CN105050399A - 在工业过程中用于防治微生物的包含二氧化氯和有机酸的抗微生物剂协同混合物 - Google Patents
在工业过程中用于防治微生物的包含二氧化氯和有机酸的抗微生物剂协同混合物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供通过抗微生物剂的协同相互作用防治细菌污染的方法。本发明包括二氧化氯和有机酸的组合，它们的组合的抗微生物效应大于它们单独的活性之和，即协同作用。
Description
技术领域
本发明涉及抗微生物剂的协同组合及其在工业过程、材料或产品中在微生物的存在被认为非期望时用于防治该微生物的方法。
背景技术
已知在工业水系统中存在微生物可以是工业过程中的一个重大的问题，导致降低产率、产品品质和过程效率的问题。微生物的物理存在会导致问题，如其在热交换表面上在生物膜中生长，其在此导致传热效率的降低。微生物消耗多种多样的材料的能力会导致产率的降低，例如消耗纤维素的微生物在造纸业中导致产率损失。此外，由污染微生物产生代谢产物会导致问题，例如其产生酸性产物会导致产品品质问题，或者促成腐蚀问题。
然而，在某些工业中，使用微生物生产许多种发酵产品，如工业级乙醇、白酒、啤酒、葡萄酒、药物和保健食品(提供健康益处的食品，如强化食品和膳食补充剂)、烘焙工业和工业化学品。在这些例子中期望的是抑制非期望的微生物的生长及促进期望的微生物的生长。在此，非期望的微生物竞争培养基或者产生代谢产物，其干扰期望的产生所期望的最终产品的微生物的生长。
酵母是发酵过程中常用的微生物。一种常用的酵母是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、主要用于烘焙和发酵的物种。非酵母菌属酵母也称作非传统酵母，也用于生产许多种商业产品。
其他微生物也可用于生产发酵产品。例如，纤维素乙醇生产，由纤维素生物质生产乙醇，是使用真菌和细菌。这些分解纤维素真菌的例子包括里氏木霉(Trichodermareesei)和绿色木霉(Trichodermaviride)。用于纤维素乙醇生产的细菌的一个例子是永达尔梭菌(ClostridiumIjungdahlii)。
大多数用于酿酒厂和燃料乙醇厂的酵母购自特殊酵母的生产商。该酵母是通过繁殖过程生产的。繁殖涉及由小实验室酵母培养生长大量的酵母。在繁殖期间，向酵母供应通过有氧呼吸最佳生长所需或所期望的氧、氮、糖、蛋白质、脂质和离子。
以前在酿酒厂，可以对酵母进行调理(conditioning)。调理与繁殖的区别在于其不涉及由小实验室培养大量生长。在调理期间，提供条件以使酵母再水合，将其由冬眠唤醒，并允许最大的厌氧生长和增殖。繁殖和调理的目的均是以高的存活率、高的出芽率及低水平的被其他微生物的侵染向发酵罐供应大体积的酵母。
在繁殖和/或调理之后，酵母进入发酵过程。酵母在水溶液中与诸如糖的可发酵碳水化合物相结合。酵母消耗糖，将其转化成脂肪醇，如乙醇。
发酵过程以可发酵碳水化合物的制备开始。在乙醇生产中，玉米是可发酵碳水化合物的一种可能的来源。也可以使用其他碳水化合物来源，包括谷粒和含有纤维素-淀粉的材料，如小麦或西非高粱。也可以使用纤维素生物质，如麦秆和玉米秸秆。近年来，纤维素乙醇生产受到关注，因为其使用容易获得的非食物生物质以形成有价值的燃料。
繁殖、调理和发酵过程可以采用分批或连续方法实施。分批过程用于小规模生产。每个批次完成后，开始一个新的批次。连续发酵法用于大规模生产，因为其实现连续供应，无需每次重启。
在繁殖、调理或发酵过程中，醪液或发酵混合物可能变得被其他微生物如腐败菌污染。这些微生物与期望种的酵母竞争可发酵糖，及延缓所期望的生物化学反应，由此降低产率。它们还会产生非期望的化学副产物，其会导致整个发酵批次酸败。
乙醇生产者尝试增加由一蒲式耳谷粒(约56磅(25.4千克))产生乙醇的量。被细菌污染会降低酵母的功效，从而难以达到或超过每蒲式耳2.8至2.9加仑乙醇(0.42至0.44升每千克)的所期望的水平。降低细菌的浓度会促进酵母繁殖和/或调理及提高酵母功效，从而能够达到和超过这些所期望的水平。
在这三个过程任一期间，酵母会变得被非期望的酵母、细菌或其他非期望的微生物污染。这会在用于繁殖、调理或发酵的许多容器之一中发生。其包括但不限于繁殖罐、调理罐、发酵剂罐、发酵罐以及在这些单元之间的管线和热交换器。
细菌污染以三种主要的方式降低发酵产率。首先，可用于酵母生产酒精的糖被细菌消耗及偏离酒精生产，降低产率。其次，细菌代谢的最终产物如乳酸和乙酸抑制酵母生长及酵母发酵/呼吸，这导致较低效率的酵母生产。最后，细菌与酵母竞争除糖以外的营养素。
在发酵系统或容器变得被细菌污染之后，这些细菌的生长可以远远快于所期望的酵母。该细菌与酵母竞争可发酵糖，及延缓所期望的生物化学反应，由此降低产率。细菌还产生非期望的化学副产物，其会导致整个发酵批次酸败。去除这些细菌允许所期望的酵母茁壮成长，这产生更高的生产效率。
乙醇产率仅降低百分之一也是对燃料乙醇工业特别重要的。在较大的设备中，这样的效率下降会导致每年1百万至3百万美元的收入减少。
在繁殖、调理和发酵期间减少细菌的一些方法的优点在于酵母相对于其他微生物具有更高的温度和pH耐受性。这是通过施加热量或降低酵母溶液的pH实现的。然而，这些方法对于延缓细菌生长不是完全有效的。此外，所期望的酵母在存活期间被压制，不被认为是有活力或健康的，也不能发挥作用。
在乙醇工业中主要趋势是在发酵开始时降低醪液(原料)的pH至小于4.5。降低醪液的pH会减少一些种的细菌的种群数量。然而减少成问题的细菌的功效明显更低，如乳酸生成菌或乙酸生成菌。由于用于乙醇生产的酵母被压制，也显然降低乙醇产率。
另一个方法涉及用磷酸洗涤酵母。该方法不能有效地杀灭细菌。也会压制用于乙醇生产的酵母，从而降低其功效。
另一个方法是在批次之间通过加热或使用苛性化学品以对工艺设备进行杀菌。这在生产期间对于杀灭酵母混合物中的细菌是无效的。
在另一个方法中，将抗生素添加至酵母繁殖、调理或发酵批次，以使细菌失效。目前，几乎所有的美国生物精炼厂使用抗菌剂，其中许多使用抗生素如维吉尼霉素。玉米生物精炼的一种重要产品是用作动物饲料的干酒糟，不含抗生素的饲料谷物的市场在增长。预计FDA很快会出台减少或消除在动物饲料中使用抗生素的规定。加拿大类似地关注酒糟中的抗生素，其大多数生产用于出口。欧洲已经禁止在生产酒糟用于动物饲料的乙醇厂使用抗生素。在巴西，在生产用于出口的酵母提取物的工厂以不含抗生素的方式操作是强制性的。酒糟销售占乙醇厂收益的高达20％。副产物中的抗生素浓度可以在由1至3重量％的范围内，因此丧失了这一重要的收入来源。
此外，在使用抗生素时还要考虑其他问题。抗生素的混合物应当频繁地加以平衡和改变，以避免单独使用，这会导致抗生素耐药性菌株。有时不能将有效量的抗生素添加至发酵混合物。例如，使用超过2mg/L的维吉尼霉素会抑制发酵，但是要求超过25mg/L以抑制融合魏斯氏菌(Weisellaconfusa)的生长，其是新出现的成问题的细菌菌株。过度剂量或过度使用抗生素会压制酵母，及损害功效，或导致不符合规定。
将发酵用于饮料的工业在历史上将酒花酸用于繁殖和发酵以防治与酵母竞争营养素的非期望的微生物。随着近年来燃料乙醇的扩展，以较低的程度使用酒花酸，以针对非期望的革兰氏阳性微生物。在酵母与非期望的微生物之间的竞争导致燃料乙醇的产率损失，这是因为非期望的微生物主要是乳杆菌(Lactobacillus)及醋杆菌(Acetobacter)降低发酵的功效。在饮料中，竞争微生物不仅降低功效，而且可以改变最终产品的美观和味道。
在发酵过程中使用抗生素以防治非期望的细菌的另一种替代方案是使用二氧化氯。二氧化氯是一种氧化性抗微生物剂，通常于原位产生，可以施用在发酵过程中的若干个按计量给料位点。大体积的待处理的系统以及目前生产二氧化氯的系统的有限的生产能力往往限制了可用该方法处理或者要求配置多个发生器的发酵系统。
因为乙醇产率的小幅下降也是对燃料乙醇工业特征重要的，所以乙醇生产者总是寻找提高功效的途径。使用抗微生物剂以消除、减少或控制含水系统中微生物的数量。然而，使用抗微生物剂总是会增加运行和产品的成本，因此寻找实现微生物防治的更有效的途径。此外，一些抗微生物剂可能在其抗微生物作用范围方面具有缺陷或者在其施用方式方面具有操作限制，如缺乏温度稳定性或者易于由于环境或化学因素而灭活。此外，在使用二氧化氯或其他原位产生的抗微生物剂的设备的实例中，对能够产生的抗微生物剂的体积的限制可以是巨大的。
因此，可以使用抗微生物剂的组合，特别优选为抗微生物剂的协同组合。抗微生物剂的协同组合可提供的抗微生物效应大于单种抗微生物剂之和，因此与仅是抗微生物功效方面的添加剂的组合相比，可以提供提高的性能价格比。此外，其中之一是原位产生的抗微生物剂的抗微生物剂协同组合可以减小抗微生物剂所要求的体积，因此增大可处理的系统的最大尺寸。
使用抗生素的一种潜在的替代方法是使用抗微生物的有机酸，其用作食品防腐剂，因此打消了其存在于酒糟中的考虑。有机酸具有许多应用，包括用作酸化剂、缓冲剂、抗氧剂、螯合剂、增效剂、膳食补充剂、调味剂、防腐剂和抗微生物剂。有机酸由于其对细菌的作用而用作防腐剂。该方法的一个潜在的缺点是它们单独使用时比较高的水平和所需的体积。
抗微生物剂的协同组合可提供的抗微生物效应大于单种抗微生物剂之和，因此与仅是抗微生物功效方面的添加剂的组合相比，可以提供提高的性能价格比。
附图说明
图1所示为在添加抗微生物剂之后随时间的细菌数。
具体实施方式
出于本说明书的目的，“微生物”和“微生物”的含义包括但不限于细菌、真菌、藻类、原生动物和病毒。所述组合物对其有效的优选的微生物是细菌。非期望的细菌的例子包括但不限于乳酸菌、醋酸菌以及污染乙醇发酵过程的细菌。还应当理解，含水系统中的微生物可以位于或悬浮在流体中(例如浮游)或者位于与含水系统接触的表面上(例如生物膜)。词语和短语“防治”、“微生物防治”、“防治”和“抗微生物功效”在其含义中应当解释为包括但不限于抑制微生物生长、杀微生物、灭菌、保存、消毒或防止微生物二次生长。
作为在此使用的ppm是作为单位体积的重量测量的，或者1ppm等于每升1mg(活性物质)。
作为在此使用的术语“有机酸”还涉及其盐。
本发明提供协同抗微生物剂组合，包括二氧化氯和至少一种有机酸，及使用二氧化氯和至少一种如下有机酸的组合的方法，如柠檬酸、丙酸或苯甲酸、优选柠檬酸。有机酸可以其酸的形式或其盐的形式使用。这些组合可用于防治含水系统和产品中的微生物。本发明能够在工业过程、材料或产品中在其存在被认为非期望时显著减少污染菌的数量。
本发明提供二氧化氯和有机酸的协同抗微生物的组合物，及使用二氧化氯和至少一种有机酸的组合以防治微生物生长的方法。这些组合物可用于防治在水、含水系统和产品中，尤其是生产乙醇或其他化学品的生物精炼工业中的微生物。该组合物包含二氧化氯连同有机酸，如柠檬酸、丙酸或苯甲酸。所述组合包括所述酸或它们的盐。
在一些实施方案中，本发明的组合物包含：二氧化氯连同柠檬酸、丙酸或苯甲酸或它们的盐。
本发明的发明人发现，使用二氧化氯和至少一种有机酸的组合，在含水系统中提供协同微生物防治。因此，组分的组合改善了抗微生物功效，超出基于其单独的抗微生物功效之和的预期。该出人意料地观察到的协同作用允许在工业过程中如生物精炼或期望的材料中使用减少的量的抗微生物剂以实现可接受的微生物防治。
所用的二氧化氯可以通过亚氯酸盐或氯酸盐或其他培养基的化学转化原位产生，通过电化学生成，或者可以通过二氧化氯的稳定化配制提供。在实施例中使用的有机酸包括柠檬酸、丙酸和苯甲酸，但是预期可以包括其他具有相似的抗微生物机制的有机酸，或者用作抗菌剂。也可以使用这些酸的盐。
在原位产生抗微生物剂的例子中，如二氧化氯，减少所需的抗微生物剂的量允许组合地用于系统中，否则其体积需求过大以致无法单独用二氧化氯处理。
组合物组分可以作为单独的混合物配制，及添加至待处理的系统。它们也可以在原位产生二氧化氯之后混合，及添加至所述系统，或者它们可以相继地或者在该过程的不同位置添加。本领域技术人员能够容易地针对各种待处理的系统确定适当的添加方法。
用于降低含水系统中的非期望的微生物浓度的本发明方法的一个非限制性的实施方案包括：
(a)将二氧化氯引入待处理的系统中
(b)将有机酸引入待处理的系统中，
其中在待处理的含水系统中二氧化氯的浓度为至少1ppm，二氧化氯与有机酸的比例为由1:1至1:15,000。
适当地，可用于本发明的有机酸的非限制性例子包括但不限于柠檬酸、苯甲酸、丙酸、酒石酸、乙酸、苯磺酸、草酸、苹果酸、水杨酸、乳酸葡萄糖酸、羟基乙酸及它们的盐。出于本发明的目的，所述有机酸不是酒花酸。优选的有机酸包括柠檬酸、丙酸及苯甲酸或它们的盐。柠檬酸(或其盐)是更优选的有机酸。
本发明的一个实施方案包括柠檬酸或其盐作为有机酸。
本发明的一个实施方案包括丙酸或其盐作为有机酸。
本发明的一个实施方案包括苯甲酸或其盐作为有机酸。
其中可使用所述组合物的含水系统的例子是生物精炼过程、工业发酵、冷却水、锅炉水、纸浆和造纸厂水、油气田注射水和采出水、油气管道和储存系统、燃料、压载水、废水、巴氏灭菌器、其他工业工艺用水、金属调理液、胶乳、聚合物、油漆、涂料、粘合剂、油墨、个人护理和家用产品、反渗透系统、电化学沉积系统、用于矿物提取的流体、矿浆、农产品调理、生物精炼水以及使用它们的系统。此外，所述组合物可用于其他发生含水系统的微生物污染的领域。其中使用所述组合物的优选的系统是生物精炼或工业发酵系统。
待处理的含水系统的pH一般为由3至11，或由3至7，或由4至9，或由4至8，或由4至6.5，或由4.5至6。一般而言，有机酸在如下系统中功效最大，其中该系统的pH小于或等于该酸或其盐的至少一个pKa值。
该组合物的组分可以相继地添加至待处理的含水系统，或者先组合，然后添加至待处理的系统。有机酸可以添加至含水侧系统(aqueoussidesystems)，包含其他添加剂，例如但不必然限制于表面活性剂、阻垢和防腐化合物、离子或非离子聚合物、pH调节剂及其他用于改变或修饰含水系统的化学性质的添加剂。
将二氧化氯(ClO2)以二氧化氯与有机酸的由1:1至1:15,000的比例、或由1:1直至1:10,000的比例、或由1:1至1:2000的比例、或由1:1至1:1000的比例、或由1:4至1:15,000的比例、或由1:4直至1:10,000的比例、或由1:4至1:2000的比例、或由1:4至1:1000的比例、或由1:20至1:100的比例添加至待处理的系统。
本领域技术人员能够容易地确定所需的组合物的浓度，以实现可接受的微生物防治，该浓度取决于基质。在待处理的系统中二氧化氯的使用量可以为由1ppm至150ppm。在待处理的含水系统中二氧化氯的使用量可以为由1ppm至75ppm，或由1ppm至50ppm，或由1ppm至15ppm，或由3ppm至50ppm，或由3ppm至15ppm，或由3至9ppm。一般将至少1ppm、或至少3ppm、或至少5ppm、或至少7ppm的二氧化氯用于所处理的系统中。二氧化氯与至少一种有机酸的比例可以为由1:1直至1:15,000，或由1:1至1:10000的比例，或由1:1至1:2000的比例，或由1:1至1:1200的比例，或由1:4至1:15,000的比例，或由1:4至1:10000的比例，或由1:4至1:2000的比例，或由1:4至1:1000的比例，或由1:20至1:100的比例。
在一个实施方案中，二氧化氯与有机酸的比例可以为由1:4直至1:100，或由1:4至1:50或由1:4至1:15的比例。在待处理的含水系统中二氧化氯的使用量为由1ppm至50ppm，或由1ppm至15ppm，或由1ppm至10ppm，或由3ppm至9ppm。
在一个实施方案中，有机酸为柠檬酸或其盐，二氧化氯的比例可以为由1:1直至1:15,000，或由1:1至1:10,000、或由1:1至1:5000、或1:1至1:2000、或由1:1至1:1000、或由1:4至1:15,000的比例，或由1:4至1:2000的比例，或由1:4至1:1000、或由1:20至1:100的比例。在待处理的含水系统中柠檬酸的使用量可以为由6250低至100ppm，或由4000低至100ppm，或由4000低至200ppm。在待处理的含水系统中一般使用至少100ppm、或至少200ppm、或至少300ppm的柠檬酸。
在一个实施方案中，所述有机酸是丙酸或其盐，二氧化氯与丙酸的比例为由1:4至1:1000，该组合物包含由1至50ppm的二氧化氯，或由3至15ppm的二氧化氯，或由3至9ppm的二氧化氯。
在一个实施方案中，所述有机酸是苯甲酸或其盐，二氧化氯与苯甲酸的比例为由1:1至1:10,000，该组合物包含由1至150ppm的二氧化氯，或由1至50ppm的二氧化氯，或由1至20ppm的二氧化氯。
本发明提供协同抗微生物剂组合及将其用于防治微生物的方法，例如在产生乙醇或其他化学品的工业发酵中。
在用于发酵系统中时，二氧化氯和有机酸的组合可以在发酵系统的不同位置添加，例如可以在发酵过程中的单个或多个位置添加，包括一个或多个浆料罐、烹煮器、醪液冷却器、繁殖器及发酵罐。本领域技术人员也可以确定其他的添加位置。
在采用本发明方法的发酵系统中，可以降低细菌及其他非期望的微生物的浓度，同时促进所期望的微生物的繁殖和/或调理。本发明的发明人发现，二氧化氯连同至少一种有机酸有效地降低了非期望的细菌及其他非期望的微生物的浓度，同时促进所期望的微生物的繁殖和/或调理。这些产品的组合提供协同的抗微生物处理，无需使用抗生素。
在含水系统中用于降低非期望的微生物浓度、促进所期望的微生物繁殖及提高所期望的微生物功效的本发明方法的一个非限制性的实施方案包括：
(a)将可发酵碳水化合物引入含水系统中，
(b)将至少一种酵母或所期望的微生物引入所述含水系统中，及
(c)将二氧化氯和至少一种有机酸引入所述含水系统中。
优选的有机酸包括柠檬酸、丙酸及苯甲酸或它们的盐，更优选为柠檬酸。
在含水系统中用于降低非期望的微生物浓度、促进酵母繁殖及提高酵母功效的本发明方法的另一个非限制性的实施方案包括
(a)将一定量的可发酵碳水化合物引入含水系统中，
(b)将一定量的酵母引入所述含水系统中，及
(c)将二氧化氯和至少一种有机酸引入所述含水系统中。
优选的有机酸包括柠檬酸、丙酸及苯甲酸或它们的盐，更优选为柠檬酸。
该方法的步骤可以相继地实施或以不同的顺序实施。二氧化氯和有机酸可以与酵母或者与发酵碳水化合物接触，或者可以将酵母和可发酵碳水化合物组合，然后将二氧化氯和有机酸引入酵母和碳水化合物的组合。二氧化氯和有机酸可以组合在一起，然后添加至含水系统，或者可以将它们分离地添加至含水系统。该含水系统可以在连续过程中，或者在分批过程的情况下可以是一个罐。
在该方法中，有意要减少的“非期望的”微生物与促进所期望的发酵过程的所期望的微生物竞争营养素。在此，在本发明方法中使用的二氧化氯和有机酸优选不会不利地影响所期望的促进发酵的微生物的生长和存活率，但是要消除或抑制干扰发酵过程的非期望的微生物的生长。此外，非期望的微生物的消除或抑制有利地影响所期望的微生物的生长和存活率。
二氧化氯也可以连同至少一种有机酸、优选柠檬酸一起用于处理用于洗水果和蔬菜的水。虽然二氧化氯在某些情况下单独用于洗水果和蔬菜，但是存在高有机质负载通常要求高浓度的二氧化氯才是有效的。二氧化氯和至少一种有机酸、优选柠檬酸的协同组合意味着，以降低的抗微生物剂水平可以实现更大的抗微生物效应。水果和蔬菜一般是通过喷洒或将水果或蔬菜浸没在抗微生物剂的水溶液中而洗涤的，其中抗微生物剂的浓度如上所述。二氧化氯和至少一种有机酸、优选柠檬酸的另一个应用是生产用于制备调理食品或饮品的水，或食品卫生应用，如在隧道式巴氏灭菌器中保存洗涤水。一般而言，二氧化氯可以连同至少一种有机酸、优选柠檬酸一起用于其中抗菌剂的分解仅产生盐、水和期望的食品添加剂的应用。
通过酵母发酵生产燃料乙醇用作其中可以使用本发明的一个例子。可以使用二氧化氯连同至少一种有机酸、优选柠檬酸、丙酸或苯甲酸的组合的其他发酵产品可以包括白酒、啤酒、葡萄酒、药物、药物中间体、烘焙产品、保健食品(提供健康益处的食品，如强化食品和膳食补充剂)、保健食品中间体、化工原料及酶。本发明方法也可用于处理在烘焙工业中使用的酵母。
酵母并不是唯一有益的在发酵中使用的微生物。也可以使用额外的所期望的发酵微生物，并受益于本发明，如典型地用于纤维素乙醇生产的真菌和细菌。所期望的发酵微生物的一些非限制性例子包括但不限于里氏木霉(Trichodermareesei)、绿色木霉(Trichodermaviride)和永达尔梭菌(ClostridiumIjungdahlii)。
二氧化氯可以连同有机酸一起在不同位置加入繁殖、调理和/或发酵过程中。二氧化氯可以连同有机酸一起添加至烹煮容器、发酵罐、繁殖罐、调理罐、发酵剂罐或者在液化期间。二氧化氯也可以连同有机酸一起直接添加至玉米醪。二氧化氯也可以连同有机酸一起添加至级间的热交换系统或热交换器。二氧化氯也可以连同至少一种有机酸一起添加至在这些单元或热交换器之间的管线。至少一种有机酸优选为柠檬酸、丙酸或苯甲酸。
二氧化氯可以连同有机酸一起直接添加至发酵混合物中。这可以例如在SSF(同时糖化和发酵)阶段中通过将二氧化氯和有机酸连同酵母或其他期望的微生物和可发酵碳水化合物一起添加而实现。在1与100ppm之间的二氧化氯剂量以及在1与15,000ppm之间或在1至2000ppm之间的有机酸剂量可以直接加入发酵混合物中。
二氧化氯也可以连同有机酸一起在发酵过程之前添加至醪液。在1与100ppm之间的二氧化氯剂量以及在1与15,000ppm之间或在1至2000ppm之间的有机酸剂量可以在发酵之前添加至醪液。
二氧化氯也可以连同有机酸一起在繁殖和/或调理期间进行添加。
二氧化氯可以连同有机酸一起用于在纤维素乙醇生产中实现改善的结果。与在基于碳水化合物生产乙醇的过程中使用的糖和淀粉不同，纤维素乙醇是一种由纤维素生产的乙醇。纤维素存在于非传统的生物质来源中，如柳枝稷、玉米秸秆和林业。由于大量可用的纤维素来源，此类乙醇生产是特别有吸引力的。纤维素乙醇由于原材料的特别性质而将更高水平的污染物及竞争微生物引入发酵过程中。二氧化氯可以连同至少一种有机酸一起用于纤维素乙醇生产以防治非期望的微生物。在1与100ppm之间的二氧化氯剂量以及在1与15,000ppm之间或在1至2000ppm之间的有机酸剂量可以直接加入发酵混合物中。至少一种有机酸优选为柠檬酸、丙酸或苯甲酸，更优选为柠檬酸。
有两种由纤维素生产醇的基本方法。一种方法是使用诸如里氏木霉(Trichodermareesei)和/或绿色木霉(Trichodermaviride)的真菌的水解法。另一种是使用诸如永达尔梭菌(ClostridiumIjungdahlii)的细菌的气化法。二氧化氯可以连同至少一种有机酸一起用于任一种方法。至少一种有机酸优选为柠檬酸、丙酸或苯甲酸，更优选为柠檬酸。
在发酵过程之前，在水解过程中纤维素链破碎成五碳糖和六碳糖。这是通过化学方式或酶的方式实现的。
在化学水解方法中，纤维素可以在高的温度和压力下用稀酸处理或者在较低温度和大气压下用浓酸处理。在化学水解过程中，纤维素与酸和水反应生成单个糖分子。然后中和这些糖分子，及采用酵母发酵以生产乙醇。二氧化氯可以连同至少一种有机酸一起在该方法的酵母发酵部分中使用。
可以采用两种方法进行酶解。第一种称作微生物直接转化法(DMC)。DMC法使用单一的微生物以将纤维素生物质转化成乙醇。乙醇和所需的酶是通过相同的微生物产生的。二氧化氯可以连同有机酸一起在使用该专用生物的繁殖/调理或发酵步骤中使用。
第二方法称作酶解法。在该方法中，使用纤维素酶破碎纤维素链。这些酶典型地存在于反刍动物如牛和羊的胃中，以破碎它们吃下的纤维素。酶法典型地在四或五个阶段中进行。对纤维素进行预处理，以使原材料如木材或麦秆更容易发生水解。接着使用纤维素酶将纤维素分子破碎成可发酵糖。在水解之后，将糖从残余物料中分离出并添加至酵母。使用酵母使水解产物糖发酵成乙醇。最后通过蒸馏回收乙醇。替代性地，可以通过使用能够完成这两个过程的特殊的细菌或真菌，一起实施水解和发酵。在这两个步骤一起实施时，该方法称作相继的水解和发酵(SHF)。
为了微生物功效，二氧化氯可以连同有机酸一起在酶解法中的不同位置引入。二氧化氯可以连同有机酸一起用于通过木霉素(Trichoderma)及其他真菌菌株产生的纤维素酶的生产、制造和发酵。二氧化氯可以连同有机酸一起加入纤维素同时糖化和发酵阶段(SSF)中。二氧化氯可以连同有机酸一起引入相继的水解和发酵(SHF)阶段中。它们也可以在通过产生纤维素酶的分解纤维素真菌的发酵之前、期间或之后的位置引入。替代性地，二氧化氯可以连同有机酸一起在酵母发酵阶段中添加，如上所述。
气化过程不会将纤维素链破碎成糖分子。首先，纤维素中的碳在部分燃烧反应中被转化成一氧化碳、二氧化碳和氢。然后将一氧化碳、二氧化碳和氢引入使用能够消耗一氧化碳、二氧化碳和氢以产生乙醇和水的微生物如永达尔梭菌(ClostridiumIjungdahlii)的特殊发酵罐中。最终在蒸馏步骤中从水中分离出乙醇。二氧化氯可以连同有机酸一起在涉及能够消耗一氧化碳、二氧化碳和氢以产生乙醇和水的微生物如永达尔梭菌(ClostridiumIjungdahlii)的发酵步骤中用作抗菌剂。
在一个非限制性的实施方案中，将二氧化氯连同至少一种有机酸一起添加至罐中并以预定的比例稀释至预定的浓度。在该罐中，将二氧化氯连同有机酸一起溶解在水中，以形成二氧化氯连同有机酸的混合物。批料罐中的二氧化氯连同有机酸的浓度可以跨越一个宽的范围改变。然后将二氧化氯连同至少一种有机酸一起通过出口以给定的剂量率由批料罐排出，以产生具有所期望的浓度的溶液。至少一种有机酸优选为柠檬酸、丙酸或苯甲酸，更优选为柠檬酸。
实施例
在以下实施例中报告的协同系数使用下式，其首先报告于F.C.Kull,P.C.Eisman,H.D.Sylwestrowka,andR.L.Mayer,AppliedMicrobiology9:538-541,1961：
协同系数＝Qa/QA+Qb/QB
其中，
Qa是抗微生物剂A在连同抗微生物剂B使用时实现测试微生物生长的完全抑制所需的浓度；
QA是抗微生物剂A在单独使用时实现测试微生物生长的完全抑制所需的浓度；
Qb是抗微生物剂B在连同抗微生物剂A使用时实现测试微生物生长的完全抑制所需的浓度；
QB是抗微生物剂B在单独使用时实现测试微生物生长的完全抑制所需的浓度。
协同系数(SI)为1表明两种抗微生物剂之间的相互作用仅仅是相加的，SI大于1表明两种抗微生物剂彼此是对抗性的，SI小于1表明两种抗微生物剂以协同方式相互作用。
本领域技术人员已知各种不同的方法用于测量抗微生物剂活性水平，在以下实施例中所用的终点称作最小抑制浓度(MinimalInhibitoryConcentration，或MIC)。其是可实现生长的完全抑制的一种或多种物质的最小浓度。
为了确定最小抑制浓度，构建抗微生物剂的2倍倍比稀释系列，稀释物在生长培养基中制备。在96孔微滴定板中制备稀释物，因而每个孔具有最终体积为280μl的培养基和抗微生物剂。第一孔例如具有浓度为1000ppm的抗微生物剂，第二为500ppm，第三为250ppm，以此类推，行中的最后的第12孔根本不具有抗微生物剂，用作正的生长对照。在制定稀释系列之后，孔接收悬浮在生长培养基中的微生物的接种物，因而孔中微生物的最终浓度为约5×105cfu/ml。在这些实施例中，所用的测试微生物是植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)。将培养物在适当温度下孵育18至24小时，基于外观检查混浊的孔，评定孔是正的还是负的生长。混浊的孔表明发生了生长。完全抑制生长的抗微生物剂的最小浓度(例如清澈的孔)被指定为最小抑制浓度。
为了确定两种抗微生物剂之间的相互作用对于目标微生物是相加的，还是对抗性的，还是协同的，使用96孔微滴定板采用称作“棋盘”法的改变的MIC法。为了构建棋盘孔板，使用用于构建MIC孔板的2倍倍比系列稀释法布置第一抗微生物剂，区别在于每8行是相同的稀释系列，其在第8列后结束。通过相对于第一系列以直角添加相同体积的2倍倍比稀释系列布置第二抗微生物剂。结果是8×8孔正方形的每个孔具有不同的抗微生物剂浓度组合，共实现64种不同的组合。第9和第10列根本不接收抗微生物剂，分别用作正和负的生长对照。在构建棋盘微滴定板之后，用植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)接种，在37℃下孵育，如针对MIC法所述进行评定。
实施例1：二氧化氯与柠檬酸的协同作用
针对二氧化氯和柠檬酸在pH为6时使用上述规则测定最小抑制浓度，使用植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)作为测试微生物。如所述构建棋盘协同孔板，对孔进行接种直至约5×105cfu/ml的最终浓度，孵育18至24小时，然后通过外观评定生长/未生长。根据Kull等人所述的公式计算协同系数。该实施例表明，二氧化氯和柠檬酸组合的作用大于单独的抗微生物剂的作用。抑制细菌生长所需的二氧化氯的量由100ppm下降到15至60ppm。柠檬酸的浓度由100,000ppm下降到390至12,500ppm的范围。
实施例2：二氧化氯与丙酸钠的协同作用
针对二氧化氯和丙酸钠在pH为6时使用上述规则测定最小抑制浓度，使用植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)作为测试微生物。如所述构建棋盘协同孔板，对孔进行接种直至约5×105cfu/ml的最终浓度，孵育18至24小时，然后通过外观评定生长/未生长。根据Kull等人所述的公式计算协同系数。该实施例表明，二氧化氯和丙酸钠组合的作用大于单独的抗微生物剂的作用。抑制细菌生长所需的二氧化氯的量由115ppm下降到25ppm和100ppm。丙酸钠的浓度由100,000ppm下降到390ppm至25,000ppm的范围。
实施例3：二氧化氯与苯甲酸钾(苯甲酸)的协同作用
针对二氧化氯和苯甲酸钾在pH为6时使用上述规则测定最小抑制浓度，使用植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)作为测试微生物。如所述构建棋盘协同孔板，对孔进行接种直至约5×105cfu/ml的最终浓度，孵育18至24小时，然后通过外观评定生长/未生长。根据Kull等人所述的公式计算协同系数。该实施例表明，二氧化氯和苯甲酸钾组合的作用大于单独的抗微生物剂的作用。抑制细菌生长所需的二氧化氯的量由115或130ppm下降到0.78ppm至100ppm。苯甲酸钾的浓度由100,000ppm下降到390ppm至50,000ppm的范围。
实施例4：比较例，二氧化氯与抗坏血酸
针对二氧化氯和抗坏血酸在pH为6时使用上述规则测定最小抑制浓度，使用植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)作为测试微生物。如所述构建棋盘协同孔板，对孔进行接种直至约5×105cfu/ml的最终浓度，孵育18至24小时，然后通过外观评定生长/未生长。根据Kull等人所述的公式计算协同系数。该实施例表明，二氧化氯和抗坏血酸组合的作用是对抗性的。因此，替代“任何”有机酸连同二氧化氯，这对于本领域技术人员而言并不是可实现的或显而易见的。
实施例5：发酵实验室数据
所测试的样品及其浓度可见于图1和表5。针对各个处理和对照(接种和未接种)，制备玉米粉、水和酶的三种160克浆料(30％w/w干固体)。将浆料在83℃下孵育90分钟，冷却至40℃，然后用植物乳杆菌(L.plantarum)接种。然后，向浆料按计量添加抗微生物剂。在15、30和60分钟后处理时，提取样品并测试存活率和糖。所有发酵瓶在40℃下混合20分钟，然后用酿酒酵母(S.cerevisiae)接种，在32℃下发酵62小时。在用酵母接种后0、17.5、22.5、42.5、48和64小时的时候采集质量数据。在实验结束时，采集关于质量、糖和产品、干固体、滤液密度、溶解固体和细菌数的数据。
该实施例表明，在发酵期间5ppm二氧化氯与200ppm柠檬酸组合有效地减少细菌，在参看实验室MIC和协同数据后发现这是出人意料地低。
表5：细菌数(CFU×106)
| 15分钟 | 30分钟 | 60分钟 | 62小时 | |
| 对照 | 1.20 | 1.34 | 10.3 | 0.0556 |
| 5ppm ClO2/200ppm柠檬酸 | 1.18 | 1.55 | 3.62 | 0.0030 |
Claims (19)
1.含水组合物，其包含：
(a)二氧化氯，及
(b)至少一种选自以下组中的有机酸：柠檬酸、丙酸或苯甲酸或它们的盐，
其中二氧化氯与有机酸的比例为由1:1至1:15000；所述组合物包含至少1ppm的二氧化氯。
2.根据权利要求1的组合物，其中二氧化氯与有机酸的比例为由1:1至1:2000。
3.根据权利要求1或2的组合物，其中所述组合物包括最多约50ppm的二氧化氯。
4.根据权利要求1至3之一的组合物，其中所述有机酸是柠檬酸或其盐。
5.根据权利要求1至4之一的组合物，其中所述至少一种有机酸是柠檬酸或其盐，二氧化氯与柠檬酸的比例为由1:1至1:1000，该组合物包含由1至50ppm的二氧化氯。
6.根据权利要求1至5之一的组合物，其中所述组合物包括由1至15ppm的二氧化氯或由5至10ppm的二氧化氯。
7.根据权利要求1至3之一的组合物，其中所述至少一种有机酸是丙酸或其盐，二氧化氯与丙酸的比例为由1:1至1:1000，该组合物包含由1至50ppm的二氧化氯。
8.根据权利要求7的组合物，其中所述组合物包括由1至15ppm的二氧化氯或由5至10ppm的二氧化氯。
9.根据权利要求1至3之一的组合物，其中所述至少一种有机酸是苯甲酸或其盐，二氧化氯与苯甲酸的比例为由1:1至1:1,000，该组合物包含由1至50ppm的二氧化氯。
10.根据权利要求9的组合物，其中所述组合物包括由1至15ppm的二氧化氯或由5至10ppm的二氧化氯。
11.控制含水系统中非期望的微生物浓度的方法，该方法包括以下步骤：
(a)将二氧化氯引入含水系统中，及
(b)将有机酸引入所述含水系统中，
其中所述有机酸选自以下组中：柠檬酸、丙酸、苯甲酸及它们的盐，在所处理的含水系统中二氧化氯的剂量率为至少1ppm，二氧化氯与有机酸的比例为由1:1至1:15,000。
12.控制在发酵过程中使用的含水系统中非期望的微生物浓度的方法，该方法包括以下步骤：
(a)将可发酵碳水化合物引入水溶液中；
(b)将至少一种酵母引入所述溶液中；
(c)将二氧化氯和至少一种有机酸引入所述含水系统中，
其中，在所处理的含水系统中二氧化氯的剂量率为至少1ppm。
13.根据权利要求11或12的方法，其中在所处理的含水系统中二氧化氯的剂量率为至少1ppm且最高约50ppm。
14.根据权利要求11或12的方法，其中在所处理的含水系统中二氧化氯的剂量率为至少1ppm且最高约15ppm。
15.根据权利要求11至14之一的组合物，其中所述有机酸选自以下组中：柠檬酸、丙酸、苯甲酸及它们的盐。
16.根据权利要求11至15之一的方法，其中所述有机酸是柠檬酸或其盐。
17.根据权利要求11至14之一的方法，其中所述至少一种有机酸是柠檬酸或其盐，二氧化氯与柠檬酸的比例为由1:4至1:1000，二氧化氯剂量率为由1至50ppm、或由1至15ppm的二氧化氯、或由5至10ppm的二氧化氯。
18.根据权利要求11至14之一的方法，其中所述至少一种有机酸是丙酸或其盐，二氧化氯与丙酸的比例为由1:4至1:1000，二氧化氯剂量率为由1至50ppm、或由1至15ppm的二氧化氯、或由5至10ppm的二氧化氯。
19.根据权利要求11至14之一的方法，其中所述至少一种有机酸是苯甲酸或其盐，二氧化氯与苯甲酸的比例为由1:4至1:15,000，二氧化氯剂量率为由1至50ppm、或由1至15ppm的二氧化氯、或由5至10ppm的二氧化氯。
Applications Claiming Priority (3)
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|---|---|---|---|
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