ES2645228T3 - Fragmentos del extremo terminal C del receptor de adiponectina (CTF)-inmunoglobulina - Google Patents

Abstract

Un método para detectar fragmento del extremo terminal C de ADIPOR1 o ADIPOR2 unido covalentemente a inmunoglobulina, una cadena pesada o ligera de inmunoglobulina, o un fragmento de inmunoglobulina (Ig-CTF) en una muestra biológica, comprendiendo dicho método: a. exponer una muestra biológica derivada de un sujeto de una primera especie a un primer anticuerpo de una segunda especie que se une preferentemente al Ig-CTF de la primera especie o un fragmento de unión al antígeno del mismo, formando una mezcla; b. exponer dicha mezcla a un segundo anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de una tercera especie que se une preferentemente al Ig de la primera especie; y c. detectar el Ig-CTF presente en dicha muestra.

Description

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Tabla 1.

SEQ ID NO:

Denominación Secuencia de Amino Ácidos

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Fragmento 1 de AdipoR1 VLVVAAAFVHFYGVSNLQEFRYGLEGGCTDDTLL

2

Fragmento 2 de AdipoR1 LVVAAAFVHFYGVSNLQEFRYGLEGGCTDDTLL

3

Fragmento 3 de AdipoR1 SNLQEFRYGLEGGCTDDTLL

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Fragmento 4 de AdipoR1 VVAAAFVHFYGVSNLQEFRYGLEGGCTDDTLL

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Fragmento 5 de AdipoR1 VAAAFVHFYGVSNLQEFRYGLEGGCTDDTLL

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Fragmento 6 de AdipoR1 AAAFVHFYGVSNLQEFRYGLEGGCTDDTLL

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Fragmento 7 de AdipoR1 AAFVHFYGVSNLQEFRYGLEGGCTDDTLL

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Fragmento 8 de AdipoR1 AFVHFYGVSNLQEFRYGLEGGCTDDTLL

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Fragmento 9 de AdipoR1 FVHFYGVSNLQEFRYGLEGGCTDDTLL

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Fragmento 10 de AdipoR1 VHFYGVSNLQEFRYGLEGGCTDDTLL

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Fragmento 11 de AdipoR1 HFYGVSNLQEFRYGLEGGCTDDTLL

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Fragmento 12 de AdipoR1 FYGVSNLQEFRYGLEGGCTDDTLL

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Fragmento 13 de AdipoR1 YGVSNLQEFRYGLEGGCTDDTLL

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Fragmento 14 de AdipoR1 GVSNLQEFRYGLEGGCTDDTLL

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Fragmento 15 de AdipoR1 VSNLQEFRYGLEGGCTDDTLL

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Fragmento 16 de AdipoR1 NLQEFRYGLEGGCTDDTLL

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Fragmento 17 de AdipoR1 LQEFRYGLEGGCTDDTLL

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Fragmento 18 de AdipoR1 QEFRYGLEGGCTDDTLL

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Fragmento 19 de AdipoR1 EFRYGLEGGCTDDTLL

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Fragmento 20 de AdipoR1 FRYGLEGGCTDDTLL

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Fragmento 21 de AdipoR1 RYGLEGGCTDDTLL

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Fragmento 22 de AdipoR1 YGLEGGCTDDTLL

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Fragmento 1 de AdipoR2 IFVVAGAFVHFHGVSNLQEFRFMIGGGCSEEDAL

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Fragmento 2 de AdipoR2 VAGAFVHFHGVSNLQEFRFMIGGGCSEEDAL

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Fragmento 3 de AdipoR2 SNLQEFRFMIGGGCSEEDAL

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Fragmento 4 de AdipoR2 FVVAGAFVHFHGVSNLQEFRFMIGGGCSEEDAL

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Fragmento 5 de AdipoR2 VVAGAFVHFHGVSNLQEFRFMIGGGCSEEDAL

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Fragmento 6 de AdipoR2 AGAFVHFHGVSNLQEFRFMIGGGCSEEDAL

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Fragmento 7 de AdipoR2 GAFVHFHGVSNLQEFRFMIGGGCSEEDAL

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Fragmento 8 de AdipoR2 AFVHFHGVSNLQEFRFMIGGGCSEEDAL

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Fragmento 9 de AdipoR2 FVHFHGVSNLQEFRFMIGGGCSEEDAL

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Fragmento 10 de AdipoR2 VHFHGVSNLQEFRFMIGGGCSEEDAL

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Fragmento 11 de AdipoR2 HFHGVSNLQEFRFMIGGGCSEEDAL

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Fragmento 12 de AdipoR2 FHGVSNLQEFRFMIGGGCSEEDAL

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Fragmento 13 de AdipoR2 HGVSNLQEFRFMIGGGCSEEDAL

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Fragmento 14 de AdipoR2 GVSNLQEFRFMIGGGCSEEDAL

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Fragmento 15 de AdipoR2 VSNLQEFRFMIGGGCSEEDAL

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Fragmento 16 de AdipoR2 NLQEFRFMIGGGCSEEDAL

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Fragmento 17 de AdipoR2 LQEFRFMIGGGCSEEDAL

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Fragmento 18 de AdipoR2 QEFRFMIGGGCSEEDAL

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Fragmento 19 de AdipoR2 EFRFMIGGGCSEEDAL

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Fragmento 20 de AdipoR2 FRFMIGGGCSEEDAL

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Fragmento 21 de AdipoR2 RFMIGGGCSEEDAL

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Fragmento 22 de AdipoR2 FMIGGGCSEEDAL

Tal como se usa en la presente memoria, "cadena pesada gamma de inmunoglobulina" o "cadena ligera de inmunoglobulina" incluye la respectiva secuencia de aminoácidos mostrada en la Tabla 2 (no forma parte de la invención) y secuencias que tienen al menos 75%, preferiblemente al menos 85%, más preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95% de identidad, e incluso más preferiblemente al menos 98% o 99% de identidad con la misma.

Tabla 2 (no hace parte de la invención).

SEQ ID NO:

Cadena de inmunoglobulina

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Pesada gamma

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Tal como se usa en la presente memoria, el término "inmunoglobulina" o "Ig" se refiere a un anticuerpo dirigido contra el antígeno que incluye la clase IgG, IgA, IgM, IgD e IgE y sus fragmentos que contienen una región de unión al antígeno (Fab), una cadena ligera kappa de inmunoglobulina, o una cadena pesada gamma de inmunoglobulina, tal como, por ejemplo, una cadena de inmunoglobulina que comprende la SEQ ID NO: 45 o 46 (no forma parte de la invención). Además, el término "inmunoglobulina" comprende inmunoglobulina de todas las especies que expresan el receptor de adiponectina, ya sea una inmunoglobulina nativa o modificada tal como anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos bifuncionales o anticuerpos recombinantes preparados con base en una secuencia homóloga.

Tal como se usa aquí, "unido" significa unión covalente por un enlace químico. Cuando se utiliza en referencia a Ig-CTF, "unido" se refiere a un enlace químico covalente entre un CTF que comprende una secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 1 a 44 y una inmunoglobulina.

Por ejemplo, cuando se usa en referencia a Ig-CTF, el término "unido" incluye la unión de CTF que forma un éster o amida con un residuo en las SEQ ID NOs: 45 o 46 (no forma parte de la invención). Aunque no está relacionado con el mecanismo, se cree que la unión covalente tiene lugar después de que se forma un tioéster interno activado en CTF entre cisteína y glutamina en la secuencia peptídica (SEQ ID NOs: 1 a 44). Este tioéster activado es capaz de formar un enlace con la inmunoglobulina cuando la inmunoglobulina es llevada a la proximidad del tioéster. Se cree que este mecanismo de unión propuesto es similar al proceso de unión del complemento C3b a los antígenos que se produce a través de un tioéster interno como se muestra en:

Sim R.B. y Twose TM, R.C. The covalent-binding reaction of complement component C3 Biochem J 193; 115-27 (1981);

Lutz H. U. y Stammler P. Preferential formation of C3b-IgG Complexes in vitro and in vivo from nascent C3b and naturally occurring anti-band 3 antibodies J Bio Chem 268, 17418-426, 1993; y

Suhn A y Pangburn MK. Covalent Attachment of Human Complement C3 to IgG J Bio Chem 269, 28997-29002, 1994.

Además, "unidos" a través de un mecanismo mediante el cual CTF se activa como un tioéster interno entre la cisteína y los ácidos glutámicos en la secuencia de CTF del péptido R1 (SEQ ID NO: 48) Glu-Gly-Gly-Cys-Thr-Asp-Asp-Thr-Leu-Leu (no forma parte de la invención). La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 47 se produce en muchas de las secuencias de AdipoR1 de CTF, tal como en las SEQ ID NOs: 1 a 22. En la secuencia de CTF de R2 (SEQ ID NO: 48), la secuencia de aminoácidos es Gly-Gly-Gly-Cys-Ser-Glu-Glu-Asp-Ala-Leu (no forma parte de la invención). La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 48 se produce en muchas de las secuencias de AdipoR2 de CTF, tales como en las SEQ ID NOs: 23 a 44.

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tolerable al paciente, retardando la tasa de degeneración o declive, haciendo que el punto final de degeneración sea menos debilitante, mejorando el bienestar físico o mental del sujeto, o prolongando la duración de la supervivencia. El tratamiento puede evaluarse mediante parámetros objetivos o subjetivos; incluyendo los resultados de un examen físico, examen neurológico o evaluaciones psiquiátricas.

El término "muestra" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una colección de fluidos, células o tejidos similares (por ejemplo, tejido tumoral resecado quirúrgicamente, biopsias, incluyendo aspiración con aguja fina), aislados de un sujeto, así como fluidos, células, o tejidos presentes dentro de un sujeto. En algunas realizaciones la muestra es un fluido biológico. Los fluidos biológicos son típicamente líquidos a temperaturas fisiológicas y pueden incluir fluidos naturales presentes en, extraídos de, expresados o bien extraídos de un sujeto o fuente biológica. Ciertos fluidos biológicos se derivan de determinados tejidos, órganos o regiones localizadas y ciertos otros fluidos biológicos pueden estar situados más global o sistémicamente en un sujeto o fuente biológica. Ejemplos de fluidos biológicos incluyen sangre, suero y fluidos serosos, plasma, linfa, orina, saliva, líquido quístico, gotas de lágrimas, heces, esputo, secreciones mucosas de los tejidos y órganos secretores, secreciones vaginales, fluidos ascíticos tales como aquellos asociados con tumores no sólidos, fluidos de las cavidades pleural, pericárdica, peritoneal, abdominal y otras cavidades corporales, fluidos recogidos por lavado bronquial y similares. Los fluidos biológicos también pueden incluir soluciones líquidas en contacto con un sujeto o fuente biológica, por ejemplo, medio de cultivo de células y órganos que incluye medio acondicionado de células u órganos, fluidos de lavado y similares. El término "muestra", tal como se utiliza en la presente memoria, abarca materiales retirados de un sujeto

o materiales presentes en un sujeto.

El término "progresión", tal como se utiliza en el contexto de progresión de una condición, incluye el cambio de la condición de un estado menos grave a un estado más severo o avanzado.

El término "regresión", tal como se utiliza en el contexto de la regresión de una condición, incluye el cambio de la condición de un estado más grave a un estado menos grave o avanzado.

El término "estable" tal como se utiliza en el contexto de una condición estable, está destinado a describir una condición de enfermedad que no ha cambiado o no ha cambiado significativamente durante un período de tiempo clínicamente relevante para ser considerada una condición progresiva o una enfermedad progresiva o una condición de regresión.

Tal como se usa aquí, los términos "sujeto" y "paciente" se usan indistintamente para referirse a un animal, incluyendo un mamífero, preferiblemente un ser humano.

Tal como se usa en la presente memoria, "sano" se refiere a un paciente que actualmente no sufre de una afección

o enfermedad e incluye un paciente que está predispuesto a sufrir una afección.

Tal como se usa en la presente memoria, "diagnóstico" o "diagnosticar" se refiere a la identificación de pacientes con una condición, tal como resistencia a la insulina, crecimiento celular anormal o enfermedad hepática. "Diagnóstico" o "diagnosticar" también se refiere a la identificación de los pacientes que necesitan tratamiento. En algunas realizaciones, la resistencia a la insulina está asociada con tolerancia alterada a la glucosa, prediabetes, diabetes tipo 1, diabetes tipo 2, diabetes tipo 3, diabetes juvenil o diabetes gestacional. En algunas realizaciones, el crecimiento celular anormal es cáncer, tal como, por ejemplo, cáncer de mama, cáncer metastásico, cáncer de páncreas o carcinoma hepatocelular. En algunas realizaciones, la enfermedad del hígado es hepatitis autoinmune, esteatohepatitis no alcohólica (NASH), o hepatitis alcohólica.

Tal como se usa en la presente memoria, "diabetes" se refiere a diabetes mellitus, una hiperglucemia crónica debida a secreción y/o acción defectuosa de insulina. La Organización Mundial de la Salud reconoce tres formas principales de diabetes mellitus: diabetes tipo I, tipo II, tipo 3, diabetes juvenil y diabetes gestacional. Aunque todas las formas se deben a que las células beta del páncreas no pueden producir suficiente insulina para prevenir la hiperglucemia, las causas son diferentes. La diabetes tipo I se debe generalmente a la destrucción autoinmune de las células beta pancreáticas. La diabetes tipo II se caracteriza por la resistencia a la insulina en tejidos objetivo, lo que crea una necesidad de cantidades anormalmente altas de insulina y la diabetes se desarrolla cuando las células beta no pueden satisfacer esta demanda. La diabetes gestacional es similar a la diabetes tipo II en que implica resistencia a la insulina; las hormonas del embarazo pueden causar resistencia a la insulina en las mujeres genéticamente predispuestas a desarrollar esta condición. La diabetes gestacional típicamente se resuelve con el parto del niño, sin embargo, la diabetes tipo I y II son condiciones crónicas. Todos los tipos son tratables con insulina. La diabetes tipo I, en la que la insulina no es secretada por el páncreas, es directamente tratable sólo con insulina inyectada o inhalada, aunque la dieta y otros ajustes de estilo de vida son parte del manejo. El tipo II puede ser manejado con una combinación de tratamiento dietético, comprimidos e inyecciones y, con frecuencia, suplementos de insulina.

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inmunomicrofluidos, inmunocentrífugos, Ouchterlony basados en difusión, inmunoelectroforesis en gel cohete o inmunoensayos in situ pueden adaptarse fácilmente al presente propósito.

Los inmunoensayos son útiles en la cuantificación de al menos un Ig-CTF del receptor de adiponectina en una muestra de ensayo, en particular para determinar si el nivel de al menos un Ig-CTF está alterado comparado con niveles normales detectables en individuos no enfermos. Como consecuencia, este inmunoensayo es de uso particular para determinar si un paciente puede tener una enfermedad o predisposición a la enfermedad. El inmunoensayo puede tener también otros usos, tales como, por ejemplo, el uso en el control de la progresión de la enfermedad o el control de la respuesta a las intervenciones terapéuticas. La invención descrita aquí se extiende a todos los usos de moléculas inmunointeractivas y ensayos de diagnóstico que requieren dichos inmunoensayos para su desempeño.

A título de ejemplo solamente, en ciertas realizaciones, un anticuerpo surgido contra el fragmento se inmoviliza sobre un sustrato sólido para formar un primer complejo y se pone en contacto una muestra biológica de ensayo de un paciente con la molécula unida. Después de un período de incubación adecuado, durante un período de tiempo suficiente para permitir la formación de un complejo secundario-anticuerpo, se añade y se incuba un segundo anticuerpo marcado con una molécula informadora capaz de producir una señal detectable, dejando suficiente tiempo para la formación de un complejo terciario. Cualquier material que no ha reaccionado se elimina por lavado y la presencia del complejo terciario se determina observando una señal producida por la molécula informadora. Los resultados pueden ser cualitativos, por simple observación de la señal visible o pueden ser cuantificados por comparación con una muestra de control que contiene cantidades conocidas de hapteno. Las variaciones de este ensayo incluyen un ensayo simultáneo, en el que se añaden simultáneamente tanto la muestra como el anticuerpo marcado al anticuerpo unido, o un ensayo inverso en el que el anticuerpo marcado y la muestra a ensayar se combinan primero, se incuban y luego se añaden simultáneamente al anticuerpo unido. Estas técnicas son bien conocidas por los expertos en la técnica, y la posibilidad de variaciones será fácilmente evidente.

Otros ejemplos de detección de Ig-CTF incluyen transferencia western de tipo cuantitativo, inmunohistoquímica, biochips de proteínas, espectrometría de masas y otros.

El CTF-inmunoglobulina se puede controlar por cualquier método adecuado. Los paradigmas de detección que pueden emplearse incluyen, por ejemplo, métodos ópticos, métodos electroquímicos (técnicas de voltametría y amperometría), microscopía de fuerza atómica y métodos de radiofrecuencia, por ejemplo, espectroscopia de resonancia multipolar. Los métodos ópticos incluyen, por ejemplo, ensayos colorimétricos, espectroscopia de impedancia de electrones, microscopía, tanto confocal como no confocal, detección de fluorescencia, luminiscencia, quimioluminiscencia, absorbancia, reflectancia, transmitancia y birrefringencia o índice de refracción (por ejemplo, resonancia de plasmón superficial, elipsometría, un método de espejo resonante, un método de guía de ondas de acoplador de rejilla o interferometría).

El propio Ig-CTF puede comprender un fragmento del extremo terminal C de adiporreceptor unido covalentemente a una inmunoglobulina. El término "adiporreceptor" incluye adiporreceptor 1 ("AdipoR1") y adiporreceptor 2 ("AdipoR2"). Los ejemplos de secuencias de aminoácidos de AdipoR1 incluyen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 1 a 22. Los ejemplos de secuencias de aminoácidos de AdipoR2 incluyen la secuencia de aminoácidos de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 23 a 44. En los métodos de la presente invención, se puede detectar uno o más del (es decir, al menos un) del Ig-CTF. Por ejemplo, cualquiera o una combinación de Ig-CTF en la que el CTF es uno de los fragmentos representados por las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 a la SEQ ID NO: 44.

En los métodos de la presente invención, la muestra biológica puede provenir de una serie de fuentes. Por ejemplo, la muestra biológica puede derivarse de orina, sangre, plasma sérico, saliva, ascitis, células circulantes, células tumorales circulantes, células que no están asociadas con tejido, tejidos, tejido tumoral resecado quirúrgicamente, biopsias, muestras de aspiración con aguja fina, líquido cefalorraquídeo, glóbulos blancos, fluidos intersticiales o preparaciones histológicas. Debido a su facilidad de acceso y manipulación, la sangre y el plasma pueden ser fuentes particularmente útiles de la muestra biológica.

En algunos casos, un conservante puede ayudar a estabilizar las muestras biológicas para su almacenamiento mientras se refrigera o se congela. Ejemplos de conservantes adecuados incluyen fluoruro, heparina o EDTA.

En otras realizaciones, el tejido es de hígado, páncreas, ganglio linfático, adiposo, músculo o cerebro. Un ejemplo de un método para detectar Ig-CTF en estos tejidos es la inmunohistoquímica (tinción de tejido).

Las muestras biológicas se pueden derivar de cualquier mamífero. En una realización preferida, la muestra se obtiene a partir de un ser humano. Sin embargo, otros mamíferos, incluyendo de zoológico, de investigación y animales domésticos (mascotas) como el ratón, la rata, el conejillo de indias, el hámster, el perro, el gato, la oveja, la vaca, el caballo, el burro, la mula o el cerdo también serían fuentes potenciales de muestras biológicas.

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