ES2660613T3 - Anticuerpos estables y solubles - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo que se une específicamente a TNFα que comprende: a) una cadena ligera variable que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 2 o de SEQ ID NO: 14; y b) una cadena pesada variable que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 5.

Description

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En otras realizaciones, una modificación reductora de la agregación de la invención comprende una sustitución en la posición AHo 47 en la cadena VL. En una realización, la sustitución es arginina (R) en la posición AHo 47. En otra realización, la arginina (R) en la posición AHo 47 reemplaza una lisina (K).

El sistema de numeración AHo se describe en detalle en Honegger, A. y Plückthun, A. (2001) J Mol. Biol. 309:6575 670). La posición AHo 50 en la cadena ligera variable corresponde a la posición 42 de Kabat. La posición AHo 47 en la cadena ligera variable corresponde a la posición 39 de Kabat. El sistema de numeración Kabat se describe con más detalle en Kabat et al. (Kabat, E. A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, U. S. Department of Health and Human Services, Publicación del NIH n.º 91-3242). Las tablas de conversión entre el sistema AHo y el sistema más comúnmente usado como se define por Kabat et al. se 10 proporcionan en A. Honegger, J.Mol.Biol. 309 (2001) 657-670.

Las siguientes tablas de conversión se proporcionan para dos sistemas de numeración diferentes usados para identificar posiciones de restos de aminoácidos en regiones variables de cadena pesada y ligera. El sistema de numeración Kabat se describe con más detalle en Kabat et al. (Kabat, E. A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, U. S. Department of Health and Human Services, Publicación del NIH n.º 91

15 3242). El sistema de numeración AHo se describe con más detalle en Honegger, A y Plückthun, A. (2001) J. Mol. Biol. 309:657-670.

Numeración de región variable de cadena pesada

Tabla 1: Tabla de conversión para las posiciones de restos en el dominio variable de cadena pesada

Kabat AHo

Kabat AHo

Kabat AHo

1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 * 8 8 9 9 10 10 11 11 12 12 13 13 14 14 15 15 16 16 17 17 18 18 19 19 20 20 21 21 22 22 23 23 24 24 25 25 26 26 27 * 28 27 29 28 30

44 51 45 52 46 53 47 54 48 55 49 56 50 57 51 58 52 59 52a 60 52b 61 52c 62 * 63 53 64 54 65 55 66 56 67 57 68 58 69 59 70 60 71 61 72 62 73 63 74 64 75 65 76 66 77 67 78 68 79 69 80 87 101 88 102 89 103 90 104 91 105 92 106 93 107 94 108 95 109 96 110 97 111 98 112 99 113 100 114 100a 115 100b 116 100c 117 100d 118 100e 119 100f 120 100g 121 100h 122 100i 123 * 124 * 125 * 126 * 127 * 128 * 129 * 130

Kabat AHo

Kabat AHo

Kabat AHo

29 31

70 81 * 131

30 32

71 82 * 132

31 33

72 83 * 133

32 34

73 84 * 134

33 35

74 85 * 135

34 36

75 86 * 136

35 37

76 87 101 137

35a 38

77 88 102 138

35b 39

78 89 103 139

* 40

79 90 104 140

* 41

80 91 105 141

* 42

81 92 106 142

36 43

82 93 107 143

37 44

82a 94 108 144

38 45

82b 95 109 145

39 46

82b 96 110 146

40 47

83 97 111 147

41 48

84 98 112 148

42 49

85 99 113 149

43 50

86 100

Columna 1, posición de resto en sistema de numeración Kabat. Columna 2, número correspondiente en sistema de numeración AHo para la posición indicada en la columna 1. Columna 3, posición de resto en sistema de numeración Kabat. Columna 4, número correspondiente en sistema de numeración AHo para la posición indicada en la columna 3. Columna 5, posición de resto en sistema de numeración Kabat. Columna 6, número correspondiente en sistema de numeración AHo para la posición indicada en la columna 5.

Numeración de región variable de cadena ligera Tabla 2: Tabla de conversión para las posiciones de restos en el dominio variable de cadena ligera

Kabat AHo

Kabat AHo

Kabat AHo

1 1

43 51 83 101

2 2

44 52 84 102

3 3

45 53 85 103

4 4

46 54 86 104

5 5

47 55 87 105

6 6

48 56 88 106

7 7

49 57 89 107

8 8

50 58 90 108

9 9

* 59 91 109

10 10

* 60 92 110

11 11

* 61 93 111

12 12

* 62 94 112

13 13

* 63 95 113

14 14

* 64 95a 114

15 15

* 65 95b 115

16 16

* 66 95c 116

17 17

51 67 95d 117

18 18

52 68 95e 118

Kabat AHo

Kabat AHo

Kabat AHo

19 19 20 20 21 21

53 69 54 70 55 71 95f 119 * 120 * 121

22 22 23 23 24 24 25 25 26 26 27 27 * 28 27a 29 27b 30 27c 31 27d 32 27e 33 27f 34 * 35 28 36 29 37 30 38 31 39 32 40 33 41 34 42 35 43 36 44 37 45 38 46 39 47 40 48 41 49 42 50

56 72 57 73 58 74 59 75 60 76 61 77 62 78 63 79 64 80 65 81 66 82 67 83 68 84 * 85 * 86 69 87 70 88 71 89 72 90 73 91 74 92 75 93 76 94 77 95 78 96 79 97 80 98 81 99 82 100 * 122 * 123 * 124 * 125 * 126 * 127 * 128 * 129 * 130 * 131 * 132 * 133 * 134 * 135 * 136 96 137 97 138 98 139 99 140 100 141 101 142 102 143 103 144 104 145 105 146 106 147 107 148 108 149

Columna 1, posición de resto en sistema de numeración Kabat. Columna 2, número correspondiente en sistema de numeración AHo para la posición indicada en la columna 1. Columna 3, posición de resto en sistema de numeración Kabat. Columna 4, número correspondiente en sistema de numeración AHo para la posición indicada en la columna 3. Columna 5, posición de resto en sistema de numeración Kabat. Columna 6, número correspondiente en sistema de numeración AHo para la posición indicada en la columna 5.

Los anticuerpos de la invención pueden comprender modificaciones adicionales según se desee. Por ejemplo, un anticuerpo de la invención puede comprender sustituciones de aminoácidos para reducir su inmunogenicidad in vivo de acuerdo con los métodos descritos, por ejemplo, en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos n.º 12/973.968 y/o sustituciones para potenciar la solubilidad del anticuerpo, como se describe en el documento WO 09/155725. Por 5 lo tanto, en una realización, un anticuerpo de la invención comprende serina (S) en la posición 12 de cadena pesada (numeración AHo); serina (S) o treonina (T) en la posición 103 de cadena pesada (numeración AHo) y/o serina (S) o treonina (T) en la posición 144 de cadena pesada (numeración AHo). Adicionalmente, el anticuerpo puede comprender serina (S) o treonina (T) en las posiciones 97, 98 y/o 99 de cadena pesada (numeración AHo). Preferentemente, el anticuerpo comprende serina (S) en la posición 12 de cadena pesada (numeración AHo), 10 treonina (T) en la posición 103 de cadena pesada (numeración AHo) y treonina (T) en la posición 144 de cadena pesada (numeración AHo).

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En una realización, un anticuerpo de la invención comprende la cadena ligera variable: SEQ ID NO: 11: armazón de cadena ligera variable de FW1.4 (K127)

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En otra realización, un anticuerpo de la invención comprende la cadena ligera variable: SEQ ID NO: 12: armazón de cadena ligera variable sustituida de FW1.4

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En otra realización más preferida, un anticuerpo de la invención comprende la secuencia: SEQ ID NO: 13:

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10 En otra realización, un anticuerpo de la invención comprende la cadena ligera variable (las CDR están subrayadas): SEQ ID NO: 14:

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Por lo tanto, en una realización, un anticuerpo de la invención comprende la secuencia: SEQ ID NO: 15:

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En otra realización, un anticuerpo de la invención comprende la secuencia: SEQ ID NO: 16:

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En una realización, un anticuerpo de la invención comprende la secuencia:

SEQ ID NO: 17:

(34rFW1.4_VL_K47R_DHP):

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dominios de VL y VH con la sustitución es al menos 0,5 kcal/mol menor que la energía libre entre los dominios VL y VH correspondientes que no comprenden la sustitución de aminoácidos), reduciendo de este modo la propensión a la agregación del anticuerpo modificado en comparación con la de un anticuerpo parental.

Como se indicó anteriormente, el anticuerpo puede ser, por ejemplo, un Fab, un F(ab’)2, un Fv monocatenario 5 (scFv), un fragmento Fv, un diacuerpo, un diacuerpo monocatenario, un anticuerpo en tándem o un anticuerpo lineal; En una realización preferida, el anticuerpo es un Fv monocatenario (scFv).

En una realización preferida, la identificación de la una o más posiciones de restos que participan en la interfaz entre la cadena ligera variable y la cadena pesada variable del anticuerpo (es decir, la etapa (ii)) implica la determinación de la energía libre entre la interfaz VL – VH. Esto se puede realizar usando programas bioinformáticos comúnmente

10 conocidos. Un ejemplo de un programa bioinformático adecuado es CHARMM (Chemistry at HARvard Macromolecular Mechanics).

A fin de determinar la energía libre entre la interfaz VL – VH, típicamente, se proporciona una presentación molecular atomística completa de la proteína. La energía libre de la interfaz es la diferencia de energía entre el anticuerpo entero que comprende ambos dominios variables VL y VH y la suma de las energías de los dominios

15 individuales en el contexto de un método de solvente implícito. Esto implica tres cálculos de energía únicos, (1) en la G(a) del anticuerpo; (2) en la G(b) de la VL; y (3) en la G(c) de la VH. Por consiguiente, la energía libre de la interfaz es

G interfaz = G(a) – G(b) – G(c)

En una realización, el método de solvente implícito es GBMV o PBSA como es sabido en la técnica.

20 La determinación de energía libre puede comprender además la etapa de simular la distribución de carga de la proteína. Dicha distribución de carga se puede simular basándose en las fuerzas electroestáticas o de van der Waals.

Para determinar una modificación adecuada, pueden elegirse para su sustitución uno o más restos de aminoácido que participan en la interfaz. Por ejemplo, se genera un modelo molecular de la proteína que comprende las una o 25 más sustituciones (por ejemplo, cambiando uno o más restos por alanina) en las posiciones seleccionadas y se determina la energía libre de la interfaz de la presentación molecular sustituida. Si la energía libre de la interfaz del modelo molecular sustituido es menor que la energía libre de la interfaz del modelo molecular inicial, se selecciona el resto de aminoácido para su sustitución. Dentro del contexto de CHARMm, se pueden construir mutaciones, por ejemplo, con el protocolo Build Mutants. Las una o más sustituciones en el modelo molecular pueden estar en las

30 posiciones que son conocidas o se sospecha están implicadas en la interfaz VL/VH.

En una realización, se realiza una etapa adicional de minimización de energía del modelo molecular que comprende las una o más sustituciones en las posiciones seleccionadas en el área aproximadamente las mutaciones. Dicha área se puede ajustar a 10 Angstrom.

En una realización, una posición de resto identificada para su sustitución está ocupada por un aminoácido cargado.

35 Un anticuerpo producido por un método de la invención puede comprender cualquier cadena ligera o cadena pesada variable adecuada como es sabido en la técnica y comprende preferentemente al menos una CDR de un anticuerpo de conejo. En el presente documento se describen determinadas cadenas ligeras y pesadas variables preferidas. Por ejemplo, un anticuerpo de la invención puede comprender: un armazón de VL de anticuerpo que tiene al menos un 65% de identidad, más preferentemente un 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, más preferentemente un 99%

40 respecto de la SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12, que comprende además arginina (R) en la posición AHo 47 y/o en la posición AHo 50 de la cadena ligera variable; y un armazón de VH de anticuerpo que tiene al menos un 80% de identidad, más preferentemente un 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, más preferentemente un 99% respecto de la SEQ ID NO: 3.

La modificación de la una o más posiciones de restos se hace preferentemente de acuerdo con las enseñanzas del

45 documento PCT/CH2008/000285, que se incorpora al presente documento por referencia en su totalidad. Brevemente, para un subtipo de anticuerpo dado, ciertos aminoácidos están presentes en posiciones de restos específicas del armazón del anticuerpo. Por ejemplo,

a) para una región variable de cadena pesada VH3 humana, los aminoácidos preferidos son:

(i) glutamina (Q) en la posición 1 de aminoácido usando sistema de numeración AHo o de Kabat;

50 (i) (ii) glutamina (Q) en la posición 6 de aminoácido usando sistema de numeración AHo o de Kabat;

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anticuerpo se modifica para que comprenda arginina (R) en la posición AHo 47 y/o posición AHo 50 de la cadena ligera variable. En algunas realizaciones, se sustituye lisina (K) por arginina (R) en la posición AHo 47 y/o la posición AHo 50 de la cadena ligera variable. Ya que los anticuerpos de la invención pueden comprender modificaciones adicionales según se desee, los métodos de la invención pueden comprender la etapa adicional de modificar el 5 anticuerpo, tal como para que comprenda serina (S) en la posición 12 de cadena pesada (numeración AHo); serina

(S) o treonina (T) en la posición 103 de cadena pesada (numeración AHo). Adicionalmente, el anticuerpo se puede modificar para que comprenda serina (S) o treonina (T) en las posiciones 97, 98 y/o 99 de cadena pesada (numeración AHo). Preferentemente, el método comprende la etapa de modificar el anticuerpo para que comprenda serina (S) en la posición 12 de cadena pesada (numeración AHo), treonina (T) en la posición 103 de cadena pesada (numeración AHo) y treonina (T) en la posición 144 de cadena pesada (numeración AHo).

La invención proporciona además un método de generar un anticuerpo humanizado con una propensión baja a la agregación en solución, comprendiendo el método seleccionar un armazón de cadena ligera variable que comprende arginina (R) en la posición AHo 47 y/o en la posición AHo 50. El método puede comprender además seleccionar un armazón de cadena pesada variable que comprende una serina (S) en la posición 12 de cadena

15 pesada (numeración AHo); serina (S) o treonina (T) en la posición 103 de cadena pesada (numeración AHo) y/o serina (S) o treonina (T) en la posición 144 de cadena pesada (numeración AHo). En una realización, un armazón identificado basándose en un criterio de selección seleccionado se puede modificar adicionalmente con una modificación reductora de la agregación de la invención. Por ejemplo, si se identifica un armazón de cadena ligera variable que tiene una arginina (R) en la posición 50, el resto en la posición AHo se puede sustituir con un aminoácido diferente, tal como arginina (R) o si se identifica una cadena pesada variable que tiene una serina (S) en la posición 12 AHo, los restos en las posiciones 103 y 144 AHo se pueden sustituir con treonina.

Tal como se usa en el presente documento, un anticuerpo “humanizado” es un anticuerpo que comprende CDR no humanas y secuencias de armazón de cadena variable pesada humanas o derivadas de humano y/o de cadena ligera variable humanas o derivadas de humano. La humanización de los anticuerpos es de sobra conocida en la

25 técnica. En una realización, el anticuerpo humanizado comprende al menos una y preferentemente las seis CDR de un anticuerpo producido en un conejo o seleccionada de una biblioteca de CDR.

Los armazones de anticuerpo variables pueden seleccionarse, por ejemplo, de una base de datos (tal como la base de datos de Kabat, Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/), VBASE (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/), VBASE2 (http://vbase2.org/), la base de datos de Kabat de Sequences of Proteins of Immunological interest (http://www.kabatdatabase.com/index.html), la Universal Protein Resource (UniProt; http://pir.georgetown.edu/), y base de datos Abysis (http://www.bioinf.org.uk/abs/), basándose en la identidad y/o la similitud con las secuencias de armazón variable del anticuerpo en el que se originaron las CDR o basándose en secuencias de armazón por lo demás preferidas.

Se encuentran disponibles diversos programas informáticos para buscar secuencias de armazón humanas

35 adecuadas que cumplen los requisitos seleccionados. Por ejemplo, “KabatMan” es una versión habilitada para búsquedas por ordenador de los datos de la secuencia de anticuerpo de Kabat del libro Sequences of immunological Interest. El programa KabatMan se describe en el artículo: Martin (1996) “Accessing the Kabat Antibody Sequence Database” de Computer PROTEINS: Structure, Function and Genetics, 25, 130-133, y está disponible en http://www.bioinf.org.uk/abs/simkab.html, y http://www.bioinf.org.uk/abs/kabatman.html. La base de datos Abysis, en http://www.bioinf.org.uk/abysis/, integra datos de secuencia de Kabat, IMGT y PDB con datos estructurales de la PDB. Proporciona una interfaz comprensiva de apuntar y hacer clic que permite a una persona buscar los datos de secuencia en varios criterios y mostrar resultados en formatos diferentes. Para datos de la PDB, se pueden combinar búsquedas de secuencia con restricciones estructurales.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo generado por el método descrito en el presente documento.

45 En una realización preferida, dicho anticuerpo comprende una estructura de anticuerpo VL que tiene al menos un 80% de identidad, más preferentemente un 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, más preferentemente un 99% respecto de la SEQ ID NO: 12 o la SEQ ID NO: 13; preferentemente, el anticuerpo comprende arginina (R) en la posición AHo 47 y/o en la posición AHo 50 de la cadena ligera variable.

Además o como alternativa, la estructura de anticuerpo VH es o comprende la SEQ ID NO: 3 o una secuencia que tiene al menos un 80% de identidad, más preferentemente un 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, más preferentemente un 99% respecto de la SEQ ID NO: 3.

En determinadas realizaciones, la invención proporciona además

(1) Un método para reducir la propensión a la agregación de un anticuerpo que sea un complejo heterodimérico que comprende dominios variables pesados y ligeros, comprendiendo el método las etapas de:

55 (a) proporcionar una presentación molecular atomística completa del anticuerpo;

(b)

determinar la energía libre de la interfaz entre ambos dominios;

(c)

elegir uno o más restos de aminoácido que participan en la interfaz para su sustitución proporcionando un modelo molecular del anticuerpo que comprende las una o más sustituciones en las posiciones seleccionadas y determinando la energía libre de la interfaz de la presentación molecular sustituida;

5 (d) seleccionar un resto de aminoácido para su sustitución si la energía libre de la interfaz del modelo molecular sustituido es menor que la energía libre de la interfaz del modelo molecular inicial;

(2) Un método de (1), en donde la energía libre de la interfaz se determina al calcular la diferencia de energía entre el complejo y la suma de las energías de los dominios individuales en el contexto de un método de solvente implícito;

10 (3) El método de (2), en donde el solvente es GBMV o PBSA;

(4)

El método de uno cualquiera de (1)-(3) anteriores, que comprende además la etapa de

(i) simular la distribución de carga de la proteína, en donde dicha etapa se realiza entre la etapa a y b;

(5)

El método de (4), en donde la distribución de carga se simula basándose en fuerzas electrostáticas o de van der Waals;

15 (6) El método de una cualquiera de (1)-(5) anteriores, en donde la etapa (c) comprende la etapa adicional de minimización de la energía en el área aproximadamente la mutación;

(7) El método de una cualquiera de (1)-(7) anteriores, en donde el anticuerpo es un fragmento variable monocatenario (scFv).

Los anticuerpos de la invención pueden generarse usando técnicas rutinarias en el campo de la genética

20 recombinante. Conociendo las secuencias de los polipéptidos, pueden generarse los ADNc que las codifican mediante síntesis génica por métodos bien conocidos en la técnica. Estos ADNc pueden clonarse en vectores plasmídicos adecuados.

Pueden usarse técnicas de clonación y mutagénesis convencionales bien conocidas por los expertos en la materia para acoplar enlazadores, dominios reorganizados o construcciones de fusión para la producción de fragmentos

25 Fab. Los protocolos básicos que divulgan los métodos de la presente invención se describen en Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook y Russell, 3ª ed. 2001) y en Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., 1999).

La secuencia de ADN que porta un gen que codifica un polipéptido de scFv o en el caso de fragmentos Fab, que codifica o dos genes separados o un operón bicistrónico que comprende los dos genes para la VL-Cκ y se clonan las 30 fusiones VH-CH1 en un vector de expresión adecuado, preferentemente uno con un promotor inducible. Debe tomarse la precaución de que esté presente delante de cada gen un sitio de unión a ribosomas que asegure la traducción. Ha de entenderse que los anticuerpos de la presente invención comprenden las secuencias divulgadas más que consistir en estas. Por ejemplo, las estrategias de clonación pueden requerir que se prepare una construcción a partir de la cual se produzca un anticuerpo que tenga presentes uno o unos pocos restos adicionales 35 en el extremo N-terminal. Específicamente, la metionina procedente del codón de inicio puede estar presente en la proteína final en los casos donde no se haya escindido postraduccionalmente. La mayoría de las construcciones para los anticuerpos scFv dan lugar a una alanina adicional en el extremo N-terminal. En una realización preferida de la presente invención, se selecciona un vector de expresión para expresión periplásmica en E. coli (Krebber, 1997). Dicho vector comprende un promotor delante de una secuencia de señal escindible. La secuencia codificante 40 para el péptido del anticuerpo se fusiona a continuación en fase con la secuencia de señal escindible. Esto permite dirigir el polipéptido expresado al periplasma bacteriano, donde se escinde la secuencia de señal. Después, se pliega el anticuerpo. En el caso de fragmentos Fab, tanto el VL-Cκ como los péptidos de fusión de VH-CH1 deben unirse a una señal de exportación. El enlace S-S covalente se forma en las cisteínas C-terminales después de que los péptidos hayan alcanzado el periplasma. Si se prefiere la expresión citoplasmática de los anticuerpos, dichos

45 anticuerpos pueden obtenerse normalmente con altos rendimientos en cuerpos de inclusión, que pueden separarse fácilmente de otros fragmentos y proteínas celulares. En este caso, los cuerpos de inclusión se solubilizan en un agente desnaturalizante, tal como, por ejemplo, clorhidrato de guanidina (GndHCl) y después vuelven a plegarse mediante procedimientos de renaturalización de sobra conocidos por los expertos en la materia.

Los plásmidos que expresan los polipéptidos de scFv o Fab se introducen en un hospedador adecuado,

50 preferentemente una célula bacteriana, de levadura o de mamífero, lo más preferentemente una cepa de E. coli adecuada como, por ejemplo, JM83 para expresión periplásmica o BL21 para expresión en cuerpos de inclusión. El polipéptido se puede recoger del periplasma o de cuerpos de inclusión y se purifica usando técnicas convencionales, tales como cromatografía de intercambio iónico, cromatografía en fase inversa, cromatografía de afinidad y/o filtración en gel conocidas por los expertos en la materia.

55 Los anticuerpos de la invención se pueden caracterizar con respecto a su rendimiento, solubilidad y estabilidad in vitro. Por ejemplo, pueden evaluarse las capacidades de unión a TNF, preferentemente a TNFα humano, in vitro

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Por “isotónica” se entiende que la formulación de interés tiene en esencia la misma presión osmótica que la sangre humana. Las formulaciones isotónicas en general tendrán una presión osmótica de aproximadamente 250 a 350 mOsm. Se puede medir la isotonicidad usando, por ejemplo, un osmómetro de tipo presión a vapor o congelación.

Un “poliol” es una sustancia con múltiples grupos hidroxilo e incluye azúcares (azúcares reductores y no reductores),

5 alcoholes de azúcar y ácidos de azúcar. Los polioles preferidos en el presente documento tienen un peso molecular que menor de aproximadamente 600 kD (por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 120 a aproximadamente 400 kD). Un “azúcar reductor” es uno que contiene un grupo hemiacetal que puede reducir iones de metal o reaccionar covalentemente con lisina y otros grupos amino en proteínas y un “azúcar no reductor” es uno que no tiene estas propiedades de un azúcar reductor. Los ejemplos de azúcares reductores son fructosa, manosa,

10 maltosa, lactosa, arabinosa, xilosa, ribosa, ramnosa, galactosa y glucosa. Los azúcares no reductores incluyen sacarosa, trehalosa, sorbosa, melezitosa y rafinosa. Los ejemplos de alcoholes de azúcar son manitol, xilitol, eritritol, treitol, sorbitol y glicerol. En cuanto a ácidos de azúcar, estos incluyen L-gluconato y sales metálicas de los mismos. En los casos donde se desee que la formulación sea estable a la congelación-descongelación, el poliol preferentemente es uno que no se cristaliza a temperaturas de congelación (por ejemplo, -20°C) de modo que

15 desestabiliza el anticuerpo en la formulación. Los azúcares no reductores incluyen, pero sin limitación, sacarosa y trehalosa.

Tal como se usa en el presente documento, “tampón” se refiere a una solución tamponada que resiste los cambios en el pH por la acción de sus componentes conjugados de ácido-base. El tampón de la presente invención tiene un pH en el intervalo de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 7,0; preferentemente de aproximadamente 4,8 a

20 aproximadamente 6,5. Los ejemplos de tampones que controlarán el pH en este intervalo incluyen acetato (por ejemplo, acetato de sodio), succinato (tal como succinato de sodio), gluconato, histidina, citrato y otros tampones de ácido orgánico. En los casos donde se desee una formulación estable a la congelación-descongelación, el tampón preferentemente no es fosfato.

En un sentido farmacológico, en el contexto de la presente invención, una “cantidad terapéuticamente eficaz” de un

25 anticuerpo se refiere a una cantidad eficaz en la prevención o tratamiento de un trastorno para cuyo tratamiento el anticuerpo es eficaz. Una “enfermedad/trastorno” es cualquier afección que se beneficiaría del tratamiento con el anticuerpo. Esto incluye trastornos o enfermedades crónicas y agudas incluyendo aquellas afecciones patológicas que predisponen al mamífero al trastorno en cuestión.

Un “conservante” es un compuesto que se puede incluir en la formulación para reducir en esencia la acción

30 bacteriana en la misma, facilitando de este modo, por ejemplo, la producción de una formulación multi-uso. Los ejemplos de conservantes potenciales incluyen cloruro de octadecildimetilbencilamonio, cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio (una mezcla de cloruros de alquilbencildimetilamonio en donde los grupos alquilo son compuestos de cadena larga) y cloruro de bencetonio. Otros tipos de conservantes incluyen alcoholes aromáticos, tales como fenol, alcohol butílico y bencílico, alquilparabenos tales como metil-o propilparabeno, catecol, resorcinol,

35 ciclohexanol, 3-pentanol y m-cresol. El conservador más preferido en el presente documento es alcohol bencílico.

La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más anticuerpos, junto con al menos un portador o excipiente fisiológicamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender, por ejemplo, uno o más de agua, tampones (por ejemplo, solución salina tamponada neutra o solución salina tamponada con fosfato), etanol, aceite mineral, aceite vegetal, dimetilsulfóxido, carbohidratos (por ejemplo,

40 glucosa, manosa, sacarosa o dextranos), manitol, proteínas, adyuvantes, polipéptidos o aminoácidos tales como glicina, antioxidantes, agentes quelantes tales como EDTA o glutatión y/o conservantes. Como se señaló antes, otros principios activos pueden (pero no necesariamente) incluirse en las composiciones farmacéuticas proporcionadas en el presente documento.

Un portador es una sustancia que se puede asociar con un anticuerpo antes de la administración a un paciente, a

45 menudo para el propósito de controlar la estabilidad o biodisponibilidad del compuesto. Los portadores para usarse dentro de dichas formulaciones por lo general son biocompatibles, y también pueden ser biodegradables. Los portadores incluyen, por ejemplo, moléculas monovalentes o multivalentes tales como albúmina de suero (por ejemplo, humano o bovino), albúmina de huevo, péptidos, polilisina y polisacáridos tales como aminodextrano y poliamidoaminas. Los portadores también incluyen materiales de soporte sólido tales como cuentas y

50 micropartículas que comprenden, por ejemplo, poliglicolato de poliacetato, poli(lactida-co-glicólido), poliacrilato, látex, almidón, celulosa o dextrano. Un portador puede portar los compuestos en una variedad de maneras, incluyendo unión covalente (ya sea directamente o vía un grupo enlazador), interacción no covalente o mezcla.

Pueden formularse composiciones farmacéuticas para cualquier modo de administración adecuado, incluyendo, por ejemplo, administración ocular, intranasal, ótica, sublingual, transdérmica, tópica, oral, nasal, rectal o parenteral. En 55 determinadas realizaciones, se prefieren composiciones en una forma adecuada para uso oral. Dichas formas incluyen, por ejemplo, píldoras, comprimidos, trociscos, pastillas para chupar, suspensiones acuosas u oleosas, polvos o gránulos dispersables, emulsiones, cápsulas duras o blandas o jarabes o elixires. En otras realizaciones más, las composiciones proporcionadas en el presente documento pueden formularse como un liofilizado. El término

parenteral, tal como se usa en el presente documento, incluye inyección subcutánea, intradérmica, intravascular (por ejemplo, intravenosa), intramuscular, espinal, intracraneal, intratecal e intraperitoneal, así como cualquier técnica de inyección o infusión similar.

En determinadas realizaciones, un anticuerpo de la invención se puede administrar directamente al ojo por inyección

5 al tejido ocular tal como inyecciones perioculares, conjuntivales, “subtenon”, intracamerales, intravitreales, intraoculares, subretinales, subconjuntivales, retrobulbares o intracanaliculares; por aplicación directa al ojo usando un catéter u otro dispositivo de colocación tal como una bola pequeña retinal, inserto intraocular, supositorio o un implante que comprende un material poroso, no poroso o gelatinoso por gotas oculares tópicas o ungüentos; o por un dispositivo de liberación lenta en el cul-de-sac o implantado adyacente a la esclera (tranescleral) o en la esclera

10 (intraescleral) o dentro del ojo. La inyección intracameral puede ser a través de la córnea en la cámara anterior para permitir al agente alcanzar la malla trabecular. La inyección intracanalicular puede estar en los canales colectores venosos drenando canal de Schlemm o en el canal de Schlemm.

Para administración oftálmica, un anticuerpo de la invención se puede combinar con conservadores oftlamológicamente aceptables, so-solventes, agentes tensioactivos, potenciadores de viscosidad, potenciadores de 15 penetración, tampones, cloruro de sodio, o agua para formar una suspensión o solución acuosa, estéril u oftálmica. Se pueden empacar productos oftálmicos tópicos, por ejemplo, en forma de multidosis. Por lo tanto, se pueden requerir conservadores para prevenir contaminación microbiana durante el uso. Los conservadores adecuados incluyen: clorobutanol, metilparabeno, propilparabeno, alcohol feniletílico, edetato disódico, ácido sórbico, policuaternio-1, u otros agentes conocidos a aquellos conocidos en la técnica. Dichos conservadores típicamente se

20 emplean a un nivel de 0,001 a 1,0% p/v. Las composiciones de dosis unitaria de la presente invención serán estériles, pero típicamente no conservadas. Por lo tanto, dichas composiciones por lo general no contendrán conservadores.

En determinadas realizaciones, las composiciones destinadas para administrarse tópicamente al ojo se formulan como gotas para ojos o ungüentos para ojos, en donde la cantidad total de anticuerpo será de aproximadamente

25 0,001 a 1,0% (p/p). Preferentemente, la cantidad de anticuerpo TNFα es de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 1,0% (p/p).

Se administrarán composiciones de la invención en ciertas circunstancias como soluciones para administración tópica. En general se prefieren soluciones acuosas, basándose en facilidad de formulación, así como una habilidad del paciente de administrar con facilidad dichas composiciones por medio de instalar una a dos gotas de las 30 soluciones en los ojos afectados. Sin embargo, las composiciones también pueden ser suspensiones, geles viscosos

o semi-viscosos, u otros tipos de composiciones sólidas o semi-sólidas.

Las composiciones destinadas para uso oral se pueden preparar de acuerdo con cualquier método conocido en la técnica para la fabricación de composiciones farmacéuticas y pueden contener uno o más agentes, tales como agentes edulcorantes, agentes saborizantes, agente colorante, y agentes conservadores a fin de proporcionar 35 preparaciones atractivas y apetecibles. Las tabletas contienen el principio activo en mezcla con excipientes fisiológicamente aceptables que son adecuados para la fabricación de tabletas. Dichos excipientes incluyen, por ejemplo, diluyentes inertes (por ejemplo, carbonato de calcio, carbonato de sodio, lactosa, fosfato de calcio o fosfato de sodio), agentes granulantes y disgregantes (por ejemplo, almidón de maíz o ácido algínico), agentes de unión (por ejemplo, almidón, gelatina o acacia) y agentes lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, ácido esteárico

40 o talco). Las tabletas pueden ser no revestidas o se pueden revestir por técnicas conocidas para retrasar la desintegración y absorción en el tracto gastrointestinal y por tanto proporcionan una acción sostenida sobre un periodo de tiempo más largo. Por ejemplo, se puede emplear un material de retraso de tiempo tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo.

También se pueden presentar formulaciones para uso oral como cápsulas de gelatina dura en donde el principio

45 activo se mezcla con un diluyente sólido inerte (por ejemplo, carbonato de calcio, fosfato de calcio o caolín), o como cápsulas de gelatina blanda en donde el principio activo se mezcla con agua o un medio de aceite (por ejemplo, aceite de cacahuate, parafina líquida o aceite de oliva). Las suspensiones acuosas contienen el anticuerpo en mezcla con excipientes adecuados para la fabricación de suspensiones acuosas. Dichos excipientes incluyen agentes de suspensión (por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato

50 de sodio, polivinilpirrolidona, goma de tragacanto y goma de acacia); y agentes de dispersión y humectantes (por ejemplo, fosfatidas que ocurren de manera natural tal como lecitina, productos de condensación de un óxido de alquileno con ácidos grasos tal como estearato de polioxietileno, productos de condensación de óxido de etileno con alcoholes alifáticos de cadena larga tal como heptadecaetileno-oxietanol, productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y un hexitol tal como monooleato de sorbitol de

55 polioxietileno, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol tal como monooleato de sorbitán de polietileno). Las suspensiones acuosas también pueden comprender uno o más conservadores, por ejemplo, p-hidroxibenzoato de etilo o n-propilo, uno o más agentes colorantes, uno o más agentes saborizantes, y uno o más agentes edulcorantes, tales como sacarosa o sacarina. Se pueden formular jarabes o elíxires con agentes edulcorantes, tales como glicerol, propilenglicol, sorbitol o sacarosa.

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(CO2 y H2O) se restaron del espectro de proteína. Entonces, se corrigió el espectro de proteína resultante respecto del basal y se determinó el espectro de proteína amida I a partir del ancho del pico más amplio en la región esperada. Se obtuvieron segundos espectros derivados del espectro de banda de amida I usando una tercera función polinomial de tercer grado con una función suavizante. Se estimaron cambios en estructura de proteína

5 mediante análisis derivado segundo de amida I usando una curva de calibración lineal para los cálculos de curva iniciales suponiendo 0% de desnaturalización para las 3 mediciones menores y 100% de desnaturalización para las 3 mediciones mayores. Se usaron los perfiles de desnaturalización a puntos medios aproximados de las transiciones de desdoblado térmicas (TM) para cada variante aplicando el modelo sigmoidal de Boltzmann.

Mediciones de solubilidad

10 La solubilidad relativa de varias moléculas scFv se midió después de la agregación de proteína potenciadora y precipitación en presencia de sulfato de amonio. Se agregó sulfato de amonio a la proteína en soluciones acuosas para dar incrementos de un 5% de saturación en la mezcla final de sal-proteína. La precipitación en el intervalo dinámico se determinó empíricamente y los intervalos de saturación reducidos en este intervalo a 2,5% de saturación de intervalos en la mezcla final. Después de adición de sulfato de amonio, las muestras se mezclaron con

15 cuidado y se centrifugaron 30 minutos a 6000rpm. La proteína restante en sobrenadantes se recuperó para cada porcentaje de sulfato de amonio de saturación. Se determinaron curvas de solubilidad al medir la concentración de proteína en el sobrenadante usando NanoDropTM 1000 espectrofotómetro. Se normalizaron las mediciones de proteína soluble restante en sobrenadantes y se usaron para estimar puntos medios de solubilidad relativa para cada variante aplicando el modelo sigmoidal de Boltzmann.

20 Prueba de estabilidad a plazo corto

Se examinó la proteína después de dos semanas de incubación a 40°C para agregados solubles y productos de degradación. Las proteínas con una concentración de 10 mg/ml se dializaron durante la noche a 4°C contra PBS con un intervalo amplio de pH (3,5, 4,5, 5,5, 6,5, 7,0, 7,5 y 8,5). La proteína de control con la misma concentración en PBS tampón estándar (pH 6,5) se almacenó a -80°C durante el periodo de 2 semanas. La determinación de bandas

25 de degradación por SDS-PAGE se hizo a t=0 y t=14d puntos de tiempo y los agregados solubles fueron evaluados en la SEC-HPLC. La determinación de actividad restante después de 2 semanas a 40°C se hizo usando Biacore.

EJEMPLO 1

Optimización de anticuerpo scFv anti-TNFα, 34rFW1.4, para reducir agregación

El anticuerpo 34rFW1.4 muestra una propensión a la agregación dependiente del pH en solución. El anticuerpo

30 578rFW1.4 (véase la solicitud internacional WO2009155724), que comparte la misma estructura que 34rFW1.4, no muestra una propensión a la agregación. Se generaron modelos de homología para identificar restos potenciales en 34rFW1.4 que se podrían modificar para reducir su propensión a la agregación de la siguiente manera.

Se usaron secuencias de dominio variable para construir modelos de homología del anticuerpo 34rFW1.4 y el anticuerpo 578rFW1.4. Para generar los modelos, se usaron búsquedas basadas en el algoritmo BLAST para

35 identificar estructuras de plantilla para las secuencias de dominio variable de cadena ligera (VL) y cadena pesada (VH) para cada anticuerpo por separado. Se usó BLOSUM80 (matriz para menos alineaciones divergentes) como matriz para las alineaciones debido a la alta conservación de las regiones de estructura en anticuerpos. Se seleccionaron las plantillas individuales para cada cadena (VL/VH) que mostraron más de un 70% de identidad respecto de las secuencias de búsqueda.

40 El programa MODELER del software Discovery Studio versión 2.5.5 (DS 2.5.5) (Accelrys, Inc., San Diego, CA) se usó para generar 100 modelos de scFv basándose en las plantillas de dominio variable identificado. La alineación de las secuencias de anticuerpo de referencia a modelarse con estructuras de plantilla se usó como datos de entrada. Se prepararon 100 modelos que contienen todos los átomos de no hidrógeno. Se seleccionaron las mejores estructuras de modelo basándose en una calificación de energía física de PDF (función de densidad de

45 probabilidad). La orientación relativa de dominio VH y VL se ajustó para igualar aquella de la estructura de plantilla de dominio variable con la homología más alta a ambas secuencias modeladas (VL y VH). Se eliminaron conformaciones alternas en el modelo, se agregaron terminales, y se agregaron átomos de cadena lateral faltantes. Se aplicó campo de fuerza CHARMM a los modelos scFv y se sometieron a 2000 ciclos de minimización de energía usando un gradiente RMS de 0,01 y el “born” generalizado con volumen molecular (GBMV) como modelo de

50 solvente implícito.

Se realizaron cálculos de ionización de proteína y resto pK para cada uno de los anticuerpos. Se hicieron los cálculos usando la implementación de protocolo incluido en Discovery Studio versión 2.5.5 (DS 2.5.5), basándose en la teoría desarrollada por Bashford y Karplus, 1991. Los resultados de ionización de proteína y cálculos de resto pK se compararon para las dos moléculas en términos de pK1/2 de las cadenas laterales y curvas de titulación de cada

resto titulable, incluyendo Asp, Glu, Arg, Lys, His, Tyr, Cys, los restos de terminal N y terminal C de los anticuerpos.

Se aplicó campo de fuerza CHARMM a los modelos scFv y se protonaron a pH 7,4, las curvas de titulación y los pK de los restos individuales se calcularon a partir del intervalo de pH 2 a pH 14 usando los pasos de pH de 0,2. Dos restos de Lys conservados en las posiciones 47 y 50 en la cadena ligera del anticuerpo 578rFW1.4 difirieron en

5 comparación con el Lys en aquellas posiciones en el 34rFW1.4 (véase figura 1).

Introducción de sustituciones preferidas

Se usó el software Discovery Studio para conducir simulaciones dinámicas moleculares para predecir mutaciones que mejoran la afinidad de interacción entre VL y VH, así previniendo que los dominios se separen y formando oligómeros y de agregados de orden más alto. La estabilidad de la interfaz de VL/VH del anticuerpo 34rFW1.4 se 10 estimó como términos de energía como energía libre G. Una adaptación de protocolo CHARMM (también incluido en DS 2.5.5) se usó para calcular la diferencia de energía entre el complejo de heterodímero scFv entero y la suma de las energías de cada uno de los dominios variables individuales. Los cálculos se hicieron en el contexto de un método de solvente implícito usando el Born Generalizado con integración de volumen molecular (GBMV). Las energías de ambos dominios y el complejo se calcularon, y la salida se determinó como la diferencia en energía 15 entre el complejo y la suma de los dominios individuales de acuerdo con el siguiente cálculo: G interfaz = G(a) – G(b)

– G(c), en donde G(a) es la energía del anticuerpo, G(b) es la energía de la VL, y G(c) es la energía de la VH.

Se seleccionó arginina (R) como una sustitución de resto posible para la lisina (K) en las posiciones 47 y 50, ya que el valor de pKa de cadena lateral para R (12,5) es mayor que pKa de K (10,5). Se generaron mutantes K47R y K50R al reemplazar K por R individualmente en las posiciones respectivas. 2000 ciclos de minimización de energía se

20 realizaron para restos 10 Angstroms o más cercano al área aproximadamente la mutación para permitir a las nuevas moléculas de modelo adaptarse al cambio. El modelo de solvente implícito para estas rondas de minimización de energía fue GBMV. G delta promedio predicho para los mutantes fue -94 kcal/mol. Por lo tanto, la contribución de las mutaciones fue estimada a 4 kcal/mol en comparación con el anticuerpo scFv anti-TNF parental.

Ejemplo 2

25 Análisis de estabilidad del anticuerpo 34rFW1.4 optimizado

Se generaron el mutante K50R y el mutante K47R en el anticuerpo 34rFW1.4 (que se describe en la solicitud internacional co-pendiente No. PCT/CH2009/000219, presentada el 25 de junio de 2009, los contenidos de la cual se incorporan a la presente por referencia en su totalidad). Otro mutante de 34rFW1.4 teniendo sustituciones adicionales para reducir su inmunogenicidad in vivo se preparó de acuerdo con los métodos descritos en la Solicitud

30 de Patente de los Estados Unidos n.º 12/973.968. En particular, el tercer mutante, designado 34rFW1.4_VLK50R_DHP, contuvo una serina (S) en la posición 12 de cadena pesada (numeración AHo), una treonina (T) en la posición 103 de cadena pesada (numeración AHo), y una treonina (T) en la posición 144 de cadena pesada (numeración AHo). Estudios de estabilidad de los anticuerpos 34rFW1.4 origen y mutantes se realizaron en condiciones aceleradas de la siguiente manera.

35 El anticuerpo 34rFW1.4, mutante 34rFW1.4_VL_K50R, y 34rFW1.4_VLK50R_DHP se concentraron hasta 20, 40 y 60 mg/ml en solución salina regulada con fosfato (50 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, pH 6,5) formulación e incubada 2 semanas a 40°C. Los anticuerpos 34rFW1.4 y 34rFW1.4_K47R se concentraron hasta 20 y 60 mg/ml en solución salina regulada con fosfato (50 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, pH 6,5) formulación e incubada 2 semanas a 40°C. Se analizaron muestras antes y después de 14 días de incubación para degradación usando 12,5% de electroforesis de

40 gel de dodecilsulfato – poliacrilamida de sodio (SDS-PAGE) en condiciones reductoras y no reductoras. Se usó cromatografía líquida de alto rendimiento de exclusión de tamaño (SE-HPLC) para determinar el contenido de monómero y agregados solubles de las muestras antes y después del periodo de incubación. Los monómeros fueron resueltos de especies no monoméricas en una columna TSKgel Super SW2000 (TOSOH Bioscience) y el porcentaje de proteína monomérica se calculó como el área del pico de monómero dividido por el área total de todos los picos

45 de producto. Los resultados de los estudios para 34rFW1.4 y 34rFW1.4_VLK50R_DHP se muestran en las figuras 2A-B, 3A-B y 4A-B, respectivamente. Los resultados para 34rFW1.4_VL_K50R se muestran en las figuras 5B, 6B y 7B. Estos experimentos demostraron que 34rFW1.4_VLK50R_DHP tuvo una propensión a la agregación reducida en comparación con 34rFW1.4. El mutante 34rFW1.4_K47R también demostró dicha reducción como se muestra en las figuras 8B y 9B.

50 Además, se compararon la estabilidad térmica y afinidades de unión de los anticuerpos 34rFW1.4 y 34rFW1.4_VLK50R_DHP. Los resultados demostraron que las mutaciones hechas para generar el anticuerpo 34rFW1.4_VLK50R_DHP no afectaron la estabilidad o actividad de unión con respecto al anticuerpo 34rFW1.4 origen.

Claims (1)

1. imagen1