ES2652015T3 - Procedimiento para la operativa de un dispositivo de secuenciación - Google Patents

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Abstract

Procedimiento (200) para la operativa de un dispositivo de secuenciación (100) micro-fluídico, que presenta al menos un canal de secuenciación (102) micro-fluídico, que conecta fluídicamente una primera ranura (108) microfluídica a una segunda ranura (110) micro-fluídica, en donde el canal de secuenciación (102) en la zona de la primera ranura (108) está configurado como una cavidad (112) y en la zona de la segunda ranura (110) está configurado como un poro (114), en donde el poro (114) presenta una sección transversal menor que la cavidad (112), en donde el procedimiento (200) presenta los pasos siguientes: alimentación (202) de una solución de muestras (300) en la primera ranura (108), para introducir una célula (302) en la cavidad (112); lisis (204) de la célula (302) en sus componentes celulares, para liberar ADN celular (500) de la célula (302); lavado (206) de la primera ranura (108), para extraer de la cavidad (112) y/o de la primera ranura (108) componentes celulares indeseados de la célula (302) y aislar el ADN (500) en la cavidad (112); llenado (208) de la primera ranura (108) y de la segunda ranura (110) con un tampón de secuenciación (600); y secuenciación (210) del ADN (500) en el poro (114).

Description

DESCRIPCION
Procedimiento para la operativa de un dispositivo de secuenciacion Estado de la tecnica
La presente invention se basa en un procedimiento segun el genero de la reivindicacion independiente. La 5 decodificacion del codigo genetico recibe tambien el nombre de secuenciacion de ADN y se emplea ampliamente en ciencia, medicina y en la medicina forense. Hasta ahora, es imprescindible para la secuenciacion realizar una amplia preparation de las muestras, como lisis y purification, para obtener acidos nucleicos suficientemente puros para la secuenciacion.
De los documentos US 2010/0292101, US 2006/0240543 A1 y DE 10 2013 217 694 A1 se conocen unos 10 dispositivos y procedimientos microfluldicos para el analisis de moleculas o celulas.
Descripcion de la invencion
Ante estos antecedentes, con el planteamiento aqul presentado se presenta un procedimiento para la operativa de un dispositivo de secuenciacion conforme a la reivindicacion principal. Mediante las medidas mencionadas en las reivindicaciones dependientes son posibles perfeccionamientos y mejoras ventajosas del procedimiento expuesto en 15 la reivindicacion independiente.
Se utiliza un dispositivo de secuenciacion que presenta al menos un canal de secuenciacion, que conecta fluldicamente una primera ranura a una segunda ranura, en donde el canal de secuenciacion en la zona de la primera ranura esta configurado como una cavidad y en la zona de la segunda ranura esta configurado como un poro, en donde el poro presenta una section transversal menor que la cavidad.
20 Por dispositivo de secuenciacion puede entenderse un dispositivo para determinar una secuencia de ADN. La secuencia de ADN puede analizarse mediante una instalacion de analisis convencional. Una ranura puede ser un canal para guiar un medio o para guiar varios medios. La primera ranura puede estar configurada en particular mediante una separation entre un cuerpo base del dispositivo y un primer sustrato plano. La segunda ranura puede estar configurada mediante una separacion entre el cuerpo base y un segundo sustrato plano. A este respecto los 25 sustratos pueden estar dispuestos en lados opuestos del cuerpo base. Los sustratos pueden estar dispuestos fundamentalmente en paralelo unos respecto a los otros. Un canal de secuenciacion puede atravesar o abrir el cuerpo base. Una cavidad puede recibir el nombre de depresion (ancha) en un cuerpo base con un paso fluldico en el poro (estrecho), en donde el poro tambien forma una abertura del cuerpo base. La cavidad puede recibir tambien el nombre de pocillo. La seccion transversal del poro es (bastante) menor que la seccion transversal de la cavidad, 30 por ejemplo en un orden de magnitud menor que la seccion transversal de la cavidad. Por seccion transversal puede entenderse de forma visible una superficie de seccion transversal o una separacion entre dos bordes opuestos de la cavidad y/o del poro en la zona de la formation de la seccion transversal. La seccion transversal puede conformar tambien un diametro del canal de secuenciacion, si el canal de secuenciacion presenta una superficie base circular. El poro puede presentar a este respecto una longitud que se corresponda fundamentalmente con una profundidad 35 de la cavidad.
En el caso del de secuenciacion mono-molecular, el modo de ejemplo aqul utilizado, puede prescindirse de una amplification clonal de las moleculas de ADN o acidos nucleicos a secuenciar, con lo que no se produce ningun sesgo en la secuenciacion (del ingles sequencing-bias). Del mismo modo no se precisa ninguna amplificacion en puente (del ingles bridge-amplification). Ademas de esto puede prescindirse de una laboriosa preparacion de 40 muestras.
Se utiliza un entorno micro-fluldico, que hace posible disgregar individualmente celulas de una solution de muestras, purificar ADN y secuenciar individualmente el mismo directamente a continuation en poros posconectados.
El sistema aqul utilizado hace posible una verdadera secuenciacion de celulas aisladas. De este modo se hace posible, mediante la utilization de varios canales de secuenciacion, determinar la heterogeneidad genetica de una 45 solucion de muestras que contenga celulas. Se obtiene una elevada sensibilidad de todo el sistema, ya que puede prescindirse de una purificacion por ejemplo a traves de una columna, con elevadas perdidas de purificacion en el caso de pequenas concentraciones de ADN.
El sistema aqul utilizado permite ademas el analisis de unas cantidades de celulas mlnimas, ya que cada celula puede disgregarse por si misma en un pocillo del conjunto de la matriz (del ingles array) de micro-pocillos y 50 alimentarse a la secuenciacion de nano-poros.
Ya no se necesita una purificacion de muestras especlfica para una secuenciacion, y todos los pasos individuales o procedimientos individuales pueden reproducirse y llevarse a cabo en un unico entorno micro-fluldico. De este modo descienden la propension a las averlas de todo el sistema y la complejidad temporal.
En el sistema aqul utilizado queda descartada una contaminacion de ADN foraneo del ADN a analizar o de las 5 celulas a secuenciar, ya que las lisis celulares se alimentan de forma automatizada e integrada en el verdadero proceso de secuenciacion, con lo que se evitan transmisiones de ADN y contaminaciones, que podrlan influir negativamente en el resultado de la secuenciacion.
La cavidad puede estar configurada para alojar una unica celula. Para ello la cavidad puede ser tan pequena que encaje justo una unica celula. La cavidad puede presentar en particular una seccion transversal de entre un 10 micrometro y trescientos micrometros. La cavidad puede presentar en particular una seccion transversal de entre tres micrometros y 30 micrometros.
La primera ranura y alternativa o complementariamente la segunda ranura pueden presentar una anchura de ranura de entre dos micrometros y un millmetro. La primera ranura y alternativa o complementariamente la segunda ranura pueden presentar en particular una anchura de ranura de entre cinco micrometros y 500 micrometros. En funcion de 15 los medios utilizados para preparar la secuenciacion y para la propia secuenciacion puede adaptarse la anchura de ranura. La anchura de ranura puede estar optimizada para un flujo laminar en las ranuras. En el poro puede estar dispuesto un tramo de la electroforesis. De este modo el dispositivo de secuenciacion aqul presentado puede utilizarse directamente para una electroforesis.
El dispositivo de secuenciacion puede presentar al menos otro canal de secuenciacion. En particular puede estar 20 dispuesto un gran numero de canales de secuenciacion formando una matriz. La matriz puede presentar en particular una densidad de entre 1x103 y 25x106 canales de secuenciacion por centlmetro cuadrado. Mediante muchos canales de secuenciacion pueden llevarse a cabo simultaneamente muchas secuenciaciones. Conforme a la invencion se presenta un procedimiento para la operativa de un dispositivo de secuenciacion micro-fluldico, que presenta al menos un canal de secuenciacion micro-fluldico, que conecta una primera ranura micro-fluldica a una 25 segunda ranura micro-fluldica, en donde el canal de secuenciacion esta configurado en la zona de la primera ranura como una cavidad y esta configurado en la zona de la segunda ranura como un poro, en donde el poro presenta una seccion transversal menor que la cavidad, en donde el procedimiento presenta los pasos siguientes:
alimentacion de una solucion de muestras en la primera ranura, para introducir una celula en la cavidad;
lisis de la celula en sus componentes celulares, para liberar ADN celular de la celula;
30 lavado de la primera ranura, para extraer de la cavidad y/o de la primera ranura componentes celulares indeseados de la celula y aislar el ADN en la cavidad;
llenado de la primera ranura y de la segunda ranura con un tampon de secuenciacion; y secuenciacion del ADN en el poro.
Como solucion de muestras puede alimentarse una solucion acuosa, que contenga celulas.
35 En el paso de la alimentacion puede llevarse a cabo ademas una centrifugacion, una sedimentacion y alternativa o complementariamente un tratamiento de vaclo, para introducir la celula en la cavidad. De este modo las celulas aisladas pueden secuenciarse con disolucion local y acelerarse el proceso de secuenciacion.
En el paso de la lisis puede llevarse a cabo p.ej. una lisis qulmica, una lisis enzimatica, una lisis electrica, una lisis ultrasonica y alternativa o complementariamente una lisis termica, para liberar el ADN celular. En el dispositivo de 40 secuenciacion aqul presentado puede llevarse a cabo y/o combinarse diferentes procedimientos de lisis. De esta forma pueden lisarse diferentes celulas.
En el paso de la lisis puede introducirse una fase organica (es decir un llquido) en la primera ranura. La fase organica puede introducirse en particular con un flujo laminar en la primera ranura. La fase organica puede presentar una solubilidad reducida en la solucion acuosa. Mediante un flujo laminar pueden evitarse arremolinamientos.
45 En el paso del lavado puede introducirse un llquido de lavado en la primera ranura. El llquido de lavado puede introducirse en particular con un flujo laminar en la primera ranura. El llquido de lavado puede extraer o desplazar bien un llquido de lisis. El propio llquido de lavado puede extraerse bien de la ranura. Mediante el flujo laminar pueden evitarse arremolinamientos.
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En el paso de la secuenciacion puede aplicarse una tension electrica entre un primer sustrato, que delimita la primera ranura, y un segunda sustrato que delimita la segunda ranura. Mediante un campo electrico resultante puede secuenciarse el ADN utilizando la electroforesis.
Este procedimiento puede implementarse por ejemplo en software o hardware o en una forma mixta entre software y hardware, por ejemplo en un aparato de control.
En los dibujos se han representado unos ejemplos de realizacion de la invencion, que se explican con mas detalle en la siguiente descripcion. Aqul muestran:
la fig. 1 una exposicion de un dispositivo de secuenciacion;
la fig. 2 un diagrama de desarrollo de un procedimiento para la operativa de un dispositivo de secuenciacion conforme a un ejemplo de realizacion;
la fig. 3 una exposicion de una alimentacion de una solucion de muestras en un dispositivo de secuenciacion conforme a un ejemplo de realizacion;
la fig. 4 una exposicion de una lisis de celulas en un dispositivo de secuenciacion conforme a un ejemplo de realizacion;
la fig. 5 una exposicion de ADN aislado en un dispositivo de secuenciacion conforme a un ejemplo de realizacion; y
la fig. 6 una exposicion de una secuenciacion de ADN en un dispositivo de secuenciacion conforme a un ejemplo de realizacion.
En la siguiente descripcion de unos ejemplos de realizacion favorables de la presente invencion se utilizan, para los elementos representados en las diferentes figuras y que actuan de forma similar, unos slmbolos de referencia iguales o similares, en donde se prescinde de una descripcion repetida de estos elementos.
La fig. 1 muestra una exposicion de un dispositivo de secuenciacion 100. El dispositivo de secuenciacion 100 presenta un gran numero de canales de secuenciacion 120. En el plano de exposicion aqul elegido se han representado unos junto a otros un primer canal de secuenciacion 102a, un segundo canal de secuenciacion 102b, un tercer canal de secuenciacion 102c, un cuarto canal de secuenciacion 102d, un quinto canal de secuenciacion 102e y un sexto canal de secuenciacion 102f. Los canales de secuenciacion 102 estan construidos de la misma forma. Los canales de secuenciacion 102 estan configurados en un cuerpo base 106 en forma de placa. Cada uno de los canales de secuenciacion 102 representa una conexion fluldica entre una primera ranura 108 en un primer lado del cuerpo base 106 y una segunda ranura 110 en un segundo lado opuesto del cuerpo base 106.
El canal de secuenciacion 102 esta configurado en la zona de la primera ranura 108 como una cavidad 112. En la zona de la segunda 110 el canal de secuenciacion 102 esta configurado como un poro 114. A este respecto el poro 114 presenta una seccion transversal (bastante) menor que la cavidad 112. La cavidad 112 esta configurada en particular para alojar una unica celula a secuenciar. Por ejemplo la seccion transversal o el diametro de la cavidad es de 100 a 100.000 veces mayor que la seccion transversal o el diametro del poro.
La primera ranura 108 esta configurada entre el cuerpo base 106 y un sustrato de cubierta 116 y presenta una anchura de ranura, que esta configurada para hacer posible un flujo laminar en la primera ranura 108.
La segunda ranura 110 esta configurada aqul entre el cuerpo base 106 y un sustrato inferior 118. La segunda ranura 110 presenta tambien una anchura de ranura, que esta configurada para hacer posible un flujo laminar o no laminar en la segunda ranura 108.
El sustrato de cubierta 116 presenta una primera conexion electrica 120 para el contactado electrico del sustrato de cubierta 116.
El sustrato inferior 118 presenta una segunda conexion electrica 122 para el contactado electrico del sustrato inferior 118.
Entre los dos contactos 120, 122 puede aplicarse una tension electrica para generar un campo electrico entre el sustrato de cubierta 116 y el sustrato inferior 118.
Se ha representado una seccion transversal mediante un hlbrido 100 entre micro-pocillo y nanoporo. El conjunto de la matriz de micro-pocillos 104 presenta unas cavidades 112 abiertas hacia la superficie del conjunto de la matriz de
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micro-pocillos 104. Las cavidades 112 pueden recibir el nombre de pocillos 112. Al lado inferior de los pocillos 112 se conecta respectivamente un poro 114 o nanoporo 114.
Entre la superficie del micro-pocillo y un sustrato de cubierta 116 existe una ranura micro-fluldica 108 con unas dimensiones de entre dos y 1.000 pm, de forma preferida de cinco a 500 pm. Entre el lado inferior del conjunto de la matriz de micro-pocillos 104 y el sustrato inferior 118 existe tambien una ranura micro-fluldica 110 con unas dimensiones de entre dos y 1.000 pm, de forma preferida de cinco a 500 pm. La separacion se ha elegido de tal manera que se favorece una circulacion laminar. Entre el sustrato de cubierta 116 y el sustrato inferior 118 puede aplicarse un campo electrico.
En el caso del conjunto de la matriz de micro-pocillos 104 aqul presentado las dimensiones de un pocillo 112 pueden ser de entre 500 nm y 300 pm, de forma preferida entre un pm y 30 pm. La densidad del pocillo 112 en el conjunto de la matriz de micro-pocillos 104 puede ser de entre 1x103 y 25x106 pocillos por cm2.
El planteamiento aqul presentado puede utilizarse para sistemas anallticos, en particular para sistemas de laboratorio en chip (del ingles lab-on-chip) para el analisis del medio ambiente o la diagnosis medica.
La fig. 2 muestra un diagrama de desarrollo de un procedimiento 200 para la operativa de un dispositivo de secuenciacion conforme a un ejemplo de realizacion. El procedimiento 200 puede llevarse a cabo en un dispositivo de secuenciacion, como se ha representado en la fig. 1. Para ello el dispositivo de secuenciacion esta conectado a un dispositivo para la operativa del dispositivo de secuenciacion. El dispositivo de secuenciacion esta construido en particular como un cartucho de un solo uso, que esta conectado al dispositivo a traves de unos adaptadores para hacerlo funcionar.
El procedimiento 200 presenta un paso 202 de la alimentacion, un paso 204 de la lisis, un paso 206 del lavado, un paso 208 del llenado y un paso 210 de la secuenciacion. En el paso 202 de la alimentacion se inserta una solucion de muestras en la primera ranura, para introducir una celula aislada al menos en una de las cavidades. Por ejemplo para la alimentacion se establece una baja presion en la primera ranura, para aspirar la solucion de muestras en la primera ranura y con ello en las cavidades. La solucion de muestras puede tambien introducirse a presion en la primera ranura mediante una sobrepresion. Alternativamente puede atraerse la solucion de muestras hasta la ranura mediante una sobrepresion. En el paso 204 de la lisis se descompone la al menos una celula dentro de su cavidad en sus componentes celulares, para liberar ADN celular de la celula. La lisis puede realizarse de diferentes formas. En el paso 204 de la lisis puede llevarse a cabo por ejemplo una lisis qulmica, una lisis enzimatica, una lisis electrica, una lisis ultrasonica y alternativa o complementariamente una lisis termica, para liberar el ADN celular. En el paso 206 del lavado se lava la primera ranura, para extraer de la cavidad y alternativa o complementariamente de la primera ranura componentes celulares indeseados de la celula y aislar el ADN en la cavidad. En particular puede conducirse un fluido de lavado a traves de la primera ranura, que extrae selectivamente todos los componentes celulares menos el ADN desde la cavidad. En el paso 208 del llenado se llenan la primera ranura y de la segunda ranura con un tampon de secuenciacion. Como en el paso 202 de la alimentacion el tampon de secuenciacion puede aspirarse, respectivamente atraerse y/o presionarse en la ranura. En el paso 210 de la secuenciacion se secuencia el ADN en el poro.
En el paso 202 puede llevarse a cabo ademas una centrifugacion, una sedimentacion y alternativa o complementariamente un tratamiento de vaclo, para introducir la celula en la cavidad.
La fig. 3 muestra una exposicion de una centrifugacion de una solucion de muestras 300 en un dispositivo de secuenciacion 100 conforme a un ejemplo de realizacion. El dispositivo de secuenciacion 100 se corresponde a este respecto fundamentalmente con el dispositivo de secuenciacion en la fig. 1. La alimentacion representa un paso de un procedimiento para la operativa del dispositivo de secuenciacion, como se describe en la fig. 2.
Aqul se inserta en la primera ranura 108 una solucion acuosa 300, que contiene unas celulas 302. Las cavidades 112 se humedecen a este respecto igualmente con la solucion acuosa 300. Mediante una centrifugacion, una sedimentacion y alternativa o complementariamente un tratamiento de vaclo, se insertan las celulas 302 en las cavidades 112. En una cavidad 112 encaja a este respecto respectivamente solo una celula 302. De este modo se alslan las celulas 302 individuales unas de las otras.
Se ha representado un ejemplo de realizacion para una limpieza o purificacion del ADN celular. Aqul se emplea una extraccion miniaturizada de fenol-cloroformo. Para ello se introducen las celulas 302 a analizar en agua, respectivamente una solucion de muestras 300 que contiene las celulas 302 en el chip 100.
La fig. 4 muestra una exposicion de una lisis de celulas 302 en un dispositivo de secuenciacion 100 conforme a un ejemplo de realizacion. El dispositivo de secuenciacion 100 se corresponde a este respecto fundamentalmente con el dispositivo de secuenciacion de la fig. 1. La lisis representa un paso de un procedimiento para la operativa del dispositivo de secuenciacion, como se ha descrito en la fig. 2.
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A este respecto se llena la primera ranura 108 con un llquido de lisis 400. El llquido de lisis 400 produce una lisis de las celulas 302, con ello se descomponen las celulas en sus componentes celulares. Alternativamente las celulas pueden lisarse electricamente mediante la aplicacion de un campo electrico entre 120 y 122. El llquido de lisis 400 penetra por ejemplo, a causa de su tension superficial, solo de forma poca significativa en las cavidades 112. En cada una de las cavidades 112 permanece un resto de la solucion acuosa 300.
A continuacion de la introduction se llena la ranura micro-fluldica 108 con una fase organica 400, aqul fenol en una relation 1:1. El DNA, los fragmentos celulares y los cuerpos interiores celulares contenidos en la solucion acuosa 300 se separan a causa de sus diferentes solubilidades. El DNA permanece en la solucion acuosa 300, y todos los otros componentes se transforman mediante difusion en la fase organica 400. Mediante el enjuague a continuacion de la fase organica 400, por ejemplo con cloroformo y alcohol isoamllico, por ejemplo en una relacion de 24:1, se extraen estos componentes del chip 100.
En otras palabras, las figuras 3 y 4 muestran unas ilustraciones como estadios intermedios en un desarrollo de una preparation de muestras para una secuenciacion de nanoporos conforme al planteamiento aqul presentado.
Para la preparacion de muestras se inserta en la fig. 3 una solucion de muestras, que contiene celulas, en la ranura micro-fluldica. Las celulas se introducen en los pocillos mediante centrifugation, sedimentation o apoyadas mediante un vaclo. A continuacion se realiza una lisis de las celulas en la fig. 4. Para ello pueden emplearse metodos conocidos, como una lisis qulmica, una lisis enzimatica, una lisis electrica, una lisis ultrasonica y alternativa y/o una lisis termica.
La fig. 5 muestra una exposition del ADN aislado 500 en un dispositivo de secuenciacion 100 conforme a un ejemplo de realization. El dispositivo de secuenciacion 100 se corresponde con ello fundamentalmente con el dispositivo de secuenciacion de la fig. 1. Aqul se extrae de la primera ranura 108 el llquido de lisis o un llquido de lavado de la fig. 4 introducido a continuacion en la primera ranura 108. En cada cavidad 112 esta dispuesto el resto de la solucion acuosa 300 con el DNA 500.
Se ha representado el chip 100 despues de la purification. Aqul esta disponible el ADN celular 500 en los respectivos pocillos 112, aislado en una solucion acuosa 300.
La fig. 6 muestra una exposicion de una secuenciacion del ADN 500 en un dispositivo de secuenciacion 100 conforme a un ejemplo de realizacion. El dispositivo de secuenciacion 100 se corresponde a este respecto fundamentalmente con el dispositivo de secuenciacion 1 de la fig. 1. La secuenciacion representa un paso de un procedimiento para la operativa del dispositivo de secuenciacion, como se describe en la fig. 2.
Aqul se ha introducido un medio de secuenciacion 600 en la primera ranura 108 y la segunda ranura 110. Los poros 114 estan tambien llenos del medio de secuenciacion 600. En las cavidades 112 esta dispuesta a este respecto en primer lugar la solucion acuosa 300. La solucion acuosa se mezcla mediante difusion con el medio de secuenciacion. Como resultado de ello las cavidades estan llenas del medio de secuenciacion (la solucion acuosa se ha extraldo por dilution). Se ha conectado una fuente de corriente continua 602 entre las conexiones electricas 120, 122. De este modo se configura un campo electrico entre el sustrato de cubierta 116 y el sustrato inferior 118. El campo electrico atrae el ADN a traves de los poros 114, en donde puede analizarse una velocidad de desplazamiento del ADN 500 o de partes del ADN 500 en el medio de secuenciacion 600.
Se ha representado un ejemplo de realizacion de una secuenciacion. Para ello se llenan las ranuras micro-fluldicas 108, 110 con un tampon de secuenciacion 600. Los poros 114 presentan un tramo de electroforesis, por ejemplo el mismo tampon 600 con el que tambien estan llenas las ranuras 108, 110 o un gel de agarosa.
Si se aplica una tension al sustrato de cubierta 116 y al sustrato inferior 118, se conduce el ADN celular 500 de cada pocillo 112 a traves de los poros 114 conectado a los pocillos 112.
La longitud de fragmento del ADN 500 y/o la detection con precision de la base pueden realizarse con metodos conocidos. La deteccion puede realizarse por ejemplo electrica, electromecanica u opticamente. En funcion del metodo de deteccion pueden emplearse diferentes tampones 600. Puede emplearse por ejemplo una solucion salina 1M KCI con Tris-HCl 10mM y EDTA (acido etilendiaminotetraacetico) 1mM, pH 8.0 a temperatura ambiente o una solucion 3M KCl pH 10.4, con 1mM EDTA para la deteccion electrica mediante un nanoporo de estado solido.
Si un ejemplo de realizacion comprende un enlace “y/o” entre una primera caracterlstica y una segunda caracterlstica, esto debe leerse de tal manera que el ejemplo de realizacion conforme a una primera forma de realizacion presente tanto la primera caracterlstica como la segunda caracterlstica y, conforme a otra forma de realizacion, solo la primera caracterlstica o bien solo la segunda caracterlstica.

Claims (7)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    REIVINDICACIONES
    1. Procedimiento (200) para la operativa de un dispositivo de secuenciacion (100) micro-fluldico, que presenta al menos un canal de secuenciacion (102) micro-fluldico, que conecta fluldicamente una primera ranura (108) micro- fluldica a una segunda ranura (110) micro-fluldica, en donde el canal de secuenciacion (102) en la zona de la primera ranura (108) esta configurado como una cavidad (112) y en la zona de la segunda ranura (110) esta configurado como un poro (114), en donde el poro (114) presenta una seccion transversal menor que la cavidad (112), en donde el procedimiento (200) presenta los pasos siguientes:
    alimentacion (202) de una solucion de muestras (300) en la primera ranura (108), para introducir una celula (302) en la cavidad (112);
    lisis (204) de la celula (302) en sus componentes celulares, para liberar ADN celular (500) de la celula (302);
    lavado (206) de la primera ranura (108), para extraer de la cavidad (112) y/o de la primera ranura (108) componentes celulares indeseados de la celula (302) y aislar el ADN (500) en la cavidad (112);
    llenado (208) de la primera ranura (108) y de la segunda ranura (110) con un tampon de secuenciacion (600); y
    secuenciacion (210) del ADN (500) en el poro (114).
  2. 2. Procedimiento (200) conforme a la reivindicacion 1, en el que en el paso (202) de la alimentacion como solucion acuosa (300) puede alimentarse una solucion acuosa (300), que contenga celulas (302).
  3. 3. Procedimiento (200) conforme a una de las reivindicaciones anteriores, en el que en el paso de la alimentacion (202) se lleva a cabo ademas una centrifugacion, una sedimentacion y/o un tratamiento de vaclo, para introducir la celula (302) en la cavidad (102).
  4. 4. Procedimiento (200) conforme a una de las reivindicaciones anteriores, en el que en el paso (204) de la lisis se lleva a cabo una lisis qulmica, una lisis enzimatica, una lisis electrica, una lisis ultrasonica y/o una lisis termica, para liberar el ADN celular (500).
  5. 5. Procedimiento (200) conforme a una de las reivindicaciones anteriores, en el que en el paso (204) de la lisis se introduce una fase organica (300) en la primera ranura (108), en particular con un flujo laminar en la primera ranura (108).
  6. 6. Procedimiento (200) conforme a una de las reivindicaciones anteriores, en el que en el paso (206) del lavado se introduce un llquido de lavado en la primera ranura (108), en donde el llquido de lavado se introduce en particular con un flujo laminar en la primera ranura (108).
  7. 7. Procedimiento (200) conforme a una de las reivindicaciones anteriores, en el que en el paso de la secuenciacion se aplica una tension electrica entre un primer sustrato (116), que delimita la primera ranura (108), y un segundo sustrato (118) que delimita la segunda ranura (110), para secuenciar el ADN (500) en el poro (114).
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