ES2649337T3 - Células de formación de hueso humanas en el tratamiento de enfermedades y estados óseos asociados con inmunodeficiencia o inmunosupresión - Google Patents

Células de formación de hueso humanas en el tratamiento de enfermedades y estados óseos asociados con inmunodeficiencia o inmunosupresión Download PDF

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Abstract

Células de formación de hueso aisladas para su uso en el tratamiento de una enfermedad o un estado óseo asociado con inmunodeficiencia o inmunosupresión, en las que dichas células de formación de hueso son osteoblastos u osteocitos y en las que las células de formación de hueso comprenden la expresión de HLA- II, y en las que dicha enfermedad o dicho estado óseo asociado con inmunodeficiencia o inmunosupresión es osteoporosis, osteopenia, fragilidad ósea, necrosis ósea, fractura ósea, microfracturas óseas o osteólisis de hueso.

Description

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osteocalcina. Pueden sintetizarse matrices porosas según técnicas convencionales (por ejemplo, Mikos et al., Biomaterials 14: 323, 1993; Mikos et al., Polymer 35:1068, 1994; Cook et al., J. Biomed. Mater. Res. 35:513, 1997).
Las composiciones farmacéuticas pueden incluir además o coadministrarse en combinación con cualquier citocina proinflamatoria, que puede potenciar las propiedades de APC de las células de formación de hueso. Así, la invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende células de formación de hueso y una citocina proinflamatoria para el uso simultáneo, secuencial o independiente en el tratamiento de enfermedades y estados asociados con inmunodeficiencia o inmunosupresión, incluyendo enfermedades o estados óseos asociados con inmunodeficiencia o inmunosupresión. Los ejemplos de citocinas proinflamatorias incluyen sin limitación IFN, TNF, IL-1, IL-17, IL-18.
Alternativamente o además, las presentes células pueden transformarse de manera estable o transitoria con un ácido nucleico de interés antes de la introducción en el sujeto. Las secuencias de ácido nucleico de interés incluyen, pero no se limitan a aquellas que codifican para productos génicos que potencian el crecimiento, la diferenciación y/o mineralización de osteoblastos. Por ejemplo, puede introducirse un sistema de expresión para BMP-2, de modo estable o transitorio con el fin de tratar osteoporosis o fracturas no consolidadas. Los expertos en la técnica conocen métodos de transformación celular.
La memoria descriptiva también describe una disposición que comprende un instrumento quirúrgico para la administración de una composición a un sujeto, tal como por ejemplo de manera sistémica, de manera tópica o en un sitio de lesión ósea, y que comprende además las células o poblaciones celulares tal como se describe en el presente documento, o una composición farmacéutica que comprende dichas células o poblaciones celulares, en el que la disposición está adaptada para la administración de la composición farmacéutica por ejemplo de manera sistémica, de manera tópica o en un sitio de lesión ósea. Por ejemplo, un instrumento quirúrgico adecuado puede inyectar una composición líquida que comprende células de la presente invención, tal como de manera sistémica, de manera tópica o en un sitio de lesión ósea.
Las células o poblaciones celulares pueden administrarse de manera que les permita injertarse o migrar al sitio de tejido pretendido y reconstituir o regenerar el área funcionalmente deficiente. Por ejemplo, las células pueden administrarse en un sitio de lesión musculoesquelética. Por ejemplo, puede facilitarse la osteogénesis de acuerdo con una intervención quirúrgica para remodelar tejido o insertar una férula, o un dispositivo protésico tal como una prótesis de cadera. En otras circunstancias, no se requerirá cirugía invasiva, y la composición puede administrarse mediante inyección o (por ejemplo, para la reparación de la columna vertebral) usando un endoscopio guiable.
En una realización, la preparación celular farmacéutica tal como se definió anteriormente puede administrarse en forma de composición líquida. En realizaciones, las células o la composición farmacéutica que comprende tales puede administrarse de manera sistémica, de manera tópica o en un sitio de lesión ósea.
En otra realización, las células o poblaciones celulares pueden transferirse a y/o cultivarse en un sustrato adecuado para proporcionar implantes. El sustrato en el que pueden aplicarse y cultivarse las células puede ser un metal, tal como titanio, aleación de cobalto/cromo o acero inoxidable, una superficie bioactiva tal como un fosfato de calcio, superficies de polímero tales como de polietileno, y similares. Aunque se prefiere menos, también puede usarse como sustrato material silíceo tal como vitrocerámicas. Lo más preferido son los metales, tales como titanio, y fosfatos de calcio, aunque el fosfato de calcio no es un componente indispensable del sustrato. El sustrato puede ser poroso o no poroso.
Por ejemplo, pueden transferirse células que han proliferado, o que están diferenciándose en placas de cultivo, sobre soportes sólidos tridimensionales con el fin de hacer que se multipliquen y/o continúen con el proceso de diferenciación incubando el soporte sólido en un medio líquido con nutrientes descrito en el presente documento, si es necesario. Pueden transferirse las células sobre un soporte sólido tridimensional, por ejemplo impregnando dicho soporte con una suspensión líquida que contiene dichas células. Los soportes impregnados obtenidos de este modo pueden implantarse en un sujeto humano. Tales soportes impregnados también pueden volver a cultivarse sumergiéndolos en un medio de cultivo líquido, antes de implantarse finalmente.
Es necesario que el soporte sólido tridimensional sea biocompatible de modo que permita que se implante en un ser humano. Puede ser de cualquier forma adecuada tal como un cilindro, una esfera, una placa o una parte de una forma arbitraria. De los materiales adecuados para el soporte sólido tridimensional biocompatible, puede hacerse una mención particular del carbonato de calcio, y en particular aragonita, específicamente en forma de esqueleto de coral, cerámicas porosas a base de alúmina, de zircona, de fosfato de tricalcio y/o hidroxiapatita, esqueleto de coral de imitación obtenido mediante intercambio hidrotermal que permite que el carbonato de calcio se transforme en hidroxiapatita, o si no vitrocerámicas de apatita-wollastonita, vitrocerámicas bioactivas tales como vidrios Bioglass(TM)..
Los aspectos y las realizaciones anteriores se respaldan adicionalmente por los siguientes ejemplos no limitativos.
Los ejemplos demuestran que las células de formación de hueso, que presentan HLA de clase I y de clase II, de manera natural o inducida, pueden tener propiedades inmunorreguladoras interesantes ya que podrían modular la proliferación de células T mientras tienen altas capacidades de reconstrucción ósea. Estas células de formación de
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Dex1 (5.10-4 M): 2 l de disolución madre de dexametasona (5.10-2 M) + 198 l de MEM Dex2 (10-6 M): 2 l de Dex1 (5,10-4M) + 998 l de MEM
Medio osteogénico (40 ml)
Volumen
Conc. final
MEM
31 ml /
FCS
6 ml 15%
PenEstrepGlu (100x) Dexamet. (Dex2)Ácido ascórbico
400 l 400 l 200 l 1x 10-8 M 50 g/ml
-glicerofosfato
2 ml 10 mM
Ensayo de proliferación. Se sembraron en placa 200.000 células T humanas/ml del individuo A (PBMCa) en placa de microtitulación de 96 pocillos con células de formación de hueso humanas irradiadas del individuo B (OBb) durante 7 días en un volumen total de 200 l y en presencia o ausencia de PHA (u otro agente estimulador).
Alternativamente, se sembraron en placa 200.000 células T humanas/ml de un individuo A (PBMCa) en placa de microtitulación de 96 pocillos con células de formación de hueso humanas irradiadas del individuo B (OBb) durante 7 días en un volumen total de 200 l y en presencia o ausencia de PBMCb del individuo b (o de PBMCc de un individuo c).
Se sembraron las células de formación de hueso a 100.000 células/ml. Se incubó el cultivo con 1 Ci/ml de 3Htimidina durante 18 h del periodo de cultivo para medir la proliferación de células T. Se lavaron las células dos veces con PBS enfriado en hielo y dos veces con ácido tricloroacético (TCA) al 5% enfriado en hielo. Finalmente, se lisaron las células mediante una disolución que contenía NaOH 0,1 N y Triton-X100 al 0,1%. Se recogió el sobrenadante y se mezcló con líquido de centelleo para analizarse en un contador beta.
Ejemplo 2
Fenotipo celular
La citometría de flujo mostró que esta población de células de formación de hueso expresaba marcadores mesenquimatosos (CD90, CD105 y CD73) a altos niveles. La molécula de superficie hematopoyética es débil (CD45, CD34) o está ausente (CD14, CD19). Las células expresaron un alto nivel de HLA de clase I pero de manera sorprendente, también un alto nivel de moléculas de HLA de clase II. Sin embargo, todas las moléculas coestimuladoras sometidas a prueba (CD80, CD86, CD28, CTLA-4) están ausentes (tabla 1).
De manera interesante, tal como se muestra por Le Blanc et al 2003 (Exp Hematol 31: 890-6) para células MSC, se observó que la presencia de IFN (5 ng/ml) en el medio de cultivo durante de 24 a 48 h, indujo un aumento de expresión de HLA de clase II (tabla 1). Se realizaron observaciones similares con TNF, IL-1, IL-17, IL-18 y otras citocinas proinflamatorias.
Tabla 1: Marcadores fenotípicos de células de formación de hueso cultivadas en presencia de IFN o no (porcentaje de células consideradas positivas mediante FACS)
sin IFN
con IFN
N
Media D.E. N Media D.E.
ALP
17 17 12 13 17 12 13 16 16 14 14 15 14 14 67,9 92,8 95,7 94,7 2,8 3,2 4,8 68,3 93,8 4,3 3,6 2,1 2,3 5,7 16,6 3,9 4,0 3,4 3,3 3,9 4,8 18,9 3,0 4,8 3,5 2,2 2,1 6,2 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 75,2 89,9 94,8 96 1,4 2,1 2,3 92,3 96,1 6,9 4,2 3,2 1,0 9,5 13,1 4,9 1,9 2,8 2,1 1,7 2,3 7,2 4,5 3,1 2,1 2,0 1,9 3,5
CD105
CD90
CD73
CD45
CD14
CD19
HLA de clase II
HLA de clase I
CD86
CD28
CD80
CD40L
CTLA4
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Ejemplo 3
Inmunomodulación
La población de células de formación de hueso población descrita anteriormente se verificó por su capacidad para regular el sistema inmunitario en estados in vitro. Se sometió a prueba la inducción o proliferación de células T (células mononucleares de sangre periférica, PBMC) en estados autólogos o heterólogos.
Se aislaron células de formación de hueso HLA de clase II+ y/o se expandieron a partir de pacientes que presentaban enfermedades óseas relacionadas con el sistema inmunitario. El nivel de expresión de su marcador de HLA de clase II mediante citometría de flujo y se usaron sus células (células de formación de hueso y/o PBMC) para ensayos de proliferación de células T.
No se observó respuesta proliferativa de PBMC, de un receptor a, cuando se realizó cocultivo con células de formación de hueso HLA de clase II+ ni en estados autólogos, de un receptor a, ni alogénicos, de un receptor b, (tabla 2). Esto demostró que las células de formación de hueso HLA de clase II+ no se reconocieron como células “foráneas” por células mononucleares de sangre periférica y, por tanto, no pudieron provocar una respuesta alogénica.
Además, cuando se estimularon mediante un activador mitogénico, tal como PHA, las PBMC estaban significativamente reguladas por disminución por las células de formación de hueso en estados o bien autólogos, de un donador a, o bien alogénicos, de un donador b. Se correlacionó el nivel de inmunosupresión con el nivel inicial de expresión de HLA de clase II (tabla 2).
Tabla 2: Efectos inhibidores de los osteoblastos sobre la proliferación de células T alogénicas (se presentan los valores como % de aumento o disminución, número de PBMC al inicio fijado en el 100%).
Células de formación de hueso
MSC n°
HLA II PBMCa PBMCa+ OBb PBMCa + PHA PBMCa + PHA + OBb
3
52,8% 100% 107% 700% 425% (61%)*
1
64,2% 100% 89% 912% 500% (55%)
2
85,1% 100% 100% 640% 240% (37%)
4
87,3% 100% 104% 479% 187% (39%)
* % de los niveles de PBMC-PHA
No se modificaron estos efectos mediante el pretratamiento con citocinas proinflamatorias
Ejemplo 4
Propiedades de presentación de antígeno
La adición de una segunda reserva de PBMC de otro donante conduce a un aumento de la proliferación de las PBMC del receptor, lo que sugiere un papel de APC de las células de formación de hueso HLA de clase II+ (tabla 3). Esa observación se correlaciona también con los niveles de expresión de HLA de clase II.
Tabla 3: Efectos proliferativos de células de formación de hueso sobre la proliferación de células T (de un receptor) en presencia de PBMC de otro donante (se presentan los valores como % de aumento o disminución, número de PBMC al inicio fijado en el 100%)
Células de formación de hueso
MSC n°
HLA II PBMCa PBMCa+ OBb PBMCa + PHA PBMCa + PHA + OBb PBMCa + PHA + OBb + PBMCb
6
52,8% 4,200 171% 262% 1488% 1697%
5
64,2% 3,400 238% 341% 1676% 2329%
8
75,1% 4,000 126% 327% 1450% 2225%
7
88,4% 4,800 202% 418% 1572% 2789%
De manera interesante, la adición de determinadas citocinas específicas tales como IL2, IL3, IL4, IL11, IL12 o PBMC desde el comienzo del cultivo celular, conduce a un aumento de la proliferación de las PBMC, lo que sugiere un papel de APC de las células de formación de hueso HLA de clase II+ (tabla 4). Esa observación se correlaciona también con los niveles de expresión de HLA de clase II. No se modificaron estos efectos mediante el pretratamiento con citocinas proinflamatorias.
Tabla 4: Efectos proliferativos de células de formación de hueso sobre la proliferación de células T (de un receptor) en presencia de IL2 (se presentan los valores como % de aumento o disminución, número de PBMC al inicio fijado en el 100%)
imagen8
26) a los dieciocho y veinticuatro meses, respectivamente.
A lo largo del tiempo, los beneficios del tratamiento con APC-OB se traducen en diferencias entre los dos grupos a los veinticuatro meses de más del 100% (véase la figura 4).
1.3 Progresión radiológica
5 A los 24 meses, un análisis de supervivencia demostró que el 75% de las lesiones óseas en el grupo CTRL se habían deteriorado para dar fracturas frente a ninguna en el grupo tratado con APC-OB (figura 5).
Además, tal como se muestra en la figura 6 que ilustra la evolución de la puntuación radiológica media en los dos grupos de pacientes, en el grupo CTRL la puntuación radiológica media se deterioró desde 1,3 en el nivel inicial hasta 2 a los tres meses, 2,5 a los seis meses, 2,8 a los doce meses y 3 a los dieciocho meses y veinticuatro meses.
10 En comparación, los pacientes tratados con APC-OB sólo mostraron un aumento mínimo en las puntuaciones radiológicas medias, desde 1,5 en el nivel inicial hasta 1,5, 1,8 y 1,8 a los doce, dieciocho y veinticuatro meses, respectivamente.
Conclusiones
En conclusión, los datos indican que los pacientes (con osteonecrosis de estadio I o II de la cabeza femoral
15 relacionada con inmunosupresión inducida por corticoides) que recibieron tratamiento con células de formación de hueso que presentaban características de APC mostraron una notable mejora de los parámetros de valoración clínicos y radiológicos, en comparación con el grupo de control.

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  1. imagen1
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