ES2660456T3

ES2660456T3 - El uso de mezclas sinérgicas de antimicrobianos para controlar microorganismos en procesos industriales

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Publication number: ES2660456T3
Application number: ES14719580.4T
Authority: ES
Inventors: Corinne E. CONSALO; John S. CHAPMAN
Original assignee: Solenis Technologies Cayman LP
Current assignee: Solenis Technologies Cayman LP
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2014-03-14
Publication date: 2018-03-22
Anticipated expiration: 2034-03-14
Also published as: PL2967042T3; EP2967042A2; US20140335203A1; CA2901152A1; TR201802277T4; EP2967042B1; CA2901152C; CN105050399A; BR112015020825A2; BR112015020825B1; UA118554C2; WO2014152572A2; HUE038286T2; WO2014152572A3

Abstract

Uso de una combinación de: (a) dióxido de cloro, y (b) al menos un ácido orgánico que es ácido cítrico o su sal para controlar la concentración de microorganismos indeseables en un sistema acuoso que es un sistema de biorrefinado o sistema de fermentación industrial, donde la relación de dióxido de cloro a ácido orgánico es de 1:1 a 1:15.000; y en donde el dióxido de cloro está a una concentración de 1 a 15 ppm en el sistema acuoso.

Description

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Índice de sinergia = Qa/QA + Qb/QB

donde Qa es la concentración de Antimicrobiano A requerida para lograr la inhibición completa del crecimiento del microbio de ensayo cuando se usa en combinación con Antimicrobiano B;

QA es la concentración de Antimicrobiano A requerida para lograr la inhibición completa del crecimiento del microbio de ensayo cuando se usa solo;

Qb es la concentración de Antimicrobiano B requerida para lograr la inhibición completa del crecimiento del microbio de ensayo cuando se usa en combinación con Antimicrobiano A;

QB es la concentración de Antimicrobiano B requerida para lograr la inhibición completa del crecimiento del microbio de ensayo cuando se usa solo.

Un índice de sinergia (SI) de 1 indica que las interacciones entre los dos antimicrobianos son meramente aditivas, un SI de más de uno indica que los dos antimicrobianos son antagónicos entre sí, y un SI de menos de 1 indica que los dos antimicrobianos interactúan de forma sinérgica.

Aunque existen diversos métodos conocidos por los expertos en la técnica para medir los niveles de actividad antimicrobiana, en los siguientes ejemplos, el punto final utilizado se conoce como Concentración Inhibitoria Mínima,

o MIC, del inglés Minimal Inhibitory Concentration. Esta es la concentración más baja de una sustancia o sustancias que puede lograr la inhibición completa del crecimiento.

Con el fin de determinar la Concentración Inhibitoria Mínima, se construye una serie de dos diluciones del antimicrobiano haciéndose las diluciones en medios de crecimiento. Las diluciones se realizan en una microplaca de 96 pocillos, de modo que cada pocillo tiene un volumen final de 280 μl de medio y antimicrobiano. El primer pozo tiene, por ejemplo, una concentración de 1.000 ppm de antimicrobiano, el segundo 500 ppm, el tercero 250 ppm, y así sucesivamente, con el pocillo 12 y final en la fila que no tiene antimicrobianos en absoluto y que sirve como un control de crecimiento positivo. Después de que se construye la serie de dilución, los pocillos reciben un inóculo de microbio suspendido en medio de crecimiento de modo que la concentración final de microbios en el pocillo es de ~5 x 105 ufc/ml. En estos ejemplos, el microbio de ensayo utilizado es Lactobacillus plantarum. Los cultivos se incuban a una temperatura apropiada durante 18-24 horas, y los pocillos se calificaron como positivos o negativos para el crecimiento en base a un examen visual de pocillos turbios. Un pocillo turbio indica que ha ocurrido crecimiento. La concentración más baja de antimicrobiano que inhibe completamente el crecimiento (por ejemplo, un pocillo transparente) se denomina Concentración Inhibitoria Mínima.

Con el fin de determinar si la interacción entre dos antimicrobianos es aditiva, antagonista o sinérgica frente a un microbio objetivo, se emplea una modificación del método MIC conocido como el método "tablero de ajedrez" utilizando microplacas de 96 pocillos. Para construir una placa de tablero de ajedrez, el primer antimicrobiano se usa utilizando el método de dilución doble en serie utilizado para construir una placa MIC, excepto que cada una de las ocho filas es una serie de dilución idéntica que termina después de la octava columna. El segundo antimicrobiano se usa mediante la adición de volúmenes idénticos de una serie de dilución doble en ángulos rectos a la primera serie. El resultado es que cada pocillo del cuadrado de 8 x 8 pocillos tiene una combinación diferente de concentraciones antimicrobianas, lo que da 64 combinaciones diferentes en total. Las columnas 9 y 10 no reciben antimicrobiano en absoluto y sirven como controles de crecimiento positivo y negativo, respectivamente. Después de construir la microplaca de tablero de ajedrez, se inocula con Lactobacillus plantarum, incubado a 37 ° C, y se puntua como se describe para el método MIC.

Ejemplo 1: Sinergia de dióxido de cloro con ácido cítrico (Ejemplo de referencia)

Se determinaron concentraciones inhibitorias mínimas para el dióxido de cloro y el ácido cítrico a pH 6 utilizando el protocolo descrito anteriormente con Lactobacillus plantarum como el microbio de ensayo. Las placas de sinergia del tablero de ajedrez se construyeron como se describe, los pocillos se inocularon hasta una concentración final de ~ 5 x 105 ufc/ml, se incubaron durante 18-24 horas, y luego se puntuaron visualmente para ver crecimiento/no crecimiento. Los índices de sinergia se calcularon de acuerdo con la fórmula descrita por Kull et al. Este ejemplo demuestra que el efecto de combinar dióxido de cloro y ácido cítrico es mayor que el efecto de cualquiera de los antimicrobianos solos. La cantidad de dióxido de cloro necesaria para inhibir el crecimiento bacteriano se reduce de 100 ppm a 15-60 ppm. La concentración de ácido cítrico cae de 100.000 ppm a un intervalo de 390-12.500 ppm.

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crecimiento/no crecimiento. Los índices de sinergia se calcularon de acuerdo con la fórmula descrita por Kull et al. Este ejemplo demuestra que el efecto de combinar dióxido de cloro y benzoato de potasio es mayor que el efecto de cualquier antimicrobiano solo. La cantidad de dióxido de cloro necesaria para inhibir el crecimiento bacteriano se reduce de 115 o 130 ppm a 0,78 ppm-100 ppm. La concentración de benzoato de potasio desciende de 100.000 ppm a un intervalo de 390 ppm a 50.000 ppm.

Tabla 3

Usado solo: Usado en combinación

MIC de ClO2 (QA) ppm: MIC de benzoato de potasio (QB) ppm MIC de ClO2 (Qa) ppm MIC benzoato potasio ppm de de (Qb) Relación de ClO2: Benzoato de Potasio Índice de Sinergia

115: 100.000 12,5 6.250 1:500 0,17

115: 100.000 25 3.125 1:125 0,25

115: 100.000 25 1.563 1:63 0,23

115: 100.000 25 782 1:31 0,23

115: 100.000 3,125 25.000 1:8000 0,28

115: 100.000 12,5 12.500 1:1000 0,23

115: 100.000 50 6.250 1:125 0,50

115: 100.000 100 3.125 1:31,25 0,90

115: 100.000 100 1.563 1:15,63 0,89

115: 100.000 100 782 1:7,82 0,88

115: 100.000 100 390 1:3,9 0,87

130: 100.000 8 50.000 1:6.250 0,56

130: 100.000 16 25.000 1:1.563 0,37

130: 100.000 16 12.500 1:781 0,25

130: 100.000 63,5 6.250 1:98 0,55

130: 100.000 63,5 3.125 1:49 0,52

130: 100.000 127 1.563 1:12,3 0,99

130: 100.000 127 782 1:6,2 0,99

Ejemplo 4: dióxido de cloro con ácido ascórbico (ejemplo comparativo)

Se determinaron las concentraciones inhibitorias mínimas para el dióxido de cloro y el ácido ascórbico a pH 6 usando el protocolo descrito anteriormente con Lactobacillus plantarum como el microbio de ensayo. Las placas de 10 sinergia del tablero de ajedrez se construyeron como se ha descrito, los pocillos se inocularon hasta una concentración final de ~ 5 x 105 ufc/ml, se incubaron durante 18-24 horas, y luego se puntuaron visualmente para ver

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si crecimiento/no crecimiento. Los índices de sinergia se calcularon de acuerdo con la fórmula descrita por Kull et al. Este ejemplo demuestra que el efecto de combinar dióxido de cloro y ácido ascórbico es antagónico. Por lo tanto, sustituir "cualquier" ácido orgánico junto con dióxido de cloro no es factible u obvio para alguien relativamente experto en la técnica.

Tabla 4

Usado solo: Usado en combinación

MIC de ClO2 (QA) ppm: MIC de Ascórbico ppm ácido (QB) MIC de ClO2 (Qa) ppm MIC de ascórbico ppm ácido (Qb) Relación de ClO2: ácido ascórbico Índice de Sinergia

67,5: 10.000 67,5 5000 1:74 1,50

67,5: 10.000 67,5 2500 1:37 1,25

67,5: 10.000 67,5 1250 1:18,5 1,13

67,5: 10.000 67,5 625 1:9,26 1,06

67,5: 10.000 135 313 1:2,32 2,03

67,5: 10.000 67,5 156,3 1:2,32 1,02

67,5: 10.000 135 78 1,73:1 2,01

67,5: 10.000 135 39 3,46:1 2,00

67,5: 10.000 135 156,3 1:1,16 2,02

67,5: 10.000 67,5 39 1,73:1 1,00

Ejemplo 5: Datos de laboratorio de fermentación

Las muestras ensayadas y sus concentraciones se pueden encontrar en la Figura 1 y en la tabla 5. Se hicieron tres suspensiones de 160 gramos de harina de maíz, agua y enzima (30% p/p de sólidos secos) para cada tratamiento y10 control (inoculados y no inoculados). Las suspensiones se incubaron durante 90 minutos a 83 ° C, se enfriaron a 40 °C, y luego se inocularon con L. plantarum. A continuación, las suspensiones se dosificaron con antimicrobiano. A los 15, 30 y 60 minutos después del tratamiento, se tomaron muestras y se analizaron su viabilidad y azúcares. Todos los matraces de fermentación se mezclaron durante 20 minutos a 40 °C y luego se inocularon con S. cerevisiae y se fermentaron a 32 °C durante 62 horas. Los datos de masa se recogieron a las 0, 17,5, 22,5,

15 42,5, 48 y 64 horas después de la inoculación con levadura. Al finalizar el estudio, se recopilaron datos sobre masa, azúcares y productos, sólidos secos, densidad del filtrado, sólidos disueltos y recuento de bacterias.

Este ejemplo muestra que durante la fermentación, 5 ppm de dióxido de cloro combinado con 200 ppm de ácido cítrico es efectivo en la reducción de bacterias, que fue inesperadamente bajo después de ver la MIC de laboratorio y los datos de sinergia.

20 Tabla 5: Recuento de bacterias (UFC x 106)

15 min: 30 min 60 min 62 horas

Control: 1,20 1,34 10,3 0,0556

5ppm ClO2/200ppm de ácido cítrico: 1,18 1,55 3,62 0,0030

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Claims

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