PL219803B1 - Sposób oznaczania grupy krwi i układ do oznaczania grupy krwi - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób oznaczania grupy krwi, obejmujący otrzymanie próbki poprzez zmieszanie materiału badanego z materiałem wzorcowym oraz detekcję aglutynacji w tak otrzymanej próbce. Wynalazek obejmuje także układ do oznaczania grupy krwi, umożliwiający stosowanie tego sposobu.

Ze względu na małą objętość kropli, a co za tym idzie niewielkie zużycie reagentów potrzebnych do analiz, układy mikroprzepływowe znajdują coraz więcej zastosowań, nie tylko naukowych tzw. „laboratorium w chipie” (z ang. lab-on-chip), ale także biomedycznych, jako urządzenia funkcjonujące przy łóżku pacjenta (tzw. Point-Of-Care).

Typowo, mikroukłady kropelkowe posiadają mnogość kanałów mikroprzepływowych, z ich wlotami i wylotami, które mogą się łączyć i dzielić wewnątrz układu, w których tworzone są krople roztworów otoczonych niemieszającą się z nimi fazą ciągłą. Dalej, krople wewnątrz układów mogą być łączone, transportowane wzdłuż kanałów z wymieszaniem ich zawartości, przetrzymywane w ustalonych lub zmiennych warunkach i wreszcie sortowane lub dzielone na rozgałęzieniach kanałów i odzyskiwane z układu. Wykorzystanie mikrolaboratoriów do prowadzenia reakcji chemicznych i biochemicznych wewnątrz mikrokropli posiada następujące zalety [H. Song, D. L. Chen i R. F. Ismagilov, Ang Chem int Ed, 2006, 45, 7336-7356]: i) brak dyspersji czasu przebywania elementów płynu w kanale tj. brak poszerzenia dyfuzyjnego Taylora produktu reakcji chemicznej zachodzącej w trakcie przepływu reagentów przez kapilarę, ii) szybkie i efektywne mieszanie, iii) możliwość łatwej kontroli kinetyki reakcji, iv) możliwość prowadzenia wielu reakcji równolegle oraz v) mała konsumpcja reagentów, vi) przyspieszona detekcja wyników reakcji (mała objętość kropli powoduje, że produkty reakcji szybciej osiągają mierzalne stężenie).

Ze względu na te cechy mikroukłady kropelkowe mogą być cennym narzędziem dla chemii analitycznej, chemii syntetycznej, biochemii, mikrobiologii, diagnostyki medycznej czy też diagnostyki molekularnej.

W stanie techniki oznaczanie grupy krwi polega na badaniu krwinek czerwonych wyizolowanych z krwi pacjenta w kontakcie z przeciwciałami wzorcowymi. Dla potwierdzenia wyniku bada się surowicę pacjenta w kontakcie z krwinkami wzorcowymi zawierającymi określone antygeny. Testy takie przeprowadza się w probówkach bądź na płytkach szklanych, poprzez zmieszanie ze sobą poszczególnych próbek oraz obserwację pod kątem pojawienia się aglutynacji. Jeśli w próbce znajdują się antygeny i specyficzne dla nich przeciwciała, następuje aglutynacja, czyli zlepianie się krwinek czerwonych - tworzą one różnej wielkości aglomeraty. Detekcja dokonywana jest gołym okiem laboranta.

Na podstawie obecności konkretnych antygenów na badanych krwinkach określa się grupę krwi. Czas takiej analizy to ok. 10-15 minut, a ilość krwi pobranej od pacjenta to 5-10 ml.

W przypadku próby zgodności serologicznej dawcy i biorcy przed transfuzją (próby krzyżowe) najpierw dokonuje się oznaczenia grupy krwi obu badanych, tak jak to opisano powyżej. Następnie, tą samą metodą, sprawdza się obecność innych najczęściej występujących antygenów. Po uzyskaniu pełnej charakterystyki krwi dawcy i biorcy dokonuje się właściwej próby krzyżowej. W tym celu bada się surowicę biorcy w kontakcie z krwinkami czerwonymi dawcy, aby sprawdzić, czy nie zawiera ona jakichkolwiek innych przeciwciał odpornościowych, skierowanych przeciwko krwinkom czerwonym dawcy. Brak aglutynacji wskazuje na zgodność serologiczną. Pełna próba krzyżowa trwa ok. 60 minut i wymaga pobrania dodatkowych próbek krwi od badanych [po ok. 10 ml].

W stanie techniki istnieją już rozwiązania mające na celu zmniejszenie zużycia materiału biologicznego i skrócenie czasu samego badania [Anal Bioanal Chem, 2011, 399, 1869-1875; Anal. Chem., 2010, 82, 4158-4164; Lab Chip, 2006, 6, 794-802], jednakże opierają się one na detekcji gołym okiem, co w przypadku słabiej aglutynujących antygenów może być przyczyną niezamierzonego zafałszowania wyniku przez samego badającego. Co więcej, rozwiązania takie nie sprawdzają się w przypadku prób krzyżowych, które wymagają przeprowadzenia kilkunastu, a nawet kilkudziesięciu podobnych testów.

W stanie techniki istnieją także rozwiązania angażujące złożone układy do detekcji, eliminujące błąd ludzki [Anal. Chem., 2008, 80, 6190-6197; Biomed Microdevices, 2009, 11, 217-229], wymagają one wciąż zaangażowania badającego do interpretacji wyniku.

Wszystkie znane w stanie techniki metody oznaczania grup krwi wymagają rozróżnienia próbek zaglutenowanych od nie-zaglutenowanych na podstawie pomiaru rozpraszania światła. Pomiar ten wykonywany jest albo w sposób subiektywny przez laboranta (gołym okiem, lub z wykorzystaniem

PL 219 803 B1 instrumentów optycznych), lub poprzez zautomatyzowane urządzenia rozróżniające natężenia światła przechodzącego przez próbkę lub od niej odbitego.

Moduły mikroprzepływowe opisane w poprzednich zgłoszeniach zespołu doc. Garsteckiego (np. polskie zgłoszenia wynalazków nr P-390250, P-390251, P-393619 oraz zgłoszenie międzynarodowe nr PCT/PL2011/050002) mogłyby służyć do szybkiego i niezawodnego określenia grupy krwi i wykonania pełnej próby zgodności serologicznej w sposób całkowicie automatyczny, bez większej ingerencji osób trzecich. Dotychczasowe próby zastosowania układów mikroprzepływowych do tego celu napotykały jednak na przeszkodę ze względu na opisane wcześniej problemy z detekcją ewentualnej aglutynacji w próbkach (kroplach) o bardzo małych objętościach - rzędu jednego mikrolitra lub nawet mniejszych.

Wiadomo, iż właściwości fizyczne kropli, a zwłaszcza jej lepkość mogą mieć wpływ na prędkość kropli przemieszczającej się wewnątrz mikrokanału [S. Jakiela, S. Makulska, P.M. Korczyk, P. Garstecki, Lab on Chip, 2011, DOI: 10.1039/C1LC20534J]. W szczególności, prędkość kropli w kanale zależy w skomplikowany i nie monotoniczny sposób od prędkości przepływu fazy ciągłej w kanale, od wielkości kropli, od kształtu kanału, od napięcia powierzchniowego między kroplą a cieczą ciągłą, od lepkości cieczy tworzącej kroplę oraz od lepkości cieczy ciągłej. Nieoczekiwanie Autorzy niniejszego wynalazku jako pierwsi spostrzegli, iż proces łączenia się zawartych w kropli krwinek czerwonych pod wpływem specyficznych przeciwciał w agregaty (aglutynacja) ma zauważalny i mierzalny wpływ na szybkość jej poruszania się w mikrokanale i że efekt ten pozwala na stworzenie prostej metody oznaczania grupy krwi: skoro kropla zawierająca w sobie produkty aglutynacji zmienia swoje właściwości fizyczne, to jest możliwe skonstruowanie układu do szybkiego rozpoznania procesu aglutynacji i odróżniania w tym układzie kropli aglutynowanych od nieaglutynowanych na podstawie zmiany ich lepkości, poprzez pomiar czasu przejścia badanej kropli w mikrokanale pomiędzy detektorami badającymi zmianę natężenia światła.

Dodatkowo, twórcy obecnej metody nieoczekiwanie zauważyli, że w kropli, w której wystąpiła reakcja aglutynacji, aglomeraty zlepionych krwinek czerwonych separują się i przechodzą na tył kropli w kierunku przeciwnym do kierunku poruszania się kropli w mikrokanale. W wyniku zaobserwowanego zjawiska początek kropli staje się przeźroczysty, w odróżnieniu od końca kropli, który jest nieprzeźroczysty.

A zatem, przy wykorzystaniu detektora mierzącego natężenie padającego światła można rozróżnić kroplę, w której zaszła reakcja aglutynacji, od kropli, w której ta reakcja nie nastąpiła dzięki temu, że początek kropli jest przeźroczysty dla kropli aglutynowanej, a nieprzeźroczysty dla kropli nieaglutynowanej.

Dlatego też celem obecnego wynalazku jest zaproponowanie nowego sposobu oznaczania grupy krwi, w którym detekcja ewentualnej aglutynacji w próbce opiera się na wymienionych powyżej nieoczekiwanych własnościach. Bardziej szczegółowo, w metodzie według wynalazku oznaczenie grupy krwi następuje poprzez: i) pomiar czasu przepływu kropli zawierającej próbki określonych grup krwi poddane działaniu specyficznych przeciwciał - realizowany na przykład poprzez pomiar czasu przepływu kropli w mikrokanale pomiędzy dwoma detektorami czułymi na zmianę natężenia światła, lub ii) monitorowanie zmian natężenia światła wywołanych przepływającą pod detektorem kroplą, w której zaszła (bądź nie zaszła) reakcja aglutynacji - realizowane na przykład poprzez analizę światła przechodzącego przez badaną kroplę na detektorze czułym na zmianę natężenia światła.

Zgodnie z wynalazkiem, sposób oznaczania grupy krwi, obejmujący otrzymanie próbki poprzez zmieszanie materiału badanego z materiałem wzorcowym oraz detekcję aglutynacji w tak otrzymanej próbce, przy czym zmieszanie materiału badanego z materiałem wzorcowym dokonuje się w kanale układu mikroprzepływowego, charakteryzujący się tym, że zmieszania materiału badanego z materiałem wzorcowym dokonuje się w kanale układu mikroprzepływowego, zaś detekcji aglutynacji dokonuje się poprzez pomiar natężenia światła przechodzącego przez próbkę w funkcji długości próbki w kanale mikroprzepływowym albo poprzez pomiar czasu przepływu próbki w kanale mikroprzepływowym pomiędzy dwoma detektorami.

Korzystnie, jako materiał badany stosuje się krwinki czerwone wyizolowane z krwi pacjenta, zaś jako materiał wzorcowy stosuje się przeciwciała wzorcowe.

Alternatywnie korzystnie, jako materiał badany stosuje się surowicę wyizolowaną z krwi pacjenta, zaś jako materiał wzorcowy stosuje się krwinki wzorcowe.

PL 219 803 B1

W preferowanym przykładzie realizacji wynalazku, materiał badany i materiał wzorcowy mają postać kropli zawieszonych w oleistej fazie ciągłej, korzystnie w oleju z grupy węglowodorów prostych lub sfunkcjonalizowanych, oleju mineralnym, oleju silikonowym lub oleju fluorowanym.

Wynalazek obejmuje także układ do oznaczania grupy krwi, obejmujący pierwszy kanał mikroprzepływowy i drugi kanał mikroprzepływowy, łączące się w złączu oraz trzeci kanał mikroprzepływowy, prowadzący od tego złącza do pierwszego detektora, charakteryzujący się tym, że pierwszym detektorem jest detektor czuły na zmianę natężenia światła przeznaczony i skonfigurowany do pomiaru natężenia światła przechodzącego przez próbkę w funkcji długości próbki, patrząc z biegiem trzeciego kanału mikroprzepływowego lub układ obejmuje pierwszy detektor czuły na zmianę natężenia światła i drugi detektor czuły na zmianę natężenia światła, położony za pierwszym detektorem, patrząc z biegiem trzeciego kanału mikroprzepływowego, przy czym pierwszy i drugi detektor są przeznaczone i skonfigurowane do pomiaru czasu przepływu próbki w trzecim kanale mikroprzepływowym pomiędzy tymi dwoma detektorami.

Korzystnie, trzeci kanał mikroprzepływowy obejmuje odcinek meandrujący, położony pomiędzy złączem a pierwszym detektorem.

Metoda przedstawiona w niniejszym zgłoszeniu umożliwia szybkie rozpoznanie grupy krwi na drodze zdecydowanie prostszego pomiaru optycznego, wobec którego jedynie wymagane jest stwierdzenie obecności kropli w danym punkcie w danej chwili czasu. Rozwiązanie to zdecydowanie zmniejsza wymagania stawiane pomiarom optycznym i może służyć i) uproszczeniu konstrukcji aparatu do oznaczania grupy krwi, oraz ii) umożliwić stworzenie przenośnych aparatów do oznaczania grupy krwi.

Szczegółowy opis wynalazku

Wynalazek zostanie teraz bliżej przedstawiony w korzystnych przykładach wykonania, z odniesieniem do załączonych rysunków, na których:

Fig. 1 przedstawia ogólny schemat budowy przykładowego układu mikroprzepływowego do oznaczania grup krwi według wynalazku, fig. 2 przedstawia schemat mikrokanałów w układzie służącym do rozróżniania kropel zawierających próbki różnych grup krwi, zgodnie z przykładem 1 i 2, fig. 3 przedstawia czasy przepływu kropel zawierających próbki poszczególnych grup krwi, zgodnie z przykładem 1, zaś fig. 4 przedstawia zmiany napięcia mierzonego na detektorze podczas przepływu aglutynowanej kropli (linia przerywana) i kropli nie zawierającej aglutynatów (linia ciągła), zgodnie z przykładem 2.

W korzystnej realizacji wynalazku, oznaczenie prędkości kropli zawierających mieszaniny krwinek i surowicy wykonuje się w kasecie mikroprzepływowej zawierającej kanały mikroprzepływowe (fig. 1). W korzystnej realizacji sieć kanałów mikroprzepływowych zawiera kanały 1 i 2, służące do wprowadzenia odpowiednio kropli surowicy 8 oraz kropli zawiesiny krwinek 9, zawieszonych w niemieszającym się z nimi płynie ciągłym 10. W korzystnych przykładach realizacji, płyn ciągły 10 jest dowolnym płynem nie mieszającym się z roztworami wodnymi, na przykład olejem z grupy węglowodorów prostych, lub sfunkcjonalizowanych, olejem mineralnym, olejem fluorowanym lub innym. Kanały 1 i 2 korzystnie łączą się w jeden kanał w miejscu łączenia 3. W miejscu łączenia 3 krople surowicy 8 i zawiesiny krwinek 9 mogą zostać połączone w kroplę zawierającą mieszaninę surowicy i zawiesiny krwinek 11. Korzystnie kaseta mikroprzepływowa zawiera sekcję meandrującego kanału 4, który ułatwia wymieszanie zawartości przepływającej przez niego kropli. Korzystnie, po wymieszaniu, kropla wpływa do odcinka kanału 5 wyposażonego w dwa czujniki obecności kropli 6 i 7, umieszczone w znanej odległości. Czujniki 6, 7 mogą być czujnikami optycznymi lub elektrycznymi, lub dowolnymi innymi czujnikami pozwalającymi na stwierdzenie obecności kropli 11. Porównanie czasu przepływu kropli 11 zawierających różne mieszaniny krwinek i surowicy między czujnikami 6, 7 pozwala na oznaczenie, w których kroplach 11 nastąpiła aglutynacja krwinek, a w których nie nastąpiła aglutynacja i na tej podstawie oznaczenie grupy krwi.

Korzystne przykłady wykonania wynalazku

P r z y k ł a d 1

W korzystnym przykładzie realizacji (fig. 2) do kanału układu mikroprzepływowego wprowadzane są poprzez złącza typu T dwa rodzaje odczynników: zawierające antygeny (krwinki badane bądź

PL 219 803 B1 krwinki wzorcowe o określonej grupie krwi) - są to złącza w obszarze A, oraz zawierające przeciwciała (badana surowica bądź odczynniki wzorcowe zawierające określone przeciwciała) - są to złącza w obszarze B. Odczynniki te zostają wprowadzone przez najdłuższe ramię złącza, służące jednocześnie, jako magazyn i zapobiegające kontaktowi materiału biologicznego z zaworem elektromagnetycznym. Poprzez wejścia pozostałych złączy, zarówno w obszarze A, jak i B, wprowadzana jest faza ciągła w postaci oleju (heksadekanu).

W korzystnym przykładzie realizacji, za pomocą sterowanych oprogramowaniem komputerowym zaworów elektromagnetycznych umiejscowionych na wejściach złącz T (obszar A i B), uwalniane są dwie krople - jedna pochodząca z obszaru A o objętości 64 nL, z dowolnego złącza typu T, i druga, pochodząca z obszaru B o objętości 256 nL, również z dowolnego złącza. W korzystnym przykładzie realizacji obie krople dochodzą ramionami 1 i 2 do komory reakcyjnej (obszar C), gdzie przy pomocy wysokiego napięcia (500-3000 V) o częstotliwości (100-59300 Hz) dostarczonego do układu za pomocą elektrod wymusza się zjawisko elektrokoalescencji (łączenie się kropel pod wpływem zewnętrznego pola elektromagnetycznego). Uzyskana w ten sposób kropla zawierająca oba rodzaje odczynników (antygeny i przeciwciała) zostaje skierowana z komory 3 do kanału mieszającego 4, tj. mikrokanału obejmującego meandrujące odcinki, służącego do mieszania kropli (obszar D). Pomiędzy komorą reakcyjną a kanałem mieszającym znajduje się pierwszy detektor 6 (np. TSL257), mierzący natężenie padającego światła dla dowolnej długości fali z zakresu od 180 nm do 1600 nm generowanego przez np. diodę LED - HMIB-44WY-TR7), natomiast za kanałem mieszającym, a przed kanałem wylotowym 5, znajduje się drugi detektor 7 (np. TSL257), mierzący natężenie padającego światła również dla dowolnej długości fali z zakresu od 180 nm do 1600 nm generowanego przez np. diodę LED - HMIB44WY-TR7).

W korzystnym przykładzie realizacji zmierzony zostaje czas przepływu kropli na drodze pomiędzy pierwszym detektorem 6 (np. TSL257) a drugim detektorem 7 (np. TSL257). Na podstawie różnic w prędkościach poszczególnych kropli możliwe jest rozróżnienie kropel, w którym zaszło zjawisko aglutynacji od tych, w których ten proces nie nastąpił. W korzystnej realizacji obserwację tę można zastosować do scharakteryzowania grupy krwi na podstawie analizy zestawów antygenów i przeciwciał oraz prędkości przepływu kropli zawierających różne kombinacje tych odczynników.

W zależności od tego, czy w analizowanych kroplach znajdowały się specyficzne dla antygenów przeciwciała, czy też nie, różniły się one prędkością. Czas przepływu dla wszystkich kropel, w których nie znalazły się reagentne (w znaczeniu - powodujące aglutynację) pary antygen-przeciwciało, był o kilka sekund krótszy, niż kropel zawierających aglutynaty. W korzystnym przykładzie realizacji znając zawartość poszczególnych kropel i czas przepływu pomiędzy detektorami możliwe jest określenie grupy krwi.

Fig. 3 przedstawia czasy przepływu kropel zawierających próbki poszczególnych grup krwi, będące podstawą ich rozróżnienia.

P r z y k ł a d 2

W innym korzystnym przykładzie realizacji możliwe jest rozróżnienie kropel, w których wystąpiła aglutynacja, od kropel z jej brakiem, będące podstawą do oceny grupy krwi, na podstawie odczytywania zmian natężenia światła dla dowolnej długości fali z zakresu od 180 nm do 1600 nm (generowanego przez np. diodę LED - HMIB-44WY-TR7) przechodzącego przez badaną kroplę. Przy zastosowaniu detektora zamieniającego w sposób liniowy natężenie światła na napięcie (np. TSL 257) można zaobserwować wyraźną różnicę w zarejestrowanej amplitudzie. Fig. 4 przedstawia zmiany napięcia mierzonego na detektorze 7 (np. TSL 257) (fig. 2) podczas przepływu aglutynowanej kropli o objętości 320 nL (szara linia przerywana) i kropli o objętości 320 nL nie zawierającej aglutynatów (ciągła linia czarna).

Fig. 4 przedstawia korzystną sytuację, gdzie w wyniku aglutynacji początek kropli jest znaczniej bardziej przeźroczysty od końca aglutynowanej kropli (szara linia przerywana) i pojawia się w odczycie z detektora (np. TSL 257) wyraźne maksimum w amplitudzie. Z kolei dla kropli bez aglutynacji wspomniane maksimum nie występuje (czarna linia ciągła). A zatem, metoda oparta na analizie obecności zmian natężenia światła wzdłuż kropli daje jednoznaczną odpowiedź, czy w badanej kropli zaszła reakcja aglutynacji.

Claims (6)

1. Sposób oznaczania grupy krwi, obejmujący otrzymanie próbki (11) poprzez zmieszanie materiału badanego (8) z materiałem wzorcowym (9) oraz detekcję aglutynacji w tak otrzymanej próbce (11), przy czym zmieszanie materiału badanego (8) z materiałem wzorcowym (9) dokonuje się w kanale (3) układu mikroprzepływowego, znamienny tym, że detekcji aglutynacji dokonuje się poprzez pomiar natężenia światła przechodzącego przez próbkę (11) w funkcji długości próbki (11) w kanale mikroprzepływowym (5) lub poprzez pomiar czasu przepływu próbki (11) w kanale mikroprzepływowym (5) pomiędzy dwoma detektorami (6, 7).

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako materiał badany (8) stosuje się krwinki czerwone wyizolowane z krwi pacjenta, zaś jako materiał wzorcowy (9) stosuje się przeciwciała wzorcowe.

3. Sposób według zastrzeżeń 1 albo 2, znamienny tym, że jako materiał badany (8) stosuje się surowicę wyizolowaną z krwi pacjenta, zaś jako materiał wzorcowy (9) stosuje się krwinki wzorcowe.

4. Sposób według dowolnego z poprzedzających zastrzeżeń od 1 do 3, znamienny tym, że materiał badany (8) i materiał wzorcowy (9) mają postać kropli zawieszonych w oleistej fazie ciągłej (10), korzystnie w oleju z grupy węglowodorów prostych lub sfunkcjonalizowanych, oleju mineralnym, oleju silikonowym lub oleju fluorowanym.

5. Układ do oznaczania grupy krwi, obejmujący pierwszy kanał mikroprzepływowy (1) i drugi kanał mikroprzepływowy (2), łączące się w złączu (3) oraz trzeci kanał mikroprzepływowy (5), prowadzący od tego złącza (3) do pierwszego detektora (6), znamienny tym, że pierwszym detektorem (6) jest detektor czuły na zmianę natężenia światła przeznaczony i skonfigurowany do pomiaru natężenia światła przechodzącego przez próbkę (11) w funkcji długości próbki (11), patrząc z biegiem trzeciego kanału mikroprzepływowego (5) lub układ obejmuje pierwszy detektor (6) czuły na zmianę natężenia światła i drugi detektor (7) czuły na zmianę natężenia światła, położony za pierwszym detektorem (6), patrząc z biegiem trzeciego kanału mikroprzepływowego (5), przy czym pierwszy i drugi detektor (6, 7) są przeznaczone i skonfigurowane do pomiaru czasu przepływu próbki (11) w trzecim kanale mikroprzepływowym (5) pomiędzy tymi dwoma detektorami (6, 7).

6. Układ według zastrz. 5, znamienny tym, że trzeci kanał mikroprzepływowy (5) obejmuje odcinek meandrujący (4), położony pomiędzy złączem (3) a pierwszym detektorem (6).