ES2665958T3 - Anticuerpos monoclonales contra las variantes de hemoglobina C, S, E y D - Google Patents

Anticuerpos monoclonales contra las variantes de hemoglobina C, S, E y D Download PDF

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Abstract

Un anticuerpo monoclonal que se une selectivamente a la variante de hemoglobina HbC y la HbC glicada, en el que el anticuerpo se une a un epítopo mínimo de HbC 4TPKEKSAVT12

Description

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DESCRIPCION
Anticuerpos monoclonales contra las variantes de hemoglobina C, S, E y D Antecedentes de la invención
1. Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo de los anticuerpos monoclonales contra variantes de hemoglobina glicadas y no glicadas HbC, HbS, HbE y HbD.
2. Descripción de la técnica anterior
Para los individuos que padecen diabetes mellitus tipo 1 o tipo 2, el mantenimiento del control glucémico es de máxima importancia, y dicho mantenimiento necesita la determinación del nivel de hemoglobina HbA-ic en la sangre de estos individuos. Como la diabetes alcanza proporciones de epidemia global, es particularmente importante tener ensayos de HbA-ic precisos y reproducibles. Los ensayos de HbA-ic se utilizaron también en la exploración de individuos respecto a diabetes.
Las mediciones de HbA-ic para tanto el control como la exploración de pacientes se toman como una media sobre la vida de un eritrocito. Esta media está comprometida por varias condiciones fisiológicas, entre las cuales es notable la presencia de variantes de hemoglobina y talasemias en la sangre del paciente. Las variantes de hemoglobina son prevalentes entre ciertos grupos étnicos y en ciertas regiones geográficas. De las más de 800 variantes conocidas en todo el mundo, las más comunes son HbS, HbC, HbD, y HbE. La HbS es la más prevalentes entre los individuos descendientes de africanos, la HbD entre los individuos descendientes del Punjab indio, y HbE entre los individuos del sureste de Asia. Otras formas conocidas de hemoglobina es la HbF (hemoglobina fetal) y HbA2, que pueden estar ambas elevadas en talasemia, una afección relativamente común caracterizada por un desequilibrio de las subunidades alfa y beta de la hemoglobina. Las beta talasemias también pueden existir en presencia de HbE y HbS, y el rasgo combinado de falciforme/talasemia beta existe más frecuentemente entre los individuos de ascendencia mediterránea. Las variantes y las talasemias pueden producir inexactitudes en las mediciones de la HbA-ic afectando factores tales como la supervivencia de los glóbulos rojos y las tasas de glicosilación. Las variantes también afectan a los niveles determinados inmunológicamente de hemoglobina glicada ya que la inmunorreactividad difiere de una variante glicada a la siguiente y también entre variantes glicadas en la propia HbA. Los profesionales de la salud deben saber por lo tanto de la presencia de variantes y sus proporciones relativas con respecto a HbA, así como la presencia de talasemias para conseguir una determinación apropiada del control de la glucemia.
También, la enfermedad de hemoglobina D en niños se vuelve manifiesta por la presencia de HbD y la ausencia de HbA (véase, "Hemoglobin D Disease", Fact Sheet for Health Care Providers 08/2008, Utah Department of Health).
Las determinaciones de variantes de hemoglobina se hacen normalmente por separado de las determinaciones de HbA-ic independientemente de si está presente una variante conocida actualmente. Se han desarrollado anticuerpos contra variantes específicas con este fin, y lo siguiente es una muestra de informes de dichos anticuerpos:
HbS: Jensen, R.H., y col., "Monoclonal antibodies specific for sickle cell hemoglobin," Hemoglobin 9(4), 349-362 (1985)
HbS: Epstein, N., y col., "Monoclonal antibody-based methods for quantitation of hemoglobins: application to evaluating patients with sickle cell anemia treated with hydroxyurea," Eur. J. Haemotol. 57(1), 17-24 (1996)
HbA: Rosenthal, M.A., y col., "Binding specificity of a monoclonal antibody to human HbA," Hemoglobin 19(3-4), 191-196 (1995)
HbS y HbA: Jensen, R.H., y col., "Monoclonal antibodies to human hemoglobin S and cell lines for the production thereof', US 4,752,583, expedida el 21 de junio de 1988
HbS y HbC: Garver, E.A., y col., "Screening for hemoglobins S and C in newborn and adult blood with a monoclonal antibody in an ELISA procedure," Annals of Hematology 60(6), 334-338 (1990)
Hb con sustituciones de aminoácidos únicas: Stanker, L.H., y col., "Monoclonal antibodies recognizing single amino acid substitutions in hemoglobin," J. Immunol. 136 (11), 4174-4180 (1986)
Variantes de Hb: Moscoso. H., y col., "Enzyme immunoassay for the identification of hemoglobin variants," Hemoglobin 14(4), 389-98 (1990)
Variantes de Hb: Schultz, J.C., "Utilization of monoclonal antibody-based assay HemoCard in screening for and differentiating between genotypes of sickle cell disease and other hemoglobinopathies," J. Clin. Lab. Anal. 9(6), 366-374 (1995)
Pan-specific, i.e. specific for all structural variants of glycated hemoglobin, monoclonal antbodies: Jensen, S. S.,
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"Pan-specific monoclonal antibody", documento WO 02/088185, publicado el 7 de noviembre de 2002.
Los procedimientos generales para la determinación de variantes de hemoglobina se desvelan en:
Rosenthal, M.A., y col., "Monoclonal antibody immunoassy for the identification of hemoglobin variants in neonatal screening", Screening 3, 67-76 (1994), y
Likuski, R., y col., "Calibration surface method for determination of analyte ratios", documento WO 2010/021914 publicado el 25 de febrero de 2010.
A pesar de estos informes y otros, las determinaciones de variantes se llevan a cabo en este momento por cromatografía líquida de altas prestaciones (HPLC) o electroforesis. La HPLC puede ser un rápido medio además para la obtención del nivel de HbA-ic, pero se necesitan gradientes de HPLC extendidos para la detección y cuantificación de las variantes y talasemias ya que las impurezas de la HPLC se co-eluyen con las variantes, y las diferentes variantes tienden a co-eluirse entre ellas. De hecho, ciertas variantes no se pueden resolver por HPLC, incluso con los gradientes de HPLC más optimizados. Normalmente, se utilizan procedimientos separados para mediciones rápidas de A-ic y ensayos de variantes y talasemia, haciendo imposible por lo tanto determinar simultáneamente el nivel de A1c y el estatus de variantes o talasemia por HPLC, mucho menos de una manera rápida.
Los ensayos que proporcionan la detección simultánea de múltiples analitos se denominan ensayos “múltiplex”, y las divulgaciones de ensayos múltiplex que utilizan reacciones de unión tipo afinidad sobre la superficie de perlas se detectan entonces por citometría se desvelan en las siguientes patentes:
Watkins, M.I., y col., "Magnetic particles as solid phase for multiplex flow assays”, documento US 6,280,618 B2, presentado el 28 de agosto de 2001
Watkins, M.I., y col., "Magnetic particles as solid phase for multiplex flow assays”, documento US 6,872,578 B2, presentado el 29 de marzo de 2005
Thomas, N., "Multiple assay method”, documento US 6,913,935 B1, presentado el 5 de julio de 2005
Hechinger, M., "Platelet immunoglobulin bead suspension and flow cytometry”, documento US 6,933,106 B1, presentado el 23 de agosto de 2005
Hechinger, M., "Anti-platelet immunoglobulin bead positive control”, documento US 6,951,716 B1, presentado el 4 de octubre de 2005
Watkins, M.I., y col., "Multi-analyte diagnostic test for thyroid disorders”, documento US 7,271,009 B1, presentado el 8 de septiembre de 2007
Bell, M.L., "Assay procedures and apparatus”, documento US 7,326,573 B2, presentado el 5 de febrero de 2008
Song, Y., y col., "Multiplex protein interaction determinations using glutathione-GST binding”, documento US 2002/0115116 A1, publicado el 22 de agosto de 2002
El éxito de los ensayos múltiplex para ciertas combinaciones de analitos no proporciona sin embargo la seguridad, o incluso un alto nivel de expectativa, de que se alcanzará un éxito similar para todas las combinaciones de analitos, particularmente las combinaciones con un alto nivel de homología entre los analitos. La hemoglobina y sus variantes y las formas glicadas son una de dicha combinación. Los ensayos múltiplex implican una pluralidad de diferentes inmunorreactivos en una mezcla íntima en un medio de reacción común, que crea una competición entre los inmunorreactivos por los diferentes analitos, más que en medios en los que está presente un único inmunorreactivo, y las reactividades cruzadas se producen en múltiples direcciones. Los conjuntos de las propias perlas también se deben diferenciar al mismo tiempo que se llevan a cabo los inmunoensayos. Esta diferenciación, sea por el uso de diferentes colorantes o diferentes conjuntos de perlas, un tamaño diferente de cada conjunto de perlas, u otros factores de diferenciación conocidos, añade un nivel adicional de complejidad y oportunidades adicionales de interacción.
Sumario de la invención
La presente invención se define en las reivindicaciones adjuntas y reside en el hallazgo de que las variantes de hemoglobina se pueden diferenciar entre ellas y de la HbA1c y de la hemoglobina total, y medirse los valores de cada una, en un inmunoensayo múltiplex. El ensayo puede, por ejemplo, detectar una única variante además de la HbA1c y la hemoglobina total o dos o más variantes y la hemoglobina total. Cuando se detectan dos o más variantes, se pueden seleccionar diferentes combinaciones de las variantes, aunque preferentemente el ensayo incluirá las cuatro variantes más comunes, HbS, HbC, HbE, y HbD. El ensayo puede incluir también la medición de HbA2 y HbF. Se desvela un procedimiento para detectar e identificar la presencia de variantes de hemoglobina en la sangre de un paciente. También se desvela un procedimiento para medir el nivel de HbA1c con respecto a la hemoglobina total mientras que se corrige el resultado por la presencia de variantes que también pueden estar presentes. En el presente documento también, la corrección puede ser por variantes individuales o combinaciones de variantes.
También se devela un procedimiento para la detección simultánea de Aic y variantes de hemoglobina sin corrección, lo que es útil en ciertos casos. Se desvela adicionalmente la medición de niveles de variantes particulares en forma glicada. Cuando se sabe que una variante está presente, se puede medir la versión glicada de esa variante y añadirla al nivel de HbA1c para obtener una indicación precisa de la hemoglobina glicada total.
5 La invención proporciona anticuerpos que tienen una afinidad de unión selectiva por las variantes de hemoglobina que se pueden utilizar en los procedimientos desvelados en el presente documento. En algunas realizaciones, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal que se une selectivamente a la variante de hemoglobina HbC y la HbC glicada, en el que el anticuerpo monoclonal se une a un epítopo mínimo de HbC 4TPKEKSAVT12 En particular, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal que se une selectivamente a la variante de hemoglobina HbS y la 10 HbS glicada, en la que el anticuerpo monoclonal se une a un epítopo mínimo de HbS 3LTPVEKSAVT12. Además, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal que se une selectivamente a la variante de hemoglobina HbE y HbE glicada, en el que el anticuerpo se une a un epítopo mínimo de HbE 22EVGGK26 o a 21DEVGGK26. Incluso adicionalmente, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal que se une selectivamente a la variante de hemoglobina HbD y la HbD glicada, en el que el anticuerpo monoclonal se une a un epítopo mínimo de HbD 15 121QFTPP125 o a 119GKQTPP125.
El procedimiento desvelado puede emplear también un anticuerpo, sea un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal que se una selectivamente a la hemoglobina total (en comparación con polipéptidos no hemoglobina). Un anticuerpo policlonal pan-reactivo para su uso en el procedimiento se une a uno o más epítopos presentes en las regiones siguientes de la alfa globina y la beta globina: 49SHGSAQVKGHGKKVADALTNAVAHVDDMPUNALSALSD 20 HLHAHKLRRVDPV96, betaglobina 15WGKVNVDEVGGEALG30, 45FGDLSTP51, y 76AHLDNLKGTFAT87. Un anticuerpo
pan-reactivo puede ser un anticuerpo monoclonal o policlonal que se une al epítopo 9SAVTALWGKVNV20 (beta globina) o 8KSAVTALWGKVNV20 o 11VTALW15 o a un epítopo mínimo de betaglobina que comprende la secuencia ALWG o VTX9LW, en el que X9 es uno de los 20 aminoácidos comunes de origen natural. Un anticuerpo para su uso en el procedimiento se puede unir a un epítopo en la beta globina, por ejemplo, 8KSAVTALWGKVNV20, 25 58PKVKAHGKKVLGAF71 o 87TLSELHCDKLHVDPENFR104 (betaglobina).
Se desvelan adicionalmente anticuerpos monoclonales que se unen selectivamente a formas glicadas de hemoglobina, incluyendo la unión a hemoglobinas normales y variantes, pero no se unen a formas no glicadas de hemoglobina, un resto glicosilado 1V y un resto 3H son normalmente importante para la unión de dichos anticuerpos.
El procedimiento que se desvela en el presente documento puede comprender adicionalmente la detección de otras 30 variantes de hemoglobina utilizando anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos monoclonales, que se unen selectivamente a dichas variantes.
Normalmente un anticuerpo de la invención tiene una Kd que está en el intervalo de desde 10'6 M a 10'12 M. El anticuerpo puede tener una Kd que está en el intervalo de desde 10'7 M a 10'11 M. De manera alternativa, el anticuerpo puede tener una Kd que está en el intervalo de desde 10'8 M a 10'10 M. Normalmente, la Kd está en el 35 intervalo nM, por ejemplo, cualquiera desde 10'9 M a 10'10 M.
Estas y otras características, objetivos y ventajas de la invención se entenderán mejor a partir de la siguiente descripción.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1 proporciona una representación esquemática de un ejemplo de inmunoensayo sándwich para la 40 medición de hemoglobina glicada y variantes de hemoglobina.
La FIG. 2 es un gráfico de los datos comparativos entre una serie de ensayos múltiplex como se desvela en el presente documento y una serie de ensayos HPLC.
Descripción detallada de la invención y realizaciones preferidas
Las variantes de hemoglobina que se van a detectar por el procedimiento desvelado en el presente documento son 45 cualquiera de las variantes conocidas de que se informa en la bibliografía o conocidas de otra manera por los clínicos e investigadores expertos en la tecnología del a hemoglobina, hemoglobina glicada, y diabetes. Como se ha señalado anteriormente, las cuatro variantes más comunes de hemoglobina son HbS, HbC, HbE y HbD, aunque se pueden detectar otras variantes además de estas cuatro o en lugar de una o más de ellas. Por ejemplo, dos variantes que están elevadas en la beta talasemia son HbF y HbA2. Los miembros de la unión que se utiliza para 50 cada una de esas variantes en el ensayo múltiple son generalmente anticuerpos monoclonales, preferentemente los que se desarrollan expresamente para el ensayo múltiplex. Los anticuerpos se unen preferentemente a los epítopos de las variantes que distinguen cada variante de otras variantes para minimizar la reactividad cruzada, y más importantemente que distingan las variantes de la hemoglobina tipo silvestre A0. Cuando se necesita el uso de un valor para la concentración de hemoglobina total en la muestra, la concentración se puede determinar por un 55 procedimiento de inmunoensayo o un procedimiento no-inmunoensayo. Un ejemplo de un procedimiento no inmunoensayo es la determinación de la densidad óptica. Otros ejemplos serán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica de la hemoglobina. Cuando se determina la hemoglobina total por un inmunoensayo, la
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determinación se puede llevar a cabo como una parte del ensayo múltiplex. El anticuerpo para la hemoglobina total en el ensayo múltiplex puede ser un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal, y el anticuerpo para HbA1c puede ser o un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal, preferentemente un anticuerpo monoclonal.
Anticuerpos
Como se utiliza en el presente documento, un “anticuerpo” se refiere a una proteína definida funcionalmente como una proteína de unión y definida estructuralmente como que comprende una secuencia de aminoácido que es reconocida por un experto como que se deriva de una región marco conservada de un gen que codifica una inmunoglobulina de un animal que produce anticuerpos. Un anticuerpo puede consistir en uno o más polipéptidos sustancialmente codificados por genes de inmunoglobulina o fragmentos de genes de inmunoglobulinas. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de la región constante kappa, lambda, alfa, gamma, delta, épsilon y mu, así como una miríada de genes de región variable de inmunoglobulina. Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta, o épsilon, que a su vez definen las clases de inmunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente.
Una unidad estructural de inmunoglobulina (anticuerpo) típico se sabe que comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, cada par tiene una cadena “ligera” (de aproximadamente 25 kD) y una “pesada (de aproximadamente 50 kD). El extremo N de cada cadena define una región variable de 100 a 110 o más aminoácidos, responsable primariamente del reconocimiento antigénico. Las expresiones cadena ligera variable (Vl) y cadena pesada variable (Vh) se refiere a estas cadenas ligera y pesada, respectivamente.
El término anticuerpo como se utiliza en el presente documento incluye fragmentos de anticuerpo que mantengan la especificidad de unión. Por ejemplo, hay varios fragmentos de anticuerpo bien caracterizados. Por lo tanto, por ejemplo, la pepsina digiere el extremo C hasta los enlaces disulfuro en la región de bisagra para producir F(ab')2, un dímero de Fab que por sí mismo es una cadena ligera unido a una VH-CH1 (Fd) mediante un enlace disulfuro. El F(ab')2 se puede reducir en condiciones leves para romper el enlace disulfuro en la región bisagra convirtiendo de esta manera el dímero (Fab')2 en un monómero Fab'. El monómero Fab' es esencialmente un Fab con todo o parte de la región bisagra (véase, Fundamental Immunology, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993), para una descripción más detallada de otros fragmentos de anticuerpo). Mientras que distintos fragmentos de anticuerpo se definen en términos de la digestión de un anticuerpo intacto, un experto en la técnica apreciará que los fragmentos se pueden sintetizar de novo sea químicamente o utilizando metodología de ADN recombinante. Por lo tanto, el término “anticuerpo” también incluye fragmentos de anticuerpo producidos por la modificación de anticuerpos completos o sintetizados utilizando metodologías de ADN recombinante. Los anticuerpos incluyen dímeros tales como dímeros Vh-Vl, dímeros Vh, o dímeros Vl, incluyendo una única cadena de anticuerpos. De manera alternativa, el anticuerpo puede ser otro fragmento tal como un Fv estabilizado con disulfuro (dsFv). Otros fragmentos se pueden generar también utilizando técnicas conocidas, incluyendo la utilización de técnicas recombinantes. Los anticuerpos incluyen los que se han presentado en fagos o se han generado por tecnología recombinante utilizando vectores en los que las cadenas se secretan como proteínas solubles, por ejemplo, scFv, Fv, Fab, (Fab')2 o generados por tecnología recombinante utilizando vectores en los que las cadenas se secretan como proteínas solubles.
Como se utiliza en el presente documento, un “miembro de unión inmunológica que tiene afinidad de unión selectiva” por un antígeno, por ejemplo, una variante de hemoglobina es normalmente un anticuerpo. Un miembro de unión que tiene afinidad de unión selectiva por un antígeno puede ser un péptido, por ejemplo, que se puede identificar explorando bibliotecas de péptidos, que tiene una interacción de unión selectiva con el antígeno.
En un aspecto, la invención proporciona anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a las variantes de hemoglobina HbS, HbC, HbE, y HbD. La secuencia de la cadena beta de hemoglobina es la siguiente:
VHLTPEEKSAVTALWGKVNVDEVGGEALGRLLWYPWTQRFFESFGDLSTPDAVMGNPKVKAHGKKVL
GAFSDGLAHLDNLKGTFATLSELHCDKLHVDPENFRLLGNVLVCVLAHHFGKEFTPPVQAAYQKWAG
VANALAHKYH
Las posiciones de restos de aminoácidos en la cadena beta de hemoglobina a la que se hace referencia en el presente documento es con referencia a esta secuencia de aminoácidos a menos de que se especifique otra cosa.
La HbA1c está glicada en la valina del extremo N. Las mutaciones puntuales de la cadena beta más prevalentes son HbS (Glu 6 ^ Val); HbC (Glu 6 ^ Lys); HbE (Glu 26 ^ Lys) y HbD (Glu 121 ^ Gln). Las posiciones Glu 6, Glu 26, y Glu 121 se indican subrayadas en la secuencia de la cadena beta.
La HbA2 y HbF pueden determinarse también en el ensayo divulgado en el presente documento. La hemoglobina A2 tiene dos cadenas alfa y dos cadenas beta; y la hemoglobina F tiene dos cadenas alfa y dos cadenas gamma.
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En el contexto de la presente invención, la expresión “se une específicamente” o “ inmunorreactivo específicamente (o selectivamente con”, o “tiene una afinidad selectiva por” se refiere a una reacción de unión en la que el anticuerpo se une al antígeno de interés. En el contexto de la presente invención, el anticuerpo se une al antígeno de interés, por ejemplo, HbS incluyendo la forma glicada de HbS, con una afinidad que es al menos 100 veces mejor que su afinidad por otros antígenos, por ejemplo, otras variantes de hemoglobina tal como HbA0 o HbC.
“Reactividad” como se utiliza en el presente documento se refiere a la señal de unión relativa a partir de las reacciones de un anticuerpo con el antígeno al que se une específicamente frente a otros antígenos, tal como otras variantes de hemoglobina y/o la HbA0 de tipo silvestre. La reactividad se evalúa utilizando tampones apropiados que permiten que se unan el antígeno y anticuerpo. La reactividad puede determinarse, por ejemplo, utilizando un ensayo ELISA directo o sándwich. Por ejemplo, se puede utilizar un ensayo en formato directo para determinar la reactividad con la hemoglobina de tipo silvestre y/o las variantes de hemoglobina cuando el antígeno se une directamente a la placa de ELISA, y los distintos anticuerpos se añaden para ver cuales se unen, seguido por la interrogación utilizando un anticuerpo anti-ratón marcado tal como el anticuerpo marcado con ficoeritrina. En el formato sándwich, el anticuerpo monoclonal está unido a la perla, seguido por la adición de antígeno, seguido por la interrogación con un anticuerpo de detección universal marcado con ficoeritrina, por ejemplo, un anticuerpo de detección universal marcado con ficoeritrina, que se une a todas las especies de hemoglobina. Por lo tanto, en un ejemplo que utiliza el formato sándwich, la reactividad se puede definir como la señal fluorescente relativa producida cuando el antígeno específico, por ejemplo, una variante de hemoglobina HbS, se une frente a otro antígeno, por ejemplo, una hemoglobina de tipo silvestre. Se considera que un anticuerpo es específico para un antígeno si presenta un aumento de dos veces, normalmente al menos de 3 o 4 veces, en su reactividad por el antígeno de referencia en comparación con otro antígeno que se ensaya.
“Epítopo” o “determinante antigénico” se refiere a un sitio en un antígeno en el que se une el anticuerpo. Los epítopos pueden formarse a partir de aminoácidos contiguos o aminoácidos no contiguos yuxtapuestos por el plegamiento terciario de una proteína. Los epítopos formados a partir de aminoácidos contiguos se mantienen normalmente con la exposición a disolventes desnaturalizantes mientras que los epítopos formados por plegamiento terciario se pierden normalmente con el tratamiento con disolventes desnaturalizantes. Un epítopo normalmente incluye al menos 3, y más habitualmente, al menos 5 u 8-10 aminoácidos en una única conformación espacial. Los procedimientos de mapeo de epítopos se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed (1996)). Un epítopo “mínimo” en la presente invención se determina normalmente midiendo la unión del anticuerpo a los péptidos solapados que cubren toda la secuencia de aminoácidos de la globina beta o alfa y la identificación de la secuencia de aminoácidos compartida por los péptidos unidos. Los aminoácidos importantes en el epítopo “mínimo” se identifican normalmente por exploración de alanina.
Como se entiende en la técnica, un epítopo “mínimo” puede incluir sustituciones, por ejemplo, en posiciones que no son importantes para la unión, por ejemplo, como se determina utilizando exploración de alanina. Dichas sustituciones incluyen sustituciones conservadoras en las que la alteración da como resultado la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustituciones conservadoras que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares se conocen bien en la técnica. A continuación, se dan ejemplos de entre los veinte aminoácidos comunes de origen natural de aminoácido que se pueden sustituir por otros: alanina y glicina; ácido aspártico y ácido glutámico; asparagina y glutamina; arginina y lisina; serina y treonina. Otras sustituciones conservadoras incluyen sustituciones de un aminoácido en el siguiente grupo con otro aminoácido en el grupo: isoleucina, leucina, metionina y valina. Fenilalanina, tirosina, y triptófano también son restos que se pueden sustituir entre ellos.
La tabla 1 proporciona ejemplos de inmunógenos utilizados para generar los anticuerpos monoclonales específicos contra la hemoglobina y variantes de hemoglobina.
Tabla 1
Ejemplos de inmunógenos peptídicos
Hemoglobina diana
Nombre del péptido secuencia
Hemoglobina y variantes
H1 H2N-VHLTPEEKSAVTALW-C-CONH2
H2 H2N-VHLTPEEASASTASW-C-CONH2
H2bis H2N-VHLTPEEKSASTASW-C-CONH2
HbS
H3 H2N-VHLTPVEKSAVTALW-C-CONH2
HbC
H4 H2N-VHLTPKEKSAVTALW-C-CONH2
H5 H2N-CYG-NVDEVGGKALGRLLV-CONH2
HbE
H5bis H2N-CYG-VTALWGKVNVDEVGGK-CONH2
H10
H2N-C-Hx-EVGGKALG-CONH2
H10bis H2N-EVGGKALG-Hx-C-CONH2
(continuación)
Ejemplos de inmunógenos peptídicos
Hemoglobina diana
Nombre del péptido secuencia
H6 H2N-CYG-VLAHHFGKQFTPPVQAA-CONH2
H6bis H2N-QFTPPVQAAYQKVVAGV-GYC-CONH2
HbD
H9 H2N-GKQFTGKQFTGKQFT-GYC-CONH2
H11 H2N-C-Hx-HFGKQFTP-CONH2
H11bis H2N-HFGKQFTP-Hx-C-CONH2
GP1 Glucosa-HN-VHLTPEE-Hx-C-CONH2
HbA1c
GP3 1-desoxifructopiranosil-HN-VHLTPEE-Hx-C-CONH2
H2 glicada Glucosa-HN-VHLTPEEASASTASW-C-CONH2
La tabla 2 proporciona ejemplos de regímenes de inmunización utilizados para generar anticuerpos monoclonales específicos contra la hemoglobina y las variantes de hemoglobina.
5

Claims (4)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un anticuerpo monoclonal que se une selectivamente a la variante de hemoglobina HbC y la HbC glicada, en el que el anticuerpo se une a un epítopo mínimo de HbC 4TPKEKSAVT12.
  2. 2. Un anticuerpo monoclonal que se une selectivamente a la variante de hemoglobina HbS y la HbS glicada, en el 5 que el anticuerpo se une a un epítopo mínimo de HbS 3LTPVEKSAVT12
  3. 3. Un anticuerpo monoclonal que se une selectivamente a la variante de hemoglobina HbE y la HbE glicada, en el que el anticuerpo se une a un epítopo mínimo de HbE 22EVGGK26 o 21DEVGGK26.
  4. 4. Un anticuerpo monoclonal que se une selectivamente a la variante de hemoglobina HbD y la HbD glicada, en el que el anticuerpo se une a un epítopo mínimo de HbD 121QFTPP125 o 119GKQFTPP125
    10
    Anticuerpo de detección universal marcado con PE
    imagen1
    FIG. 1
    FIG. 2
    ee
    Diferencia de la relación de %HbAic determinada por ensayos BioPlex 2200 y Variant II
    imagen2
    810Z-W-ZI
    s rose r9U3
    0,02 n
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