ES2642179T3 - Agente antitumoral y proceso para producir el mismo - Google Patents
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Description
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DESCRIPCION
Agente antitumoral y proceso para producir el mismo Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a un grupo de agentes antitumorales polimericos, que forman complejos de micelas de alto peso molecular, que tienen capacidad de marcaje como diana de tumores y retencion a largo plazo en el tumor, exhibiendo de esta manera tratamiento de cancer altamente eficaz con efectos secundarios ampliamente reducidos a los organos y tejidos normales.
De forma mas precisa, la presente invencion se refiere a agentes antitumorales polimericos de alto peso molecular, que forman complejos de micelas de alto peso molecular por union molecular o interaccion de agentes antitumorales de bajo peso molecular, tales como antraciclina o derivado de platino con copolfmero de estireno-acido maleico (en lo sucesivo en el presente documento denominado SMA, por sus siglas en ingles).
La presente invencion tambien se refiere al metodo para fabricar los mismos.
Antecedentes de la tecnologia
Desde el descubrimiento de la doxorubicina (adriamicina - Formula (1)) en 1969 por Di Marco y su colaborador (Cancer Chemotherapy Reports, Parte 1, 53, 33-41, 1969), la clase de los agentes antitumorales de antraciclina se expandio ampliamente. En 1979 se descubrio la pirarrubicina (THP-adriamicina-Formula (2)) por Umezawa et al durante una busqueda de nuevos antibioticos de antraciclina. Entre los compuestos 4'-O-sustituidos, la THP- adriamicina tiene menos toxicidad que otros agentes antitumorales de antraciclina (Gan To Kagaku Ryoho, 15, 281927, 1988).
Los antibioticos de antraciclinas se conocen por su potente efecto citotoxico que se sabe que implica multiples mecanismos de muerte celular. La generacion del radical oxfgeno por el grupo quinona en su molecula promueve su propiedad intercalante del ADN y los mecanismos inhibitorios de la topoisomerasa. Todos estos efectos dan lugar a potente muerte de las celulas cancengenas. La pirarrubicina, siendo relativamente un nuevo miembro de este grupo, tiene su accion unica inhibitoria de la smtesis de ADN y ARN, mas activa que la doxorrubicina, con cardiotoxicidad reducida.
Desafortunadamente el efecto citotoxico de estos agentes antitumorales de bajo peso molecular, tales como antraciclina o cis-platino, como muchos otros, carecen de especificidad por las celulas cancengenas lo que da lugar a graves efectos secundarios particularmente hacia las celulas rapidamente en division tales como las celulas de la medula osea y las celulas del tracto gastrointestinal. Ademas, afectan cronicamente a tejidos de division mas lenta o mas estables tales como los tejidos cardfaco y hepatico. Estos efectos secundarios son los principales factores que limitan la escala de dosis de tales farmacos potentes.
Para eliminar tales efectos secundarios de estos agentes antitumorales, la distribucion tisular del farmaco juega un papel crucial. Los presentes inventores descubrieron que el peso molecular de los farmacos es clave para la cuestion, es decir los farmacos de bajos pesos moleculares, por ejemplo, un tamano molecular menor de 10 kDa, se distribuyen rapidamente en diversos tejidos organicos normales o en tejidos tumorales indiscriminadamente a traves de difusion simple y se eliminan al final en la bilis por el tugado y/o en la orina a traves de la excrecion renal. En el caso de la doxorrubicina y la pirarrubicina con un peso molecular de 543,5 y 627,6, respectivamente, su distribucion en los organos normales, es decir los tejidos cardfaco o de la medula osea, limitan el uso eficaz a una dosis alta de estos farmacos de bajo peso molecular para la erradicacion tumoral completa.
Problemas a resolverse
Esta situacion de toxicidad y efectividad llega a ser un gran contraste entre los farmacos de alto peso molecular frente a los farmacos de bajo peso molecular. Es decir los farmacos macromoleculares de tamano por encima de 40 kDa, donde tales farmacos se acumulan y se mantienen mas en el tejido tumoral durante un largo tiempo debido al unico fenomeno del tejido tumoral, que descubrieron los presentes inventores hace algun tiempo: es decir efecto de permeabilidad y retencion potenciados (EPR, por sus siglas en ingles) de los farmacos macromoleculares o lipfdicos en los tumores solidos (Cancer Res., 44, 2115-2121, 1984; ibid, 46, 6387-92, 1986; Anticancer Res., 13, 1287-1292, 1993).
El fenomeno EPR se atribuye a las alteraciones anatomicas y fisiopatologicas en los tejidos tumorales, tales como la densidad vascular aumentada por la angiogenesis, la carencia de capa de musculo liso en los vasos de tumores solidos y la recuperacion linfatica danada. Los cambios fisiopatologicos en el tumor solido estan provocados por la produccion extensa de mediadores vasculares tales como la bradiquinina, oxido mtrico, prostaglandinas, metaloproteinasas de la matriz (MMP), VEGF / VPF y otros que resultan en la potenciacion del efecto EPR que no se
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ven en los tejidos normales (por ejemplo Cancer Res., 58, 159-165, 1995; J. Control. Release, 74, 47-61, 2001; Advan. Enzyme Regul., 41, 189-207, 2001).
Anteriormente, los presentes inventores habfan desarrollado el primer farmaco conjugado SMA polimerico [pol^estireno-co-anhndrido maleico semi n-butirato)] unido covalentemente al agente antitumoral proteico, neocarzinostatina (NCS), que se denomina SMANcS (Patente japonesa (JP) N.° 1.549.302, JP 1.545.131, JP 2.556.865 y Patente U.S. 2.556.865). Este fue el primer farmaco polimerico antitumoral en el mundo.
El SMA confiere caractensticas farmacologicas unicas caractensticas cuando se compara con los farmacos parentales de bajo peso molecular. Concretamente, los conjugados SMA podnan ser capaces de unirse rapidamente de forma no covalente a la albumina y por lo tanto conferinan tropismo tumoral por el efecto EPR en virtud del aumento del peso molecular, por lo tanto tienen excelente capacidad de marcaje del tumor como diana.
En segundo lugar, tiene inmunopotenciacion (Oda T. et al., Proc. Soc. Exp Biol. Med., 181,9-17, 1986; Masuda E y H Maeda, Cancer Res., 56, 1868-1873, 1996). Greish Khaled et al, (Drug Delivery Systems, vol. 18, n.° 3, 10 de mayo de 2003, pagina 254) desvela micelas de complejo SMA-antraciclina (pirarrubicina o doxorrubicina), donde la antraciclina se une a SMA a traves de un enlace covalente.
Descripcion de la invencion
Los inventores de la presente invencion se dirigen a un metodo para mejorar la capacidad de marcaje selectivo como diana de tumores solidos de los agentes antitumorales tales como antraciclinas que afectan adversamente a las celulas normales, reduciendo en consecuencia los efectos secundarios. Cuando se intento que el polfmero de SMA se fijara a los agentes antitumorales, se obtuvo un unico agente antitumoral polimerico; estos farmacos formaban complejos micelares de tal manera que se comportan como un polfmero e indican el efecto EPR mas extensamente, dando como resultado un efecto antitumoral mejorado y menores efectos secundarios y ademas mejor estabilidad a temperatura ambiente, al contrario que SMANCS que se prepara por polimerizacion basado en el mero enlace covalente de SMA y NCS.
Los farmacos distintos de la antraciclina, tales como el cis-platino, forman complejos micelares polimericos combinandolos con SMA, estos agentes antitumorales polimericos obtenidos de esta manera tambien tienen capacidad de marcaje como diana de tumores.
Brevemente, la presente invencion se refiere a un agente antitumoral polimerico, que forma un complejo micelar polimerico combinando el agente antitumoral de bajo peso molecular con SMA, de acuerdo con las reivindicaciones. Mas preferentemente, la presente invencion se refiere a un agente antitumoral polimerico, que forma un complejo micelar polimerico combinando SMA y agentes antitumorales de antraciclinas, tales como pirarrubicina, doxorrubicina o cis-platino.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 es un cromatograma en gel que indica el aumento del tamano molecular de la pirarrubicina despues de su union con SMA.
La Figura 2 muestra el cambio de la intensidad de fluorescencia a la misma concentracion molar que el complejo SMA-pirarrubicina contra pirarrubicina libre sola.
La Figura 3 muestra el aumento de la intensidad de fluorescencia del complejo SMA-pirarrubicina en H2O y en SDS al 10 % (dodecil sulfato sodico).
La Figura 4 muestra la liberacion dependiente de tiempo de la pirarrubicina del complejo SMA-pirarrubicina in vitro en medio acuoso a diferentes pH y en etanol.
La Figura 5 muestra el efecto citotoxico in vitro de la pirarrubicina y la doxorrubicina libres y sus complejos micelares SMA contra la lmea celular de cancer de colon humano SW 480 despues de 3 dfas de cultivo.
La Figura 6 muestra el efecto antitumoral in vivo de SMA-pirarrubicina y SMA-doxorrubicina en ratones ddY que llevan sarcoma de raton S-180 a dosis variables;
La Figura 7 muestra la supervivencia de animales tratados con el complejo SMA-pirarrubicina y pirarrubicina libre.
La Figura 8 muestra el efecto de supresion del crecimiento de SMA-pirarrubicina en ratones ddY que llevan sarcoma de raton S-180.
La Figura 9 es un cromatograma en gel que indica el aumento del tamano molecular del cis-platino despues de la formacion de la micela. La Figura 10 indica la citotoxicidad del complejo micelar SMA-cis-platino a la celula tumoral mamaria de humano despues de tres dfas de cultivo celular, en comparacion con aquella del cis-platino libre.
La Figura 11 es un cromatograma en gel que indica el aumento del tamano molecular del taxol despues de que formara complejo micelar con SMA. En la figura, "A" es el complejo micelar SMA-taxol, "B" es taxol libre; "C" es SMA libre.
La Figura 12 indica el cambio en la intensidad de fluorescencia del taxol libre, el SMA libre y el complejo micelar SMA-taxol en solucion acuosa y solucion de DSS al 10 %.
Realizacion mas preferible para llevar a cabo la invencion
Aunque el agente antitumoral de bajo peso molecular usado en la presente invencion no se restringe siempre que 5 forme complejo micelar polimerico con SMA, de acuerdo con las reivindicaciones, se prefieren agentes antitumorales de antraciclinas. Los antitumorales de antraciclinas son antibioticos que tienen la estructura glucosido de 7,8,9,10- tetrahidro-5,12-naftasenquinona de los cuales la estructura se ilustra en la Formula (1) y (2).
Los ejemplos de Antraciclinas pueden ser pirarrubicina, doxorrubicina, epirubicina, daunorubicina o acrarbicina. 10 Entre ellos, la doxorrubicina (Formula (1)) y la pirarrubicina (Formula (2)), son los mas preferidos.
15 El cis diamina dicloro platino ilustrado por la Formula (3), es un agente antitumoral denominado cis-platino. Un quelato de metal pesado tal, asi como los alcaloides tales como camptotecina, taxol y similares tambien pueden formar complejos micelares SMA para ser agentes antitumorales polimericos.
nh3
i
Cl-Fjt—NH3 (3)
Cl
20 El SMA que es el agente polimerizante en la presente invencion se obtiene por copolimerizacion de estireno con acido maleico. Ya que el SMA es un copolimero que tiene estireno y acido maleico como ingrediente indispensable, tiene basicamente la unidad monomerica de estireno mostrada por la formula (4), pero la unidad monomerica de acido maleico puede ser parcialmente semi esteres de alquilo o de acilo o anhidrido maleico como se muestra por la formula (5) (Maeda H. et al., J. Med.Chem, 28, 455-61, 1980).
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CH------CH
COOR CO
(R en la formula (5) es un resto alquilo o acilo de 1~4 carbonos). En la presente invencion, puede usarse favorablemente copolimero de estireno semi esterizado con alquilo-acido maleico, del que una parte de R es un resto butilo.
Aunque el SMA puede tener diversos intervalos de peso molecular, el tamano mas preferible de SMA usado como agente de polimerizacion en la presente invencion es de trimero (aproximadamente 660 Da) a por encima de 40 kDa.
Aunque se han desarrollado muchos complejos o conjugados de doxorrubicina, no se ha informado el uso de SMA como el nuevo vehiculo polimerico o formador de micelas. Como se ejemplifica por SMANCS, el SMA seria ventajoso sobre los polimeros existentes, debido a las siguientes razones.
(1) El termino de descomposicion medio en la concentracion en plasma puede extenderse ampliamente anionizando por polianion.
(2) El complejo se vuelve lipofilo debido a la lipofilidad del estireno de manera que pueden prepararse farmacos oleaginosos/por via oral.
(3) Pueden ser farmacos hidrofilos asi como farmacos lipofilos.
(4) Puede unirse a la albumina de tal manera que se comporte como un polimero de peso molecular de poco menos de diez kiloDaltons a unos pocos cientos de kiloDaltons de tal manera que el efecto EPR aumente adicionalmente.
(5) es anfifilo de tal manera que tiene alta capacidad de formacion de micelas.
(6) Tiene capacidad de activacion inmune.
(7) Este complejo micelar tiene gran capacidad de carga de farmaco.
(8) Puede producirse a traves de un proceso sencillo.
(9) Puede mejorar la estabilidad.
El SMA, tambien tiene multiples grupos carboxilicos funcionales (por ejemplo ~14 grupos por cadena de 7 unidades de repeticion), que pueden utilizarse para reaccionar para reticular con grupos amino o hidroxilo de multiples compuestos. Otra ventaja anadida de los farmacos polimericos de SMA-antraciclina de la presente invencion se refiere a sus caracteristicas linfotropas adquiridas que los vuelven ventajosos contra la metastasis linfatica. Concretamente, se observo alta distribucion en los linfaticos (H. Maeda et al, Gann, 73, 278-284, 1982).
Este copolimero de estireno y acido maleico tiene propiedades biologicas favorables tales como capacidad de rapidamente hacer enlaces no covalentes con la albumina (Kobayashi et al., J. Bioactiv. Compat. Polymer, 3, 319-
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333, 1988), tropismo tumoral (Maeda H., Matsumura Y., Cancer Res., 46, 6387-6392, 1986) e inmunopotenciacion (Oda T. et al., Proc. Soc. Ex.Biol. Med., 181, 9-17, 1986).
Ademas de sus propiedades fisicoqmmicas como siendo de naturaleza anfffila, el SMA facilito la toma celular altamente potenciada debido a la existencia de estireno y acido maleico (Oda T. et al, J. Nat. Cancer Inst., 79, 12051211, 1987).
En la reaccion del SMA con farmacos de bajo peso molecular, pueden usarse diversos derivados de SMA, tales como la forma bicarboxi maleflo asf como la forma anhidro, o semi esteres de alquilo o acilo de antndrido maleico. La reaccion puede llevarse a cabo tambien despues de hidrolisis o alcoholisis. El metodo de preparacion de complejos micelares de alto peso molecular por la reaccion de SMA con farmacos de bajo peso molecular se explica tomando el caso del agente antitumoral antraciclina.
El SMA hidrolizado en solucion acuosa alcalina y el agente antitumoral se disuelven en solucion acuosa, se anade carbodiimida hidrosoluble a la mezcla, se deja reaccionar a pH de 7 o menor, preferentemente a un pH de 2-5, en agitacion. Por la reaccion de sustraccion entre el grupo amino de la antraciclina y el radical carboxilo del SMA, se logra un enlace amida, un enlace ester o un enlace no covalente, tal como un enlace ionico o un enlace de hidrogeno.
Un enlace no covalente, tal como un enlace ionico o un enlace de hidrogeno tambien puede lograrse por la reaccion en presencia de aminoacidos o poliamina en la mezcla a pH 7 o menor pH, preferentemente a un pH de 2-5, en agitacion.
Se usan L-arginina, L-ornitina o lisina como aminoacido, entre ellos es mas preferible la L-arginina. La espamina y la espamidina son las mas preferibles entre la poliamina.
Despues el pH se eleva por encima de 8 preferentemente 10-12 para desprotonar grupos amino libres. Finalmente el pH se ajusta a 6-8 usando HCl 0,1 M. Se sigue con la recuperacion del polfmero por ultrafiltracion y/o cromatograffa en columna. Durante este procedimiento las micelas de SMA atrapan farmacos de bajo peso molecular, procederan cambios conformacionales acompanantes e interaccion molecular, produciendo de esta manera la forma micelar.
Como se describe anteriormente, el agente antitumoral polimerico en la presente invencion no requiere ningun aditivo, tales como tensioactivos, para la formacion de micelas. En presencia de poliamina, el agente antitumoral y el SMA solos se usan para la formacion micelar estable del complejo micelar SMA-agente antitumoral. El proceso de reaccion de condensacion por deshidratacion no se necesita para formar complejos micelares. Esta es una de las ventajas de la presente invencion.
El complejo micelar polimerico de la presente invencion puede formarse por la reaccion de farmacos de bajo peso molecular y SMA (hidrolizado), de tal manera que el farmaco se atrapa en la micela. En algunos casos, el farmaco se une a traves de reticulado por enlace covalente con SMA, por enlace ionico o bien por enlace no ionico directamente. Sin embargo no es necesario estar unido qmmicamente (union covalente en la estructura amida).
El complejo micelar de SMA obtenido de esta manera tiene propiedades farmacologicas unicas en comparacion con los agentes antitumorales de bajo peso molecular parentales. Primeramente, tiene capacidad de transporte selectivo a los tejidos tumorales y capacidad de liberacion a largo plazo verificados por el efecto EPR, por lo tanto, se consigue alta concentracion terapeutica en los tejidos tumorales con alta durabilidad. Ademas, asegura las funciones fisiologicas de los organos y tejidos cnticos normales, tales como el tejido cardfaco, la medula osea o el rinon. No existe en agentes antitumorales de bajo peso molecular parentales. Tambien se confirmo la mayor seguridad en modelos animales como se describe en el presente documento.
El complejo SMA-micela de acuerdo con la presente invencion tiene la capacidad de unirse a las protemas plasmaticas, tales como la albumina, la fibrina o la lipoprotema, predominantemente, forma enlaces no covalentes rapidamente con la albumina. Tras la inyeccion iv (inyeccion intravenosa) del farmaco de la presente invencion, el tiempo de retencion en la sangre circulada se prolonga remarcablemente.
La adicion de naturaleza hidrofoba da un amplio intervalo de posibilidades de formulacion, por ejemplo, la formulacion acuosa para iv y la formulacion oleaginosa, especialmente la formacion de lipiodol para la administracion intra arterial u oral y pueden aplicarse diversos metodos de administracion diferentes. La carga negativa permitina una vida media in vivo prolongada en comparacion con los polfmeros positivamente cargados que habitualmente tienen una vida media in vivo muy corta.
El peso molecular aparente del complejo micelar en la presente invencion puede ser mayor que 10 kDa, preferentemente mayor que 50 kDa para el fin de la invencion. El peso molecular aparente se define como el complejo a traves de afinidad mutua inter molecular, determinado por el metodo de tamiz molecular, el metodo de ultrafiltracion, el metodo de ultracentrifugacion o el metodo de dispersion de luz en la solucion.
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Tras la reaccion de ambos constituyentes, es decir SMA y bien pirarrubicina o doxorrubicina, se espera que se sometan a una reaccion de reticulado y a cambios conformacionales que resulten en un peso molecular aparente >10 kDa. El aumento adicional en el peso molecular aparente puede observarse despues de la inyeccion iv debido al enlace no covalente a la albumina. El aumento en el tamano molecular aparente resultara en un area bajo la curva (AUC) de concentracion en plasma mas amplia. Esto significa la duracion prolongada de la accion sin eliminacion y da lugar al efecto EPR observado, la alta acumulacion de farmaco en los tejidos tumorales, es decir varias veces el nivel en plasma y mucho mas que el tejido normal asf como periodo prolongado de la accion del farmaco. En consecuencia, esto resulta en el aumento del efecto antitumoral a la vez que los efectos secundarios sistemicos muy reducidos.
Ejemplos
[Ejemplo 1] Preparacion de complejos micelares de SMA pirarrubicina
(1) Se disolvieron 10 mg/ml de SMA en 10 ml de agua y el pH se ajusto a 12 y se calento a 50 °C durante 4 horas para obtener SMA hidrolizado.
(2) Se anadio pirarrubicina a una concentracion final de 10 mg/ml en H2O (10 ml) y se mezclo con una barra magnetica en un vaso de precipitados de 100 ml a temperatura ambiente.
(3) El pH de la mezcla se reajusto a 5 en agitacion con adicion gota a gota de HCl 0,01 M. Etil-dimetilaminopropil carbodiimida (EDAC), (Sigma Chemical, St.Louis, MO,
EE.UU.), se anadio despues a 10 mg/ml (10 ml de volumen total/final) en 10 alfcuotas, cada adicion con intervalos de 2 minutos y se dejo reaccionar durante 30 minutos. Se formaran precipitados coloreados que pueden recogerse por centrifugacion o filtracion. El rendimiento basado en pirarrubicina es el 99 %. (4) Los precipitados se lavaron con agua acida fffa (pH menor de 5,0) 2 veces y despues se disolvieron en H2O ajustando el pH a 10, despues bajandolo a pH 7. Se siguio con dialisis con tubo Visking y ultrafiltracion con membrana de corte de 10 kDa ((Millipore Corporation, Bedford, MA, EE.UU.) para concentrar a volumen 1/10. Este ultimo proceso se repitio 3 veces; cada vez con un volumen 10-x contra agua destilada. Despues el contenido (5 ml) se sometio a cromatograffa de filtracion en gel usando una columna Sephadex G-50 Fine (3 x 52 cm) seguido de liofilizacion. El rendimiento despues de la liofilizacion fue 140 mg: ~aproximadamente el 70 %; en peso basado en SMA y pirarrubicina, el 80 % basado en el peso de pirarrubicina.
[Ejemplo 2]
Determinacion de las caracteffsticas fisicoqmmicas y bioqmmicas de la invencion;
(1) Cromatograffa en gel
La cromatograffa por filtracion de gel usando Sephadex G-50 Fino (Pharmacia LKB, Uppsala, Suecia) se llevo a cabo para demostrar el cambio en el peso molecular despues de la reaccion de complejacion con SMA. El tamano de columna usado fue 03 x 52 cm, con tampon bicarbonato de hidrogeno sodico 0,25 M (pH 8,24) como fase movil. Cada volumen de fraccion fue 6,5 ml. Como se muestra en la Figura 1, el tamano molecular del complejo SMA mostro un tamano mucho mas grande en comparacion con tanto la pirarrubicina libre como el SmA libre.
(2) Espectro de fluorescencia
Los compuestos de antraciclina libres o sin unir mostraron un espectro de emision de fluorescencia intenso con picos tanto en 550 nm como en 590 nm cuando se excitaron a 480 nm. Esta fluorescencia se inactiva en gran medida cuando las moleculas estan en vecindad de estrecha interaccion con poffmeros grandes tales como en micelas, o capsulas lipfdicas en el caso del liposoma debido a la transferencia de energfa a los restos aromaticos en la micela, el liposoma o el medio lipfdico, dando como resultado la inactivacion eficaz o la fluorescencia suprimida. Como se muestra en la Figura 2 el espectro de fluorescencia del complejo SMA pirarrubicina se inactivo en gran medida cuando se compara con la forma libre. Por lo tanto, el espectro de fluorescencia (intensidad) inactivado podffa usarse para probar el encierro de la pirarrubicina en la micela, o el contacto muy cercano con el resto aromatico del SMA.
La intensidad de fluorescencia inactivada por la union con SMA se regenero cuando las micelas se expusieron a dodecil sulfato sodico (SDS) al 10 % como se muestra en la Figura 4. Estos fenomenos apoyan la formacion del complejo micelar de SMA a traves de enlaces no covalentes. Debido a que el SDS rompeffa la asociacion hidrofoba de la micela entre la antraciclina y el resto estirenico del SMA. Concretamente, la intensidad de fluorescencia de los conjugados/complejos SMA-pirarrubicina o SMA-doxorrubicina se vuelven comparables a aquellas de la pirarrubicina libre o la doxorrubicina libre tras la rotura de las micelas por exposicion en solucion de SDS como se muestra en la Figura 3.
De manera similar, la exposicion de las micelas a etanol, que rompe la union no covalente de las micelas SMA- farmaco, hizo la fluorescencia tan intensa como los farmacos libres, similar a la exposicion a la solucion de SDS.
(3) Liberacion del farmaco libre de la bolsa de dialisis: prueba de la naturaleza macromolecular aparente del complejo SMA-farmaco.
Es de importancia que los farmacos polimericos de gran peso molecular que tienen un peso molecular aparente mayor de 10.000, preferentemente mas de 50 kDa tal como las micelas de SMA-antraciclina, ejerzan el efecto
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EPR de busqueda tumoral y de esta manera en ultima instancia liberen el farmaco libre. Para verificar que los complejos de farmaco de la presente invencion liberan el farmaco libre de la micela o el conjugado polimerico in vitro, 20 mg de conjugados SMA-doxorrubicina o SMA-pirarrubicina se disolvieron en 5 ml de H2O y se colocaron en bolsas de dialisis selladas (P.M de corte 1.000; Spectrapor, Spectrum Laboratories Inc. CA. EE.UU.). La bolsa de dialisis se sumergio en 25 ml de H2O con pH ajustado bien a 7,4 para simular la sangre en circulacion o bien pH 5,5 para el tejido tumoral, usando NaOH 0,01 M y HCl 0,01 M y se incubaron a 37 °C durante varios dfas en oscuridad. En esta configuracion el farmaco libre, bien doxorrubicina o pirarrubicina en sf mismas, se extravaso del tubo de dialisis en unas pocas horas. La pirarrubicina o doxorrubicina liberadas fuera de la bolsa de dialisis se recogieron en un tiempo pre-determinado y la cantidad se cuantifico por absorbancia a 480 nm. Los resultados se muestran en la Figura 4.
Como se muestra en la Figura 4, la velocidad de liberacion en tal condicion fue muy lenta; aproximadamente un 3 % al dfa con una liberacion relativamente mayor a pH mas bajo para ambos compuestos indicando la estabilidad de la micela de conjugado en circulacion. Cuando la solucion externa se reemplazo por etanol la velocidad de liberacion aumento tremendamente indicando la rotura de la interaccion hidrofoba en el complejo entre las antraciclinas y el resto hidrofobo de estireno del SMA. Uno puede contemplar que este ambiente hidrofobo sena mas cercano al endosoma despues de la internalizacion de la micela polimerica en el citoplasma de una celula cancengena por endocitosis. Por lo tanto, la alta velocidad de liberacion de farmaco se llevana aproximadamente por el medio lipofilo mas acido de los tejidos malignos despues de la internalizacion endocitotica.
(4) Analisis elemental
Los analisis elementales del complejo SMA-pirarrubicina despues de la purificacion (precipitacion fraccional, ultrafiltracion y cromatograffa en columna) para H, C, N y O en la micela probaron el porcentaje de la composicion de los 2 constituyentes principales de la micela (SMA y bien doxorrubicina o pirarrubicina). Los resultados estan de acuerdo con los datos del espectrofotometro que miden la absorbancia a 480 nm.
[Ejemplo 3] Citotoxicidad in vitro
La citotoxicidad in vitro del complejo micelar de SMA-(doxorrubicina o pirarrubicina) se determino por el metodo que usa bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (ensayo MTT) tanto con celulas SW480 de cancer de colon humano como con celulas HeLa de cancer cervical humano. Se pusieron en placa en placas de cultivo de 96 pocillos (Falcon, Becton Dickinson Labware, NJ, EE.UU.) a una densidad celular de 3000 celulas/pocillo. Las celulas se cultivaron durante toda la noche en medio de Eagle modificado de Dulbecco con suero bovino fetal al 10 % en aire al 95 % y CO2 al 5 %. Las celulas SW480 y HeLa se incubaron despues en presencia de doxorrubicina nativa, pirarrubicina o sus complejos SMA durante 72 horas. La citotoxicidad se cuantifico despues como la fraccion de celulas supervivientes con respecto a los controles sin tratar con farmaco (Figura 5).
Como se muestra en la Figura 5, SMA-pirarrubicina exhibieron efectos citotoxicos casi similares in vitro a aquellas lmeas celulares cuando se comparan con pirarrubicina libre (es decir, 85-100 %). La actividad citotoxica de las micelas SMA-doxorrubicina fueron considerablemente menores que la de la doxorrubicina libre (aproximadamente el 40 %) que puede atribuirse a la mayor propiedad hidrofoba de la doxorrubicina que tiene menor velocidad de liberacion, retrasando de esta manera la liberacion de farmaco libre disponible para las celulas en el medio de cultivo. En conclusion los complejos polimericos de SMA-antraciclinas tienen actividad potencial comparable a los farmacos parentales libres, o en caso de la doxorrubicina, la actividad fue menor que el farmaco libre como se ve en la Doxorrubicina.
[Ejemplo 4] Actividades antitumorales in vivo
Se usaron ratones ddY machos de 6 semanas de edad. Se implantaron celulas de sarcoma S180 (2 x 106 celulas por raton) s.c. en la piel dorsal. Los dfas 7-10 despues de la inoculacion del tumor cuando los tumores alcanzaron un diametro de 5-7 mm, pero no eran evidentes areas necroticas, se iniciaron los tratamientos por la concentracion deseada de doxorrubicina, pirarrubicina o sus complejos de SMA. Los farmacos se disolvieron en agua destilada y se administraron iv a la vena de la cola de los ratones de acuerdo con horarios predeterminados (Vease la Figura 7). El crecimiento de los tumores se monitorizo cada 2 dfas midiendo el volumen tumoral. Como se muestra en la Figura 7, la supresion del crecimiento tumoral del complejo SMA-pirarrubicina fue mas activa que del complejo SMA- doxorrubicina.
La tasa de supervivencia de los ratones que recibieron SMA-pirarrubicina y pirarrubicina libre se muestra en la Figura 7.
Es digno de mencion que los ratones recibieron dosis de 20 o 40 mg/kg de peso corporal de piarrubicina libre equivalente de complejo SMA durante 4 dfas consecutivos, todos los tumores retrocedieron completamente. Obviamente todos los animales tratados sobrevivieron al 100 % durante mas de 6 meses. Todos los animales que recibieron 20 mg/kg de peso corporal de pirarrubicina o doxorrubicina libres, como dosis equivalente usada para el complejo, murieron en 1 semana debido a la toxicidad (Figura 7). La erradicacion completa del tumor en todos los animales obtenida con esta invencion no tiene precedentes con la mayona, si no todos, los distintos agentes antitumorales.
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[Ejemplo 5] Modelo de tumor sinergico en ratones
Similar al Ejemplo 4 anterior, se realizo otro experimento usando modelo de raton inmunologicamente singenico/tumor. El tumor usado fue el adenocarcinoma de colon 38 originado del cancer de colon. El tejido tumoral de celulas tumorales de colon 38 en bloque de aproximadamente 30 mg/sitio se implanto bilateralmente en la piel dorsal de ratones C57 BL. Despues de 14 dfas cuando el tumor solido es palpable con tamano de ~
100 mm de diametro, se iniciaron los tratamientos de farmaco usando complejo equivalente de pirarrubicina 50 mg/kg en una unica dosis administrada i.v. Los resultados mostraron que el 100 % de los animales alcanzaron la recuperacion total despues de 2 semanas de tratamiento, demostrando ademas la potencialidad prometedora de aquellos agentes. Los resultados se muestran en la Figura 8.
[Ejemplo 6] Efecto secundario potencial de los complejos micelares de SMA-Pirarrubicina y SMA- Doxorrubicina.
Se usaron ratones que llevan S-180 con tumores de aproximadamente 5-7 mm de diametro para este estudio. Se realizo el analisis de sangre completa semanalmente durante 4 semanas antes y despues de 1, 2 y 3 semanas de inyecciones iv bien de doxorrubicina, pirarrubicina o bien sus complejos micelares con SMA como se describe anteriormente. La bioqmmica de sangre incluyendo, alanina aminotransferasa (ALT), aspartato aminotransferasa (AST), deshidrogenasa lactica (LDH) y creatina fosfoquinasa (CPK) se midieron a 36 h despues de la administracion i.v. de bien farmacos libres o complejos micelares SMA.
Al mismo tiempo, los tejidos de corazon, bazo, hngado y rinon se tineron con hematoxilina-eosina (tincion H&E) para la determinacion de la toxicidad tisular citologica. Los farmacos micelares no mostraron toxicidad hasta 100 mg/kg de peso corporal cuando se administraron en inyecciones de 4 veces (25 mg/kg x 4) durante una semana, o 70 mg/kg cuando se administraron como una unica dosis. El recuento sangumeo, las funciones cardiacas y hepaticas en los animales que recibieron los farmacos micelares de complejos no mostraron diferencia significativa de cualquier animal control tratado con farmacos.
La Tabla 1 muestra un ejemplo de recuento de sangre completa de animales durante 3 semanas despues de la administracion de farmaco, recibiendo i.v. 10 mg/kg de pirarrubicina libre frente a animales que reciben 20 mg/lg de complejo SMA-pirarrubicina (20 mg/kg de equivalente pirarrubicina libre), en comparacion con control sin farmaco en ratones. Notese la seguridad remarcable de los farmacos de la presente invencion que los hace altamente prometedores para las pruebas clmicas.
[Tabla 11
- Toxicidad hematologica de la pirarrubicina libre y el complejo SMA-pirarrubicina
- Control Pirarrubicina libre 10 mg/kg Complejo SMA-pirarrubicina equivalente como 20 mg/kg de pirarrubicina
- 1 semana
- 2 semanas 3 semanas 1 semana 2 semanas 3 semanas
- Leucocito (/mm3)
- 8012 ±565 2533 ±108 5000 4500 6016,7 ±576,8 5900 ±754,7 6366,6 ±675
- Hemoglobina (g/dl)
- 14,9 ±0,46 11,1 ±0,9 12,1 15,7 15 ±0,9 14,1 ±0,56 15,9 ±0,12
- Eritrocito (x 10.000/mm3)
- 898 ±35 490,6 ±144 876 916 973 ±57,8 861 ±27,4 837,5 ±39,3
- Trombocito (x 1,00/mm3)
- 132,9 ±5,4 67,7 ±0,9 130 143 141,3 ±5,6 130,3 ±3,8 120 ±11,5
- Tasa de supervivencia (%)
- 100 100 25 25 100 100 100
- ±: Deviacion estandar
[Ejemplo 7] Cambio en el peso molecular del cis-platino
El complejo SMA-cis-platino se preparo con SMA y cis-platino del mismo modo que en el ejemplo 1 y se determino el cambio de su peso molecular.
(1) Cromatograffa en gel
Sephadex G-50 Fino (Pharmacia LKB, Uppsala, Suecia) se uso para la cromatograffa en gel en la siguiente condicion:
Fase movil; solucion tampon bicarbonato sodico 0,25 M (pH 8,24)
Tamano de columna; 45 x 1,5 cm Volumen de cada fraccion; 4 ml
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Se determino el peso molecular antes y despues de la formacion del complejo SMA-cis-platino.
El resultado se muestra en la Figura 9, que indica un aumento en el peso molecular a traves de la formacion de complejo SMA-micela.
(2) Determinacion de la permeabilidad de membrana a traves de la membrana del tamiz molecular
La permeabilidad del complejo SMA cis-platino y el cis-platino libre se determino con una membrana de tamiz molecular de maximo 3 kDa.
El resultado se muestra en la Tabla 2.
[Tabla 21
- Concentracion de cis-platino libre despues de la ultrafiltracion a traves de membrana de maximo 3 kDa
- Cis-platino libre Complejo SMA cis-platino
- % Permeado a traves de la membrana de 3 kDa
- 100 1,4
- % No permeado a traves de la membrana de 3 kDa
- 0 98,6
La concentracion de cis-platino libre se determino con el metodo colorimetrico de o-fenilendiamina a 720 nm [EJEMPLO 8] Citotoxicidad del complejo micelar de SMA cis-platino y cis-platino libre
Se incubaron celulas de cancer mamario humano en solucion de complejo micelar SMA-cisplatino (25 y 50 pg/ml) en un tubo de ensayo durante 72 horas del mismo modo que el ejemplo 3.
La citotoxicidad se expreso como una relacion de celulas que sobrevivieron junto con aquellas de sin farmaco y cis- platino libre en la Figura 10. El complejo micelar SMA cis-platino indico su toxicidad contra las celulas tumorales anteriormente descritas en el mismo grado que el cis-platino libre.
[Ejemplo 9] Complejo micelar SMA-taxol
(1) Formacion de micela SMA-taxol
Se examino la evidencia de la formacion micelar de SMA-taxol haciendo reaccionar las siguientes mezclas en la misma condicion que en la formacion de micelas SMA-pirarrubicina.
(a) SMA + Taxol solo
(b) SMA + Taxol + EDAC
Este procedimiento (a) no mostro formacion de micela incluso despues de 24 h, es decir, (Opaco/turbio) indicado el estado insoluble. En el procedimiento (b) se volvio transparente en 6-12 h, se sugiere la formacion de micelas.
La preparacion hecha en el procedimiento (b), no paso a traves de la membrana de ultrafiltracion (UF-10, corte 10 kDa).
(2) Cromatograffa en gel
La cromatograffa por filtracion en gel usando Sephadex G-50 se llevo a cabo para demostrar el cambio en el peso molecular despues de la reaccion de complejacion con SMA, del mismo modo que el Ejemplo 2.
La condicion de filtracion en gel es la misma que el Ejemplo 2, excepto que, el tamano de columna usado fue 52x1,5 cm, con tampon bicarbonato de hidrogeno sodico 0,2 M (pH 8,1) como fase movil. La micela SMA-taxol eluyo a un volumen vacfo indicando el tamano mas grande que 10 kDa. El resultado se muestra en la Figura 11. La sustancia de peso molecular patron en la parte superior de la Figura 11 es BSA (albumina de suero bovino) (67,5 kDa) y rojo fenol (354 kDa).
Esto se valido ademas por cromatograffa en columna G-150.
(3) Espectro de fluorescencia
El analisis del espectro de fluorescencia se sometio a complejo micelar SMA-taxol del mismo modo que el Ejemplo 2-(2). Como se muestra en la Figura 12 (a), el taxol libre tiene un pico a 525 nm en el espectro de fluorescencia, pero el complejo micelar SMA-taxol carece del pico en la Figura 12 (c). Sin embargo cuando la micela se transfirio a dodecil sulfato sodico al 15 %, el espectro aparecio de nuevo (Figura 12 (c) lmea punteada). Esto indica que la union
entre SMA y taxol es no covalente pero forma complejos micelares. La intensidad de fluorescencia del propio SMA en solucion de SDS es casi la misma que en solucion acuosa. Esto sugiere que el SDS cambio la union de SMA- taxol.
5 Aplicabilidad Industrial
El agente antitumoral de acuerdo con la presente invencion, tomando ventaja del efecto EPR, puede mejorar el efecto del tratamiento del cancer y reducir los efectos secundarios a los organos y tejidos normales en un gran grado, formando complejos de micelas de alto peso molecular de SMA y un agente antitumoral de bajo peso 10 molecular que en sf mismo tiene fuerte efecto antitumoral pero poco marcaje como diana selectiva de las celulas tumorales.
En la presente invencion, pueden formarse complejos micelares estables a partir de SMA, agentes antitumorales y poliaminas. El complejo se comporta como si fuera un polfmero de 10 kDa o de mayor peso molecular en el cuerpo 15 humano. Ademas cuando se une a la albumina a traves de enlace no covalente, indica un aumento aparente en el peso molecular, de tal manera que puede concentrarse en las celulas tumorales. Como resultado la presente invencion permite un efecto antitumoral diez veces mas fuerte que el agente antitumoral de bajo peso molecular contra diversos canceres con mmimos efectos secundarios, de tal manera que es un farmaco terapeutico prometedor para el cancer solido.
20
Claims (15)
- 5101520253035404550REIVINDICACIONES1. Un agente anti-tumoral polimerico, que comprende un copoKmero de estireno acido maleico (SMA) y un agente anti-tumoral, caracterizado por que el peso molecular del agente anti-tumoral es menos de 10 kDa, de tal manera que el agente anti-tumoral polimerico forma un complejo micelar polimerico, en el que el agente anti-tumoral se une al SMA a traves de un enlace no covalente y el agente anti-tumoral se atrapa en la micela.
- 2. El agente anti-tumoral polimerico de acuerdo con la reivindicacion 1, donde el agente anti-tumoral de bajo peso molecular es una antraciclina.
- 3. El agente anti-tumoral polimerico de acuerdo con la reivindicacion 2, donde la antraciclina es doxorrubicina o pirarrubicina.
- 4. El agente anti-tumoral polimerico de acuerdo con la reivindicacion 1, donde el agente anti-tumoral es cis-platino o un alcaloide.
- 5. El agente anti-tumoral polimerico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, donde el peso molecular del agente anti-tumoral polimerico es mayor que 10 kDa.
- 6. El agente anti-tumoral polimerico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, donde la unidad de monomero de acido maleico es parcialmente un semi ester de alquilo o acilo o es antndrido maleico.
- 7. El agente anti-tumoral polimerico de acuerdo con la reivindicacion 6, donde la unidad de monomero de acido maleico esta semi esterizada con un resto alquilo o acilo de 1 a 4 atomos de carbono.
- 8. El agente anti-tumoral polimerico de acuerdo con la reivindicacion 6 o 7, donde el copolfmero de estireno acido maleico (SMA) esta semi esterizado con alquilo, donde una parte de los grupos alquilo es butilo.
- 9. El agente anti-tumoral polimerico de acuerdo con la reivindicacion una de las reivindicaciones 1 a 8, donde el peso molecular del copolfmero de estireno acido maleico (SMA) es de 660 Da a 40 kDa o mas.
- 10. Un metodo de preparacion para el agente anti-tumoral polimerico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende:- disolver un copolfmero de estireno acido maleico y un agente anti-tumoral en agua en presencia de carbodiimida hidrosoluble, aminoacidos o poliamina a un pH de 7 o menor, para obtener una solucion acuosa; despues- aumentar el pH a mas de 8 para desprotonar los grupos amino libres; seguido de- neutralizacion; y finalmente- recuperar una fraccion polimerica por un proceso de separacion polimerico.
- 11. El metodo de la reivindicacion 10, donde la disolucion se lleva a cabo a pH 2-5, preferentemente en agitacion.
- 12. El metodo de la reivindicacion 10 u 11, donde el aumento de pH se lleva a cabo hasta pH 10-12.
- 13. El metodo de una de las reivindicaciones 10 a 12, donde la recuperacion se lleva a cabo usando ultra-filtracion y/o cromatograffa en columna.
- 14. El agente anti-tumoral polimerico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 9 para su uso en un metodo de tratamiento de cancer.
- 15. Uso del agente anti-tumoral polimerico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 9 para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de cancer.
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