ES2638910T3 - Nuevas bacterias termófilas extremas del género Caldicellulosiruptor - Google Patents

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Abstract

Una DIB004C de Caldicellulosiruptor sp. aislada, depositada como DSM 25177, o mutantes de la misma que conservan las propiedades de DIB004C.

Description

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Preferiblemente, se cumplen al menos dos o al menos tres, y más preferiblemente todos los criterios definidos anteriormente a) a e).
La expresión "relación de ADN-ADN", en particular, se refiere al porcentaje de similitud del ADN genómico o entero de dos microorganismos medido mediante el ensayo de hibridación/renaturalización de ADN-ADN según De Ley et al. (1970) Eur. J. Biochem. 12, 133-142 o Huß et al. (1983) Syst. Appl. Microbiol. 4, 184-192. En particular, el ensayo de hibridación de ADN-ADN es realizado preferiblemente por el Servicio de Identificación DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Alemania).
La expresión "similitud de la secuencia de gen de ADNr 16S" se refiere, en particular, al porcentaje de nucleótidos idénticos entre una región de la secuencia de ácido nucleico del gen de ARN ribosomal (ADNr) 16S de un primer microorganismo y la región correspondiente de la secuencia de ácido nucleico de la secuencia del gen de ADNr 16S de un segundo microorganismo. Preferiblemente, la región comprende al menos 100 nucleótidos consecutivos, más preferiblemente al menos 200 nucleótidos consecutivos, al menos 300 nucleótidos consecutivos o al menos 400 nucleótidos consecutivos, lo más preferiblemente aproximadamente 480 nucleótidos consecutivos.
Las cepas según la descripción tienen el potencial de ser capaces de producir una serie de diferentes productos de fermentación, incluyendo ácidos, alcoholes, cetonas e hidrógeno. En una realización, el alcohol se selecciona entre etanol, butanol, propanol, metanol, propanodiol y butanodiol. En una realización adicional, el ácido es ácido láctico, ácido propiónico, ácido acético, ácido succínico, ácido butírico o ácido fórmico, y la cetona es acetona.
Las cepas de Caldicellulosiruptor sp. según la presente descripción tienen varias características muy ventajosas necesarias para la conversión del material de biomasa lignocelulósica. Así pues, estas cepas de base poseen toda la maquinaria genética para la hidrólisis de celulosa y hemicelulosas, y para la conversión de ambos azúcares de pentosa y hexosa en diversos productos de fermentación tales como ácido láctico y etanol. Como resultará evidente a partir de los siguientes ejemplos, el examen de la secuencia completa del ADNr 16S mostró que las cepas estrechamente relacionadas pueden estar relacionadas con Caldicellulosiruptor saccharolyticus, aunque las secuencias de ADNr 16S pueden situarlas en una subespecie separada o incluso una especie diferente.
Además, las cepas de Caldicellulosiruptor sp. según la presente descripción son celulolíticas y xilanolíticas.
En una realización preferida, el microorganismo de Caldicellulosiruptor sp. es:
a) DIB004C de Caldicellulosiruptor sp., depositada el 15 de septiembre de 2011 con el número de acceso DSM 25177 según los requisitos del Tratado de Budapest en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), lnhoffenstraße 7B, 38124 Braunschweig (DE) por DIREVO Industrial Biotechnology GmbH, Nattermannallee 1, 50829 Colonia (DE);
b) un microorganismo derivado de DIB004C de Caldicellulosiruptor sp. o
c) una DIB004C mutante de Caldicellulosiruptor sp.
En otra realización preferida, el microorganismo de Caldicellulosiruptor sp. es:
a) DIB041C de Caldicellulosiruptor sp., depositada el 15 de marzo de 2012 con el número de acceso DSM 25771 según los requisitos del Tratado de Budapest en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), lnhoffenstraße 7B, 38124 Braunschweig (DE) por DIREVO Industrial Biotechnology GmbH, Nattermannallee 1, 50829 Colonia (DE);
b) un microorganismo derivado de DIB041C de Caldicellulosiruptor sp. o
c) una DIB041C mutante de Caldicellulosiruptor sp.
En otra realización preferida, el microorganismo de Caldicellulosiruptor sp. es:
a) DIB087C de Caldicellulosiruptor sp., depositada el 15 de marzo de 2012 con el número de acceso DSM 25772 según los requisitos del Tratado de Budapest en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), lnhoffenstraße 7B, 38124 Braunschweig (DE) por DIREVO Industrial Biotechnology GmbH, Nattermannallee 1, 50829 Colonia (DE);
b) un microorganismo derivado de DIB087C de Caldicellulosiruptor sp. o
c) una DIB087C mutante de Caldicellulosiruptor sp.
En otra realización preferida, el microorganismo de Caldicellulosiruptor sp. es:
a) DIB101C de Caldicellulosiruptor sp., depositada el 15 de septiembre de 2011 con el número de acceso DSM 25178 según los requisitos del Tratado de Budapest en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), lnhoffenstraße 7B, 38124 Braunschweig (DE) por DIREVO Industrial Biotechnology GmbH,
Nattermannallee 1, 50829 Colonia (DE);
b) un microorganismo derivado de DIB101C de Caldicellulosiruptor sp. o
c) una DIB101C mutante de Caldicellulosiruptor sp.
En otra realización preferida, el microorganismo de Caldicellulosiruptor sp. es:
5 a) DIB103C de Caldicellulosiruptor sp., depositada el 15 de marzo de 2012 con el número de acceso DSM 25773 según los requisitos del Tratado de Budapest en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), lnhoffenstraße 7B, 38124 Braunschweig (DE) por DIREVO Industrial Biotechnology GmbH, Nattermannallee 1, 50829 Colonia (DE);
b) un microorganismo derivado de DIB103C de Caldicellulosiruptor sp. o
10 c) una DIB103C mutante de Caldicellulosiruptor sp.
En otra realización preferida, el microorganismo de Caldicellulosiruptor sp. es:
a) DIB104C de Caldicellulosiruptor sp., depositada el 15 de marzo de 2012 con el número de acceso DSM 25774 según los requisitos del Tratado de Budapest en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), lnhoffenstraße 7B, 38124 Braunschweig (DE) por DIREVO Industrial Biotechnology GmbH,
15 Nattermannallee 1, 50829 Colonia (DE);
b) un microorganismo derivado de DIB104C de Caldicellulosiruptor sp. o
c) una DIB104C mutante de Caldicellulosiruptor sp.
En otra realización preferida, el microorganismo de Caldicellulosiruptor sp. es:
a) DIB107C de Caldicellulosiruptor sp., depositada el 15 de marzo de 2012 con el número de acceso DSM 25775
20 según los requisitos del Tratado de Budapest en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), lnhoffenstraße 7B, 38124 Braunschweig (DE) por DIREVO Industrial Biotechnology GmbH, Nattermannallee 1, 50829 Colonia (DE);
b) un microorganismo derivado de DIB107C de Caldicellulosiruptor sp. o
c) una DIB107C mutante de Caldicellulosiruptor sp.
25 Todas las cepas enumeradas anteriormente y en la Tabla 1 pertenecen al género Caldicellulosiruptor y son bacterias gram-positivas estrictamente anaeróbicas, no esporíferas, no móviles. Las células son varillas rectas se 0,4 a 0,5 μm por 2,0 a 4,0 μm, que se dan tanto individualmente como en parejas. Después de 7 días de incubación a 72 ºC en medio sólido con agar y celulosa como sustrato, ambas cepas forman colonias lechosas circulares de 0,5 a 1 mm de diámetro. Se producen zonas de clareo alrededor de las colonias que indican la degradación de la celulosa.
30 La expresión "un microorganismo", como se emplea en la presente memoria, puede referirse solo a un organismo unicelular, así como a numerosos organismos unicelulares individuales. Por ejemplo, la expresión "un microorganismo del género Caldicellulosiruptor" puede referirse a una sola célula bacteriana de Caldicellulosiruptor del género Caldicellulosiruptor, así como a múltiples células bacterianas del género Caldicellulosiruptor.
En la presente memoria, las expresiones "una cepa del género Caldicellulosiruptor" y "una célula de
35 Caldicellulosiruptor" se usan como sinónimos. En general, la expresión "un microorganismo" se refiere a numerosas células. En particular, dicho término se refiere a al menos 103 células, preferiblemente al menos 104 células, al menos 105 o al menos 106 células.
Como se mencionó anteriormente, la biomasa lignocelulítica según la presente descripción puede ser, pero no se limita a, pasto, pasto de transición, gramíneas, ballico, alpiste arundináceo, pasto mixto de pradera, Miscanthus, 40 pasto Napier, residuos de azúcar, bagazo de caña de azúcar, paja de caña de azúcar, residuos agrícolas, paja de arroz, cáscaras de arroz, paja de cebada, mazorcas de maíz, paja de cereal, paja de trigo, paja de colza, paja de paja de avena, cáscaras de avena, fibra de maíz, hojarasca, hojarasca de soja, hojarasca de maíz, desechos forestales, fibra de pulpa de madera reciclada, lodos de papel, aserrín, madera dura, madera blanda, prensado de remolacha azucarera, tallo de algodón, hojas de plátano, residuos de palma aceitera y material de biomasa
45 lignocelulósica obtenido mediante el procesamiento de plantas alimentarias. En realizaciones ventajosas, el material de biomasa lignocelulósica es madera dura y/o madera blanda, preferiblemente madera de álamo. En realizaciones ventajosas, el material de biomasa lignocelulósica es una hierba o pasto perenne, preferiblemente Miscanthus.
En realizaciones ventajosas, el material de biomasa lignocelulósica se somete a pretratamiento mecánico, termoquímico y/o bioquímico. El material de biomasa lignocelulósica podría exponerse al tratamiento con vapor. En 50 realizaciones adicionales, el material de biomasa lignocelulósica es tratado previamente con trituración mecánica y
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Para la producción de ciertos productos de fermentación, puede ser útil seleccionar un proceso de fermentación específico, tal como un proceso de fermentación discontinua, que incluye un proceso alimentado por lotes o un proceso de fermentación continua. Además, puede ser útil seleccionar un reactor de fermentación tal como un reactor de recipiente agitado, un reactor de celda inmovilizada, un reactor de lecho fluidizado o un biorreactor de membrana.
Según la invención, el método es útil para la producción de una amplia selección de productos de fermentación que incluyen ácidos, alcoholes, cetonas e hidrógeno. Por lo tanto, se pueden producir productos de fermentación tales como etanol, butanol, propanol, metanol, propanodiol, butanodiol, ácido láctico, ácido propiónico, ácido acético, ácido succínico, ácido butírico, ácido fórmico y acetona según la descripción.
La expresión "comprender", como se emplea en la presente memoria, además de su significado literal, también incluye y se refiere específicamente a las expresiones "consisten esencialmente en" y "consisten en". Por lo tanto, la expresión "comprender" se refiere a realizaciones en donde la materia objeto que "comprende" elementos enumerados específicamente no comprende elementos adicionales, así como las realizaciones en donde la materia objeto que "comprende" elementos enumerados específicamente puede englobar y/o de hecho sí engloba otros elementos. Asimismo, el término "tener" se ha de entender como el término "comprender", incluyendo también y refiriéndose específicamente a las expresiones "consisten esencialmente en" y "consisten en".
Los siguientes métodos y ejemplos solo se ofrecen con fines ilustrativos, y no pretenden limitar el alcance de la presente descripción de ninguna manera.
Métodos y ejemplos
En los siguientes ejemplos, se proporcionan materiales y métodos de la presente descripción que incluyen la determinación de las propiedades de las cepas microbianas según la presente descripción. Debe entenderse que estos ejemplos tienen un fin meramente ilustrativo y, de ningún modo, deben interpretarse como limitantes de la presente descripción.
Ejemplo 1: Aislamiento y cultivo
Todos los procedimientos de enriquecimiento y aislamiento de las cepas enumeradas en la Tabla 1 emplearon técnicas anaeróbicas para bacterias estrictamente anaeróbicas (Hungate, 1969). Las cepas se enriquecieron a partir de muestras ambientales a temperaturas superiores a 70 ºC con celulosa cristalina y madera de haya como sustrato. El aislamiento se realizó recolectando colonias cultivadas en medio de agar sólido a 72 ºC en tubos de rodillo Hungate (Hungate, 1969).
Las células se cultivan en condiciones estrictamente anaeróbicas aplicando el siguiente medio:
Medio básico
NH4CI
1,0 g
NaCI
0,5 g
MgSO4 x 7 H2O
0,3 g
CaCI2 x 2 H2O
0,05 g
NaHCO3
0,5 g
K2HPO4
1,5 g
KH2PO4
3,0 g
Extracto de levadura (bacto, BD)
0,5 g
Celobiosa
5,0 g
Vitaminas (véase más abajo)
1,0 ml
Elementos traza (véase más abajo)
0,5 ml
Resazurina
1,0 mg
Na2S x 9 H2O
0,75 g
Agua destilada
1000,0 ml
Solución madre de elementos traza
NiCI2 x 6H2O
2 g
FeSO4 x 7H2O
1 g
Citrato de NH4Fe (III), marrón, Fe al 21,5 %
10 g
MnSO4 x H2O
5 g
COCI2 X 6H2O
1 g
ZnSO4 x 7H2O
1 g
CUSO4 X 5H2O
0,1 g
H3BO3
0,1 9
Na2MoO4 x 2H2O
0,1 g
Na2SeO3 x 5H2O
0,2 g
Na2WoO4 x 2H2O
0,1 g
Agua destilada
1000,0 ml
Se añaden 0,5 ml de solución madre de elementos traza a 1 litro del medio
Solución madre de vitaminas
Ácido nicotínico
200 mg
Cianocobalamina
25 mg
Ácido p-aminobenzoico (ácido 4-aminobenzoico)
25 mg
D-pantotenato de calcio
25 mg
HCI de tiamina
25 mg
Riboflavina
25 mg
Ácido lipoico
25 mg
Ácido fólico
10 mg
Biotina
10 mg
HCI de piridoxina
10 mg
Agua destilada
200,0 ml
Se añade 1 ml de solución madre de vitaminas a 1 litro del medio
Todos los ingredientes excepto el sulfuro se disuelven en agua desionizada y se lava abundantemente el medio con gas de nitrógeno (pureza del 99,999 %) durante 20 minutos a temperatura ambiente. Tras la adición del sulfuro, se ajusta el valor del pH a 7,0 a temperatura ambiente con HCl 1 M. A continuación, se dispensa el medio en tubos de Hungate o matraces de suero bajo atmósfera de nitrógeno, y los recipientes se sellan herméticamente. Tras esterilizar en autoclave a 121 ºC durante 20 min, el valor de pH debe estar entre 6,8 y 7,0.
Las fuentes de carbono especificadas para experimentos individuales se añaden antes de la esterilización por autoclave. Todas las concentraciones de sustrato aplicadas se indican como equivalentes de glucosa sobre la base
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Claims (1)

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