alineadas, se obtendra un grado de identidad expresado en tanto por ciento. El grado de identidad entre dos secuencias de nucleotidos (o aminoacidos) puede determinarse por metodos convencionales, por ejemplo, mediante algoritmos estandar de alineamiento de secuencias conocidos en el estado de la tecnica, como por ejemplo BLAST [Altschul S.F. et al. Basic local alignment search tool. J Mol Biol.

1990 Oct 5; 215(3):403-10]. Los programas BLAST, por ejemplo, BLASTN, BLASTX, and TBLASTX, BLASTP and TBLASTN, son de dominio publico en la pagina web de The National Center for Biotechonology Information (NCBI).

El gen PTGDR codifica la protelna receptora del receptor de tipo 1 de la prostaglandina D2 (tambien conocido como DP; AS1; DP1; ASRT1; PTGDR1). Esta protelna es un miembro de la superfamilia de receptores acoplados a protelna G de union a nucleotido de guanina [en ingles guanine nucleotide-binding protein (G protein)-coupled receptor (GPCR)]. Los receptores son protelnas que presentan 7 dominios transmembranarios que responden a senales extracelulares y activan las rutas de transmision de senales de transduccion intracelulares. Se ha descrito que esta protelna es un receptor para la prostaglandina D2, un mediador de la inflamacion alergica y de la inflamacion de las vlas respiratorias en asma. Distintos procesamientos del ARNm correspondientes a dicho gen dan lugar a multiples transcritos de la protelna.

En una realization particular del metodo de diagnostico de la invention, la protelna codificada por el gen PTGDR comprende una secuencia de aminoacidos con una identidad de secuencia de 100% con la secuencia SEQ ID NO: 2.

SEQ ID NO: 2 (numero de acceso a GenBank AAC50178, version AAC50178.1) MKSPFYRCQNTTSVEKGNSAVMGGVLFSTGLLGNLLALGLLARSGLGWCSRRPLRPLPSVFYMLVCGL TVTDLLGKCLLSPVVLAAYAQNRSLRVLAPALDNSLCQAFAFFMSFFGLSSTLQLLAMALECWLSLGH PFFYRRHITLRLGALVAPVVSAFSLAFCALPFMGFGKFVQYCPGTWCFIQMVHEEGSLSVLGYSVLYS SLMALLVLATVLCNLGAMRNLYAMHRRLQRHPRSCTRDCAEPRADGREASPQPLEELDHLLLLALMTV LFTMCSLPVI

El experto en la materia entiende que las mutaciones en la secuencia de nucleotidos de los genes que dan lugar a sustituciones conservativas de aminoacidos en posiciones no crlticas para la funcionalidad de la protelna son mutaciones evolutivamente neutras que no afectan a su estructura global ni a su funcionalidad, dando lugar a variantes de la protelna. Dichas variantes caen dentro del ambito de la presente invencion, es decir, aquellas variantes de la protelna codificada por el gen PTGDR que presentan inserciones, deleciones o modificaciones de uno o mas aminoacidos con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 2.

En la presente description, los terminos “expresion” y "expresion genica" incluyen la transcription y/o traduction del acido nucleico. Por lo tanto, la cuantificacion de la expresion del gen PTGDR puede determinarse a partir del acido nucleico del gen PTGDR o de la protelna codificada por dicho gen, es decir, de la protelna receptor de prostanoide DP.

Asl, en una realizacion particular del metodo de diagnostico de la invencion, la cuantificacion de los niveles de expresion del gen PTGDR comprende la cuantificacion del ARN mensajero (ARNm) de dicho gen, o un fragmento de dicho ARNm, el ADN complementario (ADNc) de dicho gen, o un fragmento de dicho ADNc, o sus mezclas. Alternativamente, en otra realizacion particular, la cuantificacion de los niveles de expresion del gen PTGDR comprende la cuantificacion de los niveles de protelna codificada por dicho gen, o un fragmento de dicha protelna.

En la presente invention se entiende por "fragmento de ARNm” o "fragmento de ADNc” a la secuencia de nucleotidos del gen PTGDR que comprende uno o mas nucleotidos ausentes de los extremos 3’ y/o 5’ con respecto a la secuencia de nucleotidos completa del gen PTGDR. En una realization particular, el fragmento del gen PTGDR es un fragmento de la secuencia SEQ ID NO: 1.

De forma analoga, en la presente invencion se entiende por "fragmento de la protelna receptor del prostanoide DP” a la secuencia de aminoacidos de la protelna receptor del prostanoide DP que comprende uno o mas aminoacidos ausentes de su extremo amino terminal o carboxilo terminal con respecto a la secuencia de aminoacidos completa de la protelna receptor de prostanoide DP. En una realizacion particular, el fragmento de la protelna receptor de prostanoide DP es un fragmento de la secuencia SEQ ID NO: 2.

Si la cuantificacion de la expresion del gen PTGDR va a realizarse a partir del ADNc o el ARNm, primero es necesaria la extraction del acido nucleico de la muestra biologica aislada del sujeto. Para este fin, la muestra biologica se puede tratar para disgregar de forma flsica o mecanica la estructura del tejido o la celula, liberando los componentes intracelulares en una solution acuosa u organica para aislar y preparar los acidos nucleicos. Los acidos nucleicos se extraen mediante procedimientos conocidos para el experto en la materia y disponibles comercialmente (Sambroock, J., et al. 2012, "Molecular cloning: a Laboratory Manual", 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., Vol. 1-3.).

Una vez extraldo el acido nucleico se procede a realizar la cuantificacion de la expresion del gen PTGDR. Practicamente cualquier metodo convencional puede ser utilizado dentro del marco de la invencion para detectar y cuantificar los niveles de ARNm del gen PTGDR o de su ADNc correspondiente. A modo ilustrativo, no limitativo, los niveles de ARNm de dicho gen pueden ser cuantificados mediante el empleo de metodos convencionales, por ejemplo, metodos que comprenden la amplification del ARNm y la cuantificacion del producto de la amplification de dicho ARNm, tales como electroforesis y tincion, o alternativamente, mediante Southern blot y empleo de sondas apropiadas, Northern blot y empleo de sondas especlficas del ARNm del gen de interes (gen PTGDR) o de su ADNc correspondiente, mapeo con la nucleasa S1, RT-PCR, hibridacion, microarrays, etc.

Analogamente, los niveles del ADNc correspondiente a dicho ARNm del gen PTGDR tambien pueden ser cuantificados mediante el empleo de tecnicas convencionales; en este caso, el metodo de la invention incluye una etapa de slntesis del correspondiente ADNc mediante transcription inversa (RT) del ARNm correspondiente seguida de amplification y cuantificacion del producto de la amplification de dicho ADNc. Metodos convencionales de cuantificar los niveles de expresion pueden encontrarse, por ejemplo, en Sambrook et al. citado ad supra. En una realization particular, la cuantificacion de los niveles de expresion se realiza mediante una reaction en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativa, un array de ADN o ARN, o RNA-Seq o Secuenciacion Masiva aplicada al estudio de ARN.

Si la cuantificacion de la expresion del gen PTGDR va a realizarse a partir de la protelna codificada por el gen PTGDR, es decir, la protelna receptor de la prostaglandina DP, entonces la muestra biologica aislada del sujeto tiene que ser tratada para extraer las protelnas. Metodos para extraer o aislar protelnas son conocidos para el experto en la materia y estan disponibles comercialmente (Sambroock, J., et al.2012, citado ad supra).

Los niveles de la protelna receptor de la prostaglandina D pueden ser cuantificados mediante cualquier metodo convencional que permita detectar y cuantificar dicha protelna en una muestra de un sujeto. A modo ilustrativo, no limitativo, los niveles de dicha protelna pueden cuantificarse, por ejemplo, mediante el empleo de anticuerpos con capacidad de unirse a la protelna receptor de prostaglandina D y la posterior cuantificacion de los complejos formados.

Se entiende por “anticuerpo” a una glicoprotelna del tipo gamma globulina que forma parte del sistema inmunitario humoral que se une de forma especlfica a un antlgeno. El termino anticuerpo tal como aqul se utiliza incluye anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, fragmentos recombinantes de anticuerpos, combibodies, fragmentos Fab y scFv de anticuerpos, as! como los dominios de union a ligando. Anticuerpos especlficos de la protelna codificada por el gen PTGDR estan disponibles comercialmente. Ejemplos de dichos anticuerpos incluyen, sin limitar a, los anticuerpos de la empresa Thermo Fisher Scientific Inc. (Waltham, Massachusetts, USA) con numero de catalogo PA5-34114, PA5-34113, PA1-32793, PA5-34116 y PA5-34115.

Los anticuerpos que se emplean en estos ensayos pueden estar marcados o no. Los terminos "marca" o "marcado" se refieren a una composition capaz de producir una senal detectable indicativa de la presencia de la molecula marcada. Ejemplos ilustrativos de marcadores adecuados incluyen, sin limitar a, radioisotopos, cromoforos de nucleotidos, enzimas, sustratos, moleculas fluorescentes, restos quimioluminiscentes, partlculas magneticas, restos bioluminescentes, y similares. Como tal, una marca es cualquier composicion detectable por medios espectroscopicos, fotoqulmicos, bioqulmicos, inmunoqulmicos, electricos, opticos o qulmicos. Existe una amplia variedad de ensayos conocidos que se pueden utilizar en la presente invention, que utilizan anticuerpos no marcados (anticuerpo primario) y anticuerpos marcados (anticuerpo secundario); entre estas tecnicas se incluyen el Western-blot o transferencia Western, ELISA (enzimoinmunoensayo RIA (radioinmunoensayo), EIA competitivo (enzimoinmunoensayo competitivo), DAS-ELISA (ELISA tipo sandwich con doble anticuerpo), tecnicas inmunocitoqulmicas e inmunohistoqulmicas, tecnicas basadas en el empleo de biochips o microarrays de protelnas que incluyan anticuerpos especlficos o ensayos basados en precipitation coloidal en formatos tales como dipsticks. Otras maneras para detectar y cuantificar dicha la protelna receptor de prostaglandina D, incluyen tecnicas de cromatografla de afinidad, ensayos de union a ligando, espectrometrla de masas etc. No obstante, en una realization particular, la cuantificacion de los niveles de protelna se realiza mediante Western blot, ELISA, un array de protelnas o un estudio de binding. Cuando se usa un metodo inmunologico, se puede usar cualquier anticuerpo o reactivo que se sabe se une a la protelna receptor de prostaglandina D con alta afinidad para detectar la cantidad de la misma. Ejemplos de anticuerpos o reactivos con capacidad de unirse a dicha la protelna receptor de prostaglandina D incluyen, sin limitarse a, sueros policlonales, sobrenadantes de hibridomas o anticuerpos monoclonales, fragmentos de anticuerpos, Fv, Fab, Fab' y F(ab')2, scFv, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y anticuerpos humanizados. En el mercado, existen anticuerpos comerciales contra la protelna receptor de prostaglandina D que pueden emplearse en el contexto de la presente invencion, tales como los citados en parrafos anteriores.

Tal como se ha puesto de manifiesto en parrafos anteriores, para llevar a cabo la primera etapa del metodo de diagnostico de la invencion, es necesario disponer de una muestra biologica aislada del sujeto en estudio. En el contexto de la presente invention, el termino "muestra biologica” se refiere a cualquier material biologico que se puede obtener del sujeto, tal como una biopsia, un tejido, una celula o un fluido (suero, saliva, semen, esputo, lagrimas, moco, sudor, leche, extractos de cerebro y similares), y que puede albergar information sobre la dotation genetica caracterlstica de una persona. En una realization particular en el que la muestra biologica es una muestra de sangre periferica, esputo u orina. El termino "aislado/a” implica que la muestra biologica ha sido separada o extralda del resto de componentes que la acompanan de forma natural.

Una vez que se han cuantificado los niveles de expresion del gen PTGDR, el metodo de diagnostico de la invencion comprende comparar el nivel de expresion obtenido con la expresion de dicho gen en una muestra control.

La determination de los niveles de expresion del gen PTGDR necesita ser correlacionada con valores de una muestra control o muestra de referencia que corresponden al nivel de expresion del gen PTGDR medido en una muestra procedente de un sujeto que no padece sensibilidad alergica ni alergia a un determinado alergeno o que corresponden al valor medio de los niveles de expresion del gen PTGDR medidos en una coleccion de muestras biologicas de sujetos que no padecen sensibilidad alergica ni alergia a un determinado alergeno. Dicha muestra de referencia se obtiene tlpicamente combinando cantidades iguales de muestras de una poblacion de sujetos. En general, las muestras de referencia tlpicas se obtendran de sujetos que estan cllnicamente bien documentados y en los que la ausencia de sensibilidad alergica o alergia se encuentra bien caracterizada. En tales muestras, las concentraciones normales (de referencia) del biomarcador (gen PTGDR) se pueden determinar, por ejemplo, proporcionando la concentration media sobre la poblacion de referencia. Al determinar la concentracion de referencia del marcador se toman en cuenta varias consideraciones. Entre tales consideraciones estan la edad, peso, sexo, estado flsico general del paciente y similares. Por ejemplo, se toman como grupo de referencia cantidades iguales de un grupo de al menos 2, al menos 10, al menos 100 a preferiblemente mas de 1000 sujetos, preferiblemente clasificados segun las consideraciones anteriores, por ejemplo, de varias categorlas de edad. La coleccion de muestras de las que deriva el nivel de referencia estara preferiblemente constituida de sujetos que padecen el mismo tipo de sensibilidad alergica o alergia que se quiere diagnosticar.

Una vez que se ha establecido este valor medio, se puede comparar el nivel de expresion del gen PTGDR en el sujeto de estudio y dicho valor medio. De esta manera se puede asignar un nivel de expresion "incrementado" o “disminuido”. Debido a la variabilidad entre sujetos (por ejemplo, aspectos referidos a la edad, raza, etc.) es muy diflcil (si no practicamente imposible) establecer valores de referencia absolutos de expresion del gen PTGDR. Asl, en una forma de realization particular, los valores de referencia para expresion "incrementada" o "disminuida" de la expresion del gen PTGDR se determinan calculando los percentiles por medios convencionales que implica ensayar en una o varias muestras aisladas de sujetos en los que la sensibilidad alergica o alergia se encuentra bien documentada. Los niveles de expresion "incrementados" del gen PTGDR se pueden entonces asignar, preferiblemente, a muestras en donde los niveles de expresion del gen PTGDR son iguales a o superan el percentil 50 en la poblacion normal, incluyendo, por ejemplo, niveles de expresion iguales a o en exceso al percentil 60 en la poblacion normal, iguales a o en exceso al percentil 70 en la poblacion normal, iguales a o en exceso al percentil 80 en la poblacion normal, iguales a o en exceso al percentil 90 en la poblacion normal, e iguales a o en exceso al percentil 95 en la poblacion normal.

En la presente invention se entiende por "niveles de expresion incrementados" cuando el nivel de expresion se refiere a niveles del gen PTGDR superiores a los que aparecen en una muestra de referencia o muestra control. En particular, se puede considerar que una muestra presenta niveles altos de expresion del gen PTGDR cuando los niveles de expresion son de al menos 1,1 veces, 1,5 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces o incluso mas con respecto a los niveles de expresion en la muestra control.

Una vez hecha la comparacion entre el nivel de expresion del gen PTGDR en la muestra del sujeto con la expresion de dicho gen en la muestra control, se puede concluir si el sujeto padece sensibilidad alergica o no ya que, segun se ha descrito en la presente invencion, si los niveles de expresion del gen PTGDR estan incrementados con respecto a los niveles de expresion de dicho gen en la muestra control, entonces el sujeto padece sensibilidad alergica.

Los niveles de expresion del gen PTGDR tambien pueden emplearse como biomarcador de la eficacia de un tratamiento contra la alergia, basta con medir los niveles de expresion del gen antes y despues de la administration del tratamiento. Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invention se relaciona con un metodo in vitro para evaluar la eficacia de un tratamiento contra la alergia administrado a un sujeto, de aqul en adelante "metodo de evaluation de la eficacia de un tratamiento”, que comprende

(a) cuantificar los niveles de expresion del gen PTGDR en una muestra biologica de dicho sujeto antes y despues de la administracion del tratamiento, y

(b) comparar el nivel de expresion obtenido antes del tratamiento con el nivel de expresion obtenido despues del tratamiento,

en donde un nivel de expresion del gen PTGDR despues del tratamiento menor que un nivel de expresion de dicho gen antes del tratamiento, es indicativo de que el tratamiento administrado esta siendo eficaz contra la alergia.

En la presente invencion se entiende por "alergia” a la respuesta exagerada e inapropiada del sistema inmunitario frente a sustancias que son inocuas para la mayorla de las personas. Los terminos "alergia” e "hipersensibilidad” se pueden considerar sinonimos y pueden usarse indistintamente en la presente description. Ejemplos de enfermedades alergicas incluyen, sin limitar a, conjuntivitis, rinitis alergica, asma alergica, anafilaxia, urticaria, dermatitis atopica o eccema atopico, dermatitis alergica de contacto y alergia alimentaria. La sustancia que desencadena dicha respuesta exagerada e inapropiada del sistema inmunitario se denomina antlgeno que, tal como se ha explicado previamente, en el contexto de la presente invencion, dicho antlgeno es un alergeno.

Las distintas realizaciones particulares descritas para el metodo de diagnostico de la invencion, as! como las definiciones y explicaciones de los terminos y expresiones empleados, son aplicables al presente aspecto inventivo.

La eficacia de cualquier compuesto empleado en el tratamiento de la alergia puede ser evaluada mediante el metodo descrito en el presente aspecto inventivo. Ejemplos de tratamientos contra la alergia incluyen, sin limitar a, antihistamlnicos, inmunoterapia, farmacos antiasmaticos y compuestos biologicos.

Ejemplos de antihistaminicos incluyen, sin limitar a, antihistaminicos de primera generation (tales como dexclorfeniramina, hidroxicina, carbocistelna, difenhidramina, doxilamina, dimenhidrinato, dexclorfeniramina y tripelenamina entre otros), antihistaminicos de segunda generacion (tales como cetirizina, loratadina y ebastina entre otros) o antihistaminicos de segunda generacion mas posteriores (tales como levocetirizina, desloratadina, bilastina y entre otros).

La inmunoterapia, o tambien denominada como "vacunas de alergia", es un procedimiento medico que consiste en la administration repetitiva y en las mas de las ocasiones, gradual de una sustancia alergica a un paciente sensibilizado a ella, en cantidades generalmente crecientes durante varios anos, con la intention de lograr su tolerancia. Las distintas sustancias alergicas (alergenos) que pueden administrarse como “vacuna de alergia” han sido descritas en parrafos anteriores.

Ejemplos de farmacos antiasmaticos incluyen, sin limitar a, broncodilatadores betaadrenergicos (tales como salbutamol, terbutalina, formoterol, salmeterol vilanterol, entre otros), corticoides inhalados (tales como dipropionato de beclometasona, budesonida, mometasona, fluticasona y ciclesonida, entre otros), corticoides sistemicos (tales como prednisona, metilpredinosolona, triamcinolona y dexametasona, entre otros) o anticolinergicos inhalados (tales como bromuro de ipratropio o tiotropio, entre otros).

Ejemplos de biologicos incluyen, sin limitar a, omalizumab, mepolizumab y reslizumab, entre otros.

Tal como se describe en la presente invention, para evaluar si un tratamiento administrado a un sujeto esta siendo efectivo es necesario medir los niveles de expresion del gen PTGDR en dicho sujeto antes y despues de la administracion del tratamiento, y si el nivel de expresion de dicho gen despues del tratamiento es menor que el nivel de expresion de ese gen antes del tratamiento, entonces se puede concluir que el tratamiento administrado esta siendo eficaz contra la alergia.

Metodos para cuantificar los niveles de expresion de un gen ya han sido descritos previamente. En la presente invencion se entiende por “nivel de expresion menor” o “niveles de expresion menores” a una disminucion del nivel de expresion del gen PTGDR despues del tratamiento con respecto al nivel de expresion de dicho gen antes del tratamiento. Dicha disminucion del nivel de expresion puede ser de al menos 1,1 veces, 1,5 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces o incluso menor con respecto al nivel de expresion del gen PTGDR antes del tratamiento.

En la presente invention se entiende que un tratamiento esta siendo efectivo cuando la alergia padecida por el sujeto desaparece o disminuye, es decir, los slntomas asociados a la alergia se desaparecen o atenuan, y el bienestar del sujeto mejora.

Usos de la invencion

La presente invencion esta basada en el hecho de que los niveles de expresion del gen PTGDR estan incrementados en la sangre de sujetos alergicos. Por lo tanto, dicho nivel de expresion puede emplearse como biomarcador para el diagnostico de la sensibilization alergica en un sujeto.

Asl, en un aspecto, la presente invencion se relaciona con el uso in vitro de los niveles de expresion del gen PTGDR, de aqul en adelante "uso de la invencion”, como biomarcador para diagnosticar sensibilidad alergica en un sujeto o para evaluar la eficacia de un tratamiento contra la alergia en un sujeto.

Tal como se ha puesto de manifiesto a lo largo de la presente description, si los niveles de expresion del gen PTGDR estan incrementados con respecto a los niveles de expresion de dicho gen en la muestra control, entonces dicho sujeto padece sensibilidad alergica o el tratamiento no esta siendo efectivo.

Los terminos y expresiones empleados en el presente aspecto inventivo han sido definidos y explicados en parrafos anteriores.

En una realization particular del uso de la invencion, la sensibilidad alergica o la alergia se selecciona del grupo que consiste en alergia al polen, alergia a los acaros, alergia al epitelio de los animales y alergia a los hongos. Ejemplos de los distintos alergenos pueden encontrarse en parrafos anteriores.

Los niveles de expresion del gen PTGDR pueden determinarse mediante

(i) la cuantificacion del ARN mensajero (ARNm) de dicho gen, o un fragmento de dicho ARNm, el ADN complementario (ADNc) de dicho gen, o un fragmento de dicho ADNc, o sus mezclas; o

(ii) la cuantificacion de los niveles de protelna codificada por dicho gen.

Las tecnicas para la cuantificacion de expresion tanto de acidos nucleicos como de protelnas han sido descritas previamente y cualquiera de ellas puede emplearse en el contexto de la presente invention. No obstante, en una realization particular, la cuantificacion de los niveles de expresion de los acidos nucleicos se lleva a cabo mediante reaction en cadena de la polimerasa cuantitativa, un array de ADN o ARN, o un RNAseq; y en otra realizacion particular, la cuantificacion de los niveles de protelna se realiza mediante Western blot, ELISA, array de protelnas o estudios de binding.

Las caracterlsticas del gen PTGDR y de la protelna codificada por dicho gen, al igual que sus respectivas secuencias de nucleotidos y aminoacidos, han sido descritas en parrafos anteriores de la presente description.

En la presente invencion tambien se contempla el uso de inhibidores de la expresion del gen PTGDR o de la protelna codificada por dicho gen.

Se entiende por “inhibidores de la expresion” a cualquier sustancia o compuesto que sea capaz de impedir o bloquear la transcription y la traduction del gen de interes (es decir, impedir o bloquear la expresion de dicho gen), o que sea capaz de impedir que la protelna codificada por dicho gen realice su funcion (actividad).

A modo ilustrativo, agentes inhibidores de la expresion del gen PTGDR adecuados para su uso en la presente invencion son, por ejemplo, oligonucleotidos antisentido, ARN de interferencia (ARNip), ARN catallticos o ribozimas especlficos, ARN con actividad decoy, es decir, con capacidad para unirse especlficamente a un factor (proteico generalmente) importante para la expresion del gen, de manera que la expresion del gen de interes, en este caso el gen PTGDR sea inhibida, etc. Asimismo, agentes inhibidores capaces de impedir que la protelna codificada por dicho gen realice su funcion son, por ejemplo, peptidos inhibidores de la protelna, anticuerpos dirigidos especlficamente contra epltopos de la protelna esenciales para desempenar su funcion. Por tanto, el agente inhibidor del gen PTGDR se selecciona del grupo formado por ARNip, oligonucleotidos antisentido, ribozimas especlficos, anticuerpos y polipeptidos. Preferiblemente, el inhibidor del gen PTGDR es un ARNip especlfico para dicho gen.

Asl, en otro aspecto, la invention se relaciona con el uso de un ARN de interferencia especlfico del gen PTGDR (ARNip) y/o de un anticuerpo especlfico para la protelna codificada por el gen PTGDR (Ab), en la elaboration de una composition farmaceutica para el tratamiento de la alergia.

ARNip

En la presente invencion se entiende por ARN de interferencia pequenos, o ARNip (siRNA en su denomination en ingles) son agentes que son capaces de inhibir la expresion de un gen diana mediante interferencia de ARN. Un ARNip se puede sintetizar qulmicamente, se puede obtener mediante transcription in vitro o se puede sintetizar in vivo en la celula diana. Tlpicamente, los ARNip consisten en una cadena doble de ARN de entre 15 y 40 nucleotidos de longitud y que puede contener una region protuberante 3' y/o 5' de 1 a 6 nucleotidos. La longitud de la region protuberante es independiente de la longitud total de la molecula de ARNip. Los ARNip actuan mediante la degradation o el silenciamiento post-transcripcional del mensajero diana.

Los ARNip pueden ser los llamados shRNA (short hairpin RNA), caracterizados por que las cadenas antiparalelas que forman el ARNip estan conectadas por una region bucle u horquilla. Los shRNAs pueden estar codificados por plasmidos o virus, particularmente retrovirus y estar bajo el control de promotores tales como el promotor U6 de la ARN polimerasa III.

Los ARNip de la invencion son sustancialmente homologos al ARNm del gen PTGDR. Por sustancialmente homologos se entiende que tienen una secuencia que es suficientemente complementaria o similar al ARNm diana, de forma que el ARNip sea capaz de provocar la degradacion de este por interferencia de ARN. Los ARNip adecuados para provocar dicha interferencia incluyen ARNip formados por ARN, asl como ARNip que contienen distintas modificaciones qulmicas tales como:

- ARNip en los que los enlaces entre los nucleotidos son distintos a los que aparecen en la naturaleza, tales como enlaces fosforotioato.

- Conjugados de la cadena de ARN con un reactivo funcional, tal como un fluoroforo.

- Modificaciones de los extremos de las cadenas de ARN, en particular el extremo 3' mediante la modification con distintos grupos funcionales del hidroxilo en position 2'.

- Nucleotidos con azucares modificados tales como restos O-alquilados en posicion 2' tales como 2'-O-metilribosap 2'-O-fluorosibosa.

- Nucleotidos con bases modificadas tales como bases halogenadas (por ejemplo 5-bromouracilo y 5-iodouracilo), bases alquiladas (por ejemplo 7-metilguanosina).

Los ARNip y ARNsh de la invention se pueden obtener usando una serie de tecnicas conocidas para el experto en la materia. La region de la secuencia de nucleotidos que se toma como base para disenar los ARNip no es limitante y puede contener una region de la secuencia codificante (entre el codon de initiation y el codon de termination) o, alternativamente, puede contener secuencias de la region no traducida 5' o 3', preferentemente de entre 25 y 50 nucleotidos de longitud y en cualquier posicion en posicion sentido 3' con respecto al codon de iniciacion. Una forma de disenar un ARNip implica la identification de los motivos AA(N19)TT, en donde N puede ser cualquier nucleotido en la secuencia que codifica aprataxina, y la selection de aquellos que presenten un alto contenido en G/C. Si no se encuentra dicho motivo, es posible identificar el motivo NA(N21), en donde N puede ser cualquier nucleotido.

Oligonucleotidos antisentido

Alternativamente a los ARNip, la invencion tambien contempla uso de acidos nucleicos antisentido aislados para inhibir la expresion, por ejemplo, inhibiendo la transcription y/o traduction de un acido nucleico del gen PTGDR. Los acidos nucleicos antisentido se pueden unir mediante complementariedad de bases convencional o, por ejemplo, en el caso de unirse a ADN bicatenario, a traves de interacciones especlficas en el surco mayor de la doble helice. En general, estos metodos se refieren al rango de tecnicas generalmente empleadas en la tecnica e incluyen cualquier metodo que se basa en la union especlfica a secuencias de oligonucleotidos.

Una construction antisentido se puede distribuir, por ejemplo, como un plasmido de expresion que, cuando se transcribe en la celula, produce ARN que es complementario a al menos una parte unica del ARNm celular del gen PTGDR. De forma alternativa, la construccion antisentido es una sonda de oligonucleotidos que se genera ex vivo y que, cuando se introduce en la celula, produce inhibition de la expresion genica hibridando con el ARNm y/o secuencias genomicas de un acido nucleico diana. Tales sondas de oligonucleotidos son preferiblemente oligonucleotidos modificados, que son resistentes a las nucleasas endogenas, por ejemplo, exonucleasas y/o endonucleasas, y que son por lo tanto estables in vivo. Moleculas de acidos nucleicos ejemplares para su uso como oligonucleotidos antisentido son analogos de ADN de fosforamidato, fosfotionato y metilfosfonato.

Respecto al oligonucleotido antisentido, son preferidas las regiones de oligodesoxirribonucleotidos derivadas del sitio de inicio de la traduccion, por ejemplo, entre -10 y 10 del gen diana. Las aproximaciones antisentido implican el diseno de oligonucleotidos (bien ADN bien ARN) que son complementarios al ARNm que codifica el polipeptido diana. Los oligonucleotidos antisentido se uniran a los transcritos de ARNm y prevendran la traduccion.

Los oligonucleotidos que son complementarios al extremo 5' del ARNm, por ejemplo, la secuencia 5' no traducida hasta e incluyendo el codon de iniciacion AUG, deberlan funcionar de la forma mas eficaz para inhibir la traduccion. Sin embargo, se ha mostrado recientemente que las secuencias complementarias a las secuencias 3' no traducidas de los ARNm tambien son eficaces para inhibir la traduccion de los ARNm. Por lo tanto, se podrlan usar oligonucleotidos complementarios bien a las regiones 5' o 3' no traducidas, no codificantes de un gen en una aproximacion antisentido para inhibir la traduccion de ese ARNm. Los oligonucleotidos complementarios a la region 5' no traducida del ARNm deberlan incluir el complemento del codon de iniciacion AUG. Los oligonucleotidos complementarios a las regiones codificantes del ARNm son inhibidores de la traduccion menos eficaces, pero tambien se podrlan usar segun la invention. Si estan disenados para hibridar con la region 5', 3' o codificante del ARNm, los acidos nucleicos antisentido deberlan tener al menos seis nucleotidos de longitud y tener preferiblemente menos de alrededor de 100 y mas preferiblemente menos de alrededor de 50, 25, 17 o 10 nucleotidos de longitud.

Los oligonucleotidos antisentido pueden ser de ADN o ARN o mezclas quimericas o derivados o versiones modificadas de los mismos, de cadena sencilla o de cadena doble. El oligonucleotido se puede modificar en el grupo de la base, el grupo del azucar o el esqueleto de fosfato, por ejemplo, para mejorar la estabilidad de la molecula, su capacidad de hibridacion etc. El oligonucleotido puede incluir otros grupos unidos, tales como peptidos (por ejemplo, para dirigirlos a receptores de celulas huesped) o agentes para facilitar el transporte a traves de la membrana celular o la barrera hematoencefalica, agentes intercalantes. Para este fin, el oligonucleotido puede estar conjugado a otra molecula, por ejemplo, un peptido, un agente transportador, agente de corte desencadenado por hibridacion, etc.

Los oligonucleotidos antisentido pueden comprender al menos un grupo de base modificada. El oligonucleotido antisentido tambien puede comprender al menos un grupo azucar modificado seleccionado del grupo que incluye, pero no esta limitado a arabinosa, 2-fluoroarabinosa, xilulosa, y hexosas. El oligonucleotido antisentido tambien puede contener un esqueleto semejante a peptido neutro. Tales moleculas se denominan oligomeros acido nucleico peptldico (ANP).

En algunos casos, puede ser diflcil alcanzar las concentraciones intracelulares del antisentido suficientes para suprimir la traduccion de los ARNm endogenos. Por lo tanto, en una aproximacion se usa una construction de ADN recombinante en la que se coloca el oligonucleotido antisentido bajo el control de un promotor fuerte de pol III o pol II. De forma alternativa, se puede reducir la expresion del gen diana dirigiendo secuencias de desoxirribonucleotidos complementarias a la region reguladora del gen (es decir, el promotor y/o potenciadores) para formar estructuras de triple helice que previenen la transcripcion del gen en las celulas diana en el cuerpo.

Ribozimas

Tambien se pueden usar moleculas de ribozimas disenadas para cortar de forma catalltica transcritos de un ARNm diana para prevenir la traduccion de los ARNm del gen PTGDR cuya actividad se desea inhibir. Las ribozimas son moleculas enzimaticas de ARN capaces de catalizar el corte especlfico de ARN. El mecanismo de action de la ribozima implica hibridacion especlfica de secuencia de la molecula de ribozima a un ARN diana complementario, seguido por un suceso de corte endonucleolltico. La composition de las moleculas de ribozima preferiblemente incluye una o mas secuencias complementarias al ARNm diana, y la bien conocida secuencia responsable del corte del ARNm o una secuencia funcionalmente equivalente. Las ribozimas usadas en las composiciones de la presente invention incluyen las ribozimas de cabeza de martillo, las ARN endorribonucleasa (de aqul en adelante ribozimas de tipo Cech). Las ribozimas pueden estar compuestas de oligonucleotidos modificados (por ejemplo, para mejorar la estabilidad, direccionamiento, etc.) y se deberlan distribuir a celulas que expresan el gen diana in vivo. Un metodo preferido de distribution implica usar una construction de ADN que codifica la ribozima bajo el control de un promotor constitutivo fuerte de pol III o pol II, de modo que las celulas transfectadas produciran cantidades suficientes de la ribozima para destruir los mensajeros diana endogenos e inhibir la traduction. Puesto que las ribozimas, contrariamente a otras moleculas antisentido, son catallticas, se requiere una concentration intracelular menor para su eficacia.

Peptidos inhibidores

El termino peptido inhibidor, tal como aqul se utiliza, hace referencia a aquellos peptidos capaces de unirse a la protelna codificada por el gen PTGDR e inhibir su actividad segun se ha explicado anteriormente.

Anticuerpos inhibidores

Por anticuerpo inhibidor se entiende en el contexto de la presente invention todo aquel anticuerpo que es capaz de unirse a la protelna codificada por el gen PTGDR de manera especlfica e inhibir una o mas de las funciones del mismo. Ejemplos de anticuerpos especlficos de la protelna codificada por el gen PTGDR han sido citados previamente. Los anticuerpos pueden ser preparados usando cualquiera de los metodos que son conocidos para el experto en la materia. Una vez identificados anticuerpos con capacidad de union a la protelna codificada por el gen PTGDR, se seleccionaran aquellos capaces de inhibir la actividad de esta protelna usando un ensayo de identification de agentes inhibidores.

Para identificar o disenar los agentes inhibidores anteriormente definidos es necesario conocer la secuencia de nucleotidos del gen PTGDR y la secuencia de aminoacidos de la protelna codificada por dicho gen. Asl, en una realization particular, la protelna codificada por el gen PTGDR es la protelna que comprende una secuencia de aminoacidos con una identidad de secuencia del100% con la secuencia SEQ ID NO: 2. En otra realization particular, el gen PTGDR comprende una secuencia de nucleotidos con una identidad de, al menos, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% con la secuencia de nucleotidos SEQ ID NO: 1.

Cualquiera de los inhibidores de la expresion del gen PTGDR citados anteriormente puede emplearse en la elaboration de una composition farmaceutica para el tratamiento de la alergia. En una realization particular de la invention, la alergia se selecciona del grupo que consiste en alergia al polen, alergia a los acaros, alergia a los hongos y alergia a los epitelios de los animales. Ejemplos de cada una de las alergias citadas han sido citados en parrafos anteriores.

Como entiende el experto en la materia, la elaboration de la composition farmaceutica puede comprender carriers, excipientes o vehlculos farmaceuticamente aceptables, asl como adyuvantes. Metodos sobre como elaborar composiciones farmaceuticas son ampliamente conocidos por el experto en la materia.

El termino “excipiente” hace referencia a una sustancia que ayuda a la absorcion del principio activo, lo estabiliza o ayuda a la preparation de la composicion en el sentido de darle consistencia o aportar sabores que lo hagan mas agradable. Asl pues, los excipientes podrlan tener la funcion de mantener los ingredientes unidos como por ejemplo almidones, azucares o celulosas, funcion de endulzar, funcion de colorante, funcion de protection del medicamento como por ejemplo para aislarlo del aire y/o la humedad, funcion de relleno de una pastilla, capsula o cualquier otra forma de presentation como por ejemplo el fosfato de calcio dibasico, funcion desintegradora para facilitar la disolucion de los componentes y su absorcion en el intestino, sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este parrafo.

El termino “farmacologicamente aceptable” se refiere a que el compuesto al que hace referencia este permitido y evaluado de modo que no cause dano, o efectos fisiologicos indeseables, al sujeto que se administra.

La composicion puede comprender ademas un vehlculo farmacologicamente aceptable o carrier. Ademas, el vehlculo debe ser farmaceuticamente aceptable. Un “vehlculo farmaceuticamente aceptable” o “carrier farmaceuticamente aceptable” se refiere a aquellas sustancias, o combination de sustancias, conocidas en el sector farmaceutico, utilizadas en la elaboracion de formas farmaceuticas de administration e incluye, pero sin limitarse, solidos, llquidos (soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones, tales como emulsiones aceite/agua, diferentes tipos de agentes humectantes, soluciones esteriles), disolventes o tensioactivos. El vehlculo puede ser una sustancia inerte o de accion analoga a cualquiera de las secuencias de la presente invention. La funcion del vehlculo es facilitar la incorporation del extracto de la invencion asl como tambien de otros compuestos, permitir una mejor dosificacion y administracion o dar consistencia y forma a la composicion farmaceutica. Cuando la forma de presentacion es llquida, el vehlculo es el diluyente.

El vehlcuio farmacologicamente aceptable podrla ser, pero sin limitarse, una nanopartlcuia, un liposoma, una micela o una microemulsion.

Los elementos necesarios para la puesta en practica de la invention, es decir, diagnosticar sensibilidad alergica en un sujeto o evaluar la eficacia de un tratamiento contra la alergia, pueden estar disponibles en forma de kit.

Asl, en otro aspecto, la invencion se relaciona con el uso in vitro de un kit para diagnosticar sensibilidad alergica en un sujeto, o para evaluar si un tratamiento contra la alergia esta siendo efectivo, en donde dicho kit comprende

(i) una pareja de cebadores que comprenden una secuencia de nucleotidos que hibrida de forma especlfica con la secuencia de nucleotidos el del gen PTGDR, (ii) una sonda que hibrida de forma especlfica con la secuencia de nucleotidos del gen del gen PTGDR, y/o

(iii) un anticuerpo que reconoce de forma especlfica la protelna codificada por el gen PTGDR.

En la presente invencion se entiende por "kit” a aquel producto que contiene los diferentes componentes o principios activos necesarios para poner en practica la invencion, es decir, aquellos componentes necesarios para cuantificar los niveles de expresion del gen PTGDR y determinar si un sujeto padece sensibilidad alergica o el tratamiento administrado esta siendo efectivo. Opcionalmente, el kit tambien puede comprender la composition farmaceutica descrita anteriormente util para tratar la alergia. Entre los componentes necesarios para cuantificar los niveles de expresion del gen PTGDR se incluyen, pero no se limitan a, cebadores, sondas y/o anticuerpos.

En la presente invencion se entiende por “cebador”, “iniciador” o “primer’ a la cadena de acido nucleico que permite que la ADN polimerasa comience la slntesis de la nueva cadena de ADN. En la mayorla de replicaciones del ADN, el principal cebador para la slntesis de ADN es una cadena corta de ARN. Este ARN lo produce una ARN polimerasa (primasa) y luego una ADN polimerasa lo elimina y lo sustituye por ADN. En la presente invencion se entiende que una secuencia de nucleotidos dada hibrida de forma especlfica con otra secuencia de nucleotidos cuando ambas secuencias comparten un grado de complementariedad en condiciones de moderada o alta astringencia. Las condiciones exactas que determinan la astringencia de la hibridacion dependen no solamente de la fuerza ionica, temperatura y la concentration de agentes de desestabilizacion como la formamida, sino tambien de factores como la longitud de la secuencia del acido nucleico, la composition base, el porcentaje de desigualdad entre las secuencias de hibridacion y la frecuencia de presencia de subseries de esa secuencia dentro de otras secuencias no identicas. Variando las condiciones de hibridacion desde un nivel de astringencia en el que no ocurre la hibridacion a un nivel en el que se observa primero la hibridacion, pueden determinarse las condiciones que permitiran a una secuencia dada hibridar con otra secuencia. Asl, las condiciones de astringencia alta o moderada pueden determinarse emplricamente, lo cual es practica de rutina para el experto en la materia. En general, cuanto mas alta es la temperatura de hibridacion y mas baja la concentration de sales en el tampon de hibridacion, mas alta es la astringencia y solo se dara hibridacion entre secuencias de nucleotidos muy similares, es decir, con un alto grado de complementariedad.

En la presente invention se entiende por “sonda” a un fragmento de acido nucleico de pequeno tamano usado como herramienta para detectar a una secuencia complementaria de acido nucleico. Como entiende el experto en la materia, tanto las sondas como los cebadores pueden ir marcados en sus extremos para facilitar su localizacion.

Como entiende el experto en la materia, para preparar los cebadores y las sondas que hibridan de forma especlfica con el gen PTGDR es necesario conocer la secuencia de nucleotidos de dicho gen. Dichas secuencias de nucleotidos estan disponibles en las bases de datos accesibles al publico, como por ejemplo, GenBank. No obstante, en una realization particular, el gen PTGDR comprende una secuencia de nucleotidos con una identidad del 100% con la secuencia de nucleotidos SEQ ID NO: 1.

Anticuerpos que reconocen de forma especlfica la protelna codificada por el gen PTGDR han sido definidos previamente en la presente description en parrafos anteriores. Anticuerpos especlficos de la protelna PTGDR pueden obtenerse en el laboratorio a partir de la secuencia de aminoacidos de la protelna PTGDR. Dicha secuencia de aminoacidos, asl como las estructuras secundaria y terciaria de la protelna PTGDR pueden encontrarse en bases datos disponibles al publico como protein DataBank. No obstante, en una realizacion particular, la protelna codificada por el gen PTGDR es la protelna que comprende una secuencia de aminoacidos con una identidad de secuencia del100% con la secuencia SEQ ID NO: 2. Ejemplos de anticuerpos que reconocen de forma especlfica la protelna codificada por el gen PTGDR han sido citados en parrafos anteriores.

En otra realization particular, la sensibilization alergica o alergia se selecciona del grupo que consiste en alergia al polen, alergia a los acaros, alergia al epitelio de los animales y alergia a los hongos. Todos estos terminos han sido definidos y explicados previamente.

Adicionalmente, componentes utiles para la puesta en practica de la invention y que pueden estar comprendidos dentro del kit incluyen, pero no se limitan a, solution tampon, solucion de lisis, material esteril (jeringuillas, hisopos, torundas, pinzas, etc.), agua destiladas, alcoholes (etanol), etc. Adicionalmente, el kit puede contener instrucciones o indicaciones que gulen al experto en la materia en la administration del peptido de la invencion.

A lo largo de la description y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras caracterlsticas tecnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y caracterlsticas de la invencion se desprenderan en parte de la descripcion y en parte de la practica de la invencion. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustracion, y no se pretende que sean limitativos de la presente invencion.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

Figura 1.- Analisis mediante PCR a tiempo real de la expresion de PTGDR en un modelo cronico de asma alergica en raton.

Figura 2.- Representation de la curva ROC para los niveles de expresion de PTGDR y el diagnostico de alergia.

EJEMPLOS

A continuation, se ilustrara la invencion mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la efectividad del producto de la invencion.

Los resultados que se presentan se obtuvieron a partir de un estudio observacional, analltico, de tipo caso-control en el que se analizo la relacion entre la variable nivel de expresion del gen PTGDR en sangre periferica y el desarrollo de distintas manifestaciones cllnicas en pacientes alergicos. Todos los participates recibieron la information de la posibilidad de participar en el estudio y se les solicito su consentimiento informado; se siguieron las normas legales para Estudios Cllnicos en Espana y las del Comite de Etica de la Investigation del Complejo Asistencial Universitario de Salamanca. Los individuos seleccionados para el estudio acudieron a las consultas del Servicio de Inmunoalergia del Complejo Asistencial Universitario de Salamanca y cumplieron con todos los criterios de inclusion que se detallan a continuation.

El Servicio de Inmunoalergia del Hospital Universitario de Salamanca dispone de una base de datos y una genoteca con muestras de mas de 3.000 pacientes con una completa caracterizacion cllnico-biologica de los mismos. Entre estos pacientes se seleccionaron 400 individuos. De ellos, 200 pacientes alergicos diagnosticados por un Facultativo Especialista del Servicio de Inmunoalergia. Dichos pacientes presentaron sintomatologla respiratoria alergica y pruebas de hipersensibilidad inmediata positivas para algun aeroalergeno de una baterla adaptada al medio local.

Estos individuos se han comparado con 200 individuos del grupo control que siguen estrictamente los siguientes criterios: (i) ausencia de slntomas e historia cllnica compatible con alergia; (ii) sin slntomas o historia cllnica compatible con asma o rinitis, (iii) sin slntomas o historia cllnica de enfermedades respiratorias; (iv) test cutaneos negativos frente a la misma baterla de aeroalergenos comunes; (v) sin historia familiar de asma ni rinitis (parentesco de primer grado); y (vi) sin historia familiar de alergia (parentesco de primer grado). Este grupo tan bien caracterizado fue muy diflcil de obtener y resulto esencial para la identification de marcadores en estudios casocontrol. Los datos cllnicos y biologicos se recogieron en un protocolo detallado realizado a partir de las historias cllnicas, la anamnesis y el examen directo de los pacientes. El protocolo incluye tanto datos ambientales como datos cllnicos y de laboratorio para permitir una completa caracterizacion de la poblacion (Global Iniciative for Asthma. Global Strategy for Asthma Management and Prevention. 2014 [cited 2015 Enero 26; Bousquet J, et al. 2008. Allergic Rhinitis and its Impact on Asthma (ARIA) 2008 Update (in collaboration with the World Health Organization, GA(2)LEN and AllerGen). Allergy. 2008 Apr; 63(86) (8-160): p. 63 (86): 8-160; Brozek J, et al. 2010. J Allergy Clin Immunol. 2010 Sep; 126(3)(466-476)). Los niveles de IgE fueron determinados mediante enzimoinmunoanalisis ImmunoCAP Total IgE (Thermo Fisher Scientific, Waltham, EEUU). Los test cutaneos se realizaron de acuerdo con las recomendaciones de la Academia Europea de Alergia e Inmunologla Cllnica (Clinical SCoSTotEAoAa. Skin tests used in type I allergy testing Position paper. Allergy. 1989; 44(10) (1-59)) El modelo estadlstico para el analisis de las variables se llevo a cabo entre otros por un analisis multivariante incluyendo correlation canonica.

El analisis de expresion genica de PTGDR se llevo a cabo mediante PCR a tiempo real. Se procedio a la extraction de ARN total a partir de muestras de sangre periferica de los individuos objeto de estudio. La extraccion se llevo a cabo con el kit comercial Ribopure-Blood (Ambion). La calidad y cantidad de las muestras de ARN se analizo mediante espectrometrla y en un Bioanalizador Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent). Posteriormente las muestras de ARN fueron analizadas y sometidas a retrotranscripcion mediante el kit SuperScript III (Thermo Fisher Scientific). El ADNc se utilizo como base en los experimentos de RT-qPCR que se llevaron a cabo en un equipo LightCycler 480 II (Roche). Para cada muestra los resultados se analizaron por triplicado. En todos los experimentos se analizaron de forma conjunta pacientes y controles para evitar posibles sesgos experimentales. Los resultados se analizaron mediante el metodo Livak (Livak K, 2001. Methods. 25(4) (402-408): p. 25: 402-408; Livak K, Schmittgen T. 2004. Guide to Performing Relative Quantification of Gene Expression Using Real-Time Quatitative PCR.) y se normalizaron con genes constitutivos cuidadosamente seleccionados basandonos en experimentos previos llevados a cabo en nuestro laboratorio utilizando el sistema Real Time ready Human Reference Gene Panel (Roche), entre los cuales destacan GAPDH y TBP por su estabilidad y reproducibilidad (ver Tabla 1). Todos los experimentos de analisis de la expresion se llevaron a cabo siguiendo las normas MIQE (Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments) que tienen como objetivos fomentar la fiabilidad de los resultados para ayudar a asegurar la integridad de la literatura cientlfica, promover la coherencia entre los laboratorios, y aumentar la transparencia experimental (Bustin S, Benes V, Garson J, Hellemans J, Huggett J, Kubista M, et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 2009 April; 55(4)(611-622):p.

55(4): 611-622).

Tabla 1

El analisis estadlstico de los datos obtenidos se llevo a cabo empleando el programa SPSS version 19.0. (Chicago, Illinois, USA) para analizar la posible asociacion existente entre el nivel de expresion del gen PTGDR y la enfermedad alergica. Este analisis estadlstico nos permitio concluir que existe una asociacion estadlsticamente significativa entre el aumento de los niveles de expresion del gen PTGDR y la presencia del fenotipo alergico (media de expresion en pacientes alergicos: 0,915, media en controles no alergicos: 0,682, p=0,001, poder estadlstico=95%). Esta asociacion se mantuvo en todos los subfenotipos de alergia observados en los pacientes que incluyen tanto sensibilizacion a distintos alergenos como distintas manifestaciones cllnicas de la enfermedad (rinitis alergica, asma alergica, etc.).

Paralelamente se procedio a corroborar los resultados obtenidos mediante la determination de los niveles de expresion del gen PTGDR en un modelo murido (Marques-Garcla F, Marcos-Vadillo E.2016. Mouse Models Applied to the Research of Pharmacological Treatments in Asthma. Methods Mol Biol.1434:239-53. doi: 10.1007/978-1-4939-3652-6_17. PubMed PMID: 27300543). El grupo de investigation de los inventores ha desarrollado modelos de asma alergica en raton mediante la estimulacion con OVA (ovoalbumina) y el posterior tratamiento de la enfermedad con dexametasona para evaluar el comportamiento del biomarcador objeto de estudio en distintas situaciones (ratones control, ratones sensibilizados o "alergicos”, ratones no sensibilizados y ratones sensibilizados tratados con dexametasona). Tras analizar mediante PCR a tiempo real la expresion relativa del gen PTGDR (Table 2), se observaron diferencias estadlsticamente significativas entre las distintas condiciones experimentales (Kruskal-Wallis p=0,013).

Tabla 2

Los ratones sensibilizados al igual que los pacientes alergicos presentaron un aumento generalizado de los niveles de PTGDR con respecto a los de los grupos control. Al analizar el efecto de la dexametasona sobre este modelo animal se comprobo que PTGDR responde al tratamiento corticoideo. En este caso se observo una disminucion significativa de los niveles de PTGDR tras el tratamiento con el dexametasona, que podrla estar relacionada con el papel de los corticoides en el tratamiento de la alergia (Figura 1).

Tanto entre los dos grupos control como entre los dos grupos de ratones asmaticos, se comprobo que el tratamiento con dexametasona provoco una disminucion de los niveles de PTGDR. Asl, los ratones control tratados con dexametasona presentaron una mediana inferior, 1,02 (RI=0,89), a la mostrada por los controles no tratados, 2,17 (RI=3,24). Sin embargo, el poder estadlstico en este caso fue muy bajo, del 21,5%. Finalmente, tambien se observo una disminucion de la expresion de PTGDR en los ratones asmaticos y tratados con dexametasona respecto a los ratones estimulados con OVA pero que no recibieron tratamiento con el corticoide. Las medianas obtenidas fueron 36,08 (RI=26,32) frente a 84,45 (RI=77,96), respectivamente, aunque en este caso el poder estadlstico fue incluso menor, del 9,3 %.

Para analizar el potencial de aplicacion cllnica en el diagnostico de alergia de los niveles de expresion de PTGDR, se procedio a realizar una curva ROC (Figura 2) y se obtuvo un area bajo la curva de 0,654, con un IC 95 % (0,588-0,721) y un error estandar de 0,034. El analisis de dicha curva proporciona un posible punto de corte para la expresion de PTGDR de 0,51 para el cual se obtiene un 81,4% de sensibilidad y un 42,3% de especificidad. El valor predictivo positivo para este punto de corte es del 72% y el valor predictivo negativo del 55%. A la luz de estos resultados, se puede concluir que se ha obtenido un marcador mas sensible para el diagnostico de la sensibilidad alergica que los existentes en la actualidad.

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Metodo in vitro para diagnosticar sensibilizacion alergica en un sujeto que comprende

(a) cuantificar los niveles de expresion del gen que codifica el receptor de la prostaglandina D (gen PTGDR) en una muestra biologica aislada de dicho sujeto, y (b) comparar el nivel de expresion previamente obtenido con la expresion de dicho gen en una muestra control,

en donde si los niveles de expresion del gen PTGDR estan incrementados con respecto a los niveles de expresion de dicho gen en la muestra control, entonces el sujeto padece sensibilidad alergica.

2. Metodo para evaluar la eficacia de un tratamiento contra la alergia administrado a un sujeto que comprende

(a) cuantificar los niveles de expresion del gen PTGDR en una muestra biologica aislada de dicho sujeto antes y despues de la administration del tratamiento, y (b) comparar el nivel de expresion obtenido antes del tratamiento con el nivel de expresion obtenido despues del tratamiento,

en donde un nivel de expresion del gen PTGDR despues del tratamiento menor que el nivel de expresion de dicho gen antes del tratamiento, es indicativo de que el tratamiento administrado esta siendo eficaz contra la alergia.

3. Metodo segun la revindication 1 o 2, en el que la muestra biologica es una muestra de sangre periferica, esputo u orina.

4. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la cuantificacion de los niveles de expresion del gen PTGDR comprende la cuantificacion del ARN mensajero (ARNm) de dicho gen, o un fragmento de dicho ARNm, el ADN complementario (ADNc) de dicho gen, o un fragmento de dicho ADNc, o sus mezclas.

5. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la cuantificacion de los niveles de expresion se realiza mediante una reaction en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativa, un array de ADN o ARN, o RNA-Seq.

6. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la cuantificacion de los niveles de expresion del gen PTGDR comprende la cuantificacion de los niveles de protelna codificada por dicho gen o un fragmento de dicha protelna.

7. metodo segun la reivindicacion 6, en el que la protelna codificada por el gen PTGDR es la protelna que comprende una secuencia de aminoacidos con una identidad de secuencia del 100% con la secuencia SEQ ID NO: 2.

8. Metodo segun la reivindicacion 6 o 7, en el que la cuantificacion de los niveles de protelna se realiza mediante Western blot, ELISA, un array de protelnas o un estudio de binding.

9. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la sensibilizacion alergica o alergia se selecciona del grupo que consiste en alergia al polen, alergia a los acaros, alergia al epitelio de los animales y alergia a los hongos.

10. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el gen PTGDR comprende una secuencia de nucleotidos con una identidad del 100% con la secuencia de nucleotidos SEQ ID NO: 1.

11. Un kit para diagnosticar sensibilidad alergica en un sujeto, o para evaluar si un tratamiento contra la alergia esta siendo efectivo que comprende una pareja de cebadores que comprenden la secuencia de nucleotidos SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8.

12. Uso in vitro de un kit segun la reivindicacion 11 para diagnosticar sensibilidad alergica en un sujeto, o para evaluar si un tratamiento contra la alergia esta siendo efectivo

13. Uso segun la reivindicacion 12, en donde la sensibilizacion alergica o alergia se selecciona del grupo que consiste en alergia al polen, alergia a los acaros, alergia al epitelio de los animales y alergia a los hongos.