ES2663833T3 - Un método para preparar una superficie con una cobertura controlada de partículas de calibre nanométrico - Google Patents

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ES2663833T3 ES11757205.7T ES11757205T ES2663833T3 ES 2663833 T3 ES2663833 T3 ES 2663833T3 ES 11757205 T ES11757205 T ES 11757205T ES 2663833 T3 ES2663833 T3 ES 2663833T3
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Abstract

Un método para preparar un gradiente continuo de nanopartículas depositadas y cargadas eléctricamente (200) a lo largo de una superficie sólida (203), en el que el número de nanopartículas depositadas y cargadas eléctricamente (200) por unidad de superficie (203) es relativamente alto en una extremo de la superficie y relativamente bajo en el extremo opuesto de la superficie, y en el que la distancia entre las partículas depositadas, en el momento de depositarlas, se regula a través de la repulsión electrostática entre las nanopartículas en una solución (402), caracterizado por que el grado de repulsión electrostática de las partículas en la solución (402) se obtiene mediante una difusión de una solución salina (403) en la solución que comprende nanopartículas (402).

Description

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DESCRIPCIÓN
Un método para preparar una superficie con una cobertura controlada de partículas de calibre nanométrico Campo de la invención
La presente invención se refiere en general al campo de la química de superficies. Más particularmente, la invención se refiere a superficies con propiedades de escala nanométrica.
Antecedentes
El problema con las interacciones de superficies sólidas con tejido biológico vivo es un tema recurrente dentro de las áreas de tecnología médica, por ejemplo, biomateriales, biosensores y administración controlada de fármacos. Otras áreas de aplicación son la tecnología de procesamiento de alimentos y la química de métodos biotecnológicos, áreas en las que existen interacciones deseadas o no deseadas con sustancias producidas biológicamente. Por tanto, existe una necesidad constante de nuevos materiales con funciones y características mejoradas, y existe una necesidad creciente de modificaciones superficiales experimentales adecuadas para las áreas de aplicación específicas.
El campo de la nanotecnología ha progresado mucho durante las últimas décadas, principalmente debido a que los materiales nanoestructurados, con un tamaño de estructura de 1-1000 nm, tienen propiedades muy interesantes con respecto a la interacción optimizada con líquidos biológicos y tejido vivo. Un aspecto central de la presente solicitud de patente es un artículo publicado recientemente que describe un método de fabricación de superficies sólidas nanoestructuradas con nanoestructuras de alrededor de 10 nm [1]. El método incluye que superficies de oro planas se dejen reaccionar con alcanos lineales terminados en tiol (ditioles), que se unen a la superficie de oro con un grupo tiol, mientras que el otro extremo tiol constituirá una alfombra superpuesta de grupos tiol impolutos.
Una solución coloidal estable de partículas de oro cargadas negativamente en el intervalo de tamaño de 8-12 nm se puso en contacto con la superficie y las partículas de oro se adsorbieron a los grupos tiol impolutos mencionados anteriormente. Se observó que la distancia entre las partículas adsorbidas se podía controlar variando la fuerza iónica del tampón de citrato que se usó durante la adsorción. La distancia (centro a centro) se podría variar entre 10-100 nm cuando la molaridad (concentración) del tampón se variaba entre 10-0 nM según se juzgó a partir de los experimentos de visualización con microscopia electrónica de barrido (SEM). Resultados similares se han demostrado anteriormente en experimentos de adsorción de partículas con soluciones estabilizadas electrostáticamente de partículas de polímero cargadas en la superficie a superficies minerales tales como vidrio, dióxido de silicio o mica [2-5]. Además, también se han presentado resultados similares con respecto a la adsorción de nanopartículas de superficie de oro cargadas negativamente desde soluciones estabilizadas electrostáticas a superficies de vidrio o superficies de dióxido de silicio que están cargadas positivamente debido a modificaciones químicas [6].
El principio de la adsorción de partículas controlada electrostáticamente se muestra en la figura 2. Una solución 202 estabilizada electrostáticamente que contiene nanopartículas cargadas en la superficie 200 se aplica a un vaso de precipitados 201 (figura 2A). Se introduce una preparación de superficie 203 en el recipiente (figura 2B) que permite que las partículas 200 se unan a la superficie 203 por medio de enlaces electrostáticos, semicovalentes, covalentes u otros tipos de enlaces, lo que da lugar a que se obtenga una adsorción estable después de un determinado tiempo (figura 2C). Las partículas tienen una determinada distancia, r, entre sí.
Esta condición representa una condición terminal para la adsorción, y el tiempo de incubación prolongado no tiene ningún impacto adicional en la cobertura superficial de las partículas. Cuando la superficie se elimina de la solución de partículas, la distancia entre dos partículas adyacentes se puede estimar a partir del potencial de interacción por pares de acuerdo con la teoría DLVO [1,7], figura 3.
En resumen, el potencial del par U (r), en el que r es la distancia entre dos partículas, se puede calcular como la suma de un potencial de atracción Uatracción(r) que emana de las fuerzas dispersivas entre las partículas, así como un potencial de repulsión Urepulsión(r) que emana de la repulsión electrostática entre las partículas.
La forma del potencial de repulsión se puede calcular de diferentes maneras, pero siempre variará con la denominada distancia de Debye, que es una medida aproximada de la disminución del potencial fuera de la superficie de la partícula. Una corta distancia de Debye significa que el potencial de repulsión está disminuyendo rápidamente fuera de la superficie de la partícula. La distancia de Debye depende, a su vez, de la fuerza iónica en la solución de partículas 202, y se puede expresar como:
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en la que £ es la permitividad relativa, £0 es la permitividad I en el vacío, k es la constante de Boitzmann,7 es la temperatura, e es la carga elemental, W^es la constante de Avogadro y la fuerza iónica es:
n
imagen2
i= 1
en la quecyz, es la concentración molar y la carga de un ion/en la solución.
La distancia de Debye, y el intervalo del potencial de repulsión, por lo tanto, se reduce con el aumento de la concentración iónica en la solución coloidal 202. Esto significa que cada partícula se puede unir más cerca a otras partículas en la superficie cuando la condición
U(r) _ 1 kT ~ A
en la que U (r) es el potencial del par, kT es la energía térmica, y A es una constante, se cumple para r menor.
Las superficies preparadas con ditioles y nanopartículas de oro como se describe anteriormente y en [1, 8] se han usado en experimentos biológicos. En estos experimentos, los espacios entre las partículas se hicieron repelentes a las proteínas con un reactivo de maleimida conjugado que se une rápidamente de forma covalente a grupos ditiol. Las maleimidas se conjugaron con polietilenglicol (PEG) que dio como resultado que los espacios entre las partículas se volvieran repelentes a proteínas y células. La superficie de las partículas de oro absorbidas se podría modificar posteriormente con reactivos de tiol, por ejemplo, tiol con grupos metilo, lo que proporciona a las partículas de oro adsorbidas características hidrófobas. Las superficies con partículas de oro fabricadas de esta manera tienen una estructura química y una organización física muy controladas en el intervalo nanométrico, lo que hace que dichas superficies sean adecuadas para estudios de adhesión de diferentes tipos. El método descrito es muy flexible para los estudios de adhesión debido al número relativamente grande de sustancias comerciales con funciones maleimida que se pueden unir entre las partículas adsorbidas, así como de reactivos de tiol que se pueden unir a las partículas de oro adsorbidas.
Se han llevado a cabo experimentos similares en los que las nanopartículas de oro, estabilizadas por polímeros, se han aplicado a superficies de sílice y vidrio mediante la denominada tecnología de "recubrimiento por inmersión" [9]. Obsérvese que este método no utiliza repulsión electrostática entre las partículas para controlar su propagación por toda la superficie, sino que la distancia se define por las estructuras de polímero que rodean a las partículas en solución. La interacción entre estas partículas y la superficie adsorbida es débil, por lo que las partículas después de la adsorción se deben sinterizar en el sustrato, un método en el que también los polímeros circundantes desaparecen de la superficie. La superficie alrededor de las partículas de oro se convierte entonces en el sustrato de sílice subyacente que se puede modificar con silanos funcionales, por ejemplo, silanos modificados con PEG, lo que hace que esta superficie sea resistente a la bioadhesión. Las superficies de las partículas se pueden modificar con reactivos de tiol, por ejemplo, tiol conjugado con los denominados péptidos RGD, una secuencia de aminoácidos que media las interacciones celulares.
En este experimento, también se ha descrito que las partículas de polímero en una solución estabilizada electrostática se adsorben a superficies minerales cargadas y que la distancia entre las partículas adsorbidas se ha controlado con repulsión electrostática de acuerdo con la descripción anterior [10]. Las superficies adsorbidas tienen una carga neta original o se han cargado mediante modificación química, por ejemplo, con silanos funcionales. La unión entre la superficie y las partículas principalmente ha sido de naturaleza electrostática. Las superficies con las partículas de polímero adsorbidas se han usado como una plantilla litográfica con la que partes de la superficie cubiertas de partículas de polímero se han transformado en islotes de oro en el intervalo de tamaño de 10-1000 nm rodeados por el material de la superficie del sustrato. La superficie del sustrato circundante se modificó a continuación, por ejemplo, con poli-L-lisina-PEG. La lisina es un polímero cargado positivamente, que se adsorbe por superficies cargadas negativamente, y cuando se conjuga con PEG, en determinados casos hace que estas superficies sean resistentes a la bioadhesión. Las superficies de oro se pueden modificar con reactivos de tiol, por ejemplo, alcanotioles lineales, lo que hace que las superficies de oro sean hidrófobas. A estas superficies hidrófobas se pueden adsorber proteínas, por ejemplo, la proteína laminina. Dichas superficies se han usado para estudiar la proliferación celular y la interacción superficial.
Todas las tecnologías descritas anteriormente se pueden usar para estudiar la importancia de una nanoestructura de superficie para el método de adhesión, y se pueden usar como una plataforma para el diseño de materiales con características biológicas deseadas.
La mayoría de los estudios de adhesión se llevan a cabo en superficies con una configuración química constante. Al estudiar la importancia de un tipo de modificación de la superficie, es una práctica común usar varias
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preparaciones de superficie para analizar los fenómenos de adhesión de forma independiente. Este procedimiento, sin embargo, consume tiempo y trabajo ya que se deben preparar varias preparaciones de superficie para cada serie de experimentos. Además, los errores metodológicos de las mediciones pueden ser relativamente grandes, lo que significa que la interpretación del estudio previsto de los fenómenos de adhesión puede ser incorrecta o pasarse por alto.
Un método para limitar el error metodológico y reducir el tiempo dedicado a preparar superficies es crear gradientes en las características químicas de una superficie. Un ejemplo de dicho método es el denominado "gradiente de humectabilidad", una superficie que es hidrófoba en un extremo e hidrófila en el otro [11]. Entre estos puntos finales se encuentra el gradiente controlado y continuo de características químicas. Este tipo de gradiente de superficie reduce significativamente el tiempo de preparación, así como el error metodológico, y se usa a menudo en investigación académica [12-14].
Se conocen varios métodos para preparar gradientes químicos continuos en una superficie, uno de ellos el método de difusión bien conocido, figura 1. En este caso, el método de acción es tal que se mezcla un reactivo 001, por ejemplo, metilclorosilano, en un disolvente con alta densidad 002, por ejemplo, (tri-)acetato de tricloroetileno. La mezcla entonces se estratifica en un disolvente diferente 003, por ejemplo, xileno con baja densidad. Entre estas capas hay una superficie 004, por ejemplo, vidrio sobre el que se formará un gradiente. Con el tiempo, los disolventes comienzan a difundir entre sí, en los que también el conjunto de reactivos 001 difunde y se une a la superficie 004. En un momento específico de difusión, se ha producido un gradiente de grupos metilo hidrófobos sobre la superficie de vidrio hidrófilo [11]. La cantidad de reactivo que se une a la superficie en una determinada posición y, por lo tanto, la hidrofobicidad en esta posición está determinada por la concentración del conjunto de reactivos 001 en la superficie en esta posición en combinación con el tiempo durante el que la superficie se ha expuesto a la solución de reactivo. Esto significa que las características del gradiente obtenido se determinan a través del control cinético.
Fabricar un gradiente uniforme de densidad de partículas con el método descrito anteriormente debería ser difícil, ya que la unión de nanopartículas desde una solución estabilizada electrostática a una superficie que se une a estas partículas suele ser un método muy rápido en relación con la velocidad de difusión de las partículas. Esta es baja en comparación con la velocidad de difusión para moléculas pequeñas, tales como metilclorosilano. Los intentos realizados para controlar la distancia entre las nanopartículas en las superficies, en las que las nanopartículas se han adsorbido a las superficies de unión desde soluciones estabilizadas electrostáticas, variando la concentración de las partículas y el tiempo de incubación, han mostrado las dificultades para controlar los gradientes de baja densidad de partículas. Además, las partículas no muestran la misma conformidad de organización en la superficie que después de la adsorción controlada electrostática como se describe anteriormente [6, 15].
Recientemente, se divulgó un gradiente de partículas de oro sobre un sustrato de sílice, en el que la estructuración de las partículas unidas era buena [16]. Este gradiente, descrito en [16], se fabricó de acuerdo con un método modificado de "recubrimiento por inmersión", pero sin usar control electrostático o gradientes de difusión. El gradiente obtenido tenía dinámica limitada y la distancia de partículas más pequeña era de aproximadamente 50 nm. Los gradientes se modificaron químicamente con PEG entre las partículas y los péptidos RGD en la parte superior de las partículas. Las superficies en gradiente se usaron posteriormente en experimentos para investigar la adhesión celular. En general, esta publicación divulga que el interés por obtener gradientes de densidad de partículas de oro unidas en la superficie es grande, por las razones mencionadas anteriormente. La solución técnica para producir gradientes de acuerdo con [16] es, sin embargo, significativamente más compleja que la presente invención.
Además, el documento US 2003/170480 divulga un gradiente dispuesto sobre una superficie adaptada para transportar un líquido o un fluido no líquido. El gradiente comprende: (a) una superficie; y (b) una monocapa autoensamblada (SAM) dispuesta en la superficie, comprendiendo la SAM un material de distribución, estando dispuesto el material de distribución sobre la superficie para definir: (i) una primera región que define un área de alta fuerza impulsora con respecto a una interacción con un material a transportar; (ii) una segunda región que define un área de baja fuerza impulsora con respecto a una interacción con un material a transportar; y (iii) una tercera región que define una región de fuerza impulsora difusa con respecto a una interacción con un material a transportar, siendo la tercera región contigua a la primera y segunda regiones. El documento US 2009/098366 divulga un método de formación de un recubrimiento de nanopartículas adsorbidas en la superficie del sustrato. El método comprende las etapas de: poner en contacto una superficie de un sustrato con una solución acuosa que comprende primeras nanopartículas que tienen restos cargados positivamente en una superficie de la misma y segundas nanopartículas que tienen restos cargados negativamente en una superficie de la misma; y adsorber las primeras y segundas nanopartículas en la superficie para formar un recubrimiento de nanopartículas adsorbidas en la superficie del sustrato.
Sumario
En consecuencia, la presente invención busca preferentemente mitigar, aliviar o eliminar una o más de las
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deficiencias identificadas anteriormente en la técnica y de las desventajas individualmente o en cualquier combinación y resuelve al menos los problemas mencionados anteriormente proporcionando un método, una superficie, un producto y un uso de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas.
De acuerdo con un primer aspecto, se proporciona un método para preparar un gradiente continuo de nanopartículas depositadas y cargadas eléctricamente a lo largo de una superficie sólida, en el que el número de nanopartículas depositadas y cargadas eléctricamente por unidad de superficie es relativamente alto en un extremo de la superficie y relativamente bajo en el extremo opuesto de la superficie. La distancia entre las partículas depositadas, en el momento de depositarlas, se regula a través de la repulsión electrostática entre las nanopartículas en una solución. El grado de repulsión electrostática de las partículas en la solución se obtiene mediante difusión de una solución salina en la solución que comprende nanopartículas.
Esto es ventajoso, porque permite formar un gradiente mejorado de nanopartículas en una superficie.
La difusión de la solución salina se puede obtener formando una capa de una solución salina con densidad y concentración relativamente altas bajo una capa de solución sustancialmente sin sal que comprende nanopartículas, y ese gradiente continuo se puede regular mediante el tiempo de difusión y la concentración de sal en la solución salina.
En un modo de realización, la difusión de la solución salina se puede obtener manteniendo la solución salina en un depósito, puesta en contacto con la suspensión de nanopartículas que comprende además una matriz que permite la difusión de nanopartículas, pero que impide las corrientes de convección, por ejemplo, polisacáridos en una forma de partícula que contiene agua, y dicha suspensión de nanopartículas está en contacto con la superficie sólida.
Esto es ventajoso, ya que permite formar gradientes en dos dimensiones.
Las nanopartículas pueden consistir en metal, cerámica, tal como vidrio o material polimérico.
La superficie sólida puede consistir en metal, cerámica, tal como vidrio o material polimérico.
Las fuerzas de unión entre las nanopartículas y la superficie pueden comprender enlaces covalentes, interacciones culómbicas, enlaces metálicos, enlaces de Van der Waals, enlaces de hidrógeno, enlaces dipolo- dipolo o enlaces ion-dipolo.
En un modo de realización, la superficie es de oro, con reactivo de ditiol unido y las nanopartículas se unen covalentemente a grupos tiol de las moléculas de ditiol unidas a la superficie de oro.
En un modo de realización, las partículas cargadas negativamente, pero que no se unen a la superficie, se mezclan con nanopartículas que se unen a la superficie.
Esto es ventajoso, ya que puede mejorar la dispersión y evitar la formación de agrupaciones de las nanopartículas que se unen a la superficie.
El método puede comprender además añadir una primera superficie separada y una segunda superficie separada a la superficie, en la que la primera superficie separada tiene una química superficial similar a la nanopartícula y la segunda superficie separada tiene una química superficial similar a la superficie.
En un modo de realización, las marcas de escala se añaden a la superficie.
Una ventaja de esto es que puede simplificar el análisis microscópico del análisis de adhesión.
De acuerdo con un segundo aspecto, se proporciona una superficie, con un gradiente continuo de nanopartículas depositadas y cargadas eléctricamente. Las nanopartículas tienen un diámetro promedio entre 10 y 60 nm y la distancia promedio de las nanopartículas es de aproximadamente 10-60 nm en un extremo del gradiente y de aproximadamente 100-150 nm en el otro extremo del gradiente.
La longitud del gradiente puede estar entre 1 mm y 50 mm.
En un modo de realización, el gradiente es lineal.
Las nanopartículas y/o la superficie pueden consistir en metal, cerámica, tal como vidrio o material polimérico.
Las nanopartículas y/o la superficie pueden tener un compuesto conjugado con las mismas. El compuesto se puede seleccionar del grupo que consiste en grupos tiol, tales como tiol terminado en metilo, terminado en amino, terminado en ácido, terminado en péptido, conjugado con sacárido o conjugado con PEG, o tiolsilano;
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De acuerdo con un tercer aspecto, se proporciona un chip para su uso en el análisis de fenómenos de adhesión, comprendiendo el chip una superficie en gradiente de acuerdo con el segundo aspecto, una primera superficie separada y una segunda superficie separada, en la que las superficies están separadas por barreras.
Las nanopartículas y la primera superficie separada tienen el mismo tipo de compuesto conjugado con las mismas. El compuesto se selecciona del grupo que consiste en grupos tiol, tales como tiol terminado en metilo, terminado en amino, terminado en ácido, terminado en péptido, conjugado con sacárido o conjugado con PEG, o tiolsilano; PEG, tal como poli-L-lisina-PEG, silanos modificados con PEG, maleimida-PEG; y aminosilano.
La superficie en gradiente y la segunda superficie separada tienen el mismo tipo de compuesto conjugado con las mismas. El compuesto se selecciona del grupo que consiste en grupos tiol, tales como tiol terminado en metilo, terminado en amino, terminado en ácido, terminado en péptido, conjugado con sacárido o conjugado con PEG, o tiolsilano; PEG, tal como poli-L-lisina-PEG, silanos modificados con PEG, maleimida-PEG; y aminosilano.
De acuerdo con un cuarto aspecto, se proporciona el uso de la superficie de acuerdo con el segundo aspecto, o el dispositivo de acuerdo con el tercer aspecto, para análisis de adhesión. El análisis se basa en resonancia de plasmones superficiales (SPR), electroquímica, microscopia óptica o microscopia electrónica de barrido (SEM).
La presente invención proporciona la ventaja sobre la técnica anterior de que permite formar un gradiente mejorado de nanopartículas en una superficie.
Breve descripción de los dibujos
Estos y otros aspectos, características y ventajas de las que tiene capacidad la invención serán evidentes y se dilucidarán a partir de la siguiente descripción de modos de realización de la presente invención, haciéndose referencia a los dibujos que se acompañan, en los que:
las figuras 1 y 2 son ilustraciones de métodos de la técnica anterior;
la figura 3 es una ilustración de la física de la teoría DLVO;
la figura 4 es una ilustración del método de acuerdo con un modo de realización;
la figura 5 es una ilustración del método de acuerdo con otro modo de realización;
las figuras 6 a 10 son ilustraciones de modos de realización;
la figura 11 es una vista general de las superficies de acuerdo con modos de realización de la invención, analizadas con SEM;
la figura 12 muestra resultados de dos gradientes, analizados con SPR;
la figura 13 es una exploración de líneas de un gradiente de acuerdo con un modo de realización, junto con una exploración de líneas para una superficie de control positivo; y
las figuras 14 a 16 son resultados de análisis de acuerdo con modos de realización de la invención.
Descripción de modos de realización
Varios modos de realización de la presente invención se describirán con más detalle a continuación con referencia a los dibujos adjuntos para que los expertos en la técnica puedan llevar a cabo la invención. Sin embargo, la invención se puede realizar en muchas formas diferentes y no se debe interpretar como limitada a los modos de realización expuestos en el presente documento. En su lugar, estos modos de realización se proporcionan de modo que la presente divulgación sea exhaustiva y completa, y transmita completamente el alcance de la invención a los expertos en la técnica. Los modos de realización no limitan la invención, sino que la invención está limitada únicamente por las reivindicaciones de patente adjuntas. Además, la terminología usada en la descripción detallada de los modos de realización particulares ilustrados en los dibujos adjuntos no pretende ser limitante de la invención.
De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona un método para la fabricación conveniente de superficies con nanopartículas adsorbidas con un gradiente. En un modo de realización, el método se puede describir de la siguiente manera.
1. Difusión unidimensional
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En un modo de realización de acuerdo con la figura 4, se coloca en un vial 401 una superficie plana 203 con la capacidad de unirse a nanopartículas cargadas en la superficie electrostática 200 de una solución de partículas estabilizada electrostáticamente. A continuación, se añade al vial una solución sin sal o prácticamente sin sal
402, con partículas cargadas en la superficie 200. Una solución salina 403 con una densidad relativamente alta se estratifica cuidadosamente en la solución sin sal 402 de una manera tal que el nivel de la fase dependiente de la gravedad entre las soluciones 403 y 402 se nivela con la parte inferior de la superficie 203. Con el tiempo, la solución salina 403 se difundirá en la solución sin sal 402 y formará un gradiente de fuerza iónica en la misma.
Como apreciará un experto en la técnica, la superficie no tiene que ser plana, sino que puede tener cualquier tipo de curvatura o forma.
La repulsión electrostática dependiente entre las partículas se reduce cuando aumenta la fuerza iónica en el tampón cerca de la superficie 203. Por lo tanto, las partículas se adsorben gradualmente más cerca entre sí en la superficie con la densidad más alta de partículas más cercana al nivel de fase original entre las soluciones 402 y
403. La densidad más baja de partículas se encuentra en la capa superior del vial, en la que la fuerza iónica es baja y, por lo tanto, la repulsión electrostática es la más alta. Después de un tiempo de difusión controlado, la solución se vacía del vial, desde abajo a través del mismo tubo 404 que se usó cuando se estratificó la solución salina 403 en la solución sin sal 402 que contiene partículas.
En ausencia de convección y cuando la distancia desde el nivel inferior de la superficie, x = 0 mm, hasta el fondo del vial es suficiente, y cuando la distancia desde el nivel inferior de la superficie, x = 0 mm, hasta la superficie de la solución sin sal 402 es suficiente, y cuando la difusión no puede continuar durante demasiado tiempo, la distribución gradual de la concentración de sal en la solución por encima de la superficie 203 se puede describir con la segunda ley de difusión de Fick en una dimensión:
de d2 ~di = D~d^C
en la que, para las condiciones mencionadas anteriormente:
1 x
en la que c es la concentración molar de la sal, x es la posición en el vial en la relación x = 0 (que coincide con el nivel inferior de la superficie 203), t es el tiempo de difusión, co es la concentración de sal en la solución 403 en t = 0 y D es la constante de difusión para la sal en cuestión.
Esto significa que la longitud y la pendiente del gradiente de partículas adquirido se pueden variar cambiando la concentración inicial de sal co y el tiempo de difusión t, lo que da al método de fabricación una gran flexibilidad.
El desarrollo adicional de la invención descrita en la figura 5 usa viales 501 que permiten el uso de varias superficies con el mismo procedimiento de difusión que se describe en la figura 4. Una ventaja de este método es que todas las superficies del vial estarán expuestas a la misma solución de partículas de oro, molaridad de la solución salina y tiempo de difusión. Esto asegura que las superficies se pueden preparar con una alta tasa de conformidad en la misma preparación.
El método de difusión descrito en relación con la figura 1 y publicaciones anteriores [11] tiene similitudes técnicas con la invención descrita, pero difiere en varios aspectos cruciales. Las diferencias más importantes son: el componente, las nanopartículas, que se unirán a la superficie, está presente como una concentración constante y no difunde como un gradiente; la sal que difunde no se une a la superficie; el factor de creación del gradiente (repulsión electrostática del gradiente entre nanopartículas) tiene lugar en la solución en las nanopartículas y no en la superficie.
2. Difusión bidimensional
Con el método unidimensional de difusión, las superficies en gradiente se adquieren en una dimensión, por ejemplo, alta densidad de partículas unidas en un extremo del gradiente y una menor densidad en el extremo opuesto. En un modo de realización de acuerdo con la figura 6, se describe la fabricación de gradientes circulares de partículas sobre una superficie. La figura 6A es una vista lateral y la figura 6B es una vista superior.
En la parte inferior de una placa de Petri 601, se coloca una superficie plana 203. Una suspensión sin sal, o prácticamente sin sal 602 que comprende nanopartículas y una matriz que permite la difusión de nanopartículas, pero que al mismo tiempo previene las corrientes de convección, se vierte en la placa de Petri. Dicha suspensión puede consistir en polisacáridos en una forma de partícula que contiene agua, por ejemplo, partículas de gel
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usadas para la filtración en gel, por ejemplo, Sephadex g-25 o material similar. Después de eliminar un disolvente libre, por ejemplo, agua, de la capa de suspensión plana, se coloca un depósito 603, tal como una pieza redonda de papel secante, sobre la suspensión. El depósito 603 se llena previamente con la solución salina 403 con alta molaridad, por ejemplo, empapando un papel secante en dicha solución. A este sistema entonces se le da tiempo para la difusión. La solución 403 difundirá en la suspensión 602 y el frente de difusión circular alcanzará después de un tiempo la superficie 203, que inevitablemente dará como resultado una superficie circular con un gradiente de concentración radial de iones. Finalmente, la suspensión 602 se elimina por lavado con un disolvente, por ejemplo, agua. El resultado final es una superficie circular de partículas adsorbidas cuya densidad es la más alta en el centro de la superficie y la más baja hacia la periferia.
Un aspecto importante de la invención descrita es la dinámica analítica, que es el intervalo entre la parte del gradiente de superficie con el mayor número de partículas adsorbidas por unidad de superficie y la parte de la misma superficie de gradiente con el menor número de partículas adsorbidas por unidad de superficie. Cuanto mayor es este intervalo, más información analítica se obtiene en los experimentos de adhesión y adsorción. Una fuente metodológica de error puede ser que partículas eléctricas en baja concentración en un disolvente sin sal, tal como agua, tienen una tendencia a unirse irregularmente a las superficies en patrones impredecibles. Dichos patrones irregulares dificultan la interpretación de los experimentos adicionales de adhesión y adsorción. En un modo de realización de acuerdo con la figura 6C, se proporciona un método para evitar la formación de patrones irregulares. El método comprende mezclar partículas de unión a la superficie cargadas eléctricamente 200 con las partículas cargadas eléctricamente 604 que no se unen a la superficie 203. La función de estas últimas partículas es mejorar la dispersión de las partículas cargadas y de unión en la solución para que el patrón de unión no se vuelva irregular.
Experimentos típicos y métodos de evaluación
Un área de gradiente con partículas unidas normalmente es de 1-50 mm, tal como 1-10 mm. En esta superficie, se pueden llevar a cabo experimentos de adsorción con biopolímeros y experimentos de adhesión con células. El resultado de los experimentos se puede correlacionar después con un gradiente continuo de nanopartículas unidas por unidad de superficie. En experimentos de adsorción de biopolímeros simples es posible usar métodos ópticos sensibles a superficies. En los experimentos que involucran células completas se puede microscopia óptica para estudios detallados de las células, así como microscopia de fluorescencia para estudios de detalles finos.
En una aplicación de la invención, la figura 7, el gradiente de partículas se aplica a una superficie 700 a la que se ha añadido una escala para facilitar el análisis a través de un microscopio. Las marcas de escala pueden ser verticales 702, horizontales 703 o radiales 704. Las escalas y las marcas de escala pueden estar en diferentes intervalos para acomodar diferentes tipos de análisis, por ejemplo, intervalo de mm para análisis ocular o intervalo de 10-500 micrómetros para el análisis por microscopia óptica o SEM que se describe en la figura 7B, 705. Las marcas de escala pueden consistir en grabados, total o parcialmente a través de la superficie de unión a las partículas, por ejemplo, una superficie de oro modificada con ditiol, de modo que el sustrato subyacente, por ejemplo, vidrio o sílice, quede expuesto. De forma alternativa, las marcas de escala pueden ser crestas, por ejemplo, en oro, sobre una superficie de unión a partículas, por ejemplo, una superficie de vidrio o sílice modificada con tiolsilano. El patrón de superficie se genera preferentemente con técnicas de fotolitografía.
En otra aplicación de la invención, la figura 8, una superficie en gradiente de nanopartículas 203 o 700 está presente en una superficie de chip 800, por ejemplo, un portaobjetos de vidrio, junto con dos superficies adicionales separadas 801 y 802. La figura 8A es una vista superior y las figuras 8B y 8C son vistas laterales de acuerdo con dos modos de realización. Las dos superficies adicionales separadas se modifican químicamente de tal manera que una de las superficies 802 recibe la misma química de superficie que la superficie con las nanopartículas, mientras que a la otra superficie 801 recibe la misma química que la superficie que rodea las partículas en el gradiente. Cuando las tres superficies están presentes en un experimento biológico, por ejemplo, adsorción bacteriana, el operario puede examinar a través de un microscopio si la bacteria se adsorbe en un área de la superficie en gradiente. El operario también obtiene información respecto a la manera en que las bacterias se adsorben a las superficies que no contienen nanopartículas, sino únicamente químicas de superficie no mezcladas. De esta forma, el operario puede determinar si la adhesión de las bacterias está relacionada con la presencia de nanopartículas o no, y la densidad de partículas que es necesaria para la adsorción. Las diferentes superficies 203/700, 801 y 802 se pueden separar en el chip 800 con la ayuda de las barreras 803 para facilitar el uso y la fabricación de la superficie. Las barreras pueden estar hechas de grabados o espacios entre las superficies 203/700, 801 y 802 en el chip 800 de tal manera que el sustrato subyacente 804 esté expuesto. De forma alternativa, las barreras pueden consistir en crestas entre las superficies 203/700, 801 y 802, específicamente en aquellos casos en los que el gradiente de partículas se ha aplicado sobre el sustrato subyacente 804.
Una aplicación de la invención es un producto, por ejemplo, un chip, que comprende una superficie, por ejemplo, un portaobjetos de vidrio con las tres superficies mencionadas anteriormente; 1, superficie en gradiente de nanopartículas de oro en la que el gradiente de nanopartículas de oro se fabrica en una superficie de oro
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modificada con ditiol en la que los ditioles libres entre las partículas han reaccionado con maleimida-PEG y la superficie de las partículas ha reaccionado con un tiol funcional, por ejemplo, terminado en metilo, terminado en amino, terminado en ácido o terminado en péptido; 2, una superficie de oro que se ha modificado con ditiol y maleimida-PEG; 3, una superficie de oro que se ha modificado con el mismo tiol funcional que la superficie de las partículas.
Una aplicación de la invención es un producto que comprende una superficie, por ejemplo, un portaobjetos de vidrio con las tres superficies mencionadas anteriormente; 1, superficie en gradiente de nanopartículas de oro en la que el gradiente de nanopartículas de oro se fabrica en una superficie de oro modificada con ditiol en la que los ditioles libres entre las partículas han reaccionado con una molécula conjugada con maleimida, por ejemplo, terminada en metilo, terminada en amino, terminada en ácido o terminada en péptido, partículas fosforiladas, que contienen compuestos heterocíclicos, aromáticas, carbonilos, azúcares, compuestos inorgánicos, metales y la superficie de las partículas ha reaccionado con un tiol conjugado con PEG; 2, una superficie de oro que se ha modificado con ditiol y moléculas conjugadas con maleimida, por ejemplo, terminadas en metilo, terminadas en amino, terminadas en ácido o terminadas en péptido; 3, una superficie de oro que se ha modificado con el mismo tiol funcional que la superficie de las partículas.
Una aplicación de la invención es un producto que comprende una superficie, por ejemplo, un portaobjetos de vidrio con las tres superficies mencionadas anteriormente; 1, superficie en gradiente de nanopartículas de oro en la que el gradiente de nanopartículas de oro se fabrica en una superficie de oro modificada con ditiol en la que los ditioles libres entre las partículas han reaccionado con maleimida-PEG; 2, una superficie de oro que se ha modificado con ditiol y maleimida-PEG; 3, una superficie de oro puro. Con este producto, el operario puede elegir el reactivo de tiol que se debe usar. Existe una gran cantidad de tioles disponibles comercialmente que pueden afectar a la adhesión, por ejemplo, tioles conjugados con grupos amino, mono- y polisacáridos.
Una aplicación de la invención es un producto que comprende una superficie, por ejemplo, un portaobjetos de vidrio con las tres superficies mencionadas anteriormente; 1, superficie en gradiente de nanopartículas de oro en la que el gradiente de nanopartículas de oro se fabrica en una superficie de oro modificada con ditiol; 2, una superficie de oro que se ha modificado con ditiol; 3, una superficie de oro puro. Con este producto, el operario puede elegir el reactivo de maleimida que se unirá entre las partículas y el reactivo de tiol que se unirá sobre las partículas. Las posibilidades de alterar un experimento, por lo tanto, aumentarán aún más.
Una aplicación de la invención es un producto que comprende una superficie, por ejemplo, un portaobjetos de vidrio con las tres superficies mencionadas anteriormente; 1, superficie en gradiente de nanopartículas de oro en la que el gradiente de nanopartículas de oro se fabrica en una superficie de vidrio o sílice modificada con tiolsilano, en la que los tiolsilanos libres entre las partículas han reaccionado con maleimida-PEG y en la que la superficie de las partículas ha reaccionado con el tiol funcional, por ejemplo, terminado en metilo, terminado en amino, terminado en ácido o terminado en péptido; 2, una superficie de vidrio o sílice que se ha modificado con tiolsilano y maleimida-PEG; 3, una superficie de oro que se ha modificado con el mismo tiol funcional que la superficie de las partículas.
Una aplicación de la invención es un producto que comprende una superficie, por ejemplo, un portaobjetos de vidrio con las tres superficies mencionadas anteriormente; 1, superficie en gradiente de nanopartículas de oro en la que el gradiente de nanopartículas de oro se fabrica sobre una superficie de vidrio o sílice modificada con tiolsilano, en la que los tiolsilanos libres entre las partículas han reaccionado con maleimida-PEG; 2, superficie de vidrio o sílice que se ha modificado con tiolsilano y maleimida-PEG; 3, una superficie de oro sin modificar. Con este producto, el operario puede elegir el reactivo de tiol que se usará.
Una aplicación de la invención es un producto que comprende una superficie, por ejemplo, un portaobjetos de vidrio con las tres superficies mencionadas anteriormente; 1, superficie en gradiente de nanopartículas de oro en la que el gradiente de nanopartículas de oro se fabrica en una superficie de vidrio o sílice modificada con tiol- o aminosilano, en la que los silanos debajo y entre las partículas se han eliminado de tal manera, por ejemplo, mediante un tratamiento con plasma, que las partículas se sinterizan en la superficie de vidrio o sílice en la que las superficies entre las partículas han reaccionado con PEG-silano y la superficie de las partículas ha reaccionado con un tiol funcional, por ejemplo, terminado en metilo, terminado en amino, terminado en ácido o terminado en péptido; 2, una superficie de vidrio o sílice que se ha modificado con PEG-silano; 3, una superficie de oro que se ha modificado con el mismo tiol funcional que la superficie de las partículas.
Una aplicación de la invención es un producto que comprende una superficie, por ejemplo, un portaobjetos de vidrio con las tres superficies mencionadas anteriormente; 1, superficie en gradiente de nanopartículas de oro en la que el gradiente de nanopartículas de oro se fabrica en una superficie de vidrio o sílice modificada con tiol- o aminosilano y la superficie de las partículas ha reaccionado con un tiol funcional, por ejemplo, terminado en PEG, terminado en metilo, terminado en amino, terminado en ácido o terminado en péptido; 2, una superficie de vidrio o sílice que se ha modificado con tiol- o aminosilano; 3, una superficie de oro que se ha modificado con el mismo tiol funcional que la superficie de las partículas.
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Una aplicación de la invención es un producto que comprende una superficie, por ejemplo, un portaobjetos de vidrio con las tres superficies mencionadas anteriormente; 1, superficie en gradiente de nanopartículas de oro en la que el gradiente de nanopartículas de oro se fabrica en una superficie de vidrio o sílice modificada con tiol- o aminosilano, en la que los silanos debajo y entre las partículas se han eliminado de tal manera, por ejemplo, mediante un tratamiento con plasma, que las partículas se sinterizan en la superficie de vidrio o sílice en la que las superficies entre las partículas han reaccionado con PEG-silano; 2, una superficie de vidrio o sílice que se ha modificado con PEG-silano; 3, una superficie de oro sin modificar. Con este producto, un operario puede elegir el reactivo de tiol que se usará.
Una aplicación de la invención es un producto que comprende una superficie, por ejemplo, un portaobjetos de vidrio con las tres superficies mencionadas anteriormente; 1, superficie en gradiente de nanopartículas de oro en la que el gradiente de nanopartículas de oro se fabrica en una superficie de vidrio o sílice modificada con tiol- o aminosilano, en la que los silanos debajo y entre las partículas se han eliminado de tal manera, por ejemplo, mediante un tratamiento con plasma, que las partículas se sinterizan en la superficie de vidrio o sílice; 2, una superficie de vidrio o sílice; 3, una superficie de oro sin modificar. Con este producto, el operario puede elegir la química de superficie y el método de modificación para las diferentes superficies.
Para las aplicaciones mencionadas anteriormente, las tres superficies típicas pueden generarse por separado y luego combinarse en los portaobjetos de vidrio con un adhesivo. También es posible preparar estas superficies directamente sobre un portaobjetos de vidrio.
Para experimentos de adsorción de biopolímeros simples, se pueden usar métodos ópticos sensibles a superficies tales como elipsometría y resonancia de plasmones superficiales (SPR). Un caso especial de SPR es el denominado método de SPR de imágenes (iSPR) que permite la cuantificación simultánea de las nanopartículas adsorbentes y también la siguiente bioadhesión en un área de gradiente completo (véase el ejemplo). En la figura 9A se ilustra una configuración para el análisis por iSPR de una superficie en gradiente. Un aparato 900 para SPR de imágenes tal como se describe en [17], normalmente controlado con un ordenador 905, se aplica en contacto con un sustrato de SPR que comprende habitualmente una superficie de vidrio 901 sobre la que se ha aplicado una fina capa de oro 902. Por encima de la capa de oro, se coloca una cámara 904 que contiene una solución, por ejemplo, un tampón, de tal manera que la capa de oro está en contacto con la solución. La cámara 904 puede tener una entrada 907 y una salida 908 y funcionar como un sistema de perfusión para transportar la solución y los analitos hacia y desde la superficie.
En una aplicación de la invención, la superficie de oro 902 se ha modificado químicamente con la capa 903 para unir nanopartículas de la solución, y se ha aplicado un gradiente de nanopartículas a la superficie. En el análisis, la respuesta de SPR desde diferentes posiciones en la superficie en gradiente se puede correlacionar con la densidad parcial en esta posición. En el caso de que tenga lugar bioadhesión, por ejemplo, adsorción de proteínas, trombocitos o bacterias a la superficie en gradiente, esto también se puede detectar como una respuesta aditiva, figura 9B.
Últimamente, las tecnologías electroquímicas, particularmente mediciones de la impedancia, se han usado para estudiar las interacciones de células con superficies [18]. Las tecnologías electroquímicas también se pueden usar para estimar el número de nanopartículas en una superficie de electrodo. Esto es específicamente cierto para dirigir nanopartículas, por ejemplo, oro [19]. En una aplicación de la invención descrita en la figura 10, se aplica un gradiente de nanopartículas sobre una superficie 1000 que está compuesta por n superficies de unión a partículas 1001 de un material eléctricamente conductor que se ha modificado con la química 1003 para unir nanopartículas. Las superficies 1001 se colocan sobre un sustrato no conductor 1002 de tal manera que las superficies 1001 pueden actuar como electrodos aislados eléctricamente entre sí. El gradiente de nanopartículas se fabrica de tal manera que la superficie del electrodo de unión a partículas 1 en la superficie 1000 obtiene una densidad de partículas alta mientras que la superficie del electrodo de unión a partículas n en la superficie 1000 obtiene una densidad de partículas baja. Esto es posible usando la superficie 1000, tal como la superficie 203 de la figura 4 y permitiendo que la posición 0 en la superficie 1000 coincida con x = 0 en la figura 4.
La superficie 1000 se aplica en contacto con un electrolito, por ejemplo, un tampón, en una pila electroquímica 1004 que también puede tener una entrada 1005 y una salida 1006 para facilitar el transporte de electrolito y analito a la superficie 1000. Además de los electrodos 1-n ubicados en la superficie 1000, es necesario, para algunas aplicaciones, añadir un electrodo de referencia adicional 1007 y un contraelectrodo 1008 aplicado en el electrolito. En algunas aplicaciones, los electrodos 1007 y/o 1008 también se pueden colocar en la superficie 1000. Todos los electrodos 1-n en la superficie 1000 y en algunos casos 1007 y 1008, están conectados individualmente por un sistema para referencia electroquímica 1009. El sistema 1009 puede ser un sistema con capacidad para diferentes tipos de referencia electroquímica, por ejemplo, voltamperimetría, amperimetría, culombimetría, espectroscopia de impedancia o determinación de impedancia. De forma alternativa, el sistema 1009 podría ser un sistema diseñado para un único tipo de medidas electroquímicas tales como mediciones de impedancia. La respuesta electroquímica de los diferentes electrodos en la superficie 1000 se puede medir entre diferentes electrodos en la superficie 1000, o usando los electrodos 1007 y 1008 en una configuración convencional de tres electrodos [20]. Al medirla, la respuesta electroquímica de diferentes electrodos con
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diferentes posiciones en la superficie 1000 se puede correlacionar con la densidad de partículas en esta posición. Si la bioadhesión, por ejemplo, adhesión celular, tiene lugar en la superficie en gradiente, esto también se puede detectar como un cambio aditivo, generalmente negativo, de la respuesta electroquímica. Si una sustancia activa de oxidorreducción entra en contacto con la superficie, también se puede detectar como un cambio aditivo, generalmente positivo, de la respuesta electroquímica.
Ejemplo 1. Evaluación de la adsorción gradual de partículas con SEM
Se fabricaron superficies de oro con un tamaño de 11 x 20 mm por evaporación de 5 nm de Cr en primer lugar y luego 200 nm de Au sobre un sustrato de SiO2. Estas fueron lavadas y provistas de una monocapa de ditiol de acuerdo con el procedimiento descrito en detalle [1, 8]. En resumen, las superficies limpias de oro se incubaron en una solución de octanditiol en etanol, en la que se reactivaron con ditiotreitol (DDT). Se fabricó una solución de partículas de oro estabilizadas electrostáticamente con partículas de oro de alrededor de 10 nm de diámetro de acuerdo con el procedimiento descrito en detalle [1, 8]. La solución de oro se centrifugó a 16 000 g para reducir la fuerza iónica en la solución y para aumentar la concentración de las partículas. Después de la centrifugación, el sedimento de partículas de oro se diluyó hasta una concentración de partículas aproximada de 55 nM en agua pura con una conductividad de 18,2 Mfí*cm. Esta solución de partículas se transfirió a un recipiente diseñado para la fabricación de gradientes de acuerdo con la figura 5, después de ello, se colocaron varias superficies preparadas con ditiol en el mismo recipiente con una distancia específica hasta el fondo del mismo. Luego, se colocó un tampón de citrato con la concentración 1 M y pH 4,0 en el fondo del recipiente de gradiente de modo que el espacio por debajo de las superficies se llenó con este tampón. Después, se dejó que el tampón de citrato difundiera sobre las superficies durante 30 minutos, después de lo cual se detuvo el procedimiento vaciando la solución del recipiente de gradiente desde abajo. En una aplicación diferente, el tampón de citrato con la concentración 50 mM se aplicó por debajo de las superficies y se dejó difundir menos de 90 minutos, lo que da como resultado un gradiente más largo con menor pendiente comparado con el tampón 1 M en 30 minutos. Las superficies se analizaron con SEM en diferentes posiciones en la superficie en gradiente. En la figura 11 se presenta una selección de imágenes.
Ejemplo 2. Evaluación de la adsorción gradual de partículas por iSPR
Se prepararon gradientes lineales con nanopartículas de oro de 10 nm como se describe en el ejemplo 1 mediante química de ditiol. Como sustrato, se usaron superficies de vidrio en las que se había evaporado una fina capa de Au, de aprox. 50 nm. Estas superficies son adecuadas para el análisis por resonancia de plasmones superficiales, SPR, después de la fabricación de los gradientes, las superficies se colocaron en un instrumento para SPR de imágenes, que se describe en detalle en [17]. Se analizaron dos gradientes diferentes, véase la figura 12. Se había preparado un gradiente con tampón de citrato 50 mM que se dejó difundir durante 90 minutos (gradiente "largo"), y se había preparado un gradiente con tampón de citrato 1 M durante 30 minutos (gradiente "corto"). Cada gradiente de partículas también había reaccionado con maleimida-PEG para minimizar la bioadhesión entre las partículas distribuidas, y con octantiol por encima de las partículas, que hace que las superficies de las partículas sean hidrófobas para promover la bioadhesión. En cada superficie en gradiente, se analizó un área de aprox. 1 x 5 mm. En estas áreas se representaron todas las partes esenciales del gradiente. La longitud de onda de SPR presentada en el eje z del gráfico 3D es proporcional a la cobertura superficial de las nanopartículas de oro. En la figura 13 se presenta una exploración de líneas de un gradiente "corto" junto con una exploración de líneas para una superficie de control positivo (en este caso una superficie modificada con octanditiol únicamente) y una superficie de control negativa modificada con octanditiol y maleimida-PEG. Cada exploración de líneas representa un promedio de todas las exploraciones de la superficie.
Ejemplo 3. Evaluación de adsorción de fibrinógeno y adsorción de trombocitos a gradientes de nanopartículas hidrófobas con iSPR y microscopia de fluorescencia.
Se fabricaron gradientes "cortos" con nanopartículas de oro de 10 nm sobre superficies de oro diseñadas para análisis por SPR, y luego se modificaron con maleimida-PEG y octantiol de acuerdo con el ejemplo 2 anterior. Esto proporciona gradientes de partículas hidrófobas contra el fondo de PEG que rechaza proteínas. Las superficies se analizaron con iSPR. En una secuencia, se adsorbieron fibrinógeno (0,5 mg/ml en PBS) durante 5 minutos y luego trombocitos (esencialmente una preparación sin suero de un donante sano) durante 30 minutos a superficies con gradientes, superficies de control positivo (ditiol únicamente) y superficies de control negativo (ditiol modificado con maleimida-PEG). En la figura 14, se presenta la respuesta de la adsorción de fibrinógeno y trombocitos para una superficie en gradiente y una superficie controlada positiva. La curva azul muestra la adsorción de fibrinógeno, la curva verde la respuesta acumulada tanto de fibrinógeno como de trombocitos. La respuesta de las superficies subyacentes, que corresponde a lo que se muestra en la figura 13, se ha sustraído de los resultados de la figura 14. Obsérvese que la superficie positiva adsorbe tanto fibrinógeno como trombocitos homogéneamente en toda la superficie, mientras que la superficie en gradiente adsorbe proteínas y trombocitos gradualmente. Las superficies de control negativo no proporcionaron respuesta significativa. Después de la adsorción de trombocitos, las superficies se lavaron con tampón de PBS y se fijaron durante 15 minutos con glutaraldehído al 2 %. Las superficies se tiñeron (tinción del esqueleto de actina) de acuerdo con un protocolo normal y se analizaron por microscopia de fluorescencia en diferentes posiciones en las superficies. La
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figura 15 muestra trombocitos representativos en posiciones con alta (A) y baja (B) cobertura de partículas, respectivamente.
Ejemplo 4. Evaluación de adhesión microbiana a gradientes de nanopartículas hidrófobas.
Se fabricaron gradientes "largos" con nanopartículas de oro de 10 nm sobre superficies de oro modificadas con maleimida-PEG y octantiol de acuerdo con el ejemplo 2 anterior. Esto proporciona gradientes con partículas hidrófobas contra el fondo de PEG que rechaza proteínas. Se adsorbieron células de E. coli con fimbrias a las superficies en condiciones estáticas y se expusieron a un lavado controlado durante 10 minutos. Las bacterias restantes se tiñeron con naranja de acridina y DAPI, después de ello, las superficies se analizaron con lupa y microscopia de fluorescencia. La figura 16 muestra una sección de una superficie en gradiente con adsorción de células de E. coli teñidas con naranja de acridina a bajo aumento junto con una superficie de control positivo (octantiol) y una superficie de control negativo (ditiol modificado con maleimida-PEG). La cobertura superficial de nanopartículas en diferentes posiciones en el gradiente se determinó por SEM. La cobertura superficial relativa se muestra en cada imagen. La imagen insertada muestra dos bacterias teñidas con DAP a mayor aumento. La distribución de bacterias cambia drásticamente a una cobertura superficial de un 20 %.
Aunque la presente invención se ha descrito anteriormente con referencia a modos de realización específicos, no se pretende que esté limitada a la forma específica expuesta en el presente documento. Por el contrario, la invención está limitada únicamente por las reivindicaciones adjuntas, y otros modos de realización además de los específicos anteriores son igualmente posibles dentro del alcance de estas reivindicaciones adjuntas.
En las reivindicaciones, el término "comprende/comprendiendo" no excluye la presencia de otros elementos o etapas. Además, aunque se enumeran individualmente, puede implementarse una pluralidad de medios, elementos o etapas de método, por ejemplo, mediante una única unidad o procesador. Adicionalmente, aunque se pueden incluir características individuales en diferentes reivindicaciones, estas posiblemente se pueden combinar de forma ventajosa, y la inclusión en diferentes reivindicaciones no implica que una combinación de características no sea viable y/o ventajosa. Además, las referencias singulares no excluyen una pluralidad. Los términos "uno", "una", "primero", "segundo", etc. no excluyen una pluralidad. Los signos de referencia en las reivindicaciones se proporcionan simplemente como un ejemplo aclaratorio y no deben interpretarse como limitantes del alcance de las reivindicaciones de ninguna manera.
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Claims (15)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un método para preparar un gradiente continuo de nanopartículas depositadas y cargadas eléctricamente
    (200) a lo largo de una superficie sólida (203), en el que el número de nanopartículas depositadas y cargadas eléctricamente (200) por unidad de superficie (203) es relativamente alto en una extremo de la superficie y relativamente bajo en el extremo opuesto de la superficie, y en el que la distancia entre las partículas
    depositadas, en el momento de depositarlas, se regula a través de la repulsión electrostática entre las
    nanopartículas en una solución (402), caracterizado por que el grado de repulsión electrostática de las partículas en la solución (402) se obtiene mediante una difusión de una solución salina (403) en la solución que comprende nanopartículas (402).
  2. 2. El método de la reivindicación 1, en el que la difusión de la solución salina (403) se obtiene formando una capa de una solución salina bajo una capa de una solución sin sal que comprende nanopartículas (402), y cuando el gradiente continuo está regulado por el tiempo de difusión y la concentración de sal en la solución salina (403).
  3. 3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que la difusión de la solución salina (403) se obtiene
    manteniendo la solución salina (403) en un depósito (603), puesta en contacto con la suspensión de
    nanopartículas (602), comprendiendo además dicha suspensión polisacáridos en una forma de partícula que contiene agua, y dicha suspensión de nanopartículas (602) está en contacto con la superficie sólida (203).
  4. 4. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las nanopartículas (200) consisten en metal, cerámica, tal como vidrio o material polimérico; y/o en el que la superficie sólida (203) consiste en metal, cerámica, tal como vidrio o material polimérico.
  5. 5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las fuerzas de unión entre las nanopartículas (200) y la superficie (203) comprenden enlaces covalentes, interacciones culómbicas, enlaces metálicos, enlaces de Van der Waals, enlaces de hidrógeno, enlaces dipolo-dipolo o enlaces ion-dipolo.
  6. 6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la superficie (203) es de oro, con reactivo de ditiol unido y las nanopartículas (200) se unen covalentemente a grupos tiol de la molécula de ditiol unida a la superficie de oro.
  7. 7. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las partículas cargadas negativamente, pero que no se unen a la superficie (604) se mezclan con nanopartículas que se unen a la superficie (200).
  8. 8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además añadir una primera superficie separada (801) y una segunda superficie separada (802) a la superficie (203), en la que:
    - las nanopartículas (200) y la primera superficie separada (801) tienen el mismo tipo de compuesto conjugado a las mismas, en la que el compuesto se selecciona del grupo que consiste en grupos tiol, tales como tiol terminado en metilo, terminado en amino, terminado en ácido, terminado en péptido, conjugado con sacárido o conjugado con PEG, o tiolsilano; PEG, tal como poli-L-lisina-PEG, silanos modificados con PEG, maleimida-PEG; y aminosilano; y
    - la superficie en gradiente (203) y la segunda superficie separada (802) tienen el mismo tipo de compuestos conjugados a las mismas, en la que el compuesto se selecciona del grupo que consiste en grupos tiol, tales como tiol terminado en metilo, terminado en amino, terminado en ácido, terminado en péptido, conjugado con sacárido o conjugado con PEG, o tiolsilano; PEG, tal como poli-L-lisina-PEG, silanos modificados con PEG, maleimida-PEG; y aminosilano.
  9. 9. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además añadir marcas de escala (702, 703, 704) a la superficie (203).
  10. 10. Una superficie (203, 700) con un gradiente continuo de nanopartículas depositadas y cargadas eléctricamente (200), las nanopartículas (200) tienen un diámetro promedio entre 10 y 60 nm, en la que la distancia promedio de centro a centro de las nanopartículas es de aproximadamente 10-60 nm en un extremo del gradiente y de aproximadamente 100-150 nm en el otro extremo del gradiente.
  11. 11. La superficie de acuerdo con la reivindicación 10, en la que la longitud del gradiente está entre 1 mm y 50 mm; y/o en la que el gradiente es lineal.
  12. 12. La superficie de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 11, en la que las nanopartículas (200) y/o la superficie (203) consisten en metal, cerámica, tal como vidrio o material polimérico; preferentemente las nanopartículas (200) y/o la superficie (203) tienen un compuesto conjugado con las mismas, en la que el compuesto preferentemente se selecciona del grupo que consiste en grupos ditiol, grupos tiol, tales como tiol
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    terminado en metilo, terminado en amino, terminado en ácido, terminado en péptido, conjugado con sacárido o conjugado con PEG, o tiolsilano; PEG, tal como poli-L-lisina-PEG, silanos modificados con PEG, maleimida-PEG; y aminosilano.
  13. 13. Un chip (800) para su uso en el análisis de los fenómenos de adhesión, comprendiendo el chip (800) una superficie (203, 700) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, una primera superficie separada (801) y una segunda superficie separada (802), en el que:
    - las superficies están separadas por barreras (803);
    - las nanopartículas (200) y la primera superficie separada (801) tienen el mismo tipo de compuesto conjugado a las mismas, en la que el compuesto se selecciona del grupo que consiste en grupos tiol, tales como tiol terminado en metilo, terminado en amino, terminado en ácido, terminado en péptido, conjugado con sacárido o conjugado con PEG, o tiolsilano; PEG, tal como poli-L-lisina-PEG, silanos modificados con PEG, maleimida-PEG; y aminosilano; y
    - la superficie en gradiente (203) y la segunda superficie separada (802) tienen el mismo tipo de compuesto conjugado a las mismas, en la que el compuesto se selecciona del grupo que consiste en grupos tiol, tales como tiol terminado en metilo, terminado en amino, terminado en ácido, terminado en péptido, conjugado con sacárido o conjugado con PEG, o tiolsilano; PEG, tal como poli-L-lisina-PEG, silanos modificados con PEG, maleimida- PEG; y aminosilano.
  14. 14. El chip (800) de acuerdo con la reivindicación 13, en el que:
    - la superficie en gradiente (203, 700) es un gradiente de nanopartículas de oro fabricado sobre una superficie de vidrio o sílice modificada con tiol- o aminosilano y la superficie de las partículas ha reaccionado con un tiol funcional, por ejemplo, terminado en PEG, terminado en metilo, terminado en amino, terminado en ácido o terminado en péptido;
    - la primera superficie separada (801) es una superficie de oro que se ha modificado con el mismo tiol funcional que la superficie de las partículas; y
    - la segunda superficie separada (802) es una superficie de vidrio o sílice que se ha modificado con tiol- o aminosilano.
  15. 15. Uso de la superficie (203, 700) de acuerdo con las reivindicaciones 10 a 12, o el dispositivo de acuerdo con la reivindicación 13 o 14, para el análisis de adhesión, en el que el análisis se basa en resonancia de plasmones superficiales (SPR), electroquímica, microscopia óptica o microscopia electrónica de barrido (SEM).
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