ES2644476T3 - Bacterias extremadamente termófilas versátiles para la conversión de biomasa - Google Patents

Bacterias extremadamente termófilas versátiles para la conversión de biomasa Download PDF

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Description

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Como se emplea en la presente memoria, "mutante" u "homólogo" también significa un microorganismo derivado de las células o cepas según la presente descripción, que se alteran debido a una mutación. Una mutación es un cambio producido en el ADN celular, que puede ser espontáneo, causado por un factor ambiental o errores en la replicación del ADN, o inducido por condiciones físicas o químicas. Los procesos de mutación incluidos en esta subclase y en subclases indentadas son procesos dirigidos a la producción de cambios esencialmente aleatorios en el ADN del microorganismo incluyendo la incorporación de ADN exógeno. Todos los mutantes de los microorganismos comprenden las ventajas de ser termófilos extremos (crecimiento y fermentación a temperaturas superiores a 70 ºC) y son capaces de fermentar la biomasa lignocelulósica a etanol y/o ácido láctico. En una realización ventajosa, los mutantes de los microorganismos según la presente descripción tienen en un ensayo de hibridación de ADN-ADN, una relación de ADN-ADN de al menos un 80 %, preferiblemente al menos un 90 %, al menos un 95 %, más preferiblemente al menos un 98 %, lo más preferiblemente al menos un 99 % y lo más preferiblemente al menos un 99,9 % con una de las cepas bacterianas aisladas DIB004G, DIB087G, DIB097X, DIB101G, DIB101X, DIB103X, DIB104X y DIB107X.
El término “progenie” se refiere a un producto de reproducción bacteriana, un nuevo organismo producido por uno o más precursores.
Como se mencionó anteriormente, la biomasa lignocelulítica según la presente descripción puede ser pasto, pasto de transición, gramíneas, ballico, alpiste arundináceo, pasto mixto de pradera, Miscanthus, pasto Napier, residuos de azúcar, bagazo de caña de azúcar, paja de caña de azúcar, residuos agrícolas, paja de arroz, cáscaras de arroz, paja de cebada, mazorcas de maíz, paja de cereal, paja de trigo, paja de colza, paja de paja de avena, cáscaras de avena, fibra de maíz, hojarasca, hojarasca de soja, hojarasca de maíz, desechos forestales, fibra de pulpa de madera reciclada, lodos de papel, aserrín, madera dura, madera blanda, prensado de remolacha azucarera, tallo de algodón, hojas de plátano, residuos de palma aceitera y material de biomasa lignocelulósica obtenido mediante el procesamiento de plantas alimentarias. En realizaciones ventajosas, el material de biomasa lignocelulósica es madera dura y/o madera blanda, preferiblemente madera de álamo. En realizaciones ventajosas, el material de biomasa lignocelulósica es una hierba o pasto perenne, preferiblemente Miscanthus.
La expresión "relación de ADN-ADN", en particular, se refiere al porcentaje de similitud del ADN genómico o entero de dos microorganismos medido mediante el ensayo de hibridación/renaturalización de ADN-ADN según De Ley et al. (1970) Eur. J. Biochem. 12, 133-142 o Huß et al. (1983) Syst. Appl. Microbiol. 4, 184-192. En particular, el ensayo de hibridación de ADN-ADN es realizado preferiblemente por el Servicio de Identificación DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Alemania).
La expresión "similitud de la secuencia de gen de ADNr 16S" se refiere, en particular, al porcentaje de nucleótidos idénticos entre una región de la secuencia de ácido nucleico del gen de ARN ribosomal (ADNr) 16S de un primer microorganismo y la región correspondiente de la secuencia de ácido nucleico de la secuencia del gen de ADNr 16S de un segundo microorganismo. Preferiblemente, la región comprende al menos 100 nucleótidos consecutivos, más preferiblemente al menos 200 nucleótidos consecutivos, al menos 300 nucleótidos consecutivos o al menos 400 nucleótidos consecutivos, lo más preferiblemente aproximadamente 480 nucleótidos consecutivos.
Las cepas según la descripción tienen el potencial de ser capaces de producir una serie de diferentes productos de fermentación, incluyendo ácidos, alcoholes, cetonas e hidrógeno. En una realización, el alcohol se selecciona entre etanol, butanol, propanol, metanol, propanodiol y butanodiol. En una realización adicional, el ácido es ácido láctico, ácido propiónico, ácido acético, ácido succínico, ácido butírico o ácido fórmico, y la cetona es acetona.
En realizaciones ventajosas, el material de biomasa lignocelulósica se somete a pretratamiento mecánico, termoquímico y/o bioquímico. El material de biomasa lignocelulósica podría exponerse al tratamiento con vapor. En realizaciones adicionales, el material de biomasa lignocelulósica es tratado previamente con trituración mecánica y un tratamiento subsiguiente con ácido láctico, ácido acético, ácido sulfúrico o ácido sulfuroso, o sus respectivas sales o anhídridos bajo calor y presión con o sin una liberación repentina de presión. En otra realización, el material de biomasa lignocelulósica es tratado previamente con trituración mecánica y un tratamiento subsiguiente con hidróxido de sodio, hidróxido de amonio, hidróxido de calcio o hidróxido de potasio con calor y presión con o sin una liberación repentina de la presión.
En realizaciones ventajosas, el material de biomasa lignocelulósica es tratado previamente con trituración mecánica y la posterior exposición a un proceso de pretratamiento combinado de varias etapas. Dicho pretratamiento combinado de múltiples etapas puede incluir una etapa de tratamiento que consiste en cocinar en agua o vaporizar el material de biomasa lignocelulósica a una temperatura de 100 a 200 ºC durante un período de tiempo de entre 5 y 120 min. Los catalizadores adecuados incluyen ácido láctico, ácido acético, ácido sulfúrico, ácido sulfuroso, hidróxido de sodio, hidróxido de amonio, hidróxido de calcio o hidróxido de potasio, o sus respectivas sales o anhídridos pueden o no añadirse al proceso. El proceso puede incluir además una etapa que comprenda una operación de separación líquido-sólido, p. ej., filtración, separación, centrifugación o una combinación de las mismas, separando el fluido del proceso que contiene constituyentes parcial o totalmente hidrolizados y solubilizados del material de biomasa lignocelulósica de las partes insolubles restantes de la biomasa lignocelulósica. El proceso puede incluir además una etapa que comprende el lavado del material de biomasa lignocelulósica restante. El material sólido separado de los constituyentes de biomasa solubilizados puede tratarse
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Los microorganismos de la especie Thermoanaerobacter sp. según la presente descripción se refieren, en particular, a un microorganismo que pertenece al género Thermoanaerobacter y que tiene preferiblemente una o más de las siguientes características:
a) es un microorganismo del género Thermoanaerobacter; y/o
b) en un ensayo de hibridación de ADN-ADN, muestra una relación de ADN-ADN de al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 90 %, al menos un 95 %, más preferiblemente al menos un 98 %, lo más preferiblemente al menos un 99 % con las cepas de Thermoanaerobacter sp. enumeradas en la Tabla 1 con sus respectivos números de acceso; y/o
c) muestra un nivel de similitud de secuencia del gen de ADNr 16S de al menos un 98 %, preferiblemente al menos un 99 % o al menos un 99,5 %, más preferiblemente un 100 % con cualquier cepa de Thermoanaerobacter sp. enumerada en la Tabla 1 con sus respectivos números de acceso; y/o
d) es capaz de sobrevivir y/o desarrollar y/o producir altos niveles de al menos un producto de fermentación en condiciones de altas temperaturas, superiores a 70 ºC; y/o
e) es una bacteria Gram-positiva; y/o
f) es un microorganismo termófilo sacarolítico; y/o
g) es un microorganismo termófilo xilanolítico.
Preferiblemente, se cumplen al menos dos o al menos tres, y más preferiblemente todos los criterios definidos anteriormente a) a g).
En una realización ventajosa, los microorganismos según la presente descripción se refieren, en particular, a un microorganismo que pertenece al género Thermoanaerobacter y que tiene preferiblemente una o más de las siguientes características:
a) es un microorganismo del género Thermoanaerobacter;
b) es un microorganismo de la especie Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus, Thermoanaerobacter thermocopriae o Thermoanaerobacter mathranii;
c) en un ensayo de hibridación de ADN-ADN, muestra una relación de ADN-ADN de al menos un 80 %, preferiblemente al menos un 90%, al menos un 95 %, más preferiblemente al menos un 98 %, lo más preferiblemente al menos un 99 % y lo más preferiblemente al menos un 99,9 % con una de las cepas de la Tabla 1; y/o
d) muestra un nivel de similitud de secuencia del gen de ADNr 16S de al menos un 98 %, preferiblemente al menos un 99 %, al menos un 99,5 % o al menos un 99,7 %, más preferiblemente un 99,99 % con una de las cepas enumeradas en la Tabla 1; y/o
e) es capaz de sobrevivir y/o desarrollar y/o producir un producto de fermentación seleccionado del grupo que consiste en ácidos carboxílicos, preferiblemente ácido láctico y alcoholes, preferiblemente etanol, en condiciones de temperatura superior a 70 ºC, en particular, superior a 72 ºC.
Preferiblemente, se cumplen al menos dos o al menos tres, y más preferiblemente todos los criterios definidos anteriormente a) a e).
Las cepas de Thermoanaerobacter sp. según la presente descripción tienen varias características muy ventajosas necesarias para la conversión del material de biomasa lignocelulósica. Así pues, estas cepas de base poseen toda la maquinaria genética para la conversión de ambos azúcares de pentosa y hexosa en diversos productos de fermentación tales como etanol y ácido láctico. Como resultará evidente a partir de los siguientes ejemplos, el examen de la secuencia completa del ADNr 16S mostró que las cepas relacionadas con DIB087G de Thermoanaerobacter sp., DIB101G de Thermoanaerobacter sp. y DIB104X de Thermoanaerobacter sp. pueden estar relacionadas con Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus, aunque las secuencias de ADNr 16S pueden situarlas claramente en subespecies separadas o incluso especies diferentes. La cepa DIB107X de Thermoanaerobacter sp. puede estar relacionada con Thermoanaerobacter thermocopriae, aunque las secuencias de ADNr 16S las colocan claramente en subespecies separadas o incluso diferentes especies. Las cepas DIB004G de Thermoanaerobacter sp., DIB097X de Thermoanaerobacter sp., DIB101X de Thermoanaerobacter sp. y DIB103X de Thermoanaerobacter sp. pueden estar relacionadas con Thermoanaerobacter mathranii, aunque las secuencias de ADNr 16S las colocan claramente en subespecies separadas o incluso diferentes especies.
Es una gran ventaja de las cepas de Thermoanaerobacter sp. de acuerdo con la presente descripción que son
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ácido succínico, ácido butírico, ácido fórmico y acetona según la descripción.
La expresión "comprender", como se emplea en la presente memoria, además de su significado literal, también incluye y se refiere específicamente a las expresiones "consisten esencialmente en" y "consisten en". Por lo tanto, la expresión "comprender" se refiere a realizaciones en donde la materia objeto que "comprende" elementos
5 enumerados específicamente no comprende elementos adicionales, así como las realizaciones en donde la materia objeto que "comprende" elementos enumerados específicamente puede englobar y/o de hecho sí engloba otros elementos. Asimismo, el término "tener" se ha de entender como el término "comprender", incluyendo también y refiriéndose específicamente a las expresiones "consisten esencialmente en" y "consisten en".
Los siguientes métodos y ejemplos solo se ofrecen con fines ilustrativos, y no pretenden limitar el alcance de la 10 presente descripción de ninguna manera.
Métodos y ejemplos
En los siguientes ejemplos, se proporcionan materiales y métodos de la presente descripción que incluyen la determinación de las propiedades de las cepas según la presente descripción. Debe entenderse que estos ejemplos tienen un fin meramente ilustrativo y, de ningún modo, deben interpretarse como limitantes de la presente
15 descripción.
Ejemplo 1: Aislamiento y cultivo
Todos los procedimientos de enriquecimiento y aislamiento de las cepas enumeradas en la Tabla 1 emplearon técnicas anaeróbicas para bacterias estrictamente anaeróbicas (Hungate, 1969). Las cepas se enriquecieron a partir de muestras ambientales a temperaturas superiores a 70 ºC con celulosa cristalina y madera de haya como sustrato.
20 El aislamiento se realizó mediante diluciones en serie en medios líquidos con xilano como sustrato seguidas de la recogida de las colonias cultivadas en medio de agar sólido a 72 ºC en tubos de rodillo Hungate (Hungate, 1969).
Las células se cultivan en condiciones estrictamente anaeróbicas aplicando el siguiente medio:
Medio básico
NH4CI
1,0 g
NaCI
0,5 g
MgSO4 x 7 H2O
0,3 g
CaCI2 x 2 H2O
0,05 g
NaHCO3
0,5 g
K2HPO4
1,5 g
KH2PO4
3,0 g
Extracto de levadura (bacto, BD)
0,5 g
Celobiosa
5,0 g
Vitaminas (véase más abajo)
1,0 ml
Elementos traza (véase más abajo)
0,5 ml
Resazurina
1,0 mg
Na2S x 9 H2O
0,75 g
Agua destilada
1000,0 ml
Solución madre de elementos traza
NiCI2 x 6H2O
2 g
FeSO4 x 7H2O
1 g
Citrato de NH4Fe (III), marrón, Fe al 21,5 %
10 g
MnSO4 x H2O
5 g
13
COCI2 X 6H2O
1 g
ZnSO4 x 7H2O
1 g
CUSO4 X 5H2O
0,1 g
H3BO3
0,1 9
Na2MoO4 x 2H2O
0,1 g
Na2SeO3 x 5H2O
0,2 g
Na2WoO4 x 2H2O
0,1 g
Agua destilada
1000,0 ml
Se añaden 0,5 ml de solución madre de elementos traza a 1 litro del medio
Solución madre de vitaminas
Ácido nicotínico
200 mg
Cianocobalamina
25 mg
Ácido p-aminobenzoico (ácido 4-aminobenzoico)
25 mg
D-pantotenato de calcio
25 mg
HCI de tiamina
25 mg
Riboflavina
25 mg
Ácido lipoico
25 mg
Ácido fólico
10 mg
Biotina
10 mg
HCI de piridoxina
10 mg
Agua destilada
200,0 ml
Se añade 1 ml de solución madre de vitaminas a 1 litro del medio
Todos los ingredientes excepto el sulfuro se disuelven en agua desionizada y se lava abundantemente el medio con gas de nitrógeno (pureza del 99,999%) durante 20 minutos a temperatura ambiente. Tras la adición del sulfuro, se ajusta el valor del pH a 7,0 a temperatura ambiente con HCl 1 M. A continuación, se dispensa el medio en tubos de
5 Hungate o matraces de suero bajo atmósfera de nitrógeno, y los recipientes se sellan herméticamente. Tras esterilizar en autoclave a 121 ºC durante 20 min, el valor de pH debe estar entre 6,8 y 7,0.
Los sustratos de azúcar solubles (xilosa, celobiosa, glucosa) como se especifica para cada uno de los experimentos se añaden filtrados en condiciones estériles tras su esterilización por el autoclave. El xilano se esteriliza en autoclave con el medio. Tras la esterilización por autoclave, se inoculan los cultivos mediante la inyección de un cultivo de
10 siembra a través del septo de sellado y se inoculan en una incubadora a 72 ºC durante el tiempo indicado.
Ejemplo 2: HPLC
Se cuantificaron los azúcares y los productos de fermentación por HPLC-RI, usando un Via Hitachi LaChrom Elite (Hitachi corp.) dotado de una columna de ácido orgánico ROA H+ de Rezex (Phenomenex). Los analitos se separaron isocráticamente con H2SO4 2,5 mM y a 65 ºC.
15 Ejemplo 3: Análisis filogenético de genes de ADNr 16S
Se aisló ADN genómico de cultivos desarrollados como se describió anteriormente y se amplificó ADNr 16S mediante PCR usando 27F (AGAGTTTGATCMTGGCTCAG) como cebador directo y 1492R (GGTTACCTTGTTACGACTT) como cebador inverso. Se secuenciaron los productos resultantes y se analizaron las secuencias usando el software Sequencher 4.10.1 (Gene Codes Corporation). Se usó la base de datos NCBI para
20 los procedimientos BLAST.
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  1. imagen1
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