ES2651482T3 - Procedimiento de determinación de aglutinación - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento de determinación de la aglutinación de un líquido biológico midiendo un cambio de la resistencia hidrodinámica del líquido biológico que fluye a través de un canal de microfluídica de un dispositivo de microfluídica, comprendiendo el procedimiento las etapas de: a) calibrado del dispositivo de microfluídica calculando un valor calibrado de la resistencia hidrodinámica de una secuencia de gotas de un líquido biológico conocido en el que se produce la aglutinación y un valor calibrado de una secuencia de gotas de un líquido biológico conocido en el que no se produce aglutinación, de acuerdo con las etapas (b)-(i) que se llevan a cabo posteriormente para un líquido biológico de ensayo; b) carga del canal de reacción (5) de microfluídica con una fase líquida continua hidrófoba, teniendo el canal de reacción de microfluídica detectores (6, 7) espaciados a la distancia que define la sección de medición (5a) del canal de reacción de microfluídica, en el que la presión que induce el flujo en el canal de reacción (5) de microfluídica constituye la diferencia de presión en el depósito con la fase continua y la presión atmosférica; c) introducción una primera gota de referencia en el canal de reacción (5) de microfluídica, siendo una gota del líquido biológico mezclada con solución salina o PBS o agua y no miscible como la fase continua; d) producción del flujo de la primera gota de referencia a través del canal de reacción (5) de microfluídica que tiene una sección de medición (5a); e) medición del tiempo de flujo de la primera gota de referencia a través de la sección de medición (5a) del canal de reacción (5) de microfluídica; f) introducción en el canal de reacción (5) de microfluídica de una segunda gota de referencia que es la misma que la primera gota de referencia, seguida por una secuencia de 1 a 1000 gota(s) de ensayo, siendo la gota(s) de ensayo gota(s) de un líquido biológico que el mismo que comprenden las gotas de referencia, y el agente de aglutinación y no miscible con la fase continua; g) hacer fluir la segunda gota de referencia y la secuencia de gota(s) de ensayo a través del canal de reacción (5) de microfluídica; h) medición del tiempo de flujo de la segunda gota de referencia a través de la sección de medición (5a) en presencia de la secuencia de la gota(s) de ensayo en el canal de reacción (5) de microfluídica; i) cálculo de la resistencia de hidrodinámica de la primera gota de referencia y la segunda gota de referencia que está seguida por la secuencia de gota(s) de ensayo, basándose en los resultados obtenidos del tiempo de flujo formado en las etapas: e y h; y j) determinación de la aglutinación del líquido biológico comparando el valor calculado de la resistencia hidrodinámica de la primera gota de referencia con el valor calculado de resistencia hidrodinámica de la segunda gota de referencia, en el que la aglutinación se produce en la secuencia de gota(s) de ensayo si el valor calculado de la resistencia hidrodinámica de la segunda gota de referencia ha aumentado en comparación con el valor calculado de la resistencia hidrodinámica de la primera gota de referencia.
Description
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DESCRIPCION
Procedimiento de determinacion de aglutinacion Campo de la tecnica
La presente invencion se refiere a un procedimiento para llevar a cabo ensayos de aglutinacion de fluidos biologicos tales como sangre o sus componentes, o saliva u orina, y mas generalmente para la determinacion de reacciones antigeno-anticuerpo que implican aglutinacion, en dispositivos de microflmdica.
Antecedentes
Los Lab-on-chips, que operan habitualmente como dispositivos de microflmdica, son construcciones que facilitan una variedad de ensayos de muestras biologicas lfquidas, por ejemplo, sangre, plasma sangmneo u orina. Hoy dfa, los sistemas de microflmdica estan llegando a tener un aumento de importancia ya que necesitan el uso de una muestra reducida para investigar debido a su miniaturizacion.
Uno de los ensayos que se estan aplicando a los sistemas de microflmdica incluye los ensayos de aglutinacion de la sangre. Normalmente, la medicion implica una reaccion de las celulas sangmneas o las sangre completa con la sustancia que actua como reactivo, es decir, un agente de aglutinacion (anticuerpo) en un canal(es) (tal como un canal(es) de microflmdica), en el que el reactivo produce un cambio en ciertas propiedades ffsicas de la sangre investigada, de manera que se puede determinar la aglutinacion midiendo el cambio. Normalmente, el tipaje de la sangre se lleva a cabo con el uso de fracciones sangmneas, es decir, despues de la centrifugacion. Las celulas sangmneas aisladas de la sangre completa se ensayan entonces en contacto con reactivos monoclonales que contienen anticuerpos, y el plasma aislado se ensaya con globulos rojos convencionalizados con antfgenos conocidos en su superficie.
Otra categona de ensayos serologicos son los inmunoensayos, tales como la PCR y ELISA.
Los procedimientos mas ampliamente conocidos para determinar la aglutinacion implican la evaluacion visual de la aglomeracion de las celulas sangmneas en la sangre, que se pueden llevar a cabo a gran escala, por ejemplo, en placas de cristal y tubos de ensayo, o a escala miniaturizada con sistemas de microflmdica.
Por ejemplo, la Patente de EE. UU. US8318439 escribe un aparato de microflmdica para el tipaje de sangre por determinacion visual de la aparicion de agregados que resultan del proceso de aglutinacion. El dispositivo comprende un canal de reaccion de aglutinacion provisto con un suministro de sangre, un suministro de reactivo de aglutinacion, un cuello y una ventana optica en la que se puede evaluar opticamente la reaccion positiva por la aparicion de “agregados” que son visibles en la ventana. Ademas, las dimensiones seleccionadas del cuello tienen influencia sobre el numero de Reynolds, y por lo tanto potencia la reaccion de aglutinacion. Sin embargo, el procedimiento visual puede producir la generacion de errores debido a las imperfecciones del ojo humano.
Ademas, otros documentos distintos describen dispositivos y procedimientos para determinar la aglutinacion de las muestras biologicas lfquidas por comparacion del cambio de viscosidad de la sangre.
Por ejemplo, una solicitud de patente PCT WO2012164263 describe un sistema de microflmdica y un procedimiento de ensayo, que implica la medicion de una variacion de la viscosidad de una muestra. El dispositivo de microflmdica consiste en dos canales paralelos intersectados en su interior y exterior. El procedimiento implica la adicion de una muestra de sangre en los canales de microflmdica seguido por la provision de un tampon de caza en el canal. El lfquido fluye a lo largo del primer y segundo canales, en el que se proporciona el agente de aglutinacion en el primero, pero no en el segundo canal. Como la aglutinacion enlentece el caudal de la muestra de sangre, solo el fluido no aglutinado sale de la disposicion de canales y por lo tanto se bloquea la muestra aglutinada en el primer canal La distancia que viaja el lfquido aglutinado en el primer canal es indicativo del grado de aglutinacion.
Un procedimiento similar y dispositivo se describe en la solicitud de patente de EE. UU. US20090317793. El dispositivo comprende un canal de referencia y un canal de ensayo en el que se proporciona el agente de aglutinacion. Los canales estan intersectados en ambos extremos y se proporcionan regiones de mezclado dispuestas de manera que el lfquido de referencia que fluye de la seccion del canal de referencia superior a la region de mezcla bloquea el flujo del lfquido de ensayo en la parte superior del canal de ensayo. La aglutinacion se determina visualmente por observacion de la posicion del flujo en el frete de la muestra lfquida en el canal de ensayo.
Otro procedimiento de ensayo de diagnostico se describe en una aplicacion de patente PCT WO2011035385. El procedimiento implica la aglutinacion de una muestra, seguido por su deposito en un sustrato analttico poroso, en el que la muestra forma una mecha. La muestra que se aglutina en contacto con los anticuerpos espedficos se separa/eluye en contacto con el sustrato, mientras que la muestra de sangre en contacto con el anticuerpo no espedfico no se separa/eluye. La velocidad de elucion y la extension de la separacion de la muestra en el sustrato
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indican el grado de coagulacion.
Una Solicitud de patente de EE. UU. US20030224457 describe un procedimiento para determinar la presencia de anticuerpo en una muestra de sangre por tipaje inverso en un bio-disco optico con un canal de microflmdica; el procedimiento implica la aplicacion de una muestra de sangre en el canal de microflmdica seguido por el girado del disco que efectua el movimiento del suero sangurneo a traves del canal de microflmdica; a continuacion, se anade al suero un grupo sangurneo ABO conocido y se gira el bio-disco optico, despues se incuba la muestra en el canal de microflmdica. La aglutinacion se mide por exploracion de la mezcla con un rayo incidente de radiacion electromagnetica. Los datos obtenidos por la radiacion determina la presencia de celulas aglutinadas.
Por lo tanto, hay numerosas maneras para determinar la aglutinacion en dispositivos de microflmdica. Sin embargo, en ciertas circunstancias, la reaccion de aglutinacion puede producir un cese del flujo y por tanto, la muestra se puede bloquear, lo que puede dar lugar adicionalmente a una estimacion erronea de la utilidad del ensayo de aglutinacion. Ademas, puede producir dificultades en la limpieza de los canales de microflmdica. Ademas, cuando se utiliza una muestra mas pequena, es decir, una muestra que tiene un tamano de una gota o goffcula, o en el caso en el que la reaccion de aglutinacion es sustancialmente escasa, normalmente, el fenomeno de aglutinacion no se puede evaluar correctamente.
Una solicitud de patente polaca PL396494 describe un dispositivo y un procedimiento para llevar a cabo un ensayo de aglutinacion con un sistema de microflmdica que utilizan una muestra de sangre con un tamano de gota. El sistema de microflmdica se proporciona con un suministro de una gota que vehicula un anticuerpo (tal como reactivos monoclonales), un suministro de una gota que vehicula un anffgeno (por ejemplo, globulos rojos) y un canal de microflmdica en el que se mezclan las sustancias. El ensayo implica la medicion del tiempo de flujo de la gota a una distancia pre-determinada a lo largo del canal de microflmdica. El tiempo de flujo de la gota, en que se produce la reaccion de aglutinacion, es significativamente mas largo que el tiempo analogo para la gota en que no se produce la reaccion; la comparacion de los tiempos de flujo permite distinguir si se produjo la aglutinacion o no.
Por lo tanto, existe una necesidad para el desarrollo adicional de la medicion de los cambios en las propiedades ffsicas de los ffquidos cuando fluyen a traves de los canales de microflmdica. Se habfan descrito distintos procedimientos para afrontar esta necesidad. Por ejemplo, se habfan propuesto los siguientes procedimientos para la medicion de resistencia adicional de las gotas en los canales de microflmdica:
V. Labrot y col., Biomicrofluidics, vol. 3, p. 012804, 2009, describe un procedimiento para la medicion directa de la presion de la gota en una corta seccion de un canal durante el flujo de una unica gota. No obstante, necesita el uso de un micromanometro muy preciso y se producen errores adicionales debido a la presencia de canales laterales para la medicion de la presion.
Otro procedimiento, descrito en S. A. Vanapalli y col., Lab on a Chip, vol. 9, p. 982, 2009, caracteriza un comparador de flujo basado en equilibrar el flujo medido (con gota) con un flujo de referencia coloreada de velocidad controlada. No obstante, la calidad de este procedimiento es limitada por la indicacion experimental del desplazamiento de interfaz entre el aceite coloreado y transparente.
Otro procedimiento conocido mas, descrito en M. J. Fuerstman y col., Lab on a Chip, vol. 7, p. 1479, 2007 y V. Labrot y col., Biomicrofluidics, vol. 3, p. 012804, 2009 utiliza el modelo de flujo de segmentos de fluido separados mediante un bucle de canales simple midiendo la velocidad del flujo de burbujas o goffculas. La precision de este procedimiento depende cnticamente en varias conjeturas y detalles tecnicos: el comportamiento de las gotas en las uniones divergentes y la resolucion espacial de las mediciones.
Los procedimientos citados anteriormente se basan en observaciones y mediciones de las propiedades de gotas individuales.
Se sigue de las publicaciones mencionadas anteriormente que las tecnicas de medicion del cambio en ciertas propiedades ffsicas de las muestras ffquidas con los canales de microflmdica estan sometidas a un rapido desarrollo.
Existe la necesidad del desarrollo adicional de procedimientos de ensayo de aglutinacion basados en la medicion del cambio en las propiedades ffsicas de una muestra ffquida, que sean mas eficaces y den lugar a resultados mas fiables, incluso cuando se proporciona un tamano de muestra reducida, tal como gotas.
Sumario
Un procedimiento para la determinacion de la aglutinacion de un ffquido biologico midiendo un cambio en la resistencia hidrodinamica del ffquido biologico que fluye a traves de un canal de un dispositivo de microflmdica, comprendiendo el procedimiento las etapas de: a) calibrar el dispositivo de microflmdica calculando un valor calibrado de la resistencia hidrodinamica de una secuencia de gotas de un ffquido biologico conocido en el que se produce aglutinacion y un valor calibrado de una secuencia de gotas de un ffquido biologico conocido en el que la aglutinacion no se produce, de acuerdo con las etapas - que se llevan a cabo entonces con un ffquido biologico de ensayo; b) cargar el canal de reaccion de microflmdica con una fase ffquida hidrofoba continua, teniendo el canal de reaccion de microflmdica unos detectores (6, 7) espaciados a la distancia definida en la seccion de medicion del
canal de reaccion de microflmdica; c) introducir en el canal de reaccion de microflmdica una primera gota de referencia que es una gota del lfquido biologico mezclado con solucion salina o PBS o agua e inmiscible con la fase continua; d) producir que la primera gota de referencia fluya a traves del canal de reaccion de microflmdica; e) medir el tiempo de flujo de la gota que fluye a traves del canal de reaccion de microflmdica que tiene una seccion de 5 medicion f) introducir en el canal de reaccion de microflmdica una segunda gota de referencia a traves del canal de reaccion de microflmdica que es el mismo de la primera gota de referencia, seguido por una secuencia de 1 a 1000 gotas de ensayo, siendo la gota de ensayo una gota del lfquido biologico, igual que el comprendido en las gotas de referencia, y el reactivo de aglutinacion y no miscible con la fase continua; g) producir que la segunda gota de referencia y la secuencia de gotas de ensayo fluyan a traves del canal de reaccion de microflmdica; h) medir el 10 tiempo de flujo de la segunda gota de referencia a traves de la seccion de medicion en presencia de la secuencia de gotas de ensayo en el canal de reaccion de microflmdica; i) calcular la resistencia hidrodinamica de la secuencia de la gota de ensayo; y j) determinar la aglutinacion del lfquido biologico comparando la resistencia hidrodinamica con los valores calibrados.
La fase continua puede separar la gota de la superficie de la pared del canal de microflmdica.
15 El lfquido biologico puede ser una muestra de sangre completa, plasma, suero o corpusculos aislados.
El lfquido biologico puede ser una muestra de saliva.
El lfquido biologico puede ser una muestra de orina.
Para el tipaje de sangre, el reactivo de aglutinacion puede comprender anticuerpos monoclonales seleccionados de entre el grupo que consiste en anticuerpos contra el sistema de grupos sangmneos (anti-A, anti-B y anti-D).
20 La fase continua se puede seleccionar de entre el grupo que consiste en hexadecano, Fluorinert y aceite mineral.
El procedimiento puede comprender la introduccion en el canal de reaccion de microflmdica de dos gotas de referencia que tienen el mismo volumen.
La secuencia de la gota de ensayo se puede introducir en el canal de reaccion de microflmdica despues de que la segunda gota de referencia ha viajado una distancia desde 10 a 20 anchuras del canal de reaccion de microflmdica.
25 Las gotas de ensayo pueden tener un tamano de 3 a 4 anchuras del canal de reaccion de microflmdica.
La distancia entre las gotas de ensayo introducidas en el canal de reaccion de microflmdica puede ser desde 2 a 5 anchuras del canal de reaccion de microflmdica.
Breve descripcion de los dibujos
El procedimiento se presenta por medio de realizaciones ejemplares en un dibujo, en el que:
30 La Fig. 1 es una representacion esquematica de un dispositivo de microflmdica.
Las Fig. 2A-2B son una representacion esquematica util para el calculo del cambio en hidrodinamica de la muestra lfquida ensayada.
La Fig. 3 presenta los resultados de las mediciones de resistencia hidrodinamica de ciertas gotas muestras y reactivos.
35 Descripcion detallada
El procedimiento presentado en el presente documento implica la deteccion de la aglutinacion midiendo un cambio en la resistencia hidrodinamica de las muestras lfquidas biologicas que contienen antfgenos, tales como fluidos corporales humanos y animales, por ejemplo, sangre. En particular, el procedimiento implica el analisis de muestras lfquidas biologicas despues de que se han retirado del cuerpo u no se supone que se introduciran en el cuerpo. Este 40 procedimiento es especialmente adecuado para llevar a cabo ensayos de aglutinacion ordinarios, asf como para llevar a cabo un analisis de aglutinacion en el que solo esta disponible una pequena cantidad de muestra o cuando el uso de otros procedimientos de ensayo puede dar un resultado confuso. Debido a su sensibilidad, el procedimiento puede utilizarse tambien para confirmar los resultados obtenidos por diferentes procedimientos.
El procedimiento es adecuado para la deteccion de la aglutinacion, es decir, la reaccion que ocurre en una mezcla 45 que contiene antfgenos espedficos y anticuerpos. El procedimiento es util especialmente para el tipaje de la sangre, entrecruzamiento, ensayo directo de Coombs (DCT)/ ensayo directo de anti-globulina (DAT) y ensayo indirecto de Coombs/ensayo indirecto de anti-globulina (IAT), o puede servir como un ensayo individual para la deteccion de la presencia de otros anticuerpos o puede indicar una infeccion, tanto bacteriana como vmca, o incluso una enfermedad autoinmunologica (por ejemplo tiroiditis de Hashimoto). El procedimiento presentado en el presente 50 documento se lleva a cabo preferentemente a temperatura ambiente; sin embargo, tambien se puede llevar a cabo en temperaturas menores o mayores.
El procedimiento puede utilizar diferentes sistemas de microflmdica que tengan una arquitectura, que sea adecuada
la resistencia que contienen
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para mezclar un cierto volumen de una sustancia de muestra con cierto volumen de una sustancia de reactivo. Por ejemplo, un ensayo se puede llevar a cabo con un dispositivo de microflmdica que se muestra en la Fig. 1. Se pueden utilizar tambien otros dispositivos, por ejemplo, tales como los que se describen en la solicitud de patente polaca PL396494. Sin embargo, el dispositivo de microflmdica que se va a utilizar para la determinacion de un cambio en la resistencia hidrodinamica debe estar desprovisto de capilares que mantengan la resistencia hidrodinamica constante de los canales de microflmdica. Por lo tanto, el dispositivo de microflmdica se puede utilizar para llevar a cabo la medicion del cambio en la resistencia hidrodinamica, de acuerdo con la presente invencion.
El dispositivo que se muestra en la Fig. 1 tiene canales de admision 1, 2 para introducir las gotas de la sustancia de muestra 8 y sustancia de reactivo 9, que estan suspendidas en un lfquido continuo 10 que no se mezcla con las sustancias 8, 9 y un canal de reaccion 5. Por ejemplo, el lfquido 10 puede ser cualquier lfquido que no se mezcle con soluciones acuosas, tal como aceite del grupo de hidrocarburos simples o hidrocarburos funcionalizados, aceite mineral, aceite fluorado u otros. Los canales de admision 1, 2 preferiblemente se unen para formar un unico canal de reaccion 5, preferentemente precedido por una region de mezcla 3, en el que las gotas 8, 9 se pueden unir para formar una gota 11 que es una mezcla de la sustancia de muestra y de la sustancia de reactivo. Opcionalmente, en la region 3 pueden posicionarse - dentro o fuera del dispositivo - dos electrodos (a, b) para aumentar la mezcla de las gotas mediante un pulso de campo electrico oscilante (electro-coalescente). El canal de reaccion 5 puede comprender una parte serpenteante 4, o preferentemente todo el canal de reaccion 5 es un canal 5 serpenteante que facilita la mezcla de los componentes de las gotas durante el flujo a traves del canal de reaccion 5. La gota(s) mezclada fluye(n) hacia una seccion 5a que comprenden dos detectores 6,7 posicionados a una distancia considerable entre ellos para medir el tiempo de flujo de las gotas a lo largo de la seccion 5a del canal de salida 5. Los detectores 6, 7 pueden ser, por ejemplo, detectores opticos o electricos por lo tanto, la seccion 5a es una seccion de medicion 5a del canal de reaccion 5.
Para llevar a cabo un ensayo, los canales de admision 1, 2 se cargan con la fase continua 10 que es hidrofoba. La fase continua 10 del primer canal de admision 1 es, preferentemente, la misma sustancia que la del segundo canal de entra da 2. La fase continua y la muestra lfquida que se va a investigar tienen que ser inmiscibles. La fase continua 10 es hidrofoba para el material analizado que es hidrofilo (sustancialmente los fluidos corporales son soluciones acuosas). La muestra investigada tiene que ser una sustancia lfquida diferente que comprende el antfgeno. El canal de microflmdica puede tener, por ejemplo, una seccion rectangular, cuadrada, circular u oval, y preferentemente cuadrada. Las paredes del canal debenan ser, preferentemente, tambien hidrofobas para asegurar que la fase continua forme una pelfcula fina que separe la gota de las paredes. Esto elimina el riesgo de contaminacion del dispositivo de microflmdica producida por material biologico, por lo tanto el dispositivo se puede considerar como esteril.
El procedimiento para la determinacion de aglutinacion que mide el cambio de resistencia hidrodinamica implica las siguientes etapas:
- cargar el dispositivo de microflmdica con una fase continua;
- proporcionar en el canal de reaccion 5a la primera gota de referencia, es decir, la gota que comprende un volumen pre-determinado de la muestra lfquida y un volumen determinado de solucion salina. La primera gota de referencia no contiene ningun reactivo que pueda producir aglutinacion, asegurando de esta manea que no se producira aglutinacion en la primera gota de referencia;
- medicion del tiempo de flujo de la primera gota de referencia mediante la medicion en las seccion 5a del canal de reaccion 5;
- despues, de que la primera gota de referencia deje el canal de reaccion 5, se proporciona en el canal de reaccion una segunda gota de referencia que es sustancialmente, y preferentemente exactamente, la misma que la primera gota de referencia: que tenga la misma composicion (es decir, que la segunda gota de referencia tenga la misma muestra lfquida del mismo volumen, y el mismo volumen de la misma solucion salina que la primera gota de referencia). La segunda gota de referencia no contiene ningun reactivo que pueda producir la aglutinacion, asegurando, de esta manera, que no se producira la aglutinacion en la segunda gota de referencia;
- a continuacion de la introduccion en el canal de reaccion 5 de la segunda gota de referencia, a condicion de que en el canal de reaccion 5 una secuencia de gotas de ensayo, comprendiendo la secuencia, sustancialmente, desde 1 a 1000 de las gotas de ensayo. Las gotas de ensayo son gotas de muestra lfquida que contienen el reactivo, es decir, un anticuerpo monoclonal o policlonal que puede producir la aglutinacion en la gota de ensayo, en el caso de que este presente el antfgeno espedfico en la muestra lfquida. Siendo todas las gotas de ensayo de la secuencia sustancialmente, y preferentemente exactamente, la misma, es decir, todas las gotas de ensayo tienen la misma composicion, la misma muestra lfquida, el mismo reactivo conocido, y son del mismo volumen. Ademas, la muestra lfquida de cada gota de ensayo es la misma que la muestra liquida contenida en la primera y segunda gota de referencia. Por lo tanto, con una medicion de cada gota, tanto la de referencia como la de ensayo en el canal de reaccion, contiene la misma muestra lfquida;
- medir el tiempo de flujo de la segunda gota de referencia mediante la medicion en la seccion 5a del canal de reaccion 5;
- calcular la resistencia hidrodinamica del canal de reaccion 5 durante el flujo de la primera gota de referencia basandose en el tiempo de flujo medido de la primer gota de referencia mediante la medicion de la seccion 5a del canal de reaccion 5;
- calcular la resistencia hidrodinamica del canal de reaccion 5 durante el flujo de la segunda gota de referencia
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junto con la secuencia de gotas de ensayo (que tiene de 1 a 1000 gotas de ensayo) basandose en el tiempo de flujo medido de la segunda gota de referencia a traves de al seccion de medicion 5a del canal de reaccion 5;
- determinar si la aglutinacion se produce o no comparando los resultados obtenidos. Si la se produce la aglutinacion en las secuencia de las gotas de ensayo, entonces el flujo de la gota(s) de ensayo (junto con la segunda gota de referencia) producen un aumento de la resistencia hidrodinamica del canal de microflmdica (canal de reaccion 5) en comparacion con la resistencia calculada para este canal durante el flujo de las gotas no aglutinadas (es decir, la secuencia de la secuencia de gotas de ensayo no aglutinadas. Lo que se va a comparar es el valor de la resistencia hidrodinamica, calculada como se describe posteriormente, para a) primera gota de resistencia y b) segunda gota de resistencia y una secuencia (“tren”) de las gotas de ensayo fluyendo despues de la segunda gota de referencia.
A continuacion se describe el procedimiento para la determinacion de la aglutinacion de acuerdo con la invencion con mas detalle:
A continuacion de la carga de los canales de microflmdica 1,2, 5 con la fase continua, se introduce un volumen conocido de una muestra lfquida, por ejemplo en una cantidad de 60 nl - 1,5 pl en el primer canal de admision 1, por ejemplo por medio de un puerto de muestra. La tension superficial entre la muestra lfquida y la fase continua mantiene la muestra proporcionada en forma de gota 8 de manera que no se mezclara con la fase continua 10 en el canal.
En el caso de un ensayo de sangre, la muestra de sangre que se va a investigar puede ser sangre completa (no centrifugada, extrafda utilizando un procedimiento adecuado conocido en la tecnica. Por ejemplo, la muestra de sangre se puede extraer en un deposito anticoagulante. Dependiendo del procedimiento de extraccion y el tipo de envase (por ejemplo, un tubo) las siguientes sustancias son adecuadas para utilizarse como el anticoagulante: acido etilendiaminotetraacetico (EDTA) o su sal sodica - EDTA disodico (EDTA-Na2), citrato trisodico o acido cftrico, oxalato sodico u oxalato potasico, heparina (como una sal de sodio, litio o calcio). No obstante, el procedimiento que se presenta en el presente documento es aplicable independientemente del deposito en el que se recolecta la sangre.
La gota de una muestra lfquida 8 de un volumen pre-determinado se introduce en el canal de admision 2 y fluye corriente abajo de este canal 2. La gota de solucion salina 9 de un volumen pre-determinado se introduce en el canal de admision y fluye corriente abajo en el canal 9. La gota de la muestra lfquida y la gota de solucion salina se mezclan en la region de mezclado 3, formando de esta manera una primera gota de referencia de un volumen pre- determinado. La primera gota de referencia formada se introduce en el canal de reaccion 5 y fluye corriente abajo a traves del canal de reaccion 5, que preferentemente es serpenteante para proporcionar una mezcla mejor de los componentes de la gota. Los detectores 6, 7 miden el tiempo de flujo de la primera gota de referencia a traves de la seccion de medicion 5a del canal de reaccion 5. La longitud de la seccion de medicion 5a es preferentemente de 10 cm. Es importante que la primera gota de referencia sea la unica gota presente en el canal de reaccion durante la medicion del tiempo de flujo de la primera gota de referencia. Esta medicion sirve como medicion de calibracion que se tiene en cuenta en los calculos descritos posteriormente con mas detalle.
Despues de que la primera gota de referencia deja el canal de reaccion, la segunda gota de referencia se introduce en el canal de reaccion 5. Como ya se ha mencionado, la segunda gota de referencia debena ser de la misma composicion y del mismo volumen que la primera gota de referencia. Por lo tanto, la segunda gota de referencia es exactamente la misma que la primera gota de referencia. La segunda gota de referencia puede generarse por ejemplo de la misma manera que la primera gota de referencia.
A continuacion de la introduccion en el canal de reaccion 5 de la segunda gota de referencia, se introduce la secuencia de gotas de ensayo que comprenden, preferentemente desde 1 a 1000 gotas de ensayo en el canal de reaccion, por lo tanto, la secuencia de gotas de ensayo sigue a la segunda gota de referencia fluyendo corriente abajo a traves del canal de reaccion 5. Asf, la segunda gota de referencia junto con la secuencia de las gotas de ensayos forma una serie de gotas fluyendo en la misma direccion a traves del canal de reaccion 5. La distancia entre las gotas respectivas en la serie se debena seleccionar de manera que se asegure la separacion de las gotas entre ellas durante la longitud completa del canal de reaccion 5 durante el flujo de la serie de gotas a traves del canal de reaccion 5.
Mientras una serie de gotas fluye a traves del canal de reaccion 5, se mide el tiempo de flujo de la segunda gota de referencia a traves de la seccion de medicion 5a. Esto significa que durante la medicion del tiempo de flujo de la segunda gota de referencia, a traves de seccion de medicion 5a, la serie de gotas (la segunda gota de referencia y la secuencia de gotas de ensayo, es decir, un numero predeterminado de gotas de ensayo) esta presente en el canal de reaccion 5.
Las gotas de ensayo, que se van a introducir en el canal de reaccion 5 despues de la segunda gota de referencia, se pueden generar de la siguiente manera:
Se introduce un volumen conocido de la muestra lfquida 8, la misma que la muestra lfquida de la primera y segunda gotas de referencia en el canal de admision 2. El volumen conocido del reactivo 9, que comprende el
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anticuerpo monoclonal o policlonal, se introduce en el dispositivo mediante la segunda entrada del canal 1. El reactivo 9 fluye a lo largo de la segunda entrada del canal 2 para mezclarse en la region de mezcla 3 con la muestra 8, formando de esta manera la gota de ensayo 11, en el punto de mezclado 3. Sin embargo, el reactivo
9 se puede introducir en la region de mezcla de una manera diferente, por ejemplo el reactivo 9 puede depositarse en la region de mezcla 8.
La afinidad del agua del reactivo 9 y la muestra 8 debena ser similar o preferentemente la misma. El reactivo puede comprender un anticuerpo monoclonal o policlonal, por ejemplo, anti-A, anti-B o anti-D u otros, y debenan ser capaces de producir una reaccion de aglutinacion con el antfgeno si esta presente en la muestra (especificidad).
Opcionalmente, a continuacion de la introduccion de un volumen de muestra pre-determinado en el canal de admision 1, la muestra 8 se puede dividir generando una secuencia de gotas, cada una del mismo volumen, preferentemente en el intervalo de desde 60 a 300 [nl], y mas preferentemente cada una tiene un volumen de 64 nl. Cada gota de la muestra se va a mezclar con la gota de un reactivo que contiene el mismo anticuerpo monoclonal o policlonal conocido.
La secuencia formada de gotas de muestra fluye en direccion corriente abajo de manera que se mezclan, una a una, con volumenes determinados (gotas) del mismo reactivo 9 en la region de mezclado 3 del sistema de microflmdica para formar una secuencia de gotas de ensayo. Cada gota de ensayo fluye en direccion corriente abajo a traves del canal de reaccion 5 del dispositivo de microflmdica.
El canal de reaccion 5 esta provisto con los detectores 6, 7 espaciados a cierta distancia del canal de reaccion 5, definiendo la seccion de medicion 5a del canal de reaccion 5. Preferentemente, el canal de reaccion 5 es sustancialmente largo y se le da forma de una pluralidad de meandros de manera que el canal de reaccion 5 junto con la seccion de medicion 5a del canal de reaccion 5 es un canal serpenteante. Los detectores 6, 7 miden el tiempo de flujo de cada gota de referencia que fluye a traves de la distancia de la seccion de medicion 5a. Los datos obtenidos se utilizan adicionalmente para el calculo de la resistencia hidrodinamica del sistema completo, es decir, la hidrodinamica del canal de reaccion con resistencia hidrodinamica de las gotas que fluye. Preferentemente, el volumen de las gotas de referencia y las gotas de ensayo se escoge preferentemente de manera que cada gota sea 3 a 4 mas larga que la anchura del canal.
A continuacion se presenta las etapas para llevar a cabo la medicion:
1. generacion de una primera gota de referencia mezclando la gota de muestra con la solucion o PBS que sirve como marcador.
2. medicion del tiempo de flujo de la primera gota de referencia a traves de la seccion de medicion 5a del canal de reaccion 5 y el calculo de la resistencia hidrodinamica de la primera gota de referencia (rd) junto con la resistencia de un canal (R): rd + R
3. generacion de una segunda gota de referencia, exactamente la misma que la primera gota de referencia, y entonces, despues de que la segunda gota de referencia haya viajado una cierta distancia de aproximadamente
10 a 20 anchuras de canal, que es particularmente util para alcanzar la falta de interaccion entre la gota de referencia y las gotas de ensayo), la generacion de una secuencia de n gotas de ensayo (donde n = (1, 1000)) que contienen la muestra lfquida y un cierto reactivo; las gotas debenan ser 3-4 veces mas largas ( dicha longitud de las gotas caracteriza la sensibilidad mas alta de cambio de viscosidad) que la anchura del canal y separadas entre ellas 2.5 veces la anchura del canal (para conseguir la distancia segura entre las gotas lo que previene las colisiones (de un lado) y producir simultaneamente el aumento de interaccion entre las gotas (por el otro lado)),
4. medicion del tiempo de flujo de la segunda gota de referencia a traves de la seccion de medicion 5a del canal de reaccion 5 y el calculo de la resistencia hidrodinamica junto con la resistencia de un canal (R + rd + nrn),
5. comparacion del tiempo de flujo de la segunda gota de referencia con el tiempo de flujo de la primera gota de referencia hace posible el calculo de la relacion nrn/(R+rd)
Las etapas 3, 4, y 5 debenan repetirse tantas veces como numero de individuos se vayan a detectar. Debido a que cada secuencia de gotas de ensayo comprende el mismo reactivo, las etapas 3, 4 y 5 se debenan repetir para diferentes reactivos conocidos. En este procedimiento cada secuencia de gotas debena ser similar, es decir, el mismo numero de gotas en la secuencia, el mismo volumen de la muestra lfquida y el mismo volumen de reactivo en las gotas de ensayo, pero cada secuencia de las gotas de ensayo tiene diferentes reactivos conocidos (por ejemplo, diferentes anticuerpos monoclonales o policlonales)
La Fig. 2A -2B es una representacion esquematica util para los calculos de cambio de resistencia hidrodinamica de una unica gota (Fig. 2A), y una secuencia de gotas (Fig. 2B).
El tiempo de flujo de una unica gota (es decir, la segunda gota de referencia) 12 en presencia del canal de reaccion 5, la secuencia de gotas de ensayo 13, a la distancia D medida por los detectores fijados en puntos de control, da los datos utilizados en el calculo de la resistencia hidrodinamica.
La segunda gota de referencia se introduce en el canal despues de que la primera gota de referencia haya dejado el canal, de manera que no este influenciado el flujo de la primera gota de referencia por la segunda gota de
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referencia.
El tiempo de flujo de la primera gota de referencia a traves de la seccion de medicion 5a del canal de reaccion 5 depende de su viscosidad endogena, mientras que el flujo de tiempo de la gota depende de la viscosidad endogena y la carga de su viscosidad producida por la reaccion con el reactivo de aglutinacion.
Comparando la resistencia hidrodinamica del sistema (es decir, canal de reaccion + gota respectiva)) se obtiene informacion aproximadamente la presencia de un antigeno en la muestra de ensayo.
La resistencia hidrodinamica se calcula utilizando las siguientes formulas:
en las que:
P - movilidad de la gota de referencia vi -velocidad lineal de una gota V- velocidad media de la fase continua
nrn - resistencia hidrodinamica de la secuencia de gotas analizadas
ti - tiempo de deteccion de la primera gota de referencia bajo el primer detector
t2 - tiempo de deteccion de la primera gota de referencia bajo el segundo detector
ti' - tiempo de deteccion de la segunda gota de referencia bajo el primer detector
t2' - tiempo de deteccion de la segunda gota de deteccion bajo el segundo detector
D - distancia entre detectores
R - resistencia hidrodinamica de un canal
S - area de la seccion transversal del canal
rd- resistencia hidrodinamica de una gota unica
Q - tasa volumetrica de flujo en un canal
p - presion que induce el flujo
Habiendo dado el tiempo de flujo de la primera gota de referencia, de la formula I se puede utilizar para el calculo de la movilidad de la gota de referencia (p), ya que D (distancia entre detectores), S (area de la seccion transversal del canal) son valores conocidos. Ademas, Q (tasa volumetrica del flujo en un canal) - se calcula pesando el lfquido que fluye fuera del chip en una balanza en el tiempo fijo y calculando Q como una relacion del volumen de lfquido que sale fluyendo (calculado basado en el peso) y el tiempo.
Los siguientes valores de ti y t2 - medidos para la primera gota de referencia, y los valores ti', t2' medidos para la segunda gota de referencia se pueden utilizar para el calculo de la resistencia hidrodinamica del sistema utilizando la formula II - para el calculo de la resistencia hidrodinamica del sistema durante el flujo de esta gota, y utilizando la formula III - para el calculo de la resistencia hidrodinamica del sistema durante el flujo de la serie de gotas que consiste en la segunda gota de referencia y la secuencia de gotas de ensayo.
La presion que induce el flujo (p) constituya la diferencia de presion sobre el reservorio con la fase continua (aceite), y la presion atmosferica. El reservorio de fase continua es un dispensador que introduce la fase continua en el dispositivo de microflrndica.
A continuacion se lleva a cabo la etapa de calibracion. La calibracion se lleva a cabo para una variedad de secuencias de gotas de ensayo, es decir, las secuencias de gotas de ensayo aglutinadas y las gotas de ensayo no aglutinadas de viscosidad conocida. La calibracion se lleva a cabo de la siguiente manera. Se generan secuencias de gotas que comprende distintos numeros n de gotas, por ejemplo, para n de 1 a 100. UN tipo de secuencias se
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genera con gotas con aglutinacion y otro tio de secuencias se genera con gotas sin aglutinacion. Como resultado de la calibracion, se pueden obtener los valores de resistencia hidrodinamica, respecto a determinadas secuencias de gotas. Estos valores pueden someterse a algun error estandar (desviacion). La calibracion permite determinar, para cada numero n mmimo de gotas si es posible distinguir el valor de resistencia hidrodinamica de una secuencia de gotas en la que se produce la aglutinacion y de una secuencia de gotas en la que no se produce la aglutinacion. La calibracion proporciona resultados espedficos del dispositivo, dependiendo por ejemplo de su estructura y configuracion de los canales de admision y valvulas.
La calibracion da la informacion del menor numero de gotas de ensayo n que se debenan generar como una secuencia de gotas de ensayo que se van a introducir en el canal de reaccion 5 despues de la segunda gota de referencia con el fin de ser capaces de distinguir la secuencia en la que se produce la aglutinacion de las en donde no se produce la aglutinacion.
Los resultados de los ensayos que se han llevado a cabo muestran que se puede obtener una distincion cien por cien (100%) fiable para la secuencia de gotas de ensayo que tienen tres gotas de ensayo (n = 3) que fluyen despues de la segunda gota de referencia en el canal de reaccion 5. La expresion: 'una distincion cien por cien fiable' se entiende como la suma de desviaciones estandar medias triplicadas medidas para 100 gotas de ensayo aglutinadas y 100 gotas de ensayo no aglutinadas, respectivamente.
No obstante, para algunas mediciones, la secuencia de gotas de ensayo puede consistir en una gota de ensayo (n = 1) que da una distincion fiable entre la resistencia hidrodinamica de las series de gotas aglutinadas y no aglutinadas.
Las mediciones para la primera gota de referencia se llevan a cabo para determinar la resistencia hidrodinamica de esta gota. Sin embargo, no es necesario determinar el valor exacto de la resistencia hidrodinamica, sino que es suficiente determinar cuanto ha cambiado la resistencia del sistema con respecto al flujo de la fase continuo. Se senalara que el aumento de la resistencia hidrodinamica del sistema (es decir, el flujo de la fase continua con la gota) habitualmente produce una reduccion de la tasa volumetrica del flujo. Ademas, la medicion de la primera gota de referencia se puede tratar como una medicion de calibracion. A continuacion, se introduce una segunda gota de referencia, que continua con una secuencia de gotas de ensayo y cuya resistencia hidrodinamica se va a calcular. La distancia particular de la segunda gota de referencia y las gotas de ensayo se fija con el fin de reducir las interacciones entre la secuencia de gotas de ensayo y la segunda gota de referencia (dichas interacciones podnan producir resultados falsos). Como se ha mencionado en el presente documento, cada gota cambia la resistencia hidrodinamica del sistema, y esto tiene influencia en la tasa volumetrica del flujo de la fase continua. Por otro lado, el cambio de la tasa volumetrica del flujo es visible en el sistema completo; por lo tanto la segunda gota de referencia detecta la presencia de gotas adicionales cambiando su velocidad. El cambio de la velocidad de la segunda gota de referencia y la comparacion de la velocidad de la segunda gota de referencia y la primera gota de referencia (introducida individualmente en el sistema) permite calcular el cambio de resistencia hidrodinamica introducida en el sistema por las gotas de ensayo.
Cuando las gotas de ensayo se mueven en una secuencia, forman una especie de “tren” (secuencia) y tienen influencia entre ella. Las mediciones han demostrado que esta influencia aumenta (o a veces disminuye) la resistencia hidrodinamica de los lfquidos medidos, que es beneficioso para la medicion.
A continuacion se describe los estadios ejemplares de tipaje de sangre con el uso de las mediciones de resistencia hidrodinamica:
1. Cargar los canales con la fase continua.
2. La introduccion de una muestra (1-1,5 pl) en el canal de admision.
3. Division de una muestra generando una secuencia de 3 gotas, de 250 nl cada una.
4. Generacion de una primera gota de referencia que comprende solucion salina/PBS (312 nl) y la muestra (250 nl.
5. Mediciones de resistencia hidrodinamica de la primera gota de referencia.
6. Generacion de una segunda gota de referencia que comprende solucion salina/PBS (312 nl) y la muestra (250 nl, y entonces la gota de ensayo que comprende el reactivo (64 nl) con anticuerpos monoclonales (anti-A) mezclados con la primera gota de sangre.
7. Las mediciones del tiempo de flujo de la segunda gota de referencia que fluye con la gota de ensayo a traves del canal, y entonces el calculo de la resistencia hidrodinamica en el canal de microflmdica durante el movimiento de gotas analizadas.
8. Generacion de una segunda gota de referencia que comprende solucion salina/PBS (312 nl) y la muestra (250 nl) y entonces una gota de ensayo que comprende un reactivo (64 nl) con anticuerpos monoclonales (anti-B), distintos de los de la etapa previa, mezclados con la segunda gota de sangre.
9. Las mediciones del tiempo de flujo de la segunda gota de referencia durante el movimiento de las gotas analizadas y el calculo de la resistencia hidrodinamica del canal de microflmdica.
10. Generacion de una segunda gota de referencia que comprende solucion salina /PBS (312 nl) y muestra (250 nl) y entonces una gota de ensayo que comprende un reactivo (64 nl) con anticuerpos monoclonales (anti-D), distintos de los de la etapa previa, mezclados con la segunda gota de sangre.
11. Mediciones del tiempo de flujo de la segunda gota de referencia durante el movimiento de gotas analizadas y
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calculo de la resistencia hidrodinamica del canal de microflmdica.
12. Determinacion de si se produce la aglutinacion en gotas de ensayo individuales o no por comparacion de la resistencia hidrodinamica por su flujo a traves del canal de microflmdica con la resistencia en el canal de microflmdica durante el flujo de la gota de referencia.
Un factor externo que tiene influencia directamente en el tiempo de flujo es la geometna de un canal, en particular:
i) la seccion transversal de un microcanal, preferentemente rectangular, con un aspecto de relacion de lados 1:3 o 1:4,
ii) la longitud de una parte del canal de microflmdica en que las mediciones se han llevado a cabo, y tambien
iii) la viscosidad de la fase continua,
iv) la presencia o ausencia de tensioactivo en/o ambas fases, o
v) el caudal de la fase continua.
Todos estos parametros deben fijarse arbitrariamente. No obstante, se supone que las condiciones iniciales se van a fijar de manera que el procedimiento completo -desde la introduccion de la muestra hasta la lectura del resultado - toma poco tiempo, aproximadamente pocos minutos.
Para los fines de los ensayos antes de la transfusion se debe aumentar el numero de etapas en las que las gotas con muestras de sangre se generan y mezclan con los reactivos por el numero de antigenos que se van a detectar. Esto se aplica en el procedimiento hidrodinamico para la deteccion de la aglutinacion.
En vez de sangre completa se pueden utilizar globulos rojos convencionalizadas con ciertos antfgenos (conocidos) en su superficie. Los reactivos monoclonales deben por lo tanto remplazarse por el suero o plasma del paciente de manera que el ensayo mostrara la presencia de anticuerpos en su sangre. Esta variante puede ser una parte del tipaje de sangre o procedimiento de ensayo cruzado, o sirve como un ensayo individual para la deteccion de otros anticuerpos, cuya presencia puede indicar infeccion, tanto bacteriana como vmca, o incluso una enfermedad autoinmunologica (por ejemplo, tiroiditis de Hashimoto).
A continuacion se describe los estadios ejemplares del ensayo directo de Coombs (DCT)/ensayo directo de anti- globulina (DAT) con el uso de las mediciones de resistencia hidrodinamica:
1. Cargar los canales con la fase continua.
2. Introduccion de una muestra (0,5-1 pl) en la entrada del canal.
3. Division de la muestra generando una secuencia de 2 gotas, de 250 nl cada una.
4. Generacion de una gota de solucion salina/PBS (64 nl) y mezclarla con la primera gota de sangre en la camara - primera gota de referencia.
5. Mediciones del tiempo de flujo y calculo de la resistencia hidrodinamica de esta primera gota de referencia en el canal de microflmdica durante su movimiento.
6. Generacion de una segunda gota de referencia, exactamente la misma que la primera gota de referencia, y generacion de una gota de un suero anti-globulina (reactivo de Coombs) (64 nl) y mezclado con la segunda gota de sangre en la camara - gota de ensayo.
7. Mediciones del tiempo de flujo de la segunda gota de referencia durante el movimiento de la segunda gota de referencia y la gota de ensayo a traes del canal y calculo de la hidrodinamica en el canal de microflmdica durante el movimiento de estas gotas.
8. Determinacion de si se produjo la aglutinacion en la gota de ensayo o no por comparacion de su resistencia hidrodinamica con la resistencia hidrodinamica de la gota de referencia.
Preferentemente, se utiliza el hexadecano como fase continua. Tambien se puede utilizar Fluorinert (por ejemplo, FC50, HFE-7500), que se utiliza comunmente en tecnicas microflmdicas para aplicaciones bioqmmicas, asf como otros aceites minerales. La eleccion del aceite se debena basar en la humectabilidad del material con que se fabricaran los canales y de la tension superficial entre el aceite considerado y el material analizado.
Cualquier interaccion fisicoqmmica entre la fase continua y el material del que esta fabricado el canal de microflmdica descalifica dicha combinacion. Por ejemplo, algunos polfmeros elasticos, tales como el polidimetilsiloxano (PDMS), se hincha en contacto con cualquier aceite. Esto da como resultado el acortamiento de su vida de trabajo y limita marcadamente los lfmites del espectro de aplicaciones en las que se puede utilizar dicho material.
La biocompatibilidad de la fase continua y el material del canal de microflmdica es un problema importante. Un material preferido para el canal de microflmdica es el policarbonato, primeramente debido a su precio relativamente bajo y facil de procesar. Ademas, hay un procedimiento espedfico que se desarrolla haciendo su superficie hidrofoba. La translucidez del material que se escoja tambien es importante. El canal de microflmdica no tiene que ser completamente transparente, sin embargo debena ser capaz de un analisis optico del interior de al menos partes clave del canal, es decir, los puntos de control (al menos dos) en el que se disponen los detectores. Tambien se puede utilizar el polilactido (PLA) como material para el canal de microflmdica debido a su transparencia, hidrofobia, biocompatibilidad y capacidad de biodegradarse.
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Preferentemente, el canal tiene una seccion transversal rectangular o cuadrada. Es mas favorable que la seccion transversal circular debido a una disposicion de pares de remolinos que aparecen dentro de las gotas que fluyen. En una gota que fluye a traves de un canal rectangular o cuadrado, los pares de remolinos se disponen de tal manera que se aumenta la mezcla de su contenido. Estos remolinos tambien son responsables de la reunion de agregados, tales como aglutinados (complejos antfgeno-anticuerpo), en la parte posterior o anterior de una gota. Esto hace posible otro procedimiento (de confirmacion) para la deteccion de la aglutinacion - por mediciones de la intensidad de la luz que pasa a traves de la gota o comparando el contraste entre las gotas analizadas de una cierta muestra.
Un ejemplo de dicha distincion se presenta en la Fig. 3. La intensidad de la luz se convierte en amplitud de tension por un convertidor de luz en tension. La gota sin aglutinacion es homogenea, al contrario que la gota de la muestra con aglutinacion. El proceso de aglutinacion y la acumulacion adicional de agregados en la parte trasera de una gota da como resultado una distribucion no homogenea del contenido de la gota. Cualquier discrepancia entre la gota analizada y la lmea base asignada a una gota homogenea indica una reaccion que tiene lugar en el interior.
La longitud de los canales es de menor importancia. Debena ser capaz de mezclar apropiada y suficientemente el contenido de las gotas. Esto puede estar influenciado por su longitud o la forma serpenteante. Preferentemente, ambas de estas caractensticas se pueden combinar para obtener el mejor efecto.
El volumen de la gota se puede ajustar de acuerdo con la anchura del canal de microflmdica. Como el procedimiento reologico se basa en el cambio de resistencia hidrodinamica, se desea fijar un volumen para el que el cambio es el mas observable. Para los canales con la seccion transversal cuadrada y un ancho de 360 pm este efecto esta aumentado en gotas que tiene un volumen de 320 nl (como se describe en Phys. Rev. Lett., 2012, 108, 134501S. Jakiela, P. M. Korczyk, S. Makulska, O. Cybulski y P. Garstecki,). Ademas, para los analisis de muestras de sangre o globulos rojos (RBC) en contacto con reactivos monoclonales/plasma/suero, la proporcion preferida es 256 nl y 64 nl, respectivamente. Estas condiciones proporcionan la mayor diferencia en la movilidad de las gotas aglutinadas y no aglutinadas.
Ejemplo
El ensayo se llevo a cabo con el uso de sangre humana completa como muestra, y reactivos monoclonales disponibles en el mercado (como se utiliza en los laboratorios analfticos) como un reactivo que contiene anticuerpos. El area de deteccion comprende un canal de 10 cm de largo equipado con dos fotodiodos que sirven como detectores opticos y puntos de control a la vez. Los resultados de las mediciones de la resistencia hidrodinamica se presentan en la Fig. 4. La resistencia hidrodinamica tfpica es significativamente diferente para las gotas aglutinadas y no aglutinadas. La diferencia alcanza incluso un 10 % en las muestras de sangre humana completa.
Las barras de error marcan la desviacion estandar media de cada muestra, es decir una a en distribucion normal, y la triple a tambien. No hay solapamiento de triple a de las muestras aglutinadas y no aglutinadas. Por lo tanto, la probabilidad de un fallo en el tipaje es practicamente cero. La muestra con la peor precision tema un valor de a multiple ligeramente por encima de 4. Que implica que la minima fiabilidad de estas mediciones es mayor del 99,9991 % (1 error por cada millon de ensayos).
La fiabilidad de la cabecera de los ensayos de aglutinacion ABO que se llevan a cabo con tarjetas especiales puede variar y es del 93 % al 99 % (cuando se combina con otro ensayo). En el caso de la deteccion de un antfgeno A debil (A2) que se lleva a cabo con cartas la fiabilidad cae por debajo del 40 %. Como se puede ver en la Fig. 3 no hay diferencia significativa en la fiabilidad de deteccion de este antfgeno utilizando el procedimiento reologico en comparacion con una deteccion de A1. Es mas, la deteccion de antfgenos del sistema Kell se mantiene en el mismo alto nivel de fiabilidad.
La existencia de transfusiones ABO incompatibles se ha informado que vana de 1 a 250 por cada 100000 unidades de transfusion. El tipaje incorrecto (tanto por errores tecnicos como administrativos) utilizando procedimientos convencionales constituye aproximadamente el 13 % de errores de transfusion. Los errores se deben no solo a la tecnica de ensayo, sino a menudo resulta tambien de errores en el procedimiento y del manejo impropio de las muestras.
Lo que es importante es que el presente procedimiento no necesita el pre-procesamiento de la sangre tal como la centrifugacion. Otra ventaja es la poca cantidad de sangre necesaria para llevar a cabo el ensayo. Los procedimientos convencionales necesitan de 5-15 ml de sangre para el tipaje, y otro tanto para el ensayo cruzado. En el procedimiento hidrodinamico solo se necesita un microlitro de sangre mas o menos.
En los ensayos tales como PCR, LAMP o ELISA, el aumento del numero de cadenas de polfmero, ADN u otras moleculas dentro de una gota debenan resultar en un cambio medible de su resistencia hidrodinamica. Sin embargo, no hay datos concluyentes en la bibliograffa para confirmar o negar esta suposicion.
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REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento de determinacion de la aglutinacion de un Kquido biologico midiendo un cambio de la resistencia hidrodinamica del Uquido biologico que fluye a traves de un canal de microflmdica de un dispositivo de microflmdica, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
a) calibrado del dispositivo de microflmdica calculando un valor calibrado de la resistencia hidrodinamica de una secuencia de gotas de un lfquido biologico conocido en el que se produce la aglutinacion y un valor calibrado de una secuencia de gotas de un lfquido biologico conocido en el que no se produce aglutinacion, de acuerdo con las etapas (b)-(i) que se llevan a cabo posteriormente para un lfquido biologico de ensayo;
b) carga del canal de reaccion (5) de microflmdica con una fase lfquida continua hidrofoba, teniendo el canal de reaccion de microflmdica detectores (6, 7) espaciados a la distancia que define la seccion de medicion (5a) del canal de reaccion de microflmdica, en el que la presion que induce el flujo en el canal de reaccion (5) de microflmdica constituye la diferencia de presion en el deposito con la fase continua y la presion atmosferica;
c) introduccion una primera gota de referencia en el canal de reaccion (5) de microflmdica, siendo una gota del lfquido biologico mezclada con solucion salina o PBS o agua y no miscible como la fase continua;
d) produccion del flujo de la primera gota de referencia a traves del canal de reaccion (5) de microflmdica que tiene una seccion de medicion (5a);
e) medicion del tiempo de flujo de la primera gota de referencia a traves de la seccion de medicion (5a) del canal de reaccion (5) de microflmdica;
f) introduccion en el canal de reaccion (5) de microflmdica de una segunda gota de referencia que es la misma que la primera gota de referencia, seguida por una secuencia de 1 a 1000 gota(s) de ensayo, siendo la gota(s) de ensayo gota(s) de un lfquido biologico que el mismo que comprenden las gotas de referencia, y el agente de aglutinacion y no miscible con la fase continua;
g) hacer fluir la segunda gota de referencia y la secuencia de gota(s) de ensayo a traves del canal de reaccion (5) de microflmdica;
h) medicion del tiempo de flujo de la segunda gota de referencia a traves de la seccion de medicion (5a) en presencia de la secuencia de la gota(s) de ensayo en el canal de reaccion (5) de microflmdica;
i) calculo de la resistencia de hidrodinamica de la primera gota de referencia y la segunda gota de referencia que esta seguida por la secuencia de gota(s) de ensayo, basandose en los resultados obtenidos del tiempo de flujo formado en las etapas: e y h; y
j) determinacion de la aglutinacion del lfquido biologico comparando el valor calculado de la resistencia hidrodinamica de la primera gota de referencia con el valor calculado de resistencia hidrodinamica de la segunda gota de referencia, en el que la aglutinacion se produce en la secuencia de gota(s) de ensayo si el valor calculado de la resistencia hidrodinamica de la segunda gota de referencia ha aumentado en comparacion con el valor calculado de la resistencia hidrodinamica de la primera gota de referencia.
2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1 en el que la fase continua separa la gota de la superficie de la pared del canal de microflmdica.
3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en el que el lfquido biologico es una muestra de sangre completa, plasma, suero o corpusculos aislados.
4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en el que el lfquido biologico es una muestra de saliva.
5. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en el que el lfquido biologico es una muestra de orina.
6. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 3, en el que para el tipaje de sangre, el reactivo de aglutinacion
comprende anticuerpos monoclonales seleccionados de entre el grupo que consiste en anticuerpos del sistema de
grupos sangmneos (anti-A, anti-B y anti-D).
7. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones previas, en el que la fase continua se selecciona de entre el grupo que consiste en hexadecano, Fluorinert y aceite mineral.
8. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones previas, que comprende la introduccion en el canal de reaccion (5) de microflmdica de dos gotas de referencia que tienen el mismo volumen.
9. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones previas, en el que la secuencia de gota(s) de ensayo se introduce en el canal de reaccion (5) de microflmdica despues de que la segunda gota de referencia haya viajado una distancia de desde 10 a 20 anchos del canal de reaccion (5) de microflmdica.
10. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones previas, en el que las gotas de ensayo tienen un tamano de desde 3 a 4 anchos del canal de reaccion (5) de microflmdica.
11. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 10, en el que la distancia entre las gotas de ensayo introducidas en el canal de reaccion (5) de microflmdica es desde 2 a 5 anchos del canal de reaccion (5) de microflmdica.
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