ES2642629T3 - Métodos para la producción mejorada de proteínas - Google Patents

Description

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DESCRIPCION

Metodos para la production mejorada de protelnas Antecedentes de la invencion

Los cultivos de celulas animales, particularmente los cultivos de celulas de mamlfero, se usan habitualmente para la expresion de protelnas producidas recombinantemente con fines terapeuticos, profilacticos y diagnosticos. Aunque se prefieren los metodos de cultivo con celulas de mamlfero con respecto a los sistemas de expresion microbianos (por ejemplo, sistemas de expresion bacterianos o de levadura), debido a que son mas adecuados para expresar protelnas de alto peso molecular y protelnas con unas estructuras estericas complejas, los niveles de expresion de las protelnas en los sistemas basados en los cultivos con celulas de mamlfero son generalmente considerablemente menores que los de los sistemas de expresion microbianos. Aunque se han intentado numerosas estrategias para aumentar la expresion de protelnas en los cultivos con celulas de mamlfero, estos metodos no han sido capaces de optimizar las condiciones para el crecimiento celular, mantener una elevada viabilidad celular y producir grandes volumenes de una protelna de alta calidad, limitando as! su aplicacion practica en la industria biofarmaceutica.

Como tal, existe una necesidad en la materia de desarrollar metodos mejorados de cultivo a gran escala con celulas animales para la produccion y purification de protelnas (por ejemplo, anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, peptidos, enzimas, factores de crecimiento, hormonas, interleucinas, interferones y vacunas) para conseguir una produccion de protelnas fiable y rentable con unos elevados rendimientos.

Sumario de la invencion

En ciertas realizaciones, la presente invencion proporciona metodos para aumentar la produccion de una protelna en un cultivo celular mediante el cultivo de las celulas que producen la protelna en perfusion hasta una elevada densidad de celulas (por ejemplo, al menos hasta por encima de aproximadamente 50 x 106 celulas/ml, mas preferentemente por encima de aproximadamente entre 60 y 80 x 106 celulas/ml y lo mas preferentemente alrededor de aproximadamente 100 x 106 celulas/ml), denominado tambien en el presente documento como "densidad super elevada", cambiando despues el cultivo celular a semicontinuo, de forma que las celulas entren en una fase de produccion de protelnas elevada. La presente invencion se basa, al menos en parte, en el inesperado descubrimiento de que es posible cultivar celulas en un cultivo hasta una densidad mucho mayor de lo que anteriormente se crela posible. Esto, a su vez, produce significativamente mas protelna de la que se produce normalmente usando las tecnicas de cultivo celular conocidas. Especlficamente, generalmente se ensena que la densidad de celulas maxima conseguida mediante el uso de las tecnicas de cultivo celular conocidas esta limitada por la presencia de los niveles de algunos productos de desecho en particular (por ejemplo, lactato, amonio, etc.), dado que se sabe que dichos productos de desecho pueden ser toxicos para el crecimiento celular cuando se acumulan hasta unas concentraciones crlticas (vease, por ejemplo, Schumpp, B. et al., J. Cell Sci., 7 (Pt 4): 639-647 (diciembre de 1990)). Como tales, las tecnicas de cultivo celular conocidas a menudo limitan la densidad maxima a la que las celulas se cultivan inicialmente, de forma que las celulas no se vean afectadas negativamente por las concentraciones de los productos de desecho en particular.

Por ejemplo, el metodo de cultivo celular descrito en el documento WO 2009/023562 se basa en los niveles de lactato para senalizar la densidad de celulas maxima que puede conseguirse teoricamente antes de iniciar el cultivo celular en perfusion. Segun se ensena en el documento WO 2009/023562, las celulas se cultivan hasta una densidad de entre aproximadamente 1 millon y 9 millones de celulas/ml, lo que da como resultado una concentration de lactato de entre aproximadamente 1 g/l y aproximadamente 6 g/l. Segun el documento WO 2009/023562, esto senaliza el punto temporal optimo para comenzar la perfusion. Despues de la perfusion, las celulas se cultivan a continuation hasta apenas entre 5 y 40 millones de celulas/ml y se mantienen en un cultivo celular semicontinuo para producir unos tltulos de anticuerpo de entre 8-10 g/l (entre los dlas 14-17).

A diferencia de dichos metodos conocidos de cultivo celular, ningun nivel en particular de productos de desecho restringe la densidad del crecimiento celular segun los metodos de la presente invencion. Mas bien, se descubrio que cuando las celulas se cultivan inicialmente unicamente en un cultivo celular en perfusion, las celulas son capaces de crecer hasta una densidad de celulas mucho mayor (por ejemplo, al menos por encima de 40 x 106 celulas/ml) de lo que previamente se habla notificado para las tecnicas de cultivo celular conocidas, independientemente de la presencia de productos de desecho. En una realization en particular, las celulas se cultivan hasta una densidad de al menos por encima de entre aproximadamente 50 x 106 celulas/ml y 60 x 106 celulas/ml, preferentemente por encima de entre aproximadamente 70 x 106 celulas/ml y 90 x 106 celulas/ml, mas preferentemente por encima de entre aproximadamente 100 x 106 y 130 x 106 y lo mas preferentemente por encima de entre aproximadamente 140 x 106 y 200 x 106 celulas/ml o mas. A esta densidad "super" alta de celulas permite, a su vez, la produccion de unas cantidades significativamente mayores de protelna (por ejemplo, de 13,8 g/l el dla 6) en un periodo de tiempo mas corto de lo que se habla notificado previamente.

La presente invencion tambien proporciona otra ventaja inesperada mas con respecto a las tecnicas de cultivo celular conocidas, ya que optimiza la produccion de grandes cantidades de una protelna de alta calidad. Por

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ejemplo, en una realizacion, la protelna recogida segun los metodos de la presente invencion se obtiene unicamente a partir de un cultivo celular semicontinuo. Esto aumenta la frescura, la estabilidad y la calidad de la protelna, en contraste con la protelna obtenida a partir de cultivos tanto en perfusion como semicontinuos sometidos a unos periodos de cultivo mas largos, que por lo tanto es mas susceptible a la degradacion y generalmente de una calidad peor. Sin embargo, la presente invencion tambien contempla recoger la protelna de cultivos tanto en perfusion como semicontinuos (por ejemplo, cuando se cultivan las celulas en un unico biorreactor).

En ciertas realizaciones, la presente invencion emplea celulas recombinantes que expresan una protelna de interes. Por ejemplo, las celulas son transfectadas con al menos un acido nucleico que codifica una protelna de interes.

Los metodos de la presente invencion pueden usarse para mejorar la produccion de cualquier protelna de interes, incluyendo, sin limitacion, enzimas, receptores, protelnas de fusion, citocinas, factores reguladores, hormonas, protelnas diagnosticas, protelnas terapeuticas y agentes de union al antlgeno. En una realizacion en particular, la protelna es un anticuerpo (o un fragmento de union al antlgeno del mismo). De forma analoga, puede cultivarse una gran diversidad de celulas segun los metodos de la presente invencion. En una realizacion en particular, las celulas son celulas animales. En una realizacion preferida, las celulas son celulas de mamlfero, tales como las celulas CHO, NS0, BHK y Per C6.

Las condiciones de cultivo celular (por ejemplo, el pH, la temperatura, el medio, el recipiente en particular para el crecimiento de los cultivos, etc.) pueden ser determinadas y ajustadas por el experto habitual en la materia dependiendo de diversos factores, tales como la llnea celular y la protelna que se va a producir en particular. En una realizacion, el cultivo celular en perfusion y el cultivo celular en modo semicontinuo se llevan a cabo en biorreactores. Esto puede incluir un unico biorreactor o multiples biorreactores (por ejemplo, de forma que el cultivo celular en perfusion y el cultivo celular en modo semicontinuo se llevan a cabo en biorreactores independientes). Por ejemplo, el cultivo celular en perfusion puede llevarse a cabo en un biorreactor y despues las celulas pueden ser transferidas a multiples biorreactores semicontinuos.

Ademas, las condiciones del cultivo celular pueden optimizarse para maximizar la produccion de protelna. Por ejemplo, pueden optimizarse los parametros del cultivo celular, tales como el pH, la DO, la temperatura, las estrategias de suministro, la composicion del suministro, etc.

En el presente documento tambien se divulgan metodos para la clarificacion de una protelna a partir de un cultivo celular. Esto se consigue ajustando el pH del cultivo celular por debajo de un pH neutro (es decir, por debajo de un pH de 7) y sedimentando el cultivo celular, de forma que el cultivo celular se separe para formar una capa de sobrenadante y una capa de lecho celular, en el que la protelna esta presente (y a partir del cual puede aislarse) en la capa del sobrenadante. Aunque los metodos pueden ser aplicados a los cultivos celulares de la invencion, pueden ser aplicados para clarificar una protelna a partir de cualquier cultivo celular, incluyendo cultivos celulares de alta densidad.

El metodo puede implicar el ajuste del pH del cultivo celular a un pH bajo (es decir, por debajo de un pH neutro de 7 tal como a un pH de 4-7). En particular, el pH puede ajustarse hasta un pH de entre aproximadamente 4,5 y 6,5. El metodo tambien puede implicar la sedimentacion del cultivo celular durante al menos aproximadamente 30 minutos, de forma que se mejore la clarificacion del cultivo celular antes de la recoleccion de la protelna. Sin embargo, el cultivo celular puede sedimentarse durante periodos de tiempo mas largos a la discretion del artesano experto. En particular, el cultivo celular puede sedimentarse durante entre aproximadamente 30 y 120 minutos.

Opcionalmente pueden emplearse otras tecnicas de purification conocidas junto con el metodo de clarificacion descrito anteriormente. Por ejemplo, el cultivo celular puede ser centrifugado antes de la sedimentacion del cultivo celular. Alternativamente, el cultivo celular puede ser centrifugado despues de la sedimentacion del cultivo celular, o el cultivo celular puede ser centrifugado antes y despues de la sedimentacion del cultivo celular.

Otra etapa opcional que puede llevarse a cabo para mejorar el metodo de clarificacion es el lavado de la capa del lecho celular que se forma como resultado del proceso de sedimentacion con un tampon a pH bajo. En una realizacion en particular, el pH del tampon es el mismo que el pH del cultivo celular, es decir, cuando el cultivo celular se ajusta a un pH bajo (es decir, por debajo de un pH neutro de 7).

Adicionalmente, pueden usarse tecnicas de filtration para clarificar adicionalmente el cultivo celular. Por ejemplo, el cultivo celular puede ser filtrado antes de la sedimentacion del cultivo celular, el cultivo celular puede ser filtrado despues de la sedimentacion del cultivo celular, o el cultivo celular puede ser filtrado antes y despues de la sedimentacion del cultivo celular. La filtracion puede llevarse a cabo usando cualquiera de las diversas tecnicas conocidas en la materia que incluyen, pero no se limitan a, una filtracion profunda y una filtracion de pulido.

Otras caracterlsticas y ventajas de la invencion seran evidentes a partir de la siguiente description detallada y a partir de las reivindicaciones.

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Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1 representa un posible escenario para llevar a la practica los metodos de la presente invencion, es decir, en el que el proceso de cultivo celular semicontinuo de super densidad se lleva a cabo en un unico biorreactor.

La Figura 2 representa otro posible escenario para llevar a la practica los metodos de la presente invencion, es decir, en el que las celulas son perfundidas en un biorreactor de perfusion hasta que se consigue una densidad de celulas en particular y despues se transfieren a multiples reactores semicontinuos. El proceso de cultivo celular semicontinuo se lleva a cabo en un unico biorreactor.

La Figura 3 es una grafica que muestra el crecimiento celular y el perfil de production de protelna para el Experimento #1.

La Figura 4 es una grafica que muestra el crecimiento celular y el perfil de produccion de protelna para el Experimento #2.

La Figura 5 es una grafica que muestra el perfil del biorreactor de perfusion (es decir, la densidad de celulas viables y el porcentaje de viabilidad) del Experimento 3.

La Figura 6 es una grafica de superposition que representa la densidad de celulas y los perfiles de productividad de los dos biorreactores utilizados en el Experimento 3.

La Figura 7 es una grafica que muestra el crecimiento celular, la viabilidad celular y los perfiles de produccion de protelna en el biorreactor de produccion del Experimento 4.

La Figura 8 es una grafica que resume los resultados de productividad de los cuatro Experimentos en funcion de la integral celular.

La Figura 9 es una grafica que representa el efecto de la modification de los parametros experimentales (es decir, el pH, el coadyuvante de filtration, etc.) sobre el proceso de clarification.

La Figura 10 es un diagrama esquematico que representa las etapas clave del proceso de clarificacion, as! como las tecnicas opcionales para mejorar el proceso de clarificacion.

Descripcion detallada de la invencion

La presente invencion proporciona metodos mejorados para aumentar la produccion de protelna en un cultivo celular mediante el cultivo de las celulas que producen la protelna en un cultivo celular en perfusion hasta una elevada densidad de celulas (es decir, al menos por encima de 40 x 106 celulas/ml) y cambiando despues a un cultivo celular semicontinuo, de forma que las celulas entren en una fase de produccion de la protelna. La invencion tambien proporciona metodos para la clarificacion de cultivos celulares para facilitar la recoleccion de la protelna a partir de los cultivos.

Con objeto de que la presente invencion se comprenda con mas facilidad, en primer lugar se definen ciertos terminos. A lo largo de la descripcion detallada se proporcionan definiciones adicionales.

I. Definiciones

Los terminos "cultivo celular" y "cultivo" incluyen cualquier combination de celulas y medio. Los metodos de la presente invencion contemplan, sin limitation, dos tipos generales de cultivo celular, es decir, el cultivo celular en perfusion y el cultivo celular semicontinuo. Los principios subyacentes de estos tipos de cultivos celulares se describen a continuacion.

Segun se usa en el presente documento, los terminos "perfundir", "perfusion" y "cultivo en perfusion" se usan de forma intercambiable para referirse a un metodo de cultivo de celulas en el que se proporciona medio fresco adicional al cultivo y el medio gastado se retira del cultivo. La perfusion se inicia despues de la siembra del cultivo y puede producirse de forma continua o intermitente, segun se desee, durante un periodo de tiempo. El medio fresco anadido durante la perfusion normalmente proporciona complementos nutricionales para las celulas que se han agotado durante el proceso de cultivo. La perfusion tambien permite la elimination de los productos de desecho celulares y de los subproductos toxicos del cultivo celular. La perfusion se lleva a cabo durante la fase de crecimiento de las celulas, pero tambien puede continuar despues de que las celulas hayan sido transferidas a un cultivo celular semicontinuo (se analiza a continuation).

Segun se usa en el presente documento, el termino "velocidad de perfusion especlfica" (SPR) se refiere a la velocidad a la que se proporciona medio fresco al cultivo celular y se retira el medio gastado basandose en la densidad de celulas. La SPR puede calcularse usando la siguiente ecuacion:

velocidad de perfusion especlfica (SPR) = (volumen del reactor / dla) / (densidad de celulas total (x 106)).

La SPR puede ser determinada y/o ajustada por el experto habitual en la materia basandose en factores que incluyen, pero no se limitan a, la naturaleza de las celulas hospedadoras en particular, la velocidad de crecimiento de las celulas y la densidad de celulas. Por ejemplo, la SPR tlpica puede variar entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 1,0 x 10'6 ml celula'1 dla'1. En una realization, la SPR es de 1,0, de 0,9, de 0,8, de 0,7, de 0,6, de 0,5, de 0,4, de 0,3, de 0,2, de 0,1, de 0,09, de 0,08, de 0,07, de 0,06, de 0,05, de 0,04, de 0,03, de 0,02 o de 0,01.

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En una realization, la SPR varla entre 0,25 y 0,03 x 10'6 ml celula'1 dla'1. En otra realization, la SPR varla entre 0,07 6 11 6 11 y 0,01 x 10 ml celula dla' . En otra realization, la SPR varla entre 0,07 y 0,03 x 10 ml celula dla . En una

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realization en particular, la SPR se mantiene aproximadamente a 0,05 x 10 ml celula dla .

La SPR puede permanecer constante durante un periodo de tiempo, o puede alterarse (es decir, aumentarse o disminuirse) en el transcurso del periodo de perfusion. Por ejemplo, la SPR puede aumentarse de forma sostenida con el tiempo, aumentarse poco a poco con el tiempo, disminuirse de forma sostenida con el tiempo, disminuirse poco a poco con el tiempo, o cualquier combination de los mismos. La perfusion puede ser aplicada de una forma continua o de una forma intermitente. El experto habitual en la materia puede determinar la SPR, as! como la cronologla apropiada para el inicio y el cese del (los) periodo(s) de perfusion y de cualquier alteration en la perfusion, basandose en la monitorizacion de algun parametro del cultivo celular.

Segun se usa en el presente documento, el termino "cultivo semicontinuo" se refiere a un metodo de cultivo de celulas en el que se complementa el cultivo celular con medio fresco, es decir, a las celulas se les "suministra" medio nuevo, mientras que el medio gastado no se retira. Normalmente, un proceso de cultivo "semicontinuo" se lleva a cabo en un biorreactor y los componentes adicionales (por ejemplo, complementos nutricionales) son anadidos al cultivo en algun momento despues del inicio del proceso de cultivo. La adicion controlada de nutrientes afecta directamente a la velocidad de crecimiento del cultivo y permite evitar la formation de un sobreflujo de metabolitos (vease, por ejemplo, Wlaschin, K.F. et al., "Fedbatch culure and dynamic nutrient feeding," Cell Culture Engineering, 101: 43-74 (2006) y Lee, J. et al., "Control of fed-batch fermentations," Biotechnol. Adv., 17: 29-48 (1999)). Un cultivo semicontinuo normalmente se finaliza en algun punto, y las celulas y/o los componentes del medio se recogen, y opcionalmente se purifican.

Segun se usa en el presente documento, el termino "porcentaje de suministro" es el porcentaje del volumen de suministro en el volumen total del cultivo celular.

Segun se usa en el presente documento, el termino "suministro en bolo" se refiere una unica adicion de suministro.

Segun se usa en el presente documento, los terminos "inoculation", "inoculo" y "siembra" se refieren a la adicion de celulas al medio de partida para comenzar el cultivo.

Segun se usa en el presente documento, el termino "densidad de celulas" se refiere al numero de celulas en un volumen de medio dado. Una elevada densidad de celulas es deseable ya que puede dar lugar a una mayor productividad de protelna. Como tal, la densidad de celulas es monitorizada de forma rutinaria en los cultivos celulares. La densidad de celulas puede ser monitorizada mediante cualquier tecnica conocida en la materia que incluye, pero no se limita a, la extraction de muestras a partir de un cultivo y el analisis de las celulas bajo un microscopio, usando un dispositivo contador de celulas disponible comercialmente o usando una sonda adecuada disponible comercialmente introducida en el propio biorreactor (o en un serpentln a traves del cual se hacen pasar el medio y las celulas suspendidas, y despues se devuelven al biorreactor).

Segun se usa en el presente documento los terminos "densidad de celulas super alta" y "elevada densidad de celulas" se usan de forma intercambiable y se refieren a una densidad de celulas de al menos por encima de 40 x 106 celulas/ml. Las tecnicas de cultivo celular conocidas pueden implicar el cultivo de las celulas hasta un "primer nivel crltico" (es decir, "un punto durante la fase de crecimiento del ciclo celular en el que la viabilidad celular puede verse afectada por el aumento en la concentration de las producciones de desecho (por ejemplo, inhibidores del crecimiento celular y metabolitos toxicos, por ejemplo, lactato, amonio, etc.)" antes de la perfusion del cultivo celular y la obtencion de apenas entre 5 y 40 millones de celulas/ml). Por el contrario, las celulas cultivadas segun los metodos de la presente invention no estan restringidas por los productos de desecho, y por lo tanto son capaces de alcanzar una densidad de celulas super alta (es decir, al menos por encima de aproximadamente 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130 x 106 celulas/ml). Especlficamente, como parte de la presente invention se descubrio que cuando las celulas se cultivan inicialmente en un cultivo celular en perfusion, las celulas crecen hasta una densidad de celulas mucho mayor (es decir, una densidad de celulas super alta), independientemente de la presencia de productos de desecho, tales como lactato o amonio.

En la presente invention, las celulas cultivadas en un cultivo celular en perfusion son "conmutadas" (por ejemplo, desplazadas o transferidas) a un modo de cultivo semicontinuo una vez que las celulas alcanzan una elevada densidad de celulas. En una realization, la conmutacion se produce a una elevada densidad de celulas de al menos por encima de aproximadamente 50 x 106 celulas/ml. En otra realization, la conmutacion se produce a una elevada densidad de celulas de al menos entre aproximadamente 50 x 106 celulas/ml y 200 x 106 celulas/ml. En algunas realizaciones en particular, la conmutacion se produce a unas elevadas densidades celulares de aproximadamente 51 x 106 celulas/ml, 52 x 106 celulas/ml, 53 x 106 celulas/ml, 54 x 106 celulas/ml, 55 x 106 celulas/ml, 56 x 106 celulas/ml, 57 x 106 celulas/ml, 58 x 106 celulas/ml, 59 x 106 celulas/ml, 60 x 106 celulas/ml, 61 x 106 celulas/ml, 62 x 106 celulas/ml, 63 x 106 celulas/ml, 64 x 106 celulas/ml, 65 x 106 celulas/ml, 66 x 106 celulas/ml, 67 x 106 celulas/ml 68 x 106 celulas/ml, 69 x 106 celulas/ml, 70 x 106 celulas/ml, 71 x 106 celulas/ml, 72 x 106 celulas/ml, 73 x 106 celulas/ml, 74 x 106 celulas/ml, 75 x 106 celulas/ml, 76 x 106 celulas/ml, 77 x 106 celulas/ml, 78 x 106 celulas/ml, 79 x 106 celulas/ml, 80 x 106 celulas/ml, 81 x 106 celulas/ml m 82 x 106 celulas/ml, 83 x 106 celulas/ml, 84 x 106

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celulas/ml, 85 x 106 celulas/ml, 86 x 106 celulas/ml, 87 x 106 celulas/ml, 88 x 106 celulas/ml, 89 x 106 celulas/ml, 90 x

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6 celulas/ml 92 x 106 celulas/ml, 93 x 106 celulas/ml, 94 x 106 celulas/ml, 95 x 106 celulas/ml,

96 x 106 celulas/ml, 97 x 106 celulas/ml,

98 x 106 celulas/ml, 99 x 106 celulas/ml, 100 x 10 celulas/ml 101 x 106

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102 x 106 celulas/ml, 103 x 106 celulas/ml, 104 x 106 celulas/ml, 105 x 106 celulas/ml, 106 x 106

celulas/ml,

107 x 106 celulas/ml, 113 x 106 celulas/ml, 119 x 106 celulas/ml, 125 x 106 celulas/ml, 131 x 106

celulas/ml,

137 x 106 celulas/ml, 143 x 106 celulas/ml, 149 x 106 celulas/ml, 155 x 106 celulas/ml, 161 x 106

celulas/ml,

167 x 106 celulas/ml, 173 x 106 celulas/ml, 179 x 106 celulas/ml, 185 x 106 celulas/ml, 191 x 106

celulas/ml,

197 x 106 celulas/ml, 108 x 106 celulas/ml, 109 x 106 celulas/ml, 114 x 106 celulas/ml, 115 x 106

celulas/ml,

120 x 106 celulas/ml, 121 x 106 celulas/ml, 126 x 106 celulas/ml, 127 x 106 celulas/ml, 132 x 106

celulas/ml,

133 x 106 celulas/ml, 138 x 106 celulas/ml, 139 x 106 celulas/ml, 144 x 106 celulas/ml, 145 x 106

celulas/ml,

150 x 106 celulas/ml, 151 x 106 celulas/ml, 156 x 106 celulas/ml, 157 x 106 celulas/ml, 162 x 106

celulas/ml,

163 x 106 celulas/ml, 164, x 106 celulas/ml 168 x 106 celulas/ml, 169 x 106 celulas/ml, 170 x 106

celulas/ml,

174 x 106 celulas/ml, 175 x 106 celulas/ml, 180 x 106 celulas/ml, 181 x 106 celulas/ml, 186 x 106

celulas/ml,

187 x 106 celulas/ml, 192 x 106 celulas/ml, 193 x 106 celulas/ml, 110 x 106 celulas/ml, 111 x 106

celulas/ml,

116 x 106 celulas/ml, 117 x 106 celulas/ml, 122 x 106 celulas/ml, 123 x 106 celulas/ml, 128 x 106

celulas/ml,

129 x 106 celulas/ml, 134 x 106 celulas/ml, 135 x 106 celulas/ml, 140 x 106 celulas/ml, 141 x 106

celulas/ml,

146 x 106 celulas/ml, 147 x 106 celulas/ml, 152 x 106 celulas/ml, 153 x 106 celulas/ml, 112 x 106

celulas/ml,

118 x 106 celulas/ml, 124 x 106 celulas/ml, 130 x 106 celulas/ml, 136 x 106 celulas/ml, 142 x 106

celulas/ml,

148 x 106 celulas/ml, 154 x 106 celulas/ml, 158 x 106 celulas/ml, 159 x 106 celulas/ml, 160 x 106

celulas/ml,

165 x 106 celulas/ml, 166 x 106 celulas/ml, 171 x 106 celulas/ml, 172, x 106 celulas/ml, 176 x 106

celulas/ml,

177 x 106 celulas/ml, 178 x 106 celulas/ml, 182 x 106 celulas/ml, 183 x 106 celulas/ml, 184 x 106

celulas/ml,

188 x 106 celulas/ml, 189 x 106 celulas/ml, 190 x 106 celulas/ml, 194 x 106 celulas/ml, 195 x 106

celulas/ml,

196 x 106 celulas/ml, 198 x 106 celulas/ml, 199 x 106 celulas/ml o 200 x 106 celulas/ml, o mas. En una

realizacion

preferida, la conmutacion desde el cultivo en perfusion hacia el cultivo semicontinuo se produce a una

densidad de celulas de al menos aproximadamente 50 x 10 celulas/ml. En una realizacion mas preferida, la conmutacion se produce a una densidad de celulas de al menos aproximadamente 100 x 106 celulas/ml.

Segun se usa en el presente documento, el termino "proceso semicontinuo con super densidad", "proceso SDF" y "proceso semicontinuo de cultivo celular con super densidad" se usan de forma intercambiable y se refieren al proceso de cultivar celulas en un cultivo celular en perfusion y transferir despues las celulas a un modo de cultivo semicontinuo, una vez que las celulas alcanzan una elevada densidad de celulas (por ejemplo, al menos por encima de 50 x 106 celulas/ml).

La transicion desde el cultivo celular en perfusion hacia el cultivo celular semicontinuo se produce una vez que se alcanza una elevada densidad de celulas (como se ha analizado anteriormente). Una elevada densidad de celulas puede conseguirse en cualquier momento despues de la inoculacion del cultivo celular, dependiendo de la velocidad de crecimiento de la llnea celular y de la densidad de siembra. En una realizacion, la densidad elevada puede alcanzarse 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,23, 24 o 25 dlas despues de la inoculacion. En una realizacion preferida, la densidad elevada se alcanza entre aproximadamente 4 y 17 dlas despues de la inoculacion.

Segun se usa en el presente documento, el termino "densidad de celulas viables" se refiere al numero de celulas vivas presentes en un volumen dado de medio en un conjunto dado de condiciones experimentales.

Segun se usa en el presente documento, el termino "viabilidad celular" se refiere a la capacidad de las celulas del cultivo para sobrevivir en un conjunto dado de condiciones o de variaciones experimentales. El termino, segun se usa en el presente documento, se refiere tambien a aquella porcion de celulas que esta viva en un momento en particular con respecto al numero total de celulas (por ejemplo, vivas y muertas) en el cultivo en ese momento.

Segun se usa en el presente documento, "la fase de crecimiento" de un cultivo celular se refiere a la fase durante la cual la densidad de celulas viables en cualquier punto temporal es mayor que en cualquier punto temporal previo.

Segun se usa en el presente documento, la "fase de produccion" de un cultivo celular se refiere a la fase durante la cual las celulas producen unas cantidades significativas de protelna, que se acumula para el futuro procesado.

Segun se usa en el presente documento, el termino "integral celular" se refiere a la cantidad global de celulas viables durante el transcurso de un perfil de crecimiento celular.

Segun se usa en el presente documento, el termino "tltulo" se refiere a la cantidad total de protelna producida por un cultivo celular, dividida por una cantidad dada de volumen de medio. En esencia, el termino "tltulo" se refiere a una concentracion, y normalmente se expresa en unidades de miligramos de polipeptido por litro de medio. Los metodos de la presente invencion tienen el efecto de aumentar sustancialmente el tltulo del producto de polipeptido, en comparacion con el tltulo del producto de polipeptido producido a partir de otros metodos de cultivo celular conocidos en la materia.

Segun se usa en el presente documento, los terminos "medios", "medios de cultivo celular" y "medios de cultivo",

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incluyendo las variaciones gramaticales de los mismos, se usan de forma intercambiable y se refieren a la solucion nutriente en la que se cultivan las celulas (preferentemente celulas animales o de mamlfero) de un cultivo. El medio de cultivo celular es el entorno fisicoqulmico, nutricional y hormonal de las celulas, y normalmente incluye al menos uno o mas componentes entre los siguientes: una fuente de energla (por ejemplo, en forma de un carbohidrato tal como glucosa); aminoacidos esenciales, incluyendo los 20 aminoacidos basicos mas cistelna; vitaminas y/u otros compuestos organicos que normalmente son necesarios a unas concentraciones bajas; llpidos o acidos grasos libres (por ejemplo, acido linoleico); y oligoelementos (por ejemplo, compuestos inorganicos o elementos naturales que normalmente son necesarios a unas concentraciones muy bajas, habitualmente en el intervalo micromolar). El medio puede ser solido, gelatinoso, llquido, gaseoso o una mezcla de fases y materiales.

Las celulas utilizadas en los metodos de la presente invencion pueden cultivarse y mantenerse en cualquiera de los diversos medios de cultivo celular que se conocen en la materia o estan disponibles en el mercado. El experto habitual en la materia puede optar por usar uno o mas medios de cultivo celular conocidos que se seleccionan para maximizar el crecimiento celular, la viabilidad celular y/o la produccion de protelna en una celula hospedadora cultivada en particular. Algunos ejemplos de medio de cultivo celular incluyen cualquier medio adecuado para el cultivo de celulas que puedan expresar una protelna de interes, incluyendo, pero no se limitan a, un medio exento de componentes animales, tal como medio EX-CELL® TiterHigh (SAFC) y un medio definido qulmicamente, tal como medio CD CHO (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) y CD OptiCHO (Invitrogen, Carlsbad, Calif.))

Adicionalmente, el medio de cultivo celular puede complementarse opcionalmente para que incluya uno o mas componentes adicionales en las concentraciones o cantidades apropiadas, segun sea necesario o se desee, y como conoceran y llevaran a la practica los expertos habituales en la materia. Algunos ejemplos de complementos incluyen, pero no se limitan a, agentes qulmicos de seleccion genica, hormonas y otros factores de crecimiento, (por ejemplo, insulina, transferrina, factor de crecimiento epidermico, suero, somatotropina, extracto de pituitaria, aprotinina); sales (por ejemplo, calcio, magnesio y fosfato) y tampones (por ejemplo, HEPES (acido 4-[2-hidroxetil]-1- piperazinetansulfonico)); nucleosidos y bases (por ejemplo, adenosina, timidina, hipoxantina); protelna e hidrolizados; antibioticos (por ejemplo, gentamicina); agentes protectores celulares (por ejemplo, un poliol Pluronic (PLURONIC® F68)) y protelnas de la matriz extracelular (por ejemplo, fibronectina). Los complementos que ayudan al crecimiento y mantenimiento de algunos cultivos celulares en particular son susceptibles de ser facilmente determinados por los expertos habituales en la materia, tal como se describe, por ejemplo, en Barnes et al. (Cell, 22: 649 (1980)); en Mammalian Cell Culture, Mather, J. P., ed., Plenum Press, NY (1984); y en la Patente de EE.UU. n° 5.721.121.

Segun se usa en el presente documento, el termino "biorreactor" se refiere a cualquier aparato, contenedor o recipiente cerrado (por ejemplo, una camara de fermentacion) que se usa para el crecimiento de los cultivos celulares. Los biorreactores permiten el control de varios parametros durante el proceso de cultivo celular, que incluyen, pero no se limitan a, el flujo del bucle de circulacion, el pH, la temperatura, la sobrepresion y/o la velocidad de perfusion del medio. Algunos biorreactores incluyen biorreactores disponibles comercialmente, fermentadores clasicos y sistemas de cultivos celulares en perfusion, as! como biorreactores desechables.

El biorreactor puede tener cualquier tamano que sea util para el cultivo de celulas a una escala deseable segun un metodo de la invencion. Por ejemplo, un biorreactor empleado en los metodos de la presente invencion puede tener un volumen de al menos 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105,

110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220,

225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 340,

350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 550, 1.000, 1.500, 2.000, 2.500,

3.000, 3.500, 4.000, 4.500, 5.000, 5.500, 6.000, 6.500, 7.000, 7.500, 8.000, 8.500, 9.000, 9.500, 10.000, 10.500,

11.000, 11.500, 12.0000, 13.000, 14.000, 15.000 litros o mas, o cualquier volumen intermedio.

Los metodos de la presente invencion pueden emplear uno o mas biorreactores. Por ejemplo, en una realizacion, el cultivo celular en perfusion y el cultivo celular semicontinuo pueden llevarse a cabo en el mismo biorreactor. En otra realizacion, el cultivo celular en perfusion puede llevarse a cabo en biorreactores independientes. En otra realizacion, las celulas del cultivo celular en perfusion pueden ser transferidas a multiples biorreactores semicontinuos.

Un biorreactor adecuado puede estar formado (es decir, construido con) cualquier material que sea adecuado para contener cultivos celulares en las condiciones de cultivo de la presente invencion y que sea favorable para el crecimiento y la viabilidad de las celulas. Por ejemplo, un biorreactor empleado en los metodos de la presente invencion puede estar hecho de vidrio, de plastico o de metal. Sin embargo, los materiales que comprenden el biorreactor no deben interferir en la expresion ni en la estabilidad del producto de polipeptido. Los biorreactores adecuados son conocidos en la materia y estan disponibles comercialmente.

Un biorreactor de perfusion usado en los metodos de la presente invencion puede ser un biorreactor de perfusion desechable o cualquier otro biorreactor de perfusion tradicional. El biorreactor puede estar opcionalmente equipado con cualquier dispositivo de retencion celular interno o externo que incluye, pero no se limita a, filtros rotatorios, filtros de membrana de flujo tangencial, membranas dinamicas, separadores ultrasonicos, sedimentadores por

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gravedad, un dispositivo centrlfugo continuo o de retencion acustica de celulas, dispositivos de microfiltracion, dispositivos de ultrafiltracion, etc. En una realizacion en particular, el biorreactor es un biorreactor desechable equipado con una membrana de microfiltracion que tiene un tamano de poro de entre 1,2 y 10 pm.

Segun se usa en el presente documento, el termino "antiespumante" se refiere a un agente que puede ser anadido a un cultivo celular para impedir la formacion de un exceso de espuma. Algunos ejemplos de agentes antiespumantes incluyen, pero no se limitan a, simeticona al 3 % elaborada por Invitrogen and HyClone. Los antiespumantes estan disponibles en el mercado y pueden usarse a la discrecion del experto habitual en la materia.

Los cultivos celulares englobados por los metodos de la presente invencion pueden cultivarse a cualquier temperatura apropiada para el tipo celular y las condiciones de cultivo. En una realizacion, es deseable el uso de una temperatura de entre aproximadamente 30 °C y 38 °C, para mejorar la produccion de protelna. En otra realizacion, la temperatura es de al menos aproximadamente 25 °C, 26 °C, 27 °, 28 °C, 29 °C, 30 °C, 31 °C, 32 °C, 33 °C, 34 °C, 35 °C, 36 °C, 37 °C, 38 °C, 39 °C, 40 °C o 41 °C. Tambien puede ser deseable usar diferentes temperaturas en diferentes momentos durante el cultivo.

A. Cultivo celular

Segun se usa en el presente documento, el termino "celula", se refiere a celulas animales, a celulas de mamlfero, a cultivos de celulas, a celulas hospedadoras, a celulas recombinantes y a celulas hospedadoras recombinantes. Dichas celulas son generalmente llneas celulares obtenidas o derivadas de tejidos de mamlfero que son capaces de crecer y de sobrevivir cuando se colocan en un medio que contiene los nutrientes y/o los factores de crecimiento apropiados. Las celulas utilizadas en los metodos de la presente invencion son generalmente celulas animales o de mamlfero que pueden expresar y secretar, o que pueden ser modificadas molecularmente para que expresen y secreten, grandes cantidades de una protelna en particular en el medio de cultivo. En una realizacion, la protelna producida por la celula puede ser endogena u homologa de la celula. Alternativamente, la protelna es heterologa, es decir, foranea, a la celula.

Cualquier celula que sea capaz de expresar la protelna de interes puede ser cultivada segun los metodos de la presente invencion. Hay disponibles numerosas llneas celulares en fuentes comerciales, que incluyen, pero no se limitan a, la Coleccion americana de cultivos tipo (ATCC). En una realizacion de la invencion, el cultivo celular emplea celulas de hibridoma. La construccion de celulas de hibridoma productoras de anticuerpos es bien conocida en la materia. En otra realizacion de la invencion, el cultivo celular emplea celulas CHO.

Algunas celulas representativas que pueden usarse en los metodos de la presente invencion incluyen, pero no se limitan a, celulas de ovario de hamster chino (CHO), NSO, Per C6, HEK, cOs, VERO076, BRL-3A, HepG2, MRC 5, 293T, A431,3T3, CV-I, C3H10T1/2, Colo205, 293, celulas L, HL-60, FRhL-2, U937, HaK, celulas Jurkat, Rat2, BaF3, 32D, FDCP-1, PC12, Mix, mielomas murinos (por ejemplo, SP2/0 y NSO) y celulas C2C12, DG44 (Chasin et al., Som. Cell Molec. Genet., 12: 555-556 (1986); y Kolkekar et al., Biochemistry, 36: 10901-10909 (1997)), la llnea celular CHO-K1 Tet-On (Clontech), las CHO denominadas ECACC 85050302 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, Reino Unido), el clon CHO 13 (GEIMG, Genova, IT), el clon CHO B (GEIMG, Genova, IT), las CHO-K1/SF denominadas ECACC 93061607 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, Reino Unido), las RR-CHOK1 denominadas ECACC 92052129 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, Reino Unido), celulas CHO negativas para la reductasa de dihidrofolato (CHO/-DHFR, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 77: 4216 (1980)) y celulas dp12.CHO (Patente de EE.UU. n° 5.721.121); celulas de rinon de mono CV1 transformadas con SV40 (celulas COS, CoS-7, ATCC® CRL-1651); celulas de rinon embrionario humano (por ejemplo, celulas 293 o celulas 293 subclonadas para su cultivo en un cultivo en suspension, Graham et al., J. Gen. Virol., 36: 59 (1977)); celulas de rinon de cachorro de hamster (BHK, ATCC® CcL-10); celulas de rinon de mono (CV1, ATCC® CcL-70); celulas de rinon de mono verde africano (VERO-76, ATCC® CRL-1587; VERO, ATCC® CCL-81); celulas de sertoli de raton (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251 (1980)); celulas de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC® CCL-2); celulas de rinon canino (MDCK, ATCC® CCL-34); celulas de pulmon humano (W138, AtCc® CCL-75); celulas de hepatoma humano (HEP-G2, HB 8065); celulas de tumor de mama de raton (MMT 060562, ATCC® CCL-51); celulas de hlgado de rata bufalo (BRL 3A, ATCC® CRL-1442); celulas TRI (Mather, Annals NY Acad. Sci., 383: 44-68 (1982)); celulas MCR 5; celulas FS4, as! como llneas celulares de primate transformadas, hibridomas, celulas diploides normales y cepas de celulas derivadas de cultivos in vitro de tejido primario y de explantes primarios.

Las celulas adecuadas para su cultivo en los metodos de la presente invencion pueden contener introducidos (por ejemplo, a traves de una transformacion, de una transfeccion, de una infeccion o de una inyeccion) vectores de expresion (construcciones), tales como plasmidos y similares, que portan secuencias codificantes (o porciones de las mismas), que codifican una protelna deseada. Dichos vectores de expresion contienen los elementos necesarios para la transcripcion y la traduccion de la secuencia codificante insertada, y generalmente incluyen, pero no se limitan a, uno o mas de los siguientes: una secuencia de senalizacion, uno o mas genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminacion de la transcripcion.

Los metodos y las tecnicas para la construccion de vectores de expresion que contienen secuencias que codifican las protelnas producidas, as! como los elementos apropiados de control de la transcripcion y de la traduccion, son

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bien conocidos en la materia. Dichos metodos incluyen tecnicas de ADN recombinante in vitro, tecnicas sinteticas y de recombinacion genetica in vivo (vease, por ejemplo, Sambrook J. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y. (1989) y Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York, N.Y. (1989)).

Las construcciones de expresion pueden ser introducidas en las celulas a traves de una gran diversidad de metodos rutinarios de transferencia genica conocidos en la materia. Por ejemplo, dichos metodos pueden incluir, pero no se limitan a, los metodos convencionales de transfeccion genica, tales como una coprecipitacion con fosfato de calcio, una transfeccion liposomal, una microinyeccion, una electroporacion y una infeccion o una transduccion vlrica (vease, por ejemplo, la Patente de EE.UU. n° 4.399.216, Keown et al., Methods in Enzymology (1989), Keown et al., Methods in Enzymology, 185: 527-537 (1990) y Mansour et al., Nature, 336: 348-352 (1988).

Cualquiera de los diversos vectores de expresion conocidos puede ser adecuado para las celulas hospedadoras eucariotas cultivadas segun los metodos de la invention, incluyendo, pero no se limitan a, vectores para celulas hospedadoras de mamlfero (por ejemplo, BPV-1, pHyg, pRSV, pSV2, pTK2 (Maniatis); pIRES (Clontech); pRc/CMV2, pRc/RSV, pSFV1 (Life Technologies); vectores pVPakc, vectores pCMV, vectores pSG5 (Stratagene), vectores retrovlricos (por ejemplo, vectores pFB (Stratagene)), pcDNA-3 (Invitrogen), vectores adenovlricos; vectores vlricos adenoasociados, vectores de baculovirus, vectores de levadura (por ejemplo, vectores pESC (Stratagene)) o formas modificadas de cualquiera de los anteriores. Los vectores tambien pueden contener secuencias potenciadoras secuencia arriba o secuencia abajo de las secuencias de la region promotora, para la optimization de la expresion genica.

Los elementos de control (por ejemplo, las secuencias reguladoras) son aquellas regiones no traducidas del vector, por ejemplo, potenciadores, promotores y regiones no traducidas en 5' y en 3', que interactuan con las protelnas celulares del hospedador para llevar a cabo la transcription y la traduction. Dichos elementos varlan en su potencia y especificidad. Dependiendo del sistema de vector y de la celula hospedadora en particular, puede usarse cualquiera de los diversos elementos de transcripcion y de traduccion adecuados, incluyendo promotores constitutivos e inducibles. En los sistemas de celulas de mamlfero se prefieren los promotores de genes de mamlfero o de virus de mamlfero. Las construcciones para su uso en los sistemas de expresion de protelnas estan disenadas para contener al menos un promotor, una secuencia potenciadora (opcional, para los sistemas de expresion de mamlfero) y otras secuencias segun sea necesario o se requiera para una apropiada transcripcion y regulation de la expresion genica (por ejemplo, secuencias de inicio y de termination de la transcripcion, sitios de origen de replication, secuencias de poliadenilacion). La selection del vector apropiado para una apropiada transcripcion, expresion y aislamiento de las protelnas producidas en sistemas de expresion eucariotas (por ejemplo, de mamlfero) es conocida y esta en la pericia habitual de la materia.

Las secuencias de control eucariotas usadas habitualmente para su uso en vectores de expresion de mamlfero incluyen secuencias promotoras y de control compatibles con las celulas de mamlfero, tales como, por ejemplo, el promotor del citomegalovirus (CMV) (vector CDM8) y el virus del sarcoma aviar (ASV). Otros promotores usados habitualmente incluyen los promotores tempranos y tardlos del virus de simio 40 (SV40) (Fiers et al., Nature, 273: 113 (1973)) u otros promotores vlricos tales como los obtenidos a partir de polioma, Adenovirus 2 y el virus del papiloma bovino. Tambien puede usarse un promotor inducible, tal como hMTII (Karin et al., Nature, 299: 797-802 (1982)).

B. Production de protelnas

Segun se usa en el presente documento, los terminos "polipeptido", "producto polipeptldico", "protelna" y "producto proteico" se usan de forma intercambiable y, como se sabe en la materia, se refieren a una molecula que consiste en dos o mas aminoacidos, por ejemplo, al menos una cadena de aminoacidos unida a traves de enlaces peptldicos secuenciales. En una realization, una "protelna de interes" o un "polipeptido de interes" es una protelna codificada por una molecula de acido nucleico exogena que ha sido transformada en una celula hospedadora, en la que el ADN exogeno determina la secuencia de aminoacidos. En otra realizacion, una "protelna de interes" es una protelna codificada por una molecula de acido nucleico que es endogena a la celula hospedadora.

Pueden producirse numerosos polipeptidos mediante los metodos de la presente invencion. Algunos ejemplos de polipeptidos incluyen productos carnicos, protelnas naturales, homologos, ortologos, paralogos, fragmentos y otros equivalentes, variantes y analogos de los anteriores. Los polipeptidos tambien pueden incluir una o mas modificaciones, tales como, por ejemplo, una fraction lipldica, un fosfato, una fraction de azucar, etc. Algunos polipeptidos en particular que pueden ser deseables para su expresion en un metodo de la invencion incluyen, pero no se limitan a, citocinas, receptores de citocinas, factores de crecimiento (por ejemplo, factor de crecimiento epidermico (EGF), receptor del factor de crecimiento epidermico humano 2 (HER-2), factor de crecimiento de fibroblastos alfa (FGF-a.), factor de crecimiento de fibroblastos beta (FGF-p), factor de crecimiento transformante alfa (TGF-a), factor de crecimiento transformante beta (TGF-p), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento insulinoide 1 (IGF-1), factor de crecimiento insulinoide 2 (IGF-2), factor de crecimiento nervioso (NGF), factor de crecimiento nervioso beta (NGF-p)); receptores de factores de crecimiento, incluyendo protelnas de fusion o quimericas, hormonas de crecimiento (por ejemplo, hormona de crecimiento humana, hormona de

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crecimiento bovina); insulina (por ejemplo, cadena A de la insulina y cadena B de la insulina), proinsulina; eritropoyetina (EPO); factores estimulantes de colonias (por ejemplo, factor estimulante de las colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de las colonias de granulocitos y macrofagos (GM-CSF), factor estimulante de las colonias de macrofagos (M-CSF)); interleucinas (por ejemplo, desde la IL-1 hasta la IL-12); factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y su receptor (VEGF-R); interferones (por ejemplo, IFN-a, p, o g) y sus receptores; factor de necrosis tumoral (por ejemplo, TNF-a y TNF-p) y sus receptores, TNFR-1 y TNFR-2; trombopoyetina (TPO); trombina; peptido natriuretico cerebral (BNP); factores de coagulacion (por ejemplo, Factor VIII, Factor IX, factor de von Willebrand, y similares); factores anticoagulantes; activador tisular del plasminogeno (TPA), por ejemplo, urocinasa o TPA de orina humana o de tipo tisular; hormona foliculoestimulante (FSH); hormona luteinizante (Lh); calcitonina; protelnas CD (por ejemplo, CD3, CD4, CD8, CD28, CD19, etc.); protelnas CTLA (por ejemplo, CTLA4); protelnas del receptor de los linfocitos T y de los linfocitos B; protelnas morfogeneticas oseas (BmP, por ejemplo, BMP-1, BMP-2, BMP-3, etc.); factores neurotroficos, por ejemplo, factor neurotrofico oseo (BDNF); neurotrofinas, por ejemplo, 3-6; renina; factor reumatoide; RANTES (expresada y secretada por el linfocito T normal en funcion de su grado de activacion); albumina; relaxina; cadena A de la relaxina; cadena B de la relaxina; prorrelaxina; protelna inhibidora de los macrofagos (por ejemplo, MIP-1, MIP-2); protelnas o antlgenos vlricos; protelnas de la superficie de la membrana; protelnas de canales ionicos; enzimas; protelnas reguladoras; anticuerpos; protelnas inmunomoduladoras, (por ejemplo, HLA, MHC, la familia B7); receptores de migracion dirigida; protelnas de transporte; dismutasa de superoxido (SOD); protelnas de receptores acoplados a protelnas G (GPCR); protelnas neuromoduladoras; protelnas y peptidos relacionados con la enfermedad de Alzheimer, (por ejemplo, A-p), hormona paratiroidea; hormona estimulante del tiroides; lipoprotelnas; glucagon; factor natriuretico atrial; tensioactivo pulmonar; bombesina; factor de crecimiento hemopoyetico; encefalinasa; una albumina serica (por ejemplo, albumina serica humana); hormona antimulleriana; peptido asociado a las gonadotrofinas; DNasa; inhibina; activina; receptores de hormonas o de factores de crecimiento; integrina; protelna A o D; protelnas CD tales como CD-3, CD-4, Cd-8, y CD-19; PD-1 y PD-L1 (B7-H1 y ligando); y B7-H4, factores osteoinductores; inmunotoxinas; factor acelerador de la desintegracion; y otros, como se sabe en la materia, protelnas y polipeptidos de fusion, protelnas y polipeptidos quimericos y fragmentos o porciones, o mutantes, variantes o analogos de cualquiera de las protelnas y de los polipeptidos mencionados anteriormente.

En algunas formas de realizacion adicionales, pueden usarse los metodos de la presente invencion para la produccion de inmunoglobulinas (por ejemplo, anticuerpos), de moleculas que contienen un dominio de tipo inmunoglobulina (por ejemplo, moleculas que contienen un dominio de ancirina o fibronectina) y protelnas de fusion Fc. Se entiende que el termino "protelna de fusion Fc", segun se usa en el presente documento, engloba protelnas terapeuticas que comprenden una fraccion derivada de una inmunoglobulina (es decir, una fraccion Fc) y una fraccion derivada de una segunda protelna que no es una inmunoglobulina.

En una realizacion en particular de la invencion, el polipeptido producido mediante los metodos de la presente invencion es un anticuerpo. El termino "anticuerpo" se usa en el sentido mas amplio para cubrir cualquier tipo de anticuerpo conocido, incluyendo, pero no se limita a, anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos monoespeclficos, anticuerpos multiespeclficos (por ejemplo, anticuerpos biespeclficos), inmunoadhesinas, quimeras de anticuerpo- inmunoadhesina, anticuerpos humanizados, humanos, quimericos, de cadena unica, sinteticos, recombinantes, hlbridos, mutados, injertados o generados in vitro. El anticuerpo puede ser un anticuerpo de longitud completa o un fragmento de un anticuerpo. El anticuerpo puede seleccionarse entre cualquiera de los isotipos de anticuerpos conocidos, por ejemplo, IgA, IgG, IgD, IgE, IgM. El anticuerpo puede ser un monomero, un dlmero o un multlmero (por ejemplo, un trlmero o un pentamero).

El termino "anticuerpo" o "inmunoglobulina," segun se usan de forma intercambiable en el presente documento, incluye anticuerpos completos y cualquier fragmento de union al antlgeno (es decir, "porcion de union al antlgeno") o cadenas individuales de los mismos. Un "anticuerpo" comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras cadenas (L) interconectadas por puentes de disulfuro. Cada cadena pesada esta formada por una region variable de la cadena pesada (abreviada en el presente documento como Vh) y una region constante de la cadena pesada. La region constante de la cadena pesada esta formada por tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera esta formada por una region variable de la cadena ligera (abreviada en el presente documento como VL) y una region constante de la cadena ligera. La region constante de la cadena ligera esta formada por un dominio, CL. Las regiones Vh y Vl pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que estan mas conservadas, denominadas regiones en marco (FR). Cada Vh y Vl esta formada por tres CDR y cuatro FR, y dispuestas desde el amino terminal hacia el carboxi terminal en el siguiente orden: FR1, CDR1, fR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de union que interactua con un antlgeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar en la union de la inmunoglobulina con los tejidos o los factores del hospedador, incluyendo varias celulas del sistema inmunitario (por ejemplo, celulas efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema complemento clasico.

El termino "porcion de union al antlgeno" de un anticuerpo (o simplemente "porcion de anticuerpo"), segun se usa en el presente documento, se refiere a uno o mas fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad de unirse especlficamente a un antlgeno. Se ha demostrado que la funcion de union al antlgeno de un anticuerpo puede ser

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llevada a cabo por fragmentos de un anticuerpo completo. Algunos ejemplos de fragmentos de union englobados en el termino "porcion de union al antlgeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios Vl, Vh, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente de disulfuro en la region de bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios Vh y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios Vl y Vh de un unico brazo de un anticuerpo, (v) un dAb que incluye los dominios VH y Vl; (vi) un fragmento dAb (Ward et al., Nature, 341: 544-546 (1989)), que consiste en un dominio Vh; (vii) un dAb que consiste en un dominio VH o VL; y (viii) una region determinante de la complementariedad aislada (CDR) o (ix) una combinacion de dos o mas CDR aisladas que pueden estar opcionalmente unidas por un conector sintetico. Adicionalmente, aunque los dos dominios del fragmento Fv, Vl y Vh, estan codificados por genes distintos, pueden ser unidos mediante el uso de metodos recombinantes con un conector sintetico que les permite ser creados en forma de una cadena proteica unica en la que las regiones Vl y Vh se emparejan para formar moleculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena unica (scFv); vease, por ejemplo, Bird et al., Science, 242: 423-426 (1988); y Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 85: 5879-5883 (1988)). Dichos anticuerpos de cadena unica tambien pretenden estar englobados en el termino "porcion de union al antlgeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpos se obtienen usando tecnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia y los fragmentos son cribados para evaluar su utilidad de la misma forma que los anticuerpos intactos. Las porciones de union al antlgeno pueden ser producidas mediante tecnicas de ADN recombinante o mediante una escision enzimatica o qulmica de inmunoglobulinas intactas.

El termino "anticuerpo monoclonal", segun se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una poblacion de anticuerpos sustancialmente homogenea, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la poblacion son identicos excepto por posibles mutaciones naturales que pueda haber presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son muy especlficos, estando dirigidos contra un unico sitio antigenico. Adicionalmente, al contrario que las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales), que normalmente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epltopos), cada anticuerpo monoclonal esta dirigido contra un unico determinante del antlgeno. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden producirse usando la tecnologla convencional de hibridoma descrita en primer lugar por Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975), o pueden ser elaborados usando metodos de ADN recombinante (vease, por ejemplo, la Patente de EE.UU. n° 4.816.567). Los anticuerpos monoclonales tambien pueden ser aislados a partir de colecciones de anticuerpos de fagos, por ejemplo, usando las tecnicas descritas en Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); en Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991); y en las Patentes de EE.UU. n°. 5.223.409; 5.403.484; 5.571.698; 5.427.908 5.580.717; 5.969.108; 6.172.197; 5.885.793; 6.521.404; 6.544.731; 6.555.313; 6.582.915; y 6.593.081.

Un anticuerpo "biespeclfico" o "bifuncional" es un anticuerpo hlbrido artificial que tiene dos pares de cadenas pesada/ligera diferentes y dos sitios de union diferentes. Los anticuerpos biespeclficos pueden ser producidos mediante diversos metodos que incluyen la fusion de hibridomas por la union de fragmentos Fab'. Vease, por ejemplo, Songsivilai et al., Clin. Exp. Immunol., 79: 315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol., 148: 1547-1553 (1992).

Un "anticuerpo aislado”, segun se usa en el presente documento, pretende referirse a un anticuerpo que esta sustancialmente exento de otros anticuerpos que tienen unas especificidades antigenicas diferentes. Ademas, un anticuerpo aislado normalmente esta sustancialmente exento de otro material celular y/o de sustancias qulmicas. En una realizacion de la invencion, se combinan en una composicion bien definida multiples anticuerpos monoclonales "aislados" que tienen unas especificidades de union diferentes.

Segun se usa en el presente documento, "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpo (por ejemplo, IgM o IgG1) que es codificado por los genes de la region constante de la cadena pesada. En una realizacion, un anticuerpo o una porcion de union al antlgeno del mismo es de un isotipo seleccionado entre los isotipos de anticuerpo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD o IgE.

Los anticuerpos monoclonales descritos en el presente documento incluyen anticuerpos "quimericos" y "humanizados" en los que una porcion de la cadena pesada y/o ligera es identica u homologa de las correspondientes secuencias de los anticuerpos derivados de una especie en particular o perteneciente a una clase o subclase de anticuerpos en particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es identico u homologo de las correspondientes secuencias de los anticuerpos derivados de otra especie o perteneciente a otra clase o subclase de anticuerpo, as! como los fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que muestren la actividad biologica deseada (Patente de EE.UU. n° 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 81: 6851-6855 (1984)). Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quimericos que contienen una secuencia minima derivada de una inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo del receptor) en las que los residuos de la region hipervariable del receptor estan sustituidos por residuos de la region hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como raton, rata, conejo o un primate no humano, que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la region en marco Fv (FR) de la inmunoglobulina humana son sustituidos por los correspondientes residuos no humanos. Adicionalmente, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo del receptor o en el anticuerpo del donante. Estas modificaciones se realizan para refinar adicionalmente el comportamiento del anticuerpo. En general, el

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anticuerpo humanizado comprendera sustancialmente todos de al menos uno y normalmente dos, dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables se corresponden con los de una inmunoglobulina no humana, y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia de una inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado tambien comprendera opcionalmente al menos una porcion de una region constante de una inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, vease Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992). Los anticuerpos quimericos o humanizados pueden prepararse basandose en la secuencia de un anticuerpo monoclonal murino preparado como se ha descrito anteriormente. El ADN que codifica las cadenas pesada y ligera de las inmunoglobulinas puede ser obtenido a partir del hibridoma murino de interes y modificado para que contenga secuencias de inmunoglobulinas no murinas (por ejemplo, humanas) usando las tecnicas de biologla molecular habituales. Por ejemplo, para crear un anticuerpo quimerico pueden unirse las regiones variables murinas a las regiones constantes humanas usando los metodos conocidos en la materia (vease, por ejemplo, la Patente de EE.UU. n° 4.816.567 a favor de Cabilly et al.). Para crear un anticuerpo humanizado pueden insertarse las regiones CDR murinas en un marco humano usando metodos conocidos en la materia (vease, por ejemplo, la Patente de EE.UU. n° 5.225.539 a favor de Winter y las Patentes de EE.UU. n° 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 y 6.180.370 a favor de Queen et al.).

Los anticuerpos monoclonales descritos en el presente documento tambien incluyen anticuerpos "humanos", que pueden ser aislados a partir de diversas fuentes que incluyen, por ejemplo, a partir de la sangre de un paciente humano, o prepararse recombinantemente usando animales transgenicos. Algunos ejemplos de dichos animales transgenicos incluyen KM-MOUSE® (Medarex, Inc., Princeton, NJ) que tiene un transgen de una cadena pesada humana y un transcromosoma de una cadena ligera humana (vease el documento WO 02/43478), XENOMOUSE® (Abgenix, Inc., Fremont CA; descrito, por ejemplo, en las Patentes de EE.UU. n° 5.939.598; 6.075.181; 6.114.598; 6. 150.584 y 6.162.963 a favor de Kucherlapati et al.) y HUMAB-MOUSE® (Medarex, Inc.; descrito, por ejemplo, en Taylor, L. et al., Nucleic Acids Research, 20: 6287-6295 (1992); Chen, J. et al., International Immunology, 5: 647-656 (1993); Tuaillon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 90: 3720-3724 (1993); Choi et al., Nature Genetics, 4: 117-123 (1993); Chen, J. et al., EMBO J., 12: 821-830 (1993); Tuaillon et al., J. Immunol., 152: 2912-2920 (1994); Taylor, L. et al., International Immunology, 6: 579-591 (1994); y Fishwild, D. et al., Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996); las Patentes de EE.UU. n° 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.789.650; 5.877.397; 5.661.016; 5.814.318; 5.874.299; y 5.770.429; 5.545.807; y las Publicaciones PCT n° WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, Wo 98/24884 y WO 99/45962, WO 01/14424 a favor de Korman et al.). Los anticuerpos monoclonales humanos de la invencion tambien pueden prepararse usando ratones SCID en los que se han reconstituido celulas inmunitarias humanas de forma que pueda generarse la respuesta de un anticuerpo humano tras una inmunizacion. Dichos ratones se describen, por ejemplo, en las Patentes de EE.UU. n° 5.476.996 y 5.698.767 a favor de Wilson et al.

Otro ejemplo del tipo de protelna que puede producirse usando los metodos de la presente invencion es una protelna de fusion. Una protelna de fusion es una protelna, o un dominio de una protelna (por ejemplo, un dominio extracelular soluble) fusionado con una protelna o un peptido heterologo. Algunas protelnas de fusion representativas incluyen, pero no se limitan a, las protelnas expresadas en forma de una fusion con una porcion de una molecula de una inmunoglobulina, las protelnas expresadas en forma de protelnas de fusion con una fraccion de cremallera y nuevas protelnas polifuncionales, tales como una protelna de fusion de una citocina y un factor de crecimiento. El documento WO 93/08207 y el documento WO 96/40918 describen la preparacion de varias formas oligomericas solubles de una molecula denominada CD40L, que incluye una protelna de fusion de inmunoglobulina y una protelna de fusion de cremallera, respectivamente. Las tecnicas descritas en el documento WO 93/08207 y en el documento WO 96/40918 son aplicables a otras protelnas. Hablando de forma general, cualquier molecula puede ser expresada en una protelna de fusion, incluyendo, pero no se limita a, el dominio extracelular de una molecula de un receptor celular, una enzima, una hormona, una citocina, una porcion de una molecula de inmunoglobulina, un dominio de cremallera y un epltopo.

C. Clarificacion y purificacion del cultivo celular

La presente memoria descriptiva desvela metodos mejorados para la clarificacion de un cultivo celular, por ejemplo, de forma que se facilite la recoleccion de la protelna expresada. Especlficamente, la presente memoria descriptiva desvela un metodo para la clarificacion de una protelna a partir de un cultivo celular ajustando el pH del cultivo celular hasta por debajo de un pH neutro (es decir, por debajo de un pH de 7) y sedimentando el cultivo celular, de forma que el cultivo celular se separe de la capa de sobrenadante y de la capa de lecho de celulas, en la que la protelna esta presente y puede ser aislada a partir de la capa de sobrenadante. Los metodos divulgados en la presente memoria descriptiva pueden comprender etapas para mejorar el proceso de clarificacion. Por ejemplo, despues del aislamiento de la protelna a partir de la capa de sobrenadante, los metodos pueden comprender adicionalmente el lavado del lecho de celulas con el mismo tampon de pH, una sedimentacion adicional y una filtracion adicional de forma que pueda obtenerse un mayor rendimiento de protelna a partir del cultivo celular. Los metodos de clarificacion descritos en el presente documento pueden usarse junto con el metodo de cultivo celular descrito anteriormente o con cualquier otro metodo de cultivo celular.

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Segun se usa en el presente documento, el termino "capa de sobrenadante del cultivo celular" se refiere a la fraccion llquida del cultivo celular, que incluye la fase llquida del lecho de celulas.

Segun se usa en el presente documento, el termino "capa de lecho de celulas" se refiere a la capa de biomasa del cultivo celular.

Segun se usa en el presente documento, el termino "sedimentacion" se refiere al proceso para permitir que el cultivo celular repose sin alteraciones durante un periodo de tiempo, de forma que se facilite la separacion del sobrenadante del lecho de celulas. El cultivo celular puede sedimentar durante cualquier periodo de tiempo, que incluye, pero no se limita a, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63,

64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94,

95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118,

119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137,138, 139, 140, 141,

142, 143,144 y 145 minutos. En una realizacion, el cultivo celular puede sedimentar durante entre aproximadamente 30-120 minutos. En otra realizacion, el cultivo celular puede sedimentar durante entre aproximadamente 30-60, 6090 o 90-120 minutos.

Los cultivos celulares pueden ser clarificados usando los metodos descritos en el presente documento, tanto solos como junto con otras tecnicas conocidas de clarificacion y purification. Dichos procesos conocidos incluyen, pero no se limitan a, filtration, centrifugation, precipitation (por ejemplo, precipitation con etanol o precipitation con sulfato de amonio), separacion de fases, purificacion por afinidad, filtracion en gel, cromatografla de intercambio ionico, cromatografla de interacciones hidrofobas (HIC; usando resinas tales como fenil eter, butil eter o propil eter), HPLC, o fraccionamiento por inmunoafinidad o columnas de intercambio ionico, SDS-PAGE inversa, o cualquier combination de estas tecnicas. Tambien puede ser util un inhibidor de la proteasa tal como fluoruro de fenil metil sulfonilo (PMSF), para inhibir la degradation proteolltica durante la clarificacion.

El experto en la materia apreciara que los metodos de clarificacion adecuados para la protelna de interes pueden requerir una modification para tener en cuenta los cambios en el caracter de la protelna tras la expresion en un cultivo celular recombinante. Adicionalmente, el grado de clarificacion deseado dependera de la protelna en particular y del uso previsto de la proteina. Las proteinas aisladas finalmente usando los metodos descritos en el presente documento pueden ser adecuadas para usos terapeuticos y diagnosticos.

Segun se usa en el presente documento, el termino "filtracion profunda" se refiere a un tipo de filtracion que se lleva a cabo usando un filtro de profundidad. Un filtro de profundidad tiene habitualmente multiples capas de medio de filtracion, cada una con un tamano y una densidad variables, que se hacen progresivamente mas finas y densas en la capa inferior. Un filtro de profundidad atrapa particulas en su estructura, no solo en la superficie.

Segun se usa en el presente documento, el termino "filtracion de pulido" se refiere a un grado maximo de filtracion profunda y de filtracion con membrana.

La presente invention esta ilustrada adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, que no deberian ser interpretados como adicionalmente limitantes.

Ejemplos

Ejemplo 1: proceso de cultivo celular semicontinuo con super densidad

A. Metodos experimentales

Se expandieron celulas CHO recombinantes (es decir, celulas CHOK1SV productoras de anticuerpos) en matraces de cultivo celular antes de la inoculation del biorreactor de perfusion Wave. El biorreactor de perfusion se utilizo con el mismo medio basal que se usa en el proceso de expansion celular. La velocidad de perfusion se ajusto para mantener un cultivo sano con unas elevadas viabilidades celulares. En algunos experimentos, las celulas se concentraron hasta una densidad de celulas mayor, segun fuera apropiado, mediante el ajuste del medio en los caudales de entrada y salida. Una vez alcanzada la densidad de celulas viables mayor de 50 x 106 celulas/ml, se inicio el proceso de production semicontinuo. Al cultivo se le suministro una combinacion de modos de suministro en bolo y continuo, de forma que se controlara la osmolalidad y el nivel de glucosa. Despues el cultivo celular se recogio cuando la viabilidad celular disminuyo hasta aproximadamente un 60-10 %.

B. Experimento 1

Las celulas fueron inoculadas en un BIOSTAT Cultibag (Sartorius) a aproximadamente 0,84 x 106 celulas/ml. La velocidad de perfusion especifica (SPR) variaba entre 0,25 y 0,03 x 10"6 ml celula-1 dia"1. Las celulas se concentraron aproximadamente 2,6 veces cuando se alcanzo una densidad de celulas viables de 12,6 x 106 celulas/ml. Despues de una concentration, las celulas se cultivaron hasta 108,8 x 106 celulas/ml. Una vez que las

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celulas alcanzaron 108,8 x 106 celulas/ml, se detuvo la perfusion y se inicio inmediatamente el proceso semicontinuo. Durante el proceso semicontinuo, se realizaron uno o dos suministros en bolo a entre el 3 y el 10 % (es decir, el porcentaje entre el suministro y el volumen posterior al suministro) cada dla para mantener la viabilidad celular. Tambien se complemento con un suministro de glucosa en bolo para mantener un nivel suficiente. La densidad de celulas alcanzo las 124,66 x 106 celulas/ml con una viabilidad del 98 % el segundo dla despues del inicio del proceso semicontinuo. El porcentaje de suministro total fue de aproximadamente el 40 %. Como se muestra en el perfil de crecimiento y produccion representado en la Figura 3, se consiguio una productividad final de 8,8 g/l en el proceso semicontinuo despues de 6 dlas, con una viabilidad del 39 %.

C. Experimento 2

Las celulas fueron inoculadas en el WAVE BIOREACTOR® (GE Healthcare, Fairfield, CT) a aproximadamente 0,81 x 106 celulas/ml. La velocidad de perfusion especlfica (SPR) variaba entre 0,07 y 0,01 x 10'6 ml celula'1 dla'1 y variaba en diferentes puntos temporales. Las celulas se concentraron aproximadamente 1,5 veces durante una noche entre los dlas 15 y 16. El dla 16, la densidad de celulas alcanzo hasta 136,5 x 106 celulas/ml. En este punto temporal, se detuvo el proceso de profusion y se inicio el proceso semicontinuo. Se llevaron a cabo uno o dos suministros en bolo a entre el 1 y el 6 % en los dos primeros dlas para mantener la viabilidad celular. El suministro continuo de glucosa y/o de otros nutrientes se inicio el primer dla del proceso semicontinuo para mantener el nivel de glucosa, as! como para favorecer una tendencia creciente a una osmolalidad favorable, mientras se proporcionaban suficientes nutrientes.

Las celulas crecieron hasta 142,0 x 106 celulas/ml aproximadamente 7 horas despues del inicio del proceso semicontinuo, y el porcentaje de suministro total fue de aproximadamente el 28 %. Como se muestra en el perfil de crecimiento y produccion representado en la Figura 4, se consiguio una productividad final de 13,8 g/l despues de 6 dlas con una viabilidad del 61 % a partir de la fase de produccion semicontinua.

Durante este experimento se aprecio con los componentes del suministro se calan desde la solucion en las tuberlas de la bomba durante el proceso de suministro continuo, posiblemente debido a un caudal lento. Como tal, en un estudio posterior se realizaron algunas modificaciones en los suministros (vease el Experimento # 5, a continuacion) para prevenir la precipitacion de los componentes del suministro en las tuberlas de la bomba.

D. Experimento 3

Las celulas fueron inoculadas en el WAVE BIOREACTOR® (GE Healthcare, Fairfield, CT) a aproximadamente 1,20 x 106 celulas/ml. La velocidad de perfusion especlfica (SPR) variaba entre 0,07 y 0,03 (por ejemplo, 0,05) x 10'6 ml celula'1 dla'1 y variaba en diferentes puntos temporales. Como se muestra en la Figura 5, las celulas fueron transferidas parcialmente el dla 13 y el dla 18 a dos biorreactores individuales con tanques de agitacion de 5 litros a una densidad de celulas de aproximadamente 50 x 106 celulas/ml. Tambien se anadio un antiespumante para evitar la espumacion en los biorreactores. Como se muestra en el perfil de crecimiento y produccion representado en la Figura 5, se consiguio una productividad final de 6,3 g/l a una viabilidad de aproximadamente el 40 % a partir de las celulas en semicontinuo transferidas el dla 13 (es decir, las 2391AB) (vease la Figura 6). Se consiguio una productividad final de 7,1 g/l a una viabilidad de aproximadamente el 38 % a partir de las celulas en semicontinuo transferidas el dla (es decir, las 2391BB) (vease la Figura 6).

E. Experimento 4

Se llevo a cabo un analisis de perfusion adicional para repetir el proceso de cultivo celular de los ejemplos anteriores en un unico biorreactor de perfusion (es decir, de forma que tanto la perfusion como el semicontinuo se produjeran en el mismo biorreactor). Mediante la optimizacion del proceso de perfusion (por ejemplo, la velocidad de perfusion especlfica (SPR)), la densidad de celulas alcanzo mas de 100 x 106 celulas/ml el dla 8. La SPR se mantuvo en un intervalo de entre aproximadamente 0,15 y 0,05, para mantener las celulas en un estado estable y sano. Esto dio lugar a un aumento de mas del 100 % en la velocidad de crecimiento de las celulas, en comparacion con los analisis de perfusion iniciales (Experimentos # 1 y 2). La densidad de celulas aumento en aproximadamente un 70 % por dla.

Una vez que la densidad de celulas alcanzo mas de 100 x 106 celulas/ml, se inicio inmediatamente el proceso semicontinuo y se detuvo la perfusion de medio. Cada dla se realizaron entre dos y tres suministros en bolo a entre el 2 y el 6 % durante tres dlas. El segundo dla despues del inicio del proceso semicontinuo, la densidad de celulas alcanzo las 119,5 x 106 celulas/ml y se consiguio una viabilidad del 98 %. Se llevo a cabo el suministro continuo de glucosa y/o de otros nutrientes a lo largo del proceso semicontinuo para mantener el nivel de glucosa y controlar la velocidad de aumento de la osmolalidad. El porcentaje en volumen del suministro total era de aproximadamente el 60 %.

La optimizacion de las concentraciones y de las proporciones en los componentes del suministro dio lugar a una solucion transparente en las tuberlas de las bombas durante el proceso de suministro continuo. No se observo ninguna precipitacion visible. Sin embargo, el volumen de suministro aumento significativamente en comparacion con el experimento #2, lo que dio como resultado una concentration del producto mas diluida. Como se muestra en

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la Figura 7, la productividad volumetrica final fue de 8,9 g/l.

F. Resumen de los Experimentos 1-4

La Figura 8 resume la productividad y la integral celular de los Experimentos # 1-3 (es decir, en los que el proceso semicontinuo comenzo con mas de 100 x 106 celulas/ml) y del Experimento # 4 (es decir, en el que el proceso semicontinuo comenzo con aproximadamente 50 x 106 celulas/ml). La productividad esta representada en terminos del tltulo final real observado, as! como del tltulo normalizado (por ejemplo, normalizado segun el volumen de partida y densidad de celulas en la perfusion final por 100 millones de celulas/ml). Por ejemplo, el tltulo normalizado puede calcularse como sigue:

tltulo normalizado = tltulo observado / (volumen de cultivo de partida x densidad de celulas en la perfusion final en

106 celulas/ml) x 100

G. Optimizacion de las condiciones de cultivo celular

Varios parametros experimentales pueden ser ajustados para optimizar las condiciones del cultivo celular. Por ejemplo, el medio basal puede ser optimizado concentrando los nutrientes, de forma que se reduzca potencialmente el volumen de perfusion. Alternativamente o adicionalmente, el componente tamponante del pH del medio basal puede ser optimizado para manejar unas condiciones de pH bajo, tlpicas de los biorreactores con tanque de agitacion tradicionales. Ademas, la composition del suministro y/o la estrategia del suministro pueden ser utilizadas para favorecer la productividad y la eficacia, manteniendo una buena solubilidad.

Ejemplo 2: clarificacion del proceso de cultivo celular semicontinuo con super densidad

Debido a las densidades celulares super altas producidas en los metodos de cultivo descritos anteriormente, el cultivo resultante tiene un elevado porcentaje de volumen de solidos en el lecho celular (por ejemplo, un 20 % de volumen del lecho celular para los cultivos cuando la densidad de celulas es mayor de 100 x 106 celulas/ml mediante una sedimentation natural o una centrifugation), y un sobrenadante muy turbio. Como tal, la recoleccion de la protelna puede ser un reto. Consecuentemente, se probaron varios metodos experimentales diferentes para mejorar la eficacia del proceso de recoleccion, es decir, sedimentacion de las celulas, coadyuvante de filtration, adicion de CaCl2, disminucion del pH hasta 5,5 antes de la sedimentacion de las celulas, as! como varias combinaciones de estas tecnicas.

Especlficamente, se probaron varias condiciones usando el analisis 121AB del Experimento #3 (descrito anteriormente). Como se muestra en la Figura 9, el pH se redujo hasta 4,5 o 5,5, con o sin la adicion de coadyuvante de filtracion, antes de la sedimentacion del cultivo celular durante 90 minutos. Todas las condiciones probadas redujeron significativamente la turbidez (representada en forma de barras en la Figura 9) despues de la sedimentacion de las celulas. En comparacion con el tltulo del biorreactor de control, un pH de 4,5 junto con un coadyuvante de filtracion dio lugar a una cierta perdida de producto mediante un ensayo de HPLC de la protelna A (representado como slmbolos de rombos en la Figura 9).

Adicionalmente, la disminucion en el pH o la adicion de sales de calcio y/o de un coadyuvante de filtracion antes de la sedimentacion, el volumen del lecho celular aumento hasta aproximadamente un 40-50 % y produjo un sobrenadante de celulas mucho mas claro. Este proceso de clarificacion mejorado tambien se probo con otras protelnas y se obtuvieron unos resultados similares. En resumen, una estrategia de sedimentacion a pH bajo aumento significativamente la capacidad de filtracion y tambien aumento la calidad del filtrado.

Pueden llevarse a cabo finalmente etapas adicionales, tales como un lavado del lecho con un producto tampon compatible o PBS diluido en las mismas condiciones de pH que las usadas para la sedimentacion de las celulas, una sedimentacion adicional y una filtracion adicional, para mejorar el proceso de clarificacion, como se muestra en la Figura 10. Sin embargo, debe apreciarse que la Figura 10 no pretende ser limitante y que las etapas opcionales adicionales (por ejemplo, filtracion, centrifugacion, lavado, etc.) pueden producirse en un orden diferente al representado en la Figura 10. Por ejemplo, la centrifugacion puede llevarse a cabo opcionalmente antes o despues del proceso de sedimentacion.

Claims (10)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo para aumentar la produccion de una protelna en un cultivo celular, que comprende:

   a) cultivar las celulas que producen la protelna en un cultivo celular en perfusion hasta una densidad de celulas de al menos aproximadamente por encima de 50 x 106 celulas/ml; y

   b) transferir las celulas a un cultivo celular semicontinuo, de forma que las celulas entren en una fase de produccion;

   en el que las celulas son celulas animales.
2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que las celulas se cultivan en el cultivo celular en perfusion hasta una densidad de celulas de entre aproximadamente 50 x 106 celulas/ml y 150 x 106 celulas/ml.
3. 3. El metodo de las reivindicaciones 1 o 2, en el que las celulas se cultivan en el cultivo celular en perfusion hasta una densidad de celulas de al menos por encima de aproximadamente 100 x 106 celulas/ml.
4. 4. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la protelna es un anticuerpo.
5. 5. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la protelna se selecciona entre el grupo que consiste en enzimas, receptores, protelnas de fusion, citocinas, factores reguladores, hormonas, agentes de union al antlgeno, protelnas terapeuticas y protelnas diagnosticas.
6. 6. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el cultivo celular en perfusion y el cultivo celular semicontinuo se realizan en un unico biorreactor.
7. 7. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que en el que el cultivo celular en perfusion y el cultivo celular semicontinuo se realizan en biorreactores diferentes.
8. 8. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y 7, en el que el cultivo celular semicontinuo se realiza en multiples biorreactores.
9. 9. El metodo de las reivindicaciones 7 u 8, que comprende adicionalmente la recoleccion de la protelna a partir del cultivo celular semicontinuo, y no del cultivo celular en perfusion.
10. 10. El metodo de la reivindicacion 6, que comprende adicionalmente la recoleccion de la protelna tanto a partir del cultivo en perfusion como del cultivo celular semicontinuo.