JP2017048183A - 抗ヒト受容体型プロテインチロシンホスファターゼσ抗体 - Google Patents

抗ヒト受容体型プロテインチロシンホスファターゼσ抗体 Download PDF

Info

Publication number
JP2017048183A
JP2017048183A JP2016170634A JP2016170634A JP2017048183A JP 2017048183 A JP2017048183 A JP 2017048183A JP 2016170634 A JP2016170634 A JP 2016170634A JP 2016170634 A JP2016170634 A JP 2016170634A JP 2017048183 A JP2017048183 A JP 2017048183A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
antibody
ptprs
cell
cells
human
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2016170634A
Other languages
English (en)
Other versions
JP6412072B2 (ja
Inventor
智英 山崎
Tomohide Yamazaki
智英 山崎
ザオ、ジン
Jing Zhao
晃司 石田
Koji Ishida
晃司 石田
恭枝 柴田
Yasue Shibata
恭枝 柴田
チョウ、ミンクウォン
Mink-Won Cho
まゆき 遠藤
Mayuki Endo
まゆき 遠藤
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SBI Biotech Co Ltd
Original Assignee
SBI Biotech Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SBI Biotech Co Ltd filed Critical SBI Biotech Co Ltd
Publication of JP2017048183A publication Critical patent/JP2017048183A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6412072B2 publication Critical patent/JP6412072B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5058—Neurological cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G01N33/56972—White blood cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Mycology (AREA)

Abstract

【課題】ヒト受容体型プロテインチロシンホスファターゼσ抗体の提供。【解決手段】受託番号ＦＥＲＭＢＰ−１１３５６として寄託されたハイブリドーマ９Ｈ５−４、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−１１３５７として寄託されたハイブリドーマ１０Ｆ７−３８、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−１１３５８として寄託されたハイブリドーマ１３Ｇ５−５２、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−１１３５９として寄託されたハイブリドーマ１３Ｇ５−５７、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−１１３６０として寄託されたハイブリドーマ１４Ａ８−８５、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−１１３６１として寄託されたハイブリドーマ２２Ｈ８−８４、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−１１３６２として寄託されたハイブリドーマ４９Ｆ２−３０、または受託番号ＦＥＲＭＢＰ−１１３６３として寄託されたハイブリドーマ５５Ｅ７−７９が産生するモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。【選択図】なし

Description

本発明は、ヒト受容体型プロテインチロシンホスファターゼσに結合する抗体に関する。以下、「プロテインチロシンホスファターゼ」をＰＴＰと略し、「受容体型プロテインチロシンホスファターゼ」をＲＰＴＰまたはＰＴＰＲと略し、「受容体型プロテインチロシンホスファターゼσ」をＲＰＴＰ−σ、ＰＴＰ−σ、ＰＴＰＲＳと略することがあり、「ヒト」および「マウス」をそれぞれｈおよびｍという接頭語で表示することがある。
インターフェロン（以下、「インターフェロン」をＩＦＮと略することがある。）は、抗ウイルス免疫応答における最も重要なサイトカインである。ヒトの血中のインターフェロン産生細胞（ＩＰＣ：ＩＰＣは、樹状細胞（ＤＣ）の前駆細胞と位置付けられる未分化のリンパ球系樹状細胞である。ＩＰＣは、形質細胞様樹状細胞またはプラズマ細胞様樹状細胞（ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ：ｐＤＣ）と呼ばれることがある。以下、ＩＰＣとｐＤＣはこれを同義であるとし、以下原則として用語ｐＤＣで統一する。）は、ＣＤ４と主要組織適合複合体クラスＩＩ蛋白質を発現する。しかし、このような細胞の数は少なくまた細胞は急速にアポトーシスを起こし、さらにリニエージマーカーを欠いていることから、今までそれらの細胞は単離され詳しい特徴づけがされていなかった。ｐＤＣは、ＣＤ４＋ＣＤ１１ｃ−２型樹状細胞前駆細胞であることがわかり、微生物による刺激後、他の血液細胞よりも、２００〜１０００倍多いＩＦＮを産生することがわかっている。したがって、ｐＤＣ２は抗ウイルスおよび抗腫瘍免疫応答において決定的な免疫系エフェクター細胞である。
ＩＦＮαおよびＩＦＮβは、抗ウイルス活性または抗腫瘍活性を有するＩ型ＩＦＮとして知られている。一方で、ＩＦＮαは自己免疫疾患に関連していることが明らかにされた。たとえば、以下の自己免疫疾患患者においてＩＦＮαの異常産生が報告されている。そしてＩＦＮαの中和によって自己免疫症状が緩和される可能性が示唆されている。
全身性エリテマトーデス（Shiozawa et al., Arthr. & Rheum. 35, 412, 1992）、慢性関節リウマチ（Hopkins et al.,Clin. Exp. Immunol. 73, 88, 1988）、さらに、組み換えＩＦＮα２やＩＦＮの投与によって自己免疫疾患症状が発現または悪化した例が報告されている（Wada et al., Am.J. Gastroenterol. 90, 136, 1995；Perez et al., Am. J. Hematol. 49, 365, 1995；Wilson LE et al, Semin Arthritis, Rheum. 32, 163-173, 2002）。
また、ＩＦＮαが樹状細胞（ＤＣ）の分化を誘導していることも明らかになった。樹状細胞は抗原提示細胞でもあるため、樹状細胞の分化誘導は、自己免疫疾患における重要なメカニズムを構成していると考えられる。実際、ＩＦＮαの樹状細胞の分化誘導は、全身性エリテマトーデスの発症に密接に関連していることが示唆されている（Blanco et al., Science, 16:294,1540-1543,2001）。このように、ＩＦＮαの抗腫瘍活性と自己免疫疾患との密接な関連性が指摘されている。また、ＩＦＮαは乾癬の発症にも密接に関わっている（Nestle FO et al., J.Exp.Med. 202, 135-143, 2005）。
わずかな量のｐＤＣしか血中に存在していない。末梢血リンパ球におけるｐＤＣの割合は、１％以下と考えられている。しかしｐＤＣはきわめて高いＩＦＮの産生能を有する。ｐＤＣのＩＦＮ産生能は、たとえば３０００ｐｇ／ｍＬ／１０４ｃｅｌｌｓに達する。すなわち、細胞の数は少ないが、ウイルス感染時に産生される血中のＩＦＮαまたはＩＦＮβの大部分は、ｐＤＣによってもたらされていると考えられうる。
ｐＤＣは、ウイルス刺激によって樹状細胞に分化し、Ｔ細胞によるＩＦＮ−γやＩＬ−１０の産生を誘導する。またｐＤＣは、ＩＬ−３刺激によっても樹状細胞に分化する。ＩＬ−３刺激によって分化した樹状細胞は、Ｔ細胞によるＴｈ２サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０）の産生を誘導する。このようにｐＤＣは、刺激の違いによって異なる樹状細胞に分化する性質をもつ。
したがってｐＤＣは、１つはＩＦＮ産生細胞としての側面、他は樹状細胞の前駆細胞としての側面の、２つの側面をもつ細胞である。いずれの細胞も、免疫システムにおいて重要な役割を担っている。すなわちｐＤＣは、様々な面で免疫システムを支える重要な細胞の一つである。
ＩＦＮのような液性因子の活性調節には、当該因子を認識する抗体の投与が有効である。たとえばインターロイキン（ＩＬ）−１またはＩＬ−４に対する抗体によって自己免疫疾患を治療する試みが実用化された（Guler et al., Arthritis Rheum, 44, S307, 2001）。またインターフェロン（ＩＦＮｓ）においても同様に、中和抗体が自己免疫疾患の治療薬となりうると考えられている（Stewart, TA. Cytokine Growth Factor Rev. 14; 139-154, 2003）。ｐＤＣが産生するＩＦＮに対しても同様のアプローチが有効であろうことは予想できる。しかしこのようなアプローチは、産生された液性因子の作用の阻害に基づいている。もし目的とする液性因子の産生を直接的に制御することができれば、より本質的な治療効果を達成することができる。
ヒトｐＤＣを認識する抗体が報告されている。たとえば、抗ＢＤＣＡ−２モノクローナル抗体は、ヒトｐＤＣに特異的なモノクローナル抗体である（Dzionek A. et al., J.Immunol 165: 6037-6046, 2000）。抗ＢＤＣＡ−２モノクローナル抗体は、ヒトｐＤＣのＩＦＮ産生を抑制する作用を有することが明らかにされた（J. Exp. Med.194:1823-1834, 2001）。また、マウスのインターフェロン産生細胞を認識するモノクローナル抗体が、インターフェロンの産生を抑制することも報告された（Blood 2004 Jun 1;103/11:4201-4206. Epub 2003 Dec）。マウスのｐＤＣに対するモノクローナル抗体が樹状細胞数を減少させることが報告された（J. Immunol. 2003, 171:6466-6477）。
同様にヒトｐＤＣを認識し、その活性を調節しうる抗体が提供されれば有用である。たとえば本発明者らは既に、Ｌｙ４９Ｑを認識する抗体がマウスｐＤＣに特異的に結合することを明らかにしている。しかしＬｙ４９Ｑに対する抗体は、マウスｐＤＣの活性には干渉しなかった（Blood, 1 April 2005, vol. 105, No. 7, pp. 2787-2792：ＷＯ２００４／１３３２５Ａ１)。
プロテインホスファターゼはグリコーゲン代謝の研究において見出された脱リン酸化酵素である。プロテインチロシンホスファターゼ（ＰＴＰ)のほかに、プロテインセリン／スレオニンホスファターゼ、リン脂質特異的ホスファターゼ等が発見されており、これらはプロテインホスファターゼのスーパーファミリーを形成している。これらのうちプロテインチロシンホスファターゼは、タンパク質のチロシン残基に認められる可逆的なリン酸化修飾のうちのリン酸化を担う酵素である。一方、タンパク質のチロシン残基に認められる可逆的なリン酸化修飾のうちリン酸化を担う酵素としてプロテインチロシンキナーゼ（ＰＴＫ）がある。
プロテインチロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）はその細胞外ドメインにおけるリガンドの結合情報を細胞内ドメインのホスファターゼ活性に変換するが、プロテインチロシンキナーゼ（ＰＴＫ）がリガンドの結合により活性化されるのに対し、プロテインチロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）は通常、リガンドの結合により不活性化されると考えられている。したがって、プロテインチロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）とプロテインチロシンキナーゼ（ＰＴＫ）のいずれにおいてもリガンド刺激はリン酸化レベルの上昇につながるものの、シグナル特性には大きな違いが予想されている。プロテインチロシンキナーゼ（ＰＴＫ）の場合、受容体同士が相互にリン酸化し活性化されるというポジティブ・フィードバック制御が行われ、プロテインチロシンキナーゼ（ＰＴＫ）分子の局所の活性化が細胞膜上の他のプロテインチロシンキナーゼ（ＰＴＫ）分子に伝播し、その結果広範囲でリン酸化が上昇する。一方で、プロテインチロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）においてはリガンドが結合した分子のみが不活性化され、基質のリン酸化は局所的に上昇するに留まる。多くの生理機能、細胞機能に関わるプロテインチロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）は脳神経生化学、免疫学、ガン、糖尿病などの広い領域において注目を浴びている（自然科学研究機構、基礎生物学研究所、統合神経生物学研究部門のホームページhttp://niwww3.nibb.ac.jp/RPTP.pdfの写し）。
プロテインチロシンホスファターゼファミリーは、細胞膜貫通領域を有する受容体型と非受容体型に分類することができる。哺乳類には２１分子の受容体型プロテインチロシンホスファターゼ（ＲＰＴＰまたはＰＴＰＲとも略される）が存在し、８つのサブファミリーに分類され、各サブファミリーは特有の細胞外構造を有し、イムノグロブリン様ドメイン、フィブロネクチンIII型様ドメイン、炭酸脱水酵素様ドメイン、ＭＡＭドメインなどが認められる（Nat Rev Mol Cell Biol., Vol. 7, 833-846, 2006）。
ヒト受容体型プロテインチロシンホスファターゼσ（ｈＲＰＴＰ−σ、ｈＰＴＰ−σまたはｈＰＴＰＲＳと略されるが、ここでは主としてｈＰＴＰＲＳの略記が用いられる）は、ＬＡＲ（白血球抗原関連プロテインチロシンホスファターゼ）、受容体型プロテインチロシンホスファターゼδ（ＰＴＰ−δ）とともにＲ２Ａサブファミリーに属する。ＰＴＰＲファミリーの酵素は動物の発生初期から成熟後までの神経系を含む様々な組織で発現しているが、それぞれの生理機能についてはリガンド分子と基質分子の同定が容易でないことがあり明らかになっているものは少ない。
樹状細胞（ＤＣ）は、血液中、リンパ組織中などに存在する生体内における主要な抗原提示細胞であり、骨髄系樹状細胞（ｍＤＣ）と形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）に大きく分類される。ｐＤＣはその細胞表面にＴｏｌｌ様受容体としてＴＬＲ７およびＴＬＲ９を選択的に発現し、Ｉ型インターフェロンαおよびβ、特にインターフェロンαを産生する。
最近の研究により、樹状細胞に作用してその成熟や活性化を制御する種々のリガンド分子が明らかにされ、また、その受容体からの細胞内シグナル伝達機構が明らかになりつつある。しかしながら、樹状細胞の機能の調節および制御機構については不明な点が多い。他の多くの細胞で明らかにされてきたのと同様に、樹状細胞においても、タンパク質のリン酸化が受容体からのシグナル伝達・細胞運動/遊走性の制御等に重要な役割を果たしていると考えられている。タンパク質リン酸化の負の調節因子であるプロテインホスファターゼは、シグナルの強さ、長さを適正に保ち、結果、樹状細胞の活性化や機能を調節する因子として、有力な候補である。
（財団法人北海道科学技術総合振興センター（略称：ノーステック財団）のホームページ中の、田沼延公（北海道大学遺伝子病制御研究所）「樹状細胞成熟過程で誘導されるチロシンホスファターゼの機能解析」http://www.noastec.jp/kinouindex/data2005/pdf/01/01_20.pdf）
国際公開ＷＯ９５／９６５６Ａ１号公報はＲＰＴＰ−σ（ＰＴＰＲＳ）とそれをコードする核酸を開示しているが、開示されているアミノ酸配列はラット由来のものであり、ＰＴＰＲＳに特異的な抗体については言及がない。抗ヒトＰＴＰＲＳ抗体についても国際公開ＷＯ９５／９６５６Ａ１号公報は開示していない。
国際公開ＷＯ２００７／４１３１７Ａ１号公報は、少なくともＲＰＴＰ−σかＲＰＴＰ−δと特異的に結合し、免疫細胞の免疫応答性を抑制する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。この文献には、ＲＰＴＰと特異的に結合する抗体を使用することによりポックスウイルスポリペプチドＡ４１ＬとＲＰＴＰとの結合を競合的に阻害し、結果的に免疫細胞の免疫応答性の抑制が達成される旨が記載されている。しかし、この文献はＲＰＴＰ−σ（ＰＴＰＲＳ）と特異的に結合する抗体を実際に取得したことを開示してはおらず、その実施例の記載から判断する限り、Ａ４１Ｌと結合する免疫細胞で発現されたＲＰＴＰが、同じサブタイプＲ２Ａに属するＲＰＴＰ−σ、ＲＰＴＰ−δおよびＬＡＲの一部であることを確認し、ＬＡＲのイムノグロブリン様ドメインとＦｃとの融合タンパク質（ＬＡＲ（Ｉｇドメイン）−Ｆｃ融合タンパク質）を作成したに過ぎない。国際公開ＷＯ２００７／４１３１７Ａ１号公報には、ＲＰＴＰ−σのみに特異的な抗体やその作成が開示されているとは言いがたい。
ＲＰＴＰ−σ、即ち本願で言うＰＴＰＲＳの特定の部位にのみ結合する抗体や、同じサブタイプＲ２Ａに属するＲＰＴＰ−δやＬＡＲには結合せずにＲＰＴＰ−σ（ＰＴＰＲＳ）に特異的に結合し得る抗体は得られていない。ヒトＰＴＰＲＳがｐＤＣにおいて特異的な発現が見られる分子であるが、これまでヒトＰＴＰＲＳに対する抗体は得られていない。
国際公開ＷＯ２００４／１３３２５Ａ１号公報 国際公開ＷＯ９５／９６５６Ａ１号公報 国際公開ＷＯ２００７／４１３１７Ａ１号公報
Shiozawa et al., Arthr. & Rheum. 35, 412, 1992 Hopkins et al.,Clin. Exp. Immunol. 73, 88, 1988 Wada et al., Am.J. Gastroenterol. 90, 136, 1995 Perez et al., Am. J. Hematol. 49, 365, 1995 Wilson LE et al, Semin Arthritis. Rheum. 32, 163-173, 2002 Blanco et al., Science, 16:294,1540-1543,2001 Nestle FO et al., J.Exp.Med. 202, 135-143, 2005 Guler et al., Arthritis Rheum., 44. S307, 2001 Stewart, TA. Cytokine Growth Factor Rev. 14; 139-154, 2003 Dzionek, A. et al. J.Immunol. 165: 6037-6046, 2000 J. Exp. Med.194:1823-1834, 2001 Blood 2004 Jun 1;103/11:4201-4206. Epub 2003 Dec J. Immunol. 2003, 171:6466-6477 Blood, 1 April 2005, Vol. 105, No. 7, pp. 2787-2792 http://niwww3.nibb.ac.jp/RPTP.pdf Nat Rev Mol Cell Biol., Vol. 7, 833-846, 2006 http://www.noastec.jp/kinouindex/data2005/pdf/01/01_20.pdf
本発明の目的は、ヒト受容体型プロテインチロシンホスファターゼσ（ヒトＰＴＰＲＳ、ｈＲＰＴＰ−σ）に結合する抗体の提供、ならびにｐＤＣの検出、同定、または単離である。また本発明の目的は、ｐＤＣの活性の調節である。
本発明者らは、ヒトｐＤＣに関する研究を通じて、ＰＴＰＲＳの発現がｐＤＣにおいて特異的に亢進していることを確認した。そこで本発明者らは、ＰＴＰＲＳの抗体の作成と、その作用の解明を試みた。
生体由来の微量のタンパク質を認識する抗体を得るためには、一般に、遺伝子組み換え技術によって作製されたタンパク質が免疫原として利用される。本発明者らは、既に明らかにされているヒトＰＴＰＲＳのｃＤＮＡの塩基配列とそれによってコードされるアミノ酸配列(GenBank Accession No. NM_002856.3)の情報を基に、ヒトＰＴＰＲＳの発現を試みた。
タンパク質の抗体を得るために、天然のタンパク質の部分アミノ酸配列を免疫原として利用することもしばしば試みられる。しかし、抗体が細胞表面の分子を認識するためには、細胞表面においてエピトープとして抗体により認識される部分を構成している領域が選択されるべきである。したがって、断片アミノ酸配列を免疫原としてヒトＰＴＰＲＳに特異的な抗体を得ることは、現実的でないと考えられた。
このような状況の下で、本発明者らは、特殊な免疫原を利用することによってｐＤＣに結合する抗体が得られることを明らかにした。さらに、こうして得られた抗体がヒトｐＤＣを特異的に認識し、さらにその活性を調節する作用を有することを確認して本発明を完成した。
即ち本発明は、以下の抗ヒトＰＴＰＲＳ抗体、その製造方法、ならびにその用途に関する。
本発明は以下の通りである。
（１）ヒト受容体型プロテインチロシンホスファターゼσ（ヒトＰＴＰＲＳ）の細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
（２）形質細胞様樹状細胞に結合する前記（１）に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
（３）受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３５６として寄託されたハイブリドーマ９Ｈ５−４、
受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３５７として寄託されたハイブリドーマ１０Ｆ７−３８、
受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３５８として寄託されたハイブリドーマ１３Ｇ５−５２、
受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３５９として寄託されたハイブリドーマ１３Ｇ５−５７、
受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３６０として寄託されたハイブリドーマ１４Ａ８−８５、
受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３６１として寄託されたハイブリドーマ２２Ｈ８−８４、
受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３６２として寄託されたハイブリドーマ４９Ｆ２−３０、または
受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３６３として寄託されたハイブリドーマ５５Ｅ７−７９が産生するモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
（４）前記（１）または（２）に記載のモノクローナル抗体のいずれかを産生するハイブリドーマ。
（５）受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３５６として寄託されたハイブリドーマ９Ｈ５−４、
受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３５７として寄託されたハイブリドーマ１０Ｆ７−３８、
受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３５８として寄託されたハイブリドーマ１３Ｇ５−５２、
受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３５９として寄託されたハイブリドーマ１３Ｇ５−５７、
受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３６０として寄託されたハイブリドーマ１４Ａ８−８５、
受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３６１として寄託されたハイブリドーマ２２Ｈ８−８４、
受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３６２として寄託されたハイブリドーマ４９Ｆ２−３０、または
受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３６３として寄託されたハイブリドーマ５５Ｅ７−７９が産生するモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
（６）前記（５）に記載のハイブリドーマを培養し、培養物からモノクローナル抗体を採取する工程を含む、モノクローナル抗体の製造方法。
（７）次の工程を含む、ヒトＰＴＰＲＳに結合するモノクローナル抗体を産生する細胞の製造方法；
１）ヒトＰＴＰＲＳの細胞外ドメインを含む外来性のタンパク質を発現する細胞を免疫動物に投与する工程、および
２）前記免疫動物の抗体産生細胞から、ヒトＰＴＰＲＳに結合する抗体を産生する抗体産生細胞を選択する工程。
（８）ヒトＰＴＰＲＳを発現する細胞が、ヒトＰＴＰＲＳの細胞外ドメインを含むアミノ酸配列をコードする外来性のポリヌクレオチドを発現可能に保持する細胞である前記（７）に記載の方法。
（９）前記細胞が動物細胞である前記（８）に記載の方法。
（１０）前記細胞がヒト由来の細胞である前記（９）に記載の方法。
（１１）前記ヒト由来の細胞が、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞である前記（１０）に記載の方法。
（１２）得られた抗体産生細胞をクローン化する工程を付加的に含む、前記（７）〜（１１）のいずれか一項に記載の方法。
（１３）前記（９）に記載の方法によって得られた抗体産生細胞を培養し、その培養物からモノクローナル抗体を採取する工程を含む、ヒトＰＴＰＲＳの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体の製造方法。
（１４）下記の工程によって得ることができる、ヒトＰＴＰＲＳを認識するモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片：
１）ヒトＰＴＰＲＳの細胞外ドメインを含むタンパク質を外来性に発現する細胞を免疫動物に投与する工程、
２）前記免疫動物の抗体産生細胞から、ヒトＰＴＰＲＳに結合する抗体を産生する抗体産生細胞を選択する工程、および
３）工程２）で選択された抗体産生細胞を培養しその培養物からヒトＰＴＰＲＳを認識する抗体を回収する工程。
（１５）（ａ）ヒトＰＴＰＲＳの細胞外ドメインを含むアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを外来性に発現可能に保持する動物細胞、またはその細胞膜分画を含む、ヒトＰＴＰＲＳに結合する抗体を製造するための免疫原。
（１６）動物細胞がヒト由来の細胞である前記（１５）に記載の免疫原。
（１７）ヒトＰＴＰＲＳの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片を被検細胞と接触させ、該細胞に結合したモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片を検出する工程を含む、形質細胞様樹状細胞の検出方法。
（１８）ヒトＰＴＰＲＳの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片を含む、形質細胞様樹状細胞の検出用試薬。
（１９）次の成分のいずれかを形質細胞様樹状細胞に接触させる工程を含む、形質細胞様樹状細胞の活性抑制方法：
（ａ）ヒトＰＴＰＲＳに結合し、形質細胞様樹状細胞の活性を抑制するモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片、
（ｂ）（ａ）のモノクローナル抗体の相補性決定領域を移植したイムノグロブリン、またはその抗原結合領域を含む断片。
（２０）次の成分のいずれかを生体に投与する工程を含む、生体中の形質細胞様樹状細胞の活性抑制方法：
（ａ）ヒトＰＴＰＲＳに結合し、形質細胞様樹状細胞の活性を抑制するモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片、
（ｂ）（ａ）のモノクローナル抗体の相補性決定領域を移植したイムノグロブリン、またはその抗原結合領域を含む断片。
（２１）形質細胞様樹状細胞の活性が、インターフェロン産生活性およびインターフェロン産生細胞の生存のいずれか、または両方である前記（１９）または前記（２０）に記載の方法。
（２２）次の成分のいずれかを有効成分として含む、形質細胞様樹状細胞の活性抑制剤：
（ａ）ヒトＰＴＰＲＳに結合し、形質細胞様樹状細胞の活性を抑制するモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片、
（ｂ）（ａ）のモノクローナル抗体の相補性決定領域を移植したイムノグロブリン、またはその抗原結合領域を含む断片。
（２３）形質細胞様樹状細胞の活性が、インターフェロン産生活性およびインターフェロン産生細胞の生存のいずれか、または両方である前記（２２）に記載のインターフェロン産生細胞の活性抑制剤。
本発明は、ヒトＰＴＰＲＳを特異的に認識する抗体、その抗体の製造に有用な免疫原、およびその免疫原を利用する抗ヒトＰＴＰＲＳ抗体の製造方法を提供する。ヒトＰＴＰＲＳは、ＲＰＴＰファミリーに属する膜タンパク質である。本発明者らは、ヒトＰＴＰＲＳを特異的に認識する抗体が容易に得られることを明らかにした。本発明によって得ることができる抗ヒトＰＴＰＲＳ抗体は、他のＲＰＴＰファミリーを発現している細胞と、ヒトｐＤＣを識別する、高い特異性を有する抗体である。
好ましい態様において、本発明によって提供された抗ヒトＰＴＰＲＳ抗体は、ヒトｐＤＣと結合する。しかも本発明の抗体は、ヒトｐＤＣを特異的に認識する。したがってｐＤＣの検出や単離に有用である。ｐＤＣは、タイプ１ＩＦＮの大部分を産生する細胞である。したがってその検出や単離は、自己免疫疾患のような、ｐＤＣが関与する疾患の診断や研究において重要である。
さらに、本発明によって提供された抗ヒトＰＴＰＲＳ抗体は、好ましい態様において、ヒトｐＤＣの活性を調節する作用を有する。したがって、本発明の抗ヒトＰＴＰＲＳ抗体は、ｐＤＣの活性抑制に利用することができる。したがって、本発明の抗体を利用したｐＤＣの活性抑制を利用すれば、ＩＦＮαの発現が亢進した自己免疫疾患の患者においても、治療効果を期待することができる。
ｐＤＣは、わずかな細胞で多量のＩＦＮを産生する。ＩＦＮの中和には、ＩＦＮの分子数に応じた抗体が必要である。しかし本発明においては、産生細胞の活性が直接抑制される。その結果、抗ＩＦＮ抗体による中和と比較して、より少量の抗体で強力なＩＦＮの抑制効果を期待できる。さらに、持続的にＩＦＮが産生されている場合には、ＩＦＮの抗体による中和は一過的な抑制に留まると予想されるが、本発明においては、ｐＤＣの活性が抑制されることから、長期間にわたるＩＦＮ産生抑制効果が期待できる。
図１はＰＴＰＲＳのアミノ酸配列（配列番号１）である。ＰＴＰＲＳは、免疫グロブリン様ドメイン(Ig-like domain)およびフィブロネクチンIII型様ドメインを細胞外領域に有する、一回膜貫通膜タンパク質である。また、細胞内領域に２つのプロテインチロシンホスファターゼ領域(PTP domain)を有する。 図２は各種免疫細胞におけるＰＴＰＲＳの相対発現レベルを示すグラフである。ＰＴＰＲＳがｐＤＣ特異的に発現していることが示された。 図３はＰＴＰＲＳ遺伝子の発現の各組織間での比較を示すグラフである。ＰＴＰＲＳ ｍＲＮＡが膵臓や卵巣に比較的高い発現を示し、他の組織にも広範囲に発現している。 図４はヒトＰＴＰＲＳ（ｈＰＴＰＲＳ）発現細胞のＦＡＣＳソーティングによる選択を示す。 図５は免疫したｈＰＴＰＲＳ／Ｄ２ＳＣ／１細胞を用いたハイブリドーマのFACSスクリーニングを示す。抗ｈＰＴＰＲＳ抗体を産生する13個のハイブリドーマが得られた。 図６はＣＡＬ−１細胞を用いたＦＡＣＳスクリーニングを示す。 図７はヒト末梢血ｐＤＣを用いたＦＡＣＳスクリーニングを示す。 図８はｈＰＴＰＲＳと他のＰＴＰＲとの相同性を示すグラフである。ＰＴＰＲＳはＰＴＰＲファミリーに属し、そのうちいくつかのファミリー分子のアミノ酸配列はＰＴＰＲＳのアミノ酸配列に対して高い相同性を有する。 図９ＡはＰＴＰＲＳを認識し、ヒトｐＤＣに特異的に結合する抗体を産生する１０種類のハイブリドーマ細胞培養上清(２Ｇ６、４Ｂ２、２Ｇ２、９Ｈ５、１０Ｆ７、２２Ｈ８、４９Ｆ２、１４Ａ８、５５Ｅ７、１３Ｇ５)がＰＴＰＲＳのみに特異的に結合するかどうかを示す試験結果である（ｈＰＴＰＲＥは細胞表面に発現しなかった）。その結果、２Ｇ６はＰＴＰＲＦと交差反応性を示し(図９のＤ)、また４Ｂ２はＰＴＰＲＤと交差反応性を示した(図９のＣ)。それ以外の９種類の抗体はＰＴＰＲＳ特異的な結合を示した。 図９ＢはＰＴＰＲＳを認識し、ヒトｐＤＣに特異的に結合する抗体を産生する１０種類のハイブリドーマ細胞培養上清(２Ｇ６、４Ｂ２、２Ｇ２、９Ｈ５、１０Ｆ７、２２Ｈ８、４９Ｆ２、１４Ａ８、５５Ｅ７、１３Ｇ５)がＰＴＰＲＳのみに特異的に結合するかどうかを示す試験結果である（ｈＰＴＰＲＥは細胞表面に発現しなかった）。その結果、２Ｇ６はＰＴＰＲＦと交差反応性を示し(図９のＤ)、また４Ｂ２はＰＴＰＲＤと交差反応性を示した(図９のＣ)。それ以外の９種類の抗体はＰＴＰＲＳ特異的な結合を示した。 図９ＣはＰＴＰＲＳを認識し、ヒトｐＤＣに特異的に結合する抗体を産生する１０種類のハイブリドーマ細胞培養上清(２Ｇ６、４Ｂ２、２Ｇ２、９Ｈ５、１０Ｆ７、２２Ｈ８、４９Ｆ２、１４Ａ８、５５Ｅ７、１３Ｇ５)がＰＴＰＲＳのみに特異的に結合するかどうかを示す試験結果である（ｈＰＴＰＲＥは細胞表面に発現しなかった）。その結果、２Ｇ６はＰＴＰＲＦと交差反応性を示し(図９のＤ)、また４Ｂ２はＰＴＰＲＤと交差反応性を示した(図９のＣ)。それ以外の９種類の抗体はＰＴＰＲＳ特異的な結合を示した。 図９ＤはＰＴＰＲＳを認識し、ヒトｐＤＣに特異的に結合する抗体を産生する１０種類のハイブリドーマ細胞培養上清(２Ｇ６、４Ｂ２、２Ｇ２、９Ｈ５、１０Ｆ７、２２Ｈ８、４９Ｆ２、１４Ａ８、５５Ｅ７、１３Ｇ５)がＰＴＰＲＳのみに特異的に結合するかどうかを示す試験結果である（ｈＰＴＰＲＥは細胞表面に発現しなかった）。その結果、２Ｇ６はＰＴＰＲＦと交差反応性を示し(図９のＤ)、また４Ｂ２はＰＴＰＲＤと交差反応性を示した(図９のＣ)。それ以外の９種類の抗体はＰＴＰＲＳ特異的な結合を示した。 図１０は抗ＰＴＰＲＳ抗体のサルとの交差反応性の試験結果である。すべてのハイブリドーマ細胞培養上清はカニクイザルのｐＤＣ細胞群(Lineage-CD123+ HLA-DR+)に特異的に結合した。 図１１Ａはハイブリドーマのシングル化ソーティングを示す。ＦＡＣＳ Ａｒｉａ（ＢＤ）を用いて単一細胞ソーティングを行い、そして、ハイブリドーマの細胞培養上清を用い、Ｄ２ＳＣ／１細胞とｈＰＴＰＲＳ／Ｄ２ＳＣ／１細胞を染色し、シングルハイブリドーマを選択した。 図１１Ｂはハイブリドーマのシングル化ソーティングを示す。ＦＡＣＳ Ａｒｉａ（ＢＤ）を用いて単一細胞ソーティングを行い、そして、ハイブリドーマの細胞培養上清を用い、Ｄ２ＳＣ／１細胞とｈＰＴＰＲＳ／Ｄ２ＳＣ／１細胞を染色し、シングルハイブリドーマを選択した。 図１１Ｃはハイブリドーマのシングル化ソーティングを示す。ＦＡＣＳ Ａｒｉａ（ＢＤ）を用いて単一細胞ソーティングを行い、そして、ハイブリドーマの細胞培養上清を用い、ＣＡＬ−１細胞を染色し、シングルハイブリドーマを選択した。 図１１Ｄはハイブリドーマのシングル化ソーティングを示す。ＦＡＣＳ Ａｒｉａ（ＢＤ）を用いて単一細胞ソーティングを行い、そして、ハイブリドーマの細胞培養上清を用い、ヒトｐＤＣを染色し、シングルハイブリドーマを選択した。 図１２はハイブリドーマの培養上清から得た精製抗体のエンドトキシン濃度を示す。いずれも基準値である0.3 EU/mg Ab以下であった。 図１３は精製抗体の細胞表面上のヒトＰＴＰＲＳに対する結合能の試験結果である。いずれの抗体も結合能を維持していることが確認できた。 図１４は精製抗体がヒト末梢血のｐＤＣ細胞群（ＢＤＣＡ２＋）に対する特異的な結合を示す。 図１５は抗ヒトＰＴＰＲＳ抗体がマウスＰＴＰＲＳにも結合するのかどうかを試験した結果である。４９Ｆ２−３０、１３Ｇ５−５２、１３Ｇ５−５７、および２２Ｈ８-１４はｍＰＴＰＲＳ／ＣＨＯに結合した。 図１６は抗ＰＴＰＲＳ抗体のｈＰＴＰＲＳ発現細胞への捕体依存的細胞傷害活性を示す。ヒトＰＴＰＲＳ／ＣＨＯ（図１６Ａ）およびマウスＰＴＰＲＳ／ＣＨＯ（図１６Ｂ）に対する抗ＰＴＰＲＳ抗体の補体依存的細胞傷害活性を測定した。その結果、ヒトＰＴＰＲＳ／ＣＨＯのターゲットに対し、１３Ｇ５−５２と１３Ｇ５−５７は約20%のＣＤＣ活性を示し(Ａ)。一方で、マウスＰＴＰＲＳ／ＣＨＯのターゲットに対しては、１３Ｇ５−５２と１３Ｇ５−５７は約100%のＣＤＣ活性を示した(Ｂ)。 図１７は抗ｈＰＴＰＲＳキメラ抗体のｃｈ４９Ｆ２−３０（図１７Ａ）、ｃｈ９Ｈ５−４、ｃｈ１３Ｇ５-５７およびｃｈ２２Ｈ８−８４（図１７Ｂ）がエフェクター細胞数依存的にターゲットのｈＰＴＰＲＳ／ＣＨＯ細胞を傷害することを示す。 図１８は抗ＰＴＰＲＳキメラ抗体のｃｈ４９Ｆ２−３０、ｃｈ９Ｈ５−４、ｃｈ１３Ｇ５−５７およびｃｈ２２Ｈ８-８４処理によってＩＦＮα産生が完全に阻害されることが示され（図１８Ａ）、ｐＤＣ細胞群がコントロール抗体のＳｙｎａｇｉｓ処理よりも減少していることがわかった（図１８Ｂおよび図１８Ｃ）。
ヒトＰＴＰＲＳは、プラズマ細胞様樹状細胞ｐＤＣにおいて特異的な発現が見られる分子である。しかしヒトＰＴＰＲＳを認識する抗体の製造方法は確立されていなかった。
ヒトＰＴＰＲＳは、４つのアイソフォームが知られており、１９４８個のアミノ酸残基からなるアイソフォーム１、１９１０個のアミノ酸残基からなるアイソフォーム２、１５０１個のアミノ酸残基からなるアイソフォーム３、および１５０５個のアミノ酸残基からなるアイソフォーム４がある。これらは、その構造中に細胞外構造として３つのイムノグロブリン様ドメイン（第一のＩｇドメイン、第二のＩｇドメイン、第三のＩｇドメイン）、フィブロネクチンII I型様ドメインと、膜貫通ドメイン（トランスメンブランドメイン、ＴＭ領域）と、細胞内構造として２つのホスファターゼドメイン（Ｄ１およびＤ２ドメイン）が認められる。プロテインチロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）活性は細胞膜に近いＤ１ドメインのみが有している。図１にはシグナルペプチドと代表的なドメインをアミノ酸配列中にマークしてある。
ヒトＰＴＰＲＳのアイソフォーム３は配列番号１（図１）の８３１〜８５１を膜貫通ドメインとして含む膜貫通タンパク質である。Ｎ末端を含む１５０１アミノ酸残基のうち、２９アミノ酸残基（配列番号１における１から２９）がシグナル配列で、３０〜８３０が細胞外ドメインを構成する。一方Ｃ末端側は細胞内ドメインである。ＰＴＰＲＳにおいては細胞外環境にあるリガンドが活性を制御しうると考えられている。
本発明者らは遺伝子発現解析によって、ヒトＰＴＰＲＳがヒトｐＤＣにおいて特異的に発現していることを確認した。彼らは、ヒトＰＴＰＲＳを他の分子と識別できる抗体が得られれば、ｐＤＣの研究に有用であろうと考えた。ところがヒトＰＴＰＲＳを含むＰＴＰファミリーには、類似する構造をもつ多くの分子が存在する。ＲＰＴＰ−σであるＰＴＰＲＳや、ＰＴＰＲＡ（ＲＰＴＰ−α）、ＰＴＰＲＤ（ＲＰＴＰ−δ）、ＰＴＰＲＥ（ＲＰＴＰ−ε、ＰＴＰＲＦ（ＲＰＴＰ−ζ）などの分子は、特に相同性の高いアミノ酸配列を含む（図８）。したがって、細胞外ドメインを構成するアミノ酸配列の部分配列を使ったドメインペプチドを免疫原として使い、各々からこれらの分子を相互に識別することができる抗体を得ることは困難であろうと考えた。そこで本発明者らは、ヒトＰＴＰＲＳを発現する細胞を免疫原として使い、ヒトＰＴＰＲＳに対する抗体の取得を試みた。
本発明者らはヒトＰＴＰＲＳを認識する抗体を取得するために研究を重ね、特定の形質転換細胞を免疫原として使うことによって、目的とする抗体が得られることを明らかにして本発明を完成した。すなわち本発明は、ヒトＰＴＰＲＳの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片に関する。
本発明において、ヒトＰＴＰＲＳはヒトｐＤＣに発現している天然の分子、またはヒトｐＤＣに発現しているヒトＰＴＰＲＳと免疫学的に同等な分子と定義することができる。本発明において、抗体がヒトＰＴＰＲＳに結合することは、たとえば次のようにして確認することができる。
−ヒト細胞との反応性に基づく確認：
本発明者らの得た知見によれば、ヒトＰＴＰＲＳは、ヒトｐＤＣに特異的な発現が見られることから、ｐＤＣのマーカーとして利用できると考えられる。
このようなヒトＰＴＰＲＳの発現プロファイルに基づけば、まず、ｐＤＣの少なくとも一部のサブセットとの結合活性は、本発明におけるヒトＰＴＰＲＳに結合する抗体の重要な特徴の一つである。ある細胞がｐＤＣであることは、各細胞群に固有の細胞表面マーカーによって確認することができる。たとえば、細胞表面マーカーに結合する抗体と、結合活性を確認すべき抗体による二重染色によって、目的とする細胞に対して結合することが確認される。すなわち、本発明におけるｐＤＣは、たとえばＢＤＣＡ２を発現する細胞を含む。
−ヒトＰＴＰＲＳ遺伝子を発現する形質転換細胞との反応性に基づく確認：
本発明者らは、特定の条件でヒトＰＴＰＲＳ遺伝子を発現させたときに、ヒトｐＤＣで発現しているヒトＰＴＰＲＳの免疫学的特徴が再構成されることを確認した。したがってヒトＰＴＰＲＳをコードする遺伝子を人為的に導入した細胞に対する抗体の反応性に基づいて、ヒトＰＴＰＲＳとの反応性を確認することができる。すなわち本発明は、ヒトＰＴＰＲＳの細胞外ドメインを構成するアミノ酸配列を細胞外ドメインとして含む分子と結合するモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片に関する。なお細胞外ドメインは、配列番号１に示したアミノ酸配列のＮ末端から配列番号１（図１）における３０〜８３０に相当するアミノ酸配列によって構成される。
例えば、ヒトＰＴＰＲＳをコードするＤＮＡを含む発現ベクターで形質転換した細胞においては、ヒトpＤＣで発現しているＰＴＰＲＳの免疫学的特徴が維持される。したがって、ヒトＰＴＰＲＳを発現する形質転換細胞は、本発明におけるヒトＰＴＰＲＳの細胞外ドメインに対する抗体の結合性を確認するための細胞として好ましい。本発明において、形質転換細胞によって抗体の反応性を確認するときには、対照として、形質転換されていない細胞を利用するのが望ましい。
次に、本発明におけるヒトＰＴＰＲＳに結合する抗体は、ヒトＰＴＰＲＳ以外のＰＴＰファミリーを発現していることが知られている細胞群との交差性が見られる抗体であっても見られない抗体であってもよい。交差性が見られない抗体は本発明におけるヒトＰＴＰＲＳに結合する抗体として好ましい。具体的には、ｐＤＣに対する結合を確認した条件と同じ条件の下で、ヒトＰＴＰＲＳ以外のＰＴＰファミリーを発現していることが知られている細胞群との結合がある抗体は、本発明におけるヒトＰＴＰＲＳに結合する抗体として好ましい。
すなわち本発明におけるヒトＰＴＰＲＳの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体とは、好ましくは、以下の免疫学的特徴を有するモノクローナル抗体を含む。
a) ヒトｐＤＣと結合する、
b) ヒトｐＤＣと結合する条件下で、単球、マクロファージ、Ｂ細胞、ＣＤ３４陽性細胞ならびにこれらの細胞に由来する樹状細胞からなる群から選択される１または複数種との結合が確認できない。
特に、ヒトｐＤＣと結合する条件下で、単球、マクロファージ、Ｂ細胞、ＣＤ３４陽性細胞およびこれらの細胞に由来する樹状細胞からなる群から選択される１または複数種との結合が確認できない抗体は、本発明のモノクローナル抗体として好ましい。
あるいは本発明におけるヒトＰＴＰＲＳの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体とは、好ましくは、以下の免疫学的特徴を有するモノクローナル抗体を含む。
c) ヒトＰＴＰＲＳをコードするＤＮＡを発現可能に保持した発現ベクターで形質転換された形質転換細胞と結合する、
d) c)の形質転換細胞と結合する条件下で、c)の形質転換される前の宿主細胞との結合が確認できない。
本発明において、抗ヒトＰＴＰＲＳモノクローナル抗体が、ＰＴＰファミリーの他の分子と交差しないことは、各ＰＴＰファミリーを強制発現させた細胞を使って確認することができる。すなわち、各ＰＴＰファミリーのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを適当な宿主細胞に導入して強制発現させる。得られた形質転換細胞に対して、交差性を確認すべき抗ヒトＰＴＰＲＳモノクローナル抗体を接触させる。そして、ヒトＰＴＰＲＳ以外のＰＴＰファミリー分子を発現する細胞に対する結合が見られなければ、その抗体がヒトＰＴＰＲＳを他のＰＴＰファミリー分子と免疫学的に識別できることが確認できる。例えば後に述べる実施例においては、本発明によって得られた抗ヒトＰＴＰＲＳモノクローナル抗体のほとんどが、特にＰＴＰＲＳとの相同性の高かったＰＴＰＲＡ、ＰＴＰＲＤ、およびＰＴＰＲＦと交差しないことが確認されている。したがって、ヒトＰＴＰＲＳと結合し、同じ条件においてＰＴＰＲＡ、ＰＴＰＲＤ、およびＰＴＰＲＦとの結合が検出できないモノクローナル抗体は、本発明における好ましいモノクローナル抗体である。これらＰＴＰファミリー分子をＰＴＰＲＳと免疫学的に識別することができる抗体を利用すれば、ＰＴＰＲＳの発現の変化を特異的に検出することができる。なお、ＰＴＰＲＳとの相同性の高い分子のなかで、ＰＴＰＲＥの発現は細胞内で確認できるが細胞外では発現しないことが判明した。ゆえに抗体としてはＰＴＰＲＥには結合しない。
結合活性を確認すべきモノクローナル抗体と、各種の細胞との結合は、たとえばフローサイトメトリーの原理で確認することができる。フローサイトメトリーの原理による抗体の反応性の確認のためには、抗体をあらかじめ検出可能なシグナルを生成する分子または原子団で標識しておくと有利である。一般的には、蛍光標識や発光標識が利用される。蛍光標識した抗体と細胞との結合をフローサイトメトリーの原理で解析するために、蛍光標示式細胞分取器(fluorescence-activated cell sorter;ＦＡＣＳ)を利用することができる。ＦＡＣＳを利用することによって、複数の抗体と細胞との結合を効率的に確認することができる。
具体的には、たとえばｐＤＣを同定することができることがあらかじめ明らかな抗体Ａと、ｐＤＣとの結合特性を解析すべき抗体Ｂを同時にｐＤＣを含む細胞群に反応させる。抗体Ａと抗体Ｂにはあらかじめ互いに識別できる蛍光シグナルを標識しておく。もし両者のシグナルが同じ細胞群から検出されれば、それらの抗体が同じ細胞群に結合していることが確認できる。すなわち、抗体Ａと抗体Ｂが同じ結合特性を有していることがわかる。もしもそれらが異なる細胞群に結合したときは、両者の結合特性が異なることが明らかである。
本発明における好ましいモノクローナル抗体の例として、たとえば、ハイブリドーマ９Ｈ５−４、１０Ｆ７−３８、１３Ｇ５−５２、１３Ｇ５−５７、１４Ａ８−８５、２２Ｈ８−８４、４９Ｆ２−３０または５５Ｅ７−７９が産生するモノクローナル抗体を示すことができる。
ハイブリドーマ９Ｈ５−４、１０Ｆ７−３８、１３Ｇ５−５２、１３Ｇ５−５７、１４Ａ８−８５、２２Ｈ８−８４、４９Ｆ２−３０および５５Ｅ７−７９は、２０１１年４月１日付けで産業技術総合研究所内特許生物寄託センターに対して、それぞれ受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３５６、ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３５７、ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３５８、ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３５９、ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３６０、ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３６１、ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３６２およびＦＥＲＭ ＢＰ−１１３６３として寄託されている。以下に、寄託を特定する内容を記載する。
（ａ）寄託機関の名称・あて名
名称：産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
あて先：日本国茨城県つくば市東１丁目１番１号つくば中央第６（郵便番号３０５−８５６６）
（ｂ）寄託日：２０１１年３月１７日
（ｃ）受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１３５６（ハイブリドーマ ９Ｈ５−４）
（ｃ）受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１３５７（ハイブリドーマ １０Ｆ７−３８）
（ｃ）受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１３５８（ハイブリドーマ １３Ｇ５−５２）
（ｃ）受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１３５９（ハイブリドーマ １３Ｇ５−５７）
（ｃ）受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１３６０（ハイブリドーマ １４Ａ８−８５）
（ｃ）受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１３６１（ハイブリドーマ ２２Ｈ８−８４）
（ｃ）受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１３６２（ハイブリドーマ ４９Ｆ２−３０）
（ｃ）受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１３６３（ハイブリドーマ ５５Ｅ７−７９）
本発明のモノクローナル抗体は、その抗原結合領域を含む断片であってもよい。たとえばＩｇＧの酵素的な消化によって生成される、抗原結合部位を含む抗体断片も、本発明における抗体として利用することができる。具体的には、パパインまたはペプシンによる消化によって、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２などの抗体断片を得ることができる。これらの抗体断片は、抗原との結合親和性を有する抗体分子として利用しうることは周知である。あるいは、必要な抗原結合活性を維持している限り、遺伝子組み換えによって構築された抗体を用いることもできる。遺伝子組み換えによって構築された抗体としては、たとえばキメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、シングルチェインＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、線状抗体、および抗体断片より形成された多特異性抗体などを示すことができる。モノクローナル抗体、またはそれを産生する抗体産生細胞をもとに、これらの抗体を得る方法は公知である。
本発明のモノクローナル抗体は、特定の形質転換細胞を免疫原とすることによって得ることができる。すなわち本発明は、以下を含む、ヒトＰＴＰＲＳの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体を産生する細胞の製造方法に関する。
（１）ヒトＰＴＰＲＳの細胞外ドメインを含む外来性の蛋白質を発現する細胞を免疫動物に投与し、そして
（２）前記免疫動物の抗体産生細胞から、ヒトＰＴＰＲＳに結合する抗体を産生する細胞を選択する。
このようにして得られた抗体産生細胞、または不死化された当該抗体産生細胞を培養し、その培養物から目的とするモノクローナル抗体を回収することができる。抗体産生細胞を不死化するための方法については種々の方法が公知である。
本発明において免疫原として用いられる形質転換細胞は、たとえば下記のヒトＰＴＰＲＳの細胞外ドメインを含むアミノ酸配列をコードする外来性のポリヌクレオチド（ａ）を発現可能に保持した細胞を調製することによって得ることができる。
本発明において、外来性のポリヌクレオチドとは、当該ポリヌクレオチドが人為的に宿主細胞に導入されたものであることをいう。細胞としてヒト細胞が用いられる場合には、ヒトの細胞にヒトの遺伝子が導入される。このような組み合わせにおいても、人為的に導入されたポリヌクレオチドは、外来性のポリヌクレオチドとよばれる。したがって、ヒトＰＴＰＲＳの異所性(ectopic)の発現は、外来性のポリヌクレオチドの発現に含まれる。
本発明において、ヒトＰＴＰＲＳの細胞外ドメインとは、配列番号１に記載のアミノ酸配列の細胞外ドメインに相当する３０〜８３０位のアミノ酸配列をいう。たとえば、Ｎ末端側から順に、以下に示す各領域を含むアミノ酸配列は、本発明におけるヒトＰＴＰＲＳの細胞外ドメインを含むアミノ酸配列として好ましい。
［シグナル配列＋細胞外ドメイン＋膜貫通ドメイン＋細胞内領域］
あるいは、下記のように細胞内領域を部分的に欠くアミノ酸配列も、本発明におけるヒトＰＴＰＲＳの細胞外ドメインを含むアミノ酸配列に含まれる。
［シグナル配列＋細胞外ドメイン＋膜貫通ドメイン＋細胞内領域の一部］
さらに、下記のように細胞内領域を欠いた構造も、本発明におけるヒトＰＴＰＲＳの細胞外ドメインを含むアミノ酸配列に含まれる。
［シグナル配列＋細胞外ドメイン＋膜貫通ドメイン］
前記構造において、細胞外ドメイン以外の領域は、配列番号１に示すアミノ酸配列から選択された配列であることもできるし、その他の相同なアミノ酸配列を組み合わせることもできる。たとえば、シグナル配列、膜貫通ドメイン、および細胞内領域を構成するアミノ酸配列は、ヒトＰＴＰＲＳ以外のＰＴＰファミリー分子のアミノ酸配列とすることもできる。あるいは、ヒト以外の種のＰＴＰファミリーのアミノ酸配列を組み合わせることもできる。さらに、細胞外ドメイン以外の領域を構成するアミノ酸配列には、各領域の機能を維持できる範囲で、変異を含むことができる。また、各領域の間に、その他の領域を介在させることもできる。たとえば、シグナル配列と細胞外ドメインの間に、ＦＬＡＧなどのエピトープタグを挿入することもできる。特にシグナル配列は、タンパク質に翻訳された後、細胞膜表面に移送される段階でプロセシングされて除去される領域である。したがって、翻訳されたタンパク質の細胞膜の通過を誘導する任意のアミノ酸配列を、シグナル配列として利用することができる。より具体的には、ヒトＰＴＰＲＳのアミノ酸配列（配列番号１）は、ヒトＰＴＰＲＳの細胞外ドメインを含むアミノ酸配列として好ましい。
したがって、本発明において、前記(a)を構成するポリヌクレオチドは、前記構造［シグナル配列＋細胞外ドメイン＋膜貫通ドメイン＋細胞内領域］を構成するアミノ酸配列をコードする任意の塩基配列を利用することができる。たとえば配列番号１のアミノ酸配列は、配列番号２に記載の塩基配列によってコードされている。
本発明において、免疫原として用いられる形質転換細胞を得るには、適当な宿主細胞に、上記ポリヌクレオチド(a)を発現可能に保持した発現ベクターを導入すればよい。
本発明において、好ましい宿主細胞は、哺乳動物細胞である。具体的には、ヒト、サル、マウス、またはラットに由来する細胞を宿主細胞として利用することができる。特にヒト由来の細胞は、宿主細胞として好ましい。例えば、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞は、本発明における宿主細胞として利用することができる好ましいヒト胚由来の腎細胞株である。ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞は、ATCC CRL-11268として入手することができる。他の免疫動物に由来する細胞も、宿主細胞として利用することができる。免疫動物に由来する細胞を免疫原として利用すれば、宿主細胞に対する免疫応答が少ない。そのため、外来性に発現しているヒトＰＴＰＲＳの細胞外ドメインに対する抗体を効率的に得ることができる。したがって、たとえば、マウスを免疫動物とするときには、マウス由来の細胞を宿主細胞として利用することもできる。
前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞において発現を誘導できるベクターに搭載して細胞に形質転換することができる。哺乳動物細胞において発現を誘導できる市販のベクターを利用すればよい。例えば、pCMV-Script(R) Vector、pSG5 Vector（Stratagene製）、pcDNA3.1（Invitrogen製）などの発現ベクターを本発明に利用することができる。
こうして得られた形質転換細胞は、必要に応じてアジュバント等の付加的な成分とともに免疫動物に投与される。アジュバントとしては、フロインドのコンプリートアジュバントなどを利用することができる。マウスを免疫動物に用いる場合、形質転換細胞は、１０４〜１０９個の細胞、より具体的には１０４〜１０６個の細胞を投与することができる。一般に、免疫原は、抗体価が上昇するまで間隔をあけて複数回投与される。たとえば、短期間免疫法の場合は、２〜４日、より具体的には３日の間隔で形質転換細胞を投与し、２〜３回の投与の後に抗体産生細胞を回収することができる。また週１回程度の間隔で５〜６回投与した後に抗体産生細胞を回収することもできる。
本発明においては、モノクローナル抗体を得るために、回収された抗体産生細胞がクローニングされる。クローニングのために、抗体産生細胞を不死化するのが好ましい。たとえばハイブリドーマ法に代表される細胞融合法や、エプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ）による形質転換を、抗体産生細胞を不死化するための方法として利用することができる。
抗体産生細胞は、１つの細胞が１種類の抗体を産生している。したがって、１つの細胞に由来する細胞集団を確立すること（すなわちクローニング）ができれば、モノクローナル抗体を得ることができる。ハイブリドーマ法とは、抗体産生細胞を適当な細胞株と融合させ、不死化(immortalize)した後にクローニングする方法をいう。不死化された抗体産生細胞は、限界希釈法(limiting dilution method)などの手法によりクローニングすることができる。ハイブリドーマ法に有用な多くの細胞株が知られている。これらの細胞株は、リンパ球系細胞の不死化効率に優れ、かつ細胞融合に成功した細胞の選択に必要な各種の遺伝マーカーを有している。さらに抗体産生細胞の取得を目的とする場合には、抗体産生能を欠落した細胞株を用いることもできる。
たとえばマウスミエローマP3x63Ag8.653(ATCC CRL-1580)やP3x63Ag8U.1(ATCC CRL-1597)は、マウスやラットの細胞融合法に有用な細胞株として広く用いられている。一般にハイブリドーマは、同種の細胞の融合によって作成されるが、近縁の異種間でのヘテロハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得することもできる。
細胞融合の具体的なプロトコルは公知である。すなわち、免疫動物の抗体産生細胞を適当な融合パートナーと混合し、細胞融合させる。抗体産生細胞には、脾細胞、リンパ節から採取されたリンパ球細胞、末梢血Ｂ細胞などが用いられる。融合パートナーとしては、先に述べた各種の細胞株を利用することができる。細胞融合には、ポリエチレングリコール法や、電気融合法が用いられる。
次に、融合細胞が有する選択マーカーに基づいて、細胞融合に成功した細胞が選択される。たとえばＨＡＴ感受性の細胞株を細胞融合に用いた場合には、ＨＡＴ培地において成育する細胞を選択することによって、細胞融合に成功した細胞が選択される。さらに選択された細胞が産生する抗体が、目的とする反応性を有していることを確認する。
各ハイブリドーマは、抗体の反応性に基づいて、スクリーニングされる。すなわち、先に述べたような方法によって、ヒトＰＴＰＲＳに結合する抗体を産生するハイブリドーマが選択される。好ましくは、選択されたハイブリドーマをサブクローニングし、最終的に目的とする抗体の産生が確認された場合に、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマとして選択する。
具体的には、ヒト細胞との反応性、またはヒトＰＴＰＲＳ遺伝子を発現する形質転換細胞との反応性に基づいて、目的とするハイブリドーマを選択することができる。細胞に結合する抗体は、イムノアッセイの原理によって検出することができる。たとえば、細胞を抗原として利用するＥＬＩＳＡを、目的とする抗体の検出に利用することができる。具体的には、ヒトｐＤＣ、または免疫原として利用した形質転換細胞を固定化した担体に、ハイブリドーマの培養上清を接触させる。培養上清が目的とする抗体を含む場合には、抗体が担体に固定化された細胞に捕捉される。次いで、固相を培養上清から分離し、必要に応じて洗浄した後に、固相に捕捉された抗体を検出することができる。抗体の検出には、抗体を認識する抗体を利用することができる。たとえば、マウスの抗体は、抗マウスイムノグロブリン抗体によって検出することができる。もし抗体を認識する抗体をあらかじめ標識しておけば、その検出が容易である。標識としては、酵素、蛍光色素、発光色素などを利用することができる。
一方、細胞を固定化する担体としては、粒子や、マイクロタイタープレートの内壁を利用することができる。プラスチック製の粒子や容器の表面に、細胞を物理吸着によって固定することができる。たとえばポリスチレン製のビーズや反応容器を、細胞を固定するための担体として利用することができる。
ハイブリドーマの選択において、ヒトＰＴＰＲＳではなく、免疫原に用いた形質転換細胞の宿主細胞に対する抗体の産生が予測される場合がある。たとえば、実施例に示したように、ヒト細胞を免疫原としマウスを免疫動物に利用すると、ヒト細胞が異物として認識され、それに結合する抗体の産生が予測される。本発明においては、ヒトＰＴＰＲＳを認識する抗体の取得を目的とする。したがって、ヒトＰＴＰＲＳ以外のヒト細胞抗原を認識する抗体を取得する必要はない。このような抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングで排除するために、抗体の反応性の確認に先立ち、目的としない抗体を予め吸収することができる。
目的としない抗体は、存在が予測される抗体が結合する抗原によって吸収することができる。具体的には、たとえばヒトＰＴＰＲＳ以外のヒト細胞抗原に対する抗体は、ヒトＰＴＰＲＳの発現が検出できない細胞によって吸収することができる。本発明において、免疫原に用いた宿主細胞は、目的としない抗体を吸収するための抗原として好ましい。
必要に応じて、抗原に対する結合活性が確認されたモノクローナル抗体の、ｐＤＣの活性に与える実際の影響が確認される。ｐＤＣに対する影響は、たとえば後に述べるような方法によって確認することができる。
本発明のモノクローナル抗体は、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを培養して得られた培養物から回収することができる。ハイブリドーマは、in vitroまたはin vivoで培養することができる。in vitroにおいては、RPMI1640などの公知の培地を用いて、ハイブリドーマを培養することができる。培養上清には当該ハイブリドーマが分泌したイムノグロブリンが蓄積される。したがって、培養上清を採取し、必要に応じて精製することにより、本発明のモノクローナル抗体を得ることができる。培地には血清を添加しない方が、イムノグロブリンの精製が容易である。しかし、ハイブリドーマのより迅速な増殖と、抗体産生の促進を目的として、約１０％のウシ胎児血清を培地に加えることもできる。
ハイブリドーマは、in vivoにおいて培養することもできる。具体的には、ヌードマウスの腹腔にハイブリドーマを接種することにより、腹腔内でハイブリドーマを培養することができる。モノクローナル抗体は、腹水中に蓄積する。したがって、腹水を採取し、必要に応じて精製すれば、必要なモノクローナル抗体を得ることができる。得られたモノクローナル抗体は、目的に応じて適切に修飾または加工することができる。
本発明のモノクローナル抗体は、当該ハイブリドーマから抗体の抗原結合領域をコードするｃＤＮＡを取得し、これを適当な発現ベクターに挿入することによって発現させることができる。抗体の可変領域をコードするｃＤＮＡを取得し、適当な宿主細胞に発現させる技術は公知である。また抗原結合領域を含む可変領域を、定常領域と結合させることによってキメラ抗体とする手法も公知である。
例えば本発明における好ましいモノクローナル抗体として、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３５６として寄託されたハイブリドーマ９Ｈ５−４、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３５７として寄託されたハイブリドーマ１０Ｆ７−３８、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３５８として寄託されたハイブリドーマ１３Ｇ５−５２、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３５９として寄託されたハイブリドーマ１３Ｇ５−５７、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３６０として寄託されたハイブリドーマ１４Ａ８−８５、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３６１として寄託されたハイブリドーマ２２Ｈ８−８４、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３６２として寄託されたハイブリドーマ４９Ｆ２−３０、または受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３６３として寄託されたハイブリドーマ５５Ｅ７−７９などが産生するモノクローナル抗体を示すことができる。
可変領域を含むキメラ抗体、または可変領域を構成するＣＤＲを移植したヒト化抗体として、ＩｇＧまたはＩｇＭ由来の定常領域を有する抗体は、本発明における好ましい抗体に含まれる。本発明者らは、ＰＴＰＲＳに対するモノクローナル抗体がＰＴＰＲＳ発現細胞に対するＣＤＣ作用を有することを確認している。したがって、ＩｇＧまたはＩｇＭ由来の定常領域を有する抗体は、ＣＤＣ作用によるＰＴＰＲＳ発現細胞に対する細胞傷害作用を有する。このような抗体は、ｐＤＣなどのＰＴＰＲＳ発現細胞の細胞数の抑制に有用である。
ヒトＰＴＰＲＳを認識するキメラ抗体、またはヒト化抗体は、それをコードするポリヌクレオチドを利用して遺伝子工学的に製造することができる。
国際公開ＷＯ２００７／０４１３１７号（特表２００９−５１０１０２Ａ号）にヒトＰＴＰＲＳの構造が明らかにされてからすでに４年近くを経過しているが、未だにヒトＰＴＰＲＳを特異的に認識できる抗体は得られていない。本発明の免疫原によって、初めてヒトＰＴＰＲＳを認識する抗体が提供された。すなわち本発明は、下記の工程によって得ることができる、ヒトＰＴＰＲＳを認識する抗体を提供した。
（１）ヒトＰＴＰＲＳの細胞外ドメインを含むタンパク質を免疫動物に投与する工程、
（２）前記免疫動物の抗体産生細胞から、ヒトＰＴＰＲＳに結合する抗体を産生する抗体産生細胞を選択する皇帝、および
（３）（２）で選択された抗体産生細胞を培養しその培養物からヒトＰＴＰＲＳを認識する抗体を回収する工程。
ヒトＰＴＰＲＳは、ヒトｐＤＣにおいて特異的に発現していることが明らかにされた。本発明者らのＳＡＧＥによる遺伝子発現解析においても、ヒトｐＤＣにおける特異的な発現が確認された。しかし過去の報告においては、ヒトＰＴＰＲＳの発現レベルはいずれもｍＲＮＡに基づいて解析されていた。ヒトＰＴＰＲＳの検出が可能な抗体が提供されていなかったため、タンパク質の発現状態を解析することは従来行われなかった。本発明によって提供されたヒトＰＴＰＲＳの細胞外ドメインに結合する抗体は、ヒトＰＴＰＲＳタンパク質の解析を実現した。
実際に本発明者らが確認したところ、本発明に基づくヒトＰＴＰＲＳの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体は、ヒトｐＤＣを特異的に検出した。すなわち本発明は、ヒトＰＴＰＲＳの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片を被検細胞に接触させ、細胞に結合したモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片を検出する工程を含む、形質細胞様樹状細胞の検出方法に関する。
本発明に基づいてヒトＰＴＰＲＳを検出することによって、ある細胞がｐＤＣであるかどうかを確認することができる。すなわち本発明は、ヒトＰＴＰＲＳを指標とするｐＤＣの同定方法を提供する。あるいは本発明に基づいてヒトＰＴＰＲＳが検出された細胞を分離することによって、ヒトｐＤＣを分離することができる。すなわち本発明は、ヒトＰＴＰＲＳを指標とするｐＤＣの分離方法を提供する。
本発明において、ヒトＰＴＰＲＳの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片は、あらかじめ標識しておくことができる。たとえば、発光色素や蛍光色素で標識することにより、抗体を容易に検出することができる。より具体的には、蛍光色素標識抗体をｐＤＣを含む可能性のある細胞集団と接触させ、本発明の抗体が結合した細胞を蛍光色素を指標として検出することができる。さらに、蛍光色素が検出された細胞を分離すれば、ｐＤＣを分離することができる。一連の工程は、ＦＡＣＳの原理により容易に実施することができる。
あるいは本発明の抗体をあらかじめ磁性粒子などの固相担体に結合しておくこともできる。固相担体に結合した抗体がヒトＰＴＰＲＳを認識し、ｐＤＣが固相担体に捕捉される。その結果、ｐＤＣを検出または分離することができる。
本発明に基づくｐＤＣの検出に必要な抗体は、ｐＤＣ検出用試薬として供給することができる。すなわち本発明は、ヒトＰＴＰＲＳの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片を含む、ｐＤＣの検出用試薬を提供する。本発明のｐＤＣの検出用試薬には、抗体のほか、陽性対照、または陰性対照を組み合わせることができる。たとえば、免疫原に利用したヒトＰＴＰＲＳの細胞外ドメインを発現する形質転換細胞や、ヒトから採取されたｐＤＣなどを陽性対照として利用することができる。通常、ヒトｐＤＣは末梢血からはわずかしか得ることができない。したがって、特に形質転換細胞は、本発明の試薬における陽性対照として好ましい。一方、陰性対照には、ヒトＰＴＰＲＳを発現しない任意の細胞を利用することができる。
すなわち本発明は、ヒトＰＴＰＲＳの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片とを含む、ヒトｐＤＣの検出用キットを提供する。
また本発明者らは、ヒトＰＴＰＲＳの細胞外ドメインに結合する抗体がｐＤＣに与える影響を解析した。その結果、ヒトＰＴＰＲＳの細胞外ドメインに結合する抗体は、ｐＤＣの活性を抑制することが確認された。すなわち本発明は、次の成分のいずれかをｐＤＣに接触させる工程を含む、インターフェロン産生細胞の活性抑制方法に関する。
（ａ）ヒトＰＴＰＲＳに結合し、ｐＤＣの活性を抑制するモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片、および
（ｂ）（ａ）のモノクローナル抗体の相補性決定領域を移植したイムノグロブリン、またはその抗原結合領域を含む断片。
あるいは本発明は、次の成分のいずれかを生体に投与する工程を含む、生体中のｐＤＣの活性抑制方法に関する。
（ａ）ヒトＰＴＰＲＳに結合し、ｐＤＣの活性を抑制するモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片、
（ｂ）（ａ）のモノクローナル抗体の相補性決定領域を移植したイムノグロブリン、またはその抗原結合領域を含む断片、および
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に記載の成分をコードするポリヌクレオチド。
本発明においてｐＤＣは、ＩＦＮ産生能を有し、かつ細胞表面にヒトＰＴＰＲＳを発現する細胞をいう。以下、特に断りの無い場合には、ｐＤＣは、樹状細胞の前駆細胞である細胞のみならず、ＩＦＮ産生能を有し、かつ細胞表面にヒトＰＴＰＲＳを発現する細胞を含む。このようなｐＤＣの同定方法は公知である。たとえばいくつかの細胞表面マーカーを指標としてｐＤＣを他の血液細胞と識別することができる。具体的には、ヒトｐＤＣの細胞表面マーカーのプロファイルは次のとおりである(Shortman,K. and Liu, YJ, Nature Reviews 2: 151-161, 2002)。近年になって、ＢＤＣＡ−２陽性細胞をｐＤＣと位置づける報告もある(Dzionek, A. et al. J.Immunol. 165: 6037-6046, 2000)。
［ヒトｐＤＣの細胞表面抗原のプロファイル］
CD4陽性、CD123陽性、Lineage(CD3、CD14、CD16、CD19、CD20、CD56)陰性、CD11c陰性
したがって、これらの公知のマーカーの発現プロファイルを持ち、ＩＦＮ産生能をも持つ細胞をｐＤＣと言うこともできる。さらに、これらのマーカーの発現プロファイルの発現パターンとは異なるプロファイルを持つ細胞群であっても、ＩＦＮ産生能を有する生体中の細胞はｐＤＣに含まれる。
さらに、ヒトｐＤＣに共通して見られる特徴として、以下のような特徴を示すことができる。
［細胞の形態上の特徴］
−プラズマ細胞に似ている
−細胞表面が平滑な丸い細胞
−比較的大きい核をもつ
［細胞の機能的な特徴］
−ウイルス感染時に、短期間に大量のＩ型ＩＦＮを産生する
−ウイルス感染後、樹状細胞に分化する
本発明において、ｐＤＣの活性抑制とは、ｐＤＣが有する機能の少なくとも一つを抑制することをいう。ｐＤＣの機能として、ＩＦＮの産生と細胞生存を示すことができる。細胞の生存は、細胞数と言い換えることもできる。したがって、これらの機能の一方または両方のを抑制することを、ｐＤＣの活性を抑制するという。ｐＤＣによって産生されるＩ型ＩＦＮが種々の疾患の原因となっていることが明らかにされている。したがって、ｐＤＣの細胞数やＩＦＮの産生を抑制することは、それらの疾患の治療戦略として有用である。
たとえば、自己免疫性の疾患の病態とＩＦＮαの関連性が指摘されている。ＩＦＮαの大部分がｐＤＣによって産生されている。したがってその産生を抑制すれば、ＩＦＮαによってもたらされる病態を緩和することができる。なお本発明において、ｐＤＣによるＩＦＮ産生抑制とはｐＤＣが産生するＩＦＮの少なくとも１種類のＩＦＮ産生を抑制することをいう。本発明における好ましいＩＦＮは、Ｉ型ＩＦＮである。中でもＩＦＮαは重要である。
すなわち本発明は、ヒトＰＴＰＲＳの細胞外ドメインに結合する抗体を有効成分として含有する、ＩＦＮ産生抑制剤に関する。あるいは本発明は、ヒトＰＴＰＲＳの細胞外ドメインに結合する抗体を投与することを含む、ＩＦＮの産生抑制方法を提供する。さらに本発明は、ヒトＰＴＰＲＳの細胞外ドメインに結合する抗体の、ＩＦＮの産生を抑制するための医薬組成物の製造における使用に関する。
ｐＤＣには、少数の細胞で大量のＩＦＮを産生する細胞が含まれる。たとえば、ウイルスなどで刺激を受けた樹状細胞の前駆細胞は、生体が産生するＩＦＮの大部分を産生する。大量のＩＦＮを産生するｐＤＣの細胞数を抑制することは、結果としてＩＦＮの産生量を抑制することになる。したがって、ｐＤＣの細胞数の抑制によっても、ＩＦＮαによってもたらされる病態を緩和することができる。
本発明の好ましい態様において、抗ヒトＰＴＰＲＳモノクローナル抗体は、ヒトＰＴＰＲＳ発現細胞に結合し、ＣＤＣ（補体依存性の細胞傷害作用;Complement Dependent Cytotoxicity）作用によって細胞傷害作用を与えることが確認された。ＣＤＣ作用は、抗体医薬の重要な作用機序の一つである。本発明の抗ヒトＰＴＰＲＳモノクローナル抗体も、そのＣＤＣ作用により、ｐＤＣなどのヒトＰＴＰＲＳ発現細胞に対する強力な細胞傷害作用を有する。すなわち、好ましい態様において、ＩＦＮ産生の抑制機構に加えて、ｐＤＣに対する細胞傷害作用によっても、ＩＦＮ産生抑制効果を期待することができる。
本発明に用いるヒトＰＴＰＲＳの細胞外ドメインを認識する抗体は、先に述べたような方法に基づいて得ることができる。本発明における抗体は、任意のクラスであってよい。また抗体が由来する生物種も限定されない。さらに、抗体の抗原結合領域を含む断片を抗体として用いることができる。たとえばＩｇＧの酵素的な消化によって生成される、抗原結合部位を含む抗体断片も、本発明における抗体として利用することができる。具体的には、パパインまたはペプシンによる消化によって、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２などの抗体断片を得ることができる。これらの抗体断片は、抗原との結合親和性を有する抗体分子として利用しうることは周知である。あるいは、必要な抗原結合活性を維持している限り、遺伝子組み換えによって構築された抗体を用いることもできる。遺伝子組み換えによって構築された抗体の例としては、たとえばキメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、シングルチェインＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、線状抗体、および抗体断片より形成された多特異性抗体等を示すことができる。モノクローナル抗体を基に、これらの抗体を得る方法は公知である。
本発明において、抗体は、必要に応じて修飾することができる。本発明によれば、ヒトＰＴＰＲＳの細胞外ドメインを認識する抗体は、ｐＤＣの活性を抑制する作用を有する。すなわち、抗体そのものがｐＤＣに対する細胞傷害作用を有している可能性が考えられた。強いエフェクター作用を示す抗体のサブクラスは公知である。あるいは、抗体を細胞傷害物質(cytotoxic agent)によって修飾することによって、ｐＤＣの活性抑制効果をさらに増強することができる。細胞傷害物質の例としては、以下のような物質を示すことができる。
トキシン類：緑膿菌毒素(Pseudomonas Endotoxin; PE)、ジフテリアトキシン、リシン
放射性同位元素：Tc99m、Sr89、I131、Y90
抗癌剤：カリキアマイシン、マイトマイシン、パクリタキセル
タンパク質からなるトキシン類は、２官能性試薬によって抗体またはその断片などに結合することができる。あるいは、抗体をコードする遺伝子にトキシン類をコードする遺伝子を接合し、両者の融合タンパク質を得ることもできる。放射性同位元素を抗体に結合する方法も公知である。たとえば、キレート剤を利用して、抗体を放射性同位元素で標識する方法が公知である。さらに抗癌剤は、糖鎖または２官能性試薬の利用により、抗体に結合することができる。
本発明においては、人為的に構造を改変された抗体を有効成分として利用することもできる。たとえば、抗体の細胞傷害作用や安定性を改善するための様々な修飾方法が公知である。具体的には、重鎖の糖鎖が改変されたイムノグロブリンが知られている(Shinkawa, T. et al., J. Biol. Chem 278:3466-3473. 2003.)。糖鎖の改変によって、イムノグロブリンのＡＤＣＣ（抗体依存性の細胞傷害;Antibody Dependent Cell-mediated Cytotoxicity）活性が増強された。
ヒトＰＴＰＲＳの細胞外ドメインに結合する抗体は、ｐＤＣに接触させるとその活性を抑制する。したがってこれらの抗体を、ｐＤＣの活性抑制剤、または抑制方法に利用することができる。すなわち本発明は、下記（ａ）−（ｃ）からなる群から選択される少なくとも１種類の成分を有効成分として含む、ｐＤＣの活性抑制剤を提供する。あるいは本発明は、下記（ａ）−（ｃ）からなる群から選択される少なくとも１種類の成分を投与することを含むｐＤＣの活性抑制方法に関する。さらに本発明は、下記（ａ）−（ｃ）からなる群から選択される少なくとも１種類の成分のｐＤＣ活性調節剤の製造における使用に関する。
（ａ）ヒトＰＴＰＲＳの細胞外ドメインに結合する抗体、またはその抗原結合領域を含む断片、
（ｂ）（ａ）の抗体の相補性決定領域を移植したイムノグロブリン、またはその抗原結合領域を含む断片。
本発明において、ｐＤＣの活性を抑制するモノクローナル抗体としては、ヒトＰＴＰＲＳの細胞外ドメインを認識するモノクローナル抗体を利用することができる。本発明においては、１種類または複数種類のモノクローナル抗体を利用することができる。たとえば、ヒトＰＴＰＲＳの細胞外ドメインを認識する複数種のモノクローナル抗体を配合して、本発明に利用することができる。
抗体がｐＤＣのＩＦＮ産生活性の抑制作用を有することは次のようにして確認することができる。ｐＤＣはウイルスの刺激によってＩＦＮを大量に産生する。ｐＤＣに対するウイルス刺激の前、後、またはウイルス刺激と同時に抗体を与え、抗体を与えないｐＤＣを対照として、ＩＦＮの産生能を比較する。ＩＦＮ産生能は、ｐＤＣの培養上清中に含まれるＩＦＮ−αやＩＦＮ−βを測定することによって評価することができる。比較の結果、抗体の添加によって、上清中のＩＦＮの量が有意に低下すれば、試験された抗体は、ＩＦＮ産生能を抑制する作用を有することが確認できる。これらＩＦＮの測定方法は公知である。ｐＤＣは、生体におけるＩＦＮの大部分を産生する細胞である。したがって、ｐＤＣのＩＦＮ産生能の抑制によって、生体のＩＦＮの産生状態を調節することができる。
本発明において、ｐＤＣの活性にはｐＤＣの細胞数の維持が含まれる。したがって本発明におけるｐＤＣの活性の抑制は、ｐＤＣの細胞数の抑制を含む。もしｐＤＣの細胞数が、抗体の存在下で抑制されることが確認されれば、当該抗体がｐＤＣの活性を抑制していることがわかる。比較対照としては、ＩＦＮ産生と同様に、活性を確認すべき抗体と同じ動物種に由来する不活性なイムノグロブリンを用いることができる。ｐＤＣの細胞数は、細胞の計数によって定量的に比較することができる。細胞数は、ＦＡＣＳや顕微鏡によって計数することができる。
また、ｐＤＣはウイルスなどの感染の結果ＤＣ２（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌ ２）というＴｈ２を誘導する細胞へ分化するともいわれている。もしウイルス刺激によるｐＤＣのＩＦＮ産生を抑制できれば、Ｔｈ２への分化も抑制できる可能性がある。したがって、ＩＦＮ産生を抑制する本発明のモノクローナル抗体は、各種アレルギー疾患の治療効果も期待できる。
ヒトＰＴＰＲＳの細胞外ドメインを認識する抗体を、その抗体が由来する生物種とは異なる宿主に投与する場合には、当該宿主にとって異物と認識されにくい形に加工するのが望ましい。たとえば、次のような分子に加工することにより、イムノグロブリンを異物として認識されにくくすることができる。イムノグロブリン分子を以下のように加工する手法は公知である。
−定常領域を欠失した抗原結合領域を含む断片(Monoclonal Antibodies : Principles and Practice, third edition, Academic Press Limited. 1995; Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996)
−モノクローナル抗体の抗原結合領域と宿主のイムノグロブリンの定常領域とで構成されるキメラ抗体(遺伝子発現実験マニュアル 講談社 1994年 （石田 功、安東 民衛 編）)
−宿主のイムノグロブリンにおける相補性決定領域（ＣＤＲ）をモノクローナル抗体のＣＤＲに置換したＣＤＲ置換抗体(遺伝子発現実験マニュアル 講談社 1994年 （石田 功、安東 民衛 編）)
あるいは、ファージディスプレー法(McCafferty J. et al., Nature 348:552-554,1990; Kretzschmar T et.al., Curr Opin Biotechnol 2002 Dec;13(6):598-602.)によって、ヒトのイムノグロブリン可変領域遺伝子を取得することができる。ファージディスプレー法においては、ヒトイムノグロブリン可変領域をコードする遺伝子がファージ遺伝子に組み込まれる。多様なイムノグロブリン遺伝子をソースとして、ファージライブラリーを作成することができる。ファージはファージ自身を構成するタンパク質の融合タンパク質として、当該可変領域を発現する。ファージによって発現されたファージ表面の可変領域は、抗原との結合活性を維持している。したがって、抗原を発現した細胞または抗原などに結合するファージを選択することによって、ファージライブラリーから、目的とする結合活性を有する可変領域を発現したファージをスクリーニングすることができる。さらに、こうして選択されたファージ粒子の中には、目的とする結合活性を有する可変領域をコードする遺伝子が保持されている。すなわち、ファージディスプレー法においては、可変領域の結合活性を指標として、目的とする結合活性を有する可変領域をコードしている遺伝子を取得することができる。
本発明によるｐＤＣの活性抑制剤、または抑制方法において、ヒトＰＴＰＲＳの細胞外ドメインを認識する抗体、またはその少なくとも抗原結合領域を含む抗体断片は、タンパク質として、あるいはそのタンパク質をコードするポリヌクレオチドとして、投与することができる。ポリヌクレオチドを投与するには、目的とするタンパク質を発現できるように、適当なプロモーターの制御下に目的とするタンパク質をコードするヌクレオチドを配置したベクターを利用するのが望ましい。ベクターには、エンハンサーやターミネーターを配置することもできる。イムノグロブリンを構成する重鎖と軽鎖の遺伝子を保持し、イムノグロブリン分子を発現することができるベクターが公知である。イムノグロブリンを発現することができるベクターは、細胞に導入することにより投与することができる。生体への投与にあたっては、生体への投与によって細胞に感染させることができるベクターはそのまま投与することができる。あるいは、いったん生体から分離したリンパ球にベクターを導入してその後生体に戻すこともできる(ex vivo)。
本発明に基づくｐＤＣの活性抑制剤、または抑制方法において、生体に投与されるモノクローナル抗体の量は、イムノグロブリンとして体重１ｋｇあたり、通常０．５ｍｇ〜１００ｍｇ、たとえば１ｍｇ〜５０ｍｇ、好ましくは２ｍｇ〜１０ｍｇである。生体への抗体の投与間隔は、治療期間中の生体内におけるイムノグロブリンの有効濃度が維持できるように適宜調節することができる。具体的には、抗体を１〜２週間間隔で投与することができる。投与経路は、任意である。当業者は、治療に際して効果的な投与経路を適宜選択することができる。具体的には、経口的な、または非経口的な投与を示すことができる。たとえば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、または皮下注射等により、全身的にまたは局所的に抗体を投与することができる。本発明における非経口投与に適当な製剤の例としては、注射剤、座剤、噴霧剤などがあげられる。また細胞に与える場合には、通常１μｇ／ｍＬ、好ましくは１０μｇ／ｍＬ以上、より好ましくは５０μｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは０．５ｍｇ／ｍＬ以上のイムノグロブリンを与える。
本発明に基づくｐＤＣの活性抑制剤または抑制方法において、モノクローナル抗体は、任意の方法により生体に投与することができる。通常モノクローナル抗体は、薬学的に許容される担体と配合される。モノクローナル抗体には、必要に応じて増粘剤、安定剤、防腐剤および可溶化剤などの添加剤を配合することができる。このような担体または添加剤としては、ラクトース、クエン酸、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、スクロース、デンプン、タルク、ゼラチン、寒天、植物油、エチレングリコールなどがあげられる。「薬学的に許容される」という用語は、各国政府の監督当局により承認されているか、または各国の薬局方若しくは一般的に認知されている薬局方に動物、哺乳動物、および特にヒトへの使用に関して列記されていることをいう。本発明のｐＤＣの活性抑制剤は、１回または複数回の用量の凍結乾燥粉末または錠剤の形態で供給することができる。凍結乾燥粉末または錠剤には、さらに、投与の前に該組成物を所望の濃度となるように溶解するための注射用の滅菌済みの水、生理的食塩水または緩衝液を組み合わせることができる。
さらに、イムノグロブリンを発現するベクターのかたちで投与する場合には、重鎖と軽鎖を別のプラスミドとしてコトランスフェクトするとして、体重１ｋｇあたり各プラスミドを０．１〜１０ｍｇ、たとえば１〜５ｍｇを投与することができる。また in vitro において細胞に導入するためには、１〜５μｇ／１０６ｃｅｌｌのベクターが用いられる。 以下、実施例に基づいて本発明をさらに具体的に説明する。
ここに引用されたすべての先行技術文献は、参照として組み入れられる。
以下実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこの実施例により何ら制限されるものではない。
実施例１
Ａ．ＰＴＰＲＳの発現解析
Ａ−１）ＳＡＧＥライブラリーを用いた解析
ヒト単球、ｐＤＣ、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）処理したｐＤＣにおける遺伝子の発現を、ＳＡＧＥTM（Serial Analysis of Gene Expression）法により比較、解析した。解析方法は次のとおりである。
ヒト末梢血から、単球をＣＤ１４陽性細胞として単離し、pＤＣをＢＤＣＡ−４陽性細胞として、セルソーターによって分離した。さらにｐＤＣをＨＳＶ存在下で１２時間培養して、活性化したpＤＣを調製した。それぞれの細胞からＲＮＡを取得し、I-SAGETMkit（Invitrogen社）を用いて、ＳＡＧＥライブラリーを作製した。得られた約１０万タグの塩基配列データを、SAGE Analysis Software（Invitrogen社）で解析した。その結果、単球／ｐＤＣ／ｐＤＣ＋ＨＳＶのスコア値が０／７／０の遺伝子、すなわちｐＤＣ特異的な発現を示す遺伝子として、既知の遺伝子であるＰＴＰＲＳ（GenBank Acc#NM_002856.3）が見出された。ＰＴＰＲＳは、配列番号２に示す塩基配列によってコードされる。そしてそれは、免疫グロブリン様ドメイン(Ig-like domain)およびフィブロネクチンIII型様ドメイン(Fibronectin type III-like domain)を細胞外領域に有する、一回膜貫通膜タンパク質である。また、細胞内領域に２つのプロテインチロシンフォスファターゼ領域(PTP domain)を有する（図１）。
Ａ−２）定量ＲＴ−ＰＣＲによるＰＴＰＲＳ ｍＲＮＡのヒト各種免疫担当細胞における発現解析
ＰＴＰＲＳの免疫細胞での発現をより詳細に検討した。ヒト末梢血から、セルソーターによって各細胞を分取した。分取した各細胞群からＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを鋳型として、定法にしたがって定量的ＲＴ−ＰＣＲを行い、ＰＴＰＲＳ ｍＲＮＡの発現レベルを解析した。恒常的に発現していることが知られているＧＡＰＤＨ（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）遺伝子の発現レベルで標準化することにより、ＰＴＰＲＳ遺伝子の発現を各免疫細胞間で比較した。
用いたプライマーの塩基配列、およびＰＣＲの条件は以下のとおりである。
ＰＴＰＲＳ用 Forward primer: 5’CAC GGC CTA TGA CCT CCA 3’（配列番号３）
ＰＴＰＲＳ用 Reverse primer: 5’AAG TTC TTG GGC GAG ACT TG 3’（配列番号４）
ＧＡＰＤＨ用 Forward primer: 5’CCA CCC ATG GCA AAT TCC 3’（配列番号５）
ＧＡＰＤＨ用 Reverse primer: 5’TGG GAT TTC CAT TGA TGA CAA G 3’（配列番号６）
５０℃２分を１サイクル、
９５℃１０分を１サイクル、
[９５℃１５秒、６０℃６０秒]を５０サイクル。
単球、ｐＤＣ、ＨＳＶで刺激したｐＤＣ、Ｂ細胞（CD19+細胞）、Ｔ細胞（CD3+細胞）、ＰＭＡ (Phorbol 12-myristate 13-acetate)で刺激した活性化Ｔ細胞、ＮＫ細胞（CD56+細胞）について測定したところ、ＰＴＰＲＳがｐＤＣ特異的に発現していることが示された。また、特徴として、ＨＳＶで刺激したｐＤＣで、ＰＴＰＲＳの発現が低下することがわかった（図２）。
Ａ−３）定量的ＲＴ−ＰＣＲによるヒト組織におけるＰＴＰＲＳ ｍＲＮＡの発現解析
さらに、組織における発現をABI PRISM 7000(Applied Biosystem社)を用いた定量ＰＣＲにより検討した。ｃＤＮＡパネルとして、BDTM MTC multiple tissue cDNA panel (Human I; Cat.No.636742, Human immune; Cat.No.636748, Human blood fractions; Cat.No.636750；いずれもBecton Dickinson社)を用いた。使用したプライマーの塩基配列を以下に示す。
ＰＴＰＲＳ用 Forward primer: 5' ACT CAC CCA CAC CCT ACA AGA 3’（配列番号７）
ＰＴＰＲＳ用 Reverse primer: 5' CTT GGT GGT ACG GCC ATC 3'（配列番号８）
ＧＡＰＤＨ用 Forward primer: 5' CCA CCC ATG GCA AAT TCC 3’（配列番号５）
ＧＡＰＤＨ用 Reverse primer: 5' TGG GAT TTC CAT TGA TGA CAA G 3'（配列番号６）
SYBR green PCR master mix kit（Applied Biosystem社）を用いて、同じ会社から入手できるABI PRISM 7000によりＰＣＲを行った。解析には同じ会社から入手できるSequence Detection System Softwareを用いた。反応条件は次のとおりである。
ステップ１：５０℃, ２分を１サイクル
ステップ２：９５℃,１０分を１サイクル
ステップ３：９５℃,１５秒、６０℃,１分を４０サイクル
恒常的に発現していることが知られているＧＡＰＤＨ（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）遺伝子の発現レベルで標準化することにより、ＰＴＰＲＳ遺伝子の発現を各組織間で比較した。その結果、組織においてＰＴＰＲＳ ｍＲＮＡが広範囲に発現していることが明らかになった（図３）。
Ｂ．ＰＴＰＲＳ発現ベクターの作製
ＰＴＰＲＳタンパク質を発現させるため、ＰＴＰＲＳ遺伝子の発現ベクターの作製を行った。pCR4-TOPOクローニングベクターに組み込まれたPTPRS cDNA clone(Open Biosystem社 cc# MHS1010-98052887)からＰＴＰＲＳ遺伝子のみを取り出し、pcDNA3.1発現ベクターに組み込んだ（PTPRS/pcDNA3.1）。得られたPTPRS/ pcDNA3.1プラスミドを鋳型に、EcoRI、Not I、およびKozak sequence（GCC GCC ACC）を含むプライマーでＰＴＰＲＳ遺伝子を増幅した（プライマーの情報は下記に示す）。ＰＣＲ産物はpMX-IP レトロウイルスベクターにEcoRIとNot Iサイトでクローニングされた(PTPRS/pMX-IP)。ＰＣＲ反応にはKOD Plus DNA polymerase（TOYOBO社）１ユニットを用い、反応条件としては、９４℃２分を１サイクル行った後、［９４℃１５秒、６８℃４分３０秒］を２５サイクルとした。
Forward primer（配列番号９）: 5' aaa GAA TTC gcc gcc acc ATG GCG CCC ACC TGG GGC CCT3'
Reverse primer（配列番号１０）: 5' aaa gcg gcc gcT TAG GTT GCA TAG TGG TCA AAG C 3'
上記の塩基配列において、小文字は制限酵素EcoRIの切断部位またはNot Iの部位を示す。5’末端のaaaは酵素切断のための付加塩基である。
Ｃ．ヒトＰＴＰＲＳ （ｈＰＴＰＲＳ）発現細胞の作製
ＰＴＰＲＳ遺伝子を含むレトロウイルスを作成するために、FuGENE kit(Roche社)を用いてヒト胚の腎細胞株であるＨＥＫ−２９３Ｔ細胞にPTPRS/pMX-IPとウイルスパッケージングベクターPCL-ECOを一過性に遺伝子導入した。２日後に、ウィルスがｈＰＴＰＲＳ遺伝子を含む細胞培養上清を回収し、BALB/Cマウスの脾臓由来の樹状細胞であるＤ２ＳＣ／１細胞（Paglia et al.,J.Exp.Med.,178,1893-1901(1993)に基づき作成）に感染させた。pMX-IPレトロウイルスベクターはpuromycin耐性遺伝子を含むことから、感染させたＤ２ＳＣ／１細胞をpuromycinと培養することで、ｈＰＴＰＲＳを発現する細胞のみが生存できるようになり、そしてセレクションが可能になる。ｈＰＴＰＲＳ発現Ｄ２ＳＣ／１細胞はＦＡＣＳソーティングによってセレクトされ、培養された。ｈＰＴＰＲＳの発現を確認するため、10μg/mLヤギIgG（SantaCruz社）と市販されているｈＰＴＰＲＳポリクローナル抗体 (pAb; R&D社) をセレクトしたｈＰＴＰＲＳ／Ｄ２ＳＣ／１細胞にそれぞれ１００μlずつ添加し、混合物を４℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで細胞を洗浄した後、１００倍希釈したFITCラベル化抗ヤギ IgG抗体（SantaCruz社）を５０μLずつ添加し、４℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、FACSCalibur（BD）にてデータを取り込んだ（図４）。
実施例２
Ａ．抗ヒトＰＴＰＲＳモノクローナル抗体の作製
Ａ−１）免疫
免疫原とする細胞として、上記ｈＰＴＰＲＳ／Ｄ２ＳＣ／Ｉ細胞を用いた。BALB/cマウスの麻酔後、足蹠（footpad）に片足５０μlずつFreund’s Complete Adjuvant (CFA)エマルジョンを皮下注射した。計１００μl/マウスである。次の日、免疫原として準備したｈＰＴＰＲＳ／Ｄ２ＳＣ／１細胞をFreund’s Incomplete Adjuvant (IFA)でエマルジョンを作り、足蹠（footpad）に皮下注射した（５０μl/片脚、計１００μl/ マウス）。免疫は２日おきに計３回行い、最後の免疫の３日後に所属リンパ節を回収した。
Ａ−２）細胞融合
免疫したマウスの両肢から所属リンパ節由来細胞を採取し、１０％ＦＢＳを含むRPMI1640培地（SIGMA社）で培養したマウスミエローマ細胞P3-X63-Ag8.563を、リンパ節由来細胞とミエローマ細胞の比が５：４になるように混和して、遠心分離により細胞を回収した。細胞融合のために混合細胞にPEG1500（Roche社）を加えた。融合した細胞（ハイブリドーマ）は洗浄し、細胞成長サプリメントを含む10% Fetal Bovine Serum (FBS)+ HAT (Sigma社)- RPMI1640培地 (2 mM L-Glutamine, 100Unit/ml Penicillin，100μg/ml Streptomycin, 10 mM HEPES, 1 mM Sodium Pyruvate, 50μM 2-MEを含む)で培養した。
Ａ−３）免疫したｈＰＴＰＲＳ／Ｄ２ＳＣ／１細胞を用いたハイブリドーマのＦＡＣＳスクリーニング
3x105/ wellのＤ２ＳＣ／１細胞またはｈＰＴＰＲＳ／Ｄ２ＳＣ／１細胞に２．５ μg/mlに調製した抗CD16/32(2.4G2)を５０μLずつ添加しFCレセプターをブロックした。ＰＢＳで洗浄後、１０μg/mlに調製したヤギIgG、市販されている抗hPTPRS pAb (R&D社)、マウス IgG2ak（BioLegend社）と培養していたハイブリドーマの培養上清をそれぞれ６０μlずつ添加し、４℃で６０分間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄後、細胞に５０倍希釈したFITCラベルされた抗ヤギ IgG抗体と１００倍希釈のPEラベルされた抗マウスIgG抗体（BD社）を５０μlずつ添加し、遮光下４℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄し、細胞をＰＢＳ ２００μlで懸濁した。FACS Calibur（BD社）にてデータを取り込んだ。取り込んだデータをＦＳＣとＳＳＣのドットプロットで展開し、生細胞をゲーティングした。このゲート内の細胞のデータが２，０００ countになるまでデータを取り込んだ。その結果、抗ｈＰＴＰＲＳ抗体を産生する１３個のハイブリドーマが得られた (２Ｇ６、２８Ｇ１０、４Ｂ２、２Ｇ２、９Ｈ５、１０Ｆ７、２２Ｈ８、４９Ｆ２、９Ｄ２、１４Ａ８、５５Ｅ７、１３Ｇ５、１６Ｈ２) （図５）。
Ａ−４）ＣＡＬ−１細胞を用いたＦＡＣＳスクリーニング
ヒトのｐＤＣ様細胞株ＣＡＬ−１細胞の3x105を上記各ハイブリドーマの培養上清５０μlで１５分間 ４℃で染めた。FACSバッファー(1% FBS+ PBS)で１度洗浄した後、遠心し、上清を除去した。PEラベルされた抗マウスIgG抗体 ２μg/ mlを２０分間４℃で反応させた。FACS バッファーで１度洗浄した後、遠心し、上清を除去した。細胞ペレットはFACS バッファーで再懸濁し、Caliburにて解析した。その結果、ハイブリドーマ培養上清の２Ｇ６、４Ｂ２、２Ｇ２、９Ｈ５、１０Ｆ７、２２Ｈ８、４９Ｆ２、１４Ａ８、５５Ｅ７、１３Ｇ５、１６Ｈ２はＣＡＬ−１に良く反応した。一方で、２８Ｇ１０と９Ｄ２はほとんど反応しなかった（図６）。
Ａ−５）ヒト末梢血ｐＤＣを用いたＦＡＣＳスクリーニング
［ヒトＰＢＭＣの単離］
健常人から末梢血２０ mlを集め、HISTOPAQUE-1077 (SIGMA社)を用いた比重遠心で末梢血単核球 （ＰＢＭＣ）を分離した。1ｘ106のＰＢＭＣをサンプルごとに染色した。FACS バッファーで細胞を洗浄した後、Fc block reagent (Militenyi社)を５倍希釈で２５μlずつ加え、４℃で１５分間反応を行った。FACS バッファーで洗浄後、各ハイブリドーマの細胞培養上清５０μl、１０μg/ mlのヤギIgG、抗hPTPRS pAb、およびマウスIgG2a,κを加え、４℃で２０分間反応させた。FACS バッファーで洗浄後、８μg/ mlのFITCラベル化抗ヤギIgG抗体または２μg/ mlのPEラベル化抗マウスIgG抗体を加え、４℃で２０分間反応を行った。FACS バッファーで洗浄後、APCラベル化抗BDCA2抗体を１０倍希釈の５０μlで４℃で２０分間反応させた。FACS バッファーで洗浄後、３００μlのFACS バッファーに細胞を再懸濁し、FACS caliburにて解析した。その結果、２Ｇ６、２８Ｇ１０、４Ｂ２、２Ｇ２、９Ｈ５、１０Ｆ７、２２Ｈ８、４９Ｆ２、１４Ａ８、５５Ｅ７、１３Ｇ５はｐＤＣ細胞群に対して特異的な結合反応を示した。９Ｄ２はｐＤＣに結合を示す一方、ｐＤＣ以外の細胞群 (BDCA2-)にも反応を示した。１６Ｈ２はＰＢＭＣ自体に反応を示さなかった（図７）。
抗ＰＴＰＲＳ抗体の特異性試験
ＰＴＰＲＳはＰＴＰＲファミリーに属し、そのうちいくつかのファミリー分子のアミノ酸配列はＰＴＰＲＳのアミノ酸配列に対して高い相同性を有する（図８）。
Ａ−６）ＰＴＰＲＳを認識し、ヒトｐＤＣに特異的に結合する抗体を産生する１０種類のハイブリドーマ細胞培養上清(２Ｇ６、４Ｂ２、２Ｇ２、９Ｈ５、１０Ｆ７、２２Ｈ８、４９Ｆ２、１４Ａ８、５５Ｅ７、１３Ｇ５)がＰＴＰＲＳのみに特異的に結合するかどうかを検討した。特にＰＴＰＲＳとの相同性の高かったＰＴＰＲＡ (４０％)、 ＰＴＰＲＤ (７６％)、ＰＴＰＲＦ (６７％) の遺伝子導入細胞を分子のＮ末端にFLAGタグを付加して作製し、染色した。遺伝子導入細胞でのｈＰＴＰＲＥの発現はWestern Blotで確認したが、細胞表面での発現は確認できなかった。したがってｈＰＴＰＲＥは細胞表面に発現しなかった。その結果、４Ｂ２はｈＰＴＰＲＤに反応し(図９Ｃ)、２Ｇ６はｈＰＴＰＲＦに交差反応性を示した(図９Ｄ)。それ以外の８種類の抗体はＰＴＰＲＳ特異的な結合を示した（図９Ａ-Ｄ）。
Ａ−７）抗ＰＴＰＲＳ抗体のサルへの交差反応性
カニクイザルのＰＢＭＣは末梢血（１０ml; 新日本科学社）よりHISTOPAQUE-1077 (SIGMA社)を用いた比重遠心で分離した。ＦＡＣＳには、１サンプルあたり5x105の細胞を使用した。FACS バッファーで細胞を洗浄した後、FACS バッファーで希釈した１０%のカニクイザルの血清を１０μl加え、４℃で２０分間反応を行った。FACS バッファーで洗浄後、各ハイブリドーマの細胞培養上清１００μl、１０μg/ mlのマウスIgG2a,κまたはマウスIgG1,κ（BioLegend社）を加え、４℃で１５分間反応させた。FACS バッファーで洗浄後、１μg/ mlのAPCラベルされた抗マウスIgG抗体（BD社）を加え、４℃で２０分間反応を行った。FACS バッファーで洗浄後、FITCラベル化抗Lineage1抗体（BD社）、PEラベル化抗CD123抗体（BD社）、およびPerCP7Cy5.5ラベル化抗HLA-DR抗体（BD社）を１０倍希釈の２５μlで４℃で１５分間反応させた。FACS バッファーで洗浄後、３００μlのFACS バッファーに細胞を再懸濁し、FACS caliburにて解析した。使用したハイブリドーマ培養上清は、ＰＴＰＲＳ特異的で、ＣＡＬ−１細胞やヒトｐＤＣによく結合する４９Ｆ２、５５Ｅ７、１４Ａ８、１３Ｇ５、１０Ｆ７、２２Ｈ８、９Ｈ５の７種類を選択した。その結果、すべてのハイブリドーマ細胞培養上清はカニクイザルのｐＤＣ細胞群(Lineage- CD123+ HLA-DR+)に特異的に結合した（図１０）。
Ａ−８）ハイブリドーマのシングル化
上記７種類（４９Ｆ２、５５Ｅ７、１４Ａ８、１３Ｇ５、１０Ｆ７、２２Ｈ８、９Ｈ５）のハイブリドーマをそれぞれ回収し、ソーティングバッファー(1%FBS/PBS)で1×105 cells/mlになるように懸濁した。FACS Aria (BD)を用いて単一細胞ソーティング（single cell sorting）を行った。データを取り込み、取り込んだデータをＸ軸: ＦＳＣとＹ軸: ＳＳＣの２次元ドットプロットで展開した。そのドットプロット上で生細胞をゲートで囲んだ。生細胞ゲート内の細胞からダブレットを除くためのゲートをかけ、その細胞集団を９６穴平底プレートに１cell/wellとなるよう分取した。Single cell sortingした細胞は、HAT培地 (RPMI1640+2 mM L-Glutamine, 100 Unit/ml Penicillin，100 μg/ml Streptomycin, 10 mM HEPES, 1 mM Sodium Pyruvate, 50μM 2-ME) + ハイブリドーマ成長サプリメントHFCS (Roche社)で培養した。その後、ハイブリドーマの細胞培養上清を用い、Ｄ２ＳＣ細胞とhPTPRS/D2SC細胞 (図１１ＡおよびＢ)、ＣＡＬ−１細胞(図１１Ｃ)、およびヒトｐＤＣ (図１１Ｄ)を染色し、シングルハイブリドーマを選択した。
実施例３
抗体精製
ProteinG Sepharose FastFlow (GEヘルスケア社)を用いた精製により、ハイブリドーマの培養上清から８種類(９Ｈ５−４、１０Ｆ７−３８、１３Ｇ５−５２、１３Ｇ５−５７、１４Ａ８−８５、２２Ｈ８−１４、４９Ｆ２−３０、５５Ｅ７−７９)の精製抗体を得た。Pierce Rapid ELISA mouse mAb Isotyping Kit (Thermo Fisher Scientific社)を用いてアイソタイプを確認した。その結果、１３Ｇ５−５２と１３Ｇ５−５７はマウスIgG2b,κで、５５Ｅ７−７９はマウスIgG2b,κとマウス IgG1,κの両方を有し、その他はマウス IgG1,κであった。もし精製抗体にエンドトキシンが含まれていると、性質決定試験の結果に影響を与えることがある。そこで、エンドトキシン濃度の測定を行った。使用したキットはエンドスペシー ES-50Mセット、トキシカラー DIA-MPセット、およびエンドトキシン標準品 CSE-Lセット（いずれも生化学バイオビジネス社）である。その結果、いずれの精製抗体も基準値である０．３EU/mg Ab以下のエンドトキシン濃度であった(図１２)。
精製抗体の反応性の検討
精製抗体の結合能をヒトｐＤＣ様細胞株であるＣＡＬ−１細胞で確認した。(図１３)。また、すべての抗体がヒト末梢血のｐＤＣ細胞群(BDCA2+)に対して結合能を維持していた(図１４)。
ヒトＰＴＰＲＳのマウスＰＴＰＲＳ (ｍＰＴＰＲＳ)に対するアミノ酸配列の相同性は約９６％である。それらは非常に類似しているため、作製した抗ヒトＰＴＰＲＳ抗体がマウスＰＴＰＲＳにも結合するのか検討した。ｍＰＴＰＲＳの遺伝子を強制発現させたＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞；以下mPTPRS/CHOとする。）を各抗ＰＴＰＲＳ抗体１０μg/ mlで染色した。細胞数は１サンプルあたり2x105とした。FACS バッファーで洗浄後、PEラベル化抗マウス IgG抗体を５０倍希釈し、２５μlで染色した。その結果、４９Ｆ２−３０、１３Ｇ５−５２、１３Ｇ５−５７および２２Ｈ８−８４はmPTPRS/cROに結合した(図１５)。
実施例４
抗ＰＴＰＲＳ抗体のｈＰＴＰＲＳ発現細胞への捕体依存的細胞傷害活性
幼若ウサギcomplementを用いて、ヒトＰＴＰＲＳを発現するＣＨＯ細胞（以下hPTPRS/CHOとする。）およびマウスPTPRS/CUO細胞 (以下mPTPRS/ CHOとする。)に対する抗ＰＴＰＲＳ抗体の補体依存性細胞傷害活性 (Complement-dependent cellular cytotoxicity; 以下CDC活性とする)を測定した。活性は細胞から放出された乳酸脱水素酵素 (lactase dehydrogenase: LDH)の測定値より算出した細胞毒性を指標として用いることにより得た。各細胞を2×104 cells/50 μl/wellずつ９６穴Ｕ底プレートに分注した。CDC培地(RPMI1640+ 0.1%BSA+ 10 mM HEPES+ 2 mM L-Glutamine+ 100Unit/ml Penicillin+ 100μg/ml Streptomycin)で18% Complement (CEDARLANE社)を調製した。コントロール抗体(マウスIgG1,κまたはマウス IgG2b,κ)と抗ＰＴＰＲＳ抗体を３．３μg/ mlと３０μg/ mlの２点調製した。アッセイはCytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega社)のキットを用いて行った。その結果、hPTPRS/CHOのターゲットに対し、１３Ｇ５−５２と１３Ｇ５−５７は約２０％のＣＤＣ活性を示した(図１６Ａ)。一方で、mPTPRS/CHOのターゲットに対しては、１３Ｇ５−５２と１３Ｇ５−５７は約１００％のＣＤＣ活性を示した(図１６Ｂ)。
実施例５
キメラ化抗体の作製
マウス抗ＰＴＰＲＳ抗体を産生するハイブリドーマとしては、下記のものを使用した。
ハイブリドーマ ９Ｈ５−４（寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３５６）
ハイブリドーマ １０Ｆ７−３８（寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３５７）
ハイブリドーマ １３Ｇ５−５２（寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３５８）
ハイブリドーマ １３Ｇ５−５７（寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３５９）
ハイブリドーマ １４Ａ８−８５（寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３６０）
ハイブリドーマ ２２Ｈ８−８４（寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３６１）
ハイブリドーマ ４９Ｆ２−３０（寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３６２）
１．定常領域のアイソタイプ確認
７種類のハイブリドーマ（９Ｈ５−４、１０Ｆ７−３８、１３Ｇ５−５２、１３Ｇ５−５７、１４Ａ８−８５、２２Ｈ８−８４、４９Ｆ２−３０）より産生された各マウス抗体の定常領域のアイソタイプを確認した。
確認にはmouse monoclonal antibody isotyping kit（カタログ番号: MMT1; Serotec Product社; オックスフォード, 英国）とPierce Rapid ELISA mouse mAb Isotyping Kit
(Thermo Fisher Scientific社)、およびサンプルとして各９Ｈ５−４、１０Ｆ７−３８、１３Ｇ５−５２、１３Ｇ５−５７、１４Ａ８−８５、２２Ｈ８−８４および４９Ｆ２−３０ハイブリドーマ培養上清を用いた。その結果、１３Ｇ５−５２および１３Ｇ５−５７ハイブリドーマの産生する抗体のアイソタイプは重鎖としてマウス IgG2b、軽鎖としてκを含むアイソタイプであった。一方、９Ｈ５−４、１０Ｆ７−３８、１４Ｈ８−８５、２２Ｈ８−８４および４９Ｆ２−３０ハイブリドーマの産生する抗体のアイソタイプは重鎖としてマウス IgG1、軽鎖としてκを含むアイソタイプであった。
２．マウス抗ＰＴＰＲＳ抗体の可変領域をコードするｃＤＮＡのクローニング
2-1）total RNAの単離
市販のキット「RNeasy Mini Kit」（Qiagen社、カタログ番号：74106）を用いてキット添付の指示書にしたがい、７種類のハイブリドーマからtotal RNAを単離した。5×106細胞数のハイブリドーマ細胞株から調製して、約３０μｇのtotal RNAが得られた。
2-2）マウス重鎖可変領域をコードするｃＤＮＡの増幅および断片化
2-1）で単離したtotal RNAのうち５μgを使用し、5’RACE PCR法によって、マウス重鎖可変領域をコードするｃＤＮＡを増幅した。増幅にあたっては、市販のキット「5’RACE System for Rapid Amplification of cDNA ENDs, Version 2.0 Kit」（インビトロジェン社、カタログ番号：18374-058）を用いた。詳細は以下の通りである。まず、2-1）で得られたtotal cDNAから逆転写酵素によって、第１鎖ｃＤＮＡを合成した。このとき、アンチセンスプライマー（GSP1）（配列番号１１）は以下に示すものを用いた。
ｃＤＮＡの増幅に用いたGSP1プライマーは各マウス重鎖のアイソタイブにしたがって用いた。たとえば以下のアンチセンスプライマーが重鎖にマウスIgG1を含む９Ｈ５−４、１０Ｆ７−３８、１４Ａ８−８５、２２Ｈ８−８４、４９Ｆ２−３０ハイブリドーマの重鎖可変領域のクローニングに用いられる。
GSP1プライマー：mu IgG1 VH-GSP1
配列: 5'-CCA GGA GAG TGG GAG AGG CTC TTC TCA GTA TGG TGG-3'(36-mer)（配列番号３９）
GSP2プライマー：mu IgG1 VH-GSP2
配列: 5'-GGC TCA GGG AAA TAG CCC TTG ACC AGG CAT CC-3'(32-mer)（配列番号４０）
また、たとえば以下のアンチセンスプライマーが重鎖にマウスIgG1を含む９Ｈ５−４、１０Ｆ７−３８、１４Ａ８−８５、２２Ｈ８−８４、４９Ｆ２−３０ハイブリドーマの重鎖可変領域のクローニングに用いられる。
GSP1プライマー：mu IgGHγ1 GSP1
配列: 5'-TCC AGA GTT CCA GGT CAC TGT CAC-3'(24-mer)（配列番号１１）
GSP2プライマー：mu IgGHγ1 GSP2
配列: 5'-AGG GGC CAG TGG ATA GAC AGA TGG-3'(32-mer)（配列番号１３）
さらに、以下のアンチセンスプライマーが重鎖にマウスIgG2bを含む１３Ｇ５−５２、１３Ｇ５−５７ハイブリドーマの重鎖可変領域のクローニングに用いられる。
GSP1プライマー：mu IgGHγ 2B-GSP1
配列: 5'-TCC AGA GTT CCA AGT CAC AGT CAC-3'(24-mer)（配列番号４１）
GSP2プライマー：mu IgGHγ 2B-GSP2
配列: 5'-AGG GGC CAG TGG ATA GAC TGA TGG-3'(32-mer)（配列番号４２）
そして、第１鎖ｃＤＮＡの3’-末端に、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdT）を用いて、ヌクレオチドホモポリマーであるdCを付加した。そして、dC（アンカー配列）に相補的なヌクレオチドポリマーを有しているアンカープライマー（配列番号１２）とアンチセンスプライマー（GSP2）を用いて、PCR法によってｃＤＮＡを増幅した。さらに、得られたPCR産物をテンプレートとし、AUAPプライマー（配列番号１４）とアンチセンスプライマー（GSP2）を用いて、Nested PCR法によりｃＤＮＡを増幅した。さらに、このPCR産物を1.5％低融点アガロース法によって精製した。
5'RACE用アンカープライマー（配列番号１２）5'-GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACG GGI IGG GII GGG IIG-3'(36-mer)
5'RACE用AUAPプライマー（配列番号１４）5'-GGC CAC GCG TCG ACT AGT AC-3'(20-mer)
2-3）マウス軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡの増幅および断片化
2-1）で単離したtotal RNA から、2-2）と同様にして、マウス軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡを増幅した。
これら７種類の抗体はマウスIgκ軽鎖を含むことから、以下のアンチセンスプライマーが軽鎖のクローニングに用いられる。
GSP1プライマー：Mu IgVL5RACE-GSP1
配列: 5'-TTC ACT GCC ATC AAT CTT CCA CTT-3'(24-mer)（配列番号１５）
GSP2プライマー：Mu IgVL5RACE-GSP2
配列: 5'-GAT GGA TAC AGT TGG TGC AGC-3'(21-mer)（配列番号１６）
得られたPCR産物を1.5％低融点アガロース法によって精製した。
2-4） ｃＤＮＡの塩基配列の確認とＣＤＲ領域の決定
2-2）で得られた重鎖可変領域、および2-3) で得られた軽鎖可変領域のｃＤＮＡ断片をそれぞれ、市販のキット「Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit」（インビトロジェン社、カタログ番号：1325137）を用い、キット添付の指示書にしたがってpCR4Blunt-TOPO ベクターにクローニングし、大腸菌コンピテント細胞に導入して大腸菌形質転換体を得た。この形質転換体からプラスミドを得て、配列解析のために、プラスミドDNA試料をOperon Biotechnology Co. Ltd社(東京)に送付して、プラスミド中のｃＤＮＡ塩基配列を確認した。配列の解析には「Sequencher DNA sequence assembly and analysis software version 4.2.2 (Gene Codes Corporation)」および「GENETYX-MAC Version.11.1.1」software (GENETYX CORPORATION)」を用いた。
相補性決定領域（以下、「ＣＤＲ領域」と記す。）周辺に、フレームシフト、ナンセンス変異等を生じている転写物は除外し、正しい配列の転写物を抽出した。さらに、当該プラスミド中に含まれるｃＤＮＡ塩基配列について、イムノグロブリンデータベース（IgBLAST, URL:www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/）と相同性を確認して、各々の可変領域内のＣＤＲ領域(ＣＤＲ;ＣＤＲ１,ＣＤＲ２，ＣＤＲ３)の配列を決定し、またフレームワーク領域と可変領域の配列はカバットナンバリングシステム（Kabat et al.,1991, sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health Publication No. 91-3242, 5th ed., United States Department of Health and Human Services, Bethesda, MD）を用いた分析方法にしたがって決定した。
得られた抗ＰＴＰＲＳマウス９Ｈ５−４抗体の重鎖可変領域の核酸配列は配列番号４３、アミノ酸配列は配列番号４４である。マウス９Ｈ５−４抗体の重鎖可変領域内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７である。
得られた抗ＦＴＰＲＳマウス９Ｈ５−４抗体の軽鎖可変領域の核酸配列は配列番号４８、アミノ酸配列は配列番号４９である。マウス９Ｈ５−４抗体の軽鎖可変領域内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２である。
また、得られた抗ＰＴＰＲＳマウス１０Ｆ７−３８抗体および１４Ａ８−８５抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の核酸配列は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の配列を含め、９Ｈ５−４抗体のものと同じであった。
得られた抗ＰＴＰＲＳマウス１３Ｇ５−５７抗体の重鎖可変領域の核酸配列は配列番号５３、アミノ酸配列は配列番号５４である。マウス１３Ｇ５−５７抗体の重鎖可変領域内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７である。
得られた抗ＦＴＰＲＳマウス１３Ｇ５−５７抗体の軽鎖可変領域の核酸配列は配列番号５８、アミノ酸配列は配列番号５９である。マウス１３Ｇ５−５７抗体の軽鎖可変領域内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２である。
また、得られた抗ＰＴＰＲＳマウス１３Ｇ５−５２抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の核酸配列は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の配列を含め、１３Ｇ５−５７抗体のものと同じであった。
得られた抗ＰＴＰＲＳマウス２２Ｈ８−８４抗体の重鎖可変領域の核酸配列は配列番号６３、アミノ酸配列は配列番号６４である。マウス２２Ｈ８−８４抗体の重鎖可変領域内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７である。
得られた抗ＦＴＰＲＳマウス２２Ｈ８−８４抗体の軽鎖可変領域の核酸配列は配列番号６８、アミノ酸配列は配列番号６９である。マウス２２Ｈ８−８４抗体の軽鎖可変領域内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２である。
得られた抗ＰＴＰＲＳマウス４９Ｆ２−３０抗体の重鎖可変領域の核酸配列は配列番号２５、アミノ酸配列は配列番号２６である。マウス４９Ｆ２−３０抗体の重鎖可変領域内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９である。
得られた抗ＦＴＰＲＳマウス４９Ｆ２−３０抗体の軽鎖可変領域の核酸配列は配列番号３０、アミノ酸配列は配列番号３１である。マウス４９Ｆ２−３０抗体の軽鎖可変領域内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４である。
得られた抗ＰＴＰＲＳマウス９Ｈ５−４抗体の重鎖可変領域の核酸配列（471bp）を以下に示す（配列番号４３）。大文字はマウス９Ｈ５−４ ＶＨ可変領域を示し、小文字はマウスＩｇＧ１ 重鎖定常領域を示す。
ATGGAGTTGGGACTGAGCTGGGTATTTCTTGTGGCTCTTTTGAATGGTGTCCAGTGTCAGGTGCAGCTTGTAGAGACCGGGGGAGGCTTGGTGAGGCCTGGAAATTCTCTGAAACTCTCCTGTGTTACCTCGGGATTCACTTTCAGTAACTACCGGATGCACTGGCTTCGCCAGCCTCCAGGGAAGAGGCTGGAGTGGATTGCTGTAATTACAGTCAAATCTGATAATTATGGAGCAAATTATGCAGAGTCTGTGAAAGGCAGATTCACTATTTCAAGAGATGATTCAAAAAGCAGTGTCTACCTGCAGATGAACAGATTAAGAGAGGAAGACACTGCCACTTATTATTGTAGTAGATCGGTCTACTATGGTTACGTCCTAGCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAgccaaaacgacacccccatctgtctatccactggcccctaagggc
マウス９Ｈ５−４抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列（157 a.a）を以下に示す（配列番号４４）。大文字はＶＨ可変領域の配列を示し、小文字はマウスＩｇＧ１ 重鎖定常領域を示す。下線部分はシグナル配列を示し、二重下線部分はＣＤＲ領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）を示す。

９Ｈ５−４抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ１はNYRMH（配列番号４５）であり、９Ｈ５−４抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ２はVITVKSDNYGANYAESVKG（配列番号４６）であり、９Ｈ５−４抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ３はSVYYGYVLAFDY（配列番号４７）である。

得られた抗ＰＴＰＲＳマウス９Ｈ５−４抗体の軽鎖可変領域の核酸配列（402bp）を以下に示す（配列番号４８）。大文字はマウス９Ｈ５−４ ＶＨ可変領域を示し、小文字はマウスＩｇ κ 軽鎖定常領域を示す。
ATGATGTCCTCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGCTCTGTTTTCAAGGTACCAGATGTGATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAAcgggctgatgctgcaccaact
マウス９Ｈ５−４抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（134 a.a）を以下に示す（配列番号４９）。大文字はマウス９Ｈ５−４ ＶＨ可変領域の配列を示し、小文字はマウスＩｇ κ 軽鎖定常領域を示す。下線部分はシグナル配列を示し、二重下線部分はＣＤＲ領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）を示す。

９Ｈ５−４抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ１はRASQDISNYLN（配列番号５０）であり、９Ｈ５−４抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ２はYTSRLHS（配列番号５１）であり、９Ｈ５−４抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ３はQQGNTLP（配列番号５２）である。
抗ＰＴＰＲＳマウス１３Ｇ５−５７抗体の重鎖可変領域の核酸配列（465bp）を以下に示す（配列番号５３）。大文字はマウス１３Ｇ５−５７ ＶＨ可変領域を示し、小文字はマウスＩｇＧ２ｂ 重鎖定常領域を示す。
ATGAACTTGGGGCTCAGCTTGATTTTCCTTGTCCTTGTTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAAGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAACCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGTATTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAGTAATGGTGGTGGTAGCACCTATTATCCAGACACTGTAAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAGCCGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGACATGTTTACTACGGGAGGAACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAgccaaaacaacacccccatcagtctatccactggcccctaagggc
マウス１３Ｇ５−５７抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列（155 a.a）を以下に示す（配列番号５４）。大文字はＶＨ可変領域の配列を示し、小文字はマウスＩｇＧ２ｂ 重鎖定常領域を示す。下線部分はシグナル配列を示し、二重下線部分はＣＤＲ領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）を示す。

１３Ｇ５−５７抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ１はDYYMY（配列番号５５）であり、１３Ｇ５−５７抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ２はYISNGGGSTYYPDTVKG（配列番号５６）であり、１３Ｇ５−５７抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ３はHVYYGRNYAMDY（配列番号５７）である。
得られた抗ＰＴＰＲＳマウス１３Ｇ５−５７抗体の軽鎖可変領域の核酸配列（465bp）を以下に示す（配列番号５８）。大文字はマウス１３Ｇ５−５７ ＶＨ可変領域を示し、小文字はマウスＩｇ κ 軽鎖定常領域を示す。
ATGAACTTGGGGCTCAGCTTGATTTTCCTTGTCCTTGTTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAAGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAACCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGTATTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAGTAATGGTGGTGGTAGCACCTATTATCCAGACACTGTAAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAGCCGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGACATGTTTACTACGGGAGGAACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAgccaaaacaacacccccatcagtctatccactggcccctaagggc
マウス１３Ｇ５−５７抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（155 a.a）を以下に示す（配列番号５９）。大文字はマウス１３Ｇ５−５７ ＶＨ可変領域の配列を示し、小文字はマウスＩｇ κ 軽鎖定常領域を示す。下線部分はシグナル配列を示し、二重下線部分はＣＤＲ領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）を示す。

１３Ｇ５−５７抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ１はRASQDISNYLN（配列番号６０）であり、１３Ｇ５−５７抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ２はYTSRLHS（配列番号６１）であり、１３Ｇ５−５７抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ３はQQGNTLPY（配列番号６２）である。
抗ＰＴＰＲＳマウス２２Ｈ８−８４抗体の重鎖可変領域の核酸配列（458bp）を以下に示す（配列番号６３）。大文字はマウス２２Ｈ８−８４ ＶＨ可変領域を示し、小文字はマウスＩｇＧ１ 重鎖定常領域を示す。
ATGGAATGTAACTGGATACTTCCTTTTATTCTGTCAGTAACTTCAGGTGTCTACTCACAGGTTCAGCTCCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGCAAGACCTGGGGCTTCAGTGAAGTTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTTACTAGCTACTGGATGCAGTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGGGCTATTTATCCTGGAGATGGTGATACTAGGTACACTCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGCAGATAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCTTGGCATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGAAGGATTTACTACGGCTATTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCagccaaaacgacacccccatctgtctatccactggcccc
マウス２２Ｈ８−８４抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列（152 a.a）を以下に示す（配列番号６４）。大文字はＶＨ可変領域の配列を示し、小文字はマウスＩｇＧ１ 重鎖定常領域を示す。下線部分はシグナル配列を示し、二重下線部分はＣＤＲ領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）を示す。

２２Ｈ８−８４抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ１はSYWMQ（配列番号６５）であり、２２Ｈ８−８４抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ２はAIYPGDGDTRYTQKFKG（配列番号６６）であり、２２Ｈ８−８４抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ３はRIYYGYYYAMDY（配列番号６７）である。
得られた抗ＰＴＰＲＳマウス２２Ｈ８−８４抗体の軽鎖可変領域の核酸配列（430bp）を以下に示す（配列番号６８）。大文字はマウス２２Ｈ８−８４ ＶＨ可変領域を示し、小文字はマウスＩｇ κ 軽鎖定常領域を示す。
ATGGAGACAGACACAATCCTGCTATGGGTGCTGCTGCTCTGGGTTCCAGGCTCCACTGGTGACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAAGGCCAGCCAAAGTGTTGATTATGATGGTGATAGTTATATGAACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATGCTGCATCCAATCTAGAATCTGGGATCCCAGCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCAAAGTAATGAGGATCCTCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAAcgggctgatgctgcaccaactgtatccatcaagggcg
マウス２２Ｈ８−８４抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（143 a.a）を以下に示す（配列番号６９）。大文字はマウス２２Ｈ８−８４ ＶＨ可変領域の配列を示し、小文字はマウスＩｇ κ 軽鎖定常領域を示す。下線部分はシグナル配列を示し、二重下線部分はＣＤＲ領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）を示す。

２２Ｈ８−８４抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ１はKASQSVDYDGDSYMN（配列番号７０）であり、２２Ｈ８−８４抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ２はAASNLES（配列番号７１）であり、２２Ｈ８−８４抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ３はQQSNEDPL（配列番号７２）である。
抗ＰＴＰＲＳマウス４９Ｆ２−３０抗体の重鎖可変領域の核酸配列(469bp)を以下に示す（配列番号２５）。大文字はマウス４９Ｆ２−３０ ＶＨ可変領域を示し、小文字はマウスＩｇＧ１ 重鎖定常領域を示す。
ATGAACTTCGGGCTCAGGTTGATTTTCCTTGCCCTCATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGACTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCATTTTCAGTAGCTATGGCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCAGACAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTAGTGGTGGTAGTGACACCTATTATCCAGACAGTGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAACAACACCCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGACAGGTCTACTATGGTCTTTACTGGTATTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAgccaaaacgacacccccatctgtctatccactggcccctaagggcgaat
マウス４９Ｆ２−３０抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列(156 a.a) を以下に示す（配列番号２６）。大文字はＶＨ可変遺伝子を示し、小文字はマウスＩｇＧ１ 重鎖定常領域を示す。下線の配列はシグナル配列を示し、二重下線の配列はＣＤＲ領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）を示す。

４９Ｆ２−３０抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ１はSYGMS（配列番号２７）、４９Ｆ２−３０抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ２はTISSGGSDTYYPDSVKG（配列番号２８）、４９Ｆ２−３０抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ３はQVYYGLYWYFDV（配列番号２９）である。
得られた抗ＰＴＰＲＳマウス４９Ｆ２−３０抗体の軽鎖可変領域の核酸配列(413bp)を以下に示す（配列番号３０）。大文字はマウス４９Ｆ２−３０ ＶＬ可変領域を示し、小文字はマウスＩｇ κ 軽鎖定常領域を示す。
ATGGAGTCACAGATTCAGGTCTTTGTATTCGTGTTTCTCTGGTTGTCTGGTGTTGACGGAGACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCATCATTTGTAAGGCCAGTCAGGATGTGAATACTGCTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGACAATCTCCTAAATTACTGATTTACTCGGCATCCTACCGGTACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACTGGCAGTGGATCTGGGACGGATTTCACTTTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAATTTATTACTGTCAGCAACATTATAGTACTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAAcgggctgatgctgcaccaactgtatccatcaa
マウス４９Ｆ２−３０抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列(137 a.a) を以下に示す（配列番号３１）。大文字はマウス４９Ｆ２−３０ ＶＬ 可変領域を、小文字はマウスＩｇ κ 軽鎖定常領域を示す。下線の配列はシグナル配列を示し、二重下線の配列はＣＤＲ領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）を示す。

４９Ｆ２−３０抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ１はKASQDVNTAVA（配列番号３２）、４９Ｆ２−３０抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ２はSASYRYT（配列番号３３）、４９Ｆ２−３０抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ３はQQHYSTP（配列番号３４）である。
３．キメラ化抗体の発現ベクターの作製
3-1）ヒトＩｇＧ定常領域をコードするｃＤＮＡのクローニング
ヒトＰＢＭＣのtotal RNAから、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域とヒトＩｇ κ軽鎖定常領域のｃＤＮＡをクローニングし、それぞれ、市販のキット「Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit」（インビトロジェン社、カタログ番号：1325137）を用い、キット添付の指示書にしたがってpCR4Blunt-TOPO ベクターにクローニングし、大腸菌コンピテント細胞に導入して大腸菌形質転換体を得た。この形質転換体から上記プラスミドを得て、配列解析のために、プラスミドＤＮＡ試料をOperon Biotechnology Co. Ltd社(東京)に送付して、プラスミド中のｃＤＮＡ塩基配列を確認した。
3-2）キメラ９Ｈ５−４(１０Ｆ７−３８、１４Ａ８−８５)抗体の発現ベクターの作製
キメラ化ＰＴＰＲＳ抗体の重鎖をコードするｃＤＮＡを調製するために、2-2で得られたマウス９Ｈ５−４抗体の重鎖可変領域と、ヒトＩｇＧ重鎖定常領域が組み込まれたpEE6.4ベクター（Lonza Biologics社, Slough, UK）を融合し、マウス９Ｈ５−４抗体の重鎖可変領域をＰＣＲ法により増幅し、約４５０ベース長のＰＣＲ産物を得た。このとき、プライマーは以下のものである。得られたＰＣＲ産物を1.5％低融点アガロース法によって精製した。
キメラ９Ｈ５−４抗体の重鎖発現用プライマー
1) フォワードプライマー：chi10F7VH-IF(Hind3)
配列: 5' ttt AAG CTT gcc gcc acc ATG GAG TTG GGA CTG AGC TGG 3'(39-mer)（配列番号７３）
2)リバースプライマー：chi10F7VH-462R(ApaI)
配列: 5' cga tgg gcc ctt ggt gct agc TGA GGA GAC TGT GAG AGT GGT 3'(42-mer)（配列番号７４）
「９Ｈ５−４重鎖可変領域をコードするＰＣＲ産物」はＰＣＲ法によって2-2で得られたマウス９Ｈ５−４抗体の重鎖可変領域から得た。９Ｈ５−４重鎖可変領域をコードするＰＣＲ産物をHind IIIとApa I制限酵素で消化し、1.5％アガロースゲル法で精製した。これをddH2Oで溶解し、重鎖可変領域をコードするｃＤＮＡ断片の溶液とした。
得られたｃＤＮＡの９Ｈ５−４のVHコード領域を、Hind IIIとApaIをクローニングサイトとして、pEE6.4ベクター(Lonza Biologics社, Slough, UK)へのクローニングのための好適な制限部位(HindIIIおよびApaI)ならびに理想的Kozak配列(GCCGCCACC)を導入したプライマーchi10F7VH-IF(Hind3)およびchi10F7VH-462R(ApaI)を用いて、９Ｈ５−４のVH領域を含むpCR4Blunt-TOPOプラスミドクローンからＰＣＲで増幅した。Chi9H5-4VH-pEE6.4ベクターは、ヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域を含む。VHPCR断片を、HindIIIおよびApaIを用いて、インフレームでpEE6.4ベクターに挿入した。コンストラクトをｃＤＮＡ塩基配列解析によって調べ、配列解析のために、プラスミドＤＮＡ試料をOperon Biotechnology Co. Ltd社(東京)に送付して、プラスミド中のｃＤＮＡ塩基配列を確認した。
キメラ９Ｈ５−４抗体の軽鎖をコードするｃＤＮＡを調製するために、2-3で得られたマウス９Ｈ５−４抗体軽鎖可変領域と、3-2で得られたヒトIg κ軽鎖定常領域を融合したＰＣＲフラグメントを重複伸長ＰＣＲ法に基づく手法によって730塩基の長さでＰＣＲ産物を増幅した。
９Ｈ５−４軽鎖可変領域をコードするＰＣＲ産物をHind IIIとEcoRI制限酵素で消化し、1.5％アガロースゲル法で精製した。これをddH2Oで溶解し、軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡ断片の溶液とした。
得られた９Ｈ５−４のVLコードするｃＤＮＡを、pEE14.4ベクター(Lonza Biologics)へのクローニングのための好適な制限部位(HindIIIおよびEcoRI)ならびに理想的Kozak配列を導入した、プライマーchi11G9VL-IF(Hind)およびchi11G9VL-726R(RI)を用いて、９Ｈ５−４のVL領域を含むpCR4Blunt-TOPOプラスミドクローンからＰＣＲで増幅した。Chi9H5-4VL-pEE14.4ベクターは、カッパ軽鎖定常領域を含む。VL PCR断片を、HindIIIおよびEcoRIを用いて、インフレームで、pEE14.4ベクターに挿入した。コンストラクトをｃＤＮＡ塩基配列解析によって調べた。
キメラ９Ｈ５−４抗体の軽鎖発現用プライマー
1) フォワードプライマー：chi11G9VL-IF(Hind)
配列: 5' acc AAG CTT gcc gcc acc ATG ATG TCC TCT GCT CAG TTC 3'(39-mer)（配列番号７５）
2)リバースプライマー：chi11G9VL-408R
配列: 5' agc cac agt tcg TTT GAT TTC CAG CTT GGT GCC 3'(33-mer)（配列番号７６）
3) フォワードプライマー：chi11G9VL-385F
配列: 5' CTG GAA ATC AAA cga act gtg gct gca cca tct 3'(33-mer)（配列番号７７）
4) リバースプライマー：chi11G9VL-726R
配列: 5' aaa GAA TTC cta gca ctc tcc cct gtt gaa 3'(30-mer)（配列番号７８）
3-2）キメラ１３Ｇ５−５７(１３Ｇ５−５２)抗体の発現ベクターの作製
キメラ化ＰＴＰＲＳ抗体の重鎖をコードするｃＤＮＡを調製するために、2-2で得られたマウス１３Ｇ５−５７抗体の重鎖可変領域と、ヒトＩｇＧ重鎖定常領域が組み込まれたpEE6.4ベクター（Lonza Biologics社, Slough, UK）を融合した。９Ｈ５−４抗体と同様の方法によりＰＣＲ産物を得て、さらに精製した。このとき、プライマーは以下のものである。
キメラ１３Ｇ５−５７抗体の重鎖発現用プライマー
1) フォワードプライマー： chi13G5.57VH-IF(Hind3)
配列: 5' ttt AAG CTT gcc gcc acc ATG AAC TTG GGG CTC AGC TTG 3'(39-mer)（配列番号７９）
2)リバースプライマー： chi13G5.57VH-456R(ApaI)
配列: 5' cga tgg gcc ctt ggt gct agc TGA GGA GAC GGT GAC TGA GGT 3'(42-mer)（配列番号８０）
キメラ１３Ｇ５−５７抗体の軽鎖をコードするｃＤＮＡを調製するために、2-3で得られたマウス１３Ｇ５−５７抗体軽鎖可変領域と、3-2で得られたヒトIg κ軽鎖定常領域を融合したＰＣＲフラグメントを重複伸長ＰＣＲ法に基づく手法によって730塩基の長さでＰＣＲ産物を増幅した。
キメラ１３Ｇ５−５７抗体の軽鎖発現用プライマー
1) フォワードプライマー：chi11G9VL-IF(Hind)
配列: 5' acc AAG CTT gcc gcc acc ATG ATG TCC TCT GCT CAG TTC 3'(39-mer)（配列番号８１）
2)リバースプライマー： chi11G9VL-408R
配列: 5' agc cac agt tcg TTT GAT TTC CAG CTT GGT GCC 3'(33-mer)（配列番号８２）
3) フォワードプライマー：chi11G9VL-385F
配列: 5' CTG GAA ATC AAA cga act gtg gct gca cca tct 3'(33-mer)（配列番号８３）
4) リバースプライマー：chi11G9VL-726R(RI)
配列: 5' aaa GAA TTC cta gca ctc tcc cct gtt gaa 3'(30-mer)（配列番号８４）
キメラ９Ｈ５−４抗体の発現ベクターの作製と同様の方法で、キメラ１３Ｇ５−５７抗体の重鎖や軽鎖などの発現ベクターを作製した。
3-2）キメラ２２Ｈ８−８４抗体の発現ベクターの作製
キメラ化ＰＴＰＲＳ抗体の重鎖をコードするｃＤＮＡを調製するために、2-2で得られたマウス２２Ｈ８−８４抗体の重鎖可変領域と、ヒトＩｇＧ重鎖定常領域が組み込まれたpEE6.4ベクター（Lonza Biologics社, Slough, UK）を融合した。９Ｈ５−４抗体と同様の方法によりＰＣＲ産物を得て、さらに精製した。このとき、プライマーは以下のものである。
キメラ２２Ｈ８−８４抗体の重鎖発現用プライマー
1) フォワードプライマー：chi22H8VH-IF(Hind3)
配列: 5' ttt AAG CTT gcc gcc acc ATG GAA TGT AAC TGG ATA CTT 3'(39-mer)（配列番号８５）
2)リバースプライマー：chi22H8VH-456R(ApaI)
配列: 5' cga tgg gcc ctt ggt gct agc TGA GGA GAC GGT GAC TGA GGT 3'(42-mer)（配列番号８６）
キメラ２２Ｈ８−８４抗体の軽鎖をコードするｃＤＮＡを調製するために、2-3で得られたマウス２２Ｈ８−８４抗体軽鎖可変領域と、3-2で得られたヒトIg κ軽鎖定常領域を融合したＰＣＲフラグメントを重複伸長ＰＣＲ法に基づく手法によって730塩基の長さでＰＣＲ産物を増幅した。
キメラ２２Ｈ８−８４抗体の軽鎖発現用プライマー
1) フォワードプライマー：chi22H8VL-IF(Hind)
配列: 5' acc AAG CTT gcc gcc acc ATG GAG ACA GAC ACA ATC CTG 3'(39-mer)（配列番号８７）
2)リバースプライマー：chi22H8VL-420R
配列: 5' agc cac agt tcg TTT CAG CTC CAG CTT GGT CCC 3'(33-mer)（配列番号８８）
3) フォワードプライマー： chi22H8VL-397F
配列: 5' CTG GAG CTG AAA cga act gtg gct gca cca tct 3'(33-mer)（配列番号８９）
4) リバースプライマー： chi49F2VL-726R(RI)
配列: 5' aaa GAA TTC cta gca ctc tcc cct gtt gaa 3'(30-mer)（配列番号９０）
キメラ９Ｈ５−４抗体の発現ベクターの作製と同様の方法で、キメラ２２Ｈ８−８４抗体の重鎖や軽鎖などの発現ベクターを作製した。

3−2）キメラ化ＰＴＰＲＳ抗体の重鎖をコードするｃＤＮＡの調製
キメラ化ＰＴＰＲＳ抗体の重鎖をコードするｃＤＮＡを調製するために、2-2で得られたマウス４９Ｆ２−３０抗体重鎖可変領域と、3-1で得られたヒトIgG重鎖定常領域を融合したＰＣＲフラグメントを重複伸長ＰＣＲ法に基づく手法によって２つのＰＣＲフラグメントを交互し、ハイブリッド動作の結果として部分的に二重のフィラメント分子の形成を可能にするような方法で1434塩基の長さでＰＣＲ産物を増幅した。このとき、プライマーは表１に示すものである（配列番号１７〜２４）。得られたＰＣＲ産物を1.5％低融点アガロース法によって精製した。
2-2で得られたマウス４９Ｆ２−３０抗体重鎖可変領域と、3-1で得られたヒトIgG1重鎖定常領域をｃＤＮＡがオーバーラップする領域を持つ。そこで、この領域を用い、重複伸長ＰＣＲ法によって「４９Ｆ２−３０重鎖可変領域をコードするＰＣＲ産物」を得た。４９Ｆ２−３０重鎖可変領域をコードするＰＣＲ産物をHind IIIとEcoR I制限酵素で消化し、1.5％アガロースゲル法で精製した。これをddH2Oで溶解し、重鎖可変領域をコードするｃＤＮＡ断片の溶液とした。
得られたｃＤＮＡの４９Ｆ２−３０のVHコード領域を、Hind IIIとEcoR Iをクローニングサイトとして、pEE6.4ベクター(Lonza Biologics社, Slough, UK)へのクローニングのための好適な制限部位(Hind IIIおよびEcoR I)ならびに理想的Kozak配列(GCCGCCACC)を導入したプライマーchi49F2VH-IF(Hind3)およびchi49F2VH-1434R(RI)を用いて、４９Ｆ２−３０のVH領域を含むpCR4Blunt-TOPOプラスミドクローンからＰＣＲで増幅した。Chi49F2VH-pEE6.4ベクターは、ヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域を含む。VH PCR断片を、HindIIIおよびEcoRIを用いて、インフレームでpEE6.4ベクターに挿入した。コンストラクトをｃＤＮＡ塩基配列解析によって調べた。
3−3）キメラ化ＰＴＰＲＳ抗体の軽鎖をコードするｃＤＮＡの調製
キメラ化ＰＴＰＲＳ抗体の軽鎖をコードするｃＤＮＡを調製するために、2-3で得られたマウス４９Ｆ２−３０抗体軽鎖可変領域と、3-2で得られたヒトIg κ軽鎖定常領域を融合したＰＣＲフラグメントを重複伸長ＰＣＲ法に基づく手法によって726塩基の長さでＰＣＲ産物を増幅した。
４９Ｆ２−３０軽鎖可変領域をコードするＰＣＲ産物をHind IIIとEcoR I制限酵素で消化し、1.5％アガロースゲル法で精製した。これをddH2Oで溶解し、軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡ断片の溶液とした。
得られた４９Ｆ２−３０のVLコードするｃＤＮＡを、pEE14.4ベクター(Lonza Biologics社)へのクローニングのための好適な制限部位(HindIIIおよびEcoRI)ならびに理想的Kozak配列を導入した、プライマーchi49F2VL-IF(Hind)およびchi49F2VL-726R(RI)を用いて、４９Ｆ２−３０のVL領域を含むpCR4Blunt-TOPOプラスミドクローンからＰＣＲで増幅した。Chi49F2VL-pEE14.4ベクターは、カッパ軽鎖定常領域を含む。VLPCR断片を、HindIIIおよびEcoRIを用いて、インフレームで、pEE14.4ベクターに挿入した。コンストラクトをｃＤＮＡ塩基配列解析によって調べた。
3−4）キメラ化ＰＴＰＲＳ抗体ダブルジーンLonza 発現ベクターの構築
キメラ化ＰＴＰＲＳ抗体の重鎖発現ベクターおよびキメラ化ＰＴＰＲＳ抗体の軽鎖発現ベクターを、標準的なクローニング技術によって、１つの２遺伝子ベクター中で組み合わせたキメラ化ＰＴＰＲＳ抗体（ダブルジーン）Lonza 発現ベクターを構築した。
4. HEK-293F細胞における一過性発現
以下の一過性発現vector DNA（80μg）を使用した。
1)chi9H5-4VH/VL DG Lonza vector DNA
2)chi13G5-57VH/VL DG Lonza vector DNA
3)chi22H8-14VH/VL DG Lonza vector DNA
4)chi49F2-30VH/VL DG Lonza vector DNA
293F細胞をトランスフェクション前日に250 mLのエーレンマイヤーフラスコ(corning社 #431144)に8×105cells/mLで80 mLに合わせて３７℃、CO2濃度8%の条件で振とう７日間培養した。
７日間培養後に、トランスフェクションを行った293F細胞の培養液を50 mLチューブに回収し、2,070g、４℃の条件で５分間遠心分離を行った。上清をポアサイズ0.45 μmのシリンジフィルター（カタログ番号431220；CORNING社）でろ過を行い、培養上清をひとつにまとめた。
5．抗ＰＴＰＲＳキメラ化抗体の精製
キメラ９Ｈ５−４、１３Ｇ５−５７、２２Ｈ８−１４、４９Ｆ２−３０抗体をプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーによって精製した。4.で得られた粗抗体液を、それぞれプロテインＡアフィニティーカラム（rProteinA Sepharose Fast Flow (カタログ番号17-1279-01；Lot.311272；GE Healthcare社)で精製した。カラム条件は以下の通りである。結合バッファー（20 mM Sodium phosphate, 0.15 M NaCl, pH 7.4）、溶出バッファー（0.1M Glycine-HCl, pH 2.7）を用いてアフィニティー精製した。溶出画分は中和バッファー（1M Tris-HCl pH 9.5）を添加してpH７．２付近に調整した。精製後の抗体のバッファーをＰＢＳに置換するために、Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Unit 10kMWCO を用いてバッファーの交換を行った。
精製抗体の濃度は280 nmの吸光度を測定し、１mg／mlを1.38 ODとして算出した。
精製した抗ＰＴＰＲＳキメラ化抗体(ｃｈ９Ｈ５−４Ａｂ、ｃｈ１３Ｇ５−５７Ａｂ、ｃｈ２２Ｈ８−１４Ａｂ、ｃｈ４９Ｆ２−３０Ａｂ)をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、Flowcytometry法によって分析した。
作製されたキメラ９Ｈ５−４抗体の重鎖、および軽鎖の核酸配列とアミノ酸配列は、それぞれ次の配列番号の通りである。
重鎖 軽鎖
配列番号９１（核酸配列） 配列番号９３（核酸配列）
配列番号９２（アミノ酸配列） 配列番号９４（アミノ酸配列）
抗ＰＴＰＲＳキメラ９Ｈ５−４抗体の重鎖の核酸配列 (1419 bp) を以下に示す（配列番号９１）。大文字はキメラ９Ｈ５−４ ＶＨ 可変領域を、小文字はヒトＩｇＧ１ 重鎖定常領域を示す。
ATGGAGTTGGGACTGAGCTGGGTATTTCTTGTGGCTCTTTTGAATGGTGTCCAGTGTCAGGTGCAGCTTGTAGAGACCGGGGGAGGCTTGGTGAGGCCTGGAAATTCTCTGAAACTCTCCTGTGTTACCTCGGGATTCACTTTCAGTAACTACCGGATGCACTGGCTTCGCCAGCCTCCAGGGAAGAGGCTGGAGTGGATTGCTGTAATTACAGTCAAATCTGATAATTATGGAGCAAATTATGCAGAGTCTGTGAAAGGCAGATTCACTATTTCAAGAGATGATTCAAAAAGCAGTGTCTACCTGCAGATGAACAGATTAAGAGAGGAAGACACTGCCACTTATTATTGTAGTAGATCGGTCTACTATGGTTACGTCCTAGCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAgctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga
抗ＰＴＰＲＳキメラ９Ｈ５−４抗体の重鎖のアミノ酸配列 (472 a.a.) を以下に示す（配列番号９２）。大文字はキメラ９Ｈ５−４ ＶＨ 可変領域を、小文字はヒトＩｇＧ１ 重鎖定常領域を示す
MELGLSWVFLVALLNGVQCQVQLVETGGGLVRPGNSLKLSCVTSGFTFSNYRMHWLRQPPGKRLEWIAVITVKSDNYGANYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNRLREEDTATYYCSRSVYYGYVLAFDYWGQGTTLTVSSastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk

抗ＰＴＰＲＳキメラ９Ｈ５−４抗体の軽鎖の核酸配列 (705 bp) を以下に示す（配列番号９３）。大文字はキメラ９Ｈ５−４ ＶＬ 可変領域を、小文字はヒトＩｇ κ 軽鎖定常領域を示す。
ATGATGTCCTCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGCTCTGTTTTCAAGGTACCAGATGTGATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAAcgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgctag

抗ＰＴＰＲＳキメラ９Ｈ５−４抗体の軽鎖のアミノ酸配列 (234 a.a.) を以下に示す（配列番号９４）。大文字はキメラ９Ｈ５−４ ＶＬ 可変領域、小文字はヒトＩｇ κ 軽鎖定常領域を示す。
MMSSAQFLGLLLLCFQGTRCDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFGGGTKLEIKrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec

＜１３Ｇ５−５７＞
作製されたキメラ１３Ｇ５−５７抗体の重鎖、および軽鎖の核酸配列とアミノ酸配列は、それぞれ次の配列番号の通りである。
重鎖 軽鎖
配列番号９５（核酸配列） 配列番号９７（核酸配列）
配列番号９６（アミノ酸配列） 配列番号９８（アミノ酸配列）
抗ＰＴＰＲＳキメラ１３Ｇ５−５７抗体の重鎖の核酸配列 (1413 bp) を以下に示す（配列番号９５）。大文字はキメラ１３Ｇ５−５７ ＶＨ 可変領域を、小文字はヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を示す。
ATGAACTTGGGGCTCAGCTTGATTTTCCTTGTCCTTGTTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAAGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAACCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGTATTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAGTAATGGTGGTGGTAGCACCTATTATCCAGACACTGTAAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAGCCGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGACATGTTTACTACGGGAGGAACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAgctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga

抗ＰＴＰＲＳキメラ１３Ｇ５−５７抗体の重鎖のアミノ酸配列 (470 a.a.) を以下に示す（配列番号９６）。大文字はキメラ１３Ｇ５−５７ ＶＨ 可変領域を、小文字はヒトＩｇＧ１ 重鎖定常領域を示す
MNLGLSLIFLVLVLKGVQCEVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVAYISNGGGSTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSRLKSEDTAMYYCARHVYYGRNYAMDYWGQGTSVTVSSastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk

抗ＰＴＰＲＳキメラ１３Ｇ５−５７抗体の軽鎖の核酸配列 (705 bp) を以下に示す（配列番号９７）。大文字はキメラ１３Ｇ５−５７ ＶＬ 可変領域を、小文字はヒトＩｇ κ 軽鎖定常領域を示す。
ATGATGTCCTCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGCTCTGTTTTCAAGGTACCAGATGTGATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAAcgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgctag

抗ＰＴＰＲＳキメラ１３Ｇ５−５７抗体の軽鎖のアミノ酸配列 (234 a.a.) を以下に示す（配列番号９８）。大文字はキメラ１３Ｇ５−５７ ＶＬ 可変領域、小文字はヒトＩｇ κ 軽鎖定常領域を示す。
MMSSAQFLGLLLLCFQGTRCDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIKrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec

作製されたキメラ２２Ｈ８−８４抗体の重鎖、および軽鎖の核酸配列とアミノ酸配列は、それぞれ次の配列番号の通りである。
重鎖 軽鎖
配列番号９９（核酸配列） 配列番号１０１（核酸配列）
配列番号１００（アミノ酸配列） 配列番号１０２（アミノ酸配列）
抗ＰＴＰＲＳキメラ２２Ｈ８−８４抗体の重鎖の核酸配列 (1413 bp) を以下に示す（配列番号９９）。大文字はキメラ２２Ｈ８−８４ ＶＨ 可変領域を、小文字はヒトＩｇＧ１ 重鎖定常領域を示す。
ATGGAATGTAACTGGATACTTCCTTTTATTCTGTCAGTAACTTCAGGTGTCTACTCACAGGTTCAGCTCCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGCAAGACCTGGGGCTTCAGTGAAGTTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTTACTAGCTACTGGATGCAGTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGGGCTATTTATCCTGGAGATGGTGATACTAGGTACACTCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGCAGATAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCTTGGCATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGAAGGATTTACTACGGCTATTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAgctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga

抗ＰＴＰＲＳキメラ２２Ｈ８−８４抗体の重鎖のアミノ酸配列 (470 a.a.) を以下に示す（配列番号１００）。大文字はキメラ２２Ｈ８−８４ ＶＨ 可変領域を、小文字はヒトＩｇＧ１ 重鎖定常領域を示す
MECNWILPFILSVTSGVYSQVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTSYWMQWVKQRPGQGLEWIGAIYPGDGDTRYTQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCARRIYYGYYYAMDYWGQGTSVTVSSastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk

抗ＰＴＰＲＳキメラ２２Ｈ８−８４抗体の軽鎖の核酸配列 (717 bp) を以下に示す（配列番号１０１）。大文字はキメラ２２Ｈ８−８４ ＶＬ 可変領域を、小文字はヒトＩｇ κ 軽鎖定常領域を示す。
ATGGAGACAGACACAATCCTGCTATGGGTGCTGCTGCTCTGGGTTCCAGGCTCCACTGGTGACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAAGGCCAGCCAAAGTGTTGATTATGATGGTGATAGTTATATGAACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATGCTGCATCCAATCTAGAATCTGGGATCCCAGCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCAAAGTAATGAGGATCCTCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAAcgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgctag

抗ＰＴＰＲＳキメラ２２Ｈ８−８４抗体の軽鎖のアミノ酸配列 (238 a.a.) を以下に示す（配列番号１０２）。大文字はキメラ２２Ｈ８−８４ ＶＬ 可変領域、小文字はヒトＩｇ κ 軽鎖定常領域を示す。
METDTILLWVLLLWVPGSTGDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPLTFGAGTKLELKrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec

作製されたキメラ４９Ｆ２−３０抗体の重鎖、および軽鎖の核酸配列とアミノ酸配列は、それぞれ次の配列番号の通りである。
重鎖 軽鎖
配列番号３５（核酸配列） 配列番号３７（核酸配列）
配列番号３６（アミノ酸配列） 配列番号３８（アミノ酸配列）
抗ＰＴＰＲＳキメラ４９Ｆ２−３０抗体の重鎖の核酸配列 (1413 bp) を以下に示す（配列番号３５）。大文字はキメラ４９Ｆ２−３０ ＶＨ 可変領域を、小文字はヒトＩｇＧ１ 重鎖定常領域を示す。
ATGAACTTCGGGCTCAGGTTGATTTTCCTTGCCCTCATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGACTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCATTTTCAGTAGCTATGGCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCAGACAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTAGTGGTGGTAGTGACACCTATTATCCAGACAGTGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAACAACACCCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGACAGGTCTACTATGGTCTTTACTGGTATTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAgctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga
抗ＰＴＰＲＳキメラ４９Ｆ２−３０抗体の重鎖のアミノ酸配列 (470 a.a.) を以下に示す（配列番号３６）。大文字はキメラ４９Ｆ２−３０ ＶＨ 可変領域を、小文字はヒトＩｇＧ１ 重鎖定常領域を示す。
MNFGLRLIFLALILKGVQCEVQLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFIFSSYGMSWVRQTPDKRLEWVATISSGGSDTYYPDSVKGRFTISRDNANNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARQVYYGLYWYFDVWGAGTTVTVSSastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
抗ＰＴＰＲＳキメラ４９Ｆ２−３０抗体の軽鎖の核酸配列 (705 bp) を以下に示す（配列番号３７）。大文字はキメラ４９Ｆ２−３０ ＶＬ 可変領域を、小文字はヒトＩｇ κ 軽鎖定常領域を示す。
ATGGAGTCACAGATTCAGGTCTTTGTATTCGTGTTTCTCTGGTTGTCTGGTGTTGACGGAGACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCATCATTTGTAAGGCCAGTCAGGATGTGAATACTGCTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGACAATCTCCTAAATTACTGATTTACTCGGCATCCTACCGGTACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACTGGCAGTGGATCTGGGACGGATTTCACTTTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAATTTATTACTGTCAGCAACATTATAGTACTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAAcgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgctag
抗ＰＴＰＲＳキメラ４９Ｆ２−３０抗体の軽鎖のアミノ酸配列 (234 a.a.) を以下に示す（配列番号３８）。大文字はキメラ４９Ｆ２−３０ ＶＬ 可変領域、小文字はヒトＩｇ κ 軽鎖定常領域を示す。
MESQIQVFVFVFLWLSGVDGDIVMTQSHKFMSTSVGDRVSIICKASQDVNTAVAWYQQKPGQSPKLLIYSASYRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAIYYCQQHYSTPYTFGGGTKLEIKrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
実施例６
作製した抗ヒトＰＴＰＲＳキメラ抗体（ｃｈ４９Ｆ２−３０、ｃｈ９Ｈ５−４、ｃｈ１３Ｇ５−５７、ｃｈ２２Ｈ８−８４)の抗体依存性細胞傷害活性
(Antibody-dependent cellular cytotoxicity; ＡＤＣＣ活性)を測定した。活性は細胞から放出された乳酸脱水素酵素 (ＬＤＨ)の測定値より算出した細胞毒性を指標とした。エフェクター細胞となるヒト末梢血単核球はHISTOPAQUE-1077を使った比重遠心で精製した。ターゲットとなる細胞は、ＣＨＯ (チャイニーズハムスター卵巣細胞株)を使ったｈＰＴＰＲＳ遺伝子の強制形質転換細胞を用いた(2ｘ104/ well)。エフェクターとターゲット細胞の割合が、10:1、20:1、40:1、および80:1になるように混合し、作製した抗ヒトＰＴＰＲＳキメラ抗体（ｃｈ４９Ｆ２−３０、ｃｈ９Ｈ５−４、ｃｈ１３Ｇ５−５７、ｃｈ２２Ｈ８−８４)またはコントロール抗体のSynagisを10 μg/ mlを加えて、４時間３７℃で培養し、抗体の細胞傷害活性効果を評価した。その結果、抗ｈＰＴＰＲＳキメラ抗体のｃｈ４９Ｆ２−３０、ｃｈ９Ｈ５−４、ｃｈ１３Ｇ５−５７、ｃｈ２２Ｈ８−８４はエフェクター細胞数依存的にターゲットのhPTPRS/CHO細胞を傷害した（図１７Ａおよび図１７Ｂ）。この結果は、作製した抗ＰＴＰＲＳキメラ抗体が、ＰＴＰＲＳを発現する細胞を選択的に傷害することを示した。
抗ＰＴＰＲＳ抗体のｐＤＣへの効果を検討した。ヒト末梢血からＰＢＭＣを精製し、10μg/ mlの抗ヒトＰＴＰＲＳキメラ抗体と混合し２４時間培養した。その後、ｐＤＣに発現しているトール様レセプター９のリガンドであるCpG2216で２４時間刺激し、IFNα産生を誘導した。CpG刺激後、IFNαの産生量を試験した。結果、作製した抗ヒトＰＴＰＲＳキメラ抗体（ｃｈ４９Ｆ２−３０、ｃｈ９Ｈ５−４、ｃｈ１３Ｇ５−５７、ｃｈ２２Ｈ８−８４)処理によってIFNα産生が完全に阻害されていた（図１８Ａ）。さらに、ｃｈ４９Ｆ２−３０、ｃｈ９Ｈ５−４、ｃｈ１３Ｇ５−５７、ｃｈ２２Ｈ８−８４処理した６時間後に細胞を回収し、ｐＤＣｌを抗ＢＤＣＡ2抗体と抗ＢＤＣＡ４抗体の二重染色で確認すると、ｐＤＣ細胞群がコントロール抗体のSynagis処理よりも減少していることがわかった（図１８Ｂおよび図１８Ｃ）。これらの結果は、抗ＰＴＰＲＳキメラ抗体がＰＴＰＲＳを特異的に発現するｐＤＣを傷害し、その結果、CpG2216刺激によるIFNα産生を阻害したことを示した。
本発明は、ヒトＰＴＰＲＳを特異的に認識する抗体、その抗体の製造に有用な免疫原、およびその免疫原を利用する抗ヒトＰＴＰＲＳ抗体の製造方法を提供する。
ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３５６
ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３５７
ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３５８
ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３５９
ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３６０
ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３６１
ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３６２
ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３６３
配列番号３：フォワードプライマー
配列番号４：リバースプライマー
配列番号５：フォワードプライマー
配列番号６：リバースプライマー
配列番号７：フォワードプライマー
配列番号８：リバースプライマー
配列番号９：フォワードプライマー
配列番号１０：リバースプライマー
配列番号１１：アンチセンスプライマー
配列番号１２：アンカープライマー
配列番号１２：ｎはデオキシイノシンである。
配列番号１３：アンチセンスプライマー
配列番号１４：ＡＵＡＰプライマー
配列番号１５：アンチセンスプライマー
配列番号１６：アンチセンスプライマー
配列番号１７：プライマー
配列番号１８：プライマー
配列番号１９：プライマー
配列番号２０：プライマー
配列番号２１：プライマー
配列番号２２：プライマー
配列番号２３：プライマー
配列番号２４：プライマー
配列番号３５：抗ＰＴＰＲＳキメラ４９Ｆ２−３０抗体重鎖核酸配列
配列番号３６：抗ＰＴＰＲＳキメラ４９Ｆ２−３０抗体重鎖アミノ酸配列
配列番号３７：抗ＰＴＰＲＳキメラ４９Ｆ２−３０抗体軽鎖核酸配列
配列番号３８：抗ＰＴＰＲＳキメラ４９Ｆ２−３０抗体軽鎖アミノ酸配列
配列番号３９：プライマー
配列番号４０：プライマー
配列番号４１：プライマー
配列番号４２：プライマー
配列番号７３：フォワードプライマー
配列番号７４：リバースプライマー
配列番号７５：フォワードプライマー
配列番号７６：リバースプライマー
配列番号７７：フォワードプライマー
配列番号７８：リバースプライマー
配列番号７９：フォワードプライマー
配列番号８０：リバースプライマー
配列番号８１：フォワードプライマー
配列番号８２：リバースプライマー
配列番号８３：フォワードプライマー
配列番号８４：リバースプライマー
配列番号８５：フォワードプライマー
配列番号８６：リバースプライマー
配列番号８７：フォワードプライマー
配列番号８８：リバースプライマー
配列番号８９：フォワードプライマー
配列番号９０：リバースプライマー
配列番号９１：抗ＰＴＰＲＳキメラ９Ｈ５−４抗体重鎖核酸配列
配列番号９２：抗ＰＴＰＲＳキメラ９Ｈ５−４抗体重鎖アミノ酸配列
配列番号９３：抗ＰＴＰＲＳキメラ９Ｈ５−４抗体軽鎖核酸配列
配列番号９４：xx：抗ＰＴＰＲＳキメラ９Ｈ５−４抗体軽鎖アミノ酸配列
配列番号９５：抗ＰＴＰＲＳキメラ１３Ｇ５−５７抗体重鎖核酸配列
配列番号９６：抗ＰＴＰＲＳキメラ１３Ｇ５−５７抗体重鎖アミノ酸配列
配列番号９７：抗ＰＴＰＲＳキメラ１３Ｇ５−５７抗体軽鎖核酸配列
配列番号９８：抗ＰＴＰＲＳキメラ１３Ｇ５−５７抗体軽鎖アミノ酸配列
配列番号９９：抗ＰＴＰＲＳキメラ２２Ｈ８−８４抗体重鎖核酸配列
配列番号１００：抗ＰＴＰＲＳキメラ２２Ｈ８−８４抗体重鎖アミノ酸配列
配列番号１０１：抗ＰＴＰＲＳキメラ２２Ｈ８−８４抗体軽鎖核酸配列
配列番号１０２：抗ＰＴＰＲＳキメラ２２Ｈ８−８４抗体軽鎖アミノ酸配列

Claims (23)

  1. ヒト受容体型プロテインチロシンホスファターゼσ（ヒトＰＴＰＲＳ）の細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
  2. 形質細胞様樹状細胞に結合する請求項１に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
  3. 受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３５６として寄託されたハイブリドーマ９Ｈ５−４、 受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３５７として寄託されたハイブリドーマ１０Ｆ７−３８、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３５８として寄託されたハイブリドーマ１３Ｇ５−５２、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３５９として寄託されたハイブリドーマ１３Ｇ５−５７、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３６０として寄託されたハイブリドーマ１４Ａ８−８５、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３６１として寄託されたハイブリドーマ２２Ｈ８−８４、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３６２として寄託されたハイブリドーマ４９Ｆ２−３０、または受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３６３として寄託されたハイブリドーマ５５Ｅ７−７９が産生するモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
  4. 請求項１または２に記載のモノクローナル抗体のいずれかを産生するハイブリドーマ。
  5. 受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３５６として寄託されたハイブリドーマ９Ｈ５−４、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３５７として寄託されたハイブリドーマ１０Ｆ７−３８、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３５８として寄託されたハイブリドーマ１３Ｇ５−５２、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３５９として寄託されたハイブリドーマ１３Ｇ５−５７、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３６０として寄託されたハイブリドーマ１４Ａ８−８５、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３６１として寄託されたハイブリドーマ２２Ｈ８−８４、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３６２として寄託されたハイブリドーマ４９Ｆ２−３０、または受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３６３として寄託されたハイブリドーマ５５Ｅ７−７９が産生するモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
  6. 請求項５に記載のハイブリドーマを培養し、培養物からモノクローナル抗体を採取する工程を含む、モノクローナル抗体の製造方法。
  7. 次の工程を含む、ヒトＰＴＰＲＳに結合するモノクローナル抗体を産生する細胞の製造方法；
    （１）ヒトＰＴＰＲＳの細胞外ドメインを含む外来性のタンパク質を発現する細胞を免疫動物に投与する工程、および
    （２）前記免疫動物の抗体産生細胞から、ヒトＰＴＰＲＳに結合する抗体を産生する抗体産生細胞を選択する工程。
  8. ヒトＰＴＰＲＳを発現する細胞が、ヒトＰＴＰＲＳの細胞外ドメインを含むアミノ酸配列をコードする外来性のポリヌクレオチドを発現可能に保持する細胞である請求項７に記載の方法。
  9. 前記細胞が動物細胞である請求項８に記載の方法。
  10. 前記細胞がヒト由来の細胞である請求項９に記載の方法。
  11. 前記ヒト由来の細胞が、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞である請求項１０に記載の方法。
  12. 得られた抗体産生細胞をクローン化する工程を付加的に含む、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 請求項９に記載の方法によって得られた抗体産生細胞を培養し、その培養物からモノクローナル抗体を採取する工程を含む、ヒトＰＴＰＲＳの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体の製造方法。
  14. 下記の工程によって得ることができる、ヒトＰＴＰＲＳを認識するモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片：
    （１） ヒトＰＴＰＲＳの細胞外ドメインを含むタンパク質を外来性に発現する細胞を免疫動物に投与する工程、
    （２）前記免疫動物の抗体産生細胞から、ヒトＰＴＰＲＳに結合する抗体を産生する抗体産生細胞を選択する工程、および
    （３）工程（２）で選択された抗体産生細胞を培養しその培養物からヒトＰＴＰＲＳを認識する抗体を回収する工程。
  15. （ａ） ヒトＰＴＰＲＳの細胞外ドメインを含むアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを外来性に発現可能に保持する動物細胞、またはその細胞膜分画を含む、ヒトＰＴＰＲＳに結合する抗体を製造するための免疫原。
  16. 動物細胞がヒト由来の細胞である請求項１５に記載の免疫原。
  17. ヒトＰＴＰＲＳの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片を被検細胞と接触させ、該細胞に結合したモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片を検出する工程を含む、形質細胞様樹状細胞の検出方法。
  18. ヒトＰＴＰＲＳの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片を含む、形質細胞様樹状細胞の検出用試薬。
  19. 次の成分のいずれかを形質細胞様樹状細胞に接触させる工程を含む、形質細胞様樹状細胞の活性抑制方法：
    （ａ）ヒトＰＴＰＲＳに結合し、形質細胞様樹状細胞の活性を抑制するモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片、
    （ｂ）（ａ）のモノクローナル抗体の相補性決定領域を移植したイムノグロブリン、またはその抗原結合領域を含む断片。
  20. 次の成分のいずれかを生体に投与する工程を含む、生体中の形質細胞様樹状細胞の活性抑制方法：
    （ａ）ヒトＰＴＰＲＳに結合し、形質細胞様樹状細胞の活性を抑制するモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片、
    （ｂ）（ａ）のモノクローナル抗体の相補性決定領域を移植したイムノグロブリン、またはその抗原結合領域を含む断片。
  21. 形質細胞様樹状細胞の活性が、インターフェロン産生活性およびインターフェロン産生細胞の生存のいずれか、または両方である請求項１９または請求項２０に記載の方法。
  22. 次の成分のいずれかを有効成分として含む、形質細胞様樹状細胞の活性抑制剤：
    （ａ）ヒトＰＴＰＲＳに結合し、形質細胞様樹状細胞の活性を抑制するモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片、
    （ｂ）（ａ）のモノクローナル抗体の相補性決定領域を移植したイムノグロブリン、またはその抗原結合領域を含む断片。
  23. 形質細胞様樹状細胞の活性が、インターフェロン産生活性およびインターフェロン産生細胞の生存のいずれか、または両方である請求項２２に記載のインターフェロン産生細胞の活性抑制剤。
JP2016170634A 2011-04-28 2016-09-01 抗ヒト受容体型プロテインチロシンホスファターゼσ抗体 Active JP6412072B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2011101752 2011-04-28
JP2011101752 2011-04-28

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2013549652A Division JP6001557B2 (ja) 2011-04-28 2012-04-27 抗ヒト受容体型プロテインチロシンホスファターゼσ抗体

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2017048183A true JP2017048183A (ja) 2017-03-09
JP6412072B2 JP6412072B2 (ja) 2018-10-24

Family

ID=46147004

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2013549652A Active JP6001557B2 (ja) 2011-04-28 2012-04-27 抗ヒト受容体型プロテインチロシンホスファターゼσ抗体
JP2016170634A Active JP6412072B2 (ja) 2011-04-28 2016-09-01 抗ヒト受容体型プロテインチロシンホスファターゼσ抗体

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2013549652A Active JP6001557B2 (ja) 2011-04-28 2012-04-27 抗ヒト受容体型プロテインチロシンホスファターゼσ抗体

Country Status (17)

Country Link
US (2) US9803026B2 (ja)
EP (2) EP3232202B1 (ja)
JP (2) JP6001557B2 (ja)
KR (1) KR101873614B1 (ja)
CN (1) CN103703372B (ja)
AU (2) AU2012248158C1 (ja)
BR (1) BR112013027631A2 (ja)
CA (1) CA2834243C (ja)
ES (2) ES2638088T3 (ja)
HU (2) HUE054211T2 (ja)
IL (1) IL229127A (ja)
MX (1) MX352599B (ja)
PL (2) PL3232202T3 (ja)
PT (2) PT3232202T (ja)
RU (2) RU2715642C2 (ja)
SG (3) SG10202108240VA (ja)
WO (1) WO2012148003A1 (ja)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8158757B2 (en) 2007-07-02 2012-04-17 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating and diagnosing cancer
WO2012148003A1 (en) * 2011-04-28 2012-11-01 Sbi Biotech Co., Ltd. ANTI-HUMAN RECEPTOR-TYPE PROTEIN TYROSINE PHOSPHATASE σ ANTIBODY
CN106167526A (zh) 2011-07-15 2016-11-30 昂考梅德药品有限公司 Rspo结合剂和其应用
MX2015000565A (es) 2012-07-13 2015-04-10 Oncomed Pharm Inc Agentes de union de proteina de r-espondina humana (rspo3) y usos de los mismos.
US20150175979A1 (en) 2012-07-23 2015-06-25 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Ptprs and proteoglycans in autoimmune disease
US11160873B2 (en) * 2014-02-04 2021-11-02 Monash University Anti-metalloprotease antibody for diagnosis and treatment of cancers
WO2015117199A1 (en) * 2014-02-04 2015-08-13 Monash University Anti-metalloprotease antibody for diagnosis and treatment of cancers
CA2961374A1 (en) 2014-09-16 2016-03-24 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Treatment of fibrotic diseases
EP3633371A1 (en) * 2014-12-18 2020-04-08 F. Hoffmann-La Roche AG Assay and method for determining cdc eliciting antibodies
JP7251792B2 (ja) * 2017-03-23 2023-04-04 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア 抗Ｃ５ａ抗体とその使用
CA3057676A1 (en) * 2017-03-24 2018-09-27 The Regents Of The University Of California Proteoglycan irregularities in abnormal fibroblasts and therapies based therefrom
US11242398B2 (en) 2017-08-01 2022-02-08 Remd Biotherapeutics, Inc. Anti-OX40 antibodies and methods of activating OX40
WO2020023679A1 (en) * 2018-07-25 2020-01-30 Accurus Biosciences, Inc. Novel cldn 18.2-specific monoclonal antibodies and methods of use thereof
MX2022004058A (es) * 2019-10-04 2022-07-13 Albert Einstein College Of Medicine Kir3dl3 es un receptor inhibidor del sistema inmunitario y usos del mismo.
CN114426582B (zh) * 2022-01-07 2022-11-25 陕西脉元生物科技有限公司 一种神经特异性烯醇化酶单克隆抗体及其制备方法和应用
CN116041526B (zh) * 2022-11-14 2023-09-29 华中农业大学 一种鼠抗草鱼IgT单克隆抗体及其制备方法和应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009003274A1 (en) * 2007-06-29 2009-01-08 The Hospital For Sick Children Susceptibility gene for inflammatory bowel disease

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU7847494A (en) 1993-10-01 1995-05-01 New York University Novel receptor-type phosphotyrosine phosphatase-sigma
AU2003252328A1 (en) 2002-08-01 2004-02-23 Ginkgo Biomedical Research Institute Co., Ltd. Method of detecting mouse interferon-producing cells
US7435590B2 (en) * 2003-03-14 2008-10-14 Taisho Pharmaceutical Co., Ltd. Monoclonal antibody and hybridoma producing the same
US8038996B2 (en) 2004-03-27 2011-10-18 University Of Arizona Composition and method for cancer treatment
US20080008719A1 (en) 2004-07-10 2008-01-10 Bowdish Katherine S Methods and compositions for the treatment of prostate cancer
EP1928916A2 (en) 2005-09-29 2008-06-11 Viral Logic Systems Technology Corp. Immunomodulatory compositions and uses therefor
US20110287034A1 (en) * 2008-11-14 2011-11-24 The Brigham And Womens Hospital, Inc. Therapeutic and diagnostic methods relating to cancer stem cells
US20120231014A1 (en) * 2009-08-18 2012-09-13 Case Western Reserve University Neural Regeneration
WO2011097327A2 (en) * 2010-02-02 2011-08-11 La Jolla Institute For Allergy & Immunology Compositions and methods of modulating receptor protein tyrosine phosphatases
WO2012148003A1 (en) * 2011-04-28 2012-11-01 Sbi Biotech Co., Ltd. ANTI-HUMAN RECEPTOR-TYPE PROTEIN TYROSINE PHOSPHATASE σ ANTIBODY

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009003274A1 (en) * 2007-06-29 2009-01-08 The Hospital For Sick Children Susceptibility gene for inflammatory bowel disease

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANN. NY ACAD. SCI., vol. Vol.1183, JPN6016005781, January 2010 (2010-01-01), pages 89 - 103 *
J. BIOL. CHEM., vol. 285, no. 18, JPN6016005775, 30 April 2010 (2010-04-30), pages 13966 - 13978 *
J. CELL BIOL., vol. 147, no. 2, JPN6016005779, 18 October 1999 (1999-10-18), pages 375 - 388 *
NATURE MED., vol. 12, no. 2, JPN6016005784, February 2006 (2006-02-01), pages 207 - 213 *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2016262677A1 (en) 2016-12-08
US20180155446A1 (en) 2018-06-07
JP6412072B2 (ja) 2018-10-24
AU2012248158C1 (en) 2017-02-02
EP2702412B1 (en) 2017-07-26
AU2016262677B2 (en) 2018-08-30
HUE054211T2 (hu) 2021-08-30
WO2012148003A1 (en) 2012-11-01
CN103703372B (zh) 2018-01-26
MX352599B (es) 2017-11-30
EP2702412A1 (en) 2014-03-05
JP6001557B2 (ja) 2016-10-05
IL229127A (en) 2017-11-30
MX2013012393A (es) 2014-04-30
US10730955B2 (en) 2020-08-04
RU2715642C2 (ru) 2020-03-02
IL229127A0 (en) 2013-12-31
RU2017118262A3 (ja) 2018-11-02
EP3232202B1 (en) 2020-02-19
AU2012248158A1 (en) 2014-01-30
AU2012248158B2 (en) 2016-09-08
PL2702412T3 (pl) 2018-01-31
HUE034752T2 (en) 2018-02-28
KR101873614B1 (ko) 2018-07-02
PT2702412T (pt) 2017-11-02
BR112013027631A2 (pt) 2022-01-04
ES2788183T3 (es) 2020-10-20
US9803026B2 (en) 2017-10-31
RU2017118262A (ru) 2018-11-02
SG10202108240VA (en) 2021-09-29
PL3232202T3 (pl) 2020-10-05
CA2834243C (en) 2019-08-27
ES2638088T3 (es) 2017-10-18
CA2834243A1 (en) 2012-11-01
PT3232202T (pt) 2020-05-22
KR20140033024A (ko) 2014-03-17
CN103703372A (zh) 2014-04-02
RU2013152816A (ru) 2015-06-10
US20140127223A1 (en) 2014-05-08
EP3232202A1 (en) 2017-10-18
SG194614A1 (en) 2013-12-30
JP2014524733A (ja) 2014-09-25
SG10201503257WA (en) 2015-06-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6412072B2 (ja) 抗ヒト受容体型プロテインチロシンホスファターゼσ抗体
JP5420688B2 (ja) 抗ｉｌｔ７抗体
JP7244102B2 (ja) 抗ホスホリパーゼｄ４抗体

Legal Events

Date Code Title Description
A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20170622

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20170817

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20180104

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20180302

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20180502

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20180907

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20180927

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6412072

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250