ES2661500T3

ES2661500T3 - Variantes de HMGB1 y sus usos

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Publication number: ES2661500T3
Application number: ES13740316.8T
Authority: ES
Inventors: Marco Emilio Bianchi; Maura CASALGRANDI; Emilie Joelle VENEREAU; Silvia Brunelli
Original assignee: Universita degli Studi di Milano Bicocca; Ospedale San Raffaele SRL
Current assignee: Universita degli Studi di Milano Bicocca; Ospedale San Raffaele SRL
Priority date: 2012-07-26
Filing date: 2013-07-26
Publication date: 2018-04-02
Anticipated expiration: 2033-07-26
Also published as: EP2877248A1; EP2877248B1; US20150203551A1; US10626153B2; WO2014016417A1

Abstract

Una variante de HMGB1, caracterizada porque es un quimioatrayente celular y no estimula la producción de citoquinas y/o quimioquinas a partir de una célula, derivados y fragmentos de la misma para su uso en un método para inducir regeneración tisular, en donde dicha variante de HMGB1 consiste en SEQ ID NO: 1 en la que los residuos 5 de cisteína localizados en las posiciones 23, 45 o 106 son remplazados cada uno por un residuo de aminoácido que contiene el mismo número de átomos de carbono que la cisteína, en donde los derivados tienen un porcentaje de identidad de al menos 85% con SEQ ID NO: 1 y en donde los fragmentos tienen una longitud de al menos 84 aminoácidos, siendo dichos derivados y fragmentos quimioatrayentes celulares y no estimulando la producción de citoquinas y/o quimioquinas a partir de una célula y comprendiendo cada uno los residuos de cisteína localizados en las posiciones 23, 45 o 106 de SEQ ID NO: 1 remplazados por un residuo de aminoácido que contiene el mismo número de átomos de carbono que la cisteína.

Description

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concentraciones crecientes de todo-tiol-HMGB1. Los efectos de la forma competidora de HMGB1 no son estadísticamente significativos (ANOVA). (E-F) Migración de fibroblastos 3T3 de ratón hacia todo-tiol-HMGB1 wt previamente expuesto a concentraciones crecientes de H2O2 durante 1 hora (E) (*, P < 0,05 frente a todo-tiol-HMGB1 no tratado con H2O2, ANOVA), y hacia todo-tiol-HMGB1 wt o el mutante E106 (SEQ ID NO: 1 en el que C106 es remplazado por glutamina) purificado en presencia de DTT (F) (*, P <0,05 frente a control no tratado). (G) Los macrófagos humanos se estimularon durante 4 horas con disulfuro-HMGB1 wt o el mutante E106 (0,4 μM) preparado en ausencia de DTT. La expresión de TNF-α, MIP-2 e IL-8 se midió mediante PCR en tiempo real y se expresó como la multiplicidad de incremento en comparación con los macrófagos no estimulados (*, P <0,05 frente a disulfuro-HMGB1; prueba t). En todos los paneles, los datos son representativos de al menos tres experimentos independientes y las barras representan la media ± DT de las muestras por triplicado (cuando no son visibles, caen dentro delos símbolos)

Figura 3. BoxA y el anticuerpo monoclonal DPH1.1 previenen la migración de células inducida por HMGB1pero no la expresión de citoquinas.(A,C) Migración de fibroblastos 3T3 de ratón hacia todo-tiol-HMGB1 wt en presencia o no de BoxA (A) o fragmentos F(ab')2 del anticuerpo monoclonal anti-HMGB1 DPH1.1 (C). (B,D) Los macrófagos humanos se estimularon durante 4 horas con disulfuro-HMGB1 (0,4 μM) en presencia de BoxA (B)o fragmentos F(ab')2 de DPH1.1 (D). La expresión de TNF-α semidió mediante PCR en tiempo real y se expresó como la multiplicidad de aumento en comparación con los macrófagos no estimulados. En todos los paneles, los datos son representativos de al menos tres experimentos independientes y las barras representan la media ± DT de las muestras por triplicado (*, P <0,05 frente a control; ANOVA).

Figura 4. Las cisteínas de HMGB1 son esenciales para promover la producción de citoquinas/quimioquinas,pero no para la quimiotaxis.(A) Movilidad electroforética de HMGB1 wt recombinante y mutantes preparados en ausencia de DTT, determinada como se describe en la leyenda de la Fig. 1B. (B) Se estimularon macrófagos humanos durante 4 horas con mutantes o HMGB1 wt preparada en ausencia de DTT (0,4 μM). La expresión de TNF-α se midió mediante PCR en tiempo real (*, P <0,05 frente a control, ANOVA). (C-D) Migración de fibroblastos 3T3 hacia mutantes HMGB1 1 nM, expuestos o no durante 1 hora a DTT 5mM (C) o a H2O2 100 mM (D). Las barras representan lamedia ± DT demuestras por triplicado (*, P <0,05 frente a control, ANOVA).

Figura 5. La oxidación modula las actividades de HMGB1 in vivo.(A) Movilidad electroforética de HMGB1 de los músculos tibiales anteriores recogidos en los tiempos indicados (2, 6, 24 y 72 h) después de la inyección de cardiotoxina (CTX). Lasmuestras secalentaron en presencia (+) o ausencia (-) deβ-mercaptoetanol (β-me) 350mM, se cargaron en un gel de SDS -PA al 12% y se revelaron mediante transferencia de Western utilizando un anticuerpo policlonal contra HMGB1. El producto lisado total del músculo tibial anterior se añadió como control (L). (B-D) 3S-HMGB1 induce el reclutamiento de leucocitos in vivo. Se creó una bolsa de aire en ratones mediante inyección dorsal subcutánea de aire. El día 6, se inyectaron en las bolsas de aire 200 μl de PBS que contenía 10 pmoles de CXCL12, 300 pmoles de HMGB1 (wt o 3S) o ambos. (C) Alternativamente, se inyectaron 200 μl de PBS que contenía o no 1 o 10 nmoles de HMGB1 (wt o 3S) en las bolsas de aire (C) o 1 nmol de HMGB1 (wt o 3S) en ausencia o presencia de N-acetilcisteína (NAC) (100 nmoles/g) (D). Después de 6 horas, las células se recogieron de las bolsas de aire, se tiñeron con anticuerpos anti-Ly6C y anti-CD11b y se analizaron mediante citometría de flujo (GB, glóbulos blancos) (*, P <0,05; **, P <0,01; *** , P <0.001, ANOVA más la prueba post-hoc de Dunnett).

Figura 6. HMGB1 induce el reclutamiento de macrófagosM2 y células satélite in vivo en un modelo de lesión muscular aguda. Se realizó una lesión muscular en el tibial anterior (TA) de C57BL/6 de 8 semanas de edad al inyectar 50 μl de cardiotoxina (CTX) 15 μM en presencia o no de 150 μg de HMGB1 (wt o 3S) (tres animales por grupo) . Los ratones se sacrificaron 2 o 5 días después de la inyección de CTX, y los músculos TA se disecaron y se congelaron en isopentano enfriado con N2 líquido. (A) Tinción de inmunofluorescencia de macrófagos M2c (CD163, color rojo) en secciones de músculos TA 2 días después de la inyección intramuscular de cardiotoxina y HMGB1 (wt

o 3S). (a1). Tinción de inmunofluorescencia de células satélite (Pax 7, color verde) en secciones de músculos TA 5 días después de la inyección intramuscular de cardiotoxina y HMGB1 (wt o 3S). (a2)(B) Cuantificación de macrófagos M2 (panel superior) y células satélite (panel inferior) realizada en 20 secciones aleatorias por muestra. ** = p <0,01; *** p <0,001.

Figura 7. HMGB1 induce la migración de mioblastos in vitro. Migración de células C2C12 miogénicas hacia HMGB1 wt o 3S (1 μM) en cámaras Boyden modificadas (***, P <0,001 frente a control; ANOVA). Suero Bovino Fetal (FBS) como control positivo.

Figura 8. Preservación de la estructura muscular por HMGB1 después de una lesión muscular aguda. La lesión muscular se realizó en el tibial anterior (TA) de C57BL/6 de 8 semanas de edad al inyectar 50 μl de CTX 10 μM en presencia o no de 150 μg de HMGB1 (wt o 3S) (tres animales por grupo). Las secciones representativas de los músculos TA de los ratones tratados y no tratados se tiñeron con hematoxilina y eosina 2 días después de la lesión por CTX.

Figura 9. Los mutantes HMGB1 inducen la migración celular, pero no la producción de citoquina/quimioquina. (A) Migración de fibroblastos 3T3 hacia HMGB1 1 nM wt o mutantes (C23S, C45S) expuestos o no durante 1 hora a DTT 5 mM. Las barras representan la media ± DT de muestras por triplicado (*, P <0,05 frente a control, ANOVA). (B-C) Se estimularon macrófagos humanos durante 4 horas con HMGB1 wt o

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de una sola banda con un pm aparente de 28 kDa, tanto en condiciones reductoras como no reductoras. Por el contrario, la disulfuro-HMGB1 migró en condiciones no reductoras en forma de una banda única de 26 kDa y se desplazó en condiciones reductoras a la misma posición de 28 kDa que la todo-tiol-HMGB1 (Fig. 1B). Los anticuerpos monoclonales o policlonales contra HMGB1 reconocieron ambas formas de HMGB1 (Fig. 1B). La disulfuro-HMGB1 se cambió fácilmente al patrón electroforético de la todo-tiol-HMGB1 después de una exposición de 5 minutos a DTT 5 mM; por el contrario, los autores ocasionalmente detectaron la formación de disulfuro-HMGB1 después de la dilución en tampones equilibrados con aire que carecían de agentes reductores. Esto indica que las formas todo-tiol-y disulfuro-HMGB1 se interconvierten fácilmente en presencia de donantes (DTT) o aceptores (oxígeno) de electrones.

Las actividades estimuladoras de citoquina y quimioatrayentes de HMGB1 son mutuamente excluyentes

Recientemente, (4,5) mostraron que la disulfuro-HMGB1 tiene actividad estimuladora de citoquinas que se pierde después de la reducción con DTT. Los autores confirmaron que la disulfuro-HMGB1 induce la activación de la vía NF-κB (Fig. 1C) y la expresión de citoquina/quimioquina por los macrófagos (Fig. 1D), mientras que la todo-tiol-HMGB1 no lo hace. Sin embargo, se desconoce la influencia de las modificaciones redox sobre la actividad quimiotáctica de HMGB1. Los autores demostraron recientemente que el reclutamiento de células inflamatorias inducido por HMGB1 depende de la formación de un heterocomplejo de HMGB1-CXCL12 que actúa exclusivamente a través de CXCR4 y no a través de otros receptores de HMGB1 (10). Utilizando un ELISA híbrido (anticuerpo de captura anti-CXCL12 y anticuerpo de detección anti-HMGB1) los autores encontraron que la todo-tiol-HMGB1 forma el heterocomplejo con CXCL12; no se pudo detectar la formación de heterocomplejos entre disulfuro HMGB1 y CXCL12 (Fig. 2A). La todo-tiol-HMGB1 presenta sinergia con CXCL12 en la inducción de la migración de monocitos humanos, como se esperaba (10), mientras que la disulfuro-HMGB1 no (Fig. 2B).

Los fibroblastos responden a concentraciones más bajas de HMGB1 en comparación con los leucocitos (11) y apoyan su propia migración al secretar CXCL12 tanto basalmente como en respuesta a la activación de HMGB1 del Receptor para Productos Finales de Glicación Avanzada (RAGE) (10). Los fibroblastos de ratón 3T3 migraron de manera dependiente de la dosis hacia todo-tiol-HMGB1, pero no hacia disulfuro-HMGB1 (Fig. 2C) En particular, la adición de DTT a disulfuro-HMGB1 (recientemente todo tiol HMGB1) restauró casi por completo la actividad quimiotáctica de la proteína.

Tomados en conjunto, los resultados de los autores indican que la formación del enlace disulfuro C23-C45 inhibe la función quimioatrayente de HMGB1 (Tabla I).

Tabla I. Resumen del estado redox de HMGB1 frente a la actividad. Las formas redox mutuamente excluyentes de HMGB1 promueven el reclutamiento decélulas o la liberación decitoquinas pro-inflamatorias: las cisteínas reducidas hacen de HMGB1 un quimioatrayente, un enlace disulfuro hacen de ella una citoquina pro-inflamatoria y la oxidación adicional de sus cisteínas a sulfonatosmediante especies reactivas del oxígeno anula ambas actividades.

Molécula / Nivel redox de cisteína: Visión de conjunto molecular esquemática Actividad inductora de citoquina Actividad quimioatrayente

Todo-tiol-HMGB1 CysH: imagen11 No Si

Disulfuro-HMGB1 Cys-Syc: imagen12 Si No

HMGB1 oxidada terminalmente por ROS CysO3-: imagen13 No No

Por lo tanto, las actividades estimuladoras de citoquinas y quimioatrayentes de HMGB1 son mutuamente excluyentes. Además, la disulfuro-HMGB1 y la todo-tiol-HMGB1 no compiten entre sí (Fig. 2D). De hecho, las funciones quimioatrayentes y estimuladoras de citoquinas de HMGB1 requieren diferentes receptores: CXCR4 y TLR4, respectivamente (3-5,10). Los pequeños reajustes conformacionales asociados con la formación de un único enlace disulfuro disminuyen pero no anulan la unión de HMGB1 al ADN (12), cómo pueden segregar y restringir de manera tan efectiva las interacciones de la todo-tiol-y la disulfuro-HMGB1 a CXCL12 y TLR4, respectivamente, aún necesita ser investigado.

Las especies reactivas del oxígeno (ROS) anulan la actividad proinflamatoria de HMGB1 oxidando de forma terminal sus cisteínas a sulfonatos (4,5,13). Los autores muestran que HMGB1 expuesta a H2O2 no tiene actividad

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