ES2638088T3 - Anticuerpo anti-proteína tirosina fosfatasa de tipo receptor humano - Google Patents

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Abstract

Un anticuerpo monoclonal o un fragmento que incluye una región de unión a antígeno del mismo que se une a un dominio extracelular de la proteína tirosina fosfatasa σ de tipo receptor humano (PTPRS humana) sobre una célula dendrítica plasmocitóide y suprime la producción de IFN por, y/o la supervivencia de, la célula.

Description

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DESCRIPCION
Anticuerpo anti-protema tirosina fosfatasa de tipo receptor humano Campo tecnico
La presente invencion se refiere a un anticuerpo que se une a la protema tirosina fosfatasa a de tipo receptor humano. En adelante, la "protema tirosina fosfatasa" se abrevia como PTP, la "protema tirosina fosfatasa de tipo receptor" se abrevia como RPTP o PTPR, la protema tirosina fosfatasa a del tipo receptor se abrevia a veces como RPTP-a, PTP-a o PTPRS y "humano" y "raton" son a veces representados por los prefijos hym, respectivamente.
Tecnica anterior
Los interferones (en adelante "interferon" a veces se abrevian como IFN) son las citoquinas mas importantes en la respuesta inmunitaria antiviral. Una celula productora de interferon (IPC: IPC es una celula dendntica linfocftica indiferenciada que esta posicionada como celula precursora de una celula dendntica (DC). La IPC tambien se denomina a veces celula dendntica plasmocitoide o celula dendntica de tipo celula plasmatica (celula dendntica plasmocitoide: pDC). De aqu en adelante, se considera que IPC y pDC tienen el mismo significado en la presente memoria, y se normalizan en lo sucesivo mediante el termino pDC como regla general. Una pDC en sangre humana expresa una protema de complejo mayor de histocompatibilidad de Clase II junto con CD4. Sin embargo, dado que el numero de tales celulas es pequeno y las celulas rapidamente causan apoptosis y carecen de un marcador de linaje, esas celulas no han sido aisladas o caracterizadas en detalle hasta ahora. Se demostro que pDC es una celula precursora de celulas dendnticas de tipo CD4+CD11c-2, y que produce IFN de 200 a 1.000 veces mayor que la producida por otras celulas sangumeas despues de la estimulacion por un microorganismo. Por lo tanto, pDC2 es una celula efectora del sistema inmunitaria decisiva en respuestas inmunitarias antivirales y antitumorales.
El IFNa y el IFNp se conocen como IFN de Tipo I que tienen actividad antiviral o actividad antitumoral. Por otra parte, se aclaro que el IFNa se refiere a enfermedades autoinmunitarias. Por ejemplo, la produccion anormal de IFNa se informo en pacientes que padecen las siguientes enfermedades autoinmunitarias. Ademas, se sugirio la posibilidad de aliviar una enfermedad autoinmunitaria neutralizando el IFNa.
Se informo sobre la artritis reumatoide eritematosa sistemica (Shiozawa et al., Arthr. & Rheum. 35, 412, 1992) y cronica (Hopkins et al., Clin. Exp. Immunol 73, 88, 1988) y, ademas, sobre los ejemplos en los que se expresaba o deterioraba un estado de una enfermedad autoinmunitaria mediante la administracion de IFNa2 o IFN recombinantes (Wada et al., Am. J. Gastroenterol. 90,136, 1995; Perez et al., Am. J. Hematol. 49, 365, 1995; Wilson LE et al., Semin Artritis, Rheum. 32,163-173, 2002).
Ademas, se aclaro tambien que el IFNa induce la diferenciacion de una celula dendntica (DC). Dado que una celula dendntica es tambien una celula presentadora de antfgeno, se considera que la induccion de la diferenciacion de una celula dendntica constituye un mecanismo importante en las enfermedades autoinmunitarias. De hecho, se sugirio que la induccion de la diferenciacion de una celula dendntica de IFNa esta mtimamente relacionada con el inicio del eritematoso sistemico (Blanco et al., Science, 16: 294, 1540-1543, 2001). Por lo tanto, se ha senalado la actividad antitumoral y la relacion mtima con enfermedades autoinmunitarias de IFNa. Ademas, el IFNa tambien se relaciona mtimamente con el inicio de la psoriasis (Nestle FO et al., J. Exp. Med. 202,135-143, 2005).
Solo una pequena cantidad de pDC esta presente en la sangre. Se considera que la proporcion de pDC en linfocitos de sangre periferica es de 1% o menos. Sin embargo, la pDC tiene una capacidad extremadamente alta de produccion de IFN. La capacidad de las pDC para producir IFN alcanza, por ejemplo, 3.000 pg/mL/104 Celulas. A saber, puede considerarse que, aunque el numero de celulas es pequeno, la mayor parte del IFNa o IFNp en la sangre se produce mientras que la infeccion vinca es provocada por pDC.
La pDC se diferencia para proporcionar una celula dendntica por estimulacion viral para inducir la produccion de IFN-y e IL-10 por una celula T. Ademas, la pDC tambien se diferencia para proporcionar una celula dendntica por la medio de la estimulacion de IL-3. La celula dendntica diferenciada por la estimulacion de IL-3 induce la produccion de citoquinas Th2 (IL-4, IL-5, IL-10) por una celula T. Por lo tanto, la pDC tiene la caractenstica de que se diferencia para proporcionar diferentes celulas dendnticas dependiendo de la diferencia de estimulacion.
Por lo tanto, pDC es una celula que tiene dos aspectos: uno es un aspecto como celula productora de IFN y otro es un aspecto como celula precursora para una celula dendntica. Ambas celulas juegan un papel importante en un sistema inmunologico. A saber, la pDC es una de las celulas importantes que apoyan un sistema inmunologico desde varios aspectos.
Para el control de la actividad de un factor humoral tal como IFN, la administracion de un anticuerpo que reconoce el factor es eficaz. Por ejemplo, se puso en practica un intento de tratar una enfermedad autoinmunitaria mediante un
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anticuerpo contra la interleucina (IL)-1 o la IL-4 (Guler et al., Arthritis Rheum, 44, S307, 2001). Ademas, se considera que un anticuerpo neutralizado puede convertirse en un farmaco terapeutico para enfermedades autoinmunitarias tambien en interferones (IFN) (Stewart, TA. Cytokine Growth Factor Rev. 14; 139-154, 2003). Se puede esperar que un enfoque similar sea eficaz para los IFN producidos por pDC. Sin embargo, este enfoque se basa en la inhibicion de la accion del factor humoral producido. Si la produccion de un factor humoral objetivo puede ser controlada directamente, se puede lograr un efecto terapeutico mas esencial.
Se informo sobre un anticuerpo que reconoce pDC humana. Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal anti-BDCA-2 es un anticuerpo monoclonal que es espedfico de pDC humana (Dzionek A. et al., J. Immunol 165: 6037-6046, 2000). Se aclaro que el anticuerpo monoclonal anti-BDCA-2 tiene una accion de supresion de la produccion de IFN de pDC humana (J. Exp. Medicina. 194:1823-1834, 2001). Ademas, se informo tambien de que un anticuerpo monoclonal que reconoce una celula productora de interferon de raton suprime la produccion de interferones (Blood 1 dejun. de 2004; 103/11: 4201-4206. Epub dic. 2003). Se informo de que un anticuerpo monoclonal contra pDC de raton disminuyo el numero de celulas dendnticas (J. Immunol. 2003,171: 6466-6477).
Esto es util si se proporciona un anticuerpo que reconoce de forma similar la pDC humana y puede controlar su actividad. Por ejemplo, los autores de la presente invencion ya han aclarado que un anticuerpo que reconoce Ly49Q se une espedficamente a pDC de raton. Sin embargo, un anticuerpo contra Ly49Q no interfirio la actividad de pDC de raton (Blood, 1 de abril de 2005, vol. 105, Num. 7, pags. 2787-2792: documento WO2004/13325A1).
Las fosfatasas proteicas son enzimas desfosforilantes que se encontraron en los estudios del metabolismo del glucogeno. Ademas de la protema tirosina fosfatasa (PTP), se han encontrado protema serina/treonina fosfatasa, fosfatasa espedfica de fosfolfpidos y similares, y estas forman una superfamilia de protemas fosfatasas. De estas, la protema tirosina fosfatasa es una enzima que es responsable de la desfosforilacion entre las modificaciones de fosforilacion reversibles que se observan en los residuos de tirosina de las protemas. Por otra parte, la protema tirosina quinasa (PTK) se ilustra como una enzima que es responsable de la fosforilacion entre las modificaciones de fosforilacion reversibles que se observan en los residuos de tirosina de las protemas.
La protema tirosina fosfatasa (PTP) convierte la informacion de union de un ligando de un dominio extracelular del mismo en actividad fosfatasa de un dominio intracelular, y se considera que la protema tirosina quinasa (PTK) es activada por la union de un ligando, mientras que la protema tirosina fosfatasa (PTP) es generalmente inactivada por la union de un ligando. Por lo tanto, tanto en la protema tirosina fosfatasa (PTP) como en la protema tirosina quinasa (PTK), la estimulacion de un ligando conduce a un aumento en el nivel de fosforilacion, mientras que se espera una gran diferencia en las propiedades de la senal. En el caso de la protema tirosina quinasa (PTK), el control de retroalimentacion positiva en el que los receptores son fosforilados entre sf y activados, y la activacion topica de las moleculas de protema tirosina quinasa (PTK) se transmite a otras moleculas de protema tirosina quinasa (PTK) en una membrana celular, con lo que se aumenta la fosforilacion en un amplio intervalo. Por otra parte, solo las moleculas a las que se han unido los ligandos se inactivan en la protema tirosina fosfatasa (PTP), y la fosforilacion del sustrato se incrementa solo topicamente. La protema tirosina fosfatasa (PTP) que participa en muchas funciones fisiologicas y funciones celulares recibe mucha atencion en amplias areas de la neurobioqmmica del cerebro, la inmunologfa, los canceres, la diabetes mellitus y similares (copia de la pagina de inicio de la Division de Neurobiologfa Molecular, Instituto Nacional de Biologfa Basica,
http://niwww3.nibb.ac.jp/RPTP.pdf).
La familia de las protemas tirosina fosfatasas puede clasificarse en un tipo receptor que tiene una region que penetra la membrana celular y un tipo no receptor. Existen 21 moleculas de tirosina fosfatasas de tipo receptor (tambien abreviadas como RPTP o PTPR) en mairnferos, que se clasifican en ocho subfamilias y cada subfamilia tiene una estructura extracelular inherente en la que se observan un dominio de tipo inmunoglobulina, un dominio de tipo fibronectina tipo III, un dominio de tipo carbonato deshidratasa, un dominio MAM y similares (Nat Rev Mol Cell Biol., Vol. 7, 833-846, 2006).
La protema tirosina fosfatasa a de tipo receptor humano (abreviada como hRPTP-a, hPTP-a o hPTPRS y la abreviatura hPTPRS que se utiliza principalmente en la presente memoria) pertenece a una subfamilia R2A junto con LAR (protema tirosina fosfatasa relacionada con el antfgeno leucocitario) y la protema tirosina fosfatasa a de tipo receptor (PTP-a). Las enzimas de la familia de PTPR se expresan en diversos tejidos incluyendo sistemas nerviosos desde el comienzo de la generacion hasta despues de la maduracion de los animales, pero se han aclarado pocas funciones de las mismas ya que la identificacion de moleculas de ligando y moleculas de sustrato no es facil.
Las celulas dendnticas (DC) son las principales celulas presentadoras de antfgeno en un organismo vivo, que estan presentes en la sangre, tejidos linfoides y similares y se clasifican grosso modo en celulas dendnticas mieloides (mDC) y celulas dendnticas plasmocitoides (pDC). Las pDC expresan selectivamente TLR7 y TLR9 como receptores de tipo Toll en las superficies celulares de las mismas y producen interferones a y p de tipo I, espedficamente interferon a.
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Los estudios recientes han aclarado varias moleculas de ligando que actuan sobre celulas dendnticas controlando su maduracion y activacion, y se han aclarado los mecanismos de transmision de senales intracelulares a partir de sus receptores. Sin embargo, hay muchos puntos poco claros sobre los mecanismos de modificacion y control de las funciones de las celulas dendnticas. De manera similar a la clarificacion en muchas otras celulas, se considera que la fosforilacion de protemas juega un papel importante tambien en celulas dendnticas para el control de la transmision de senales a partir de receptores, movimiento/migracion de celulas y similares.
Las protemas fosfatasas que son factores de control negativo para la fosforilacion de protemas son candidatos dominantes como factores para mantener intensidades y longitudes adecuadas de senales para modular la activacion y las funciones de las celulas dendnticas. (Nobuhiro Tanuma (Instituto de Medicina Genetica, Universidad de Hokkaido), "Functional Analysis Of Tyrosine Phosphatase Induced in Maturing of Dendritic Cells" en la pagina de inicio del Centro de Avance del Norte para Ciencia y Tecnologfa (abreviatura: NOASTEC),
http://www.noastec.jp/kinouindex/data2005/pdf/01/01_20.pdf).
La Publicacion Internacional Num. WO95/9656A1 describe RPTP-a (PTPRS) y un acido nucleico que la codifica; sin embargo, la secuencia de aminoacidos descrita es una derivada de rata, y la publicacion no hace mencion de un anticuerpo espedfico de PTPRS. La Publicacion Internacional Num. WO95/9656A1 tampoco describe nada a cerca de un anticuerpo anti-PTPRS humano.
La Publicacion Internacional Num. WO2007/41317A1 se refiere a un anticuerpo aislado que se une espedficamente a al menos RPTP-a o RPTP-5 para suprimir la respuesta inmunitaria de una celula inmunitaria, o un fragmento de union a antfgeno del mismo. El documento describe que la union del polipeptido de poxvirus A41 L y RPTP se inhibe competitivamente utilizando un anticuerpo que se une espedficamente a RPTP, consiguiendo de este modo la supresion de la respuesta inmunitaria de una celula inmunitaria. Sin embargo, este documento no describe que se obtuvo realmente el anticuerpo que se une espedficamente a RPTP-a (PTPRS), y en lo que se refiere a la descripcion de los Ejemplos, los Ejemplos simplemente confirmaron que la RPTP expresada en una celula inmunitaria que se une a A41L es una parte de RPTP-a, RPTP-5 y LAR que pertenecen al mismo subtipo R2A y preparo una protema de fusion del dominio de tipo inmunoglobulina de LAR y Fc (protema de fusion LAR (dominio de Ig)-Fc). Es diffcil decir que la Publicacion Internacional Num. WO2007/41317A1 describe un anticuerpo espedfico unicamente para RPTP-a y su preparacion.
El documento WO2010256332 Informa del uso de un anticuerpo comercialmente disponible contra PTPRS humano denominado 1H6 para su inmunodeteccion.
Lista de referencias
Literatura de Patentes
PTL 1: WO2004/13325A1 PTL 2: WO95/9656A1 PTL 3: WO2007/41317A1
Literatura no relacionada con Patentes
NPL 1: Shiozawa et al., Arthr. & Rheum. 35, 412, 1992
NPL 2: Hopkins et al., Clin. Exp. Immunol. 73, 88, 1988
NPL 3: Wada et al., Am. J. Gastroenterol. 90, 136, 1995
NPL 4: Perez et al., Am. J. Hematol. 49, 365, 1995
NPL 5: Wilson LE y col., Semin Artritis. Reuma. 32,163-173, 2002
NPL 6: Blanco et al., Science, 16: 294, 1540-1543, 2001
NPL 7: Nestle FO et al., J. Exp. Med. 202, 135-143, 2005
NPL 8: Guler et al., Arthritis Rheum., 44. S307, 2001
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NPL 12: Blood 2004 Jun 1; 103/11: 4201 -4206. Epub dic. 2003
NPL 13: J. Immunol. 2003, 171: 6466-6477
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NPL 15:
http://niwww3.nibb.ac.jp/RPTP.pdf
NPL 16: Nat Rev Mol Cell Biol., Vol. 7,833-846, 2006
NPL 17:
http://www.noastec.jp/kinouindex/data2005/pdf/01/01_20.pdf
Compendio de la invencion
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Problema tecnico
El objeto de la presente invencion es proporcionar un anticuerpo que se une a la protema tirosina fosfatasa a de tipo receptor humano (PTPRS humana, hRPTP-a), y detectar, identificar o aislar pDC. Ademas, el objeto de la presente invencion es modular la actividad de pDC.
Los autores de la presente invencion confirmaron a traves de los estudios relativos a pDC humanas que la expresion de PTPRS en pDC se refuerza espedficamente. Por lo tanto, los autores de la presente invencion intentaron preparar un anticuerpo de PTPRS y aclarar su accion.
Con el fin de obtener un anticuerpo que reconozca una cantidad traza de una protema derivada de un organismo, se utiliza generalmente una protema preparada mediante una tecnologfa de recombinacion genica como inmunogeno. Los autores de la presente invencion han intentado expresar PTPRS humana basandose en la secuencia de bases de ADNc de PTPRS humana, que ya se ha aclarado, y por ende la informacion sobre la secuencia de aminoacidos codificada (Num. de Acceso de GenBank NM_002856.3).
Con el fin de obtener un anticuerpo de una protema, a menudo se intenta utilizar una secuencia parcial de aminoacidos de una protema natural como inmunogeno. Sin embargo, para que un anticuerpo reconozca una molecula sobre una superficie celular, se debe seleccionar una region que constituye una parte que es reconocida por un anticuerpo como epftopo sobre una superficie celular. Por lo tanto, se considero que la obtencion de un anticuerpo que es espedfico de PTPRS humana utilizando una secuencia de aminoacidos fragmento como inmunogeno se encuentra distante.
Solucion al problema
Bajo tal situacion, los autores de la presente invencion han aclarado que se puede obtener un anticuerpo que se une a pDC utilizando un inmunogeno especial. Ademas, tambien han confirmado que el anticuerpo asf obtenido reconoce espedficamente pDC humana y tiene una accion de modulacion de su actividad y completaron la presente invencion.
Por lo tanto, la presente invencion se refiere al siguiente anticuerpo anti-PTPRS humano, al metodo para su produccion, y a sus aplicaciones.
La presente invencion se indica a continuacion.
1. Un anticuerpo monoclonal o un fragmento que incluye una region de union a antfgeno del mismo que se une a un dominio extracelular de la protema tirosina fosfatasa a de tipo receptor humano (PTPRS humana) sobre una celula dendntica plasmocitoide y suprime la produccion de IFN por, y/o la supervivencia de, la celula.
2. El anticuerpo monoclonal o un fragmento de acuerdo con el apartado (1) anteriormente mencionado, en donde dicho anticuerpo es producido por el hibridoma 9H5-4 que se deposito como Num. de Acceso FERM BP-11356, hibridoma 10F7-38 que se deposito como Num. de Acceso FeRM BP-11357, hibridoma 13G5-52 que se deposito como Num. de Acceso FERM BP-11358, hibridoma 13G5-57 que se deposito como Num. de Acceso FERM BP-11359, hibridoma 14A8-85 que se deposito como Num. de Acceso FERM BP-11360, hibridoma 22H8-84 que se deposito como Num. de Acceso FERM BP-11361, hibridoma 49F2-30 que se deposito como Num. de Acceso FERM BP-11362 o hibridoma 55E7-79 que se deposito como Num. de Acceso FERM BP-11363.
(3) El anticuerpo monoclonal o fragmento de acuerdo con el apartado (2) anteriormente mencionado, en donde dicho anticuerpo es producido por el hibridoma 55E7-79 que se deposito como Num. de Acceso FERM BP- 11363.
(4) El anticuerpo monoclonal o fragmento de acuerdo con el apartado (1) anteriormente mencionado, que se produce por recombinacion genetica a partir del anticuerpo producido por el hibridoma de acuerdo con los apartados (2) o (3) anteriormente mencionados.
(5) El anticuerpo monoclonal o fragmento de acuerdo con el apartado (4) anteriormente mencionado, que es humanizado.
(6) El anticuerpo monoclonal o fragmento de acuerdo con los apartados (4) o (5) anteriormente mencionados, que se produce por ingeniena genetica utilizando un polinucleotido que codifica el anticuerpo.
(7) El anticuerpo monoclonal o fragmento de acuerdo con el apartado (1) anteriormente mencionado que comprende:
(A) una CDR1 de cadena pesada expuesta en el SEQ ID NO: 45, una CDR2 de cadena pesada expuesta en el SEQ ID NO: 46, una CDR3 de cadena pesada expuesta en el SEQ ID NO: 47, una CDR1 de cadena ligera expuesta en el SEQ ID NO: ID NO: 50, una CDr2 de cadena ligera expuesta en el SEQ ID NO: 51, y una CDR3 de cadena ligera expuesta en el SEQ ID NO: 52;
(B) una CDR1 de cadena pesada expuesta en el SEQ ID NO: 55, una CDR2 de cadena pesada expuesta
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en el SEQ ID NO: 56, una CDR3 de cadena pesada expuesta en el SEQ ID NO: 57, una CDR1 de cadena ligera expuesta en el SEQ ID NO: ID NO: 60, una CDR2 de cadena ligera presentada en el SEQ ID NO: 61, y una cDR3 de cadena ligera expuesta en el SEQ ID NO: 62;
(C) una CDR1 de cadena pesada expuesta en el SEQ ID NO: 65, una CDR2 de cadena pesada expuesta en el SEQ ID NO: 66, una CDR3 de cadena pesada expuesta en el SEQ ID NO: 67, una CDR1 de cadena ligera expuesta en el SEQ ID NO: ID NO: 70, una CDR2 de cadena ligera presentada en el SEQ ID NO: 71, y una cDR3 de cadena ligera expuesta en el SEQ ID NO: 72;
(D) una CDR1 de cadena pesada expuesta en el SEQ ID NO: 27, una CDR2 de cadena pesada expuesta en el SEQ ID NO: 28, una CDR3 de cadena pesada expuesta en el SEQ ID NO: 29, una CDR1 de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 32, una CDR2 de cadena ligera expuesta en el SEQ ID NO: 33, y una CDR3 de cadena ligera expuesta en el SEQ ID NO: 34;
(E) una region variable de cadena pesada expuesta en el SEQ ID NO: 44 y una region variable de cadena ligera expuesta en el SEQ ID NO: 49;
(F) una region variable de cadena pesada expuesta en el SEQ ID NO: 54 y una region variable de cadena ligera expuesta en el SEQ ID NO: 59;
(G) una region variable de cadena pesada expuesta en el SEQ ID NO: 64 y una region variable de cadena ligera expuesta en el SEQ ID NO: 69; o
(H) una region variable de cadena pesada expuesta en el SEQ ID NO: 26 y una region variable de cadena ligera expuesta en el SEQ ID NO: 31.
(8) El anticuerpo monoclonal o fragmento de acuerdo con el apartado (1) anteriormente mencionado, que esta quimerizado.
(9) El anticuerpo monoclonal o fragmento de acuerdo con el apartado (8) anteriormente mencionado que comprende:
(A) una cadena pesada expuesta en el SEQ ID NO: 92 y una cadena ligera expuesta en el SEQ ID NO: 94;
(B) una cadena pesada expuesta en el SEQ ID NO: 96 y una cadena ligera expuesta en el SEQ ID NO: 98;
(C) una cadena pesada expuesta en el SEQ ID NO: 100 y una cadena ligera expuesta en el SEQ ID NO: 102; o
(D) una cadena pesada expuesta en el SEQ ID NO: 36 y una cadena ligera expuesta en el SEQ ID NO: 38.
(10) Un hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal de acuerdo con el apartado (1) anteriormente mencionado.
(11) Un metodo para la produccion de una celula que produce un anticuerpo monoclonal de acuerdo con el apartado (1) anteriormente mencionado que comprende:
1) administrar una celula que expresa una protema exogena que incluye un dominio extracelular de PTPRS humana a un animal para inmunizar al animal con la celula y
2) seleccionar una celula productora de anticuerpos que produce un anticuerpo de acuerdo con el apartado
(I) anteriormente mencionado del animal inmunizado.
(12) El anticuerpo monoclonal o fragmento de acuerdo con el apartado (1) mencionado anteriormente, en donde dicho anticuerpo se puede obtener mediante las siguientes etapas:
1) administrar a un animal una celula que expresa exogenamente una protema que incluye un dominio extracelular de PTPRS humano para inmunizar al animal con la celula;
2) seleccionar una celula productora de anticuerpos que produce un anticuerpo que se une a PTPRS humana a partir de la celula productora de anticuerpos del animal inmunizado; y
3) cultivar la celula productora de anticuerpos seleccionada en el apartado (2), y recoger del cultivo un anticuerpo que reconoce la PTPRS humana, se une a una celula dendntica plasmocitoide y suprime la actividad de la celula dendntica plasmocitoide;
en donde la actividad de la celula dendntica plasmocitoide es la produccion de IFN y/o la supervivencia celular.
(13) El uso de un inmunogeno para la produccion del anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicacion 1, que comprende una celula animal que retiene exogenamente y expresablemente un polinucleotido que codifica una secuencia de aminoacidos que incluye un dominio extracelular de PTPRS humana o una fraccion de membrana celular de la misma.
(14) El uso de acuerdo con el apartado (13), anteriormente mencionado en donde la celula animal es una celula derivada de raton.
(15) Un metodo para la deteccion de una celula dendntica plasmocitoide, que comprende poner en contacto un anticuerpo monoclonal o un fragmento que incluye una region de union a antfgeno del mismo que se une a un dominio extracelular de PTPRS humana con una celula sujeto y detectar dicho anticuerpo monoclonal o fragmento que se ha unido a la celula.
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(16) El anticuerpo monoclonal o fragmento de acuerdo con cualquiera de los apartados (1) a (9) y (12) anteriormente mencionados para su uso en la deteccion de una celula dendntica plasmocitoide.
(17) Un metodo ex vivo para suprimir la actividad de una celula dendntica plasmocitoide, que comprende poner en contacto el anticuerpo monoclonal o un fragmento de acuerdo con cualquiera de los apartados (1) a (9) y (12) anteriormente mencionados con la celula dendntica plasmocitoide, en donde dicha actividad de la celula dendntica plasmocitoide es la produccion de IFN y/o la supervivencia celular.
(18) El anticuerpo monoclonal o fragmento de acuerdo con cualquiera de los apartados (1) a (9) y (12) anteriormente mencionados para su uso en el tratamiento del organismo humano o animal mediante terapia.
(19) El anticuerpo monoclonal o fragmento de acuerdo con cualquiera de los apartados (1) a (9) y (12)
anteriormente mencionados para uso en el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria en el que se
mejora la expresion de IFNalfa.
Efectos ventajosos de la invencion
La presente invencion proporciona un anticuerpo que reconoce espedficamente PTPRS humana, el uso de un
inmunogeno para la produccion del anticuerpo y un metodo para la produccion de una celula que produce el
anticuerpo anti-PTPRS humana. La PTPRS humana es una protema de membrana que pertenece a la familia RPTP. Los autores de la presente invencion aclararon que se puede obtener facilmente un anticuerpo que reconoce espedficamente la PTPRS humana. El anticuerpo anti-PTPRS humana que puede obtenerse mediante la presente invencion es un anticuerpo que tiene alta especificidad, que distingue pDC humana de celulas que expresan otras familias de RPTP.
El anticuerpo anti-PTPRS humana proporcionado por la presente invencion se une a un dominio extracelular de PTPRS humana en una pDC. Ademas, el anticuerpo de la presente invencion reconoce espedficamente pDC humana. Por lo tanto, es util para la deteccion y aislamiento de pDC. La pDC es una celula que produce la mayor parte del IFN de Tipo 1. Por lo tanto, su deteccion y aislamiento son importantes en los diagnosticos y estudios de enfermedades en las que esta implicada la pDC tales como las enfermedades autoinmunitarias.
Ademas, el anticuerpo anti-PTPRS humana proporcionado por la presente invencion tiene una accion para modular la actividad de pDC humana. Por lo tanto, el anticuerpo anti-PTPRS humana de la presente invencion puede utilizarse para suprimir la actividad de pDC. Por lo tanto, si se utiliza la supresion de la actividad de pDC que utiliza el anticuerpo de la presente invencion, puede esperarse un efecto terapeutico incluso en un paciente con una enfermedad autoinmunitaria en la que se ha mejorado la expresion de IFNa.
La pDC produce una gran cantidad de IFN con celulas pequenas. Para la neutralizacion de IFN, es necesario un anticuerpo correspondiente al numero molecular de IFN. Sin embargo, en la presente invencion, la actividad de la celula producida se suprime directamente. Como resultado, se puede esperar un efecto de supresion de IFN mas fuerte con una menor cantidad de anticuerpo en comparacion con la neutralizacion por un anticuerpo anti-IFN. Ademas, en el caso en que se produce persistentemente IFN, se espera que la neutralizacion del IFN por un anticuerpo se suprima solo transitoriamente, mientras que se suprime la actividad de pDC y por lo tanto se puede esperar un efecto de supresion de la produccion de IFN a largo plazo en la presente invencion.
Breve descripcion de los dibujos
La FIG. 1 es la secuencia de aminoacidos de PTPRS (SEQ ID NO: 1). La PTPRS es una protema de membrana de dominio transmembranal unico que tiene un dominio de tipo inmunoglobulina (dominio de tipo Ig) y un dominio de tipo a la fibronectina Tipo III en la region extracelular. Ademas, tiene dos regiones de protema tirosina fosfatasa (dominios PTP) en la region intracelular;
La FIG. 2 es un grafico que muestra los niveles de expresion relativos de PTPRS en diversas celulas inmunitarias. Se demostro que PTPRS se expresa de una manera espedfica de pDC;
La FIG. 3 es un grafico que muestra la comparacion de la expresion del gen PTPRS entre tejidos. El ARNm de PTPRS muestra una expresion relativamente alta en el bazo y el ovario, y tambien se expresa ampliamente en otros tejidos;
La FIG. 4 muestra la seleccion de la celula que expresa PTPRS humana (hPTPRS) mediante clasificacion FACS;
La FIG. 5 muestra el escrutinio mediante FACS de hibridomas utilizando celulas hPTPRS/D2SC/1 inmunizadas. Se obtuvieron trece hibridomas que producen un anticuerpo anti-hPTPRS;
La FIG. 6 muestra el escrutinio mediante FACS utilizando celulas CAL-1;
La FIG. 7 muestra el escrutinio mediante FACS utilizando pDC de sangre periferica humana;
La FIG. 8 es un grafico que muestra la homologfa de hPTPRS con otras PTPR. PTPRS pertenece a la familia PTPR, de la cual las secuencias de aminoacidos de varias moleculas familiares tienen una alta homologfa contra la secuencia de aminoacidos de PTPRS;
La FIG. 9 es el resultado del ensayo que muestra si los diez tipos de sobrenadantes de cultivo de celulas de hibridoma (2G6, 4B2, 2G2, 9H5, 10F7, 22H8, 49F2, 14A8, 55E7, 13G5) que reconocen PTPRS y producen un
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anticuerpo que se une espedficamente a pDC humanas se unen espedficamente solo a PTPRS (hPTPRE no se expresa en la superficie celular). Como resultado de ello, 2G6 mostro reactividad cruzada con PTPRF (Figura 9, D), y 4B2 mostro reactividad cruzada con PTPRD (Figura 9, C). Otros 9 tipos de anticuerpos mostraron union espedfica de PTPRS (Figura 9, A a D);
La FIG. 10 es el resultado del ensayo de reactividad cruzada del anticuerpo anti-PTPRS con un mono. Todos los sobrenadantes del cultivo celular de hibridoma se unen espedficamente al grupo de celulas pDC (Linaje CD 123+ HLA-DR+) de un mono cynomolgus;
La FIG. 11 muestra la clasificacion individualizada de los hibridomas. La clasificacion de celulas individuales se realizo utilizando FACS Aria (BD), y la celula D2SC/1 y la celula hPTPRS/D2SC/1 (A y B), la celula CAL-1 (C) y pDC humana (D) se tineron utilizando los sobrenadantes de cultivo celulares de los hibridomas, y se seleccionaron hibridomas individuales;
La FIG. 12 muestra las concentraciones de la endotoxina en los anticuerpos purificados obtenidos a partir de los sobrenadantes de cultivo de los hibridomas. Todas las concentraciones tuvieron el valor patron de 0,3 Eu/mg de Ab o menos;
La FIG. 13 es el resultado de ensayo de las capacidades de los anticuerpos purificados para unirse a PTPRS humana sobre la superficie celular. Se pudo confirmar que todos los anticuerpos manteman su capacidad de union;
La FIG. 14 muestra la union espedfica de los anticuerpos purificados a los grupos de celulas pDC (BDCA2+) de sangre periferica humana;
La FIG. 15 es el resultado de someter a ensayo si los anticuerpos anti-PTPRS humana se unen o no a PTPRS de raton. 49F2-30, 13G5-52, 13G5-57 y 22H8-84 se unieron a mPTPRS/CHO;
La FIG. 16 muestra las actividades citotoxicas dependientes del complemento de los anticuerpos anti-PTPRS frente a una celula que expresa hPTPRS. Se midieron las actividades citotoxicas dependientes del complemento de los anticuerpos anti-PTPRS contra PTPRS/CHO humano (Figura 16A) y PTPRS/CHO de raton (Figura 16B). Como resultado, 13G5-52 y 13G5-57 mostraron aproximadamente 20% de la actividad de CDC frente a la diana de PTPRS/CHO humano (A), mientras que 13G5-52 y 13G5-57 mostraron aproximadamente 100% de la actividad de CDC frente a la diana de raton PTPRS/CHO (B);
La FIG. 17 muestra que ch49F2-30 (Figura 17A), ch9H5-4, ch13G5-57 y ch22H8-84 (Figura 17B) de un anticuerpo quimerico anti-hPTPRS danan la celula hPTPRS/CHO diana de una forma dependiente del numero de celulas efectoras; y
La FIG. 18 muestra que la produccion de IFNa es completamente inhibida por el tratamiento del anticuerpo quimerico anti-PTPRS con ch49F2-30, ch9H5-4, ch13G5-57 y ch22H8-84 (Figura 18A), y se aclaro que la poblacion de pDC estaba disminuida mas que en el tratamiento con Synagis del anticuerpo de control (Figura 18B y Figura 18C).
Descripcion de las realizaciones
La PTPRS humana es una molecula cuya expresion espedfica se observa en una celula dendntica de tipo celula plasmatica pDC. Sin embargo, todavfa no se ha establecido ningun metodo para la produccion de un anticuerpo que reconozca la PTPRS humana.
Se conocen cuatro isoformas de PTPRS humana, que incluyen la isoforma 1 que consiste en 1.948 residuos de aminoacido, la isoforma 2 que consiste en 1.910 residuos de aminoacido, la isoforma 3 que consiste en 1.501 residuos de aminoacidos y la isoforma 4 que consiste en 1.505 residuos de aminoacidos. En sus estructuras, se observan tres dominios de tipo inmunoglobulina (primer dominio Ig, segundo dominio Ig y tercer dominio Ig), un dominio de tipo fibronectina Tipo III, un dominio transmembrana (dominio transmembrana, region TM) como estructuras extracelulares y dos dominios fosfatasa (Dominios D1 y D2) como estructuras intracelulares. Solo el dominio D1 que esta cerca de la membrana celular tiene actividad de protema tirosina fosfatasa (PTP). En la Fig. 1, los peptidos senal y los dominios tfpicos estan marcados en la secuencia de aminoacidos.
La isoforma 3 de la PTPRS humana es una protema que penetra la membrana que incluye de 831 a 851 del SEQ ID NO: 1 (Figura 1) como dominio transmembrana. De los 1.501 residuos de aminoacidos que incluyen el extremo N terminal, 29 residuos de aminoacidos (1 a 29 en el SEQ ID NO: 1) constituyen una secuencia senal y 30 a 830 constituyen un dominio extracelular. Por otra parte, el lado C-terminal es un dominio intracelular. Se considera que los ligandos en el entorno extracelular controlan la actividad en PTPRS.
Los autores de la presente invencion han confirmado mediante un analisis de expresion genica que la PTPRS humana se expresa espedficamente en pDC humana. Consideraron que, si se puede obtener un anticuerpo que pueda distinguir la PTPRS humana de otras moleculas, esto sena util para los estudios de pDC. Sin embargo, hay muchas moleculas que tienen estructuras similares en la familia PTP incluyendo PTPRS humana. Las moleculas tales como PTPRS que son RPTP-a y PTPRA (RPTP-a), PTPRD (RPTP-5), PTPRE (RPTP-£, PTPRF (RPTP-Z) incluyen espedficamente una secuencia de aminoacidos que tiene alta homologfa (Figura 8). Por lo tanto, consideraron que sena diffcil obtener un anticuerpo que pudiera diferenciar estas moleculas entre sf utilizando un peptido de dominio utilizando la secuencia parcial de una secuencia de aminoacidos que constituye un dominio
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extracelular como inmunogeno. Por lo tanto, los autores de la presente invencion intentaron obtener un anticuerpo contra la PTPRS humana utilizando una celula que expresa la PTPRS humana como inmunogeno.
Los autores de la presente invencion han realizado estudios intensivos para obtener un anticuerpo que reconoce la PTPRS humana y aclararon que el anticuerpo objetivo se puede obtener utilizando una celula transformadora espedfica como inmunogeno y completando la presente invencion. A saber, la presente invencion se refiere a un anticuerpo monoclonal que se une a un dominio extracelular de PTPRS humana, o un fragmento que incluye una region de union a antigeno del mismo.
En la presente invencion, la PTPRS humana puede definirse como una molecula natural que se expresa en pDC humana, o una molecula que es inmunologicamente equivalente a PTPRS humana que se expresa en pDC humana. En la presente invencion, se puede confirmar que el anticuerpo se une a PTPRS humana, por ejemplo, como sigue.
- Confirmacion basada en la reactividad con celulas humanas:
De acuerdo con el hallazgo obtenido por los autores de la presente invencion, se considera que la PTPRS humana puede utilizarse como un marcador para pDC puesto que se observa la expresion espedfica de pDC humana.
Basandose en dicho perfil de expresion de la PTPRS humana, en primer lugar, la actividad de pDC de unirse a al menos una parte del subconjunto es una de las caractensticas importantes del anticuerpo que se une a la PTPRS humana en la presente invencion. Que una cierta celula es pDC se puede confirmar mediante un marcador de superficie celular que es inherente a cada grupo celular. Por ejemplo, la union a la celula objetivo se confirma por tincion doble con un anticuerpo que se une a un marcador de superficie celular y un anticuerpo cuya actividad de union ha de ser confirmada. A saber, la pDC en la presente invencion incluye, por ejemplo, una celula que expresa BDCA2.
- Confirmacion basada en la reactividad con la celula transformadora que expresa el gen de PTPRS humana:
Los autores de la presente invencion han confirmado que, cuando se expresa un gen de PTPRS humana en una afeccion espedfica, se reconstituyen las caractensticas inmunologicas de la PTPRS humana expresada en la pDC humana. Por lo tanto, la reactividad con PTPRS humana se puede confirmar basandose en la reactividad de un anticuerpo contra una celula en la que se ha introducido artificialmente un gen que codifica la PTPRS humana. A saber, la presente invencion se refiere a un anticuerpo monoclonal que se une a una molecula que incluye una secuencia de aminoacidos que constituye un dominio extracelular de PTPRS humana como dominio extracelular, o un fragmento que incluye una de sus regiones de union a antfgeno. Mientras tanto, el dominio extracelular esta constituido por la secuencia de aminoacidos correspondiente a 30 a 830 en el SEQ ID NO: 1 (Figura 1) a partir del extremo N terminal de la secuencia de aminoacidos mostrada en el SEQ ID NO: 1.
Por ejemplo, en una celula que se ha transformado con un vector de expresion que incluye un ADN que codifica la PTPRS humana, se mantienen las caractensticas inmunologicas de PTPRS que se expresan en pDC humana. Por lo tanto, es preferible una celula transformante que expresa PTPRS humana como celula para confirmar la propiedad de union del anticuerpo frente a un dominio extracelular de PTPRS humana en la presente invencion. Cuando la reactividad del anticuerpo se confirma mediante una celula transformante en la presente invencion, es deseable utilizar una celula que no se ha transformado como control.
A continuacion, el anticuerpo que se une a la PTPRS humana en la presente invencion puede ser un anticuerpo cuya reactividad cruzada con un grupo de celulas que se sabe que expresa la familia pTp distinta de la PTPRs humana se observa o no se observa. El anticuerpo cuya reactividad cruzada no se observa es preferible como anticuerpo que se une a la PTPRS humana en la presente invencion. Espedficamente, un anticuerpo cuya union con un grupo de celulas que se sabe que expresa una familia de PTP distinta de PTPRS humana en la misma condicion que la condicion bajo la cual se ha confirmado la union a pDC es preferible como anticuerpo que se une a PTPRS humana en la presente invencion .
A saber, un anticuerpo monoclonal que se une a un dominio extracelular de PTPRS humana en la presente invencion incluye preferiblemente un anticuerpo monoclonal que tiene las siguientes caractensticas inmunologicas.
a) se une a pDC humana,
b) bajo la condicion en la que se une a la pDC humana, su union a una clase o clases multiples seleccionadas del grupo que consiste en un monocito, un macrofago, una celula B y una celula CD34 positiva, y las celulas dendnticas derivadas de estas celulas, no puede confirmarse.
Espedficamente, es preferible como anticuerpo monoclonal de la presente invencion un anticuerpo cuya union a una clase o clases multiples seleccionadas del grupo que consiste en un monocito, un macrofago, una celula B y una celula CD34 positiva, y celulas dendnticas derivadas de estas celulas no puede ser confirmada bajo la condicion en
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la que el anticuerpo se une a pDC humana.
Alternativamente, el anticuerpo monoclonal que se une al dominio extracelular de PTPRS humana en la presente invencion incluye preferiblemente un anticuerpo monoclonal que tiene las siguientes caractensticas inmunologicas.
c) se une a una celula transformante que se ha transformado con un vector de expresion que conserva expresamente un ADN que codifica PTPRs humana,
d) bajo la condicion de union a la celula transformada en c), la union a una retiene antes de la transformacion en c) no puede ser confirmada.
En la presente invencion, que el anticuerpo monoclonal anti-PTPRS humana no reacciona de forma cruzada con otras moleculas en la familia PTP puede confirmarse utilizando una celula en la que cada familia PTP ha sido expresada de manera forzada. Es decir, un ADNc que codifica una secuencia de aminoacidos de cada familia PTP se expresa de manera forzada introduciendolo en una celula anfitriona adecuada. Un anticuerpo monoclonal anti- PTPRS humana cuya reactividad cruzada ha de ser confirmada se pone en contacto con la celula transformante obtenida. A continuacion, si no se observa la union a una celula que expresa otra molecula de la familia PTP distinta de la PTPRS humana, puede confirmarse que el anticuerpo puede distinguir inmunologicamente la PTPRS humana de otra molecula de la familia PTP. Por ejemplo, en los Ejemplos mencionados a continuacion, se confirmo que la mayona de los anticuerpos monoclonales anti-PTPRS humanas obtenidos por la presente invencion no reaccionaban de forma cruzada con PTPRA, PTPRD y PTPRF que teman espedficamente alta homologfa con PTPRS. Por lo tanto, un anticuerpo monoclonal que se une a PTPRS humana y cuya union a PTPRA, PTPRD y PTPRF en las mismas condiciones no se detecta es un anticuerpo monoclonal preferible en la presente invencion. Si se utiliza un anticuerpo que puede distinguir inmunologicamente estas moleculas de PTP de PTPRS, el cambio en la expresion de PTPRS se puede detectar espedficamente. Ademas, se demostro que, entre las moleculas que tienen alta homologfa con PTPRS, la expresion de PTPRE puede confirmarse en una celula pero PTPRE no se expresa fuera de la celula. Por lo tanto, no se une a PTPRE como anticuerpo.
La union entre un anticuerpo monoclonal cuya actividad de union ha de ser confirmada y varias celulas puede confirmarse, por ejemplo, mediante el principio de citometna de flujo. Con el fin de confirmar la reactividad del anticuerpo mediante el principio de citometna de flujo, es ventajoso marcar el anticuerpo de antemano con una molecula o grupo atomico que genera una senal detectable. Generalmente, se utiliza una marca de fluorescencia o una marca de emision de luz. Con el fin de analizar la union entre un anticuerpo marcado con fluorescencia y una celula mediante el principio de citometna de flujo, se puede utilizar un clasificador de celulas activado por fluorescencia (FACS). Utilizando el FACS, la union entre multiples anticuerpos y celulas se puede confirmar eficazmente.
Espedficamente, por ejemplo, un anticuerpo A que se ha clarificado de antemano para poder identificar pDC, y un anticuerpo B cuya propiedad para unirse a pDC se va a analizar se hacen reaccionar simultaneamente con un grupo de celulas que incluye pDC. El anticuerpo A y el anticuerpo B estan marcados con senales de fluorescencia que pueden distinguirse entre sf de antemano. Si se detectan las dos senales en el mismo grupo celular, se puede confirmar que dichos anticuerpos se unen al mismo grupo celular. A saber, se puede encontrar que el anticuerpo A y el anticuerpo B tienen la misma propiedad de union. Si se unen a diferentes grupos de celulas, es evidente que sus propiedades de union son diferentes.
Ejemplos del anticuerpo monoclonal preferible en la presente invencion pueden incluir un anticuerpo monoclonal producido por los hibridomas 9H5-4, 10F7-38, 13G5-52, 13G5-57, 14A8-85, 22H8-84, 49F2-30 o 55E7-79.
Los hibridomas 9H5-4, 10F7-38, 13G5-52, 13G5-57, 14A8-85, 22H8-84, 49F2-30 y 55E7-79 se depositaron como Numeros de acceso FERM BP-11356, FERM BP-11357, FERM BP-11358, FERM BP-11359, FERM BP-11360, FERM BP-11361, FERM BP-11362 y FERM BP-11363 respectivamente, en el International Patent Organism Depositary (IPOD), National Institute of Technology and Evaluation el 1 de abril de 2011. A continuacion se describira el contenido para especificar el deposito.
(a) Nombre de la organizacion depositaria: International Patent Organism Depositary (IPOD), National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
Direccion: Tsukuba Central 6. 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki 305-8566, Japon
(b) Fecha de la deposicion: 1 de abril de 2011
(c) Num. de acceso FERM BP-11356 (hibridoma 9H5-4)
(c) Num. de acceso FERM: BP-11357 (hibridoma 10F7-38)
(c) Num. de acceso FERM BP-11358 (hibridoma 13G5-52)
(c) Num. de acceso FERM BP-11359 (hibridoma 13G5-57)
(c) Num. de Acceso FERM BP-11360 (hibridoma 14A8-85)
(c) Num. de Acceso FERM BP-11361 (hibridoma 22H8-84)
(c) Num. de acceso FERM BP-11362 (hibridoma 49F2-30)
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(c) Num. de acceso FERM BP-11363 (hibridoma 55E7-79)
El anticuerpo monoclonal de la presente invencion puede ser un fragmento que incluye una region de union a antigeno del mismo. Por ejemplo, tambien se puede utilizar como anticuerpo en la presente invencion un fragmento de anticuerpo que incluye un sitio de union a antfgeno que se genera por digestion enzimatica de IgG. Espedficamente, se puede obtener un fragmento de anticuerpo tal como Fab o F(ab')2 por digestion con papama o pepsina. Es bien conocido que estos fragmentos de anticuerpo pueden utilizarse como moleculas de anticuerpo que tienen afinidad de union por un antigeno. Alternativamente, mientras se mantenga la actividad de union al antfgeno necesaria, tambien se puede utilizar un anticuerpo construido por el gen recombinante. Algunos ejemplos del anticuerpo construido mediante recombinacion genica pueden incluir anticuerpos quimericos, anticuerpos con CDR transplantada, Fv de cadena sencilla, diacuerpos, anticuerpos lineales y anticuerpos multiespedficos que se forman a partir de fragmentos de anticuerpo. Se conocen metodos para obtener estos anticuerpos basados en anticuerpos monoclonales o celulas productoras de anticuerpos que producen los anticuerpos monoclonales.
El anticuerpo monoclonal de la presente invencion puede obtenerse utilizando una celula transformante espedfica como inmunogeno. A saber, la presente invencion se refiere a un metodo para la produccion de una celula que produce un anticuerpo monoclonal que se une a un dominio extracelular de PTPRS humana sobre una celula dendntica plasmocitoide y suprime la produccion de IFN por, y/o la supervivencia de, la celula cuyo metodo comprende:
(1) administrar una celula que expresa una protema exogena que incluye un dominio extracelular de PTPRS humana a un animal para inmunizar al animal con la celula y
(2) seleccionar una celula productora de anticuerpos que produce el anticuerpo monoclonal que se une a un dominio extracelular de PTPRS humana sobre una celula dendntica plasmocitoide y suprime la produccion de IFN por, y/o la supervivencia de, la celula del animal inmunizado.
Mediante el cultivo de la celula productora de anticuerpos asf obtenida o de la celula productora de anticuerpos que ha sido inmortalizada, el anticuerpo monoclonal objetivo puede recogerse del cultivo. Se conocen varios metodos para el metodo para inmortalizar la celula productora de anticuerpos.
La celula transformante que se usa como inmunogeno en la presente invencion se puede obtener, por ejemplo, preparando la siguiente celula que conserva de manera expresable un polinucleotido exogeno (a) que codifica una secuencia de aminoacidos que incluye un dominio extracelular de PTPRS humana.
En la presente invencion, el polinucleotido exogeno se refiere a que el polinucleotido se ha introducido artificialmente en una celula anfitriona. En el caso en que se utiliza una celula humana como celula, se introduce un gen humano en una celula humana. Tambien en tal combinacion, el polinucleotido introducido artificialmente se denomina polinucleotido exogeno. Por lo tanto, la expresion ectopica de PTPRS humana esta incluida en la expresion del polinucleotido exogeno.
En la presente invencion, el dominio extracelular de la PTPRS humana se refiere a la secuencia de aminoacidos desde las posiciones 30 a 830 que corresponden al dominio extracelular de la secuencia de aminoacidos descrita en el SEQ ID NO: 1. Por ejemplo, una secuencia de aminoacidos que incluye las regiones respectivas en el orden desde el lado del extremo N terminal mencionado a continuacion es preferible como secuencia de aminoacidos que incluye un dominio extracelular de PTPRS humana en la presente invencion.
[Secuencia senal + dominio extracelular + dominio transmembrana + region intracelular]
Alternativamente, una secuencia de aminoacidos que carece parcialmente de regiones intracelulares siguiente tambien esta incluida en la secuencia de aminoacidos que incluye un dominio extracelular de PTPRS humana en la presente invencion.
[Secuencia senal + dominio extracelular + dominio transmembrana + parte de la region intracelular]
Ademas, una estructura que carece de una region intracelular siguiente esta tambien incluida en la secuencia de aminoacidos que incluye un dominio extracelular de PTPRS humana en la presente invencion.
[Secuencia senal + dominio extracelular + dominio transmembrana]
En las estructuras mencionadas anteriormente, las regiones distintas del dominio extracelular pueden tener una secuencia seleccionada de la secuencia de aminoacidos mostrada en el SEQ ID NO: 1, o pueden incluir otra secuencia homologa de aminoacidos combinada. Por ejemplo, una secuencia de aminoacidos que constituye una secuencia senal, un dominio transmembrana y una region intracelular puede ser una secuencia de aminoacidos de moleculas de la familia PTP distintas de PTPRS humana. Alternativamente, se puede combinar una secuencia de
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aminoacidos de una familia PTP de una especie distinta de la humana. Ademas, las secuencias de aminoacidos que constituyen las regiones distintas del dominio extracelular pueden incluir mutacion en la medida en que se puedan mantener las funciones de las regiones respectivas. Ademas, puede interponerse otra region entre las regiones respectivas. Por ejemplo, puede insertarse una etiqueta epitopica tal como FLAG entre la secuencia senal y el dominio extracelular. Espedficamente, la secuencia senal es una region que se traduce a protema, se procesa en la etapa de transferencia a la superficie de una membrana celular y se elimina. Por lo tanto, se puede utilizar como secuencia senal cualquier secuencia de aminoacidos que induzca el paso de la membrana celular de la protema traducida. Mas espedficamente, la secuencia de aminoacidos de PTPRS humana (SEQ ID NO: 1) es preferible como secuencia de aminoacidos que incluye un dominio extracelular de PTPRS humana.
Por lo tanto, para el polinucleotido que constituye el apartado (a) anteriormente mencionado en la presente invencion, se puede utilizar cualquier secuencia de bases que codifica una secuencia de aminoacidos que constituye la estructura mencionada anteriormente [secuencia senal + dominio extracelular + dominio transmembrana + region intracelular]. Por ejemplo, la secuencia de aminoacidos del SEQ ID NO: 1 esta codificada por la secuencia de bases descrita en el SEQ ID NO: 2.
En la presente invencion, con el fin de obtener una celula transformante que se use como inmunogeno, solo es necesario introducir un vector de expresion en el que el polinucleotido (a) mencionado anteriormente se mantenga de manera expresable en una celula anfitriona adecuada.
La celula anfitriona en la presente invencion es preferiblemente una celula de mairnfero. Espedficamente, se puede utilizar como celula anfitriona una celula derivada de un ser humano, un mono, un raton o una rata. Espedficamente, la celula anfitriona es preferiblemente una celula derivada de raton. Una celula HEK-293T es una lmea celular de rinon derivada de embrion humano, que puede utilizarse como celula anfitriona en la presente invencion. Una celula HEK-293T esta disponible como ATCC CRL-11268. Las celulas derivadas del animal que se debe inmunizar tambien pueden utilizarse como celulas anfitrionas. Cuando se utiliza como un inmunogeno una celula derivada de un animal que se debe inmunizar, la respuesta inmunitaria contra la celula anfitriona es pequena. Por lo tanto, se puede obtener eficazmente un anticuerpo contra un dominio extracelular de PTPRS humana que se expresa exogenamente. Por lo tanto, por ejemplo, cuando se usa un raton como animal a inmunizar, tambien se puede utilizar una celula derivada de raton como celula anfitriona.
El polinucleotido anteriormente mencionado puede transformarse en una celula montando el polinucleotido en un vector que puede inducir la expresion en una celula anfitriona. Se puede utilizar un vector disponible comercialmente que pueda inducir la expresion en una celula de mai^ero. En la presente invencion se pueden utilizar vectores de expresion tales como vector el pCMV-Script (R), el vector pSG5 (fabricado por Stratagene) y pcDNA3.1 (fabricado por Invitrogen).
La celula transformante asf obtenida se administra a un animal para inmunizar al animal, junto con componentes adicionales tales como un coadyuvante segun sea necesario. Como coadyuvante, se puede utilizar el coadyuvante completo de Freund. En el caso en que se utiliza un raton como animal inmunizado, la celula transformante puede administrarse a partir de 104 a 109 celulas, mas espedficamente a partir de 104 a 106 celulas. En general, el inmunogeno se administra varias veces a intervalos hasta que aumenta el tttulo de anticuerpos. Por ejemplo, en el caso de un proceso de inmunizacion de corta duracion, la celula transformante puede administrarse a intervalos de 2 a 4 dfas, espedficamente 3 dfas, y la celula productora de anticuerpos puede recogerse despues de 2 a 3 penodos de administracion. Alternativamente, la celula productora de anticuerpos puede recogerse despues de 5 a 6 penodos de administracion a intervalos de aproximadamente una vez por semana.
En la presente invencion, la celula productora de anticuerpos recogida se clona para obtener un anticuerpo monoclonal. Es preferible que la clonacion immortalize la celula productora de anticuerpos. Por ejemplo, se puede utilizar un procedimiento de fusion de celulas tal como un procedimiento de hibridoma, o transformacion por virus de Epstein-Barr (EBV) como procedimiento para la inmortalizacion de la celula productora de anticuerpos.
En la celula productora de anticuerpos, una celula produce un tipo de anticuerpo. Por lo tanto, si puede establecerse un grupo celular derivado de una celula (es decir, clonacion), se puede obtener un anticuerpo monoclonal. El procedimiento de hibridoma se refiere a un procedimiento en el que una celula productora de anticuerpos se fusiona con una cepa celular adecuada, inmortalizada y clonada. La celula productora de anticuerpos inmortalizada puede clonarse mediante una tecnica tal como un metodo de dilucion limitante. Se conocen muchas cepas celulares que son utiles para el procedimiento del hibridoma. Estas cepas celulares tienen diversos marcadores geneticos que tienen excelente la eficacia de inmortalizacion de una celula basada en linfocitos y necesarios para la seleccion de una celula que ha tenido exito en la fusion celular. Ademas, en el caso en el que se pretende obtener una celula productora de anticuerpos, tambien se puede utilizar una cepa celular que carece de capacidad productora de anticuerpos.
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ampliamente como cepas celulares que son utiles en procesos de fusion celular en ratones y ratas. En general, se prepara un hibridoma fusionando celulas homologas, pero se puede obtener un anticuerpo monoclonal a partir de heterohibridomas heterologos estrechamente relacionados.
Se conoce un protocolo espedfico de fusion celular. A saber, una celula productora de anticuerpos de un animal inmunizado se mezcla con un companero de fusion adecuado para efectuar la fusion celular. Para la celula productora de anticuerpos, por ejemplo, se usa una celula de bazo, una celula de linfocito recogida de un ganglio linfatico y una celula B de sangre periferica. Como companero de fusion, pueden utilizarse diversas cepas celulares que se han mencionado anteriormente. Para la fusion celular, se utiliza un procedimiento de polietilenglicol o un procedimiento de fusion electrica.
A continuacion, la celula que ha tenido exito en la fusion celular se selecciona basandose en un marcador de seleccion posefdo por la celula de fusion. Por ejemplo, en el caso en que se usa una cepa celular sensible a HAT para la fusion celular, la celula que ha tenido exito en la fusion celular se selecciona seleccionando la celula que crece en un medio HAT. Ademas, se confirma que el anticuerpo producido por la celula seleccionada tiene la reactividad deseada.
Cada hibridoma se selecciona basandose en la reactividad del anticuerpo. A saber, un hibridoma que produce un anticuerpo que se une a PTPRS humana se selecciona mediante el procedimiento mencionado anteriormente. Preferiblemente, el hibridoma seleccionado se subclona y, en el caso en que finalmente se confirma la produccion del anticuerpo objetivo, se selecciona como un hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal de la presente invencion.
Espedficamente, el hibridoma objetivo puede seleccionarse en base a la reactividad con una celula humana o a la reactividad con una celula transformante que expresa el gen de PTPRS humana. El anticuerpo que se une a la celula se puede detectar por el principio de un inmunoensayo. Por ejemplo, se puede utilizar ELISA que utiliza una celula como antfgeno para la deteccion del anticuerpo objetivo. Espedficamente, un sobrenadante de cultivo de un hibridoma se pone en contacto con un soporte sobre el cual se fija la pDC humana, o una celula transformante utilizada como inmunogeno. En el caso en que el sobrenadante del cultivo incluye el anticuerpo objetivo, el anticuerpo es capturado por la celula fijada sobre el soporte. A continuacion, la fase solida se separa del sobrenadante del cultivo y se lava segun sea necesario, con lo que se puede detectar el anticuerpo capturado en la fase solida. Para la deteccion del anticuerpo se puede utilizar un anticuerpo que reconoce el anticuerpo. Por ejemplo, se puede detectar un anticuerpo de raton mediante un anticuerpo de inmunoglobulina anti-raton. Si se marca de antemano un anticuerpo que reconoce el anticuerpo, su deteccion es facil. Como marcador, por ejemplo, se puede utilizar una enzima, un pigmento fluorescente o un pigmento de emision de luz.
Por otra parte, como el soporte para fijar la celda, se pueden utilizar partfculas, o una pared interior de una placa de microtitulacion. La celula puede ser fijada por adsorcion ffsica sobre la superficie de las partfculas o un recipiente elaborado de plastico. Por ejemplo, se pueden utilizar cuentas o un recipiente de reaccion de poliestireno como soporte para fijar la celula.
En la seleccion de un hibridoma, se espera la produccion de un anticuerpo contra PTPRS no humana, pero en algunos casos se espera la celula anfitriona de la celula transformante utilizada para el inmunogeno. Por ejemplo, como se muestra en los Ejemplos, cuando se utiliza una celula humana como inmunogeno y se utiliza un raton como animal a inmunizar, la celula humana se reconoce como una sustancia extrana y se espera la produccion de un anticuerpo que se una a ella. La presente invencion tiene por objeto obtener un anticuerpo que reconozca PTPRS humana. Por lo tanto, no es necesario obtener un anticuerpo que reconozca un antfgeno celular humano distinto de PTPRS humana. Con el fin de excluir un hibridoma que produzca tal anticuerpo mediante escrutinio, se puede absorber de antemano un anticuerpo no deseado antes de la confirmacion de la reactividad del anticuerpo.
El anticuerpo no deseado puede ser absorbido por un antfgeno al que se une un anticuerpo cuya presencia se espera. Espedficamente, por ejemplo, los anticuerpos contra antfgenos de celulas humanas distintos de la PTPRS humana pueden ser absorbidos por celulas en las que la expresion de PTPRS humana no puede ser detectada. En la presente invencion, la celula anfitriona utilizada como inmunogeno es preferible como antfgeno para absorber el anticuerpo no deseado.
Cuando sea necesario, se confirma el efecto real sobre la actividad de la pDC del anticuerpo monoclonal cuya actividad de union frente al antfgeno ha sido confirmada. El efecto sobre la pDC puede ser confirmado, por ejemplo, por medio del metodo que se menciona a continuacion.
El anticuerpo monoclonal de la presente invencion puede recogerse de un cultivo obtenido cultivando un hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal. El hibridoma se puede cultivar in vitro o in vivo. El hibridoma se puede cultivar in vitro utilizando un medio conocido tal como RPMI1640. En el sobrenadante del cultivo, se acumula una inmunoglobulina secretada por el hibridoma. Por lo tanto, el anticuerpo monoclonal de la presente invencion se
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puede obtener recogiendo el sobrenadante de cultivo y purificando segun sea necesario. La purificacion de la inmunoglobulina es mas facil en el caso en que no se anade suero al medio. Sin embargo, para propositos de proliferacion mas rapida del hibridoma y aceleracion de la produccion del anticuerpo, se puede anadir al medio aproximadamente 10% de suero bovino fetal.
El hibridoma tambien puede cultivarse in vivo. Espedficamente, inoculando el hibridoma en la cavidad abdominal de un raton atimico, el hibridoma puede cultivarse en la cavidad abdominal. El anticuerpo monoclonal se acumula en el lfquido asdtico. Por lo tanto, se puede obtener un anticuerpo monoclonal deseado recolectando el fluido de ascitis y purificando segun sea necesario. El anticuerpo monoclonal obtenido puede ser adecuadamente modificado o procesado de acuerdo con el proposito.
El anticuerpo monoclonal de la presente invencion puede expresarse obteniendo ADNc que codifica una region de union al antigeno del anticuerpo del hibridoma e insertandolo en un vector de expresion adecuado. Se conoce una tecnica para obtener un ADNc que codifica una region variable de un anticuerpo y que se expresa en una celula anfitriona adecuada. Ademas, tambien se conoce una tecnica para unir una region variable que incluye una region de union al antfgeno a una region constante para formar un anticuerpo quimerico.
Por ejemplo, como anticuerpo monoclonal preferible en la presente invencion, se puede representar un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma 9H5-4 que se deposito como Num. de Acceso FERM BP-11356, el hibridoma 10F7-38 que se deposito como Num. de Acceso FERM BP-11357, el hibridoma 13G5-52 que se deposito como Num. de Acceso FERM BP-11358, el hibridoma 13G5-57 que se deposito como Num. de Acceso FErM BP-11359, el hibridoma 14A8-85 que se deposito como Num. de Acceso FERM BP-11360, el hibridoma 22H8 -84 que se deposito como Num. de Acceso FERM BP-11361, el hibridoma 49F2-30 que se deposito como Num. de Acceso FERM BP-11362 o el hibridoma 55E7-79 que se deposito como Num. de Acceso FErM BP-11363.
Como anticuerpo quimerico que incluye una region variable, o anticuerpo humanizado al que se ha trasplantado CDR que constituye una region variable, un anticuerpo que tiene una region constante derivada de IgG o IgM esta incluido en el anticuerpo preferible en la presente invencion. Los autores de la presente invencion han confirmado que un anticuerpo monoclonal contra PTPRS tiene una accion de CDC contra la celula que expresa PTPRS. Por lo tanto, el anticuerpo que tiene una region constante derivada de IgG o IgM tiene una accion citotoxica contra una celula que expresa PTPRS por la accion de CDC. Tal anticuerpo es util para suprimir el numero de celulas de la celula que expresa PTPRS tal como pDC.
El anticuerpo quimerico que reconoce la PTPRS humana o el anticuerpo humanizado pueden producirse mediante ingeniena genica utilizando un polinucleotido que codifica el anticuerpo.
Ya han pasado aproximadamente cuatro anos desde que se aclaro la estructura de la PTPRS humana en el documento WO2007/041317 (documento JP2009-510102A); Sin embargo, todavfa no se ha obtenido un anticuerpo que pueda reconocer espedficamente la PTPRS humana. Un anticuerpo que reconoce la PTPRS humana fue proporcionado primero por el inmunogeno de la presente invencion. A saber, la presente invencion proporciona un anticuerpo que se une a un dominio extracelular de PTPRS humana en una pDC y suprime la produccion de IFN por, y/o la supervivencia de, la celula, que puede obtenerse mediante los siguientes procedimientos:
(1) administrar a un animal una celula que expresa exogenamente una protema que incluye un dominio extracelular de PTPRS humana para inmunizar al animal con la celula;
(2) seleccionar una celula productora de anticuerpos que produce un anticuerpo que se une a PTPRS humana a partir de la celula productora de anticuerpos del animal inmunizado; y
(3) cultivar la celula productora de anticuerpos seleccionada en el apartado (2), y recoger del cultivo un anticuerpo que reconoce PTPRS humana, se une a una pDC y suprime la actividad de la pDC;
en donde la actividad de la pDC es la produccion de IFN y/o la supervivencia celular.
Se aclaro que la PTPRS humana se expresa espedficamente en la pDC humana. La expresion espedfica en pDC humana tambien se confirmo en el analisis de expresion genica mediante SAGE por parte de los autores de la presente invencion. Sin embargo, en los informes anteriores, el nivel de expresion de la PTPRS humana se analizo sobre la base del ARNm en todos los casos. Puesto que no se proporciono un anticuerpo mediante el cual se habilitaba la deteccion de PTPRS humana, el estado de expresion de una protema no se analizo en el pasado. El anticuerpo que se une a un dominio extracelular de PTPRS humana, que fue proporcionado por la presente invencion, realizo el analisis de una protema PTPRS humana.
De acuerdo con la confirmacion real por parte de los autores de la presente invencion, el anticuerpo monoclonal que se une a un dominio extracelular de PTPRS humana basado en la presente invencion detecto espedficamente pDC humana. A saber, la presente invencion se refiere a un metodo ex vivo para la deteccion de una celula dendntica plasmocitoide, que incluye poner en contacto un anticuerpo monoclonal o un fragmento que incluye una region de
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union a antfgeno del mismo que se une a un dominio extracelular de PTPRS humana con una celula sujeto y detectar dicho anticuerpo monoclonal o fragmento que se ha unido a la celula.
Mediante la deteccion de la PTPRS humana basandose en la presente invencion, puede confirmarse si una determinada celula es pDC o no. A saber, la presente invencion proporciona un metodo para la identificacion de pDC utilizando PTPRS humana como mdice. Alternativamente, la pDC humana se puede separar separando la celula en la que se ha detectado la PTPRS humana de acuerdo con la presente invencion. A saber, la presente descripcion proporciona un metodo para la separacion de pDC utilizando PTPRS humana como mdice.
En la presente invencion, se puede marcar de antemano un anticuerpo monoclonal que se une a un dominio extracelular de PTPRS humana, o un fragmento que incluye una region de union a antfgeno del mismo. Por ejemplo, el anticuerpo se puede detectar facilmente marcando con un pigmento de emision de luz o un pigmento de fluorescencia. Mas espedficamente, un anticuerpo marcado con pigmento de fluorescencia se pone en contacto con un agregado de celulas que posiblemente incluye pDC, por lo que se puede detectar una celula a la que se ha unido el anticuerpo de la presente invencion utilizando el pigmento de fluorescencia como mdice. Ademas, si la celula en la que se ha detectado el pigmento de fluorescencia esta separada, se puede separar la pDC. La serie de procedimientos se puede llevar a cabo facilmente por el principio de FACS.
Alternativamente, el anticuerpo de la presente invencion se puede unir de antemano a un soporte en fase solida, tal como partmulas magneticas. El anticuerpo unido al soporte en fase solida reconoce la PTPRS humana, y la pDC es capturada por el soporte de fase solida. Como resultado, la pDC puede ser detectada y separada.
El anticuerpo requerido para la deteccion de pDC basandose en la presente invencion puede suministrarse como un agente para detectar la pDC. A saber, la presente invencion proporciona un anticuerpo monoclonal o un fragmento que incluye una region de union a antfgeno del mismo que se une a un dominio extracelular de PTPRS humana en una pDC y suprime la produccion de IFN por, y/o la supervivencia de, la celula, para su uso en la deteccion de una pDC. Para el agente para detectar pDC, ademas del anticuerpo, se puede combinar un control positivo o un control negativo. Por ejemplo, la celula transformante que expresa un dominio extracelular de PTPRs humana, que se utilizo como un inmunogeno, o la pDC recogida de un ser humano se pueden utilizar como control positivo. Generalmente, la pDC humana se puede obtener solo en poca cantidad a partir de sangre periferica. Por lo tanto, la celula transformante es espedficamente preferible como control positivo en el agente de la presente invencion. Por otra parte, cualquier celula que no exprese PTPRS humana puede ser utilizada para el control negativo.
A saber, la presente descripcion proporciona un kit para detectar pDC humana, que incluye un anticuerpo monoclonal que se une a un dominio extracelular de PTPRS humana, o un fragmento que incluye una region de union a antfgeno del mismo.
Ademas, los autores de la presente invencion han analizado el efecto del anticuerpo que se une a un dominio extracelular de PTPRS humana en la pDC. Como resultado, han confirmado que el anticuerpo que se une a un dominio extracelular de PTPRS humana suprime la actividad de la pDC. A saber, la presente descripcion se refiere a un metodo para suprimir la actividad de una celula productora de interferon, que incluye poner en contacto cualquiera de los siguientes componentes con la pDC:
(a) un anticuerpo monoclonal que se une a PTPRS humana para suprimir la actividad de pDC, o un fragmento que incluye una region de union a antfgeno del mismo, y
(b) una inmunoglobulina a la que se ha trasplantado una region determinante de complementariedad del anticuerpo monoclonal de (a), o un fragmento que incluye una region de union a antfgeno del mismo.
Alternativamente, la presente descripcion se refiere a un metodo para suprimir la actividad de pDC en un organismo vivo, que incluye administrar cualquiera de los siguientes componentes al organismo vivo:
(a) un anticuerpo monoclonal que se une a PTPRS humana para suprimir la actividad de pDC, o un fragmento que incluye una region de union a antfgeno del mismo,
(b) una inmunoglobulina a la que se ha trasplantado una region determinante de complementariedad del anticuerpo monoclonal de (a), o un fragmento que incluye una region de union a antfgeno del mismo, y
(c) un polinucleotido que codifica el componente descrito en (a) o (b).
En la presente descripcion, pDC se refiere a una celula que tiene una capacidad para producir IFN, y expresa PTPRS humana sobre una superficie celular. A continuacion, a menos que se indique lo contrario, la pDC abarca no solo una celula que es una celula precursora de una celula dendntica sino tambien una celula que tiene capacidad para producir IFN y expresa PTPRs humana sobre una superficie celular. Se conoce un metodo para identificar dicha pDC. Por ejemplo, la pDC se puede distinguir de otras celulas sangumeas utilizando varios marcadores de superficie celular como indices. Espedficamente, el perfil del marcador de superficie celular de pDC humana es el siguiente (Shortman, K. y Liu, YJ, Nature Reviews 2: 151-161, 2002). Tambien se informo en los ultimos anos de que
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la celula positiva para BDCA-2 se posiciona como pDC (Dzionek, A. et al. J. Immunol. 165: 6037-6046, 2000).
[Perfil de antigeno de superficie celular de pDC humana]
CD4 positivo, CD 123 positivo, Linaje (CD3, CD14, CD16, CD19, CD20, CD56) negativo, CD11c negativo
Por lo tanto, una celula que tiene el perfil de expresion de estos marcadores conocidos y que tiene asimismo capacidad para producir IFN tambien se puede denominar pDC. Ademas, incluso un grupo de celulas que tienen un perfil que es diferente del patron de expresion del perfil de expresion de estos marcadores, una celula en un organismo vivo que tiene capacidad para producir IFN, las celulas estan incluidas en las pDC.
Ademas, como caractensticas que se observan comunmente en la pDC humana, se pueden mostrar las siguientes caractensticas.
[Caractensticas en forma de celula]
• se parece a una celula de plasmatica.
• es una celula redonda que tiene una superficie celular lisa.
• tiene un nucleo relativamente grande. [Caractensticas funcionales de la celula]
• produce una gran cantidad de IFN de Tipo I en un corto penodo de tiempo durante la infeccion viral.
• se diferencia para proporcionar una celula dendntica despues de la infeccion viral.
En la presente descripcion, la supresion de la actividad de pDC se refiere a la supresion de al menos una funcion posefda por pDC. Como funciones de pDC, se puede mostrar la produccion de iFn y la supervivencia celular. En otras palabras, puede decirse que la supervivencia celular es un numero de celulas. Por lo tanto, la supresion de una o ambas funciones se refiere a la supresion de la actividad de pDC. Se aclaro que el IFN de Tipo I producido por pDC causa diversas enfermedades. Por lo tanto, es util suprimir el numero de celulas de pDC y la produccion de IFN como estrategias terapeuticas para esas enfermedades.
Por ejemplo, se senalo una relacion entre las condiciones patologicas de las enfermedades autoinmunitarias y el IFNa. La mayor parte del IFNa es producido por pDC. Por lo tanto, si se suprime su produccion, se pueden aliviar las condiciones patologicas acarreadas por IFNa. Mientras tanto, en la presente invencion, la supresion de la produccion de IFN por pDC se refiere a la supresion de la produccion de al menos un tipo de IFN entre los IFN producidos por pDC. Los IFN de Tipo I son IFN preferibles en la presente invencion. Entre ellos, el IFNa es importante.
A saber, la presente descripcion se refiere a un agente para suprimir la produccion de IFN, que incluye un anticuerpo que se une a un dominio extracelular de PTPRS humana como ingrediente activo. Alternativamente, la presente descripcion proporciona un metodo para suprimir la produccion de IFN, que incluye administrar un anticuerpo que se une a un dominio extracelular de PTPRS humana. Ademas, la presente descripcion se refiere al uso de un anticuerpo que se une a un dominio extracelular de PTPRS humana en la produccion de una composicion farmaceutica para suprimir la produccion de IFN.
La pDC incluye una celula que produce una gran cantidad de IFN por un pequeno numero de celulas. Por ejemplo, una celula precursora de una celula dendntica que ha sido estimulada, por ejemplo, por un virus, produce la mayor parte del IFN producido por un organismo vivo. La supresion del numero de celulas de pDC que produce una gran cantidad de IFN conduce consecuentemente a la supresion de la cantidad de produccion de IFN. Por lo tanto, las condiciones patologicas acarreadas por IFNa tambien pueden aliviarse suprimiendo el numero de celulas de pDC.
En una realizacion preferible de la presente invencion, se confirmo que un anticuerpo monoclonal anti-PTPRS humana se une a una celula que expresa PTPRS humana e imparte una accion citotoxica mediante una accion de CDC (Citotoxicidad Dependiente del Complemento). La accion de CDC es uno de los mecanismos de accion importantes en los medicamentos de anticuerpos. El anticuerpo monoclonal anti-PTPRS humana de la presente invencion tambien tiene una fuerte accion citotoxica contra celulas que expresan PTPRS humana tales como pDC por la accion de CDC de las mismas. A saber, puede esperarse tambien un efecto de supresion de la produccion de IFN por una accion citotoxica contra pDC ademas del mecanismo de supresion de la produccion de IFN en una realizacion preferible.
El anticuerpo que reconoce un dominio extracelular de PTPRS humana usado en la presente invencion se puede obtener basandose en el metodo mencionado anteriormente. El anticuerpo en la presente invencion puede ser de cualquier clase. Ademas, la especie del organismo de la que se obtiene el anticuerpo tampoco esta limitada. Ademas, puede utilizarse como anticuerpo un fragmento que incluye una region de union al antfgeno del anticuerpo. Por ejemplo, tambien se puede utilizar como anticuerpo en la presente invencion un fragmento de anticuerpo que incluye un sitio de union a antfgeno que se genera por digestion enzimatica de IgG. Espedficamente, se puede obtener un fragmento de anticuerpo tal como Fab o F(ab')2 por digestion con papama o pepsina. Es bien sabido que
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estos fragmentos de anticuerpos pueden utilizarse como moleculas de anticuerpo que tienen afinidad de union con antigenos. Alternativamente, tambien puede utilizarse un anticuerpo construido por recombinacion genica mientras mantenga la actividad de union al antigeno necesaria. Los ejemplos del anticuerpo construido por recombinacion genica pueden incluir anticuerpos quimericos, anticuerpos de trasplante de CDR, Fv de cadena sencilla, diacuerpos y anticuerpos lineales, y anticuerpos multiespedficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo. Se conocen metodos para obtener estos anticuerpos basados en anticuerpos monoclonales.
En la presente invencion, el anticuerpo se puede modificar segun sea necesario. De acuerdo con la presente invencion, un anticuerpo que reconoce un dominio extracelular de PTPRS humana tiene una accion para suprimir la actividad de pDC. Es decir, se considero la posibilidad de que el propio anticuerpo tenga una accion citotoxica contra pDC. Se conoce la subclase del anticuerpo que muestra una accion efectora fuerte. Alternativamente, mediante la modificacion del anticuerpo con una sustancia citotoxica (un agente citotoxico), se puede mejorar adicionalmente el efecto de supresion de la actividad de pDC. Algunos ejemplos de la sustancia citotoxica pueden incluir las siguientes sustancias.
Toxinas: Endotoxina de Pseudomonas (PE), difteria Lisina
Elementos radioisotopicos: Tc99m, Sr89, I131, Y90 Agentes anticancerosos: caliqueamicina, mitomicina, paclitaxel
Las toxinas compuestas de una protema pueden unirse, por ejemplo, a un anticuerpo o a un fragmento del mismo mediante un agente bifuncional. Alternativamente, un gen que codifica toxinas puede unirse a un gen que codifica un anticuerpo para proporcionar una protema de fusion de los dos genes. Tambien se conoce un metodo para unir un elemento radioisotopico a un anticuerpo. Por ejemplo, se conoce un metodo para marcar un anticuerpo con un elemento radioisotopico utilizando un agente quelante. Ademas, un agente anticanceroso puede unirse a un anticuerpo utilizando una cadena de azucar o un agente bifuncional.
En la presente invencion, tambien se puede utilizar como ingrediente activo un anticuerpo cuya estructura se ha modificado artificialmente. Por ejemplo, se conocen diversos metodos de modificacion para mejorar la accion citotoxica y la estabilidad de un anticuerpo. Espedficamente, se conoce una inmunoglobulina en la que se ha modificado una cadena de azucar de una cadena pesada (Shinkawa, T. et al., J. Biol. Chem 278:3466-3473. 2003.). Mediante la modificacion de la cadena de azucar, se aumento la actividad ADCC (Citotoxicidad Mediada por Celulas Dependiente de Anticuerpos) de la inmunoglobulina.
Cuando el anticuerpo que se une a un dominio extracelular de PTPRS humana se pone en contacto con pDC, su actividad se suprime. Por lo tanto, estos anticuerpos se pueden utilizar como un agente o metodo para suprimir la actividad de pDC. A saber, la presente descripcion proporciona un agente para suprimir la actividad de pDC, que incluye al menos un tipo de componente seleccionado del grupo que consiste en los siguientes apartados (a)-(b) como ingrediente activo. Alternativamente, la presente descripcion se refiere a un metodo para suprimir la actividad de pDC, que incluye administrar al menos un tipo de componente seleccionado del grupo que consiste en los siguientes apartados (a)-(b). Ademas, la presente descripcion se refiere al uso del componente seleccionado del grupo que consiste en los siguientes apartados (a)-(b) en la produccion de un agente para suprimir la actividad de pDC.
(a) Un anticuerpo que se une a un dominio extracelular de PTPRS humana, o un fragmento que incluye una region de union a antfgeno del mismo, y
(b) Una inmunoglobulina a la que se ha trasplantado una region determinante de complementariedad del anticuerpo monoclonal de (a), o un fragmento que incluye una region de union a antfgeno del mismo.
En la presente invencion, como anticuerpo monoclonal que suprime la actividad de pDC, puede utilizarse un anticuerpo monoclonal que reconoce un dominio extracelular de PTPRS humana. En la presente invencion, pueden utilizarse una clase o varias clases de anticuerpo monoclonal. Por ejemplo, se pueden incorporar y utilizar en la presente invencion diversos tipos de anticuerpos monoclonales que reconocen un dominio extracelular de PTPRS humana.
El hecho de que un anticuerpo tenga una accion de supresion de la actividad productora de IFN de pDC puede confirmarse de la siguiente manera. La pDC produce una gran cantidad de IFN mediante la estimulacion de un virus. Proporcionando un anticuerpo antes o despues de la estimulacion con el virus contra pDC, o simultaneamente con la estimulacion con el virus, y utilizando pDC a la que no se proporciona el anticuerpo como control, se comparan las capacidades de produccion de IFN. Las capacidades de produccion de IFN se pueden evaluar midiendo IFN-a e IFN-p incluidos en el sobrenadante de cultivo de pDC. Como resultado de la comparacion, cuando la cantidad de IFN en el sobrenadante disminuye significativamente mediante la adicion del anticuerpo, puede confirmarse que el anticuerpo sometido a ensayo tiene una accion de supresion de la capacidad de producir iFn. Se conoce un metodo
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para medir estos IFN. La pDC es una celula que produce la mayona de los IFN en un organismo vivo. Por lo tanto, mediante la supresion de la capacidad de produccion de IFN de pDC, se puede modular el estado de produccion de IFN en un organismo vivo.
En la presente invencion, la actividad de pDC incluye el mantenimiento del numero de celulas de pDC. Por lo tanto, la supresion de la actividad de pDC en la presente invencion incluye la supresion del numero de celulas de pDC. Si se confirma que el numero de celulas de pDC esta suprimido en presencia de un anticuerpo, se comprueba que el anticuerpo suprime la actividad de pDC. Como control para comparacion, se puede utilizar una inmunoglobulina inerte derivada de la misma especie animal que la de un anticuerpo cuya actividad se va a confirmar, como en la produccion de IFN. El numero de celulas de pDC se puede comparar cuantitativamente contando el numero de la celula. El numero de celulas puede ser contado mediante FACS o mediante un microscopio.
Ademas, tambien se considera que pDC se diferencia para proporcionar una celula que induce Th2 denominada DC2 (Celula Dendntica 2) como resultado de la infeccion, por ejemplo, con un virus. Si la produccion de IFN de pDC por estimulacion con un virus puede ser suprimida, tambien es posible que la diferenciacion para proporcionar Th2 pueda ser suprimida. Por lo tanto, se pueden esperar efectos terapeuticos sobre diversas enfermedades alergicas para el anticuerpo monoclonal de la presente invencion que suprime la produccion de IFN.
En el caso en el que el anticuerpo que reconoce un dominio extracelular de PTPRS humana se administra a un anfitrion que es diferente de una especie de organismo de la que se obtiene el anticuerpo, es deseable procesar el anticuerpo a una forma que apenas sea reconocida como una sustancia extrana para el anfitrion. Por ejemplo, mediante la transformacion en las siguientes moleculas, la inmunoglobulina puede llegar a ser diffcil de reconocer como una sustancia extrana. Se conoce la tecnica para procesar una molecula de inmunoglobulina de la siguiente manera.
- Un fragmento que incluye una region de union al antfgeno que carece de una region constante (Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, tercera edicion, Academic Press Limited. 1995; Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996)
- Un anticuerpo quimerico que esta constituido por una region de union al antfgeno de un anticuerpo monoclonal y una region constante de una inmunoglobulina de un anfitrion (Experimental Manual for Gene Expression, Kodansha Ltd., 1994 (editado por Isao Ishida y Tamie Ando))
- Un anticuerpo con CDR sustituida obtenido mediante la sustitucion de una region determinante de complementariedad (CDR) en una inmunoglobulina de un anfitrion por una CDR de un anticuerpo monoclonal (Experimental Manual for Gene Expression, Kodansha Ltd., 1994 (editado por Isao Ishida y Tamie Ando)).
Alternativamente, se puede adquirir un gen de la region variable de inmunoglobulina de un ser humano mediante un procedimiento de presentacion de fagos (McCafferty J. et al., Nature 348: 552-554, 1990; Kretzschmar T et. Al., Curr Opin Biotechnol dic 2002: 13 (6): 598-602.). En el procedimiento de presentacion en fagos, se incorpora un gen que codifica una region variable de inmunoglobulina humana a un gen del fago. Se puede preparar una biblioteca de fagos utilizando varios genes de inmunoglobulina como fuentes. Un fago expresa la region variable como una protema de fusion de una protema que constituye el propio fago. La region variable en la superficie del fago, que es expresada por el fago, mantiene la actividad de union con el antfgeno. Por lo tanto, seleccionando un fago que se une a una celula que ha expresado un antfgeno, puede escrutar un fago que ha expresado una region variable que tiene una actividad de union pretendida a partir de una biblioteca de fagos. Ademas, se conserva un gen que codifica una region variable que tiene una actividad de union deseada en las partmulas de fago escrutadas de esta manera. A saber, en el procedimiento de presentacion de fagos, se puede adquirir un gen que codifica una region variable que tiene una actividad de union pretendida utilizando la actividad de union de la region variable como mdice.
En el agente o procedimiento para suprimir la actividad de pDC, el anticuerpo que reconoce un dominio extracelular de PTPRS humana o un fragmento de anticuerpo que incluye al menos una region de union a antfgeno del mismo se puede administrar como una protema o un polinucleotido que codifica la protema. Con el fin de administrar el polinucleotido, es deseable utilizar un vector en el que se ha dispuesto un polinucleotido que codifica una protema pretendida bajo el control de un promotor adecuado de modo que se pueda expresar una protema pretendida. Tambien se puede disponer un potenciador o terminador en el vector. Se conoce un vector que puede retener genes de una cadena pesada y una cadena ligera que constituyen la inmunoglobulina y que pueden expresar una molecula de inmunoglobulina. El vector que puede expresar una inmunoglobulina puede administrarse introduciendolo en una celula. En la administracion a un organismo vivo, un vector que puede ser transmitido a una celula mediante la administracion al organismo vivo se puede administrar tal cual. Alternativamente, se puede introducir un vector en un linfocito que ha sido separado una vez de un organismo vivo y despues devolver al organismo vivo (ex vivo).
En el agente o procedimiento para suprimir la actividad de pDC, la cantidad del anticuerpo monoclonal que se va a administrar a un organismo vivo como una inmunoglobulina es generalmente de 0,5 mg a 100 mg, por ejemplo de 1 mg a 50 mg, preferiblemente de 2 mg a 10 mg, por 1 Kg de peso corporal. Los intervalos de administracion del
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anticuerpo a un organismo vivo pueden modularse adecuadamente de modo que se pueda mantener la concentracion efectiva de la inmunoglobulina en un organismo vivo durante un penodo terapeutico. Espedficamente, el anticuerpo se puede administrar a intervalos de 1 a 2 semanas. La v^a de administracion es opcional. Un experto en la tecnica puede seleccionar adecuadamente una via de administracion eficaz para una terapia. Espedficamente, se puede mostrar la administracion oral o parenteral. Por ejemplo, el anticuerpo puede administrarse sistematicamente o topicamente por inyeccion intravenosa, inyeccion intramuscular, inyeccion peritoneal o inyeccion subcutanea. Los ejemplos de formulaciones que son adecuadas para la administracion parenteral pueden incluir un agente de inyeccion, un supositorio y un aerosol. Ademas, cuando se proporciona el anticuerpo a una celula, se proporciona una inmunoglobulina generalmente de 1 pg/mL, preferiblemente 10 pg/mL o mas, mas preferiblemente 50 pg/mL o mas, aun mas preferiblemente 0,5 mg/mL o mas.
En el agente o metodo para suprimir la actividad de pDC, el anticuerpo monoclonal puede administrarse a un organismo vivo por medio de cualquier metodo. Generalmente, el anticuerpo monoclonal se combina con un portador farmaceuticamente aceptable. Cuando sea necesario, se pueden incorporar al anticuerpo monoclonal aditivos tales como un agente espesante, un estabilizante, un agente antiseptico y un solubilizante. Algunos ejemplos de dicho portador o aditivo pueden incluir lactosa, acido dtrico, acido estearico, estearato de magnesio, sacarosa, almidon, talco, gelatina, agar, aceites vegetales y etilenglicol. El termino "farmaceuticamente aceptable" se refiere a haber sido aceptado por el supervisor del gobierno de cada pafs, o estar listado en la farmacopea de cada pafs o una farmacopea generalmente reconocida con respecto al uso en animales, mairnferos y espedficamente en seres humanos. El agente para suprimir la actividad de pDC puede proporcionarse en forma de un polvo o comprimido liofilizado que incluye una dosis o dosis plurales. El polvo o comprimido liofilizado se puede combinar adicionalmente con agua esterilizada para inyectables, solucion salina fisiologica o tampon para disolver la composicion para proporcionar una concentracion deseada antes de la administracion.
Ademas, cuando se administra en forma de un vector que expresa una inmunoglobulina, cada plasmido se puede administrar de 0,1 a 10 mg, por ejemplo de 1 a 5 mg por 1 kg de peso corporal, considerando que una cadena pesada y una cadena ligera son co-transfectadas como plasmidos separados. Ademas, para introducir en una celula in vitro, se utiliza un vector de 1 a 5 pg/106 celulas.
A continuacion, la presente invencion se explicara mas espedficamente con referencia a los Ejemplos, pero la presente invencion no se considera limitada por los Ejemplos.
Ejemplos
Ejemplo 1
A. Analisis de la expresion de PTPRS A-1) Analisis utilizando la biblioteca SAGE
Las expresiones de un gen en monocitos humanos, pDC y pDC tratados con virus del herpes simple (HSV) se compararon y analizaron mediante un procedimiento SAGE™ (Analisis en Serie de la Expresion Genica). El metodo de analisis es el siguiente.
Se aislo un monocito como una celula positiva para CD14 y se separo pDC como una celula positiva para BDCA-4 a partir de celulas mononucleares de sangre periferica humana mediante un clasificador de celulas. Ademas, la pDC se cultivo en presencia de HSV durante 12 horas para preparar pDC activada. Se obtuvieron los ARN de las respectivas celulas, y se preparo una biblioteca SAGE utilizando un kit I-SAGE™ (Invitrogen). Los datos de la secuencia de bases obtenidos de aproximadamente 100.000 etiquetas se analizaron mediante SAGE Analysis Software (Invitrogen). Como resultado, puesto que un gen que tiene un valor de puntuacion de monocito/pDC/pDC+HSV de 0/7/0, es decir, un gen que muestra expresion espedfica de pDC, se encontro un gen conocido: PTPRS (GenBank Acc # NM_002856.3). La PTPRS esta codificada por la secuencia de bases mostrada en el SEQ ID NO: 2. Ademas, es un unico dominio transmembrana que tiene un dominio de tipo inmunoglobulina (dominio de tipo Ig) y un dominio de tipo Fibronectina de tipo III en la region extracelular. Ademas, tiene dos regiones de protema tirosina fosfatasa (dominios PTP) en la region intracelular (FIG. 1).
A-2) Analisis de la expresion de ARNm de PTPRS en diversas celulas competentes inmunes humanas mediante RT- PCR cuantitativa
La expresion de PTPRS en celulas inmunitarias se analizo con mas detalle. Cada celula se aislo de sangre periferica humana mediante un clasificador de celulas. El ARN se extrajo de la poblacion celular aislada, y se sintetizo el ADNc. Utilizando el ADNc obtenido como molde, se llevo a cabo la RT-PCR cuantitativa de acuerdo con un procedimiento general para analizar el nivel de expresion del ARNm de PTPRS. Por normalizacion con el nivel de expresion de un gen GAPDH (gliceraldetndo-3-fosfato deshidrogenasa) que se sabe que se expresa
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constantemente, se comparo la expresion del gen PTPRS entre celulas inmunitarias.
Las secuencias de base de los cebadores utilizados y las condiciones para la PCR son las siguientes.
Cebador directo para PTPRS: 5' CAC GGC CTA TGA CCT CCA 3' (SEQ ID NO: 3)
Cebador inverso para PTPRS: 5' AAG TTC TTG GGC GAG ACT TG 3' (SEQ ID NO: 4)
Cebador directo para GAPDH: 5' CCA CCC ATG GCAAAT TCC 3' (SEQ ID NO: 5)
Cebador inverso para GAPDH: 5' TGG GAT TTC CAT TGA TGA CAA G 3' (SEQ ID NO: 6)
1 Ciclo a 50°C durante 2 minutos,
1 Ciclo a 95°C durante 10 minutos, y
50 Ciclos [a 95°C durante 15 segundos y a 60°C durante 60 segundos].
Se analizaron un monocito, pDC, pDC estimulada con HSV, una celula B (celula CD19+), una celula T (celula CD3+), una celula T activada estimulada con PMA (12-miristato 13-acetato de Forbol) y una NK (Celula CD56+), y se demostro que la PTPRS se expresaba en una forma espedfica de pDC. Ademas, se encontro como caractenstica que la expresion de PTPRS es disminuida por la pDC estimulada con HSV (FIG. 2).
A-3) Analisis de la expresion del ARNm de PTPRS en tejido humano mediante RT-PCR cuantitativa
Ademas, la expresion en tejidos se estudio mediante PCR cuantitativa utilizando ABI PRISM 7000 (Applied Biosystem). Como paneles de ADNc, el panel de ADNc de tejido multiple BD™ MTC (Humano I; Num. de Cat. 636742, Inmune humano; Num. de cat. 636748. Fracciones de sangre humana; Num. de cat. 636750; todos de Becton Dickinson). A continuacion se muestran las secuencias de bases de los cebadores utilizados.
Cebador directo para PTPRS: 5' ACT CAC CCA CAC CCT ACAAGA 3' (SEQ ID NO: 7)
Cabador inverso para PTPRS: 5' CTT GGT GGT ACG GCC ATC 3' (SEQ ID NO: 8)
Cebador directo para GAPDH: 5' CCA CCC ATG GCAAAT TCC 3' (SEQ ID NO: 5)
Cebador inverso para GAPDH: 5' TGG GAT TTC CAT TGA TGA CAA G 3' (SEQ ID NO: 6)
Utilizando un kit de mezcla maestro de PCR SYBR green (Applied Biosystem), se llevo a cabo la PCR mediante ABI PRISM 7000 disponible en la misma comparua. Para el analisis se utilizo el Soporte Logico del Sistema de Deteccion de Secuencias disponible de la misma comparua. Las condiciones de reaccion son las siguientes.
Etapa 1: 1 ciclo a 50°C durante 2 minutos Etapa 2: 1 ciclo a 95°C durante 10 minutos
Etapa 3: 40 ciclos a 95°C durante 15 segundos y a 60°C durante 1 minuto
Mediante normalizacion con el nivel de expresion de un gen GAPDH (gliceraldehndo-3-fosfato deshidrogenasa) que se sabe que se expresa constantemente, se comparo la expresion del gen PTPRS entre tejidos. Como resultado, el ARNm de PTPRS se expreso ampliamente en los tejidos (FIG. 3).
B. Preparacion del vector de expresion de PTPRS
Con el fin de expresar una protema PTPRS, se llevo a cabo la preparacion de un vector de expresion de un gen PTPRS. Unicamente se extrajo un gen de PTPRS de un clon de ADNc de PTPRS que se habfa incorporado en un vector de clonacion pCR4-TOPO (Open Biosystem Num. cc MHS1010-98052887) y se incorporo en un vector de expresion pcDNA3.1 (PTPRS/pcDNA3.1). Utilizando el plasmido PTPRS/pcDNA3.1 obtenido como molde, se amplifico el gen de PTPRS con un cebador que inclrna EcoRI, Not I y la secuencia de Kozak (GCC GCC ACC) (a continuacion se muestra la informacion sobre el cebador). El producto de PCR se clono en un vector retroviral pMX- IP en sitios EcoRI y Not I (PTPRS/pMX-IP). Para la reaccion de PCR, se utilizo una unidad de ADN polimerasa KOD Plus (TOYOBO) y las condiciones de reaccion fueron 1 ciclo a 94°C durante 2 minutos y 25 ciclos [a 94°C, 15 segundos y a 68°C durante 4 Minutos y 30 segundos].
Cebador directo (SEQ ID NO: 9): 5' aaa GAA TTC gcc gcc acc ATG GCG CCC ACC TGG GGC CCT3'
Cebador inverso (SEQ ID NO: 10): 5' aaa gcg gcc gcT TAG GTT GCA TAG TGG TCAAAG C3'
En las secuencias de bases mencionadas anteriormente, los caracteres pequenos representan los sitios de escision de la enzima de restriccion EcoRI o los sitios de Not I. La aaa en el extremo 5' es una base adicional para la escision enzimatica.
C. Preparacion de celulas que expresan PTPRS humana (hPTPRS)
Para producir un retrovirus que contiene el gen de PTPRS, la celula HEK-293T que es una cepa de celulas renales de un embrion humano se transfecto transitoriamente con PTPRS/pMX-IP y un vector de empaquetamiento del
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retrovirus PCL-ECO mediante el kit FuGENE (Roche). Dos dfas despues, se recogio el sobrenadante del cultivo celular en el que se recogio un virus que inclma un gen hPTPRS y se infecto con una celula D2SC/1 que es una celula dendntica derivada del bazo de un raton BALB/c (este se preparo basandose en Paglia et al., J. Exp. Med., 178, 1893-1901 (1993)). Dado que el vector retroviral pMX-IP incluye un gen de resistencia a la puromicina, solo se hace posible que sobreviva una celula que expresa hPTPRS cultivando la celula D2SC/1 infectada con puromicina, por lo que se hace posible la seleccion. Las celulas D2SC/1 que expresan hPTPRS se seleccionaron mediante clasificacion FACS y se cultivaron. Con el fin de confirmar la expresion de hPTPRS, se anadieron 10 pg/ml de IgG de cabra (SantaCruz) y un anticuerpo policlonal hPTPRS comercialmente disponible (pAb; R&D) a las celulas hPTPRS/D2SC/1 seleccionadas por 100 pl de cada, y la mezcla se incubo a 4°C durante 30 minutos. La celula se lavo con PBS y despues se anadio un anticuerpo anti-IgG de cabra marcado con FITC (SantaCruz) diluido 100 veces por 50 pl y la mezcla se incubo a 4°C durante 30 minutos. Despues de lavar con PBS, los datos fueron importados por FACSCalibur (BD) (FIG. 4).
Ejemplo 2
A. Preparacion de anticuerpo monoclonal anti-PTPRS humana A-1) Inmunizacion
Como celula utilizada como inmunogeno, se utilizo la celula hPTPRS/D2SC/1 mencionada anteriormente. Se anestesiaron ratones BALB/c y se inyecto una emulsion de Adyuvante Completo de Freund (CFA) por via subcutanea a las almohadillas en 50 pl por pie. El total fue de 100pl/raton. Al dfa siguiente, se preparo una emulsion utilizando una celula hPTPRS/D2SC/1 preparada como inmunogeno y un Coadyuvante Incompleto de Freund (IFA) y se inyecto subcutaneamente a las almohadillas (50 pl/pie, 100 pl/raton total). La inmunizacion se realizo cada dos dfas durante tres veces en total, y los ganglios linfaticos retirados se recogieron a los 3 dfas despues de la ultima inmunizacion.
A-2) Fusion celular
Las celulas de los ganglios linfaticos retirados se recogieron de los dos pies de un raton inmunizado y se mezclaron con una celula de mieloma de raton P3-X63-Ag8.563 que se habfa cultivado en un medio RPMI1640 (SIGMA) incluyendo FBS al 10% de modo que la proporcion de celulas de los ganglios linfaticos y celulas de mieloma se convirtio en 5:4, y las celulas se recogieron por centrifugacion. Se anadio PEG1500 (Roche) a las celulas mixtas para la fusion celular. La celula fusionada (hibridoma) se lavo y cultivo en Suero Bovino Fetal al 10% (FBS) incluyendo un suplemento de crecimiento celular+medio HAT (Sigma)-RPMI1640 (incluyendo 2 mM de L-Glutamina, 100 unidades/ml de Penicilina, 100 pg/ml de Estreptomicina, HEPES 10 mM, Piruvato Sodico 1 mM, 2-ME 50 pM).
A-3) Escrutinio FACS de hibridomas utilizando celulas hPTPRS/D2SC/1 inmunizadas
Un anti-CD16/32 (2,4G2) preparado a 2,5 pg/ml se anadio por 50 pl a 3 * 105/pocillo de la celula D2SC/1 o hPTPRS/D2SC/1 para bloquear un receptor FC. Despues de lavar con PBS, se anadieron una IgG de cabra preparada a 10 pg/ml, un pAb anti-hPTPRS comercialmente disponible (R&D), una IgG2ak de raton (BioLegend) y el sobrenadante de cultivo del hibridoma cultivado por 60 pl de cada, y la mezcla se incubo a 4°C durante 60 minutos. Despues de lavar con PBS, se anadio a las celulas un anticuerpo anti-IgG de cabra marcado con FITC diluido 50 veces, marcado con FITC y un anticuerpo de IgG anti-raton marcado con PE (BD), diluido 100 veces, por 50 pl de cada y la mezcla se incubo a 4°C durante 30 minutos bajo proteccion contra la luz. Despues de lavar con PBS, la celula se suspendio en 200 pl de PBS. Los datos fueron recogidos mediante FACS Calibur (BD). Los datos recogidos fueron desarrollados por parcelas de puntos de FSC y SSC para seleccionar "to gate" una celula viva. Los datos se recogieron hasta que los datos de la celula en esta ventana de analisis "gate" alcanzaron el recuento de 2.000. Como resultado, se pueden obtener 13 hibridomas que producen un anticuerpo anti-hPTPRS (2G6, 28G10, 4B2, 2G2, 9H5, 10F7, 22H8, 49F2, 9D2, 14A8, 55E7, 13G5, 16H2) (FIG. 5).
A-4) Escrutinio mediante FACS utilizando celulas CAL-1
Se tineron 3 * 105 celulas CAL-1 de una cepa celular de tipo pDC humana en 50 pl del sobrenadante de cultivo del hibridoma mencionado anteriormente durante 15 minutos a 4°C. Las celulas se lavaron una vez con tampon FACS (FBS + PBS al 1%) y despues se centrifugaron para eliminar el sobrenadante. A continuacion se hicieron reaccionar 2 pg/ml de un anticuerpo anti-IgG de raton marcado con PE a 4°C durante 20 minutos. Las celulas se lavaron una vez con un tampon FACS y se centrifugaron. El sedimento celular se volvio a suspender mediante un tampon FACS y se analizo mediante Calibur. Como resultado, 2G6, 4B2, 2G2, 9H5, 10F7, 22H8, 49F2, 14A8, 55E7, 13G5 y 16H2 en el sobrenadante de cultivo de hibridoma reaccionaron bien con CAL-1. Por otra parte, 28G10 y 9D2 reaccionaron poco (FIG. 6).
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[Aislamiento de PBMC humanas]
Se recogieron 20 ml de sangre periferica de un ser humano sano y se aislaron celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) mediante centrifugacion por gravedad espedfica utilizando HISTOPAQUE-1077 (SIGMA). Se tineron con cada muestra 1 * 106 PBMC. Las celulas se lavaron con un tampon FACS, se anadio un reactivo de bloqueo de Fc (Miltenyi) por 25 jl mediante dilucion 1:5 y se realizo una reaccion a 4°C durante 15 minutos. Despues de lavar con un tampon FACS, se anadieron 50 jl del sobrenadante del cultivo celular de cada hibridoma, 10 jg/ml de una IgG de cabra, un pAb anti-hPTPRS y una IgG2a,K de raton y se realizo una reaccion a 4°C durante 20 minutos. Despues de lavar con un tampon FACS, se anadieron 8 jg/ml de un anticuerpo anti-IgG de cabra marcado con FITC o 2 jg/ml de un anticuerpo anti-IgG de raton marcado con PE y se realizo una reaccion a 4°C durante 20 minutos. Despues de lavar con un tampon FACS, se hicieron reaccionar 50 jl de un anticuerpo anti- BDCA2 marcado con APC mediante dilucion 1:10 a 4°C durante 20 minutos. Despues de lavar con un tampon FACS, la celula se resuspendio en 300 jl de un tampon FACS y se analizo mediante FACS Calibur. Como resultado, 2G6, 28G10, 4B2, 2G2, 9H5, 10F7, 22H8, 49F2, 14A8, 55E7 y 13G5 mostraron una reaccion de union espedfica para la poblacion de celulas pDC. 9D2 mostro union a pDC, y tambien mostro reacciones con el grupo celular distinto de pDC (BDCA2-). 16El H2 no mostro una reaccion para las PBMC (FIG. 7).
Ensayo sobre la especificidad del anticuerpo anti-PTPRS
La PTPRS pertenece a la familia PTPR y las secuencias de aminoacidos de las diversas moleculas familiares de la misma tienen una alta homologfa frente a la secuencia de aminoacidos de PTPRS (FIG. 8).
A-6) Se examino si las 10 clases de sobrenadantes de cultivos celulares de hibridoma que generan un anticuerpo que reconoce PTPRS y se une espedficamente a pDC humana (2G6, 4B2, 2G2, 9H5, 10F7, 22H8, 49F2, 14A8, 55E7, 13G5) se unen espedficamente o no solo a PTPRS. Las celulas transfectadas de PTPRA (40%), PTPRD (76%) y PTPRF (67%) que tuvieron espedficamente alta homologfa con PTPRS se prepararon expresando una etiqueta FLAG en el extremo N terminal de la molecula y se tineron. La expresion de hPTPRE en las celulas transfectadas fue confirmada mediante Transferencia Western, pero la expresion en la superficie celular no pudo ser confirmada. Por lo tanto, la hPTPRE no se expresa en la superficie celular. Como resultado, 4B2 reacciono con hPTPRD (FIG. 9C), y 2G6 mostro reactividad cruzada con hPTPRF (FIG. 9D). Otros 8 tipos de anticuerpos mostraron union espedfica a PTPRS (Figuras 9A-D).
A-7) Reactividad cruzada del anticuerpo anti-PTPRS contra mono
Se aislaron las PBMC de un mono cynomolgus a partir de sangre periferica (10 ml, Shin-Nippon Biomedical Laboratories, Ltd.) mediante centrifugacion por gravedad espedfica utilizando HISTOPAQUE-1077 (SIGMA). Para FACS, se utilizaron 5 * 105 celulas por muestra. Las celulas se lavaron con un tampon FACS y se anadieron 10 jl de suero de cynomolgus al 10% diluido con un tampon FACS y se llevo a cabo la reaccion a 4°C durante 20 minutos. Despues de lavar con un tampon FACS, se anadieron 100 jl del sobrenadante del cultivo celular de cada hibridoma y 10 jg/ml de IgG2a,K de raton o IgG1,K de raton, (BioLegend) y se llevo a cabo una reaccion a 4°C durante 15 minutos. Despues de lavar con un tampon FACS, se anadio 1 jg/ml de un anticuerpo anti-IgG de raton marcado con APC (BD) y se llevo a cabo una reaccion a 4°C durante 20 minutos. Despues de lavar con un tampon FACS, se hicieron reaccionar a 4°C durante 15 minutos un anticuerpo anti-Lineagel marcado con FITC (BD), un anticuerpo anti-CD 123 marcado con PE (BD) y un anticuerpo anti-HLA-DR marcado con PerCP7Cy5.5 (BD) por 25 |jL por dilucion de 1:10. Despues de lavar con un tampon FACS, las celulas se resuspendieron en 300 jl de un tampon FACS y se analizaron mediante un FACS Calibur. Como sobrenadantes del cultivo de hibridomas utilizados, se seleccionaron 7 tipos: 49F2, 55E7, 14A8, 13G5, 10F7, 22H8 y 9H5 que son espedficos de PTPRS y se unen bien a una celula CAL-1 y pDC humana. Como resultado, todos los sobrenadantes de cultivo celular de hibridoma se unieron espedficamente al grupo de poblacion de pDC (Linaje-CD 123+HLA-DR+) del mono cynomolgus (FIG. 10). A-8) Individualizacion de hibridomas
Los 7 tipos de hibridomas mencionados anteriormente (49F2, 55E7, 14A8, 13G5, 10F7, 22H8 y 9H5) se recogieron cada uno y se suspendieron en un tampon de clasificacion (FBS/PBS al 1%) para convertirse en 1 x 105 celulas/ml. Usando FACS Aria (BD), se realizo la clasificacion de celulas individuales. Se recolectaron los datos y los datos recolectados se desarrollaron mediante un grafico bidimensional de puntos del eje X: FSC y eje Y:SSC. Las celulas vivas se confinaron en la parcela de puntos. Se llevo a cabo la seleccion mediante establecimiento de ventanas de analisis para retirar los dobletes de la celula en la ventana de analisis de la celula viva, y la poblacion de celulas se dispenso a una placa de fondo plano de 96 pocillos para que fuera de 1 celula/pocillo. La celula sometida a la clasificacion de celulas individuales se cultivo en un medio HAT (RPMI1640+L-Glutamina 2 mM, 100 Unidades/ml de Penicilina, 100 jg/ml de Estreptomicina, HEPES 10 mM, Piruvato Sodico 1 mM y 2-ME 50 jM) + un suplemento de crecimiento de hibridomas hFcS (Roche). Despues de eso se tineron la celula D2SC y la celula hPTPRS/D2SC (FIG. 11AyB), la celula CAL-1 (FiG. 11C) y la pDC humana (FIG. 11D) utilizando el sobrenadante del cultivo celular del hibridoma y se selecciono un unico hibridoma.
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Ejemplo 3
Purificacion del anticuerpo
Se obtuvieron ocho tipos de anticuerpos purificados (9H5-4, 10F7-38, 13G5-52, 13G5-57, 14A8-85, 22H8-84, 49F2- 30 y 55E7-79) del sobrenadante de cultivo de los hibridomas mediante purificacion utilizando Protem G Sepharose FastFlow (GE Healthcare). Utilizando el kit de isotipificacion de mAb de raton ELISA rapido de Pierce (Thermo Fisher Scientific), se determinaron los isotipos. Como resultado, 13G5-52 y 13G5-57 fueron IgG2b,K de raton, 55E7-79tuvo tanto IgG2b, k de raton, e IgGI, k de raton, y otros fueron IgG1, k de raton. Si el anticuerpo purificado incluye endotoxina, puede afectar el resultado de un ensayo de determinacion de propiedades. Por lo tanto, se midio la concentracion de endotoxina. Los kits utilizados fueron el conjunto Endospecy ES-50M, el conjunto Toxicolor DIAMP y el conjunto de producto patron de Endotoxina CSE-L (todos de Seikagaku Biobusiness Corporation). Como resultado de ello, todos los anticuerpos purificados teman una concentracion de endotoxina igual o menor que el valor patron de 0,3 UE/mg de Ab (FlG. 12).
Estudio sobre la reactividad del anticuerpo purificado
Las capacidades de union de los anticuerpos purificados se confirmaron mediante una celula CAL-1 de la cepa de celulas de tipo pDC humana (FIG. 13). Ademas, todos los anticuerpos manteman una capacidad de union contra la poblacion humana de pDC de sangre periferica humana (BDCA2 +) (FIG. 14).
La homologfa de la secuencia de aminoacidos de PTPRS humana frente a PTPRS de raton (mPTPRS) es de aproximadamente 96%. Debido a que son notablemente similares entre sf, se estudio si el anticuerpo anti-PTPRS preparado tambien se une a PTPRS de raton. Una celula CHO en la que se habfa expresado de forma forzada el gen de mPTPRS (celula de ovario de hamster chino, en lo sucesivo denominada mPTPRS/CHO) se tino con 10 |jg/ml de cada anticuerpo anti-PTPRS. El numero de celulas fue de 2 x 105 por muestra. Despues de lavar con un tampon FACS, se diluyo 50 veces un anticuerpo anti-IgG raton marcado con Pe y se tino con 25 jl. Como resultado, 49F2-30, 13G5-52, 13G5-57 y 22H8-84 se unieron a mPTPRS/CHO (FIG. 15).
Ejemplo 4
Citotoxicidad celular dependiente del complemento del anticuerpo anti-PTPRS frente a una celula que expresa hPTPRS
Utilizando suero de cna de conejo como fuente de complemento, se midio la citotoxicidad celular dependiente del complemento (denominada en lo sucesivo actividad de CDC) del anticuerpo anti-PTPRS frente a una celula CHO que expresa PTPRS humana (denominada en lo sucesivo hPTPRS/CHO) y una celula PTPRS/CHO de raton (denominada en lo sucesivo mPTPRS/CHO). La actividad se obtuvo utilizando toxicidad celular que se calculo a partir de un valor medido de lactasa deshidrogenasa (LDH) liberada de la celula como mdice. Cada celula se dispenso a una placa de fondo en U de 96 pocillos a 2 x 104 celulas/50 pl/pocillo. Se preparo un Complemento al 18% (CEDARLANE) con un medio CDC (RPMI 1640 + BSA al 0,1% + HEPES 10 mM + L-Glutamina 2mM + 100 Unidad/ml de Penicilina + 100 pg/ml de Estreptomicina). Se prepararon dos clases: 3,3 jg/ml y 30 jg/ml para un anticuerpo de control (IgG1, k de raton o IgG2b, k de raton) y un anticuerpo anti-PTPRS. Se realizo un ensayo utilizando un kit de Ensayo de Citotoxicidad No Radioactiva CytoTox 96 (Promega). Como resultado, 13G5-52 y 13G5-57 mostraron aproximadamente 20% de actividad CDC frente a la diana de hPTPRS/CHO (FIG. 16A). Por otra parte, 13G5-52 y 13G5-57 mostraron aproximadamente 100% de actividad CDC contra la diana de mPTPRS/CHO (FIG. 16B).
Ejemplo 5
Preparacion de anticuerpo quimerico
Como hibridoma para la produccion de un anticuerpo anti-PTPRS de raton, se utilizo el siguiente.
Hibridoma 9H5-4 (Num. de acceso: FERM BP-11356)
Hibridoma 10F7-38 (Num. de acceso: FERM BP-11357)
Hibridoma 13G5-52 (Num. de acceso: FERM BP-11358)
Hibridoma 13G5-57 (Num. de acceso: FERM BP-11359)
Hibridoma 14A8-85 (Num. de acceso: FERM BP-11360)
Hibridoma 22H8-84 (Num. de acceso: FERM BP-11361)
Hibridoma 49F2-30 (Num. de acceso: FERM BP-11362)
1. Confirmacion del isotipo de la region constante
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Se confirmo el isotipo de la region constante de cada uno de los anticuerpos de raton producidos a partir de siete hibridomas (9H5-4,10F7-38,13G5-52, 13G5-57, 14A8-85, 22H8-84 y 49F2-30).
Para la confirmacion, se utilizo un kit de isotipificacion de anticuerpo monoclonal de raton (Num. de catalogo: MMT1, Serotec Product, Oxford, UK) o kit de isotipificacion de mAb de raton Pierce Rapid ELISA (Thermo Fisher Scientific), y se utilizaron tales sobrenadantes de cultivo de hibridoma 9H5-4,10F7-38,13G5-52, 13G5-57, 14A8-85, 22H8-84 y 49F2-30 como muestra.
Como resultado, el isotipo de los anticuerpos producidos por los hibridomas 13G5-52 y 13G5-57 era un isotipo que inclma IgG2b de raton como cadena pesada y k como cadena ligera. Por otra parte, el isotipo de los anticuerpos producidos por los hibridomas 9H5-4, 10F7-38, 14A8-85, 22H8-84 y 49F2-30 era un isotipo que inclma IgG1 de raton como cadena pesada y k como cadena ligera.
2. Clonacion de ADNc que codifica la region variable del anticuerpo anti-PTPRS de raton 2-1) Aislamiento del ARN total
Utilizando un kit disponible comercialmente "RNeasy Mini Kit" (Qiagen, Num. de catalogo: 74106), se aislo el ARN total de siete hibridomas de acuerdo con la instruccion adjunta al kit. Se obtuvieron aproximadamente 30 |jg del ARN total mediante preparacion a partir de la cepa de celulas de hibridoma de numero de celular 5 x 106
2-2) Amplificacion y fragmentacion de ADNc que codifica la region variable de cadena pesada de raton
Utilizando 5 jg del ARN total aislado en el apartado 2-1), el ADNc que codifica para la region variable de la cadena pesada de raton se amplifico mediante el procedimiento de PCR 5' RACE. En la amplificacion, se utilizo un kit comercial "5' RACE System for Rapid Amplification of cDNA ENDs, Version 2.0 Kit" (Invitrogen, Num. de Catalogo: 18374-058). Los detalles son los siguientes. En primer lugar, se sintetizo un ADNc de primera hebra a partir del ARN total obtenido en 2-1) mediante una transcriptasa inversa. En ese momento, se utilizo el cebador antisentido (GSP1) que se muestra a continuacion.
El cebador GSP1 utilizado para la amplificacion de cDNA se utiliza de acuerdo con el isotipo de cada cadena pesada de raton. Por ejemplo, se utilizan los siguientes cebadores antisentido para la clonacion de la region variable de la cadena pesada de los hibridomas 9H5-4, 10F7-38, 14A8-85, 22H8-84 y 49F2-30 incluyendo IgG1 de raton como cadena pesada.
Cebador GSP1 : mu IgG1 VH-GSP1
Secuencia : 5' 5'-CCA GGA GAG TGG GAG AGG CTC TTC TCA GTA TGG TGG-3' (36-mero) (SEQ ID NO: 39)
Cebador GSP2 : mu IgG1 VH-GSP2
Secuencia : 5'-GGC TCA GGG AAA TAG CCC TTG ACC AGG CAT CC-3' (32-mero) (SEQ ID NO: 40)
Asimismo, por ejemplo, pueden utilizarse los siguientes cebadores antisentido para la clonacion de la region variable de la cadena pesada de los hibridomas 9H5-4, 10F7-38, 14A8-85, 22H8-84 y 49F2-30 incluyendo IgG1 de raton como cadena pesada.
Cebador GSP1 : mu IgGHY1-GSP1
Secuencia : 5'-TCC AGA GTT CCA GGT CAC TGT CAC-3' (24-mero) (SEQ ID NO: 11)
Cebador GSP2 : mu IgG Hy1-GSP2
Secuencia : 5'-AGG GGC CAG TGG ATA GAC AGA TGG-3' (32-mero) (SEQ ID NO:13)
Y los siguientes cebadores antisentido se utilizan para la clonacion de la region variable de cadena pesada de los hibridomas 13G5-52 y 13G5-57 incluyendo IgG2b de raton como una cadena pesada.
Cebador GSP1 : mu IgGHY 2B-GSP1
Secuencia : 5'-TCC AGA GTT CCAAGT CAC AGT CAC-3' (24-mero) (SEQ ID NO: 41)
Cebador GSP2 : mu IgG Hy 2B-GSP2
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Secuencia : 5'-AGG GGC CAG TGG ATA GAC TGA TGG-3' (24-mero) (SEQ ID NO: 42)
Ademas, utilizando una desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) en el extremo 3' del ADNc de la primera hebra, se anadio un homopoKmero de nucleotidos dC. Ademas, utilizando un cebador de anclaje que tiene un polfmero de nucleotidos que es complementario a la dC (secuencia de anclaje) (SEQ ID NO: 12), y el cebador antisentido (GSP2), se amplifico el ADNc mediante un procedimiento de PCR. Ademas, utilizando el producto de PCR obtenido como molde, y utilizando un cebador AUAP (SEQ ID NO: 14) y el cebador antisentido (GSP2), se amplifico el ADNc mediante un procedimiento de PCR anidada. Ademas, este producto de PCR se purifico mediante un procedimiento de agarosa de bajo punto de fusion al 1,5%.
Cebador de anclaje para 5'RACE (SEQ ID NO: 12): 5'-GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACG GGI IGG GII GGG IIG-3' (36-mero)
AUAP para 5'RACE (SEQ ID NO: 14): 5'-GGC CAC GCG TCG ACT AGT AC-3' (20-mero)
2-3) Amplificacion y fragmentacion de ADNc que codifica la region variable de cadena ligera de raton
A partir del ARN total aislado en el apartado 2-1), se amplifico un ADNc que codifica la region variable de la cadena ligera de raton de una manera similar a 2-2).
Dado que estos siete anticuerpos incluyen la cadena ligera IgK de raton, se utilizan los siguientes cebadores antisentido para la clonacion de la cadena ligera.
Cebador GSP1 : Mu IgVL5RACE-GSP1
Secuencia : 5' 5'-TTC ACT GCC ATC AAT CTT CCACTT-3' (24-mero) (SEQ ID NO: 15)
Cebador GSP2 : Mu IgVL5RACE-GSP2
Secuencia 5'- GAT GGA TAC AGT TGG TGC AGC-3' (21-mero) (SEQ ID NO: 16)
El producto de PCR obtenido se purifico mediante un procedimiento de agarosa de bajo punto de fusion al 1,5%.
2-4) Confirmacion de la secuencia de bases del ADNc y determinacion de la region CDR
Los fragmentos de ADNc de la region variable de la cadena pesada obtenida en 2-2) y la region variable de la cadena ligera obtenida en 2-3) se clonaron a un vector pCR4Blunt-TOPO utilizando un kit disponible comercialmente "Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit" (Invitrogen, Numero de Catalogo: 1325137), de acuerdo con la instruccion adjunta al kit, y se introdujo en una celula competente de E. coli para proporcionar un transformante de E. coli. Se obtuvo un plasmido a partir de este transformante y se envio una muestra de ADN de plasmido a Operon Biotechnology Co. Ltd (Tokio) para el analisis de secuencia para confirmar la secuencia de bases de ADNc en el plasmido. Para los analisis de las secuencias, se utilizaron "Sequencher DNA sequence assembly and analysis software version 4.2.2 (Gene Codes Corporation)" y "GENEtYx-MAC Version 11. 1.1 "software (GENeTyX CORPORATION)".
Los transformantes que se convirtieron en ARN inactivos puesto que se excluyeron el desplazamiento del marco, la mutacion sin sentido y similares ocurridos alrededor de una region de determinacion de la complementariedad (denominada en lo sucesivo "region CDR") y se extrajeron los transformantes que teman las secuencias correctas. Ademas, se confirmaron la base de datos de inmunoglobulinas (IgBLAST, URL:
www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) y la homologfa para la secuencia de bases de ADNc incluida en el plasmido para determinar las secuencias de la region CDR (CDR; CDR1, CDR2 , CDR3) en cada region variable. La region marco y la secuencia de la region variable se determinaron de acuerdo con el metodo de analisis utilizando el sistema de numeracion de Kabat (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health Publicacion Num. 91-3242, 5a ed., United States Department of Health and Human Services, Bethesda, MD).
La secuencia de acido nucleico de la region variable de cadena pesada del anticuerpo 9H5-4 de raton anti-PTPRS obtenido fue el SEQ ID NO: 43 y la secuencia de aminoacidos fue el SEC ID NO 44. Las secuencias de aminoacidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la region variable de cadena pesada del anticuerpo 9H5-4 de raton fueron los SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46 y SEQ ID NO: 47, respectivamente.
La secuencia de acido nucleico de la region variable de la cadena ligera del anticuerpo 9H5-4 de raton anti-PTPRS obtenido es el SEQ ID NO: 48 y la secuencia de aminoacidos es el SEQ ID NO: 49. Las secuencias de aminoacidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la region variable de la cadena ligera del anticuerpo 9H5-4 de raton son los SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 y SEQ ID NO: 52, respectivamente.
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Y las secuencias de acido nucleico de la region variable de la cadena pesada y la region variable de la cadena ligera del anticuerpo 10F7-38 de raton anti-PTPRS obtenido y del anticuerpo 14A8-85 fueron las mismas que las del anticuerpo 9H5-4, incluyendo las secuencias de las CDR1, CDR2 y CDR3.
La secuencia de acido nucleico de la region variable de cadena pesada del anticuerpo 13G5-57 de raton anti-PTPRS obtenido fue el SEQ ID NO: 53 y la secuencia de aminoacidos fue el SEQ ID NO: 54. Las secuencias de aminoacidos de las CDR1, CDR2 y CDR3 en la region variable de cadena pesada del anticuerpo 13G5-57 de raton fueron los SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56 y SEQ ID NO: 57, respectivamente.
La secuencia de acido nucleico de la region variable de la cadena ligera del anticuerpo 13G5-57 de raton anti- PTPRS obtenido es el SEQ ID NO: 58 y la secuencia de aminoacidos es el SEQ ID NO: 59. Las secuencias de aminoacidos de CDR1, CDR2 y CDR3 en la region variable de la cadena ligera del anticuerpo 13G5-57 de raton son los SEQ ID NO: 60, SEQ ID nO: 61 y SEQ ID NO: 62, respectivamente.
Y las secuencias de acido nucleico de la region variable de cadena pesada y la region variable de cadena ligera del anticuerpo 13G5-52 de raton anti-PTPRS obtenido fueron las mismas que las del anticuerpo 13G5-57, incluyendo las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3.
La secuencia de acido nucleico de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo 22H8-84 de raton anti- PTPRS obtenido fue el SEQ ID NO: 63 y la secuencia de aminoacidos fue el SEQ ID NO: 64. Las secuencias de aminoacidos de las CDR1, CDR2 y CDR3 en la region variable de cadena pesada del anticuerpo 22H8-84 de raton fueron los SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66 y SEQ ID NO: 67, respectivamente.
La secuencia de acido nucleico de la region variable de la cadena ligera del anticuerpo 22H8-84 de raton anti- PTPRS obtenido es el SEQ ID NO: 68 y la secuencia de aminoacidos es el SEQ ID NO: 69. Las secuencias de aminoacidos de las CDR1, CDR2 y CDR3 en la region variable de la cadena ligera del anticuerpo 22H8-84 de raton son los SEQ ID NO: 70, sEq ID nO: 71 y SEQ ID NO: 72, respectivamente.
La secuencia de acido nucleico de la region variable de cadena pesada del anticuerpo 49F2-30 de raton anti-PTPRS obtenido fue el SEQ ID NO: 25 y la secuencia de aminoacidos fue el SEQ Id NO: 26. Las secuencias de aminoacidos de las CDR1, CDR2 y CDR3 en la region variable de cadena pesada del anticuerpo 49F2-30 de raton son los SEQ ID NO: 27, sEq ID nO: 28 y SEQ ID NO: 29, respectivamente.
La secuencia de acido nucleico de la region variable de la cadena ligera del anticuerpo 49F2-30 de raton anti- PTPRS obtenido es el SEQ ID NO: 30, y la secuencia de aminoacidos es el SEQ ID NO: 31. Las secuencias de aminoacidos de las CDR1, CDR2 y CDR3 en la region variable de la cadena ligera del anticuerpo 49F2-30 de raton son los SEQ ID NO: 32, sEq ID nO: 33 y SEQ ID NO: 34, respectivamente.
A continuation se muestra la secuencia de acido nucleico (471pb) de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo 9H5-4 de raton anti-PTPRS obtenido (SEQ ID NO: 43). Las letras mayusculas muestran la region variable VH de 9H5-4 de raton y las letras minusculas muestran la region constante de la cadena pesada de lgG1 de raton.
AT GG AGTT GGG ACT G AGCTGGGTATTT CTT GT GGCTCTTTT GAAT GGT GT C C AGT GT C
AGGTGCAGCTTGTAGAGACCGGGGGAGGCTTGGTGAGGCCTGGAAATTCTCTGAAA
CTCTCCTGTGTTACCTCGGGATTCACTTTCAGTAACTACCGGATGCACTGGCTTCGCC
AGCCTCCAGGGAAGAGGCTGGAGTGGATTGCTGTAATTACAGTCAAATCTGATAATTA
T GG AGC AAATTAT GC AG AGT CT GT G AAAGGC AG ATT C ACTATTT C AAG AG AT GATT C A
AAAAGCAGTGTCTACCTGCAGATGAACAGATTAAGAGAGGAAGACACTGCCACTTAT
TATTGTAGTAGATCGGTCTACTATGGTTACGTCCTAGCCTTTGACTACTGGGGCCAAGG
CACCACTCTCACAGTCTCCTCAgccaaaacgacacccccatctgtctatccactggcccctaagggc
A continuacion se muestra la secuencia de aminoacidos (157 a.a) de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo 9H5-4 de raton (SEQ ID NO: 44). Las letras mayusculas muestran la secuencia de la region variable VH y las letras minusculas muestran la region constante de la cadena pesada de IgG1 de raton. La parte subrayada significa la secuencia senal y la parte doblemente subrayada significa la region CDR (CDR1, CDR2, CDR3).
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MELGLSWVFLVALLNGVOCOVOLVETGGGLVRPGNSLKLSCVTSGFTFSNYRMHWLRO PPGKREEWTAVITVKSDNYGANYAESVKGRFTISRnnSKSSVYEOMNREREEDTATYYG SRS V Y Y G YVL AFD Y W GQGTTLTV S Sakttppsvyplapkg
La CDR1 de la region variable de cadena pesada del anticuerpo 9H5-4 es NYRMH (SEQ ID NO: 45), la CDR2 de la region variable de cadena pesada del anticuerpo 9H5-4 es VITVKSDNYGANYAESVKG (SEQ ID NO: 46), y la CDR3 de la region variable de cadena pesada del anticuerpo 9H5-4 es SVYYGYVLAFDY (SEQ ID NO: 47).
A continuation se muestra la secuencia de acido nucleico (402 pb) de la region variable de la cadena ligera del anticuerpo 9H5-4 de raton anti-PTPRS obtenido (SEQ ID NO: 48). Las mayusculas muestran la region variable VH de 9H5-4 de raton y las letras minusculas muestran la region constante de la cadena ligera Ig k de raton.
ATGATGTCCTCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGCTCTGTTTTCAAGGTACCAGATG
TGATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTC
ACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGA
AACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGT
CCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAAC
CTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTGGA
CGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAAcgggctgatgctgcaccaact
A continuacion se muestra la secuencia de aminoacidos (134 a.a) de la region variable de la cadena ligera del anticuerpo 9H5-4 de raton (SEQ ID NO: 49). Las letras mayusculas muestran la secuencia de la region variable VH de 9H5-4 de raton y las letras minusculas muestran la region constante de la cadena ligera Ig k de raton. La parte subrayada significa la secuencia senal y la parte doblemente subrayada significa la region CDR (CDR1, CDR2, CDR3).
MMSSAOFLGLLLLCFOGTRCDIOMTOTTSSLSASLGDRVTISCRASODTSNYT.NWYOOK
PDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSITISNFEOEniATYFC.OOGNTLPWTFGG
GTKLEIKradaapt
La CDR1 de la region variable de la cadena ligera del anticuerpo 9H5-4 es RASQDISNYLN (SEQ ID NO: 50), la CDR2 de la region variable de la cadena ligera del anticuerpo 9H5-4 es YTSRLHS (SEQ ID NO: 51), y la CDR3 de la region variable de la cadena ligera del anticuerpo 9H5-4 es QQGNTLP (SEQ ID NO: 52).
A continuacion se muestra la secuencia de acido nucleico (465 pb) de la region variable de cadena pesada del anticuerpo 13G5-57 de raton anti-PTPRS (SEQ ID NO: 53). Las letras mayusculas muestran la region variable VH de 13G5-57 de raton y las letras minusculas muestran la region constante de la cadena pesada de IgG2b de raton.
ATGAACTTGGGGCTCAGCTTGATTTTCCTTGTCCTTGTTTTAAAAGGTGTCCAGTGTG
AAGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCTGAAA
CTCTCCTGTGCAACCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGTATTGGGTTCGCCA
GACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAGTAATGGTGGTGGTAGCAC
CTATTATCCAGACACTGTAAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAAC
ACCCTGTACCTGCAAATGAGCCGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTG
CAAGACATGTTTACTACGGGAGGAACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCT
CAGTCACCGTCTCCTCAgccaaaacaacacccccatcagtctatccactggcccctaagggc
A continuacion se muestra la secuencia de aminoacidos (155 a.a) de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo 13G5-57 de raton (SEQ ID NO: 54). Las letras mayusculas muestran la secuencia de la region variable VH y las letras minusculas muestran la region constante de la cadena pesada de IgG2b de raton. La parte subrayada significa la secuencia senal y la parte doblemente subrayada significa la region CDR (CDR1, CDR2,
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CDR3).
MNLGLSLIFLVLVLKGVOCEVKLVESGGGLVOPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWVROT PEKRLEWVAYISNGGGSTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTTYLOMSREKSEDTAMYYCAR FTVYY GRNYAMDYWGOGTSVTV SSakttnnswnlankg
La CDR1 de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo 13G5-57 es DYYMY (SEQ ID NO: 55), la CDR2 de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo 13G5-57 es YISNGGGSTYYPDTVKG (SEQ ID No: 56), y la CDR3 de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo 13G5-57 es HVYYGRNYAMDY (SEQ ID NO: 57).
A continuation se muestra la secuencia de acido nucleico (465 pb) de la region variable de la cadena ligera del anticuerpo 13G5-57 de raton anti-PTPRS obtenido (SEQ iD NO: 58). Las letras mayusculas muestran la region variable VH de 13G5-57 de raton y las letras minusculas muestran la region constante de la cadena ligera Ig k de raton.
ATGAACTTGGGGCTCAGCTTGATTTTCCTTGTCCTTGTTTTAAAAGGTGTCCAGTGTG
AAGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCTGAAA
CTCTCCTGTGCAACCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGTATTGGGTTCGCCA
GACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAGTAATGGTGGTGGTAGCAC
CTATTATCCAGACACTGTAAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAAC
ACCCT GTACCT GC AAAT G AGCCGT CT G AAGTCT G AGGAC AC AGCC AT GTATTACT GT G
CAAGACATGTTTACTACGGGAGGAACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCT
CAGTCACCGTCTCCTCAgccaaaacaacacccccatcagtctatccactggcccctaagggc
A continuacion se muestra la secuencia de aminoacidos (155 a.a) de la region variable de la cadena ligera del anticuerpo 13G5-57 de raton (SEQ ID NO: 59). Las letras mayusculas muestran la secuencia de la region variable VH de 13G5-57 de raton y las letras minusculas muestran la region constante de la cadena ligera Ig k de raton. La parte subrayada significa la secuencia senal y la parte doblemente subrayada significa la region CDR (CDR1, CDR2, CDR3).
MMS S AOFLGLLLLCF OGTRCDIOMT OTTS SLS ASLGDRVTISCR A SODT SN YT ,NWY OOK PDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEOEDIATYFCOOGNTLPYTFGG GTKLEIKradaaptvsifppsseqltsggaswcf
La CDR1 de la region variable de la cadena ligera del anticuerpo 13G5-57 es RASQDISNYLN (SEQ ID NO: 60), la CDR2 de la region variable de la cadena ligera del anticuerpo 13G5-57 es YTSRLHS (SEQ ID nO: 61), y la CDr3 de la region variable de la cadena ligera del anticuerpo 13G5-57 es QQGNTLPY (SEQ ID NO: 62).
A continuacion se muestra la secuencia de acido nucleico (458 pb) de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo 22H8-84 de raton anti-PTPRS (SEQ ID NO: 63). Las letras mayusculas muestran la region variable VH de 22H8-84 de raton y las letras minusculas muestran la region constante de cadena pesada de IgG1 de raton.
ATGG AAT GTAACT GG ATACTTCCTTTTATTCT GT C AGTAACTT C AGGT GT CTACTC AC A GGTTC AGCT CC AGC AGT CT GGGGCT GAGCT GGC AAGACCTGGGGCTT C AGT G AAGT T GT CCTGC AAGGCTT CT GGCTAC ACCTTTACTAGCTACTGGAT GC AGTGGGTAAAAC A GAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGGGCTATTTATCCTGGAGATGGTGATACT AGGTAC ACTC AGAAGTT C AAGGGC AAGGCC AC ATT GACT GC AGATAAATCCT CC AGC AC AGCCTAC AT GC AACTC AGC AGCTT GGC AT CT G AGG ACTCTGCGGT CTATTACT GT G CAAGAAGGATTTACTACGGCTATTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTC AGTCACCGTCTCCTCagccaaaacgacacccccatctgtctatccactggcccc
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A continuation se muestra la secuencia de aminoacidos (152a.a) de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo 22H8-84 de raton (SEQ ID NO: 64). Las letras mayusculas muestran la secuencia de la region variable VH y las letras minusculas muestran la region constante de la cadena pesada de IgG1 de raton. La parte subrayada significa la secuencia senal y la parte doblemente subrayada significa la region CDR (CDR1, CDR2, CDR3).
MECNWILPFILSVTSGVYSOVOLOOSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTSYWMOWVKO RPGOGLEWIGAIYPGDGDTRYTOKFKGKATLTADKSSSTAYMOLSSTASEDSAVYYCAR R T YY G YY YA MD YW GOGTS VTV S Sakttrroswnl a
La CDR1 de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo 22H8-84 es SYWMQ (SEQ ID NO: 65), la CDR2 de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo 22H8-84 es AIYPGDGDTRYTQKFKG (SEQ ID NO: 66), y la CDR3 de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo 22H8-84 es RIYYGYYYAMYY (SEQ ID NO: 67).
A continuacion se muestra la secuencia de acido nucleico (430 pb) de la region variable de la cadena ligera del anticuerpo 22H8-84 de raton anti-PTPRS obtenido (SEQ ID NO: 68). Las letras mayusculas muestran la region variable VH de 22H8-84 de raton y las letras minusculas muestran la region constante de la cadena ligera de Ig k de raton.
ATGGAGACAGACACAATCCTGCTATGGGTGCTGCTGCTCTGGGTTCCAGGCTCCACT
GGTGACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGG
CCACCATCTCCTGCAAGGCCAGCCAAAGTGTTGATTATGATGGTGATAGTTATATGAA
CTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATGCTGCATCCAA
TCTAGAATCTGGGATCCCAGCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCAC
CCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCAAAGT
AATGAGGATCCTCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAAcgggctgatgctgc
accaactgtatccatcaagggcg
A continuacion se muestra la secuencia de aminoacidos (143 a.a) de la region variable de la cadena ligera del anticuerpo 22H8-84 de raton (SEQ ID NO: 69). Las letras mayusculas muestran la secuencia de la region variable VH de 22H8-84 de raton y las letras minusculas muestran la region constante de la cadena ligera de Ig k de raton. La parte subrayada significa la secuencia senal y la parte doblemente subrayada significa la region CDR (CDR1, CDR2, CDR3).
METDTILLWVLLLWVPGSTGDIVLTOSPASLAVSLGORATISCKASOSVDYDGDSYMNW
YOOKPGOPPKLLIYAASNT.ESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCOOSNEDPL
TFGAGTKLELKradaaptvsikg
La CDR1 de la region variable de la cadena ligera del anticuerpo 22H8-84 es KASQSVDYDGDSYMN (SEQ ID NO: 70), la CDR2 de la region variable de la cadena ligera del anticuerpo 22H8-84 es AASNLES (SEQ ID NO: 71), y la cDr3 de la region variable de la cadena ligera del anticuerpo 22H8-84 es QQSNEDPL (SEQ iD NO: 72).
A continuacion se muestra la secuencia de acido nucleico de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo 49F2-30 de raton anti-PTPRS (469 pb) (SEQ ID NO: 25). Las letras mayusculas muestran la region variable VH de 49F2-30 de raton y las letras minusculas muestran la region constante de la cadena pesada de IgG1 de raton.
AT GA ACTTCGGGCT C AGGTT GATTTTCCTT GCCCTC ATTTT AAAAGGT GTCC AGT GT G AGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGACTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAA CTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCATTTTCAGTAGCTATGGCATGTCTTGGGTTCGCC AGACTCCAGACAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTAGTGGTGGTAGTGAC ACCT ATT AT CC AG AC AGT GT G A AGGGGCG ATT C ACC AT CT CC AG AG AC AAT GCC A A CAACACCCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATT ACT GT GC AAG AC AGGT CT ACT AT GGT CTTT ACT GGT ATTT CG ATGT CT GGGGCGC AG GGACCACGGTCACCGTCTCCTCAgccaaaacgacacccccatctgtctatccactggcccctaagggcgaat
A continuacion se muestra la secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo 49F2-30 de raton (156 a.a) (SEQ ID NO: 26). Las letras mayusculas muestran el gen de la region variable VH y las
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letras minusculas muestran la region constante de la cadena pesada de IgG1 de raton. Las secuencias subrayadas muestran las secuencias de senal, y las secuencias de doble subrayado muestran las regiones CDR (CDR1, CDR2, CDR3).
MNFGLRLIFLAIILKGVQCEVQLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFIFSSYGMSWVRQTPDKRLEWVATISSGGSDTYYP DSVKGRFTISRDNANNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARQVYYGLYWYFDVWGAGTTVTVSS akttppsvyplapkge
La CDR1 de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo 49F2-30 es SYGMS (SEQ ID NO: 27), la CDR2 de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo 49F2-30 es TISSGGSDTYYPDSVKG (SEQ ID nO: 28), y la CDR3 de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo 49F2-30 es QVYYGLYWYFDV (SEQ ID NO: 29).
A continuation se muestra la secuencia de acido nucleico de la region variable de la cadena ligera del anticuerpo 49F2-30 de raton anti-PTPRS obtenido (413 pb) (SEQ ID NO: 30). Las letras mayusculas muestran la region variable VL de 49F2-30 de raton y las letras minusculas muestran la region constante de la cadena ligera de Ig k de raton.
AT GG AGT C AC AG ATT C AGGT CTTTGT ATTCGT GTTT CTCT GGTTGTCT GGTGTTG ACG GAGACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGG GTC AGC AT C ATTT GT AAGGCC AGT C AGG AT GT GAAT ACT GCT GT AGCCTGGT ATC AA CAGAAACCAGGACAATCTCCTAAATTACTGATTTACTCGGCATCCTACCGGTACACT GGAGT CCCT G ATCGCTTC ACT GGC AGT GG ATCT GGG ACGG ATTTC ACTTTC ACC ATC AGC AGT GT GC AGGCT GAAGACCT GGC AATTTATTACT GT C AGC AAC ATT AT AGT ACT CCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAAcgggctgatgctgcaccaactgtatcc atcaa
A continuacion se muestra la secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena ligera del anticuerpo 49F2-30 de raton (137 a.a) (SEQ ID NO: 31). Las letras mayusculas muestran la region variable VL de 49F2-30 de raton y las letras minusculas muestran la region constante de la cadena ligera de Ig k de raton. Las secuencias subrayadas muestran las secuencias de senal, y las secuencias de doble subrayado muestran las regiones CDR (CDR1, CDR2, CDR3).
MESQIQVFVFVFLWLSGVDGDIVMTQSHKFMSTSVGDRVSIICKASQDVNTAVAWYQQKPGQSPKLLIYSASYRYTGVPD RFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAIYYCQQHYSTPYTFGGGTKLEIK radaaptvsi
La CDR1 de la region variable de la cadena ligera del anticuerpo 49F2-30 es KASQDVNTAVA (SEQ ID NO: 32), la CDR2 de la region variable de la cadena ligera del anticuerpo 49F2-30 es SASYRYT (SEQ ID nO: 33), y la CDr3 de la region variable de la cadena ligera del anticuerpo 49F2-30 es QQHYSTP (SEQ ID No: 34).
3. Preparation del vector de expresion del anticuerpo quimerizado
3-1) donation de ADNc que codifica la region constante de Ig humana
Los ADNc de una region constante de cadena pesada de IgG1 humana y una region constante de cadena ligera de Ig k humana se clonaron a partir del ARN total de PBMC humanas, y se clonaron cada uno al vector pCR4Blunt- TOPO y se introdujeron en una celula competente de E. coli utilizando un kit disponible comercialmente "Kit de clonacion Zero Blunt TOPO PCR" (Invitrogen, Num. de Catalogo: 1325137) de acuerdo con las instrucciones adjuntas al kit para proporcionar un transformante de E. coli. El plasmido antes mencionado se obtuvo a partir de este transformante y se envio una muestra de ADN del plasmido a Operon Biotechnology Co., Ltd. (Tokio) para el analisis de secuencias para confirmar la secuencia de bases de ADNc en el plasmido.
3-2) Preparacion del vector de expresion del anticuerpo 9H5-4 (10F7-38, 14A8-85) quimerizado
Con el fin de preparar un ADNc que codificaba una cadena pesada de un anticuerpo PTPRS quimerizado, se fusionaron la region variable de cadena pesada del anticuerpo 9H5-4 de raton obtenido en el apartado 2-2 y el vector pEE6.4 (Lonza Biologics, Slough, UK) al que habia incorporado la region constante de la cadena pesada de IgG humana y la region variable de la cadena pesada del anticuerpo 9H5-4 de raton se amplifico mediante el metodo de PCR y se obtuvo el producto de PCR que tenia una longitud de aproximadamente 450 bases. En ese momento, los cebadores eran los siguientes. El producto de PCR obtenido se purifico mediante un procedimiento de agarosa de bajo punto de fusion al 1,5%.
El cebador para expresar la cadena pesada en el anticuerpo 9H5-4 quimerico
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1) Cebador directo : chi10F7VH-IF (Hind3)
Secuencia : 5' ttt AAG CTT gcc gcc acc ATG GAG TTG GGA CTG AGC TGG 3' (39-mero) (SEQ ID NO: 73)
2) Cebador inverso : chi10F7VH-462R (ApaI)
Secuencia : 5' cga tgg gcc ctt ggt get age TGA GGA GAC TGT GAG AGT GGT 3' (42-mero) (SEQ ID NO: 74)
Se obtuvo "un producto de PCR que codificaba la region variable de cadena pesada 9H5-4" a partir de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo 9H5-4 de raton obtenida en el apartado 2-2 mediante el procedimiento de PCR. El producto de PCR que codificaba la region variable de cadena pesada 9H5-4 se digirio con Hind III y una enzima de restriccion Apa I y se purifico mediante un procedimiento de gel de agarosa al 1,5%. Esto se disolvio con ddH2O para proporcionar una solucion de un fragmento de ADNc que codificaba la region variable de cadena pesada.
La region codificante de Vh de 9H5-4 del ADNc obtenido se amplifico mediante PCR a partir de un clon del plasmido pCR4Blunt-TOPO que inclrna la region codificante de Vh del 9H5-4, utilizando los cebadores chi10F7VH-IF (Hind3) y chi10F7VH-462R (ApaI) en los cuales se habfan introducido sitios de restriccion preferibles para la clonacion en un vector pEE6.4 (Lonza Biologics, Slough, UK) (Hind III y ApaI ) y una secuencia de Kozak ideal (GCCGCCACC) utilizando Hind III y ApaI como sitios de clonacion. El vector chi9H5-4VH-pEE6.4 incluye una region constante de cadena pesada de IgG1 humana. El fragmento de PCR de Vh se inserto en el vector pEE6.4 en marco utilizando Hind III y ApaI. El constructo se investigo mediante un analisis de secuencia de bases de ADNc y se envio una muestra de ADN de plasmido a Operon Biotechnology Co., Ltd. (Tokio) para el analisis de secuencias para confirmar la secuencia de bases de ADNc en el plasmido.
Con el fin de preparar un ADNc que codifica una cadena ligera de un anticuerpo 9H5-4 quimerizado, el producto de PCR se amplifico en una longitud de aproximadamente 730 bases mediante una tecnica basada en la PCR de extension de solapamiento del fragmento de PCR en el que se habfan fusionado la region variable de cadena ligera del anticuerpo 9H5-4 obtenida en el apartado 2-3 y la region constante de la cadena ligera de Ig k humana obtenida en el apartado 3-2.
El producto de PCR que codifica la region variable de la cadena ligera 9H5-4 se digirio mediante Hind III y una enzima de restriccion EcoRI, y se purifico mediante un procedimiento de gel de agarosa al 1,5%. Esto se disolvio en ddH2O para proporcionar una solucion de un fragmento de ADNc que codifica la region variable de cadena ligera.
El ADNc que codifica Vl de 9H5-4 obtenido se amplifico mediante PCR a partir de un clon del plasmido pCR4Blunt- TOPO que inclrna la region Vl de 9H5-4 utilizando los cebadores chi11G9VL-IF (Hind) y chi11G9VL-726R (RI) en los que se habfan introducido sitios de restriccion (Hind III y EcoRI) preferibles para la clonacion en un vector pEE 14.4 (Lonza Biologics) y una secuencia ideal de Kozak. El vector Chi9H5-4VL-pEE14.4 incluye una region constante de cadena ligera kappa. El fragmento de PCR de Vl se inserto en el vector pEE14.4 en marco utilizando Hind III y EcoRI. El constructo se investigo mediante un analisis de secuencia de bases de ADNc.
El cebador para expresar la cadena ligera en el anticuerpo 9H5-4 quimerico
1) Cebador directo : chi11G9VL-IF (Hind)
Secuencia : 5' acc AAG CTT gcc gcc acc ATG ATG TCC TCT GCT CAG TTC 3' (39-mero) (SEQ ID NO: 75)
2) Cebador inverso : chi11G9VL-408R
Secuencia : 5' agc cac agttcg TTT GAT TTC CAG CTT GGT GCC 3' (33-mero) (SEQ ID NO: 76)
3) Cebador directo : chi11G9VL-385F
Secuencia : 5' CTG GAAATC AAA cga act gtg gct gca cca tct 3' (33-mero) (SEQ ID NO: 77)
4) Cebador inverso : chi11G9VL-726R (RI)
Secuencia : 5' aaa GAA TTC cta gca ctc tcc cct gtt gaa 3' (30-mero) (SEQ ID NO: 78)
3-2) Preparacion del vector de expresion del anticuerpo 13G5-57 (13G5-52) quimerizado
Con el fin de preparar un ADNc que codifica una cadena pesada de un anticuerpo PTPRS quimerizado, se fusionaron la region variable de la cadena pesada del anticuerpo 13G5-57 de raton obtenido en el apartado 2-2 y el vector pEE6.4 (Lonza Biologics, Slough, UK) en el que se habfa incorporado la region constante de la cadena pesada de IgG humana. En un metodo similar al anticuerpo 9H5-4, se obtuvo el producto de PCR y se purifico. En ese momento, los cebadores eran los siguientes.
El cebador para expresar la cadena pesada en el anticuerpo quimerico 13G5-57
1) Cebador directo : chi13G5.57VH-IF (Hind3)
Secuencia : 5' ttt AAG CTT gcc gcc acc ATG AAC TTG GGG CTC AGC TTG 3' (39-mero) (SEQ ID NO: 79)
2) Cebador inverso: chi13G5.57VH-456R (ApaI)
Secuencia : 5' cga tgg gcc ctt ggt gct agc TgA GgA GAC GGT GAC TGA GGT 3' (42-mero) (SEQ ID NO: 80)
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de PCR se amplifico en una longitud de aproximadamente 730 bases mediante una tecnica basada en la PCR de extension de solapamiento del fragmento de PCR en el que se habfan fusionado la region variable de la cadena del anticuerpo 13G5-57 de raton obtenida en el apartado 2-3 y la region constante de la cadena ligera de Ig k humana obtenida en el apartado 3-2.
El cebador para expresar la cadena ligera en el anticuerpo quimerico 13G5-57
1) Cebador directo : chi11G9VL-IF (Hind)
Secuencia : 5' acc AAG CTT gcc gcc ATG ATG TCC TCT GCT CAG TTC 3' (39-mero) (SEQ ID NO: 81)
2) Cebador inverso : chi11G9VL-408R
Secuencia : 5' agc cac agttcg TTT GAT TTC CAG CTT GGT GCC 3' (33-mero) (SEQ ID NO: 82)
3) Cebador directo: chi11G9VL-385F
Secuencia : 5' CTG GAA ATC AAA cga act gtg gct gca cca tct 3' (33-mero) (SEQ ID NO: 83)
4) Cebador inverso : chi11G9VL-726R (RI)
Secuencia : 5' aaa GAA TTC cta gca ctc ccc cct gtt gaa 3' (30-mero) (SEQ ID NO: 84)
De una manera similar a la preparacion de vectores de expresion de anticuerpo 9H5-4 quimerizado, se prepararon vectores de expresion para tales cadena pesada y cadena ligera de anticuerpo 13G5-57 quimerico.
3-2) Preparacion del vector de expresion del anticuerpo 22H8-84 quimerizado
Con el fin de preparar un ADNc que codifica una cadena pesada de un anticuerpo PTPRS quimerizado, se fusionaron la region variable de la cadena pesada del anticuerpo 22H8-84 de raton obtenido en el apartado 2-2 y el vector pEE6.4 (Lonza Biologics, Slough, UK) en el que se habfa incorporado la region constante de la cadena pesada de IgG humana. En un metodo similar al del anticuerpo 9H5-4, se obtuvo el producto de PCR y se purifico. En ese momento, los cebadores eran los siguientes.
El cebador para expresar la cadena pesada en el anticuerpo quimerico 22H8-84
1) Cebador directo : chi22H8VH-IF (Hind3)
Secuencia : 5' ttt AAG CTT gcc gcc acc ATG GAA TGT AAC TGG ATA CTT 3' (39-mero) (SEQ ID NO: 85)
2) Cebador inverso : chi22H8VH-456R (ApaI)
Secuencia : 5' cga tgg gcc ctt ggt gct agc TGA GGA GAC GGT GAC TGA GGT 3' (42-mero) (SEQ ID NO: 86)
Con el fin de preparar un ADNc que codifica una cadena ligera de un anticuerpo 22H8-84 quimerizado, el producto de PCR se amplifico en una longitud de aproximadamente 730 bases mediante una tecnica basada en la PCR de extension de solapamiento del fragmento de PCR en el que se habfan fusionado la region variable de cadena ligera del anticuerpo 22H8- 84 de raton obtenida en el apartado 2-3 y la region constante de la cadena ligera de Ig k humana obtenida en el apartado 3-2.
El cebador para expresar la cadena ligera en el anticuerpo quimerico 22H8-84
1) Cebador directo : chi22H8VL-IF (Hind)
Secuencia : 5' acc AAG CTT gcc gcc acc ATG GAG ACA GAC ACAATC CTG 3' (39-mero) (SEQ ID NO: 87)
2) Cebador inverso : chi22H8VL-420R
Secuencia : 5' agc cac agttcg TTT CAG CTC CAG CTT GGT CCC 3' (33-mero) (SEQ ID NO: 88)
3) Cebador directo : chi22H8VL-397F
Secuencia : 5' CTG GAG CTG AAA cga act gtg gct gca cca tct 3' (33-mero) (SEQ ID NO: 89)
4) Cebador inverso: chi49F2VL-726R (RI)
Secuencia : 5' aaa GAA TTC cta gca ctc tcc cct gtt gaa 3' (30-mero) (SEQ ID NO: 90)
De una manera similar a la preparacion de vectores de expresion de anticuerpo 9H5-4 quimerizado, se prepararon vectores de expresion para tales cadena pesada y cadena ligera de anticuerpo 22H8-84 quimerizado.
3-2) Preparacion de ADNc que codifica la cadena pesada de anticuerpo PTPRS quimerizado
Con el fin de preparar un ADNc que codifica una cadena pesada de un anticuerpo PTPRS quimerico, los dos fragmentos de PCR se alteraron mediante un procedimiento basado en un procedimiento de PCR de extension de solapamiento en un fragmento de PCR en el que se habfan fusionado la region variable de la cadena pesada del anticuerpo 49F2-30 de raton obtenido en el apartado 2-2 y la region constante de cadena pesada de IgG humana obtenida en el apartado 3-1 y el producto de PCR se amplifico en una longitud de 1434 bases mediante un metodo que permite la formacion parcial de una molecula de doble filamento como resultado de una operacion tnbrida. En ese momento, los cebadores (SEQ ID NOS: 17 a 24) eran los que se muestran en la Tabla 1. El producto de PCR obtenido se purifico mediante un procedimiento de agarosa de bajo punto de fusion al 1,5%.
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Tabla 1
Nombre del cebador Secuencia
Cebador para expresar la cadena pesada en el anticuerpo quimerico 49F2-30
1)
chi49F2VH-IF(Hind3) 5' acc AAG CTT gcc gcc acc ATG AAC TTC GGG CTC AGG TTG 3' (39-mero)
2)
chi49F2VH-447R 5' ctt ggt gct agc TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT 3' (33-mero)
3)
chi49F2VH-424F 5' ACC GTC TCC TCA gct agc acc aag ggc cca tcg 3' (33-mero)
4)
chi49F2VH-1434R(RI) 5' ttt GAA TTC tca ttt acc cgg aga cag gga 3' (30-mero)
Cebador para expresar la cadena ligera en el anticuerpo quimerico 49F2-30
5)
chi49F2VL-IF(Hind) 5' acc AAG CTT gcc gcc acc ATG GAG TCA CAG ATT CAG GCT 3' (33-mero)
6)
chi49F2VL-408R 5' agc cac agt tcg TIT TAT TTC CAG CTT GGT CCC 3' (33-mero)
7)
chi49F2VL-385F 5' CTG GAA ATA AAA cga act gtg gct gca cca tct 3' (33- mero)
8)
chi49F2VL-726R(RI) 5' aaa GAA TTC cta gca ctc tcc cct gtt gaa 3' (30-mero)
Hay una region en la que el ADNc se solapa con la region variable de la cadena pesada del anticuerpo 49F2-30 de raton obtenida en el apartado 2-2 y la region constante de la cadena pesada de IgG1 humana obtenida en el apartado 3-1. Por lo tanto, utilizando esta region, se obtuvo "un producto de PCR que codifica la region variable de cadena pesada de 49F2-30" mediante un procedimiento de PCR de extension de solapamiento. El producto de PCR que codifica la region variable de la cadena pesada de 49F2-30 se digirio con Hind III y una enzima de restriccion EcoR I y se purifico mediante un procedimiento de gel de agarosa al 1,5%. Esto se disolvio con ddH2O para proporcionar una solucion de un fragmento de ADNc que codifica la region variable de cadena pesada.
La region codificante de Vh de 49F2-30 del ADNc obtenido se amplifico mediante PCR a partir de un clon del plasmido pCR4Blunt-TOPO que incluia la region codificante de Vh de 49F2-30, utilizando los cebadores chi49F2VH- IF (Hind3) y chi49F2VH-1434R (RI) en los cuales se habfan introducido sitios de restriccion preferibles para la clonacion en un vector pEE6.4 (Lonza Biologics, Slough, Reino Unido) (Hind III y EcoRI) y una secuencia ideal de Kozak (GCCGCCACC) utilizando Hind III y EcoRI como sitios de clonacion. El vector chi49F2VH-pEE6.4 incluye una region constante de cadena pesada de IgG1 humana. El fragmento de PCR de Vh se inserto en el vector pEE6.4 en marco utilizando Hind III y EcoRI. El constructo se investigo mediante un analisis de secuencia de bases de ADNc.
3-3) Preparacion de ADNc que codifica para la cadena ligera del anticuerpo PTPRS quimerizado
Con el fin de preparar un ADNc que codifica una cadena ligera de un anticuerpo PTPRS quimerizado, el producto de PCR se amplifico en una longitud de 726 bases mediante una tecnica basada en PCR de extension de solapamiento del fragmento de PCR en el que se habfan fusionado la region variable de cadena ligera del anticuerpo 49F2-30 de raton obtenida en el apartado 2-3 y la region constante de la cadena ligera de Ig k humana obtenida en el apartado 3-2.
El producto de PCR que codifica la region variable de cadena ligera de 49F2-30 se digirio con Hind III y una enzima de restriccion EcoRI, y se purifico mediante un procedimiento de gel de agarosa al 1,5%. Esto se disolvio en ddHhO para proporcionar una solucion de un fragmento de ADNc que codifica la region variable de cadena ligera.
El ADNc que codifica Vl de 49F2-30 obtenido se amplifico mediante PCR a partir de un clon del plasmido pCR4Blunt-TOPO que incluia la region Vl de 49F2-30 utilizando los cebadores chi49F2VL-IF (Hind) y chi 49F2VL- 726R (RI) en los que se habfan introducido sitios de restriccion (Hind III y EcoRI) preferibles para la clonacion en un vector pEE14.4 (Lonza Biologics) y una secuencia ideal de Kozak. El vector Chi49F2VL-pEE14.4 incluye una region constante de cadena ligera kappa. El fragmento de PCR de Vl se inserto en el vector pEE14.4 en marco utilizando Hind III y EcoRI. El constructo se investigo mediante un analisis de secuencia de bases de ADNc.
5
10
15
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25
30
35
40
45
50
3-4) Construccion del vector de expresion de Lonza de doble gen del anticuerpo PTPRS quimerizado
Se construyo un vector de expresion de Lonza de anticuerpo PTPRS quimerico (gen doble) en el que se habfan combinado el vector de expresion de la cadena pesada del anticuerpo PTPRS quimerizado y el vector de expresion de la cadena ligera del anticuerpo PTPRS quimerizado en un vector de gen doble mediante una tecnologfa de clonacion convencional.
4. Expresion transitoria en celulas HEK-293F
Se utilizaron los siguientes ADN del vector de expresion transitoria (80 |jg).
1) ADN del vector chi9H5-4VH/VL DG Lonza
2) ADN del vector chi13G5-57VH/VL DG Lonza
3) ADN del vector chi22H8-84VH/VL DG Lonza
4) ADN del vector cHi49F2-30VH/VL DG Lonza
El dfa anterior de la transfeccion, una celula 293F se ajusto a 80 ml a 8 x 105 celulas/ml en un matraz Erlenmeyer de 250 ml (Corning Num. 431144), y se cultivo agitando en condiciones de 37°C y una concentracion de CO2 del 8% durante 7 dfas.
Despues del cultivo durante 7 dfas, se recogio un Kquido de cultivo de una celula 293F que habfa sido sometida a transfeccion en un tubo de 50 mL y se centrifugo bajo condiciones de 2.070 g y 4°C durante 5 minutos. El sobrenadante se filtro mediante un filtro de jeringa (Num. de catalogo 431220; CORNING) que tema un tamano de poro de 0,45 jm, y los sobrenadantes de cultivo se reunieron.
5. Purificacion de anticuerpo quimerizado anti-PTPRS
Los anticuerpos 9H5-4, 13G5-57, 22H8-84 y 49F2-30 quimerizados se purificaron mediante cromatograffa de afinidad con protema A. Cada uno de los lfquidos de anticuerpo bruto obtenidos en el apartado 4. se purifico mediante una columna de afinidad de protema A (rProtein A Sepharose Fast Flow (Num. de Catalogo 17-1279-01; 311272; GE Healthcare). Las condiciones de la columna son las siguientes. La purificacion de afinidad se llevo a cabo utilizando un tampon de union (Fosfato Sodico 20 mM, NaCl 0,15 M, pH 7,4) y un tampon de elucion (Glicina- HCl 0,1 M, pH 2,7). El pH de la fraccion eluida se ajusto a aproximadamente 7,2 anadiendo un tampon neutralizante (Tris-HCl 1 M de pH 9,5). Con el fin de sustituir el tampon del anticuerpo purificado por PBS, se reemplazo el tampon utilizando la unidad de dialisis Slide-A-Lyzer MINI 10kMWCO.
La concentracion del anticuerpo purificado se calculo midiendo la absorbancia a 280 nm y definiendo 1 mg/l como 1,38 DO.
El anticuerpo quimerizado anti-PTPRS purificado (ch9H5-4Ab, ch13G5-57Ab, ch22H8-84Ab y ch49F2-30Ab) se analizo mediante SDS-PAGE y un procedimiento de Citometna de flujo.
Las secuencias de acido nucleico y las secuencias de aminoacidos de la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo 9H5-4 quimera preparado se representan respectivamente mediante los siguientes numeros de secuencia.
Cadena pesada
Cadena ligera
SEQ ID NO: 91
SEQ ID NO: 93
(Secuencia de acido nucleico)
(Secuencia de acido nucleico)
SEQ ID NO: 92
SEQ ID NO: 94
(Secuencia de aminoacidos)
(Secuencia de aminoacidos)
A continuacion se muestra la secuencia de acido nucleico de la cadena pesada del anticuerpo quimera 9H5-4 anti- PTPRS (1419 pb) (SEQ ID NO: 91). Las letras mayusculas muestran la region variable VH de 9H5-4 quimera, y las letras minusculas muestran la region constante de la cadena pesada de IgG1 humana.
ATGGAGTTGGGACTGAGCTGGGTATTTCTTGTGGCTCTTTTGAATGGTGTCCAGTGTC
AGGTGC AGCTT GTAG AG ACCGGGGGAGGCTT GGT GAGGCCT GG AAATT CTCTGAAA
CTCTCCTGTGTTACCTCGGGATTCACTTTCAGTAACTACCGGATGCACTGGCTTCGCC
AGCCTCCAGGGAAGAGGCTGGAGTGGATTGCTGTAATTACAGTCAAATCTGATAATTA
T GGAGC AAATTAT GC AGAGT CT GT G AAAGGC AG ATT C ACTATTT C AAG AG AT GATT C A
AAAAGCAGTGTCTACCTGCAGATGAACAGATTAAGAGAGGAAGACACTGCCACTTAT
TATTGTAGTAGATCGGTCTACTATGGTTACGTCCTAGCCTTTGACTACTGGGGCCAAGG
CACCACTCTCACAGTCTCCTCAgctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctc
tgggggeaeageggeeGtgggctgeetggtcaaggactacttccecgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagc
ggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcaccc
agacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacat
gcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggac
ccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcata
atgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaat
ggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgag
aaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatccca
gcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctcctt
cttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaac
cactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga
A continuacion se muestra la secuencia de aminoacidos de la cadena pesada del anticuerpo 9H5-4 quimera anti- PTPRS (472 a.a.) (SEQ ID NO: 92). Las letras mayusculas muestran la region variable VH de 9H5-4 quimera, y las 5 letras minusculas muestran la region constante de la cadena pesada de lgG1 humana.
MELGLSWVFLVALLNGVQCQVQLVETGGGLVRPGNSLKLSCVTSGFTFSNYRMHWLRQ
PPGKRLEWIAVITVKSDNYGANYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNRLREEDTATYYCS
RS V Y Y G YVL AFD YW GQGTTLTV S Sastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvs wnsgaltsgvhtf
pavlqssglyslsswtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevt
cvwdvshedpevkfhwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqpre
pqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealh
nhytqkslslspgk
A continuacion se muestra la secuencia de acido nucleico de la cadena ligera del anticuerpo 9H5-4 quimera anti- PTPRS (705 pb) (SEQ ID NO: 93). Las letras mayusculas muestran la region variable VL de 9H5-4 quimera y las letras minusculas muestran la region constante de la cadena ligera de Ig k humana.
ATGATGTCCTCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGCTCTGTTTTCAAGGTACCAGATG
TGATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTC
ACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGA
AACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGT
CCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAAC
CTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTGGA
CGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAAcgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatct
gatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataac
gccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctga
gcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacagg
ggagagtgctag
A continuacion se muestra la secuencia de aminoacidos de la cadena ligera del anticuerpo 9H5-4 quimera anti- PTPRS (234 a.a.) (SEQ ID NO: 94). Las letras mayusculas muestran la region variable de VL de 9H5-4 quimera y las letras minusculas muestran la region constante de la cadena ligera de Ig k humana.
5
MMSSAQFLGLLLLCFQGTRCDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQK
PDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFGG
GTKLEIKrtvaapsvfifppsdeqlksgtaswcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadye
khkvyacevthqglsspvtksfnrgec
<13G5-57>
10 Las secuencias de acido nucleico y las secuencias de aminoacidos de la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo 13G5-57 quimera preparado se representan respectivamente mediante los siguientes numeros de secuencia.
Cadena pesada
Cadena ligera
SEQ ID NO: 95
SEQ ID NO: 97
(Secuencia de acido nucleico)
(Secuencia de acido nucleico)
SEC ID NO: 96
SEQ ID NO: 98
(Secuencia de aminoacidos)
(Secuencia de aminoacidos)
A continuacion se muestra la secuencia de acido nucleico de la cadena pesada del anticuerpo 13G5-57 quimera 15 anti-PTPRS (1413 pb) (SEQ ID NO: 95). Las letras mayusculas muestran la region variable de VH de 13G5-57 quimera, y las letras minusculas muestran la region constante de la cadena pesada de IgG1 humana.
ATGAACTTGGGGCTCAGCTTGATTTTCCTTGTCCTTGTTTTAAAAGGTGTCCAGTGTG
AAGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCTGAAA
CTCTCCTGTGCAACCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGTATTGGGTTCGCCA
GACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAGTAATGGTGGTGGTAGCAC
CTATTATCCAGACACTGTAAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAAC
ACCCTGTACCTGCAAATGAGCCGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTG
CAAGACATGTTTACTACGGGAGGAACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCT
CAGTCACCGTCTCCTCAgctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggc
acagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgca
caccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctaca
tctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgt
gcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggt
cacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaaga
caaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaagga
gtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacag
gtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcg
ccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctaca
gcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgc
agaagagcctctccctgtctccgggtaaatga
A continuacion se muestra la secuencia de aminoacidos de la cadena pesada del anticuerpo 13G5-57 quimera anti- PTPRS (470 a.a.) (SEQ ID NO: 96). Las letras mayusculas muestran la region variable VH de 13G5-57 quimera, y 5 las letras minusculas muestran la region constante de la cadena pesada de IgG1 humana.
MNLGLSLIFLVLVLKGV QCEVKLVESGGGLV QPGGSLKLSC ATSGFTFSDYYMYWVRQT
PEKRLEWVAYISNGGGSTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSRLKSEDTAMYYCAR
HV YY GRN YAMD YWGQGTSVTV SSastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtf
pavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevt
cvwdvshedpevkfhwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqpre
pqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealh
nhytqkslslspgk
A continuacion se muestra la secuencia de acido nucleico de la cadena ligera del anticuerpo 13G5-57 quimera anti- 10 PTPRS (705 pb) (SEQ ID NO: 97). Las letras mayusculas muestran la region variable de 13G5-57VL quimera, y las letras minusculas muestran la region constante de la cadena ligera de Ig k humana.
ATGATGTCCTCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGCTCTGTTTTCAAGGTACCAGATG
TGATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCGCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTC
ACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGA
AACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGT
CCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAAC
CTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACA
CGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAAcgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatc
tgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataa
cgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctg
agcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacag
gggagagtgctag
A continuacion se muestra la secuencia de aminoacidos de la cadena ligera del anticuerpo 13G5-57 quimera anti- PTPRS (234 a.a.) (SEQ ID NO: 98). Las letras mayusculas muestran la region variable VL de 13G5-57 quimera, y 5 las letras minusculas muestran la region constante de la cadena ligera de Ig k humana.
MMSSAQFLGLLLLCFQGTRCDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQK
PDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGG
GTKLEIKrtvaapsvfifppsdeqlksgtaswcllnniypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadye
khkvyacevthqglsspvtksfnrgec
Las secuencias de acido nucleico y las secuencias de aminoacidos de la cadena pesada y de la cadena ligera del 10 anticuerpo 22H8-84 quimera preparado se representan respectivamente mediante los siguientes numeros de secuencia.
Cadena pesada
Cadena ligera
SEQ ID NO: 99
SEQ ID NO: 101
(Secuencia de acido nucleico)
(Secuencia de acido nucleico)
SEQ ID NO: 100
SEQ ID NO: 102
(Secuencia de aminoacidos)
(Secuencia de aminoacidos)
A continuacion se muestra la secuencia de acido nucleico de la cadena pesada del anticuerpo 22H8-84 quimera anti-PTPRS (1413 pb) (SEQ ID NO: 99). Las mayusculas muestran la region variable VH de 22H8-84 quimera, y las 15 letras minusculas muestran la region constante de la cadena pesada de IgG1 humana.
AT GGAAT GTAACT GG ATACTTCCTTTTATTCT GTC AGTAACTT C AGGT GT CTACTC AC A
GGTTC AGCTCC AGC AGTCT GGGGCTGAGCT GGC AAGACCT GGGGCTT C AGT GAAGT
TGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTTACTAGCTACTGGATGCAGTGGGTAAAACA
GAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGGGCTATTTATCCTGGAGATGGTGATACT
AGGTACACTCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGCAGATAAATCCTCCAGC
ACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCTTGGCATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTG
CAAGAAGGATTTACTACGGCTATTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTC
AGTCACCGTCTCCTCAgctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcac
agcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcaca
ccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatc
tgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgc
ccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtca
catgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagaca
aagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagta
caagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtg
tacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgcc
gtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagc
aagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcag
aagagcctctccctgtctccgggtaaatga
A continuacion se muestra la secuencia de aminoacidos de la cadena pesada del anticuerpo 22H8-84 quimera anti- PTPRS (470 a.a.) (SEQ ID NO: 100). Las mayusculas muestran la region variable VH de 22H8-84 quimera, y las letras minusculas muestran la region constante de la cadena pesada de IgG1 humana.
5
MECN WILPFILS VTSGV Y SQ V QLQQSGAELARPGAS VKLSCKASG YTFTS YWMQ WVKQ
RPGQGLEWIGAIYPGDGDTRYTQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCAR
RIYY G Y YYAMD Y W GQGTS VTV S Sastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfp
avlqssglyslsswtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfippkpkdtlmisrtpevtc
vwdvshedpevkfhwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrwsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprep
qvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhn
hytqkslslspgk
A continuacion se muestra la secuencia de acido nucleico de la cadena ligera del anticuerpo 22H8-84 quimera anti- PTPRS (717 pb) (SEQ ID NO: 101). Las letras mayusculas muestran la region variable vL de 22H8-84 quimera, y 10 las letras minusculas muestran la region constante de la cadena ligera de Ig k humana.
AT GG AG AC AG AC AC AAT CCT GCTAT GGGTGCTGCT GCT CT GGGTTCC AGGCTCC ACT
GGTGACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGG
CC ACC AT CT CCT GC AAGGCC AGCC AAAGT GTT G ATTAT GAT GGT GATAGTTATATGAA
CTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATGCTGCATCCAA
T CTAGAAT CT GGG ATCCC AGCC AGGTTTAGT GGC AGT GGGT CTGGGAC AG ACTT C AC
CCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGC AAAGT
AATGAGGATCCTCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAAcgaactgtggctgc
accatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggc
caaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctac
agcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctc
gcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgctag
La secuencia de aminoacidos de la cadena ligera del anticuerpo anti-PTPRS de la quimera 22H8-84 (238 a.a.) se muestra a continuacion (SEQ ID NO: 102). Las letras mayusculas muestran la region variable de la quimera 22H8-84 5 VL, y las letras minusculas muestran la region constante de la cadena ligera Ig k humana.
METDTILLWVLLLWVPGSTGDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMNW
YQQKPGQPPKLLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPL
TFGAGTKLELKrtvaapsvfifppsdeqlksgtaswcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltl
skadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
Las secuencias de acidos nucleicos y las secuencias de aminoacidos de la cadena pesada y de la cadena ligera del 10 anticuerpo 49F2-30 quimera preparado estan representadas respectivamente mediante los siguientes numeros de secuencia.
Cadena pesada
Cadena ligera
SEQ ID NO: 35
SEC ID NO: 37
(Secuencia de acido nucleico)
(Secuencia de acido nucleico)
SEQ ID NO: 36
SEC ID NO: 38
(Secuencia de aminoacidos)
(Secuencia de aminoacidos)
A continuacion se muestra la secuencia de acido nucleico de la cadena pesada del anticuerpo 49F2-30 quimera anti- PTPRS (1413 pb) (SEQ ID NO: 35). Las letras mayusculas muestran la region variable vH de 49F2-30 quimera, y 15 las letras minusculas muestran la region constante de la cadena pesada de IgG1 humana.
ATGAACTTCGGGCTCAGGTTGATTTTCCTTGCCCTCATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTG
AGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGACTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAA
CTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCATTTTCAGTAGCTATGGCATGTCTTGGGTTCGCC
AGACTCCAGACAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTAGTGGTGGTAGTGAC
ACCTATTATCCAGACAGTGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAA
CAACACCCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATT
ACTGTGCAAGACAGGTCTACTATGGTCTTTACTGGTATTTCGATGTCTGGGGCGCAG
GGACCACGGTCACCGTCTCCTCAgctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacc
tctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccag
cggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacc
cagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacat
gcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggac
ccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcata
atgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaat
ggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgag
aaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatccca
gcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctcctt
cttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaac
cactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga
A continuacion se muestra la secuencia de aminoacidos de la cadena pesada del anticuerpo 49F2-30 quimera anti- PTPRS (470 a.a.) (SEQ ID NO: 36). Las letras mayusculas muestran la region variable VH de 49F2-30 quimera, y 5 las letras minusculas muestran la region constante de la cadena pesada de IgG1 humana.
MNFGLRLIFLALILKGVQCEVQLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFIFSSYGMSWVRQT
PDKRLEWVATISSGGSDTYYPDSVKGRFTISRDNANNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCAR
QVYYGLYWYFDVWGAGTTVTVSSastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtf
pavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevt
cvwdvshedpevkfiiwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqpre
pqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpeimykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealh
nhytqkslslspgk
A continuacion se muestra la secuencia de acido nucleico de la cadena ligera del anticuerpo 49F2-30 quimera anti- 10 PTPRS (705 pb) (SEQ ID NO: 37). Las letras mayusculas muestran la region variable VL de 49F2-30 quimera, y las letras minusculas muestran la region constante de la cadena ligera de Ig k humana.
ATGGAGTCACAGATTCAGGTCTTTGTATTCGTGTTTCTCTGGTTGTCTGGTGTTGACG
GAGACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGG
GTCAGCATCATTTGTAAGGCCAGTCAGGATGTGAATACTGCTGTAGCCTGGTATCAA
CAGAAACCAGGACAATCTCCTAAATTACTGATTTACTCGGCATCCTACCGGTACACT
GGAGTCCCTGATCGCTTCACTGGCAGTGGATCTGGGACGGATTTCACTTTCACCATC
AGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAATTTATTACTGTCAGCAACATTATAGTACT
CCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAAcgaactgtggctgcaccatctgtcttcat
cttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtgg
aaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagca
ccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaag
agcttcaacaggggagagtgctag
15 A continuacion se muestra la secuencia de aminoacidos de la cadena ligera del anticuerpo 49F2-30 quimera anti- PTPRS (234 a.a.) (SEQ ID NO: 38). Las letras mayusculas muestran la region variable VL de 49F2-30 quimera, y las letras minusculas muestran la region constante de la cadena ligera de Ig k humana.
MESQIQVFVFVFLWLSGVDGDIVMTQSHKFMSTSVGDRVSIICKASQDVNTAVAWYQQ
KPGQSPKLLIYSASYRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAIYYCQQHYSTPYTFG
GGTKLEIKrtvaapsvfifppsdeqlksgtaswcllnniypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskady
ekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
20
Ejemplo 6
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
30, ch9H5-4, ch13G5-57 y ch22H8-84)
Se midio la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (actividad ADCC). La actividad se obtuvo utilizando la citotoxicidad celular calculada a partir del valor medido de la lactasa deshidrogenasa (LDH) liberada de una celula como mdice. Las celulas mononucleares de sangre periferica humana que van a ser celulas efectoras se purificaron mediante centrifugacion por gravedad espedfica utilizando HISTOPAQUE-1077. Como celula que va a ser una diana, se utilizo una celula transformada de manera forzada de un gen de hPTPRS utilizando CHO (cepa de celulas de ovario de hamster chino) (2 x 104/pocillo). Las celulas efectoras y diana se mezclaron de manera que su proporcion fuese 10:1, 20:1, 40:1 y 80:1, 10 pg/ml de anticuerpo quimerico anti-PTPRS humana preparado (ch49F2- 30, ch9H5-4, Ch13G5-57 y ch22H8-84) o un anticuerpo de control Synagis y la mezcla se cultivo durante 4 horas a 37°C para evaluar el efecto de citotoxicidad celular del anticuerpo. Como resultado, ch49F2-30, ch9H5-4, ch13G5-57 y ch22H8-84 del anticuerpo quimerico anti-hPTPRS lisaron la celula hPTPRS/CHO de la diana en una forma dependiente del numero de celulas efectoras (FIG. 17A y FIG 17B). Este resultado mostro que el anticuerpo quimerico anti-PTPRS preparado mostro selectivamente la citotoxicidad contra las celulas que expresaban PTPRS.
Se estudio el efecto del anticuerpo anti-PTPRS en pDC. Las PBMC se aislaron a partir de sangre periferica humana, se mezclaron con 10 pg/ml de un anticuerpo quimerico anti-PTPRS humana y se cultivaron durante 24 horas. Despues de eso, se llevo a cabo la estimulacion durante 24 horas con CpG2216 que es un ligando de un receptor tipo Toll 9 expresado en pDC para inducir la produccion de IFNa. Veinticuatro horas despues de la estimulacion con CpG, se sometio a ensayo la cantidad de produccion de IFNa. En consecuencia, la produccion de IFNa se inhibio completamente mediante el tratamiento del anticuerpo quimerico anti-PTPRS humana preparado (ch49F2-30, ch9H5-4, ch13G5-57 y ch22H8-84) (FIG. 18A). Ademas, cuando la celula se recogio 6 horas despues del tratamiento con ch49F2-30, ch9H5-4, ch13G5-57 y ch22H8-84 y se confirmo la pDC mediante doble tincion con un anticuerpo anti-BDCA2 y un anticuerpo anti-BDCA4, se encontro que la poblacion de pDC disminuyo mas que el tratamiento con Synagis del anticuerpo de control (FIG. 18B y FIG. 18C). Estos resultados mostraron que el tratamiento del anticuerpo quimerico anti-PTPRS abolio por consiguiente la produccion de IFNa mediante la estimulacion con CpG2216.
Aplicabilidad Industrial
La presente invencion proporciona un anticuerpo de acuerdo con las reivindicaciones que reconoce espedficamente PTPRS humana, el uso de un inmunogeno para la produccion del anticuerpo, y un metodo para la produccion de una celula que produce el anticuerpo anti-PTPRS humana.
Numeros de acceso
FERM BP-11356 FERM BP-11357 FERM BP-11358 FERM BP-11359 FERM BP-11360 FERM BP-11361 FERM BP-11362 FERM BP-11363
Texto libre de la lista
SEQ ID NO
: 3:
SEQ ID NO
: 4:
SEQ ID NO
: 5:
SEQ ID NO
: 6:
SEQ ID NO
: 7:
SEQ ID NO
: 8:
SEQ ID NO
: 9:
SEQ ID NO
10
SEQ ID NO
11
SEQ ID NO
12
SEQ ID NO
12
SEQ ID NO
13
SEQ ID NO
14
SEQ ID NO
15
SEQ ID NO
16
SEQ ID NO
17
SEQ ID NO
18
cebador directo cebador inverso cebador directo cebador inverso cebador directo cebador inverso cebador directo cebador inverso cebador antisentido cebador de anclaje n es desoxiinosina. cebador antisentido cebador AUAP cebador antisentido cebador antisentido cebador cebador

Claims (41)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    1. Un anticuerpo monoclonal o un fragmento que incluye una region de union a antigeno del mismo que se une a un dominio extracelular de la protema tirosina fosfatasa a de tipo receptor humano (PTPRS humana) sobre una celula dendntica plasmocitoide y suprime la produccion de IFN por, y/o la supervivencia de, la celula.
  2. 2. El anticuerpo monoclonal o fragmento de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde dicho anticuerpo es producido por el hibridoma 9H5-4 que se deposito como Num. de Acceso FERM BP-11356, el hibridoma 10F7-38 que se deposito como Num. de Acceso FERM BP-11357, el hibridoma 13G5-52 que se deposito como Num. de Acceso FERM BP-11358, el hibridoma 13G5-57 que se deposito como Num. de Acceso FERM BP-11359, el hibridoma 14A8-85 que se deposito como Num. de Acceso FERM BP-11360, el hibridoma 22H8-84 que se deposito como Num. de Acceso FERM BP-11361, el hibridoma 49F2-30 que se deposito como Num. de Acceso FERM BP-11362 o el hibridoma 55E7-79 que se deposito como Num. de Acceso FERM BP-11363.
  3. 3. El anticuerpo monoclonal o fragmento de acuerdo con la reivindicacion 2, en donde dicho anticuerpo es producido por el hibridoma 55E7-79 que se deposito como Num. de Acceso FERM BP-11363.
  4. 4. El anticuerpo monoclonal o fragmento de acuerdo con la reivindicacion 1, que se produce mediante recombinacion genetica a partir del anticuerpo producido por el hibridoma de acuerdo con la reivindicacion 2 o 3.
  5. 5. El anticuerpo monoclonal o fragmento de acuerdo con la reivindicacion 4, que es humanizado.
  6. 6. El anticuerpo monoclonal o fragmento de acuerdo con la reivindicacion 4 o 5, que se produce por ingeniena genetica utilizando un polinucleotido que codifica el anticuerpo.
  7. 7. El anticuerpo monoclonal o fragmento de acuerdo con la reivindicacion 1, que comprende:
    (A) una CDR1 de cadena pesada expuesta en el SEQ ID NO: 45, una CDR2 de cadena pesada expuesta en el SEQ ID NO: 46, una CdR3 de cadena pesada expuesta en el SEQ ID NO: 47, una CDR1 de cadena ligera expuesta en el SEQ ID NO: 50, una CDR2 de cadena ligera expuesta en el SEQ ID NO: 51, y una CDR3 de cadena ligera expuesta en el SEQ ID NO: 52;
    (B) una CDR1 de cadena pesada expuesta en el SEQ ID NO: 55, una CDR2 de cadena pesada expuesta en el SEQ ID NO: 56, una CdR3 de cadena pesada expuesta en el SEQ ID NO: 57, una CDR1 de cadena ligera expuesta en el SEQ ID NO: ID NO: 60, una CDR2 de cadena ligera expuesta en el SEQ ID NO: 61, y una cDr3 de cadena ligera expuesta en el SEQ ID NO: 62;
    (C) una CDR1 de cadena pesada expuesta en el SEQ ID NO: 65, una CDR2 de cadena pesada expuesta en el SEQ ID NO: 66, una CdR3 de cadena pesada expuesta en el SEQ ID NO: 67, una CDR1 de cadena ligera expuesta en el SEQ ID NO: ID NO: 70, una CDR2 de cadena ligera presentada en el SEQ ID NO: 71, y una cDr3 de cadena ligera expuesta en el SEQ ID NO: 72;
    (D) una CDR1 de cadena pesada expuesta en el SEQ ID NO: 27, una CDR2 de cadena pesada expuesta en el SEQ ID NO: 28, una CdR3 de cadena pesada expuesta en el SEQ ID NO: 29, una CDR1 de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 32, una CDR2 de cadena ligera expuesta en el SEQ ID NO: 33, y una CDR3 de cadena ligera expuesta en el SEQ ID NO: 34;
    (E) una region variable de cadena pesada expuesta en el SEQ ID NO: 44 y una region variable ligera expuesta en el SEQ ID NO: 49;
    (F) una region variable de cadena pesada expuesta en el SEQ ID NO: 54 y una region variable ligera expuesta en el SEQ ID NO: 59;
    (G) una region variable de cadena pesada expuesta en el SEQ ID NO: 64 y una region variable ligera expuesta en el SEQ ID NO: 69; o
    (H) una region variable de cadena pesada expuesta en el SEQ ID NO: 26 y una region variable ligera expuesta en el SEQ ID NO: 31.
  8. 8. El anticuerpo monoclonal o fragmento de acuerdo con la reivindicacion 1, que esta quimerizado.
  9. 9. El anticuerpo monoclonal o fragmento de acuerdo con la reivindicacion 8, que comprende:
    (A) una cadena pesada expuesta en el SEQ ID NO: 92 y una cadena ligera expuesta en el SEQ ID NO: 94;
    (B) una cadena pesada expuesta en el SEQ ID NO: 96 y una cadena ligera expuesta en el SEQ ID NO: 98;
    (C) una cadena pesada expuesta en el SEQ ID NO: 100 y una cadena ligera expuesta en el SEQ ID NO: 102; o
    (D) una cadena pesada expuesta en el SEQ ID NO: 36 y una cadena ligera expuesta en el SEQ ID NO: 38.
    de cadena de cadena de cadena de cadena
  10. 10. Un hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicacion 1.
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
  11. 11. Un metodo para la produccion de una celula que produce el anticuerpo monoclonal de la reivindicacion 1, que comprende:
    1) administrar una celula que expresa una protema exogena que incluye un dominio extracelular de PTPRS humana a un animal para inmunizar al animal con la celula y
    2) seleccionar una celula productora de anticuerpos que produce el anticuerpo de la reivindicacion 1 del animal inmunizado.
  12. 12. El anticuerpo o fragmento monoclonal de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde dicho anticuerpo puede obtenerse mediante las siguientes etapas:
    1) administrar a un animal una celula que expresa exogenamente una protema que incluye un dominio extracelular de PTPRS humana para inmunizar al animal con la celula;
    2) seleccionar una celula productora de anticuerpos que produce un anticuerpo que se une a PTPRS humana a partir de la celula productora de anticuerpos del animal inmunizado; y
    3) cultivar la celula productora de anticuerpos seleccionada en el apartado (2), y recoger del cultivo un anticuerpo que reconoce PTPRS humana, se une a una celula dendntica plasmocitoide y suprime la actividad de la celula dendntica plasmocitoide;
    en donde la actividad de la celula dendntica plasmocitoide es la produccion de IFN y/o la supervivencia celular.
  13. 13. El uso de un inmunogeno para la produccion del anticuerpo monoclonal de la reivindicacion 1, que comprende una celula animal que conserva exogena y expresablemente un polinucleotido que codifica una secuencia de aminoacidos que incluye un dominio extracelular de PTPRS humana, o una fraccion de membrana celular de la misma.
  14. 14. El uso de acuerdo con la reivindicacion 13, en donde la celula animal es una celula derivada de raton.
  15. 15. Un metodo para la deteccion de una celula dendntica plasmocitoide, que comprende poner en contacto un anticuerpo monoclonal o un fragmento que incluye una region de union a antfgeno del mismo que se une a un dominio extracelular de PTPRS humana con una celula sujeto y detectar dicho anticuerpo monoclonal o fragmento que se ha unido a la celula.
  16. 16. El anticuerpo monoclonal o fragmento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y 12 para uso en la deteccion de una celula dendntica plasmocitoide.
  17. 17. Un metodo ex vivo para suprimir la actividad de una celula dendntica plasmocitoide, que comprende poner en contacto el anticuerpo monoclonal o fragmento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y 12 con la celula dendntica plasmocitoide, en donde dicha actividad de la celula dendntica plasmocitoide es la produccion de IFN y/o la supervivencia celular.
  18. 18. El anticuerpo monoclonal o fragmento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y 12 para su uso en el tratamiento del organismo humano o animal mediante terapia.
  19. 19. El anticuerpo monoclonal o fragmento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y 12 para su uso en el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria en la que se mejora la expresion de IFN-alfa.
    - 109-
    FIG. 1
    MAPTWGPGMVSWGPMGLLWLLVGGCAAEEPPRFIKEPKDQIGVSGGVASFVCQATGDPKPRVTWNKKGKKVNSQRFETIEFDE
    Peptido Serial Dominio tipo Ig
    SAGAVLRIQPLRTPRDENVYECVAQNSVGEITVHAKLTVl REDQI PSGFPNIDMGPQLKWERTRTATMLCAASGNPDPEITWFKDF
    Dominio tipo Ig
    LPVDPSASNGRIKQLRSGALQIESSEETDQGKYECVATNSAGVRYSRPANI WRVRRVAPRFSILPMSHEIMPGGNVNITCVAVGSP
    Dominio similar a fibronectina tipo III
    MPYVKWMQGAEDLTPEDDMEyGRMyLELTDVKDSANYTCVAMSSI GVIFAVAQITVK.SLPKAPGTPMVTFNTATSITITWDSGNPD
    Dominio similar a fibronectina tipo III
    PySYYVJFYKSKSQnGPYQIKFniTTTRYRIGGiaPNRFYFIVWfiAVNSinOGPPSFRVVTRTGFOAPASAPRNVOARMIRATTMIVO
    Dominio similar a fibronectina tipo III
    \AfEFPVFPIMGI IRGYRVYYTMFPFHPVGNWOKHISIVnnai I TTWiaRI I FnFTYTVRVI AFTRVGnnPI SnPIQ\/KTnon\/pr;OPMNI
    RAEARSFTKITI SWSPPRQFRIIKYFI l-FRFnni-iGRF\/rtRTFnPTTRY\A/Fni k'PMTFYAFRI AARSPnm FtAFTP\/\/RORTI OSIRP
    Dominio similar a fibronectina tipo III
    KkIFKVKMiy KTRWI I .S\A/FFPnMYM.aPTPYKIOYM(ai Xi n\/nFiRTTtt*l ITHI k-PMTFVNF\/l TM RGSSLGGLQQTVTAWTAFNLLNG
    KPSVAPKPDADGFIMVYLPDGQSPVPVQSYFIVMVPLRKSRGGGFLTPLGSPEDMDLEELIQDISRLQRRSLRHSRQLEVPRPYIAAR
    FSVLPPTFHPGDQKQYGGFDNRGLEPGHRYVLFVLAVLQKSEPTFAASPFSDPFQLDNPDPQPIVDGEEGLIWVIGPVLAWFIICIVI
    Region transmembrana
    AILLYKNKPDSKRKDSEPRTKCLLNNADLAPHHPKDPVEMRRINFQTPGMLSHPPIPIADMAEHTERLKANDSLKLSQEYESIDPGQQ
    FTWEHSNLEVNKPKNRYANVIAYDHSRVILQPIEGIMGSDYINANYVDGYRCQNAYIATQGPLPETFGDFWRMVWEQRSATIVMMT
    Dominio PTP
    RLEEKSRIKCDQYWPNRGTETYGFIQVTLLDTIELATFCVRTFSLHKNGSSEKREVRQFQFTAWPDHGVPEYPTPFLAFLRRVKTCN
    PPDAGPIWHCSAGVGRTGCFIVIDAMLERIKPEKTVDVYGHVTLMRSQRNYMVQTEDQYSFIHEALLEAVGCGNTEVPARSLYAYIQ
    KLAQVEPG EHVTGMELEFKRLANSKAHTSRFISANLPCNKFKNRLVNIMPYESTRVCLQPIRGVEGSDYINASFIDGYRQQKAYIATQ Dominio PTP
    GPLAETTEDFWRMLWENNSTIWMLTKLREMGREKCHQYWPAERSARYQYFWDPMAEYNMPQYILREFKVTDARDGQSRTVRQ FQFTDWPEQGVPKSGEGFIDE1GQVHKTKEQFGQDGPISVHCSAGVGRTGVFITLSIVLERMRYEGWDIFQTVKMLRTQRPAMVQT EDEYQFCYQAALFYI GSFDHYAT
    - 110-
    Induccion relativa de ARNm
    imagen1
    pancreas
    bazo
    timo
    prostata
    testiculo
    ovario
    intestino
    recto
    leucocito
    sangre
    periferica
    360 1
    FIG. 3
    Nivel de expresion relativa
    _k ro ro gj
    tn © cn © tn o
    a o ° © O o o
    monocito
    pDC
    pDC estimulada con HSV
    Celula B
    Celula T
    Celula T activada
    Celula NK
    leucocito
    Tj
    P
    ro
    imagen2
    1(T
    FL4-H
    __
    o.ew
    FIG. 4
    FIG. 5
    CSN: Sobrenadante de cultivo
    PTPRS
    D2SC
    D2SC
    D2SC
    IgG de raton
    PTPRS
    D2SC
    IgG de cabra D2SC/1
    anticuerpo
    anti-IgG de cabra clasificada por FACS
  20. 0.027
    f 102
    FL4-H
    hPTPRS-pAb D2SC/1
    clasificada por FACS
    55E7
    2G2
    in’
    54.5 MJ
    Ilf
    ft!
    Ilf 1
    * 10 1.17 Ilf 14* 10*
    i«*
    0.27 8.ILM
    10*
    Ilf
    44% 1W.S* r , ,, 1.23
    r■ —■ . ii ■ ■.
    14* n* 10* I05 I44
    I
    2G6
    pAb PTPRS
    IgG de cabra
    28G10
    9D2
    13G5
    16H2
    9H5
  21. 0.44
    8.074
    IJJ
  22. 0.21
    0.13
    ki
    . l-Oi
    22H8
    10F7
    49F2
    4B2
    14A8
    imagen3
  23. 0.054
    a055'
  24. 0.059
  25. 0.058
    a054,
    CSN:28G10
    CSN:4B2
    CSN:2G2
    CSN:9H5
    ' 110* r——------
    CSN: 10F7
    CSN: 22H8
    CSN: 49F2
    CSN:9D2
    CSN: 14A8
  26. 99.2
  27. 98.
    1.76
    IgG de raton
    pAb hPTPRS
    CSN: 13G5
    IgG de Cabra
    CSN: 55E7
    CSN: 16H2
    CSN: Sobrenadante de cultivo
    F G. 7
    IgG de raton CSN: 2G6
    CSN: 28G10
    CSN: 4B2
    CSN: 2G2
    CSN: 9H5
    U.6S
    an
    CSN: 49F2
    CSN:9D2
    CSN: 14A8
    CSN: S5E7
    CSN:10F7
    CSN:22H8
    CSN:16H2
    IgG de
    Cabra
    pAb PTPRS
    CSN:13G5
    BDCA2
    imagen4
    imagen5
    imagen6
    (X055
  28. 0.072
    hPTPRF^
    hPTPRF."1!
    lgG2ak
    10F7
    22H8
    2G6
    4B2
    2G2
    9H5
    de raton
    pcDNA
    293T
    hPTPRD
    293T
    49F2
    14A8
    55 E7
    13G5
    pcDNA
    293T
    hPTPRD
    293T
    FIG. 9D
    Ig Control
    anticuerpo lgG2ak
    (contra
    2G6
    4B2
    2G2
    9H5
    10F7
    anti-Flag
    de raton
    anti-Flag)
    pcDNA
    293T
    293T
    ■r
    22H8
    49F2
    14A8
    55E7
    13G5
    pcDNA
    293T
    293T
    imagen7
    imagen8
    22H8-84
    106 1D1 10s t0* 10* 10* 10* 10* 10s 10* 10* 10* 10* 10s
    FU-H FU41 flA-H
    10* 10' 10* 10* to4
    FL4-M
    14A8-89
    IgG de raton
    9H5-4
    9H5-5
    9H5-7
    22H8-15
    D2SC/1
    hPTPRS T
    D2SC/1 3
    49F2-25
    49F2-30
    49F2-32
    10F7-39
    10F7-44
    D2SC/1
    hPTPRS
    D2SC/1
    FIG. 11B
    IgG de raton
    13G5-62
    D2SC/1 i*
    hPTPRS
    D2SC/1
    LU
    1«fl 10* 10* «’ 10* 1fl° 10' 10* 10s 10
    55E7-77
    55E7-78
    55E7-79
    14A8-85
    14A8-86
    D2SC/1
    hPTPRS
    D2SC/1
    imagen9
    FL4-M
    FU-H
    9H5-4
    9H5-5
    IgG de raton
    13G5-60
    to* I01 tV l*1 104
    14A8-66
    '0* TTTT--------]
    !</ J41 l®1 10*
    14A8-89
    IgG de cabra
    pAb hPTPRS
    BDCA2
    22H8-19
    9H5-4
    9H5-5
    9H5-7
    22H8-84
    22H8-15
    IgG
    de raton
    0*3
    49F2-25
    49F2-30
    49F2-32
    10F7-38
    10F7-39
    10F7-44
    13G5-52
    1305-57
    13G5-60
    55E7-77
    55E7-78
    55E7-79
    14A8-85
    14A8-86
    14A8-89
    FIG. 11D
    imagen10
    FL2-H: PC
    FL2-H: PE
    ID0 101 102 103 104
    FL2-H: PC
    Endotoxina (UE/mg Ab)
  29. 0.200
  30. 0.180
    0,160
    0,140
  31. 0.100
  32. 0.080
  33. 0.060
  34. 0.040
    0,020
    0,000
    9H5-4 10F7-38 13G5-52 13G5-57 14A8-85 22H8-84 49F2-30 55E7-79
    FIG. 13
    13G5-S2
    13G5-57
    9H5-4
    10F7-38*
  35. 98.3
  36. 99.8
    1200
    13G5-57 A6_3_5ug-mJ
    49F2-30
    55E7-79
    22H8-84
    14A8-85
    99,6
  37. 98.2
  38. 99.4
    FSCxSSC
    lgG1, K de raton * lgG2b, K de raton *
  39. 0.13
    marca: 10ug/mL-20—25^L
    live gale; FSCxSSC
    live gate; FSCxSSC
    mou3e IgGlJi
    sin marca: 5jug/mL-50juL
    mouse igG2t> 9
    imagen11
    imagen12
    imagen13
    55E7- Sin
    79 Anlicuerpof
    lgG1,k de raton
    lgG2b,k de raton
    FIG. 16
    Analisis de citotoxicidad: PTPRShumana/CHO
    20,0
    10,0
    Analisis de citotoxicidad: PTPRS de raton/CHO
  40. 120.0
    100,0
    60,0
  41. 40.0
    20,0
    lgG1,k
    lgG2b,k
    55E7-
    Sin
    de raton
    de raton
    79 An
    icuerpo
    citotoxicidad (%) CD citotoxicidad (%)
    A
    Analisis ADCC
    imagen14
    imagen15
    imagen16
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