ES2660468T3

ES2660468T3 - Composición inmunogénica

Info

Publication number: ES2660468T3
Application number: ES12724950.6T
Authority: ES
Inventors: Cindy Castado
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 2011-05-27
Filing date: 2012-05-25
Publication date: 2018-03-22
Anticipated expiration: 2032-05-25
Also published as: EP2714911A2; CN103717742B; SI3564378T1; ES2615737T3; BR112013030395B1; WO2012163817A2; US20170247421A1; BR112013030396A2; CA2837395A1; HUE064492T2; US10377816B2; EP3564378A1; CN103732750A; EP3138916A1; WO2012163810A1; PL2714910T3; US10093722B2; CA2837393A1; ES2743442T3; HRP20170094T1

Abstract

Un polipéptido que comprende un primer fragmento y un segundo fragmento, en el que (i) el primer fragmento es un fragmento del dominio de repetición de la toxina A y comprende al menos 100 aminoácidos; (ii) el segundo fragmento es un fragmento del dominio de repetición de la toxina B y comprende al menos 100 aminoácidos; (iii) el extremo proximal del primer fragmento está situado dentro de una primera porción de repetición; (iv) el extremo proximal del segundo fragmento está situado dentro de una segunda porción de repetición y en el que el primer fragmento y el segundo fragmento están separados por menos de o exactamente 5 aminoácidos en la estructura primaria, en el que el polipéptido provoca anticuerpos que neutralizan la toxina A y la toxina B y en el que la primera porción de repetición y la segunda porción de repetición tienen una identidad de secuencia entre sí superior al 50 %.

Description

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otra cepa. El primer extremo proximal está dentro de una "repetición larga" o una "repetición corta" si el primer fragmento termina en un aminoácido que está dentro de una "repetición larga" o una "repetición corta", de forma similar, el segundo extremo proximal está dentro de un "repetición larga" o una "repetición corta" si el segundo fragmento termina en un aminoácido que está dentro de una "repetición larga" o una "repetición corta".

Las posiciones de los aminoácidos de cada dominio se han definido para la toxina A y la toxina B de la cepa VPI10463 (ATCC43255). Estas son las siguientes

Tabla 1

Nombre: Posición inicial Posición final

ToxA_I: RC1 1832 1852

RC2: 1853 1873

RC3: 1874 1893

RL: 1894 1924

ToxA_II: RC1 1925 1944

RC2: 1945 1965

RC3: 1966 1986

RC4: 1987 2007

RC5: 2008 2027

RL: 2028 2058

ToxA III: RC1 2059 2078

RC2: 2079 2099

RC3: 2100 2120

RC4: 2121 2141

RC5: 2142 2161

RL: 2162 2192

ToxA_IV: RC1 2193 2212

RC2: 2213 2233

RC3: 2234 2253

RC4: 2254 2275

RL: 2276 2306

ToxA_V: RC1 2307 2326

RC2: 2327 2347

RC3: 2348 2368

RC4: 2369 2389

RC5: 2390 2409

RL: 2410 2440

ToxA_VI: RC1 2441 2460

RC2: 2461 2481

(continuación)

Nombre: Posición inicial Posición final

RC3: 2482 2502

RC4: 2503 2522

RL: 2523 2553

ToxA_VII: RC1 2554 2573

RC2: 2574 2594

RC3: 2595 2613

RL: 2614 2644

ToxA_VIII: RC1 2645 2664

RC2: 2665 2686

RC3: 2687 2710

ToxB_I: RC1 1834 1854

RC2: 1855 1876

RC3: 1877 1896

RL: 1897 1926

ToxB_II: RC1 1927 1946

RC2: 1947 1967

RC3: 1968 1987

RC4: 1988 2007

RC5: 2008 2027

RL: 2028 2057

ToxB_III: RC1 2058 2078

RC2: 2079 2099

RC3: 2100 2119

RC4: 2120 2139

RC5: 2140 2159

RL: 2160 2189

ToxB_IV: RC1 2190 2212

RC2: 2213 2233

RC3: 2234 2253

RC4: 2254 2273

RC5: 2274 2293

RL: 2294 2323

ToxB_V: RC1 2324 2343

RC2: 2344 2366

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(Rice P y col., Trends in Genetics 2000 col. 16(6):276-277). Los parámetros anteriormente mencionados son los parámetros predeterminados para las comparaciones de péptidos (junto con la ausencia de penalizaciones para los huecos finales).

En una realización de la divulgación, la primera porción repetida y la segunda porción repetida tienen una alta similitud estructural entre sí. Se puede considerar que dos secuencias tienen una alta similitud estructural cuando su porcentaje de identidad es superior al 40 %, 45 %, 50 % o 60 % (M. Marty-Renom y col., Annu. Rev. Biophys. Biomol Struct. 2000 vol 29:291-325). La presencia de una alta similitud estructural puede determinarse comparando las dos secuencias usando los softwares SwissModel y SwissPDB Viewer.

En una realización de la divulgación, el polipéptido de la invención provoca anticuerpos que neutralizan la toxina A o la toxina B. En una realización adicional de la divulgación, el polipéptido provoca anticuerpos que neutralizan la toxina A. En una realización adicional de la divulgación, el polipéptido provoca anticuerpos que neutralizan la toxina

B. En una realización adicional, el polipéptido provoca anticuerpos que neutralizan la toxina A y la toxina B. La expresión "provoca anticuerpos neutralizantes" significa que cuando las composiciones se usan para inmunizar a un mamífero, por ejemplo un ratón, un cobaya o un ser humano, el mamífero genera anticuerpos neutralizantes.

Se puede medir si un polipéptido provoca anticuerpos neutralizantes contra una toxina inmunizando ratones con una composición inmunogénica que comprende el polipéptido, recogiendo sueros y analizando los títulos de antitoxina de los sueros usando ELISA. Los sueros deben compararse con una muestra de referencia obtenida de ratones que no han sido inmunizados. Un ejemplo de esta técnica se puede encontrar en el Ejemplo 6. El polipéptido de la invención provoca anticuerpos que neutralizan la toxina A si los sueros contra el polipéptido dan una lectura de ELISA mayor que 10 %, 20 %, 30 %, 50 %, 70 %, 80 %, 90 % o un 100 % más alta que la muestra de referencia.

En una realización adicional, el polipéptido de la invención provoca una respuesta inmune protectora en un huésped mamífero contra cepas de C.difficile. La expresión "provocar una respuesta inmune protectora" significa que cuando la composición inmunogénica de la invención se usa para inmunizar un mamífero tal como un ratón, una cobaya o un ser humano, el mamífero genera anticuerpos que pueden proteger al mamífero de la muerte causada por C.difficile. En una realización, el huésped mamífero se selecciona del grupo que consiste en un ratón, un conejo, una cobaya, un mono, un primate no humano o un ser humano. En una realización, el huésped mamífero es un ratón. En una realización adicional, el huésped mamífero es un ser humano.

Se puede determinar si un polipéptido provoca una respuesta inmune protectora en un huésped mamífero contra cepas de C.difficile usando un ensayo de desafío. En dicho ensayo, el huésped mamífero se vacuna con el polipéptido y se desafía por exposición a C.difficile, el tiempo en el que el mamífero sobrevive después de que el desafío se compara con el tiempo que sobrevive un mamífero de referencia que no ha sido inmunizado con el polipéptido. Un polipéptido provoca una respuesta inmune protectora si un mamífero inmunizado con el polipéptido sobrevive al menos 10 %, 20 %, 30 %, 50 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 % más que un mamífero de referencia que no ha sido inmunizado después del desafío con C.difficile. En una realización, el polipéptido de la invención provoca una respuesta inmune protectora contra cepas de C.difficile en un mamífero seleccionado del grupo que consiste en un ratón, una cobaya, un mono o un ser humano. En una realización, el mamífero es un ratón, en una realización adicional, el mamífero es un ser humano.

La estructura nativa de los dominios C-terminal (repetidos) de las toxinas A y B consiste en una estructura de tipo solenoide β extendida. Esta estructura consiste principalmente en estructuras de lámina β, con una minoría de estructuras α helicoidales como se ve en Ho y col.,(PNAS 102:18373-18378 (2005)). Las estructuras secundarias presentes se pueden determinar usando dicroísmo circular. Por ejemplo, midiendo la forma y la magnitud de los espectros de CD en la región de UV lejano (190-250 nm) y comparando los resultados con los de las estructuras conocidas. Esto se puede llevar a cabo usando un trazado óptico de 0,01 cm desde 178 hasta 250 nm, con una resolución de 1 nm y un ancho de banda en un espectropolarímetro Jasco J-720, por ejemplo como se ve en el Ejemplo 5 a continuación.

En una realización, el primer fragmento comprende menos de 28 %, 25 %, 23 %, 20 %, 18 %, 15 %, 10 % o 7 % de estructura secundaria alfa helicoidal. En una realización, el segundo fragmento comprende menos de 28 %, 25 %, 23 %, 20 %, 18 %, 15 %, 10 % o 7 % de estructura secundaria alfa helicoidal. En una realización adicional, tanto el primer fragmento como el segundo fragmento comprenden menos de 28 %, 25 %, 23 %, 20 %, 18 %, 15 %, 10 % o 7 % de estructura secundaria alfa helicoidal.

En una realización, el primer fragmento comprende más de 20 %, 25 %, 28 %, 30 %, 33 %, 35 %, 38 %, 40 % o 42 % de estructura de lámina beta. En una realización, el segundo fragmento comprende más de 20 %, 25 %, 28 %, 30 %, 33 %, 35 %, 38 %, 40 % o 42 % de estructura de lámina beta. En una realización adicional, tanto el primer fragmento como el segundo fragmento comprenden más de 20 %, 25 %, 28 %, 30 %, 33 %, 35 %, 38 %, 40 % o 42 % de estructura de lámina beta.

En una realización, el primer extremo proximal está dentro de la porción de repetición V (aminoácidos 2307-2440 de SEQ ID NO: 1 o sus equivalentes en una cepa diferente), VI (aminoácidos 2441-2553 de SEQ ID NO: 1 o sus equivalentes en una cepa diferente), VII (aminoácidos 2554-2644 de SEQ ID NO: 1 o sus equivalentes en una cepa

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York). La encapsulación dentro de liposomas se describe por Fullerton, Patente de EE.UU. n.º 4.235.877.

En un aspecto de la divulgación se proporciona un kit de vacuna, que comprende un vial que contiene una composición inmunogénica de la invención, opcionalmente en forma liofilizada, y que comprende además un vial que contiene un adyuvante como se describe en el presente documento. Se prevé que en este aspecto de la invención, el adyuvante se use para reconstituir la composición inmunogénica liofilizada.

Un aspecto adicional de la divulgación es un procedimiento para evitar o tratar la infección por C.difficile que comprende administrar al huésped una dosis inmunoprotectora de la composición inmunogénica o la vacuna o el kit de la invención. En una realización, se proporciona un procedimiento para evitar o tratar los episodios primarios y/o de reaparición de la infección por c.difficile que comprende administrar al huésped una dosis inmunoprotectora de la composición inmunogénica o la vacuna o el kit de la divulgación.

Un aspecto adicional de la divulgación es una composición inmunogénica o una vacuna o un kit de la divulgación para su uso en el tratamiento o la prevención de la enfermedad de C.difficile. En una realización, se proporciona una composición inmunogénica o una vacuna o un kit de la divulgación para su uso en el tratamiento o prevención de episodios primarios y/o de reaparición de la enfermedad de C.difficile.

Un aspecto adicional de la divulgación es el uso de la composición inmunogénica o la vacuna o el kit de la divulgación en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de la enfermedad de C.difficile. En una realización, se proporciona una composición inmunogénica o una vacuna o un kit de la divulgación para su uso en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de episodios primarios y/o de reaparición de la enfermedad de C.difficile.

Alrededor de” o "aproximadamente" se definen como dentro del 10 % más o menos de la cifra proporcionada para los fines de la invención.

Las expresiones "que comprende", "comprender", "comprende" en el presente documento están destinadas por los inventores a ser opcionalmente sustituibles por los términos "que consiste en", "consistir en" y "consiste en", respectivamente, en todos los casos. El término “comprende” significa “incluye”. Por tanto, a menos que el contexto requiera otra cosa, la palabra "comprende" y variaciones tales como "comprender" y "que comprende" se entenderá que implican la inclusión de un compuesto o composición indicada (p. ej., ácido nucleico, polipéptido, antígeno) o una etapa o un grupo de compuestos o etapas, pero no la exclusión de cualquier otro compuesto, composición, etapas o grupos de los mismos. La abreviatura, "p. ej.," se obtiene del latín exempli gratia, y se usa en el presente documento para indicar un ejemplo no limitante. Por tanto, la abreviatura "p ej.," es sinónimo del término "por ejemplo".

Las realizaciones en el presente documento relacionadas con las "composiciones de vacuna" de la invención también se aplican a realizaciones relacionadas con "composiciones inmunogénicas" de la invención, y viceversa.

A menos que se explique de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente divulgación. Se pueden encontrar definiciones de términos comunes en biología molecular en Benjamin Lewin, Genes V, publicado por Oxford University Press, 1994 (ISBN 87-9); Kendrew y col., (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicada por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); y Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).

Los términos singulares "un", "una", y "el", "la" incluyen los referentes en plural a menos que el contexto indique claramente otra cosa. De forma análoga, la palabra "o" pretende incluir la palabra "y", a menos que el contexto indique claramente otra cosa. El término "pluralidad" se refiere a dos o más. Se debe entender además que todos los tamaños de bases o tamaños de aminoácidos, y todos los valores de pesos moleculares o de masas moleculares, proporcionados para los ácidos nucleicos o polipéptidos son aproximados, y se proporcionan para la descripción. Además, las limitaciones numéricas proporcionadas con respecto a las concentraciones o niveles de una sustancia, tal como un antígeno, pueden ser aproximadas.

Con el fin de que la presente invención pueda comprenderse mejor, se exponen los siguientes ejemplos. Estos ejemplos son con fines de ilustración únicamente.

Ejemplos

Ejemplo 1: Diseño de cinco fusiones de Tox A-Tox B C.difficile

Se diseñaron proteínas de fusión que contienen los fragmentos de los dominios de repetición C-terminal de ToxA y ToxB. Estas fusiones contenían un fragmento del dominio de repetición C-terminal de ToxA y un fragmento del dominio de repetición C-terminal de ToxB, y una unión entre el extremo C-terminal del fragmento de ToxA y el extremo N terminal del fragmento de ToxB. Se diseñaron dos estrategias, en la primera estrategia; la fusión fue diseñada de tal manera que la larga estructura de solenoide se mantuvo en la unión entre los dos fragmentos. En la

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segunda estrategia, los dos fragmentos de las fusiones están separados por un engarce para permitir su correcto plegamiento independiente.

La parte C-terminal de ToxA y B está compuesta por secuencias repetidas: repeticiones cortas (RC) y repeticiones largas (RL) (PNAS 2005 vol 102: 18373-18378).

La conocida estructura 3D parcial para el dominio C-terminal de ToxA (PNAS 2005 Greco y col., vol 102: 1837318378; Nature Structural & Molecular Biology 2006 vol 13 (5): 460-461; ódigos PDB: 2F6E, 2G7C y 2QJ6).

Los inventores predijeron que hay dos tipos de interacciones importantes entre los restos de la parte C-terminal de ToxA y ToxB. La primera interacción se produce entre los restos contenidos en una RL y su RC anterior y es importante para mantener la estructura de tipo solenoide. El segundo tipo de interacción se produce entre los restos contenidos en una RL y la siguiente RC y esta interacción media la función de unión a carbohidratos de la toxina.

Se definió una nueva repetición RC-RL-RC "estructural-funcional". La estructura de esta repetición se mantuvo intacta en las fusiones diseñadas por los investigadores.

La Figura 2 representa los dominios C-terminales de ToxA y ToxB y el recuadro "RC-RL-RC" definido.

En la Tabla 1 se presentan las posiciones de las repeticiones cortas (RC) y las repeticiones largas (RL) de ToxA y ToxB.

En la Tabla 2 se presenta una lista de los recuadros "RC-RL-RC" contenidos en el dominio C-terminal de ToxA y ToxB.

Tabla 2

Nombre: Posición inicial Posición final

ToxA_1: 1874 1944

ToxA_2: 2008 2078

ToxA_3: 2142 2212

ToxA_4: 2254 2326

ToxA_5: 2390 2460

ToxA_6: 2503 2573

ToxA_7: 2595 2664

ToxB_1: 1877 1946

ToxB_2: 2008 2078

ToxB_3: 2140 2212

ToxB_4: 2274 2343

Finalmente, el número de las RC entre dos RL se mantendrá en las fusiones diseñadas para mantener la larga estructura tipo solenoide.

Antes del diseño de las uniones para las fusiones, se definieron dos hipótesis de trabajo: primera hipótesis, cuanto más cortas son las fusiones, mejor será la probabilidad de que las fusiones sean sobre expresadas de forma estable; segunda hipótesis, de acuerdo con el concepto de recuadros "RC-RL-RC", la posición de inicio tiene que ser elegida con el fin de garantizar un correcto plegamiento de la primera RC de este recuadro RC-RL-RC anteriormente definido. Por tanto las fusiones comienzan a principios de la RC que precede al recuadro RC-RL-RC. Usando estas dos hipótesis, se analizaron tres posiciones de inicio: los restos 2370, 2234 y 2121 de ToxA.

La posición de inicio 2370 fue excluida. La posición de inicio de 2234 también fue excluida debido a que uno de los restos de las interacciones importantes para la estabilidad estructural de la proteína no se conserva. Por lo tanto, se decidió que toda fusión diseñada comenzará en el resto 2121 de ToxA.

Todas las fusiones terminarán en el último resto de ToxB.

Se diseñaron cuatro fusiones (F1-4) con el fin de mantener toda la fusión en una larga estructura de tipo solenoide entre los dos fragmentos de fusión.

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Las fusiones 1 (F1) y 2 (F2) fueron diseñadas usando la misma hipótesis. Todas las secuencias de proteínas RC de ToxA y ToxB habían sido comparadas usando un software de alineamiento múltiple (ClustalW-Thompson JD y col., (1994) Nucleic Acids Res., 22, 4673-4680). Las secuencias más similares fueron la tercera RC VIII de ToxA y la tercera RC II de ToxB y la tercera RC III de ToxB. Con el fin de elegir entre estas dos RC de ToxB, se realizó un modelado de homología estructural (usando el SwissModel interfaz-Arnold K y col., (2006) Bioinformática, 22, 195201) en la parte C-terminal de ToxB usando la estructura 3D conocida del dominio C-terminal parcial de ToxA (código PDB: 2QJ6). Usando la tercera RC VIII de ToxA, la mejor superposición estructural local (se realizó usando SwissPDBViewer-Guex N y col., (1997), Electroforesis 18, 2714-2723) se obtuvo con la tercera RC II de ToxB. Por lo tanto, se diseñaron dos uniones: la primera está entre la tercera RC VIII de ToxA y la cuarta RC II de ToxB (F1) y la segunda está entre la segunda RC VIII de ToxA y la tercera RC II de ToxB (F2). Estas uniones se presentan en la Figura 3 y 4 respectivamente.

Para diseñar la fusión 3 (F3), se realizó una superposición estructural global entre la estructura conocida del dominio C-terminal parcial de ToxA y la estructura prevista del dominio C-terminal de ToxB (usando los softwares SwissModel y SwissPDBViewer). La mejor superposición se encontró entre la RL VII de ToxA y la RL II de ToxB. Por lo tanto, se decidió hacer una unión en esta RL similar. La unión se realizó en primer lugar en una región en la que se conserva la secuencia entre ToxA y ToxB, después de eso, para mantener en la parte de ToxA de la fusión, los restos en interacción con la RC anterior y, por último, para mantener en la parte de ToxB, los restos en interacción con la siguiente RC. Esta unión se presenta en la Figura 5.

Para el diseño de la fusión 4 (F4), el dominio C-terminal de ToxB se dividió en 4 fragmentos y se realizó en ellos un modelado de homología más preciso (SwissModel). La división se realizó con el fin de mantener intactos los recuadros "RC-RL-RC" (cada dominio termina al final de la RC que sigue a una RL). Se realizó una superposición estructural entre las estructuras previstas de estos fragmentos y la estructura tridimensional conocida de ToxA y se obtuvo la mejor superposición estructural de la tercera RC de ToxB (RC I) y la última RC de ToxA (tercera RC VIII). Por lo tanto, la unión se realizó entre la segunda RC VIII de ToxA y la tercera RC I de ToxB. Este diseño se presenta en la Figura 6.

La última fusión (F5) se diseñó con el fin de permitir un plegamiento correcto independiente de los dos fragmentos de la fusión. El engarce se añadió entre el último resto de la secuencia de proteína ToxA y el comienzo de la cuarta RC II de ToxB (siempre teniendo en cuenta la importancia de un recuadro "RC-RL-RC" intacto). Solo un resto exógeno (glicina) se añadió como engarce y se ubicó entre dos glicinas existentes. Por tanto, el engarce también puede describirse que está compuesto por 3 glicinas que rodean la cadena beta conocida (para ToxA) y prevista (para ToxB). Este último diseño se muestra en la Figura 7.

Ejemplo 2: Clonación expresión y purificación de las proteínas de fusión

Plásmido de expresión y cepa recombinante

Los genes que codifican las proteínas de fusión de los dominios C-terminal parciales de ToxA y ToxB (SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6 y 7) y una etiqueta His se clonaron en el vector de expresión pET24b (+) (Novagen) usando sitios de restricción Ndel/Xhol con procedimientos convencionales. La construcción final se generó mediante la transformación de la cepa de E. coli BLR (DE3) con el vector de expresión recombinante de acuerdo con el procedimiento convencional con células tratadas con CaCl2 (Hanahan D. «Transformación de plásmido por Simanis. » en Glover, DM (Ed), Clonación de ADN. IRL Press London. (1985): págs. 109-135).

Cepa huésped:

BLR (DE3). BLR es un derivado recA de BL21. Las cepas que tienen la designación (DE3) son lisogénicas para un profago λ que contiene una ARN polimerasa de T7 inducible por IPTG. Los lisógenos de DE3 λ están diseñados para la expresión de proteínas a partir de vectores pET Esta cepa también es deficiente en las proteasas Ion y ompT.

Genotipo: cepa E.coli BLR:: DE3, F-ompT hsdSB(rB-mB-) gal dcm (DE3) Δ(srl-recA)306::Tn10 (TetR)

Expresión de las proteínas recombinantes:

Un transformante de E.coli se extrajo de una placa de agar y se usó para inocular 200 ml de caldo LBT ± 1 % (p/v) de glucosa + kanamicina (50 μg/ml) para obtener una D.O.600nm entre 0,1-0,2. Los cultivos se incubaron durante una noche a 37 °C, 250 RPM.

Este cultivo de una noche se diluyó a 1:20 en 500 ml de medio LBT que contenía kanamicina (50 μg/ml) y se cultivó a 37 °C a una velocidad de agitación de 250 rpm hasta que la D.O.620nm alcanzó 0,5/0,6.

A una D.O.600nm de alrededor de 0,6, el cultivo se enfrió antes de inducir la expresión de la proteína recombinante mediante la adición de isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido 1 mM (IPTG; EMD Chemicals Inc., número de catálogo: 5815) y se incubó durante una noche a 23 °C, 250 RPM.

Después de la inducción durante una noche (alrededor de 16 horas), se evaluó la D.O.600nm después de la inducción

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y el cultivo se centrifugó a 14 000 RPM durante 15 minutos y los microgránulos se congelaron a -20 °C por separado.

Purificación:

El sedimento bacteriano se volvió a suspender en tampón de bicina 20 mM (pH 8,0) que contenía NaCl 500 mM y una mezcla de inhibidor de proteasa (Complete, Roche). Las bacterias se lisaron usando un sistema French Press 138 MPa. Los componentes solubles (sobrenadante) e insolubles (microgránulos) se separaron por centrifugación, por ejemplo, a 20 000 g durante 30 minutos a 4 °C.

La proteína marcada con 6-His se purificó en condiciones nativas en IMAC. Los componentes solubles se cargaron en una columna GE (15 ml, por ejemplo) (con carga de Ni) equilibrada previamente con el mismo tampón usado para la resuspensión bacteriana. Después de cargar en la columna, la columna se lavó con el mismo tampón. La elución se realizó usando un tampón de bicina 20 mM (pH 8,0) que contenía NaCl 500 mM y diferentes concentraciones de imidazol (5-600 mM). Después del análisis en gel, se seleccionaron las fracciones más puras, se concentraron y se cargaron en cromatografía SEC para la etapa de purificación adicional.

Las fracciones que contienen las proteínas de fusión se seleccionaron sobre la base de la pureza mediante SDS-PAGE y se dializaron frente a tampón de bicina (Bicina 20 mM, NaCl 150 mM, con o sin EDTA 5 mM, pH 8,0), La concentración de proteína se determinó usando el Ensayo de Proteína DC de BioRad. De este modo, las proteínas se combinaron, se esterilizaron por filtración a 0,22 μm, y se almacenaron a -80 °C.

Como alternativa, la purificación de IMAC fue precedida por una etapa de purificación de DEAE usando tampón de bicina 2 mM (pH 8,0) para la carga y el lavado, y se eluyó usando un gradiente con el mismo tampón pero con NaCl 1M añadido.

Ejemplo 3-Clonación expresión y purificación de los fragmentos separados ToxA y ToxB C.difficile

Plásmido de expresión y cepa recombinante.

Los genes que codifican los fragmentos de proteína ToxA y ToxB (SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9) y una etiqueta His se clonaron en el vector de expresión pET24b(+) (Novagen) usando los sitios de restricción NdeI/XhoI con procedimientos convencionales. La construcción final se generó mediante la transformación de la cepa de E. coli BLR (DE3) con el vector de expresión recombinante de acuerdo con el procedimiento convencional con células tratadas con CaCl2 (Hanahan D. «transformación de plásmido por Simanis. » en Glover, DM (Ed), Clonación de ADN. IRL Press London. (1985): págs. 109-135).

Cepa huésped:

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Genotipo: cepa E.coli BLR:: DE3, F-ompT hsdSB(rB mB-) gal dcm (DE3) Δ(srl-recA)306::Tn 10 (TetR) Expresión de las proteínas recombinantes:

A una D.O. a 600 nm de alrededor de 0,6, el cultivo se enfrió antes de inducir la expresión de la proteína recombinante mediante la adición de isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido 1 mM (IPTG; EMD Chemicals Inc., número de catálogo: 5815) y se incubó durante una noche a 23 °C, 250 RPM.

Después de la inducción durante una noche (alrededor de 16 horas), se evaluó la D.O. a 600nm después de la inducción y el cultivo se centrifugó a 14 000 RPM durante 15 minutos y los microgránulos se congelaron a -20 °C por separado.

Purificación:

El sedimento bacteriano se volvió a suspender en tampón de bicina 20 mM (pH 8,0) que contenía NaCl 500 mM suplementado con una mezcla de inhibidor de proteasa (Complete, sin EDTA, Roche cat 11873580001) y benzonasa. (Roche cat 1.01695.0001). Las bacterias se lisaron usando un sistema French Press 2 x 138 MPa. Los componentes solubles (sobrenadante) e insolubles (microgránulos) se separaron por centrifugación a 34 000 g o 48 000 g durante 25-30 minutos a 4 °C. El sobrenadante se recogió y se filtró en un filtro de 0,22 µm.

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La proteína marcada con 6-His se purificó en condiciones nativas en IMAC. Los componentes solubles se cargaron en una columna GE (por ejemplo, 15 ml) (con carga de Ni) equilibrada previamente con el mismo tampón usado para la resuspensión bacteriana. Después de la carga, la columna se lavó con el mismo tampón.

Para Tox A:

La elución se realizó usando un tampón de bicina 20 mM (pH 8,0) que contenía NaCl 500 mM y diferentes concentraciones de imidazol (5-100 mM). Después del análisis en gel, se seleccionaron las fracciones más puras, se concentraron y se cargaron en cromatografía SEC (SUPERDEX™ 75) para la etapa de purificación adicional en el mismo tampón sin imidazol.

Para Tox B:

Se realizó un segundo lavado con tampón de bicina 20 mM (pH 8,0) que contenía NaCl 500 mM y desoxicolato al 0,5 N % o el mismo tampón con NaCl 150 mM. La elución se realizó usando un tampón de bicina 20 mM (pH 8,0) que contenía NaCl 500 mM y diferentes concentraciones de imidazol (10-500 mM). Después del análisis en gel, se seleccionaron las fracciones más puras, se suplementaron con EDTA 5 mM y se cargaron en cromatografía SEC (SUPERDEX™200) para una etapa de purificación adicional en el mismo tampón con EDTA 5 mM.

Las fracciones que contienen fragmentos ToxA o ToxB se seleccionaron sobre la base de la pureza mediante SDS-PAGE y se dializaron frente a tampón de bicina (Bicina 20 mM, NaCl 150 mM, pH 8,0), la concentración de proteína se determinó usando el ensayo de proteína RCDC de BioRad. De este modo, las proteínas se combinaron, se esterilizaron por filtración a 0,22 μm, y se almacenaron a -80 °C.

Ejemplo 4-Evaluación del peso molecular de las cinco fusiones ToxA-ToxB C.difficile

La ultracentrifugación analítica se usa para determinar la homogeneidad y la distribución del tamaño en las solución de las diferentes especies dentro de una muestra de proteína midiendo la velocidad a la que las moléculas se mueven en respuesta a una fuerza centrífuga. Esto se basa en el cálculo de los coeficientes de sedimentación de las diferentes especies que se obtienen por el experimento de la velocidad de sedimentación, que dependen de su forma molecular y masa.

1. Las muestras de proteínas se centrifugan en una ultracentrífuga analítica Beckman-Coulter PROTEOMELAB™ XL-1 a 42 000 RPM después de equilibrar el rotor AN-60Ti a 15 °C.

a.: Proteína de fusión F1, 500 μg/ml, Bicina 20 mM, NaCl 150 mM, pH 8,0

b.: Proteína de fusión F2, 500 μg/ml, Bicina 20 mM, NaCl 150 mM, pH 8,0

c.: Proteína de fusión F3, 500 μg/ml, Bicina 20 mM, NaCl 150 mM, pH 8,0

d.: Proteína de fusión F4, 500 μg/ml, Bicina 20 mM, NaCl 150 mM, pH 8,0

e.: Proteína de fusión F5, 500 μg/ml, Bicina 20 mM, NaCl 150 mM, pH 8,0

2.: Para la recopilación de datos, se registraron 160 exploraciones a 280 nm cada 5 minutos.

3.: El análisis de los datos se realizó usando el programa SEDFIT para la determinación de la distribución C(S). La determinación del volumen específico parcial de las proteínas se realizó con el software SEDNTERP a partir de su secuencia de aminoácidos. SEDNTERP también se usó para determinar la viscosidad y la densidad del tampón.

4.: El peso molecular de las diferentes especies se determinó a partir del diagrama de distribución C(S) (concentración frente a coeficiente de sedimentación), considerando que es una mejor representación de los datos brutos que la distribución C(M) (concentración frente a peso molecular) para caracterizar la distribución de tamaño de una mezcla.

La Figura 8 describe la distribución de las fusiones ToxA-ToxB como se determina por ultracentrifugación analítica de la velocidad de sedimentación.

El peso molecular de la especie principal detectada a partir de la distribución C(S) de las cinco proteínas de fusión ToxA-ToxB corresponde a su forma monomérica. Las mejores relaciones de fricción ajustadas determinadas para las cinco fusiones están todas entre 2 y 2,2. Esto puede indicar que las proteínas están presentes en solución como una forma elongada, que sería consistente con la estructura de la proteína.

Ejemplo 5-Evaluación de las estructuras secundarias y terciarias de las fusiones ToxA-ToxB C.difficile mediante dicroísmo circular y espectroscopia de fluorescencia

El dicroísmo circular se usa para determinar la composición de la estructura secundaria de una proteína midiendo la diferencia en la absorción de la luz polarizada a mano izquierda frente a la luz polarizada a mano derecha que se

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