ES2670986T3

ES2670986T3 - Nuevo gen GPIIIa

Info

Publication number: ES2670986T3
Application number: ES08764706.1T
Authority: ES
Inventors: Atsuko Taniue; Hiroyuki Ishii; Shinji Maekawajiri; Nozomi Nagata; Takanori Oka
Original assignee: Wakunaga Pharmaceutical Co Ltd; Japanese Red Cross Society
Current assignee: Wakunaga Pharmaceutical Co Ltd; Japanese Red Cross Society
Priority date: 2007-05-25
Filing date: 2008-05-26
Publication date: 2018-06-04
Anticipated expiration: 2028-05-26
Also published as: JP5602426B2; JPWO2008146797A1; CN101849003A; KR20100028566A; KR101624357B1; US9079961B2; TW200904978A; CA2687937C; WO2008146797A1; EP2161335A1; EP2161335A4; CA2687937A1; EP2161335B1; US20100173292A1

Abstract

Polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos de un gen GPIIIa, en el que el residuo de nucleótido correspondiente al de la posición 1297 de la SEQ ID NO: 1 es un residuo de timina, o un fragmento del mismo que comprende dicho residuo de timina y que tiene una longitud de al menos 10 bases.

Description

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DESCRIPCION

Nuevo gen GPIIIa CAMPO TÉCNICO

[0001] La presente invención se refiere a un nuevo gen GPIIIa que es un marcador para la determinación de púrpura trombocitopénica neonatal aloinmune o el riesgo de desarrollarla. Más particularmente, la presente invención se refiere a un medio para detectar la mutación en el gen GPIIIa, un procedimiento de detección y un kit de detección de la mutación.

TÉCNICA ANTERIOR

[0002] Las plaquetas se adhieren a un sitio de angiopatía y a continuación se unen (agregan) entre sí para formar un trombo, y estas funciones están controladas por diversas proteínas existentes en la membrana de las plaquetas. Los ejemplos conocidos de tales proteínas de membrana incluyen GPI (glucoproteína I), GPIIb (glicoproteína 11 b) y GPIIIa (glicoproteína IIIa). Con respecto a GPIIIa, el ADNc de longitud completa que codifica una proteína GPIIIa se aisló de plaquetas de un individuo normal, y se ha especificado su estructura de gen (J. Biol. Chem. 262 (9) pág. 3936-3939). Además, se han llevado a cabo investigaciones sobre antígenos plaquetarios existentes en estas proteínas de membrana (HPA-1 a 7) (J. Clin. Invest 40 P1597 (1961), Prog. Hematol. 4 P222 (1964), Vox Sang 4 P161 (1959 ), Vox Sang 39 p113 (1980)).

[0003] Los antígenos plaquetarios son conocidos como causas de la púrpura trombocitopénica neonatal aloinmune (NAITP), púrpura postransfusional, refractariedad a la terapia de transfusión de plaquetas, y similares. En los individuos japoneses, se dice que los anticuerpos anti-HPA-2b están involucrados en la refractariedad a terapia de transfusión de plaquetas y los anticuerpos anti-HPA-4b están involucrados en NAITP. Por lo tanto, la tipificación del tipo antígeno plaquetario se está convirtiendo en clínicamente importante.

[0004] Los tipos de antígenos plaquetarios se producen debido a los polimorfismos de varias glicoproteínas (Tabla 1), cuyos polimorfismos son producidos por la sustitución de un solo aminoácido a nivel de proteína o una sustitución de una sola base a nivel genético. Por lo tanto, en la tipificación del antígeno plaquetario basada en el gen, se evalúa tal diferencia de una sola base (Japanese Journal of Transfusion Medicine.Vol.No.1 39 (1): 204-211, 1993).

[Tabla 1]

Sistema de antígeno: Antígeno Proteína de membrana de plaqueta Sustitución de aminoácido Codón

HPA-1: HPA-1a GPIIIa Leu (33) CTG

HPA-1b: Pro CCG

HPA-2: HPA-2a GPIb Thu (145) ACG

HPA-2b: Met ATG

HPA-3: HPA-3a GPIIb Ile (843) ATC

HPA-3b: Ser AGC

HPA-4: HPA-4a GPIIIa Arg (143) CGA

HPA-4b: Gln CAA

HPA-5: HPA-5a GPIa Glu (505) GAG

HPA-5b: Lys AAG

HPA-6: HPA-6a GPIIIa Arg (489) CGA, CGG

HPA-6b: Gln CAG

HPA-7: HPA-7a GPIIIa Pro (407) CCC

HPA-7b: Ala GCC

HPA-8: HPA-8a GPIIIa Arg (636) CGT

HPA-8b: Cys TGT

NaKa: NaKa+ CD36 Pro (90) CCT

NaKa-: Ser TCT

[0005] Sin embargo, también existen tipos de antígenos plaquetarios desconocidos, y no se ha logrado todavía una suficiente elucidación de los mismos. Con respecto a HPA-7, los únicos polimorfismos descritos hasta ahora son HPA-7a, en el que la base en la posición 1297 en el gen GPIIIa es citosina (el aminoácido en la posición 407 es prolina) y HPA-7b en el que la base en la posición 1297 en el gen es guanina (el aminoácido en la posición 407 es alanina) (Kuijpers et al Blood:. 81: 70-76, 1993).

[0006] Ko et al. (Journal of transfusión and cell therapy, vol. 53, página 220, 2007) describe además un nuevo alelo encontrado del sitio del exón 9 del gen GPIIIa en HPA-7 que corresponde a la posición 1297 y el aminoácido en la

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posición 407. Sin embargo, Ko et al. no describen todas las mutaciones en la posición 1297, en particular no describen la mutación 1297 T.

CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN

[0007] Los presentes inventores han encontrado un nuevo antígeno específico de plaquetas en un análisis de la púrpura trombocitopénica neonatal aloinmune (NAITP). Específicamente, los presentes inventores han encontrado que el residuo de nucleótido en la posición 1297 existente en el exón 9 del gen GPIIIa, que normalmente es citosina, está sustituido de citosina a timina en un paciente que sufre de púrpura trombocitopénica neonatal aloinmune. Además, los presentes inventores han encontrado que esta sustitución estaba involucrada en púrpura trombocitopénica neonatal aloinmune (Ejemplo 1). La presente invención se basa en este hallazgo.

[0008] Un objeto de la presente invención es proporcionar un nuevo gen y proteína GPIIIa mutados, medios para detectar la mutación en el gen y la proteína, un procedimiento de detección y un kit de detección de la mutación.

[0009] Según la presente invención, se proporciona un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos del gen GPIIIa, en el que el residuo de nucleótido en la posición 1297 del gen GPIIIa (SEQ ID NO: 1) es un residuo de timina o un fragmento del mismo, que comprende el residuo timina y que tiene una longitud de al menos 10 bases (en lo sucesivo denominado "polinucleótido, según la presente invención").

[0010] Según la presente invención, se proporciona una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la proteína GPIIIa, en el que el residuo de aminoácido en la posición 407 de la proteína GPIIIa (SEQ ID NO: 2) es un residuo de serina, o un fragmento del mismo que comprende el residuo de serina, que tiene al menos 6 residuos de aminoácidos (en lo sucesivo denominado la "proteína, según la presente invención").

[0011] Según la presente descripción, se proporciona un cebador que puede hibridar con una secuencia de nucleótidos del polinucleótido según la presente invención o una secuencia complementaria de la misma, y que se usa para la amplificación, mediante un procedimiento de amplificación de ácido nucleico, de una región que comprende el residuo de nucleótido en la posición 1297 del gen GPIIIa o el residuo que se empareja con el mismo (en lo sucesivo denominado "cebador según la presente descripción"). Este cebador está comprendido en un kit para detectar el polimorfismo 1297T según la presente invención.

[0012] Según la presente descripción, se proporciona un conjunto de cebadores que consiste en dos o más clases de los cebadores según la presente invención, que se utiliza para la amplificación, mediante un procedimiento de amplificación de ácido nucleico, de una región que comprende el residuo de nucleótido en la posición 1297 del gen GPIIIa o el residuo que se empareja con el mismo (en lo sucesivo denominado "conjunto de cebadores según la presente descripción"). Este conjunto de cebadores está comprendido en un kit para detectar el polimorfismo 1297T según la invención.

[0013] Según la presente descripción, se proporciona una sonda que puede hibridar con una secuencia de nucleótidos del polinucleótido según la presente invención o una secuencia complementaria de la misma, y que se utiliza para la detección del residuo de timina en la posición 1297 de la gen GPIIIa (en lo sucesivo denominado la "sonda según la presente descripción"). Esta sonda está comprendida en un kit para detectar el polimorfismo 1297T según la invención.

[0014] Según la presente invención, se proporciona un anticuerpo contra la proteína o un fragmento de la misma según la presente invención (en lo sucesivo denominado el "anticuerpo según la presente invención"). Siendo dicho anticuerpo específico al residuo de aminoácido en la posición 407 de la proteína GPIIIa que es un residuo de serina.

[0015] Según la presente descripción, se proporciona un procedimiento para determinar púrpura trombocitopénica neonatal aloinmune o el riesgo de desarrollarla, mediante la detección de la mutación en el gen GPIIIa, que comprende la etapa de detectar el resto de timina en la posición 1297 del gen GPIIIa usando el cebador, el conjunto de cebadores o la sonda según la presente invención.

[0016] Además, según la presente descripción, se proporciona un procedimiento para determinar púrpura trombocitopénica neonatal aloinmune o el riesgo de desarrollarla, mediante la detección de la mutación del gen GPIIIa, que comprende una etapa de detectar el residuo serina en la posición 407 de la proteína GPIIIa usando el anticuerpo según la presente invención (en lo sucesivo, los dos procedimientos descritos anteriormente se denominan colectivamente el "primer procedimiento de la presente descripción").

[0017] Según la presente descripción, se proporciona un procedimiento para determinar la posibilidad de aparición de la refractariedad a la terapia de transfusión de plaquetas en la transfusión de plaquetas, mediante la detección de la mutación del gen GPIIIa, que comprende la etapa de detectar el residuo de timina en la posición 1297 del gen GPIIIa usando el cebador, el conjunto de cebadores o la sonda según la presente invención.

[0018] Además, según la presente descripción, se proporciona un procedimiento para determinar la posibilidad de

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aparición de la refractariedad a la terapia de transfusión de plaquetas en la transfusión de plaquetas mediante la detección de la mutación del gen GPIIIa, que comprende la etapa de detectar el residuo serina en la posición 407 de la proteína GPIIIa usando el anticuerpo según la presente invención (en lo sucesivo, los dos procedimientos descritos anteriormente se denominan colectivamente el "segundo procedimiento de la presente descripción").

[0019] Según la presente invención, se proporciona un kit para determinar púrpura trombocitopénica neonatal aloinmune o el riesgo de desarrollarla, que comprende al menos el cebador, el conjunto de cebadores, la sonda como se describen anteriormente o el anticuerpo según la presente invención.

[0020] Según la presente invención, se proporciona un kit para determinar la posibilidad de aparición de la refractariedad a la terapia de transfusión de plaquetas en la transfusión de plaquetas, que comprende al menos el cebador, el conjunto de cebadores, la sonda como se describen anteriormente o el anticuerpo según la presente invención.

[0021] La sonda, el cebador, el conjunto de cebadores, tal como se describen anteriormente, o el anticuerpo según la presente invención se pueden utilizar como un marcador para la determinación la púrpura trombocitopénica neonatal aloinmune o el riesgo de desarrollarla. Por lo tanto, la presente invención es útil para las pruebas genéticas para púrpura trombocitopénica neonatal aloinmune y similares. Además, la sonda, el cebador, el conjunto de cebadores, tal como se describen anteriormente, o el anticuerpo según la presente invención se pueden utilizar como un marcador para determinar la posibilidad de aparición de la refractariedad a la terapia de transfusión de plaquetas en la transfusión de plaquetas. Por lo tanto, la presente invención es útil para la predicción del efecto de transfusión en la transfusión de plaquetas y similares.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[Gen mutado y proteína mutada]

[0022] El polinucleótido según la presente invención se puede utilizar como un ácido nucleico estándar marcado en la hibridación competitiva para la detección de la mutación del residuo de nucleótido en la posición 1297 del gen GPIIIa (SEQ ID NO: 1), es decir, la sustitución al residuo de timina (en lo sucesivo, denominado el "polimorfismo 1297T del gen GPIIIa") (Ejemplo 1). Además, se puede utilizar como una secuencia de nucleótidos de una sonda de oligonucleótidos para su uso en la detección.

[0023] En la presente memoria, el "(residuo de nucleótido en la posición 1297 del gen GPIIIa" significa el residuo de nucleótido situado en la posición 1297 contada desde el punto de partida, es decir, el primer residuo que es el residuo de adenina del codón de iniciación en la región que codifica un péptido señal en el gen GPIIIa.

[0024] Las posiciones 1 a 78 del gen GPIIIa constituyen la región que codifica un péptido señal, y las posiciones 79 a 2364 del gen GPIIIa constituyen la región que codifica una proteína madura.

[0025] El ácido nucleico estándar marcado para detectar el polimorfismo 1297T del gen GPIIIa puede ser uno capaz de detectar la sustitución del residuo de nucleótido en la posición 1297 del gen GPIIIa al residuo timina, y también puede ser un fragmento del polinucleótido según la presente invención. El fragmento del polinucleótido según la presente invención es, en particular, un fragmento de un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos del gen GPIIIa, de la que el residuo de nucleótido en la posición 1297 es un residuo de timina, en el que el fragmento comprende el residuo de timina y tiene una longitud de por lo menos 10 bases.

[0026] El polinucleótido según la presente invención incluye un polinucleótido seleccionado de los siguientes (i), (ii),

(iii) y (iv):

(i) un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1;

(ii) un polinucleótido que consiste en una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 en la que se insertan, se sustituyen y/o se eliminan uno o más nucleótidos y/o se añaden uno o más nucleótidos a uno o ambos de sus extremos, y que codifica una proteína funcionalmente equivalente a una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 (con la condición de que, en el polinucleótido, el residuo de nucleótido de la posición 1297 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 es un residuo de timina) ;

(iii) un polinucleótido que se hibrida, bajo condiciones rigurosas, con un polinucleótido que consiste en la secuencia complementaria de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1, y que codifica una proteína funcionalmente equivalente a una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 (con la condición de que, en el polinucleótido, el residuo de nucleótido correspondiente al residuo de nucleótido de la posición 1297 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 es un residuo de timina); y

(iv) un polinucleótido que tiene un 70% o más de identidad con un polinucleótido que consiste en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1, y que codifica una proteína funcionalmente equivalente a una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 (con la condición de que, en el polinucleótido, el residuo de nucleótido correspondiente al residuo de nucleótido de la posición 1297 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 es un residuo de timina).

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[0027] La secuencia en las posiciones 1 a 78 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 es una secuencia que codifica un péptido señal (GenBank n° de acceso NM_000212). En la presente invención, la secuencia que codifica un péptido señal no está limitada a esta secuencia, siempre que pueda codificar un péptido capaz de funcionar como un péptido señal.

[0028] El polinucleótido según la presente invención es preferiblemente un polinucleótido que codifica una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o una parte de la misma que comprende el residuo de aminoácido en la posición 407 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

[0029] En la presente invención, cuando se proporciona la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, las secuencias de nucleótidos que la codifican se pueden determinar fácilmente, y se pueden seleccionar varias secuencias de nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

[0030] Por consiguiente, un polinucleótido que codifica una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 también significa no sólo una parte de toda la secuencia de ADN de SEQ ID NO: 1, una secuencia de ADN que codifica los mismos aminoácidos, que tiene un codón que tiene una relación de degeneración con la misma como una secuencia de ADN. La presente descripción incluye, además, las secuencias de ARN correspondientes a estas secuencias.

[0031] Un ejemplo preferido de un polinucleótido que codifica una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 incluye un polinucleótido que consiste en una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1.

[0032] En la presente memoria, ya sea o no una proteína que es funcionalmente equivalente a la proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, se puede determinar mediante la evaluación de los fenómenos biológicos o funciones relacionadas con la expresión de la proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

[0033] El polinucleótido según la presente invención es preferiblemente un polinucleótido que consiste en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 o un fragmento de la misma que comprende el residuo de nucleótido en la posición 1297 de la SEQ ID NO: 1. El polinucleótido según la presente invención es más preferiblemente un polinucleótido que comprende al menos un polinucleótido que consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 7 (secuencia de nucleótidos en las posiciones 1201 a 1391 en SEQ ID NO: 1). El polinucleótido según la presente invención es aún más preferiblemente un polinucleótido que comprende al menos un polinucleótido que consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3 (secuencia de nucleótidos en las posiciones 1281 a 1320 en SEQ ID NO: 1).

[0034] La proteína según la presente invención se puede utilizar como un antígeno para la preparación de un anticuerpo capaz de detectar la mutación del residuo de aminoácido en la posición 407 de la proteína GPIIIa, es decir, la sustitución al residuo serina (en lo sucesivo, se denomina el "polimorfismo 407S de la proteína GPIIIa).

[0035] En la presente memoria, el "residuo de aminoácido en la posición 407 de la proteína GPIIIa" significa el residuo de aminoácido situado en la posición 407 contada desde el punto de partida, es decir, el primer residuo, que es el residuo de glicina en el extremo N-terminal de la secuencia de aminoácidos que constituye la proteína GPIIIa madura.

[0036] La "proteína GPIIIa madura" indica una proteína codificada por la secuencia de nucleótidos en las posiciones 79 a 2364 del gen GPIIIa, que no comprende el péptido señal. Por ejemplo, es una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

[0037] La proteína según la presente invención incluye una proteína seleccionada de las siguientes (v), (vi), (vii) y (viii):

(v) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2;

(vi) una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 en la que se insertan, sustituyen y/o se eliminan uno o más aminoácidos y/o se añaden uno o más aminoácidos a uno o ambos de sus extremos, y que es funcionalmente equivalente a una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 (con la condición de que el residuo de aminoácido en la posición 407 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 es un residuo de serina);

(vii) una proteína que es codificada por un polinucleótido que hibrida, en condiciones rigurosas, con un polinucleótido que consiste en la secuencia complementaria de la secuencia de nucleótidos de un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y que es funcionalmente equivalente a una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 (con la condición de que el residuo de aminoácido que corresponde al residuo aminoácido en la posición 407 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 es un residuo de serina); y

(viii) una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene el 70% o más de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y que es funcionalmente equivalente a una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 (con la condición de que el residuo de aminoácido que corresponde al

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residuo aminoácido en la posición 407 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 es un residuo de serina).

[0038] La proteína según la presente invención es preferiblemente una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o un fragmento de la misma que comprende el residuo de aminoácido en la posición 407 de la SEQ ID NO: 2. La proteína según la presente invención es más preferiblemente una proteína (polipéptido) que comprende al menos un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 (secuencia de aminoácidos en las posiciones 381 a 450 en la SEQ ID NO: 2). La proteína según la presente invención es aún más preferiblemente una proteína (polipéptido) que comprende al menos un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 (secuencia de aminoácidos en las posiciones 395 a 420 en la SEQ ID NO: 2).

[0039] El antígeno para preparar un anticuerpo capaz de detectar el polimorfismo 407S de la proteína GPIIIa puede ser uno capaz de detectar la sustitución del residuo de aminoácido en la posición 407 en la proteína GPIIIa al residuo de serina, y también puede ser un fragmento de la proteína (péptido) según la presente invención. El fragmento de la proteína según la presente invención es, en particular, un fragmento de una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la proteína GPIIIa de la que el residuo de aminoácido en la posición 407 es un residuo serina, en el que el fragmento comprende el residuo de serina.

[0040] El fragmento de la proteína según la presente invención es un polipéptido que tiene al menos 6 residuos de aminoácidos (por ejemplo, 8, 10, 12 15 o más residuos de aminoácidos).

[0041] En la presente invención, el "gen GPIIIa" es conocido como un gen que codifica una proteína de membrana de las plaquetas, y ha sido registrado con el N° de Acceso de GenBank M35999 (SEQ ID NO: 5 (secuencia de bases), SEQ ID nO: 6 (secuencia de aminoácidos)) o el N° de Acceso NM_000212.

[0042] El gen GPIIIa incluye no sólo el polinucleótido de la siguiente (I'), sino también un polinucleótido homólogo seleccionado de los siguientes (II'), (III') y (IV'):

(i') un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5;

(ii') un polinucleótido que consiste en una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5 en la que se insertan, sustituyen y/o se eliminan uno o más nucleótidos y/o se añaden uno o más nucleótidos a uno o ambos de sus extremos, y que codifica una proteína funcionalmente equivalente a una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6;

(iii') un polinucleótido que se hibrida, bajo condiciones rigurosas, con un polinucleótido que consiste en la secuencia complementaria de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5, y que codifica una proteína funcionalmente equivalente a una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6; y (iv') un polinucleótido que tiene el 70% o más de identidad con un polinucleótido que consiste en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5, y que codifica una proteína funcionalmente equivalente a una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

[0043] La secuencia en las posiciones 1 a 78 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5 es una secuencia que codifica el péptido señal (GenBank de N° de acceso NM_000212). En la presente invención, la secuencia que codifica el péptido señal no está limitada a esta secuencia, siempre que pueda codificar un péptido capaz de funcionar como un péptido señal.

[0044] El gen GPIIIa es preferiblemente un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5.

[0045] Además, el gen GPIIIa es preferiblemente un polinucleótido que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

[0046] Como proteína GPIIIa, además de la proteína de (v') a continuación, se proporcionan las proteínas (polipéptidos) homólogas seleccionadas de (vi'), (vii'), y (viii'):

(v') una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6;

(vi') una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos como la SEQ ID NO: 6 en la que se insertan, sustituyen y/o se eliminan uno o más aminoácidos y/o se añaden uno o más aminoácidos a uno o ambos de sus extremos, y que es funcionalmente equivalente a una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6;

(vii') una proteína que es codificada por un polinucleótido que hibrida, en condiciones rigurosas, con un polinucleótido que consiste en la secuencia complementaria de una secuencia de nucleótidos de un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, y que es funcionalmente equivalente a una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; y

(viii') una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene el 70% o más de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, y que es funcionalmente equivalente a una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6.

[0047] La proteína GPIIIa es preferiblemente una proteína codificada por la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID

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[0048] Además, como proteína GPIIIa, se proporciona más preferiblemente una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

[0049] En la presente memoria, "se insertan, sustituyen y/o se eliminan uno o más nucleótidos y/o se añaden uno o más nucleótidos a uno o ambos de sus extremos" y "se insertan, sustituyen y/o se eliminan uno o más aminoácidos y/o se añaden uno o más aminoácidos a uno o ambos de sus extremos " significa que la modificación se ha llevado a cabo mediante un procedimiento técnico bien conocido, tal como la mutagénesis dirigida al sitio, o por sustitución de una pluralidad de nucleótidos o aminoácidos en un grado en que se puede producir de forma natural. El número de nucleótidos o aminoácidos a modificar puede ser, por ejemplo, de 1 a 30, preferiblemente de 1 a 20, más preferiblemente de 1 a 10, aún más preferiblemente de 1 a 4, con especial preferencia de 1 a 2 inserciones, sustituciones o eliminaciones, y/o la adición o adiciones a uno o ambos de los extremos.

[0050] La secuencia de nucleótidos modificada del polinucleótido según la presente invención es una secuencia de nucleótidos modificada que no afecta el residuo de nucleótido de la posición 1297 del gen GPIIIa, y puede ser preferiblemente una secuencia de nucleótidos del polinucleótido según la presente invención que tiene una o más (por ejemplo, una o varias, o 1, 2, 3 o 4) mutaciones que no afectan a las funciones de una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.

[0051] La secuencia de nucleótidos modificada del gen GPIIIa puede ser preferiblemente una secuencia de nucleótidos del gen GPIIIa que tiene una o más (por ejemplo, una o varias, o 1, 2, 3 o 4) mutaciones que no afectan a las funciones de una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

[0052] La secuencia de aminoácidos modificada de la proteína según la presente invención es una secuencia de aminoácidos modificada que no afecta al residuo de aminoácido en la posición 407 de la proteína GPIIIa, y puede ser preferiblemente una secuencia de aminoácidos de la proteína según la presente invención que se muestra en la SEQ ID NO: 2 que tiene una o más (por ejemplo, una o varias, o 1, 2, 3 o 4) sustituciones conservativas.

[0053] La secuencia de aminoácidos modificada de la proteína GPIIIa puede ser preferiblemente la secuencia de aminoácidos de la proteína GPIIIa que se muestra en la SEQ ID NO: 6 que tiene una o más (por ejemplo, una o varias, o 1, 2, 3 o 4) sustituciones conservativas.

[0054] En la presente memoria, una "sustitución o sustituciones conservativa" significa que uno o más residuos de aminoácidos están sustituidos por un residuo o residuos de aminoácidos que son químicamente similares a los misms de tal manera que las funciones de la proteína no se modifican sustancialmente. Ejemplos de la misma incluyen los casos en que un determinado residuo hidrofóbico es sustituido por otro residuo hidrofóbico y los casos en que un determinado residuo polar se sustituye por otro residuo polar que tienen la misma carga eléctrica. Dicho aminoácido o aminoácidos funcionalmente similares que pueden ser sustituidos son conocidos en la técnica para cada aminoácido. Los ejemplos particulares de los mismos incluyen, como aminoácidos no polares (hidrófobos), alanina, valina, isoleucina, leucina, prolina, triptófano, fenilalanina y metionina. Los ejemplos de aminoácidos polares (neutros) incluyen glicina, serina, treonina, tirosina, glutamina, asparagina y cisteína. Los ejemplos de aminoácidos (básicos) que tienen carga positiva incluyen arginina, histidina y lisina. Los ejemplos de aminoácidos (ácidos) que tienen carga negativa incluyen ácido aspártico y ácido glutámico.

[0055] En la presente memoria, "hibridar" significa hibridarse, en condiciones rigurosas, con un polinucleótido diana, mientras que no se hibride con nucleótidos distintos del nucleótido diana. Las "condiciones rigurosas" se pueden determinar en base a la temperatura de fusión (°C) de la doble cadena formada por la secuencia de sonda o la secuencia de cebador y la cadena complementaria de la misma, la concentración de sal de la solución y similares. El establecimiento de condiciones rigurosas apropiadas después de seleccionar una secuencia de sonda o una secuencia de cebador es una técnica bien conocida para los expertos en la técnica (por ejemplo, Molecular Cloning 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)).

[0056] La hibridación se puede llevar a cabo según un procedimiento conocido. En los casos donde se utiliza una biblioteca disponible comercialmente, se puede llevar a cabo según el procedimiento descrito en las instrucciones del fabricante adjuntas al mismo.

[0057] En la presente memoria, el término "identificar" con respecto a una secuencia de bases o una secuencia de aminoácidos significa el grado de coincidencia, entre las secuencias que deben compararse, de las bases o residuos de aminoácidos que constituyen cada secuencia. El valor de cada "identificar" indicado en la presente memoria puede ser un valor calculado por un programa de búsqueda de homologías conocido por los expertos en la técnica, y se puede calcular fácilmente mediante FASTA, BLAST o similar usando el valor los parámetros por defecto (ajuste inicial).

[0058] Una secuencia de aminoácidos que tiene el 70% o más de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 puede ser una secuencia de aminoácidos que tiene preferiblemente 80% o más, más preferiblemente

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98% o más, y lo más preferiblemente 99% o más de identidad con la misma.

[0059] Una secuencia de aminoácidos que tiene el 70% o más de identidad con SEQ ID NO: 6 puede ser una secuencia de aminoácidos que tiene preferiblemente 85% o más, aún más preferiblemente 90% o más, aún más preferiblemente 95%

98% o más, y lo más preferiblemente 99% o más de identidad con la misma.

[0060] En la presente invención, cuando se proporciona la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6 se puede determinar fácilmente secuencias de nucleótidos que la codifican y se pueden seleccionar varias secuencias de nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

[0061] Por consiguiente, un polinucleótido que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 también significa no sólo una parte de toda la secuencia de ADN de SEQ ID NO: 5, una secuencia de ADN que codifica los mismos aminoácidos, que tiene un codón que tiene una relación de degeneración con la misma como una secuencia de ADN. La presente descripción incluye, además, las secuencias de ARN correspondientes a estas secuencias.

[0062] Un ejemplo preferido de un polinucleótido que codifica una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 incluye un polinucleótido que consiste en una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5.

[0063] En la presente memoria, ya sea o no una proteína que es funcionalmente equivalente a la proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, se puede determinar mediante la evaluación de los fenómenos biológicos o funciones relacionadas con la expresión de la proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

[0064] Según la presente invención, se proporciona un polinucleótido que consiste en una secuencia complementaria de una secuencia de nucleótidos de un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos del gen GPIIIa, en el que el residuo de nucleótido en la posición 1297 del gen GPIIIa es el residuo de timina, o un fragmento del mismo, que comprende el emparejamiento del residuo con el residuo de timina.

[Cebador y conjunto de cebadores]

[0065] El cebador según la presente descripción puede hibridar específicamente con el polinucleótido según la presente invención, para amplificar, mediante un procedimiento de amplificación de ácido nucleico, una región que comprende el residuo de nucleótido en la posición 1297 del gen GPIIIa o el residuo que se empareja con el mismo con el mismo. Por lo tanto, el cebador según la presente descripción puede utilizarse como un marcador para la determinación de púrpura trombocitopénica neonatal aloinmune o el riesgo de desarrollarla. Además, el cebador según la presente descripción puede utilizarse como un marcador para determinar la posibilidad de aparición de la refractariedad a la terapia de transfusión de plaquetas en la transfusión de plaquetas.

[0066] El cebador según la presente descripción significa un compuesto de ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN) o similares, y preferiblemente uno compuesto de ADN.

[0067] El cebador según la presente descripción puede amplificar, mediante un procedimiento de amplificación de ácido nucleico, una región que comprende el residuo de nucleótido en la posición 1297 del gen GPIIIa o el residuo que se empareja con el mismo en la secuencia de nucleótidos del polinucleótido según la presente invención o la secuencia complementaria de la misma. Ejemplos de los mismos incluyen los que consisten en un polinucleótido que tiene al menos 10, preferiblemente al menos 15, más preferiblemente al menos 20, aún más preferiblemente al menos 21 residuos de nucleótidos contiguos en la secuencia de nucleótidos del polinucleótido según la presente invención o la secuencia complementaria de la misma. Además, los ejemplos del cebador de la presente invención incluyen los que consisten en un polinucleótido que tiene de 10 a 30, 12 a 30, 15 a 30, 20 a 30, y 21 a 30 residuos de nucleótidos contiguos en una secuencia de nucleótidos del polinucleótido según la presente invención o una secuencia complementaria de la misma.

[0068] Además, el cebador según la presente descripción puede ser uno capaz de hibridar con una región que comprende el residuo de nucleótido en la posición 1297 del gen GPIIIa o el residuo que se empareja con el mismo, en una secuencia de nucleótidos del polinucleótido según la presente invención o una secuencia complementaria de la misma.

[0069] En el presente documento, un polinucleótido que comprende nucleótidos contiguos en una secuencia de nucleótidos del polinucleótido según la presente invención o una secuencia complementaria de la misma puede funcionar como cebador según la presente descripción, y los ejemplos del mismo incluyen también un polinucleótido modificado que comprende nucleótidos contiguos en una secuencia de nucleótidos del polinucleótido según la presente invención o una secuencia complementaria de la misma en la que se introducen una o varias (por ejemplo,

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la secuencia de aminoácidos de 80% o más, más preferiblemente o más, aún más preferiblemente

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1, 2, 3 o 4) mutaciones (que pueden seleccionarse, por ejemplo, de inserción, sustitución, deleción y adición), en la que la mutación no afecta al residuo de nucleótido de la posición 1297 del gen GPIIIa. Un ejemplo de un polinucleótido modificado incluye un polinucleótido que comprende al menos 12 a 30 nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 o una secuencia complementaria de la misma que tiene una o varias mutaciones introducidas a la misma, y que funciona como el cebador según la presente descripción.

[0070] La longitud del cebador según la presente descripción puede ser de al menos 10 bases, y es preferiblemente de al menos 15 bases, más preferiblemente, de al menos 20 bases, aún más preferiblemente, de al menos 21 bases. Además, el cebador según la presente descripción tiene de 12 a 30 bases, de 20 a 30 bases, o de 21 a 30 bases de longitud.

[0071] Según la presente descripción, se proporciona un cebador que tiene una longitud de 12 a 30 bases que consiste en un polinucleótido que tiene al menos 10 (más preferiblemente al menos 15, aún más preferiblemente al menos 20, aún más preferiblemente al menos 21) nucleótidos contiguos de un nucleótido en una secuencia de nucleótidos del polinucleótido según la presente invención o una secuencia complementaria de la misma; que puede amplificar, mediante un procedimiento de amplificación de ácido nucleico, una región que comprende el residuo de nucleótido en la posición 1297 de una secuencia de nucleótidos del gen GPIIIa, y que es para utilizar en la detección del polimorfismo 1297T del gen GPIIIa.

[0072] El cebador según la presente descripción también pueden usarse como un conjunto de cebadores que comprende una combinación de dos o más clases de los cebadores según la presente descripción.

[0073] El conjunto de cebadores según la presente descripción se puede seleccionar de tal manera que una región que comprende el residuo de nucleótido en la posición 1297 del gen GPIIIa o un residuo que se empareja con el mismo, en una secuencia de nucleótidos del polinucleótido según la presente invención o una secuencia complementaria de la misma, puede ser amplificada por un procedimiento de amplificación de ácido nucleico. Un procedimiento de amplificación de ácido nucleico es bien conocido y los expertos en la técnica pueden seleccionar un par de cebadores para la amplificación de un ácido nucleico según sea apropiado. Por ejemplo, en el procedimiento de PCR, los cebadores se pueden seleccionar de tal manera que uno de los dos cebadores se empareja con la cadena positiva del gen GPIIIa mutado, el otro cebador se empareja con la cadena negativa del gen GPIIIa mutado, y con una hebra extendida por un cebador que se empareja al otro cebador. Además, en el procedimiento lAmP (WO 00/28082), tres regiones del extremo 3', es decir, F3c, F2c y F1c, y tres regiones del extremo 5', es decir, B1, B2 y B3, se definen cada uno para un gen diana, cuyas seis regiones se pueden utilizar para el diseño de cuatro tipos de cebadores.

[0074] El cebador y el conjunto de cebadores según la presente descripción se pueden utilizar como un cebador y un conjunto de cebadores en un procedimiento de amplificación de ácido nucleico conocido, tal como un procedimiento de PCR (Saiki, RK, Bugawan, TL, et al. (1986) Nature, 324, 163-166), un procedimiento NASBA (Comptom, J. (1991) Nature, 650,91-92), un procedimiento TMA (Kacian, DL, y Fultz, TJ (1995) Patente de Estados Unidos 5.399.491), un procedimiento sDa (Walker, GT, Little, mC, et al (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 392396) o un procedimiento de PCR-SSCP (Orita, M., Iwahara, H., et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 86, 27762770) según un procedimiento convencional.

[0075] Los cebadores según el presente procedimiento se pueden sintetizar químicamente en base a las secuencias de nucleótidos descritas en la presente memoria. La preparación de un cebador es bien conocida, y puede llevarse a cabo según un procedimiento convencional.

[Sonda]

[0076] La sonda según la presente descripción se hibrida específicamente con el polinucleótido según la presente descripción, y puede detectar el polimorfismo 1297T del gen GPIIIa. Por lo tanto, la sonda según la presente descripción puede utilizarse como un marcador para la determinación de púrpura trombocitopénica neonatal aloinmune y/o el riesgo de desarrollarla. Además, la sonda según la presente descripción puede utilizarse como un marcador para determinar la posibilidad de aparición de la refractariedad a la terapia de transfusión de plaquetas en la transfusión de plaquetas.

[0077] La sonda según la presente descripción significa que una que consiste en ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN) o similares, y es preferiblemente una que consiste en ADN.

[0078] Un ejemplo de la sonda según la presente descripción incluye las que son capaces de hibridar con una región que comprende el residuo de nucleótido en la posición 1297 del gen GPIIIa o el residuo que se empareja al mismo, en la secuencia de nucleótidos del polinucleótido según la presente invención o la secuencia complementaria de la misma.

[0079] Un ejemplo de la sonda según la presente descripción incluye las que consisten en un polinucleótido que comprende al menos 10, preferiblemente al menos 14, más preferiblemente al menos 15, aún más preferiblemente

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al menos 16 residuos de nucleótidos contiguos en una secuencia de nucleótidos del polinucleótido según la presente invención o una secuencia complementaria de la misma. Además, un ejemplo de sonda de la presente descripción incluye las que consisten en un polinucleótido que comprende de 10 a 20, 12 a 20, 14 a 20, 15 a 20, y 16 a 20, 10 a 30, 12 a 30, 14 a 30, 15 a 30 o 16 a 30 residuos de nucleótidos contiguos en una secuencia de nucleótidos del polinucleótido según la presente invención o una secuencia complementaria de la misma.

[0080] En el presente documento, el polinucleótido que comprende los nucleótidos contiguos en una secuencia de nucleótidos del polinucleótido según la presente invención o una secuencia complementaria de la misma puede funcionar como la sonda según la presente descripción, y los ejemplos del mismo incluyen también un polinucleótido modificado que comprende los nucleótidos contiguos en una secuencia de nucleótidos del polinucleótido según la presente invención o una secuencia complementaria de la misma en la que se introducen una o varias (por ejemplo, 1, 2, 3 o 4) mutaciones (que pueden seleccionarse, por ejemplo, de inserción, sustitución, deleción y adición), en el que la mutación no afecta el residuo nucleótido de la posición 1297 del gen GPIIIa. Un ejemplo de un polinucleótido modificado incluye un polinucleótido que comprende al menos de 12 a 30 nucleótidos contiguos en una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 o una secuencia complementaria de la misma que tiene 1 o varias mutaciones introducidas a la misma, y que funciona como la sonda según la presente descripción.

[0081] La longitud de la sonda según la presente descripción es de al menos 10 bases. Además, la longitud de la sonda según la presente descripción es de 12 a 30 bases.

[0082] Según la presente descripción, se proporciona una sonda y un cebador que tienen una longitud de 12 a 30 bases, que consiste en un polinucleótido que tiene al menos 10 (más preferiblemente al menos 15) nucleótidos contiguos en una secuencia de nucleótidos del polinucleótido según la presente invención o una secuencia complementaria de la misma, que se puede hibridar con una región que comprende el residuo de nucleótido en la posición 1297 de una secuencia de nucleótidos del gen GPIIIa, y que es para utilizar en la detección del polimorfismo 1297T del gen GPIIIa.

[0083] La sonda según la presente descripción puede usarse como sonda en un procedimiento conocido tal como un procedimiento de transferencia Northern, un procedimiento de transferencia Southern o un procedimiento de hibridación in situ, según un procedimiento convencional.

[0084] La sonda según la presente descripción se puede sintetizar químicamente basándose en una secuencia de nucleótidos descrita en la presente memoria. La preparación de un cebador es bien conocida y se puede llevar a cabo según un procedimiento convencional.

[Anticuerpo]

[0085] El anticuerpo según la presente invención puede reconocer específicamente la proteína según la presente invención y puede detectar el polimorfismo 407S de la proteína GPIIIa. Por lo tanto, el anticuerpo según la presente invención se puede utilizar como un marcador para la determinación de púrpura trombocitopénica neonatal aloinmune o el riesgo de desarrollarla. Además, el anticuerpo según la presente invención se puede utilizar como un marcador para determinar la posibilidad de aparición de la refractariedad a la terapia de transfusión de plaquetas en la transfusión de plaquetas.

[0086] Según una realización preferida del anticuerpo según la presente invención, se proporciona un anticuerpo que reconoce una región que comprende el residuo de aminoácido en la posición 407 de la proteína GPIIIa en una secuencia de aminoácidos de la proteína según la presente invención. Mediante el uso de dicho anticuerpo, se puede detectar el polimorfismo 407s de la proteína GPIIIa. Los ejemplos de dicho anticuerpo incluyen un anticuerpo contra una proteína que comprende al menos 6 residuos de aminoácidos que tienen el residuo de aminoácido en la posición 407 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

[0087] Un ejemplo de un anticuerpo contra la proteína según la presente invención incluye un anticuerpo contra una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o una parte de la misma.

[0088] Un ejemplo de un anticuerpo según la presente invención incluye un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo monocatenario (scFv), un anticuerpo humanizado, un anticuerpo poliespecífico y un fragmento de anticuerpo, tal como Fab, Fab', F(ab')2 Fc y Fv.

[0089] El anticuerpo según la presente invención puede obtenerse utilizando un procedimiento bien conocido por los expertos en la técnica.

[Procedimiento de detección]

[0090] La sustitución del residuo de nucleótido en la posición 1297 en la secuencia de nucleótidos del gen GPIIIa al residuo de timina puede ser un índice de púrpura trombocitopénica neonatal aloinmune o el riesgo de desarrollarla. Por lo tanto, según la presente invención, la púrpura trombocitopénica neonatal aloinmune o el riesgo de

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desarrollarla se pueden determinar mediante la detección del polimorfismo 1297T del gen GPIIIa.

[0091] Existe la posibilidad de que el antígeno plaquetario (antígeno HPA-7) en el que el residuo de nucleótido en la posición 1297 en el gen GPIIIa está sustituido por el residuo de timina provoque la refractariedad a la terapia de transfusión de plaquetas en la transfusión de plaquetas debido a la diferencia en el antígeno. Por lo tanto, la sustitución puede ser un índice de si tiene lugar o no la refractariedad a la terapia de transfusión de plaquetase en la transfusión de plaquetas, es decir, un índice del efecto de la transfusión en la transfusión de plaquetas. De este modo, según la presente invención, la posibilidad de aparición de refractariedad a la terapia de transfusión de plaquetas en la transfusión de plaquetas se puede determinar mediante la detección del polimorfismo 1297T del gen GPIIIa.

[0092] El procedimiento de detección según la presente descripción no está limitado con tal de que sea un procedimiento capaz de detectar el polimorfismo 1297T del gen GPIIIa o el polimorfismo 407S de la proteína GPIIIa en una muestra de ensayo, y sus ejemplos incluyen un procedimiento de hibridación, un procedimiento de amplificación de ácido nucleico y un procedimiento de reacción antígeno-anticuerpo.

[0093] En el presente documento, la "muestra de ensayo" puede comprender una región que contiene el residuo de nucleótido en la posición 1297 del gen GPIIIa o el residuo de aminoácido en la posición 407 de la proteína GPIIIa, y puede obtenerse por extracción del gen, ARNm o proteína de una persona a ensayar (sujeto). El ARNm puede convertirse a ADNc, según se requiera, antes de su uso. En la presente memoria, el "gen" también incluye dicho ADNc.

[0094] En el presente documento, el "sujeto" puede ser, además de un recién nacido, un pariente consanguíneo del recién nacido. La presente invención es ventajosa en el sentido de que el riesgo de desarrollar púrpura trombocitopénica neonatal aloinmune puede determinarse prenatalmente.

[0095] El gen, el ARNm o la proteína del sujeto se pueden extraer de cualquier célula en el cuerpo, y las células son preferiblemente células de leucocitos.

[0096] Según la presente invención, el gen extraído o ARNm se puede someter como tal a un procedimiento de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (procedimiento RFLP) (Southerns, EM (1975) J. Mol. Biol. 98, 503), un procedimiento de sonda de oligonucleótido específica de alelo (procedimiento ASO) (Wallace, RB, Schaffer, NJ, et al. (1979) Nucleic Acid Res., 6, 3543) o un procedimiento de ensyao de ligación de oligonucleótidos, para detectar el polimorfismo 1297T del gen GPIIIa.

[0097] Según el procedimiento de detección de la presente descripción, el polimorfismo 1297T del gen GPIIIa en una muestra de ensayo se puede detectar mediante amplificación de una muestra de ácido nucleico (ARNm o un producto de transcripción inversa del mismo) mediante un procedimiento de amplificación de ácido nucleico usando el cebador o la conjunto de cebadores según la presente descripción y análisis del producto de amplificación.

[0098] La detección del polimorfismo 1297T del gen GPIIIa utilizando un procedimiento de amplificación de ácido nucleico puede llevarse a cabo mediante, por ejemplo, las siguientes etapas de:

(c) realizar un procedimiento de amplificación de ácido nucleico utilizando un polinucleótido derivado de una muestra de ensayo como plantilla y el cebador o el conjunto de cebadores según la presente descripción; y

(d) analizar un producto de amplificación formado.

[0099] En la etapa (c), el ARNm preparó a partir de la muestra de ensayo o el ADN complementario (ADNc) transcrito de forma inversa a partir del ARNm se pueden utilizar como plantilla.

[0100] La amplificación del gen se puede llevar a cabo utilizando un procedimiento de amplificación de ácido nucleico tal como un procedimiento de PCR (Saiki, RK, Bugawan, TL, et al. (1986) Nature, 324, 163-166), un procedimiento NASBA (Comptom, J. (1991) Nature, 650,91-92), un procedimiento tMa (Kacian, DL, y Fultz, TJ (1995) patente de Estados Unidos 5.399.491) o un procedimiento SDA (Walker, GT, Little, MC, et al (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 392-396).

[0101] Un gen amplificado por estos procedimientos se puede utilizar para detectar el polimorfismo 1297T del gen GPIIIa dependiendo de las características del producto de amplificación. Por ejemplo, con un fragmento amplificado por el procedimiento de PCR, la scuencia de nucleótidos se puede determinar fácilmente mediante un procedimiento de determinación de la secuencia de base, y de ese modo, se puede determinar si el residuo de nucleótido en la posición 1297 del gen GPIIIa es o no timina.

[0102] La amplificación del gen mediante PCR también se puede llevar a cabo utilizando un procedimiento de PCR- SSCP (Orita, M., Iwahara, H., et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 2776-2770) que reconoce la diferencia de una base. Un procedimiento de PCR-SSCP es un procedimiento en el que el fragmento de ácido nucleico amplificado por PCR se desnaturaliza por calor para formar cadenas individuales, y se separa usando gel de poliacrilamida no desnaturalizante a una temperatura constante. El procedimiento puede detectar una diferencia de

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una base mediante la evaluación, como la diferencia en la movilidad electroforética, de la diferencia en la formación de la estructura de orden superior debido a la diferencia de un fragmento de nucleótidos.

[0103] De otro modo, un fragmento amplificado por un procedimiento de PCR puede analizarse mediante un procedimiento de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (procedimiento RFLP) (Southerns, EM (1975) J. Mol. Biol. 98, 503), un procedimiento de sonda de oligonucleótido específica de alelo (procedimiento ASO) (Saiki, RK, Bugawan, TL, et al, (1986) Nature, 324, 163-166), un procedimiento de ensayo de ligación de oligonucleótidos (Landegren, U, Kaiser, R., et al. (1990) PCR Protocols, Academic Press, Inc. pág. 92-98), un procedimiento de PCR-PHFA (Oka, T., Matsunaga, H., et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1541-1547), un procedimiento de PCR-rSSO (Kawai, S., et al, (1994) Hum Immunol, 41 (2), 121-126) o similares. En los casos en que se tratan simultáneamente múltiples muestras, se prefiere un procedimiento de PCR-PHFA o un procedimiento de PCR-rSSO.

[0104] Según el procedimiento de detección de la presente invención, el polimorfismo 1297T del gen GPIIIa en la muestra de ensayo se puede detectar mediante la amplificación de una muestra de ácido nucleico (ARNm o un producto de transcripción inversa del mismo), mediante un procedimiento de amplificación de ácido nucleico, usando el cebador o el conjunto de cebadores según la presente descripción, que se puede hibridar con una región que comprende el residuo de nucleótido en la posición 1297 del gen GPIIIa o el residuo que se empareja con el mismo en una secuencia de nucleótidos del polinucleótido según la presente invención o una secuencia complementaria de la misma, y la detección del producto de amplificación.

[0105] Según el primer procedimiento según la presente descripción, el sujeto para el que se identifica el residuo de nucleótido de la posición 1297 como timina se le proporciona una evaluación de que se detecta el polimorfismo 1297T del gen GPIIIa, y por lo tanto se puede diagnosticar o determinar que es un paciente con púrpura trombocitopénica neonatal aloinmune o que tiene el riesgo de desarrollarla.

[0106] Según el segundo procedimiento según la presente descripción, el sujeto para el que se identifica el residuo de nucleótido de la posición 1297 como timina se le proporciona una evaluación de que se detecta el polimorfismo 1297T del gen GPIIIa, y por lo tanto se puede diagnosticar o determinar que tiene posibilidades de desarrollar refractariedad a la terapia de transfusión de plaquetas en la transfusión de plaquetas.

[0107] Según el procedimiento de detección de la presente descripción, el polimorfismo 1297T del gen GPIIIa en una muestra de ensayo se puede detectar por hibridación de la sonda según la presente descripción con una muestra de ácido nucleico (ARNm o un producto de transcripción inversa del mismo) y la detección del complejo de hibridación, es decir, nucleótidos de doble cadena.

[0108] Para un procedimiento detallado de un procedimiento de hibridación, se puede hacer referencia a Nucleic Acid Hybridization Bios Scientific Publishers (1999).

[0109] La detección del polimorfismo 1297T del gen GPIIIa utilizando un procedimiento de hibridación puede llevarse a cabo mediante, por ejemplo, las siguientes etapas de:

(a) poner en contacto un polinucleótido derivado de una muestra de ensayo con la sonda según la presente invención; y

(b) detectar un complejo de hibridación.

[0110] En la etapa (a), el ARNm preparado a partir de la muestra de ensayo o el ADN complementario (ADNc) transcrito de forma inversa a partir del ARNm, como el polinucleótido derivado de la muestra de células a ensayar, puede ponerse en contacto con la sonda.

[0111] En el procedimiento de detección usando la sonda, la sonda puede estar marcada. Un ejemplo de un marcador incluye un marcador utilizando sustancias radiactivas, enzimas y sustancias fluorescentes.

[0112] La detección del producto de hibridación se puede llevar a cabo utilizando un procedimiento bien conocido tal como hibridación Northern, hibridación Southern o hibridación de colonias.

[0113] Según el primer procedimiento según la presente descripción, el sujeto para el que se identifica el residuo de nucleótido de la posición 1297 como timina se le proporciona una evaluación de que se detectó el polimorfismo 1297T del gen GPIIIa, y por lo tanto se puede diagnosticar o determinar que es un paciente con púrpura trombocitopénica neonatal aloinmune o que tiene el riesgo de desarrollarla.

[0114] Según el segundo procedimiento según la presente descripción, el sujeto para el que se identifica el residuo de nucleótido de la posición 1297 como timina se le proporciona una evaluación de que se detecta el polimorfismo 1297T del gen GPIIIa, y por lo tanto se puede diagnosticar o determinar que tiene posibilidades de desarrollar refractariedad a la terapia de transfusión de plaquetas en la transfusión de plaquetas.

[0115] Según el procedimiento de detección de la presente descripción, el polimorfismo 407S de la proteína GPIIIa

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en la muestra de ensayo se puede detectar poniendo en contacto el anticuerpo según la presente invención con la muestra de ensayo y detectar la reacción antígeno-anticuerpo.

[0116] La detección del polimorfismo 407S de la proteína GPIIIa usando la reacción antígeno-anticuerpo se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante las siguientes etapas de:

(e) poner en contacto una proteína derivada de una muestra de ensayo con el anticuerpo según la presente invención; y

(f) detectar un complejo antígeno-anticuerpo.

[0117] Un procedimiento para detectar la reacción antígeno-anticuerpo es bien conocido para los expertos en la técnica y, por ejemplo, la proteína GPIIIa en una muestra de células a ensayar que se considera que comprende células precursoras de proliferación de neuronas productoras de dopamina, puede detectarse mediante un procedimiento inmunológico. Para el procedimiento inmunológico, se puede aplicar un procedimiento previamente conocido, tal como un procedimiento de tinción inmunohistológica, un inmunoensayo enzimático, un procedimiento de transferencia Western, un procedimiento de aglutinación, un procedimiento de competición o un procedimiento sándwich, a la muestra de células sometidas a un tratamiento adecuado según la necesidad, tal como la separación de células y operación de extracción. El procedimiento de tinción immunohistológica puede llevarse a cabo mediante, por ejemplo, un procedimiento directo usando un anticuerpo marcado o un procedimiento indirecto utilizando un anticuerpo marcado contra el anticuerpo. Para un agente de marcaje, se puede utilizar una sustancia de marcaje conocida, tal como una sustancia fluorescente, una sustancia radiactiva, una enzima, un metal y un colorante.

[0118] Según el primer procedimiento según la presente descripción, al sujeto en el que se detecta el complejo antígeno-anticuerpo se proporciona la evaluación de que se detecta el polimorfismo 407S de la proteína GPIIIa, y por lo tanto se puede diagnosticar o determinar que es un paciente con púrpura trombocitopénica neonatal aloinmune o que tiene el riesgo de desarrollarla.

[0119] Según el segundo procedimiento según la presente descripción, al sujeto en el que se detecta el complejo antígeno-anticuerpo se proporciona la evaluación de que se detecta el polimorfismo 407S de la proteína GPIIIa, y por lo tanto se puede diagnosticar o determinae que tiene posibilidades de desarrollar refractariedad a la terapia de transfusión de plaquetas en la transfusión de plaquetas.

[Kit de detección]

[0120] Según la presente invención, se proporciona un kit para llevar a cabo el procedimiento de detección según la presente invención.

[0121] Un ejemplo de un kit de detección para llevar a cabo el procedimiento de detección según la presente invención incluye un kit para detectar el polimorfismo 1297T del gen GPIIIa, que comprende al menos la sonda, el cebador o el conjunto de cebadores según la presente descripción. Además, un ejemplo de un kit de detección para llevar a cabo el procedimiento de detección según la presente invención incluye un kit para detectar el polimorfismo 407S de la proteína GPIIIa, que comprende al menos el anticuerpo según la presente invención.

[0122] La sonda, cebador, conjunto de cebadores y anticuerpo según la presente descripción pueden ser aquellos marcados.

[0123] El kit de detección según la presente invención que comprende al menos la sonda según la presente descripción detecta el polimorfismo 1297T del gen GPIIIa mediante el procedimiento de hibridación.

[0124] El kit según la presente invención puede comprender, además, si se desea, varios reactivos para llevar a cabo el procedimiento de hibridación, tal como un compuesto sustrato utilizado para la detección del marcador; un tampón de hibridación; una instrucción; y/o un instrumento.

[0125] El kit de detección según la presente descripción que comprende al menos el cebador según la presente invención o el conjunto de cebadores según la presente descripción detecta la expresión del gen GPIIIa mediante un procedimiento de amplificación de ácido nucleico.

[0126] El kit según la presente invención puede comprender, además, si se desea, varios reactivos para llevar a cabo el procedimiento de amplificación de ácido nucleico, tal como un tampón; un patrón interno que indica que la PCR puede proceder normalmente; una instrucción; y/o un instrumento.

[0127] El kit de detección según la presente invención que comprende al menos el anticuerpo según la presente invención detecta el polimorfismo 407S de la proteína GPIIIa mediante la detección de una reacción antígeno- anticuerpo.

[0128] El kit según la presente invención puede comprender, además, según la tercera descripción del

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procedimiento de detección, varios reactivos para llevar a cabo una reacción de antígeno-anticuerpo, tal como un anticuerpo secundario utilizado para el procedimiento de ELISA o similar; un reactivo colorante; un tampón; una instrucción; y/o un instrumento.

EJEMPLOS

[0129] La presente invención se describirá ahora concretamente por medio de Ejemplos, pero la presente invención, por ejemplo, la secuencia del cebador, la secuencia de la sonda y similares, no está limitada a las mismas.

Ejemplo 1: Relación entre el polimorfismo en el gen GPIIIa (HPA-7) y púrpura trombocitopénica neonatal aloinmune

[0130] Con respecto al niño afectado diagnosticado como púrpura trombocitopénica neonatal aloinmune (NAITP), se esperaba que el anticuerpo contenido en el suero materno reaccione con las plaquetas en el niño afectado. Dado que el niño afectado fue un segundo hijo, se considera que la madre, que se sensibilizó al antígeno específico de plaquetas derivado del padre durante el embarazo del primer hijo, adquirió la producibilidad de anticuerpos contra este antígeno, y las plaquetas del niño afectado fueron atacadas por el anticuerpo producido durante el embarazo del segundo hijo. Dado que el antígeno específico de plaquetas del niño afectado deriva del padre, se confirmó la reactividad de los sueros del niño afectado y su madre contra las plaquetas del padre mediante el procedimiento MPHA (Japanese Journal of Transfusion and Cell Therapy, Vol. 52. No.6 52 (6) 678-683, 2006).

[0131] En primer lugar, las plaquetas del padre se inmovilizaron sobre pocillos de una microplaca, cuyas plaquetas se sometieron a continuación a reacciones con los sueros del niño afectado y la madre, y diluyentes de los mismos. Los productos resultantes se hicieron reaccionar con eritrocitos de oveja revestidos con el anticuerpo IgG humano, y se observaron las imágenes resultantes de agregación.

[0132] Como resultado, el suero de la madre y el suero del niño afectado, que eran hasta 1024 veces y 16 veces diluidos, respectivamente, mostraron reacciones positivas contra las plaquetas del padre.

[0133] Posteriormente, se analizaron los tipos de los genes de antígenos plaquetarios utilizando el procedimiento PCR-PHFA (WO98 / 02574).

[0134] Como resultado, se observaron incompatibilidades ya que, entre los antígenos plaquetarios, con respecto a HPA-2, la madre tenía (a-b+), el padre tenía (a+b-) y el niño afectado tenía (a+b+); y, con respecto a HPA-3, la madre tenía (a+b-), y el padre y el niño afectado tenían (a+b+). Sin embargo, con respecto a los tipos de antígenos plaquetarios de HPA-1, 4, 5 y 6, se observaron compatibilidades, ya que los padres y el niño afectado ambos tenían (a+b-). Por otro lado, con respecto a HPA-7, se reveló que el gen de HPA-7a está presente, mientras que el gen de HPA-7b está ausente en todos aquellos individuos en comparación con los ADN estándar previamente descritos para HPA-7a y HPA-7b mediante el procedimiento de PHFA.

[0135] El antígeno específico de plaquetas derivado del padre se considera que existe en el niño afectado. Por lo tanto, se comprobaron las reactividades de las plaquetas del padre contra los anticuerpos conocidos, y las plaquetas fueron negativas contra los anticuerpos de HPA-1 a HPA-6, mientras que mostraron una reactividad contra el anticuerpo de HPA-7b. Aquí, dado que las plaquetas del padre reaccionaron con el anticuerpo de HPA-7b, se esperaba una cierta sustitución de bases en una región correspondiente a HPA-7 dentro del gen GPIIIa. En vista de esto, el exón 9 del gen GPIIIa en el ADN cromosómico del padre se amplificó usando los siguientes cebadores y el producto de amplificación se purificó usando Wizard Plus sV Gel y el sistema de PCR Clean, seguido de su ligación en el vector pT7Blue-T (fabricado por Novagen) y la introducción en la cepa JM109 de E. coli (fabricada por TAKARA).

WHPA7-A: 5'-TCCAGAGCTGGAGTGTTAACTG (SEQ ID NO: 9)

WHPA7-B: 5'-CTGGCAGGCACAGTCACAATC (SEQ ID NO: 10)

[0136] Las colonias de color blanco obtenidas se cultivaron y los plásmidos fueron entonces purificados, seguido de la secuenciación usando el cebador M13-R18 (fabricado por TAKAEA) para confirmar la secuencia de bases de la región clonada. La secuenciación se llevó a cabo utilizando el terminador BigDye versión 1.1 (fabricado por Applied Biosystems). Los resultados de la secuenciación fueron como se muestra en la Tabla 2. HPA-7a indica el gen de HPA-7a, HPA-7b indica el gen de HPA-7b, y HPA-7new indica un nuevo gen diferente del gen de HPA-7a y del gen de HPA-7b.

O)

en

o

en

o

en

■fs.

O

eo

o

en

o

1201

1220

1240

HPA-7a: C A G A G C T G G A G T G T T A A C T G G G C C C A A C T G T G T C T A A A T A

HPA-7t>: C A G A G C T G G A G T G T T A A C T G G G C G C A A C T G T G T C T A A A T A

HPA'7new: C A G A G C T G G A G T G T T A A C T G G G C C C A A C T G T G T C T A A A T A

: 1241 1280 1280

HPA-7a: C A A T C T T T G T T T C C A T C C A G G T G A G G T T G A G C A T T G A G G C

HPA-7b: C A A T C T T T C T T T C C A T C C A G G T G A G C T T C A G C A T T G A G G C

HPA~7new: C A A T C T T T C T T T C c A T C C A 0 G T G A G C T T C A G C A T T G A G G C

: 1281 1297 1300 1320

W HPA-7a: C A A G G T G G G A G G G T G T :^C G G A G G A G A A G G A G A A G T C C T T T

HPA-7b: C A A G G T G C G A G G G T G T C C A G G A G A A G G A G A A G T C C T T T

HPA-7new: C A A G G T G C G A G G G T G T ■° C C A G G A G A A G G A G A A G T C C T T T

: 1321 1340 1360

HPA-7a: A C C A T A A A G C C C G T G G G C T T C A A G G A C A G C C I G A T C G T 0 C

HPA-7b: A C C A T A A A G C C C G T G G G C T T C A A G G A C A G C C T G A T 0 G T C G

HPA-7new: A G C A T A A A G C C C G T G G G C T T C A A G G A C A G C C T G A T C G T c C

1361

HPA-7a AGGTCACCTTT GATT

HPA-7b AGGTCACCTTT GATT

HPA-7new AGGT CACCTTT GATT

1380

G G A C T G T

G C C T G C C T G C C T

G C C A G G C C A G G C C A G

Q)

CT

Q)

N3

05 05 en en

en o en o

en o

eo |5J

o en

l\5

o

en

05

g;

05

eo

: 331

HPA-7a: Trp Ala

HPA-7b: Trp Ala

HPA-'/new: Trp Ala

: 411

HPA-7a: Glu Lys

HPA-7b: Glu Lys

HPA-7new: Glu Lys

: 441

HPA-7a: Ala Glu

HPA-7b: Ala Glu

HPA-7new: Ala Glu

Gln: Leu Cys Leu Asn Thr 11o 350 Phe Leu Ser Ib Gln Val Ser Phe Ser

Gln: Leu Cys Leu Asn Thr Ib Phe Leu Ser Ib GJn Val Ser Phe Ser

Gln: Leu Cys Leu Asn Thr Se Phe Leu Ser Ib Gln Val Ser Phe Ser

Ser: Phe Thr Ib Lys Pro Val 420 Gly Phe Lys Asp Ser Leu lie Val Gln

Ser: Phe Thr lie Lys Pro Val Gly Phe Lys Asp Ser Leu Ib Val Gln

Ser: Phe Thr Ib Lys Pro Val Giy Phe Lys Asp Ser Leu lie Val Gln

450

Pro Asn Ser His Arg Cys Asn Asn

Pro Asn Ser His Ar* Cys Asn Asn

lie: Glu Ala Lys Val Arg Gly Cys Pfo¡ ¡Gln

lio: Glu Ala Lys Val Ar& Gly Cys .Ala 31 Gln

Ib: Glu Ala Lys Val Arff Gly Cys Seh ¡Gln

430

Val Thr Phe Asp Cys Asp Cys Ala Cys Gln

Glu

Ala

410

Lys

440

Gln

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[0137] Como se muestra en la Tabla 2 y la Tabla 3, se confirmó el gen (HPA-7new) en el que la base en la posición 1297 del gen GPIIIa es timina y el aminoácido en la posición 407 de la proteína producida a partir de este gen es serina (SEQ ID NO: 7 (secuencia de bases), SEQ ID NO: 8 (secuencia de aminoácidos)). Con respecto al gen de HPA-7, como polimorfismos genéticos, se ha descrito hasta ahora el gen de HPA-7a en el que la base en la posición 1297 del gen GPIIIa es citosina y el aminoácido en la posición 407 es prolina, y el gen de HPA-7b en el que la base en la posición 1297 del gen GPIIIa es guanina y el aminoácido en la posición 407 es alanina, pero el gen confirmado esta vez se confirmó que tenía una nueva secuencia diferente de éstas.

Ejemplo 2: Construcción del sistema de detección para nuevo alelo de HPA-7 mediante el procedimientos de PCR- PHFA

[0138] A continuación, se describirá la construcción de un sistema de detección para el nuevo alelo de HPA-7 mediante el procedimiento de PCR-PHFA. En el procedimiento de PHFA, el producto obtenido mediante amplificación de la muestra utilizando cebadores no marcados (ADN de la muestra) y el producto obtenido mediante la amplificación de la misma región utilizando cebadores marcados (ADN estándar) se mezclaron juntos y se desnaturalizaron con calor, y se analizó si las secuencias del ADN de la muestra y el ADN estándar son o no idénticas en base al grado de sustitución de la cadena que se produce tras la hibridación bajo un gradiente de temperaturas.

(1) Preparación de los ADN estándar marcados

[0139] Se amplificaron los plásmidos a los que se incorporaron respectivamente el gen de HPA-7a, el gen de HPA- 7b y el nuevo alelo (HPA-7new) confirmados en el Ejemplo 1 utilizando los siguientes cebadores, para preparar productos de PCR de los cuales un extremo se marcó con DNP (dinitrofenilo) y el otro extremo se marcó con biotina, cuyos productos se utilizaron como ADN estándar para HPA-7a, HPA-7b y HPA-7new, respectivamente. DNP-WHPA7-A: 5'-TCCAGAGCTGGAGTGTTAACTG (SEQ ID NO: 11)

biotina-WHPA7-B: 5'-CTGGCAGGCACAGTCACAATC (SEQ ID NO: 12)

(2) Preparación del ADN de muestra

[0140] Se amplificaron los plásmidos a los que se incorporaron respectivamente HPA-7a, HPA-7b y HPA-7new mediante PCR usando los siguientes cebadores no marcados para obtener los ADN de muestra. Además, se amplificaron los ADN cromosómicos de los cuales se conocían los genotipos de antemano con los mismos cebadores para obtener los ADN de muestra.

WHPA7-A: 5'-TCCAGAGCTGGAGTGTTAACTG (SEQ ID NO: 9)

WHPA7-B: 5'-CTGGCAGGCACAGTCACAATC (SEQ ID NO: 10)

(3) Hibridación competitiva

[0141] Con 30 pl de 3 x SSC (concentración final), 1 pl de un ADN estándar que tenía marcadores en ambos extremos y 20 pl de un ADN de muestra se mezclaron, y la mezcla resultante se calentó a 98°C durante 10 minutos, para desnaturalizar los ADN en cadenas sencillas. La mezcla se enfrió gradualmente a 70°C a una velocidad de 1°C/10 minutos para la hibridación. En este momento, las cadenas complementarias que tenían la secuencia completamente coincidente se reconstruyeron preferiblemente en comparación con las que tenían desapareamientos. Es decir, en los casos en que la muestra de ADN tiene completamente la misma secuencia que el ADN estándar, los marcadores en ambos extremos del ADN estándar matemáticamente se diluyen, de manera que se espera que la proporción de moléculas que tienen ambos marcadores sea de aproximadamente 1/21 del total. Por el contrario, en los casos en que la misma secuencia que el ADN estándar está ausente en el ADN de muestra, se reconstruyó preferiblemente el ADN estándar original que tenía los marcadores en ambos extremos.

(4) Detección de ADN estándar reconstruido

[0142] En un pocillo de una microplaca revestida con antelación con estreptavidina, se añadió el ADN estándar que tenía los marcadores en ambos extremos, cuyo ADN se conservó en el pocillo a través de la biotina en el extremo terminal. Mediante la adición de fosfatasa alcalina marcada con un anticuerpo anti-DNP a la misma, se espera que la fosfatasa alcalina se capture en el pocillo a través del ADN estándar. La adición de pNPP (paranitrofenol), que es un sustrato de esta enzima, causó el revelado de color amarillo. Este color se cuantificó y se detectó midiendo la absorbancia a 405 nm. En los casos en que la misma secuencia que el ADN estándar está presente en un ADN de muestra, la absorbancia es baja, mientras que en los casos en que la misma secuencia está ausente, la absorbancia es alta. Con respecto al valor de índice, la absorbancia medida para cada ADN estándar mezclado con agua se definió como 100, y se mostró la proporción de la absorbancia medida después de la mezcla con cada muestra, la desnaturalización con calor y el gradiente de temperaturas. En los casos en que este valor no es más de 20, la muestra se califica que es positiva contra el ADN estándar, y en los casos en que el valor no es menor que 20, la muestra se califica que es negativa.

[0143] Para los ADN estándar preparados a partir de los genes de HPA-7a, HPA-7b y HPA-7new, se midió el valor

5

10

15

20

25

30

35

40

45

del índice mostrado por cada muestra de ADN. Los resultados fueron como se indica en Tabla 4

ADN de muestra: ADN estándar

A405: Índice

HPA-7a: HPA-7b HPA-7new HPA-7a HPA-7b HPA-7new

Control positivo: 0,897 0,984 1,060 100 100 100

HPA-7a: 0,049 0,529 0,661 5 54 62

HPA-7b: 0,407 0,046 0,695 45 5 66

HPA-7new: 0,577 0,659 0,050 64 67 5

HPA-7a/b: 0,095 0,069 0,618 11 7 58

No, 1: 0,052 0,543 0,681 6 55 64

No, 2: 0,101 0,533 0,135 11 54 13

No, 3: 0,062 0,572 0,705 7 58 67

No, 4: 0,059 0,535 0,642 7 54 61

No, 5: 0,066 0,520 0,637 7 53 60

No, 6: 0,040 0,484 0,586 4 49 55

No, 7: 0,039 0,467 0,603 4 47 57

[0144] Los ADN de muestra preparados a partir de los plásmidos en la que se clonaron los genes respectivos mostraron valores bajos del índice contra sus respectivos ADN estándar.

[0145] Aquí, los valores de índice en las muestras N° 1 y N° 3 a N° 7 no eran más de 20 contra HPA-7a, mientras que mostraron valores superiores a 50 contra HPA-7b y HPA-7new, de manera que se supuso que tenían el genotipo homocigótico de HPA-7a. Por otra parte, la muestra No. 2 mostró valores del índice de no más de 20 contra los ADN estándar de HPA-7a y HPA-7new, de manera que se supuso que tenían el genotipo heterocigótico de HPA- 7a/new.

[0146] A partir de los resultados anteriores, se demostró que el polimorfismo 1297T del gen GPIIIa se puede detectar utilizando el procedimiento de PCR-PHFA.

Ejemplo 3: Construcción del procedimiento para la detección de un nuevo alelo mediante el procedimiento de microesferas fluorescentes

[0147] A continuación se describirá la construcción de un procedimiento para la detección del nuevo alelo HPA-7 mediante el procedimiento de microesferas fluorescentes. En el procedimiento de microesferas fluorescentes (Clin Chem. 43 (9) pág. 1799-801 (1997)), se pueden identificar 100 clases de microesferas mediante la coloración de las microesferas con dos tipos de colorantes fluorescentes, de manera que se consiguen 10 gradaciones para cada colorante. Mediante la inmovilización de diferentes sondas en las respectivas microesferas y la realización de la hibridación con ADN de muestra, se detectan simultáneamente las reactividades contra las múltiples sondas de ADN en el ensayo.

(1) Amplificación de genes

[0148] Se sometió un ADN cromosómico humano a amplificación por PCR usando los siguientes cebadores según un procedimiento convencional.

Biotina-P6/7FC: 5'-CCATCCAGGTGAGCTTCAGC (SEQ ID NO: 13)

Biotina-P6/7RC-2: 5'-AGTGGTTGCAGGTATATGAGGG (SEQ ID NO: 14)

(2) Preparación de microesferas Luminex

[0149] Como secuencias de sondas, se inmovilizaron oligonucleótidos que tenían las siguientes secuencias de nucleótidos sobre microesferas Luminex (fabricadas por Luminex) según un procedimiento convencional. Microesferas No. 1 (microesferas para la detección de HPA-7a): 5'-GCTGTCCCCAGGAG-3' (SEQ ID NO: 15) Microesferas No. 2 (microesferas para la detección de HPA-7b): 5'-GAGGCTGTGCCCAGGA-3' (SEQ ID NO: 16) Microesferas No. 3 (microesferas para la detección de HPA-7new): 5'-GAGGCTGTTCCCAGG-3' (SEQ ID NO: 17) Microesferas No. 4 (microesferas comunes para la detección de HpA-7): 5'-TGAACCTAATAGCCATCGC-3' (SeQ ID NO: 18)

(3) Hibridación y detección

[0150] Como muestras, se utilizaran los siguientes.

Muestra No. 1: un plásmido que tiene el gen de HPA-7a

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Muestra No. 2 Muestra No. 3 Muestra No. 4 Muestra No. 5 Muestra No. 6

un plásmido que tiene el gen de HPA-7b

una muestra de plásmido que tiene el gen de HPA-7new

un ADN cromosómico No. 001

un ADN cromosómico No. 019

un ADN cromosómico No. 193

[0151] Mediante el uso de éstas como muestras, se llevaron a cabo la amplificación por PCR y la hibridación con las sondas, y se midieron los valores de fluorescencia de los productos de PCR capturados por las sondas unidas a las microesferas.

[0152] En primer lugar, se mezclaron 5 ml de la solución de reacción de PCR con 5 ml de solución alcalina para desnaturalizar el ADN en cadenas sencillas. La mezcla resultante se neutralizó mediante la mezcla con 25 ml de una solución de hibridación que contenía los cuatro tipos anteriores de microesferas y estreptavidina marcada con fluorescencia (fabricada por BD Biosciences). La mezcla resultante se incubó a 55°C durante 30 minutos para la hibridación de las sondas con el producto de PCR, y se llevó a cabo el marcaje con fluorescencia del producto de PCR. Posteriormente, después de la adición de una solución de lavado y el mezclado de la mezcla resultante, se eliminó el sobrenadante por centrifugación para eliminar los productos de la PCR no unidos a las sondas y el exceso de estreptavidina marcada con fluorescencia. Las microesferas se suspendieron en la solución de lavado, y se llevó a cabo la identificación de los productos de PCR marcados con fluorescencia con la sonda en las microesferas y se llevaron a cabo cuatro tipos de microesferas utilizando el aparato Luminex. Los resultados de la detección fueron como se muestran en la Tabla 5.

[Tabla 5]

Muestra No.: Microesferas No.

Microesferas No. 1: Microesferas No. 2 Microesferas No. 3 Microesferas No. 4

Muestra No. 1: 7466 47 78 5503

Muestra No. 2: 69 12067 1649 5985

Muestra No. 3: 128 594 12190 5929

Muestra No. 4: 10017 79 217 7504

Muestra No. 5: 9611 83 142 7836

Muestra No. 6: 5355 174 9324 6054

[0153] Con respecto a los valores de fluorescencia, estableciendo el valor de corte en 2000, las células coloreadas se consideraban positivas. Dado que la muestra No. 1, la muestra nNo. 2 y la muestra No. 3 son plásmidos que tienen las secuencias de HPA-7a, HPA-7b y HPA-7new, respectivamente, reaccionaron específicamente con sus respectivas sondas, para dar valores de fluorescencia superiores el valor de corte. Además, todos reaccionaron con las microesferas No. 4 que tenían la secuencia común que la sonda, para dar altos valores de fluorescencia. Por otro lado, dado que las muestras No. 4 y No. 5, que son ADN cromosómicos, dieron altos valores de fluorescencia contra las microesferas que se unen con HPA-1a y la secuencia común, se puede observar que tiene HPA-7a homocigoto. Dado que la muestra No. 6 dio altos valores de fluorescencia contra las microesferas que se unen con HPA-7a, HPA-7new y la secuencia común, se puede observar que tiene HPA-7a y HPA-7new heterocigotos.

[0154] A partir de los resultados anteriores, se demostró que el polimorfismo 1297T del gen GPIIIa se puede detectar mediante el uso del procedimiento de microesferas fluorescentes.

LISTADO DE SECUENCIAS

[0155]

<110> Japanese Red Cross Society Wakunaga Pharmaceutical Co., Ltd.

<120> un nuevo gen GPIIIa

<130> 173651PX

<150> JP 2007-139642 <151> 2007-05-25

<160> 18

<170> PatentIn version 3.4

<210> 1 <211> 4469

<212> ADN

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

60

111

159

207

255

303

351

399

447

495

543

591

639

687

735

783

831

879

927

975

1023

<213>: Homo sapiens

<220>

<221>: CDS

<222>: (79)..(2364)

<400>: 1

atgcgagcgc ggccgcggcc ccggccgctc tgggtgactg tgctggcgct gggggcgctg

gcgggcgttg gcgtagga: ggg ccc aac atc tgt acc acg cga ggt gtg agc





: Gly Pro Asn Ile Cys Thr Thr Arg Gly Val Ser





: 1 5 10

tcc: tgc cag cag tgc ctg gct gtg agc ccc atg tgt gcc tgg tgc tct

Ser: Cys Gl n Gl n Cys Leu Ala Val Ser Pro Met Cys Ala Trp Cys
Ser



: 15 20 25

gat: gag gcc ctg cct ctg ggc tca cct cgc tgt gac ctg aag gag aat

Asp: Gl u Ala Leu Pro Leu Gly Ser Pro Arg Cys Asp Leu Lys Glu Asn


: 30 35 40

ctg
ctg: aag gat aac tgt gcc cca gaa tcc atc gag ttc cca gtg agt

Leu
Leu: Lys Asp Asn Cys Ala Pro Glu Ser Ile Gl u Phe Pro Val Ser

: 45 50 55

gag: gcc cga gta cta gag gac agg ccc ctc agc gac aag ggc tct gga

Glu: Ala Arg Val Leu Glu Asp Arg Pro Leu Ser Asp Lys Gly Ser Gly

60: 65 70 75

gac: agc tcc cag gtc act caa gtc agt ccc cag agg att gca ctc cgg

Asp: Ser Ser Gl n Val Thr Gl n Val Ser Pro Gl n Arg Ile Ala Leu Arg



: 80 85 90

ctc: cgg cca gat gat tcg aag aat ttc tcc atc caa gtg cgg cag gtg

Leu: Arg Pro Asp Asp Ser Lys Asn Phe Ser Ile Gl n Val Arg Gl n Val


: 95 100 105

gag: gat tac cct gtg gac atc tac tac ttg atg gac ctg tct tac tcc

Glu: Asp Tyr Pro Val Asp Ile Tyr Tyr Leu Met Asp Leu Ser Tyr Ser

: 110 115 120

atg: aag gat gat ctg tgg agc atc cag aac ctg ggt acc aag ctg gcc

Met: Lys Asp Asp Leu Trp Ser Ile Gl n Asn Leu Gly Thr Lys Leu Ala

: 12 5 130 135

acc: cag atg cga aag ctc acc agt aac ctg cgg att ggc ttc ggg gca

Thr: Gl n Met Arg Lys Leu Thr Ser Asn Leu Arg Ile Gly Phe Gly Ala

140: 145 150 155

ttt: gtg gac aag cct gtg tca cca tac atg tat atc tcc cca cca gag

Phe: Val Asp Lys Pro Val Ser Pro Tyr Met Tyr Ile Ser Pro Pro Glu


: 160 165 170

gcc: ctc gaa aac ccc tgc tat gat atg aag acc acc tgc ttg ccc atg

Ala: Leu Glu Asn Pro Cys Tyr Asp Met Lys Thr Thr Cys Leu Pro Met



: 175 180 185

ttt: ggc tac aaa cac gtg ctg acg cta act gac cag gtg acc cgc ttc

Phe: Gly Tyr Lys Hi s Val Leu Thr Leu Thr Asp Gl n Val Thr Arg
Phe

: 190 195 200

aat: gag gaa gtg aag aag cag agt gtg tca cgg aac cga gat gcc cca

Asn: Gl u Glu Val Lys Lys Gl n Ser Val Ser Arg Asn Arg Asp Ala Pro

: 205 210 215

gag: ggt ggc ttt gat gcc atc atg cag gct aca gtc tgt gat gaa aag

Glu: Gly Gly Phe Asp Ala Ile Met Gl n Ala Thr Val Cys Asp Glu Lys

220: 225 230 235

att: ggc tgg agg aat gat gca tcc cac ttg ctg gtg ttt acc act gat

Ile: Gly Trp Arg Asn Asp Ala Ser Hi s Leu Leu Val Phe Thr Thr Asp

: 240 245 250

gcc: aag act cat ata gca ttg gac gga agg ctg gca ggc att gtc cag

Ala: Lys Thr Hi s Ile Ala Leu Asp Gly Arg Leu Ala Gly Ile Val Gl n



: 255 260 265

cct: aat gac ggg cag tgt cat gtt ggt agt gac aat cat tac tct gcc

Pro: Asn Asp Gly Gl n Cys Hi s Val Gly Ser Asp Asn Hi s Tyr Ser Ala


: 270 275 280

tcc: act acc atg gat tat ccc tct ttg ggg ctg atg act gag aag cta

Ser: Thr Thr Met Asp Tyr Pro Ser Leu Gly Leu Met Thr Glu Lys Leu

: 285 290 295

tcc: cag aaa aac atc aat ttg atc ttt gca gtg act gaa aat gta gtc

Ser: Gl n Lys Asn Ile Asn Leu Ile Phe Ala Val Thr Glu Asn Val Val

300: 305 310 315

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

1071

1119

1167

1215

1263

1311

1359

1407

1455

1503

1551

1599

1647

1695

1743

1791

1839

1887

1935

1983

2031

2079

2127

aat: ctc tat cag aac tat agt gag ctc atc cca ggg acc aca gtt ggg

Asn: Leu Tyr Gln Asn Tyr Ser Glu Leu Ile Pro Gly Thr Thr Val Gly



: 320 325 330

gtt: ctg tcc atg gat tcc agc aat gtc ctc cag ctc att gtt gat gct

Val: Leu Ser Met Asp Ser Ser Asn Val Leu Gln Leu Ile Val Asp Ala



: 335 340 345

tat: ggg aaa atc cgt tct aaa gtc gag ctg gaa gtg cgt gac ctc cct

Tyr: Gly Lys Ile Arg Ser Lys Val Glu Leu Glu Val Arg Asp Leu Pro


: 350 355 360

gaa: gag ttg tct cta tcc ttc aat gcc acc tgc ctc aac aat gag gtc

Glu: Gl u Leu Ser Leu Ser Phe Asn Ala Thr Cys Leu Asn Asn Glu Val

: 365 370 375

atc: cct ggc ctc aag tct tgt atg gga ctc aag att gga gac acg gtg

Ile: Pro Gly Leu Lys Ser Cys Met Gly Leu Lys Ile Gly Asp Thr Val

380: 385 390 395

agc: ttc agc att gag gcc aag gtg cga ggc tgt tcc cag gag aag gag

Ser: Phe Ser Ile Glu Ala Lys Val Arg Gly Cys Ser Gln Glu Lys Glu




: 400 405 410

aag: tcc ttt acc ata aag ccc gtg ggc ttc aag gac agc ctg atc gtc

Lys: Ser Phe Thr Ile Lys Pro Val Gly Phe Lys Asp Ser Leu Ile Val



: 415 420 425

cag: gtc acc ttt gat tgt gac tgt gcc tgc cag gcc caa gct gaa cct

Gln: Val Thr Phe Asp Cys Asp Cys Ala Cys Gln Ala Gln Ala Glu Pro


: 430 435 440

aat: agc cat cgc tgc aac aat ggc aat ggg acc ttt gag tgt ggg gta

Asn: Ser Hi s Arg Cys Asn Asn Gly Asn Gly Thr Phe Glu Cys Gly Val

: 445 450 455

tgc: cgt tgt ggg cct ggc tgg ctg gga tcc cag tgt gag tgc tca gag

Cys: Arg Cys Gly Pro Gly Trp Leu Gly Ser Gln Cys Glu Cys Ser Glu

460: 465 470 475

gag: gac tat cgc cct tcc cag cag gac gag tgc agc ccc cgg gag ggt

Glu: Asp Tyr Arg Pro Ser Gl n Gln Asp Glu Cys Ser Pro Arg Glu Gly




: 480 485 490

cag: ccc gtc tgc agc cag cgg ggc gag tgc ctc tgt ggt caa tgt gtc

Gln: Pro Val Cys Ser Gln Arg Gly Glu Cys Leu Cys Gly Gln Cys Val



: 495 500 505

tgc: cac agc agt gac ttt ggc aag atc acg ggc aag tac tgc gag tgt

Cys: Hi s Ser Ser Asp Phe Gly Lys Ile Thr Gly Lys Tyr Cys Glu
Cys


: 510 515 520

gac
gac: ttc tcc tgt gtc cgc tac aag ggg gag atg tgc tca ggc cat

Asp
Asp: Phe Ser Cys Val Arg Tyr Lys Gly Glu Met Cys Ser Gly Hi s

: 525 530 535

ggc: cag tgc agc tgt ggg gac tgc ctg tgt gac tcc gac tgg acc
ggc

Gly: Gl n Cys Ser Cys Gly Asp Cys Leu Cys Asp Ser Asp Trp Thr
Gly

540: 545 550 555

tac
tac: tgc aac tgt acc acg cgt act gac acc tgc atg tcc agc aat

Tyr
Tyr: Cys Asn Cys Thr Thr Arg Thr Asp Thr Cys Met Ser Ser Asn




: 560 565 570

ggg: ctg ctg tgc agc ggc cgc ggc aag tgt gaa tgt ggc agc tgt gtc

Gly: Leu Leu Cys Ser Gly Arg Gly Lys Cys Glu Cys Gly Ser Cys Val



: 575 580 585

tgt: atc cag ccg ggc tcc tat ggg gac acc tgt gag aag tgc ccc acc

Cys: Ile Gln Pro Gly Ser Tyr Gly Asp Thr Cys Gl u Lys Cys Pro Thr


: 590 595 600

tgc: cca gat gcc tgc acc ttt aag aaa gaa tgt gtg gag tgt aag aag

Cys: Pro Asp Ala Cys Thr Phe Lys Lys Glu Cys Val Glu Cys Lys Lys

: 605 610 615

ttt: gac cgg gga gcc cta cat gac gaa aat acc tgc aac cgt tac tgc

Phe: Asp Arg Gly Ala Leu Hi s Asp Glu Asn Thr Cys Asn Arg Tyr Cys

620: 625 630 635

cgt: gac gag att gag tca gtg aaa gag ctt aag gac act ggc aag gat

Arg: Asp Glu Ile Glu Ser Val Lys Glu Leu Lys Asp Thr Gly Lys Asp



: 640 645 650

gca: gtg aat tgt acc tat aag aat gag gat gac tgt gtc gtc aga ttc

Ala: Val Asn Cys Thr Tyr Lys Asn Glu Asp Asp Cys Val Val Arg Phe



: 655 660 665

cag: tac tat gaa gat tct agt gga aag tcc atc ctg tat gtg gta gaa

Gln: Tyr Tyr Glu Asp Ser Ser Gly Lys Ser Ile Leu Tyr Val Val Glu

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

2175

2223

2271

2319

2364

2424

2484

2544

2604

2664

2724

2784

2844

2904

2964

3024

3084

3144

3204

3264

3324

3384

3444

3504

3564

3624

3684

3744

3804

3864

3924

3984

4044

4104

4164

4224

4284

4344

4404

4464

4469

670 675 680

gag cca gag tgt ccc aag ggc cct gac atc ctg gtg gtc ctg ctc tca

Glu Pro Glu Cys Pro Lys Gly Pro Asp Ile Leu Val Val Leu Leu Ser

685 690 695

gtg atg ggg gcc att ctg ctc att ggc ctt gcc gcc ctg ctc atc tgg

Val Met Gly Ala Ile Leu Leu Ile Gly Leu Ala Ala Leu Leu Ile Trp

700 705 710 715

aaa ctc ctc atc acc atc cac gac cga aaa gaa ttc gct aaa ttt gag

Lys Leu Leu Ile Thr Ile His Asp Arg Lys Glu Phe Ala Lys Phe Glu

720 725 730

gaa gaa cgc gcc aga gca aaa tgg gac aca gcc aac aac cca ctg tat

Glu Glu Arg Ala Arg Ala Lys Trp Asp Thr Ala Asn Asn Pro Leu Tyr

735 740 745

aaa gag gcc acg tct acc ttc acc aat atc acg tac cgg ggc act

Lys Glu Ala Thr Ser Thr Phe Thr Asn Ile Thr Tyr Arg Gly Thr

750 755 760

taatgataag cagtcatcct cagatcatta tcagcctgtg ccaggattgc aggagtccct gccatcatgt ttacagagga cagtatttgt ggggagggat ttcggggctc agagtggggt aggttgggag aatgtcagta tgtggaagtg tgggtctgtg tgtgtgtatg tgggggtctg tgtgtttatg tgtgtgtgtt gtgtgtggga gtgtgtaatt taaaattgtg atgtgtcctg ataagctgag ctccttagcc tttgtcccag aatgcctcct gcagggattc ttcctgctta gcttgagggt gactatggag ctgagcaggt gttcttcatt acctcagtga gaagccagct ttcctcatca ggccattgtc cctgaagaga agggcagggc tgaggcctct cattccagag gaagggacac caagccttgg ctctaccctg agttcataaa tttatggttc tcaggcctga ctctcagcag ctatggtagg aactgctggc ttggcagccc gggtcatctg tacctctgcc tcctttcccc tccctcaggc cgaaggagga gtcagggaga gctgaactat tagagctgcc tgtgcctttt gccatcccct caacccagct atggttctct cgcaagggaa gtccttgcaa gctaattctt tgacctgttg ggagtgagga tgtctgggcc actcaggggt cattcatggc ctgggggatg taccagcatc tcccagttca taatcacaac ccttcaaaga tttgccttat tggcagctct actctggagg tttgtttaga agaagtgtgt cacccttagg ccagcaccat ctctttacct cctaattcca caccctcact gctgtagaca tttgctatga cctggggatg tctctcatga ccaaatgctt ttcctcaaag ggagagagtg ctattgtaga gccagaggtc tggccctatg cttccggcct cctgtccctc atccatagca cctccacata cctggccctg agccttggtg tgctgtatcc atccatgggg ctgattgtat ttaccttcta cctcttggct gccttgtgaa ggaattattc ccatgagttg gctgggaata agtgccagga tggaatgatg ggtcagttgt atcagcacgt gtggcctgtt cttctatggg ttacaacctc atttaactca gtctttaatc tgagaggcca cagtgcaatt ttattttatt tttctcatga tgaggttttc ttaacttaaa agaacatgta tataaacatg cttgcattat atttgtaaat ttatgtgtat ggcaaagaag gagagcatag gaaaccacac agacttgggc agggtacaga cactcccact tggcatcatt cacagcaagt cactggccag tggctggatc tgtgaggggc tctctcatga tagaaggcta tggggataga tgtgtggaca cattggacct ttcctgagga agagggactg ttcttttgtc ccagaaaagc agtggctcca ttggtgttga catacatcca acattaaaag ccacccccaa atgcccaaga aaaaaagaaa gacttatcaa catttgttcc atgagcagaa aactggagct ctggcctcag tgttacagct aaataatctt taattaaggc aagtcacttt cttcttctta aagctgtttc tagtttgaga aatgatggga ttttagcagc cagtcttgaa ggtctctttc agtatcaaca ttctaagatg ctgggactta ctgtgtcatc aaatgtgcgg ttaagattct ctgggatatt gatactgttt gtgtttttag ttgggagatc tgagagacct ggctttggca agagcagatg tcattccata tcacctttct caatgaaagt ctcattctat cctctctcca aacccgtttt ccaacatttg ttaatagtta cgtctctcct gatgtagcac ttaagcttca tttagttatt atttctttct tcactttgca cacatttgca tccacatatt agggaaggaa taagtagctg caaactatct attcctgtat tattgtgtta acattgagat aaacc

<210> 2

<211> 762

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Gly: Pro Asn Ile Cys Thr Thr Arg Gly Val Ser Ser Cys Gl n Gl n Cys

1: 5 10 15

Leu: Ala Val Ser Pro Met Cys Ala Trp Cys Ser Asp Glu Ala Leu Pro



: 20 25 30

Leu: Gly Ser Pro Arg Cys Asp Leu Lys Glu Asn Leu Leu Lys Asp Asn


: 35 40 45

Cys: Ala Pro Glu Ser Ile Gl u Phe Pro Val Ser Gl u Ala Arg Val Leu

50: 55 60

Glu: Asp Arg Pro Leu Ser Asp Lys Gly Ser Gly Asp Ser Ser Gl n Val

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

65: 70 75 80

Thr: Gl n Val Ser Pro Gln Arg Ile Ala Leu Arg Leu Arg Pro Asp Asp




: 85 90 95

Ser: Lys Asn Phe Ser Ile Gl n Val Arg Gln Val Gl u Asp Tyr Pro Val



: 100 105 110

Asp: Ile Tyr Tyr Leu Met Asp Leu Ser Tyr Ser Met Lys Asp Asp Leu


: 115 120 125

Q_ L. 1-: Ser Ile Gln Asn Leu Gly Thr Lys Leu Ala Thr Gln Met Arg Lys

: 130 135 140

Leu: Thr Ser Asn Leu Arg Ile Gly Phe Gly Ala Phe Val Asp Lys Pro

145: 150 155 160

Val: Ser Pro Tyr Met Tyr Ile Ser Pro Pro Glu Ala Leu Glu Asn Pro



: 165 170 175

cys: Tyr Asp Met Lys Thr Thr Cys Leu Pro Met Phe Gly Tyr Lys Hi s



: 180 185 190

Val: Leu Thr Leu Thr Asp Gl n Val Thr Arg Phe Asn Glu Glu Val Lys


: 195 200 205

Lys: Gl n Ser Val Ser Arg Asn Arg Asp Ala Pro Gl u Gly Gly Phe Asp

: 210 215 220

Al a: Ile Met Gln Ala Thr Val Cys Asp Glu Lys Ile Gly Trp Arg Asn

225: 230 235 240

Asp: Ala Ser Hi s Leu Leu Val Phe Thr Thr Asp Ala Lys Thr Hi s Ile



: 245 250 255

Ala: Leu Asp Gly Arg Leu Ala Gly Ile Val Gln Pro Asn Asp Gly Gln



: 260 265 270

Cys: Hi s Val Gly Ser Asp Asn Hi s Tyr Ser Ala Ser Thr Thr Met Asp


: 275 280 285

Tyr: Pro Ser Leu Gly Leu Met Thr Glu Lys Leu Ser Gln Lys Asn Ile

290: 295 300

Asn: Leu Ile Phe Ala Val Thr Glu Asn Val Val Asn Leu Tyr Gln
Asn

305: 310 315 320

Tyr: Ser Glu Leu Ile Pro Gly Thr Thr Val Gly Val Leu Ser Met Asp



: 325 330 335

Ser
Ser: Asn Val Leu Gln Leu Ile Val Asp Ala Tyr Gly Lys Ile Arg



: 340 345 350

Ser: Lys Val Glu Leu Glu Val Arg Asp Leu Pro Gl u Glu Leu Ser Leu

: 355 360 365

Ser: Phe Asn Ala Thr Cys Leu Asn Asn Glu Val Ile Pro Gly Leu Lys

: 370 375 380

Ser: Cys Met Gly Leu Lys Ile Gly Asp Thr Val Ser Phe Ser Ile Glu

385: 390 395 400

Ala: Lys Val Arg Gly Cys Ser Gln Glu Lys Glu Lys Ser Phe Thr Ile




: 405 410 415

Lys: Pro Val Gly Phe Lys Asp Ser Leu Ile Val Gl n Val Thr Phe Asp



: 420 425 430

Cys: Asp Cys Ala Cys Gln Ala Gln Ala Glu Pro Asn Ser Hi s Arg
Cys


: 435 440 445

Asn
Asn: Gly Asn Gly Thr Phe Glu Cys Gly Val Cys Arg Cys Gly Pro

: 450 455 460

Gly: Trp Leu Gly Ser Gln Cys Glu Cys Ser Glu Gl u Asp Tyr Arg Pro

465: 470 475 480

Ser: Gl n Gln Asp Glu Cys Ser Pro Arg Glu Gly Gl n Pro Val Cys
Ser




: 485 490 495

Gln: Arg Gly Glu Cys Leu Cys Gly Gln Cys Val Cys Hi s Ser Ser Asp


: 500 505 510

Phe: Gly Lys Ile Thr Gly Lys Tyr Cys Glu Cys Asp Asp Phe Ser Cys


: 515 520 525

Val: Arg Tyr Lys Gly Glu Met Cys Ser Gly Hi s Gly Gln Cys Ser Cys

: 530 535 540

Gly: Asp Cys Leu Cys Asp Ser Asp Trp Thr Gly Tyr Tyr Cys Asn Cys

545: 550 555 560

Thr
Thr: Arg Thr Asp Thr Cys Met Ser Ser Asn Gly Leu Leu Cys Ser



: 565 570 575

Gly: Arg Gly Lys Cys Glu Cys Gly Ser Cys Val Cys Ile Gln Pro
Gly



: 580 585 590

Ser: Tyr Gly Asp Thr Cys Gl u Lys Cys Pro Thr Cys Pro Asp Ala Cys


: 595 600 605

Thr: Phe Lys Lys Glu Cys Val Glu Cys Lys Lys Phe Asp Arg Gly Ala

: 610 615 620

: Leu His Asp Glu Asn Thr Cys Asn Arg Tyr Cys Arg Asp Glu Ile Glu

: 625 630 635 640

: Ser Val Lys Glu Leu Lys Asp Thr Gly Lys Asp Ala Val Asn Cys Thr

5: 645 650 655

: Tyr Lys Asn Glu Asp Asp Cys Val Val Arg Phe Gl n Tyr Tyr Glu Asp


: 660 665 670

: Ser Ser Gly Lys Ser Ile Leu Tyr Val Val Glu Gl u Pro Glu Cys Pro

: 675 680 685

10: Lys Gly Pro Asp Ile Leu Val Val Leu Leu Ser Val Met Gly Ala Ile

: 690 695 700

: Leu Leu Ile Gly Leu Ala Ala Leu Leu Ile Trp Lys Leu Leu Ile Thr

: 705 710 715 720

: Ile His Asp Arg Lys Glu Phe Ala Lys Phe Glu Gl u Glu Arg Ala Arg

15: 725 730 735

: Ala Lys Trp Asp Thr Ala Asn Asn Pro Leu Tyr Lys Glu Ala Thr Ser


: 740 745 750

: Thr Phe Thr Asn Ile Thr Tyr Arg Gly Thr

: 755 760

20: <210> 3 <211> 40 <212> ADN

: <213> Homo sapiens

25: <400> 3

: caaggtgcga ggctgttccc aggagaagga gaagtccttt

: <210> 4

30: <211> 26 <212> PRT

: <213> Homo sapiens

: <400> 4

35: Val Ser Phe Ser Ile Glu Ala Lys Val Arg Gly Cys Ser Gln Glu Lys

: 1 5 10 15

: Glu Lys Ser Phe Thr Ile Lys Pro Val Gly

: 20 25

40: <210> 5 <211> 4469 <212> ADN

: <213> Homo sapiens

45: <220> <221> CDS

: <222> (79) . .(2364)

: <400> 5

50: atgcgagcgc ggccgcggcc ccggccgctc tgggtgactg tgctggcgct gggggcgctg

: gcgggcgttg gcgtagga ggg ccc aac atc tgt acc acg cga ggt gtg agc




: Gly Pro Asn Ile Cys Thr Thr Arg Gly Val Ser




: 1 5 10

: tcc tgc cag cag tgc ctg gct gtg Val agc ccc atg tgt gcc tgg tgc tct

55: Ser Cys Gln Gln Cys Leu Ala Ser Pro Met Cys Ala Trp Cys Ser

: 15 20 25

: gat gag gcc ctg cct ctg ggc tca cct cgc tgt gac ctg aag gag aat

: Asp Glu Ala Leu Pro Leu Gly Ser Pro Arg Cys Asp Leu Lys Glu Asn

: 30 35 40

60: ctg ctg aag gat aac tgt gcc cca gaa tcc atc gag ttc cca gtg Val agt

: Leu Leu Lys Asp Asn Cys Ala Pro Glu Ser Ile Gl u Phe Pro Ser

: 45 50 55

: gag gcc cga gta cta gag gac agg ccc ctc agc gac aag ggc tct gga

: Glu Ala Arg Val Leu Glu Asp Arg Pro Leu Ser Asp Lys Gly Ser Gly

65: 60 65 70 75

: gac agc tcc cag gtc act caa gtc agt ccc cag agg att gca ctc cgg

: Asp Ser Ser Gln Val Thr Gl n Val Ser Pro Gln Arg Ile Ala Leu Arg


: 80 85 90

40

60

111

159

207

255

303

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

399

447

495

543

591

639

687

735

783

831

879

927

975

1023

1071

1119

1167

1215

1263

1311

1359

1407

1455

ctc: cgg cca gat gat tcg aag aat ttc tcc atc caa gtg cgg cag gtg

Leu: Arg Pro Asp Asp Ser Lys Asn Phe Ser Ile Gl n Val Arg Gln Val


: 95 100 105

gag: gat tac cct gtg gac atc tac tac ttg atg gac ctg tct tac tcc

Glu: Asp Tyr Pro Val Asp Ile Tyr Tyr Leu Met Asp Leu Ser Tyr Ser


: 110 115 120

atg: aag gat gat ctg tgg agc atc cag aac ctg ggt acc aag ctg gcc

Met: Lys Asp Asp Leu Trp Ser Ile Gln Asn Leu Gly Thr Lys Leu Ala

: 12 5 130 135

acc: cag atg cga aag ctc acc agt aac ctg cgg att ggc ttc ggg gca

Thr: Gl n Met Arg Lys Leu Thr Ser Asn Leu Arg Ile Gly Phe Gly Ala

140: 145 150 155

ttt: gtg gac aag cct gtg tca cca tac atg tat atc tcc cca cca gag

Phe: Val Asp Lys Pro Val Ser Pro Tyr Met Tyr Ile Ser Pro Pro Glu


: 160 165 170

gcc: ctc gaa aac ccc tgc tat gat atg aag acc acc tgc ttg ccc atg

Al a: Leu Glu Asn Pro Cys Tyr Asp Met Lys Thr Thr Cys Leu Pro Met



: 175 180 185

ttt: ggc tac aaa cac gtg ctg acg cta act gac cag gtg acc cgc ttc

Phe: Gly Tyr Lys Hi s Val Leu Thr Leu Thr Asp Gl n Val Thr Arg
Phe


: 190 195 200

aat: gag gaa gtg aag aag cag agt gtg tca cgg aac cga gat gcc cca

Asn: Gl u Glu Val Lys Lys Gl n Ser Val Ser Arg Asn Arg Asp Ala Pro

: 205 210 215

gag: ggt ggc ttt gat gcc atc atg cag gct aca gtc tgt gat gaa aag

Glu: Gly Gly Phe Asp Ala Ile Met Gln Ala Thr Val Cys Asp Glu Lys

220: 225 230 235

att: ggc tgg agg aat gat gca tcc cac ttg ctg gtg ttt acc act gat

Ile: Gly Trp Arg Asn Asp Ala Ser Hi s Leu Leu Val Phe Thr Thr Asp



: 240 245 250

gcc: aag act cat ata gca ttg gac gga agg ctg gca ggc att gtc cag

Ala: Lys Thr Hi s Ile Ala Leu Asp Gly Arg Leu Ala Gly Ile Val Gln



: 255 260 265

cct: aat gac ggg cag tgt cat gtt ggt agt gac aat cat tac tct gcc

Pro: Asn Asp Gly Gln Cys Hi s Val Gly Ser Asp Asn Hi s Tyr Ser Ala


: 270 275 280

tcc: act acc atg gat tat ccc tct ttg ggg ctg atg act gag aag cta

Ser: Thr Thr Met Asp Tyr Pro Ser Leu Gly Leu Met Thr Glu Lys Leu

: 285 290 295

tcc: cag aaa aac atc aat ttg atc ttt gca gtg act gaa aat gta gtc

Ser: Gl n Lys Asn Ile Asn Leu Ile Phe Ala Val Thr Glu Asn Val Val

300: 305 310 315

aat: ctc tat cag aac tat agt gag ctc atc cca ggg acc aca gtt ggg

Asn: Leu Tyr Gln Asn Tyr Ser Glu Leu Ile Pro Gly Thr Thr Val Gly



: 320 325 330

gtt: ctg tcc atg gat tcc agc aat gtc ctc cag ctc att gtt gat gct

Val: Leu Ser Met Asp Ser Ser Asn Val Leu Gln Leu Ile Val Asp Ala



: 335 340 345

tat: ggg aaa atc cgt tct aaa gtc gag ctg gaa gtg cgt gac ctc cct

Tyr: Gly Lys Ile Arg Ser Lys Val Glu Leu Glu Val Arg Asp Leu Pro


: 350 355 360

gaa: gag ttg tct cta tcc ttc aat gcc acc tgc ctc aac aat gag gtc

Glu: Gl u Leu Ser Leu Ser Phe Asn Ala Thr Cys Leu Asn Asn Glu Val

: 365 370 375

atc: cct ggc ctc aag tct tgt atg gga ctc aag att gga gac acg gtg

Ile: Pro Gly Leu Lys Ser Cys Met Gly Leu Lys Ile Gly Asp Thr Val

380: 385 390 395

agc: ttc agc att gag gcc aag gtg cga ggc tgt ccc cag gag aag gag

Ser: Phe Ser Ile Glu Ala Lys Val Arg Gly Cys Pro Gln Glu Lys Glu




: 400 405 410

aag: tcc ttt acc ata aag ccc gtg ggc ttc aag gac agc ctg atc gtc

Lys: Ser Phe Thr Ile Lys Pro Val Gly Phe Lys Asp Ser Leu Ile Val


: 415 420 425

cag: gtc acc ttt gat tgt gac tgt gcc tgc cag gcc caa gct gaa cct

Gln: Val Thr Phe Asp Cys Asp Cys Ala Cys Gln Ala Gln Ala Glu Pro


: 430 435 440

aat: agc cat cgc tgc aac aat ggc aat ggg acc ttt gag tgt ggg gta

Asn: Ser Hi s Arg Cys Asn Asn Gly Asn Gly Thr Phe Glu Cys Gly Val


: 445 450 455

: tgc cgt tgt ggg cct ggc tgg ctg gga tcc cag tgt gag tgc tca gag 1503

: cys Arg Cys Gly Pro Gly Trp Leu Gly Ser Gln Cys Glu Cys Ser Glu

: 460 465 470 475

5: gag gac tat cgc cct tcc cag cag gac gag tgc agc ccc cgg gag ggt 1551

: Glu Asp Tyr Arg Pro Ser Gl n Gln Asp Glu Cys Ser Pro Arg Glu Gly




: 480 485 490

: cag ccc gtc tgc agc cag cgg ggc gag tgc ctc tgt ggt caa tgt gtc 1599

: Gln Pro Val Cys Ser Gln Arg Gly Glu Cys Leu Cys Gly Gln Cys Val

10: 495 500 505

: tgc cac agc agt gac ttt ggc aag atc acg ggc aag tac tgc gag tgt 1647

: Cys Hi s Ser Ser Asp Phe Gly Lys Ile Thr Gly Lys Tyr Cys Glu Cys



: 510 515 520

: gac gac ttc tcc tgt gtc cgc tac aag ggg gag atg tgc tca ggc cat 1695

15: Asp Asp Phe Ser Cys Val Arg Tyr Lys Gly Glu Met Cys Ser Gly Hi s


: 525 530 535

: ggc cag tgc agc tgt ggg gac tgc ctg tgt gac tcc gac tgg acc ggc 1743

: Gly Gl n Cys Ser Cys Gly Asp Cys Leu Cys Asp Ser Asp Trp Thr Gly

: 540 545 550 555

20: tac tac tgc aac tgt acc acg cgt act gac acc tgc atg tcc agc aat 1791

: Tyr Tyr Cys Asn Cys Thr Thr Arg Thr Asp Thr Cys Met Ser Ser Asn





: 560 565 570

: ggg ctg ctg tgc agc ggc cgc ggc aag tgt gaa tgt ggc agc tgt gtc 1839

: Gly Leu Leu Cys Ser Gly Arg Gly Lys Cys Glu Cys Gly Ser Cys Val

25: 575 580 585

: tgt atc cag ccg ggc tcc tat ggg gac acc tgt gag aag tgc ccc acc 1887

: Cys Ile Gln Pro Gly Ser Tyr Gly Asp Thr Cys Gl u Lys Cys Pro Thr



: 590 595 600

: tgc cca gat gcc tgc acc ttt aag aaa gaa tgt gtg gag tgt aag aag 1935

30: Cys Pro Asp Ala Cys Thr Phe Lys Lys Glu Cys Val Glu Cys Lys Lys


: 605 610 615

: ttt gac cgg gga gcc cta cat gac gaa aat acc tgc aac cgt tac tgc 1983

: Phe Asp Arg Gly Ala Leu Hi s Asp Glu Asn Thr Cys Asn Arg Tyr Cys

: 620 625 630 635

35: cgt gac gag att gag tca gtg aaa gag ctt aag gac act ggc aag gat 2031

: Arg Asp Glu Ile Glu Ser Val Lys Glu Leu Lys Asp Thr Gly Lys Asp





: 640 645 650

: gca gtg aat tgt acc tat aag aat gag gat gac tgt gtc gtc aga ttc 2079

: Ala Val Asn Cys Thr Tyr Lys Asn Glu Asp Asp Cys Val Val Arg Phe

40: 655 660 665

: cag tac tat gaa gat tct agt gga aag tcc atc ctg tat gtg gta gaa 2127

: Gln Tyr Tyr Glu Asp Ser Ser Gly Lys Ser Ile Leu Tyr Val Val Glu



: 670 675 680

: gag cca gag tgt ccc aag ggc cct gac atc ctg gtg gtc ctg ctc tca 2175

45: Glu Pro Glu Cys Pro Lys Gly Pro Asp Ile Leu Val Val Leu Leu Ser


: 685 690 695

: gtg atg ggg gcc att ctg ctc att ggc ctt gcc gcc ctg ctc atc tgg 2223

: Val Met Gly Ala Ile Leu Leu Ile Gly Leu Ala Ala Leu Leu Ile Trp

: 700 705 710 715

50: aaa ctc ctc atc acc atc cac gac cga aaa gaa ttc gct aaa ttt gag 2271

: Lys Leu Leu Ile Thr Ile Hi s Asp Arg Lys Glu Phe Ala Lys Phe Glu





: 720 725 730

: gaa gaa cgc gcc aga gca aaa tgg gac aca gcc aac aac cca ctg tat 2319

: Glu Gl u Arg Ala Arg Ala Lys Trp Asp Thr Ala Asn Asn Pro Leu Tyr

55: 735 740 745

: aaa gag gcc acg tct acc ttc acc aat atc acg tac cgg ggc act 2364

: Lys Gl u Ala Thr Ser Thr Phe Thr Asn Ile Thr Tyr Arg Gly Thr



: 750 755 760

taatgataag cagtcatcct cagatcatta tcagcctgtg ccaggattgc aggagtccct 2424

60 gccatcatgt ttacagagga cagtatttgt ggggagggat ttcggggctc agagtggggt 2484

aggttgggag aatgtcagta tgtggaagtg tgggtctgtg tgtgtgtatg tgggggtctg 2544

tgtgtttatg tgtgtgtgtt gtgtgtggga gtgtgtaatt taaaattgtg atgtgtcctg 2604

ataagctgag ctccttagcc tttgtcccag aatgcctcct gcagggattc ttcctgctta 2664

gcttgagggt gactatggag ctgagcaggt gttcttcatt acctcagtga gaagccagct 2724

65 ttcctcatca ggccattgtc cctgaagaga agggcagggc tgaggcctct cattccagag 2784

gaagggacac caagccttgg ctctaccctg agttcataaa tttatggttc tcaggcctga 2844

ctctcagcag ctatggtagg aactgctggc ttggcagccc gggtcatctg tacctctgcc 2904

tcctttcccc tccctcaggc cgaaggagga gtcagggaga gctgaactat tagagctgcc 2964

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

3024

3084

3144

3204

3264

3324

3384

3444

3504

3564

3624

3684

3744

3804

3864

3924

3984

4044

4104

4164

4224

4284

4344

4404

4464

4469

tgtgcctttt

gctaattctt

ctgggggatg

tggcagctct

ctctttacct

tctctcatga

tggccctatg

agccttggtg

gccttgtgaa

ggtcagttgt

gtctttaatc

ttaacttaaa

ggcaaagaag

tggcatcatt

tagaaggcta

ttcttttgtc

ccacccccaa

aactggagct

cttcttctta

ggtctctttc

ttaagattct

ggctttggca

cctctctcca

ttaagcttca

agggaaggaa

aaacc

gccatcccct

tgacctgttg

taccagcatc

actctggagg

cctaattcca

ccaaatgctt

cttccggcct

tgctgtatcc

ggaattattc

atcagcacgt

tgagaggcca

agaacatgta

gagagcatag

cacagcaagt

tggggataga

ccagaaaagc

atgcccaaga

ctggcctcag

aagctgtttc

agtatcaaca

ctgggatatt

agagcagatg

aacccgtttt

tttagttatt

taagtagctg

caacccagct

ggagtgagga

tcccagttca

tttgtttaga

caccctcact

ttcctcaaag

cctgtccctc

atccatgggg

ccatgagttg

gtggcctgtt

cagtgcaatt

tataaacatg

gaaaccacac

cactggccag

tgtgtggaca

agtggctcca

aaaaaagaaa

tgttacagct

tagtttgaga

ttctaagatg

gatactgttt

tcattccata

ccaacatttg

atttctttct

caaactatct

atggttctct

tgtctgggcc

taatcacaac

agaagtgtgt

gctgtagaca

ggagagagtg

atccatagca

ctgattgtat

gctgggaata

cttctatggg

ttattttatt

cttgcattat

agacttgggc

tggctggatc

cattggacct

ttggtgttga

gacttatcaa

aaataatctt

aatgatggga

ctgggactta

gtgtttttag

tcacctttct

ttaatagtta

tcactttgca

attcctgtat

cgcaagggaa

actcaggggt

ccttcaaaga

cacccttagg

tttgctatga

ctattgtaga

cctccacata

ttaccttcta

agtgccagga

ttacaacctc

tttctcatga

atttgtaaat

agggtacaga

tgtgaggggc

ttcctgagga

catacatcca

catttgttcc

taattaaggc

ttttagcagc

ctgtgtcatc

ttgggagatc

caatgaaagt

cgtctctcct

cacatttgca

tattgtgtta

gtccttgcaa

cattcatggc

tttgccttat

ccagcaccat

cctggggatg

gccagaggtc

cctggccctg

cctcttggct

tggaatgatg

atttaactca

tgaggttttc

ttatgtgtat

cactcccact

tctctcatga

agagggactg

acattaaaag

atgagcagaa

aagtcacttt

cagtcttgaa

aaatgtgcgg

tgagagacct

ctcattctat

gatgtagcac

tccacatatt

acattgagat

<210> l: 6

<211> :: 762

<212>: PRT

<213> 1: Homo sap ens

<400>: 6

Gly: Pro Asn Ile Cys Thr Thr Arg

1: 5

Leu: Ala Val Ser Pro Met Cys Ala



: 20

Leu: Gly Ser Pro Arg Cys Asp
Leu


: 35 40

cys: Ala Pro Glu Ser Ile Gl u Phe

50: 55

Glu: Asp Arg Pro Leu Ser Asp Lys

65: 70

Thr: Gl n Val Ser Pro Gl n Arg Ile




: 85

Ser: Lys Asn Phe Ser Ile Gl n Val


: 100

Asp: Ile Tyr Tyr Leu Met Asp Leu


: 115 120

Q_ L. 1-: Ser Ile Gl n Asn Leu Gly Thr

130: 135

Leu: Thr Ser Asn Leu Arg Ile Gly

145: 150

Val: Ser Pro Tyr Met Tyr Ile Ser



: 165

Cys: Tyr Asp Met Lys Thr Thr
Cys



: 180

Val: Leu Thr Leu Thr Asp Gl n
Val


: 195 200

Lys: Gl n Ser Val Ser Arg Asn Arg

: 210 215

Ala: Ile Met Gl n Ala Thr Val Cys

225: 230

Asp: Ala Ser Hi s Leu Leu Val Phe



: 245

Ala: Leu Asp Gly Arg Leu Ala Gly



: 260

Cys: Hi s Val Gly Ser Asp Asn Hi s

Gly: Val Ser Ser Cys Gl n Gl n Cys

: 10 15

Trp: Cys Ser Asp Glu Ala Leu Pro

25: 30

Lys: Glu Asn Leu Leu Lys Asp Asn




: 45

Pro: Val Ser Gl u Ala Arg Val Leu



: 60

Gly: Ser Gly Asp Ser Ser Gl n Val


: 75 80

Ala: Leu Arg Leu Arg Pro Asp Asp

: 90 95

Arg: Gl n Val Gl u Asp Tyr Pro Val

105: 110

Ser: Tyr Ser Met Lys Asp Asp Leu




: 125

Lys: Leu Ala Thr Gl n Met Arg
Lys



: 140

Phe: Gly Ala Phe Val Asp Lys Pro


: 155 160

Pro
Pro: Glu Ala Leu Glu Asn
Pro

: 170 175

Leu: Pro Met Phe Gly Tyr Lys Hi s

185: 190

Thr: Arg Phe Asn Glu Glu Val Lys



: 205

Asp: Ala Pro Gl u Gly Gly Phe
Asp



: 220

Asp: Glu Lys Ile Gly Trp Arg Asn


: 235 240

Thr
Thr: Asp Ala Lys Thr Hi s Ile

: 250 255

Ile: Val Gl n Pro Asn Asp Gly Gl n

265: 270

Tyr: Ser Ala Ser Thr Thr Met Asp

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65


: 275 280 285

Tyr: Pro Ser Leu Gly Leu Met Thr Glu Lys Leu Ser Gln Lys Asn Ile

290: 295 300

Asn: Leu Ile Phe Ala Val Thr Glu Asn Val Val Asn Leu Tyr Gln
Asn

305: 310 315 320

Tyr: Ser Glu Leu Ile Pro Gly Thr Thr Val Gly Val Leu Ser Met Asp



: 325 330 335

Ser
Ser: Asn Val Leu Gln Leu Ile Val Asp Ala Tyr Gly Lys Ile Arg



: 340 345 350

Ser: Lys Val Glu Leu Glu Val Arg Asp Leu Pro Gl u Glu Leu Ser Leu

: 355 360 365

Ser: Phe Asn Ala Thr Cys Leu Asn Asn Glu Val Ile Pro Gly Leu Lys

: 370 375 380

Ser: Cys Met Gly Leu Lys Ile Gly Asp Thr Val Ser Phe Ser Ile Glu

385: 390 395 400

Al a: Lys Val Arg Gly Cys Pro Gln Glu Lys Glu Lys Ser Phe Thr Ile




: 405 410 415

Lys: Pro Val Gly Phe Lys Asp Ser Leu Ile Val Gl n Val Thr Phe Asp


: 420 425 430

cys: Asp Cys Ala Cys Gln Ala Gln Ala Glu Pro Asn Ser Hi s Arg Cys


: 435 440 445

Asn
Asn: Gly Asn Gly Thr Phe Glu Cys Gly Val Cys Arg Cys Gly Pro

: 450 455 460

Gly: Trp Leu Gly Ser Gln Cys Glu Cys Ser Glu Gl u Asp Tyr Arg Pro

465: 470 475 480

Ser: Gl n Gln Asp Glu Cys Ser Pro Arg Glu Gly Gl n Pro Val Cys
Ser




: 485 490 495

Gln: Arg Gly Glu Cys Leu Cys Gly Gln Cys Val Cys Hi s Ser Ser Asp


: 500 505 510

Phe: Gly Lys Ile Thr Gly Lys Tyr Cys Glu Cys Asp Asp Phe Ser Cys


: 515 520 525

Val: Arg Tyr Lys Gly Glu Met Cys Ser Gly Hi s Gly Gln Cys Ser Cys

: 530 535 540

Gly: Asp Cys Leu Cys Asp Ser Asp Trp Thr Gly Tyr Tyr Cys Asn Cys

545: 550 555 560

Thr
Thr: Arg Thr Asp Thr Cys Met Ser Ser Asn Gly Leu Leu Cys Ser



: 565 570 575

Gly: Arg Gly Lys Cys Glu Cys Gly Ser Cys Val Cys Ile Gln Pro
Gly



: 580 585 590

Ser: Tyr Gly Asp Thr Cys Gl u Lys Cys Pro Thr Cys Pro Asp Ala Cys


: 595 600 605

Thr: Phe Lys Lys Glu Cys Val Glu Cys Lys Lys Phe Asp Arg Gly Ala

: 610 615 620

Leu: Hi s Asp Glu Asn Thr Cys Asn Arg Tyr Cys Arg Asp Glu Ile Glu

625: 630 635 640

Ser: Val Lys Glu Leu Lys Asp Thr Gly Lys Asp Ala Val Asn Cys Thr




: 645 650 655

S_ 1-: Lys Asn Glu Asp Asp Cys Val Val Arg Phe Gl n Tyr Tyr Glu Asp



: 660 665 670

Ser
Ser: Gly Lys Ser Ile Leu Tyr Val Val Glu Glu Pro Glu Cys Pro


: 675 680 685

Lys: Gly Pro Asp Ile Leu Val Val Leu Leu Ser Val Met Gly Ala Ile

690: 695 700

Leu
Leu: Ile Gly Leu Ala Ala Leu Leu Ile Trp Lys Leu Leu Ile Thr

705: 710 715 720

Ile: Hi s Asp Arg Lys Glu Phe Ala Lys Phe Glu Gl u Glu Arg Ala Arg




: 725 730 735

Ala: Lys Trp Asp Thr Ala Asn Asn Pro Leu Tyr Lys Glu Ala Thr Ser



: 740 745 750

Thr: Phe Thr Asn Ile Thr Tyr Arg Gly Thr


: 755 760

<210> ;: 7

<211> :: 191

<212> ADN

<213> Homo: sap ens

<400>: 7

cagagctgga gtgttaactg ggcccaactg tgtctaaata caatctttct ttccatccag gtgagcttca gcattgaggc caaggtgcga ggctgttccc aggagaagga gaagtccttt accataaagc ccgtgggctt caaggacagc ctgatcgtcc aggtcacctt tgattggact gtgcctgcca g 5

<210> 8

<211> 70

<212> PRT

<213> Homo sapiens

10

<400> 8

Trp: Ala Gln Leu Cys Leu Asn Thr Ile Phe Leu Ser Ile Gln Val Ser

1: 5 10 15

Phe: Ser Ile Glu Ala Lys Val Arg Gly Cys Ser Gl n Glu Lys Glu Lys

15: 20 25 30

Ser: Phe Thr Ile Lys Pro Val Gly Phe Lys Asp Ser Leu Ile Val Gln


: 35 40 45

Val: Thr Phe Asp Cys Asp Cys Ala Cys Gln Ala Gl n Ala Glu Pro Asn

50 55 60

20 Ser His Arg Cys Asn Asn 65 70

<210> 9

<211> 22 25 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador 30

<400> 9

tccagagctg gagtgttaac tg

<210> 10 35 <211> 21

<212> ADN <213> Artificial

<220>

40 <223> cebador

<400> 10

ctggcaggca cagtcacaat c

45 <210> 11

<211> 22 <212> ADN <213> Artificial

50 <220>

<223> cebador

<400> 11

tccagagctg gagtgttaac tg

55

<210> 12 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial

60

<220>

<223> cebador

<400> 12

65 ctggcaggca cagtcacaat c

<210> 13

<211> 20

60

120

180

191

22

21

22

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

<212> <213>: ADN Arti fi ci al

<220> <223>: cebador

<400> 13 ccatccaggt gagcttcagc

<210> <211> <212> <213>: 14 22 ADN Artificial

<220> <223>: cebador

<400> 14 agtggttgca ggtatatgag gg

<210> <211> <212> <213>: 15 14 ADN Artificial

<220> <223>: sonda

<400> 15 gctgtcccca ggag

<210> <211> <212> <213>: 16 16 ADN Artificial

<220> <223>: sonda

<400> 16 gaggctgtgc ccagga

<210> <211> <212> <213>: 17 15 ADN Artificial

<220> <223>: sonda

<400> 17 gaggctgttc ccagg

<210> <211> <212> <213>: 18 19 ADN Artificial

<220> <223>: sonda

<400> 18 tgaacctaat agccatcgc

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

REIVINDICACIONES

1. Polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos de un gen GPIIIa, en el que el residuo de nucleótido correspondiente al de la posición 1297 de la SEQ ID NO: 1 es un residuo de timina, o un fragmento del mismo que comprende dicho residuo de timina y que tiene una longitud de al menos 10 bases.
2. Polinucleótido o el fragmento del mismo, según la reivindicación 1, seleccionado de los siguientes (i), (ii), (iii) y (iv):

(i) un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1;

(ii) un polinucleótido que consiste en una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 en la que se insertan, se sustituyen y/o se eliminan uno o más nucleótidos, y/o se añaden uno o más nucleótidos a uno o ambos de sus extremos, y que codifica una proteína funcionalmente equivalente a una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2;

(iii) un polinucleótido que se hibrida, bajo condiciones rigurosas, con un polinucleótido que consiste en la secuencia complementaria de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1, y que codifica una proteína funcionalmente equivalente a una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2; y

(iv) un polinucleótido que tiene un 70% o más de identidad con un polinucleótido que consiste en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1, y que codifica una proteína funcionalmente equivalente a una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2
3. Polinucleótido o el fragmento del mismo, según la reivindicación 1, que codifica una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o una parte de la misma que tiene al menos 6 residuos de aminoácidos.
4. Polinucleótido o el fragmento del mismo, según la reivindicación 1, que consiste en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 o un fragmento de la misma que tiene una longitud de al menos 10 bases.
5. Proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de una proteína GPIIIa, en la que el residuo de aminoácido que corresponde al de la posición 407 de la SEQ ID NO: 2 es un residuo de serina, o un fragmento de la misma que comprende dicho residuo de serina y que tiene al menos 6 residuos de aminoácidos.
6. Proteína o el fragmento de la misma, según la reivindicación 5, seleccionada de los siguientes (v), (vi), (vii) y (viii):

(v) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2;

(vi) una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 en la que se insertan, se sustituyen y/o se eliminan uno o más aminoácidos, y/o se añaden uno o más aminoácidos a uno o ambos de sus extremos, y que es funcionalmente equivalente a una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2;

(vii) una proteína que es codificada por un polinucleótido que hibrida, en condiciones rigurosas, con un polinucleótido que consiste en la secuencia complementaria de una secuencia de nucleótidos de un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y que es funcionalmente equivalente a una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; y

(viii) una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene el 70% o más de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y que es funcionalmente equivalente a una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
7. Proteína o el fragmento de la misma, según la reivindicación 5, que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o una parte de la misma que tiene al menos 6 residuos de aminoácidos.
8. Kit para detectar el polimorfismo 1297T del gen GPIIIa, que comprende un cebador que puede hibridar con una secuencia de nucleótidos del polinucleótido, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o una secuencia complementaria de la misma, y que se utiliza para la amplificación, mediante un procedimiento de amplificación de ácido nucleico, de una región que comprende el residuo de nucleótido en la posición 1297 que es un residuo de timina del gen GPIIIa o el residuo que se empareja con el mismo.
9. Kit, según la reivindicación 8, en el que el cebador consiste en un polinucleótido que comprende al menos 10 nucleótidos contiguos de una secuencia de nucleótidos del polinucleótido, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o una secuencia complementaria de la misma.
10. Kit, según la reivindicación 8 o 9, en el que el cebador tiene una longitud de al menos 12 a 30 bases.
11. Kit para detectar el polimorfismo 1297T del gen GPIIIa, que comprende un conjunto de cebadores que consiste en dos o más clases de los cebadores definidos en cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, y que se utiliza para la amplificación, mediante un procedimiento de amplificación de ácido nucleico, de una región que comprende el residuo de nucleótido en la posición 1297 del gen GPIIIa o el residuo que se empareja con el mismo.
12. Kit para detectar el polimorfismo 1297T del gen GPIIIa, que comprende una sonda que se puede hibridar con una secuencia de nucleótidos del polinucleótido, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o una secuencia complementaria de la misma, y que es para usar en la detección del residuo de timina en la posición 1297 del gen

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GPIIIa.
13. Kit, según la reivindicación 12, en el que la sonda comprende un polinucleótido que se hibrida con una región que comprende el residuo de nucleótido en la posición 1297 del gen GPIIIa o el residuo que se empareja con el mismo en una secuencia de nucleótidos del polinucleótido, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o una secuencia complementaria de la misma.
14. Kit, según la reivindicación 12 o 13, en el que la sonda consiste en un polinucleótido que comprende al menos 10 nucleótidos contiguos de una secuencia de nucleótidos del polinucleótido, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o una secuencia complementaria de la misma.
15. Kit, según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en el que la sonda tiene una longitud de al menos 12 a 30 bases.
16. Anticuerpo contra una proteína, según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, o un fragmento del mismo, que es específico para el residuo de aminoácido en la posición 407 de la proteína GPIIIa que es un residuo de serina.
17. Anticuerpo, según la reivindicación 16, para la determinación de púrpura trombocitopénica neonatal aloinmune o del riesgo de desarrollar púrpura trombocitopénica neonatal aloinmune, o la posibilidad de aparición de refractariedad a la terapia de transfusión de plaquetas en la transfusión de plaquetas.
18. Kit para determinar la púrpura trombocitopénica neonatal aloinmune o el riesgo de desarrollarla, o la posibilidad de aparición de la refractariedad a la terapia de transfusión de plaquetas en la transfusión de plaquetas, que comprende al menos el anticuerpo, según la reivindicación 16.
19. Kit, según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15, para usar en la determinación de púrpura trombocitopénica neonatal aloinmune o el riesgo de desarrollarla, o la posibilidad de aparición de la refractariedad a la terapia de transfusión de plaquetas en la transfusión de plaquetas.