ES2651672T3 - Módulo de expresión inducible y sus usos - Google Patents

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Abstract

Combinación que comprende: - un módulo de expresión que comprende un gen de interés que codifica un polipéptido que tiene un efecto terapéutico para una afección diana ligada operativamente a un promotor inducible que comprende (i) al menos una secuencia reguladora CARE (C/EBP-elemento de respuesta a ATF) que contiene una secuencia AARE (elemento de respuesta a aminoácido) y (ii) un promotor mínimo, un vector que comprende dicho módulo de expresión, una célula hospedadora que comprende dicho vector o dicho módulo de expresión o una composición farmacéutica que comprende dicho módulo de expresión, dicho vector o dicha célula hospedadora, y - un régimen de carencia de un aminoácido esencial, para uso simultáneo, separado o secuencial para el tratamiento por terapia génica de una afección diana elegida del grupo que comprende enfermedades proliferativas, enfermedades infecciosas, enfermedades genéticas, enfermedades neurológicas o enfermedades cardiovasculares.

Description

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El término “promotor” es bien conocido por el especialista en la materia y se refiere a una región del ADN situada en la proximidad de un gen sobre el que se fija la ARN polimerasa con el fin de iniciar la transcripción.
Generalmente, la expresión “ligado operativamente” significa que la secuencia promotora está colocada con relación a la secuencia codificante del gen de interés de manera que la transcripción pueda comenzar. Esto significa que el promotor está colocado aguas arriba de la región codificante, a una distancia que permita la expresión de esta última.
Existen diferentes tipos de promotores tales como los promotores constitutivos o los promotores inducibles. Los promotores inducibles son promotores cuya actividad está controlada por las condiciones ambientales particulares o la presencia de un compuesto particular; permiten por lo tanto un control de la expresión del gen de interés.
Los promotores usados en el marco de la invención pueden derivar de genes nativos, o estar compuestos por diferentes elementos derivados de diferentes promotores naturales, o incluso pueden comprender segmentos de ADN sintéticos.
Se entiende por “promotor mínimo” un promotor consistente en un sitio de inicio de la transcripción y secuencias para la fijación del complejo de inicio de la transcripción (secuencia TATA) funcionales en una célula o un organismo hospedador.
Estos elementos son clásicos en el campo de la materia referido. Se pueden citar más particularmente los promotores mínimos de los genes TK, CMV y HSP (promotor mínimo del gen de la proteína de choque térmico de Drosophile desprovisto de su secuencia activadora).
De preferencia, el promotor usado según la invención es el promotor mínimo de timidina cinasa o un derivado de este. El promotor mínimo de timidina cinasa corresponde a la parte de -40 a +50 de la secuencias de la timidina cinasa, siendo +1 el sitio de inicio de la transcripción (Majumder S, DePamphilis ML, Mol Cell Biol, 1994); se define por la secuencia SEQ ID NO :1.
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El término “derivado de” corresponde a una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 90 % de identidad con una secuencia de referencia, particularmente al menos un 95 % de identidad y preferiblemente al menos un 99 % de identidad. El término “porcentaje de identidad entre dos secuencias de ácido nucleico” hace referencia al porcentaje de nucleótidos idénticos entre dos secuencias comparadas, estando obtenido dicho porcentaje mediante el mejor alineamiento de la secuencia completa. El término “mejor alineamiento” corresponde al alineamiento que permite obtener el porcentaje de identidad más elevado. Puede obtenerse usando diferentes algoritmos bien conocidos por el especialista en la materia (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA, TFASTA, GENETICS COMPUTER GROUP, 575 Science Dr., Madison, WI, EE.UU.).
El promotor puede ser un promotor eucariótico que debe ser funcional en el organismo hospedador.
Se entiende por “secuencia reguladora CARE” (C/EBP-elemento de respuesta a ATF) cualquier secuencia diana de la ruta de señalización eIF2/ATF4 capaz de ligarse al factor de transcripción ATF4. En esta ruta, se liga el factor de transcripción ATF4 (factor de transcripción activante 4, también llamado CREB2, TAXREB67, TXREB) con estas secuencias CARE para inducir o regular la transcripción de genes diana en respuesta a un estrés ambiental dado (Kilberg et al., Trends Endocrinol Metab. nov. de 2009; 20(9): 436-43).
Se han descrito diferentes secuencias CARE, especialmente para los genes siguientes: CHOP (proteína homóloga de C/EBP, también llamada GADD153), ASNS (asparagina sintetasa), SNAT2 (transportador de aminoácidos del sistema A), ATF3, TRIB3, Cat-1, xCT, HERP, VEGF y 4E-BP1.
Más particularmente, en el marco de la invención, se entiende por “elemento de respuesta de aminoácido” (AARE) secuencias reguladoras CARE dianas del factor de transcripción ATF4 en caso de carencia de aminoácido: estas secuencias CARE son secuencias CARE particulares diana en caso de fosforilación de elF2 por la cinasa GCN2, estando inducida esta fosforilación por una carencia de un aminoácido, preferiblemente una carencia de un aminoácido esencial.
Los ejemplos de secuencias AARE usadas según la invención comprenden, pero sin limitación, las secuencias CARE de los genes ASNS, SNAT2, ATF3 y TRIB3.
En un modo particular de realización de la invención, la secuencia reguladora CARE que contiene una secuencia
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AARE presente en el módulo de expresión usado según la invención comprende o consiste en una secuencia seleccionada entre el grupo que comprende: la secuencia CARE del gen TRIB3 (SEQ ID NO :2), la secuencia CARE del gen ASNS (SEQ ID NO :4), la secuencia CARE del gen ATF3 (SEQ ID NO :5) y la secuencia CARE del gen SNAT2 (SEQ ID NO :6), o un derivado de esta.
Preferiblemente, dicha secuencia reguladora CARE que contiene una secuencia ARE presente en el módulo de expresión usado según la invención comprende o consiste en una o varias copias de la secuencia SEQ ID NO :2, o un derivado de esta.
Secuencia CARE del gen TRIB3 (SEQ ID NO :2)
Secuencia CARE del gen CHOP (SEQ ID NO :3)
Secuencia CARE del gen ASNS (SEQ ID NO:4)
Secuencia CARE del gen ATF3 (SEQ ID NO :5)
Secuencia CARE del gen SNAT2 (SEQ ID NO :6)
En un modo de realización particular de la invención, el promotor inducible comprendido en el módulo de expresión usado según la invención comprende una o varias copias de una secuencia reguladora CARE que contiene la secuencia AARE (elemento de respuesta a aminoácido). Más particularmente, dicho promotor comprende al menos una, al menos dos o al menos tres copias de una secuencia reguladora CARE que contiene una secuencia AARE (elemento de respuesta a aminoácido).
Más particularmente, el promotor inducible comprendido en el módulo de expresión usado según la invención comprende dos copias de una secuencia CARE que contiene una secuencia AARE (elemento de respuesta a aminoácido).
De preferencia, el promotor inducible comprendido en el módulo de expresión usado según la invención comprende dos copias de la secuencia CARE que contienen una secuencia AARE (elemento de respuesta a aminoácido) de TRIB3 (SEQ ID NO :2).
En un modo de realización preferido, el promotor del módulo de expresión usado según la invención comprende dos copias de la secuencia CARE que contienen una secuencia AARE (elemento de respuesta a aminoácido) del gen TRIB3 (SEQ ID NO :2) y el promotor de timidina cinasa (SEQ ID NO :1). Preferiblemente, el promotor del módulo de expresión usado según la invención comprende o consiste en la secuencia SEQ ID NO :7 o un derivado de esta.
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Según la invención, la secuencia reguladora CARE que contiene una secuencia AARE (elemento de respuesta a aminoácido) comprendida en el módulo de expresión usado según la invención está colocada aguas arriba (en posición 5’) o aguas abajo (en posición 3’) del promotor mínimo. Preferiblemente, está colocada aguas arriba.
El promotor inducible usado en la invención, que comprende al menos una secuencia reguladora CARE (C/EBPelemento de respuesta a ATF) que contiene una secuencia AARE (elemento de respuesta a aminoácido) y un promotor mínimo, es inducible de preferencia por la carencia de aminoácido (uno o varios aminoácidos), más preferiblemente por una carencia de aminoácido esencial.
El gen de interés en uso en la presente invención puede obtenerse de un organismo eucariótico, de un procariota, de un parásito o de un virus. Puede aislarse mediante cualquier técnica convencional en el campo de la materia, por
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codifica un péptido señal que permite su secreción de la célula hospedadora. El péptido señal puede ser aquel del gen en cuestión o heterólogo (obtenido de un gen cualquiera secretado o sintético).
Finalmente, el gen de interés contiene un terminador.
En un modo de realización particular de la invención, el módulo de expresión usado según la invención comprende además la secuencia 5'UTR del gen ATF4 (SEQ ID NO :8, Vattem et al, PNAS, 2004; Lu et al J.Cell Biol 2004) o una secuencia similar, aguas arriba del sitio de inicio de la traducción del módulo.
Según la invención, una secuencia similar significa una secuencia 5' UTR de un gen que tiene la misma regulación traduccional que ATF4. Los ejemplos de genes que tienen una secuencia 5' UTR similar comprenden, pero sin limitación: GADD34 (Lee et al, J Biol Chem, 2009), ATF5 (Zhou et al, J Biol Chem, 2008) y BACE1 (Zhou et al, Mol Cell Biol, 2006).
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La invención tiene por otro lado como objeto un vector que comprende un módulo de expresión que comprende un gen de interés ligado operativamente a un promotor inducible que comprende (i) al menos una secuencia reguladora CARE (C/EBP-elemento de respuesta a ATF) que contiene una secuencia AARE (elemento de respuesta a aminoácido) y seleccionado del grupo de secuencias SEQ ID NO: 2, 4, 5 o 6 y (ii) un promotor mínimo de timidina cinasa definido por la secuencia SEQ ID NO : 1 para su uso en el tratamiento de enfermedades proliferativas, enfermedades infecciosas, enfermedades genéticas, enfermedades neurológicas o enfermedades cardiovasculares por terapia génica.
Según la invención, puede tratarse de un vector sintético (lípidos catiónicos, liposomas poliméricos,…), de un plásmido o incluso de un vector vírico.
Puede estar eventualmente asociado a una o varias sustancias que mejoran la eficacia transfeccional y/o la estabilidad del vector. Estas sustancias están ampliamente documentadas en la bibliografía accesible para el especialista en la materia (véanse, por ejemplo, Felgner et al., 1987, Proc. West. Pharmacol Soc. 32, 115-121; Hodgson y Solaiman, 1996, Nature Biotechnology 14, 339-342; Remy et al., 1994, Bioconjugate Chemistry 5, 647654). A modo ilustrativo, pero no limitante, puede tratarse de polímeros, de lípidos especialmente catiónicos, de liposomas, de proteínas nucleares o incluso de lípidos neutros. Estas sustancias pueden usarse solas o en combinación. Es una combinación viable un vector recombinante plasmídico asociado a lípidos catiónicos (DOGS, DC-CHOL, espermina-col, espermidina-col, etc.) y lípidos neutros (DOPE).
La elección de los plásmidos utilizables en el marco de la presente invención es vasta. Puede tratarse de vectores de clonación y/o de expresión. De manera general, son conocidos por el especialista en la materia y numerosos entre ellos están disponibles comercialmente, pero es igualmente posible construirlos o modificarlos mediante las técnicas de manipulación genética. Se puede citar a modo de ejemplos los plásmidos derivados de pBR322 (Gibco BRL), pUC (Gibco BRL), pBluescript (Stratagene), pREP4, pCEP4 (lnvitrogene) o incluso pPoly (Lathe et al., 1987, Gene 57, 193-201). De preferencia, un plásmido puesto en práctica en el marco de la presente invención contiene un origen de replicación que asegura el inicio de la replicación en una célula productora y/o una célula hospedadora (por ejemplo, se mantendrá el ColEI original para un plásmido destinado a producirse en E. coli, y el sistema oriP/EBNAl si se desea que sea autorreplicativo en una célula hospedadora de mamífero, Lupton y Levine, 1985, Mol Cell Biol 5, 2533-2542; Yates et al., Nature 313, 812-815). Puede comprender además un gen de selección que permita seleccionar o identificar las células transfectadas (complementación de una mutación auxotrófica, gen que codifica la resistencia a un antibiótico,…). Puede comprender también elementos suplementarios que mejoran su mantenimiento y/o su estabilidad en una célula dada (secuencia cer que favorece el mantenimiento monomérico de un plásmido, secuencias de integración en el genoma celular).
Al tratarse de un vector vírico, se puede considerar un vector derivado de un adenovirus, lentivirus, retrovirus, virus asociado a adenovirus (AAV), herpesvirus, alfavirus, parvovirus, poxvirus (viruela aviar, viruela del canario, virus de vacuna especialmente de la cepa MVA (virus Ankara modificado) o Copenhague...) o un espumavirus. Se recurrirá
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de preferencia a un vector no replicativo y, eventualmente, no integrativo. Los retrovirus tienen la propiedad de infectar e integrarse mayoritariamente en células en división y a este respecto son particularmente apropiados para una aplicación en terapia anticancerosa. Un vector retrovírico conveniente para la puesta en práctica de la presente invención consta de las secuencias terminales LTR (repetición terminal larga) y una región de encapsidación. Puede derivar de un retrovirus de cualquier origen (múrido, primate, felino, humano, etc.) y en particular puede derivar de un retrovirus elegido entre el grupo que comprende MoMuLV (virus de leucemia de múrido Moloney), MVS (virus de sarcoma de múrido) o retrovirus de múrido Friend (Fb29). Se propaga en una estirpe de encapsidación capaz de proporcionar en trans los polipéptidos víricos gag, pol y/o env necesarios para la constitución de una partícula vírica. Se describen tales estirpes en la bibliografía (PA317, Psi CRIP GP + Am-12 etc.). El vector retrovírico según la invención puede constar de modificaciones especialmente al nivel de las LTR (reemplazos de la región promotora por un promotor eucariótico) o de la región de encapsidación (reemplazo por una región de encapsidación heteróloga, por ejemplo de tipo VL30) (véanse las solicitudes francesas 9408300 y 9705203).
En un modo de realización preferido de la invención, el vector usado según la invención es un vector lentivírico, un vector adenovírico o un vector derivado de un virus asociado a adenovirus (AAV).
Según un modo de realización ventajoso, el vector vírico usado según la invención puede estar en forma de un vector de ADN o partícula vírica infecciosa.
La presente solicitud divulga igualmente una célula hospedadora que comprende un vector o un módulo de expresión para uso según la invención.
Tal como se usa aquí, una célula está constituida por cualquier célula transfectable por un vector tal como se describe anteriormente.
En particular, puede usarse una célula de mamífero, preferiblemente una célula humana. Puede tratarse de una célula primaria o tumoral de cualquier origen, especialmente hematopoyética (citoblasto totipotente, leucocito, linfocito, monocito o macrófago...), muscular (célula satélite, miocito, mioblasto, músculo liso...), cardiaca, pulmonar, traqueal, hepática, epitelial o fibroblástica, pero también citoblastos.
La presente invención tiene igualmente como objeto una composición farmacéutica que comprende un módulo de expresión que comprende un gen de interés ligado operativamente a un promotor inducible que comprende o consiste en la secuencia SEQ ID NO: 7 para su uso en el tratamiento de enfermedades proliferativas, enfermedades infecciosas, enfermedades genéticas, enfermedades neurológicas o enfermedades cardiovasculares por terapia génica.
Una composición farmacéutica usada según la invención está más particularmente destinada al tratamiento preventivo o curativo de enfermedades por terapia génica (incluyendo inmunoterapia) y se enfrenta más particularmente a las enfermedades proliferativas (cánceres, tumores, displasias, etc.), a las enfermedades infecciosas y especialmente víricas (inducidas por ejemplo por los virus de hepatitis B o C, el VIH (virus de la inmunodeficiencia humano), herpes, retrovirus, etc.), a las enfermedades genéticas (mucoviscidosis, miopatías, hemofilias, diabetes...), a las enfermedades cardiovasculares (reestenosis, isquemia, dislipidemia...) o incluso a las enfermedades neurológicas (enfermedades psiquiátricas, enfermedades neurodegenerativas como Parkinson o Alzheimer, adicciones por ejemplo al tabaco, alcohol, a las drogas, epilepsia…).
Una composición farmacéutica usada según la invención puede fabricarse de manera convencional con vistas a una administración por vía local, parenteral o digestiva, pero también por estereotaxia. En particular, se asocia una cantidad terapéuticamente eficaz de agente terapéutico o profiláctico con un soporte aceptable desde un punto de vista farmacéutico. Las vías de administración consideradas son múltiples. Se pueden citar, por ejemplo, la vía intragástrica, subcutánea, intracardiaca, intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intratumoral, intranasal, intrapulmonar o intratraqueal. Para estos tres últimos modos de realización, es ventajosa una administración por aerosol o instilación.
La administración puede tener lugar en dosis única o repetida una o varias veces después de un cierto plazo de intervalo. La vía de administración y las dosis apropiadas varían en función de diversos parámetros, por ejemplo del individuo, la patología, el gen de interés para transferir y la vía de administración. Cuando se pone en práctica un vector, pueden considerarse dosis que comprenden de 0,01 a 100 mg de ADN, de preferencia de 0,05 a 10 mg y, de manera muy preferida, de 0,5 a 5 mg.
La formulación puede incluir igualmente un diluyente, un adyuvante o un excipiente aceptable desde un punto de vista farmacéutico, al igual que agentes de solubilización, estabilización y conservación. Una composición preferida está en forma inyectable. Puede formularse en disolución acuosa, salina (fosfato, monosódica, disódica, magnesio, potasio…) o isotónica.
Puede presentarse en dosis única o en multidosis en forma líquida o seca (polvo, liofilizado…) susceptible de reconstituirse de manera extemporánea por un diluyente apropiado.
La presente solicitud divulga igualmente el uso terapéutico o profiláctico de un módulo de expresión, un vector o una
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Claims (1)

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