ES2635514T3 - Método para producir ADN de cadena sencilla - Google Patents

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Pasi Piiparinen
Anne Aittakorpi
Merja Lindfors
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Abstract

Un método para producir un ADN de cadena sencilla mediante amplificación simétrica de un ADN deseado usando al menos un par de cebadores específicos, constituido por un primer cebador no marcado y un segundo cebador no marcado, comprendiendo dicha amplificación las etapas de: a) llevar a cabo una primera etapa de PCR que comprende repetir las etapas de desnaturalización, hibridación de ambos cebadores, primero y segundo, y extensión de los mismos, b) llevar a cabo una segunda etapa de PCR que consiste en repetir las etapas de desnaturalización, hibridación y extensión, en donde la hibridación y la extensión se combinan y se llevan a cabo a una temperatura a la cual solo dicho segundo cebador se hibrida y extiende el ADN diana, en donde dicho primer cebador tiene una temperatura de fusión TmA y dicho segundo cebador tiene una temperatura de fusión TmB, y en donde las áreas de temperatura de hibridación de dicho primer cebador y dicho segundo cebador solapan parcialmente, y en donde la definición "no marcado" se refiere a cebadores que no comprenden ninguna secuencia de nucleótidos adicional en su extremo 5' o 3'.

Description

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DESCRIPCION
Metodo para producir ADN de cadena sencilla Campo de la invencion
La invencion se refiere a un metodo para producir moleculas de ADN de cadena sencilla, y a un kit para uso en dicho metodo.
Antecedentes de la invencion
Una reaccion en cadena de polimerasa (PCR, del ingles “polymerase chain reaction”) es un metodo bien establecido para amplificar secuencias de acido nucleico. Los protocolos de PCR usados mas habitualmente producen un acido desoxirribonucleico de cadena doble (dsADN), en el que las secuencias de dos cadenas son complementarias entre ellas. Sin embargo, en muchas aplicaciones de biologfa molecular y biotecnologfa se requiere la produccion de solo una cadena, es decir la preparacion de un ADN de cadena sencilla (ssADN), que incluye aquellas que emplean ssADN como sonda de hibridacion.
Se han descrito varias estrategias para producir ssADN. Una forma es separar las cadenas del dsADN amplificado mediante una desnaturalizacion prolongada, por ejemplo mediante calor o alcali. Las cadenas separadas pueden entonces mantenerse separadas enfriando rapidamente. Alternativamente, se puede eliminar selectivamente una cadena tras una reaccion de amplificacion usando, por ejemplo, digestion de exonucleasa en donde la cadena deseada es protegida de la actividad enzimatica de la exonucleasa (publicacion de patente de EE.UU. 5.518.900). La cadena deseada tambien puede ser capturada selectivamente en base a una modificacion de la cadena, tal como un cebador biotinilado usado en una pCr, en condiciones de desnaturalizacion (p.ej., publicacion de patente Europea EP0456304 y publicacion de patente de EE.UU. 5.817.797).
El ssADN tambien puede ser creado mediante una PCR asimetrica, en la que se usan dos cebadores a diferentes concentraciones. Dicho metodo se describe en la publicacion de patente de EE.UU. 5.066.584, en la que se produce un exceso de ssADN de modo lineal, una vez agotado el cebador que limita la velocidad del proceso, en la amplificacion exponencial del dsADN. La asimetffa alcanzada, y por tanto la cantidad de ssADN producido, es diffcil de predecir, especialmente cuando se usa una mezcla de cebadores degenerados competitivos. Otra forma de producir moleculas de acido nucleico de cadena sencilla es transcribir dsADN en ARN, que a continuacion puede ser amplificado a traves de etapas multiples en un cARN de cadena sencilla mediante un metodo isotermo de Amplificacion Basada en Secuencia de Acido Nucleico (NASBA) (publicacion de patente de EE.UU. 5.409.818).
La publicacion de patente de EE.UU. 6.887.664 describe un metodo de ciclado termico asmcrono para producir un exceso de ssADN. El metodo comprende la hibridacion de dos cebadores a dos temperaturas diferentes a la primera y segunda cadenas de un acido nucleico, cada hibridacion seguida de una extension. Una segunda temperatura de hibridacion es inferior a una primera temperatura de hibridacion. El ciclo de etapas puede repetirse durante de 2 a 50 ciclos o mas para producir dsADN. Las etapas de hibridacion y extension de un segundo cebador se pueden omitir en el ultimo o en mas ciclos para producir un exceso de ssADN. Cuando se usa para la produccion de ssADN, sin embargo, el metodo requiere de mucho tiempo. Esto es debido a las dos temperaturas de hibridacion diferentes para la produccion de dsADN antes de que la produccion de ssADN se pueda iniciar en los ultimos ciclos.
Mazars et al., NAR, 1991, 19: 4783 describe un metodo de amplificar ADN genomico en el que cebadores con diferentes temperaturas de fusion (Tm) son empleados en la misma concentracion. El ciclado se lleva a cabo en dos rondas en un unico recipiente. Los cebadores son espedficos de los exones 7 y 8 de p53 y del exon 1 de KRAS. La primera ronda de PCR conduce a la produccion de ADN de cadena doble, y el ADN de cadena sencilla se produce en la segunda ronda de PCR.
Zhu et al. (Antimicrob. Agents Chemother., 2007, 51: 3707-3713) describe un metodo de PCR asimetrica multiple de dos rondas para producir ssADN. En el metodo, se usan cebadores espedficos de secuencia, asf como cebadores marcados con una secuencia no relacionada universal en sus extremos 5' (cebadores UT). Los cebadores UT estan disenados de tal modo que se obtiene una diferencia de Tm de al menos 10°C en comparacion con los cebadores espedficos de secuencia. La reaccion de primera ronda produce ADN de cadena doble, mientras que la reaccion de segunda ronda produce ssADN ya que se emplea una temperatura de hibridacion mayor que permite que solo se hibriden los cebadores UT a la diana. En este metodo, el diseno de cebador es mas diffcil y restringido debido a que la secuencia universal afecta y crea, por ejemplo, estructuras secundarias. La etiqueta de secuencia no relacionada universal hace que los cebadores sean relativamente largos y, por tanto, prolonga el tiempo requerido para la amplificacion de ADN y aumenta los costes de smtesis.
En general, muchos de estos metodos comparten la desventaja de la necesidad de intervencion manual y de multiples etapas de procesado. Por tanto, existe una necesidad en la tecnica de un metodo fiable para producir ssADN.
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Breve descripcion de la invencion
La presente invencion proporciona un metodo para producir un ADN de cadena sencilla mediante amplificacion asimetrica de un ADN deseado usando al menos un pareja de cebadores espedficos de un primer cebador no marcado y un segundo cebado no marcado, en donde dicho primer cebador tiene una temperature de fusion TmA y dicho segundo cebador tiene una temperatura de fusion TmB, y en donde las areas de temperatura de hibridacion de dicho primer cebador y dicho segundo cebador estan parcialmente solapadas. En el metodo, dicha amplificacion de ADN comprende las etapas de a) llevar a cabo una primera etapa de PCR, que comprende etapas repetidas de desnaturalizacion, hibridacion y extension, y b) llevar a cabo una segunda etapa de PCR que consiste en etapas repetidas de desnaturalizacion, hibridacion y extension, en donde la hibridacion y la extension se combinan y se llevan a cabo a la misma temperatura. Ambos cebadores, primero y segundo, se hibridan y extienden a una diana a la temperatura de hibridacion de la primera etapa de PCR, mientras que solo dicho segundo cebador se hibrida y extiende a la diana a la temperatura de hibridacion de la segunda etapa de PCR.
En una realizacion, TmA es aproximadamente 8°C a aproximadamente 20°C menor que TmB. En otras realizaciones, TmA es aproximadamente 8°C a aproximadamente 16°C, aproximadamente 8°C a aproximadamente 12°C, o aproximadamente 8°C a aproximadamente 10°C menor que TmB. En una realizacion adicional, la hibridacion de la primera etapa de PCR se lleva a cabo a una temperatura TmA ± 8°C. En otra realizacion adicional, la hibridacion de la segunda etapa de PCR se lleva a cabo a una temperatura TmB ± 14°C.
Tanto el primer como el segundo cebador pueden consistir en una mezcla de cebadores degenerados, tales como cebadores que se hibridan con regiones conservadas de genes que codifican topoisomerasas gyrB/parE. En una realizacion, dicho primer cebador comprende al menos una secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 1 y/o dicho segundo cebador comprende al menos una secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 2. Algunas realizaciones de la presente invencion comprenden el uso de cebadores marcados en el metodo.
El metodo segun la presente invencion puede consistir en las etapas descritas anteriormente o puede comprender etapas adicionales. El metodo tambien puede usarse para amplificacion multiple de ADN, en donde se usa mas de un primer cebador y mas de un segundo cebador para amplificar multiples ADNs diana simultaneamente. En otras realizaciones, solo se usa un primer cebador y un segundo cebador.
La presente invencion proporciona ademas un kit, tal como se define en las reivindicaciones, para uso en el presente metodo. El kit comprende al menos un par de cebadores espedficos de un primer cebador no marcado que tiene una temperatura de fusion TmA y un segundo cebador no marcado que tiene una temperatura de fusion TmB, y en donde las areas de temperatura de hibridacion de dicho primer cebador y dicho segundo cebador solapan parcialmente, y en donde ambos cebadores, primero y segundo, se hibridan a y extienden una diana a una temperatura de hibridacion de una primera etapa de pCr, mientras que solo el segundo cebador se hibrida a y extiende la diana a una temperatura de hibridacion de una segunda etapa de PCR. En algunas realizaciones, el kit comprende solo un primer cebador y un segundo cebador.
Dichos primer y segundo cebadores pueden ser cada uno una mezcla de cebadores degenerados, tal como cebadores que se hibridan con regiones conservadas de genes que codifican topoisomerasas gyrB/parE. En una realizacion, dicho primer cebador comprende al menos una secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 1 y dicho segundo cebador comprende al menos una secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, los cebadores proporcionados en el kit son cebadores marcados.
Adicionalmente, una realizacion comprende dichos cebadores que estan contenidos en un compartimento separado de un biochip. En otra realizacion, dicho biochip comprende ademas un compartimento separado para sondas de oligonucleotidos unidas.
Descripcion breve de las figuras
A continuacion la invencion sera descrita en mayor detalle a traves de las realizaciones preferidas en referencia a las figuras anexas, en las que:
Figura 1: ilustra las areas de temperatura de hibridacion en las que pueden actuar el primer cebador y el segundo cebador como punto de partida para una extension en una PCR. TmA representa la temperatura de fusion del primer cebador y TmB representa la temperatura de fusion del segundo cebador. El eje X representa una temperatura de hibridacion (°C). La reaccion se convierte entonces para favorecer la produccion de ssADN a una temperatura de hibridacion a la que el primer cebador no se hibrida a la cadena diana pero el segundo cebador se hibrida de manera eficaz.
Figura 2: ilustra una comparacion entre una PCR asimetrica (Figuras 2B y 2D) y un metodo de ssADN de la presente invencion (Figuras 2A y 2C). Cada calle de la respectiva figura representa una muestra, con un marcador de peso molecular en la primera calle de la izquierda.
Figura 3: ilustra la hibridacion de un ssADN marcado, producido mediante el metodo segun la presente invencion, en un microsistema. Una muestra de paciente hibridada incluyo Pseudomonas aeruginosa como agente causante. El
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microsistema incluyo dos sondas espedficas de Pseudomonas aeruginosa (manchas con drculos) que se unieron espedficamente a las cadenas diana. Tambien fueron detectables dos oligonucleotidos de control positivo (manchas marcadas con triangulos).
Figura 4: ilustra la deteccion simultanea de S. aureus (mancha marcada con un triangulo) y gen mecA (manchas con drculos) en un microsistema. Las manchas de mecA del microsistema comprendfan dos oligos de mecA espedficos por mancha. Tambien se detectaron cuatro oligonucleotidos de control (manchas recuadradas).
Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion se refiere a un metodo nuevo para producir ADN de cadena sencilla en una reaccion de amplificacion de PCR simetrica. El metodo comprende dos etapas de PCR distintas: una primera etapa de PCR produce dsADN y una segunda etapa de PCR produce ssADN. El metodo no requiere implicacion manual, minimizando de este modo el riesgo de contaminacion y el tiempo de procesamiento. Tambien permite determinar la cantidad de ssADN producido. Ademas, el procedimiento completo puede llevarse a cabo de forma conveniente en una unica reaccion de amplificacion de PCR.
En este contexto, el termino “PCR simetrica” se refiere a una amplificacion de PCR en la que se emplean concentraciones iguales de los miembros de un par de cebadores. El termino “PCR asimetrica” se refiere a una amplificacion de PCR en la que los miembros de un par de cebadores se usan en concentraciones diferentes.
La presente invencion se basa en cebadores no marcados que se disenan de tal modo que el area de temperatura de hibridacion, en la que cual un primer cebador y un complejo ADN plantilla son suficientemente estables para permitir que una polimerasa extienda el cebador eficientemente, de un primer cebador solapa, siendo inferior, a la correspondiente temperatura de hibridacion de un segundo cebador, tal como se ilustra en la Figura 1. En otras palabras, las areas de las temperaturas de hibridacion de dicho primer cebador y dicho segundo cebador solapan parcialmente. La primera etapa de la reaccion se lleva a cabo a una temperatura de hibridacion optima para el primer cebador. En la segunda etapa, la temperatura de hibridacion aumenta hasta cerca de una temperatura de extension a la cual la polimerasa replica el ADN a una velocidad optima. La hibridacion y la extension se llevan a cabo a continuacion a la misma temperatura de modo combinado como una PCR de dos etapas. La temperatura de hibridacion de la segunda etapa no permite que el primer cebador se hibride. Los cebadores se pueden disenar de tal modo que las cualquiera de las cadenas de ADN pueda actuar como plantilla para la produccion de ssADN.
En este contexto, el termino “no marcado” se refiere a cebadores que no comprenden ninguna secuencia de nucleotidos adicional en sus extremos 5' o 3'. Sin embargo, dichos cebadores no marcados pueden comprender otras biomoleculas reactivas, tal como etiquetas o marcas, en su extremo 5' o 3' o hibridadas en su secuencia espedfica de diana.
En este contexto, el termino “cebador” se refiere a un oligonucleotido, preferiblemente de cadena sencilla, que tiene la capacidad de iniciar una smtesis de ADN en las condiciones apropiadas, que normalmente incluye nucleotidos y una polimerasa de ADN. La longitud adecuada para los cebadores es variable, normalmente oscilando entre 10 y 100 nucleotidos. En el contexto de la presente invencion, pueden actuar como cebadores analogos de oligonucleotidos, tales como acidos nucleicos peptfdicos (PNA), u oligonucleotidos que comprenden bases modificadas, y por tanto se incluyen en la definicion de cebador. Un cebador no necesita tener una secuencia exactamente igual a la del acido nucleico plantilla, pero debe ser suficientemente complementario para hibridarse con la plantilla. Adicionalmente, el termino “cebador” incluye mezclas de cebadores, tales como las mezclas de cebadores degenerados.
Una temperatura de fusion (Tm) de un cebador es la temperatura (en unas condiciones de fuerza ionica y pH definidas) a la cual estan presentes el 50% de los enlaces de hidrogeno entre pares de bases de una cadena de acido nucleico. Habitualmente, se lleva a cabo una etapa de hibridacion en la PCR aproximadamente 5°C por debajo de la Tm. Una temperatura de hibridacion demasiado baja solo produce una pequena cantidad del producto deseado. La Tm (°C) puede calcularse, por ejemplo, mediante la ecuacion: 81,5 + 16,6 log [Na+] + 0,41 (%GC) - 0,61 (%for) - 500/N, en la que [Na+] es la concentracion de cationes monovalentes, %GC es el porcentaje de guanina y citosina, %for es el porcentaje de formamida, y N es la longitud del oligonucleotido.
Un par de cebadores no marcados para uso en la presente invencion esta disenado para presentar una diferencia de aproximadamente 8°C a aproximadamente 20°C, preferiblemente de aproximadamente 8°C a aproximadamente 16°C, y mas preferiblemente de aproximadamente 8°C a aproximadamente 12°C, e incluso mas preferiblemente de aproximadamente 8°C a aproximadamente 10°C entre las temperaturas de fusion (Tm) del primer cebador y del segundo cebador. La Tm del primer cebador (TmA) es inferior a la Tm del segundo cebador (TmB). Se pueden disenar multiples pares de cebadores no marcados para ser usados simultaneamente en el metodo de la presente invencion.
En la primera etapa de la PCR del metodo segun la presente invencion, se produce dsADN mediante PCR simetrica segun protocolos conocidos en la tecnica. Esta reaccion comprende la repeticion de etapas de desnaturalizacion, hibridacion y extension. Opcionalmente, la primera etapa de la PCR puede comprender ademas una parte de PCR de anotacion en la que la temperatura de hibridacion es disminuida despues de cada ciclo, por ejemplo en 1°C.
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Tfpicamente, la primera etapa de la reaccion de amplificacion de PCR del metodo comprende aproximadamente 30 ciclos de amplificacion. El numero de ciclos puede variar desde aproximadamente 10 a aproximadamente 50.
Tras un numero apropiado de ciclos de amplificacion en la primera etapa, la reaccion de amplificacion se convierte para favorecer la produccion de ssADN a partir de una cadena de ADN, es decir una cadena diana, de la plantilla. Esto se logra usando una PCR de dos etapas con una temperatura de hibridacion suficientemente alta (de aproximadamente 63°C a aproximadamente 73°C) para permitir que solo se una a la cadena diana el segundo cebador y para permitir que se produzcan la hibridacion y la extension de forma combinada a la misma temperatura. Como la Tm del primer cebador es inferior a la Tm del segundo cebador, la alta temperatura de hibridacion usada en la segunda etapa favorece la hibridacion del segundo cebador y la posterior amplificacion de ssADN a partir de la cadena diana. En otras palabras, el segundo cebador tiene una Tm que permite la hibridacion dentro de un amplio rango de temperaturas y, de esta manera, permite primero la produccion de dsADN a una temperatura de hibridacion menor y despues la produccion de ssADN a una temperatura de hibridacion mayor. Si es necesario, tambien es posible llevar a cabo una etapa de desnaturalizacion adicional tras la PCR.
En una realizacion del metodo, la temperatura de hibridacion de la primera etapa puede definirse como TmA ± 8°C y preferiblemente como TmA ± 6°C, y la segunda etapa como TmB ± 14°C y preferiblemente como TmB ± 12°C, aunque manteniendo la diferencia de aproximadamente 8°C a aproximadamente 20°C entre las temperaturas de fusion de los cebadores y las condiciones a las que el primer cebador no se hibrida a la segunda temperatura de hibridacion.
Los cebadores pueden incorporar caractensticas adicionales en un ADN amplificado que permitan que el ADN sea detectado o inmovilizado, pero que no afecte a la propiedad basica del cebador, es decir, una capacidad de amplificacion de ADN. Se puede usar una serie de metodos de marcado conocidos basados en un cebador marcado, o se pueden usar nucleotidos para producir un ADN marcado para uso en la presente invencion. Los ejemplos de metodos de marcado adecuados incluyen marcas fluorescentes {p.ej., Cy5, Cy3, Cy2, rojo Texas, FITC, Alexa 488, TMR, FluorX, ROX, TET o HEX), marcas radiactivas (p.ej., 32P, 33P o 33S), marcas quimioluminiscentes (p.ej., HiLight Single-Color Kit), y deteccion colorimetrica (p.ej., basada en marcaje de biotina y deteccion de conjugado de biotina-estreptavidina-enzima).
El ADN a amplificar puede obtenerse a partir de varias fuentes y de muestras que se sospechen que contienen acidos nucleicos. Estas incluyen fluidos corporales, tales como sangre entera, saliva, esputos, orina, fluidos fecales, peritoneales y pleurales, muestras de tejido, cultivos celulares o microbianos, muestras medioambientales, y muestras de comida o pienso. Los metodos apropiados para extraer o aislar ADN de dichas muestras se encuentran facilmente disponibles en la tecnica.
En el metodo de la presente invencion, los reactivos usados en la amplificacion de ADN mediante PCR pueden ser cualesquier reactivos que se usen convencionalmente para la amplificacion de ADN y que son bien conocidos por los especialistas en la tecnica. Los reactivos adecuados y de precio competitivo que se encuentran disponibles comercial incluyen diferentes tipos de ADN polimerasas y tampones de las mismas (p.ej., AmpliTaq GOLD™, AmpliTaq® LD, DyNAzyme™, TaqPlus® Precision, o HotStart-Taq®), nucleotidos o mezclas de nucleotidos pre- preparadas (p.ej., Sigma, Applied Biosystems o Amersham Biosystems), y MgCh (por el que se usa generalmente un producto del fabricante de la ADN polimerasa). Preferiblemente, la ADN polimerasa usada es HotStartTaq® (Qiagen).
El equipamiento usado para la amplificacion puede ser cualquier dispositivo adecuado (p.ej., Termociclador Biometra® T1, Applied Biosystems GenAmp® PCR system 2700, o Eppendorf Mastercycler®). Practicamente, se pueden usar todos los dispositivos y equipamiento adecuados para la amplificacion de ADN, y la amplificacion tambien puede realizarse manualmente transfiriendo tubos de reaccion de una temperatura a otra. Adicionalmente, la amplificacion se puede llevar a cabo directamente sobre un biochip que comprende pocillos espedficos para la PCR, y un area de hibridacion espedfica, tal como un microsistema, sobre la cual se pueden unir las sondas y los oligonucleotidos de control.
El presente metodo puede usarse para producir ssADN para varios propositos, tales como ensayos basados en hibridacion de diferente tipo, o secuenciamiento. Por ejemplo, ademas de producir dianas marcadas para microsistemas, mediante el metodo de la presente invencion se podnan producir sondas de microsistema de mayor longitud (>75 a 100 nucleotidos), que no pueden sintetizarse de forma optima mediante los actuales metodos de smtesis de oligonucleotidos.
Adicionalmente, la presente invencion proporciona un kit, tal como se define en las reivindicaciones, para uso en el metodo segun la presente invencion. El kit comprende un primer cebador no marcado y un segundo cebador no marcado, descrito en mas detalle mas adelante, en donde dicho primer cebador tiene una temperatura de fusion TmA y dicho segundo cebador tiene una temperatura de fusion TmB, y donde las areas de temperatura de hibridacion de dicho primer cebador y dicho segundo cebador solapan parcialmente. El kit puede comprender ademas algunos o todos los reactivos necesarios, tal como tampones, nucleotidos, controles, MgCh, y una polimerasa para la reaccion de amplificacion. Ademas, el kit puede comprender uno o mas cebadores adicionales, siendo por tanto adecuado para PCR multiples.
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En una realizacion, el kit puede comprender ademas un dispositivo en el que se lleva a cabo la amplificacion de ADN. Dichos dispositivos incluyen incubadoras, termocicladores y biochips de diferente tipo.
Ejemplo 1. Amplificacion de ADN de cadena sencilla
Se extrajo ADN de una muestra de un paciente clmico que se sospechaba que tema una infeccion bacteriana usando un robot de extraccion de acido nucleico (Nuclisens® easyMAG™, bioMerieux, Francia). Tras la extraccion de ADN, se amplifico la diana deseada mediante PCR. En primer lugar, una mezcla de reaccion que contema tampon de PCR IxHot Start Taq® (Qiagen, Alemania), a la que se anadio MgCh de tal modo que la concentracion final fue de 2,0 mM, 300 pM de cada uno de dATP, dGTP, dCTP y dTTP (Finnzymes, Finlandia), 1,5 g/L de BSA (EuroClone, Italia), y se preparo 0,125 U/pL de ADN polimerasa Hot Start Taq® (Qiagen, Alemania). Mezclas de cebadores de amplio rango (Tabla 1) que procedfan de regiones conservadas de genes que codifican genes de topoisomerasa gyrB y parE y que amplifican eficazmente ADN de diferentes bacterias, fueron anadidas a la mezcla de tal modo que la concentracion final de ambas mezclas de cebadores gB3F y gB4R marcado con Cy5 (pedidas en Thermo Electron, EE.UU.) fueron 1 pM. Finalmente, se anadio 1,5 pL de un ADN aislado y el volumen total se llevo a 15 pL.
Tabla 1. Cebadores usados en la reaccion de amplificacion.
Nombre del cebador
Gen amplificado Tm (°C). Media Secuencia 5'->3'
gB3F
gyrB 57,8 CGICCIGGKATGTAYATHGG (SEQ ID NO: 1)
Cy5-gB4R
gyrB 69,0 RMICCWACICCRTGYAGICCICC (SEQ ID NO: 2)
En las secuencias de los cebadores, I representa una base inosina; K representa una base G o T; Y representa una base C o T; H representa una base A o C o T; R representa una base A o G; M representa una base A o C; y W representa una base A o T.
En los calculos de Tm, se aplico un programa de analisis proporcionado por “Integrated DNA Technologies” usando una concentracion de Na+ de 50 mM y una concentracion de oligo de 0,25 pM. Se disenaron los cebadores de tal modo que un cebador Cy5-gB4R tema una Tm mayor y por tanto produjo ssADN en la reaccion. La diferencia entre la Tm media de los cebadores fue de 11,2°C.
La PCR se llevo a cabo usando un termociclador (Eppendorf, Alemania). La primera etapa de la PCR se inicio con una etapa de desnaturalizacion de 15 minutos a 95°C. Esta vino seguida de 36 ciclos de 10 segundos a 96°C, 20 segundos a 52°C y 5 segundos a 72°C para producir dsADN. A continuacion, se llevo a cabo la segunda etapa de la PCR usando 10 ciclos de 10 segundos a 95°C y 30 segundos a 67°C. Los productos de amplificacion fueron analizados mediante electroforesis de gel de agarosa usando SYBR® Green II (Invitrogen, EE.UU.) para demostrar la amplificacion de ssADN bacteriano.
Ejemplo 2. Comparacion entre el metodo de la presente invencion y la PCR asimetrica
Un objetivo de este experimento fue comparar el metodo de la presente invencion con una PCR asimetrica.
Se aislo un ADN bacteriano a partir de diferentes elementos aislados de cultivo bacteriano, que conteman Staphylococcus aureus, S. epidermis, S. haemolyticus, S. lugdunesis, Enterococcus faecium, E. faecalis, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae y Listeria monocytogenes como agentes causantes, usando los metodos descritos en el Ejemplo 1. Se aplico la siguiente mezcla de reaccion a una PCR asimetrica (principio descrito en la publicacion de patente de EE.UU. 5.066.584): 0,15 pM o 0,495 pM de mezcla de cebadores gB3F (Thermo Electron, EE.UU.), 0,6 pM o 1,98 pM de mezcla de cebadores gB4R marcados con Cy5 (Thermo Electron, EE.UU.), tampon de PCR 1xHot Start Taq® (Qiagen, Alemania), al que se anadio MgCh de tal modo que la concentracion final fue de 2,0 mM, 300 pM de cada uno de dATP, dGTP, dCTP y dTTP (Finnzymes, Finlandia), 1,5 g/L de BSA (EuroClone, Italia), 0,125 U/pL de ADN polimerasa Hot Start Taq® (Qiagen, Alemania), y 1,5 pL de ADN aislado en un volumen total de 15 pL. Se uso el siguiente programa de PCR: una etapa de desnaturalizacion de 15 minutos a 95°C, 36 ciclos de 20 segundos a 95°C, 35 segundos a 52°C, y 20 segundos a 72°C.
Al metodo de la presente invencion, se aplico la siguiente mezcla: 0,6 pM o 1,98 pM de mezcla de cebadores gB3F (Thermo Electron, EE.UU.), 0,6 pM o 1,98 pM de mezcla de cebadores gB4R marcados con Cy5 (Thermo Electron, EE.UU.), tampon de PCR 1xHot Start Taq® (Qiagen, Alemania), al que se anadio MgCh de tal modo que la concentracion final fue de 2,0 mM, 300 pM de cada uno de dATP, dGTP, dCTP y dTTP (Finnzymes, Finlandia), 1,5 g/L de BSA (EuroClone, Italia), 0,125 U/pL de ADN polimerasa Hot Start Taq® (Qiagen, Alemania), y 1,5 pL de ADN aislado en un volumen total de 15 pL. La PCR se llevo a cabo usando el termociclador (Eppendorf, Alemania). Se inicio un programa de PCR con una etapa de desnaturalizacion de 15 minutos a 95°C. A esta le siguieron 36 ciclos de 20 segundos a 95°C, 35 segundos a 52°C, y 20 segundos a 72°C para producir dsADN (primera etapa de la PCR). A continuacion, 10 ciclos de 10 segundos a 95°C y 30 segundos a 67°C, y finalmente 5 ciclos de 10 segundos a 95°C y 30 segundos a 69°C produjeron ssADN (segunda etapa de la PCR).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Tras la PCR, el exito de la amplificacion de ssADN fue verificado mediante electroforesis de gel usando un gel de agarosa que contema SYBR® Green II (Invitrogen, EE.UU.). La Figura 2 demuestra que tanto en concentraciones bajas (Figuras 2A y 2B) como altas (Figuras 2C y 2D) de cebador, la produccion de ssADN y la de dsADN es mas efectiva mediante el metodo de la presente invencion (Figuras 2A y 2C) que mediante una pCr asimetrica (Figuras 2B y 2D).
Ejemplo 3: Hibridacion de ADN de cadena sencilla marcado en un microsistema
Se amplifico ADN, ex^do de una muestra de cultivo de sangre positiva de un paciente de sepsis, tal y como se ha descrito en el Ejemplo 2 usando mezclas de cebadores 1 pM. La hibridacion del ADN amplificado se llevo a cabo sobre un biochip que contiene un area de hibridacion espedfica, un microsistema, sobre el que se unieron sondas espedficas de diferentes bacterias diana. Las sondas espedficas de especie utiles se describen, por ejemplo, en la publicacion de patente internacional WO2004046379.
La mezcla de reaccion de hibridacion contema aproximadamente de 50 a 100 ng de diana marcada, 2xtampon de hibridacion (que consistfa en 1 comprimido de PBS pH 7,4 (Sigma, EE.UU.), NaCl 0,7 M (Fluka, Suiza), 0,1% de Tween® 20 (100%, Fluka, Suiza), 2xdisolucion de Denhardt (5x, Sigma, EE.UU.), 20 pg/mL de ADN de esperma de salmon (dsADN) (Amersham, Reino Unido)), oligonucleotidos de control de hibridacion, y agua esterilizada. El volumen de la mezcla de reaccion fue de 25 pL. Se precalento 2xtampon de hibridacion a 55°C antes del uso. La mezcla de reaccion de hibridacion se transfirio a un area de hibridacion del biochip. El area de hibridacion se sello con pinzas y el biochip se coloco en un dispositivo de hibridacion especial. Durante 10 minutos de hibridacion a 55°C, una diana de ssADN marcado con Cy5 se unio a la secuencia de sonda complementaria inmovilizada sobre el microsistema, creando una estructura de cadena doble marcada.
Tras la etapa de hibridacion, el biochip se lavo brevemente a fin de eliminar un ADN no hibridado. Las etapas de lavado se llevaron a cabo como se indica a continuacion: en 2xdisolucion SSC durante 1 minuto a 40°C, y en 0,2xdisolucion SSC durante 1 minuto a 40°C. Tras el lavado, el biochip se seco. El biochip se analizo con un lector optico, que consistio en una fuente de luz LED y una camara CCD. La deteccion se basa en una senal fluorescente liberada por el ssADN marcado con Cy5 y capturada por la camara.
Un ejemplo del resultado de la hibridacion se presenta en la Figura 3. Se detecto Pseudomonas aeruginosa en la muestra. La identificacion estaba en lmea con el resultado del cultivo de sangre. Por tanto, el ssADN producido mediante el metodo de la presente invencion es claramente adecuado para aplicaciones de biologfa molecular.
Ejemplo 4. Deteccion de Staphylococcus aureus y gen mecA
El ADN extrafdo de un elemento aislado de cultivo bacteriano derivado de un paciente de Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) fue amplificado usando el metodo descrito a continuacion.
Se aislo ADN de la muestra para ser analizado usando un robot de extraccion de acido nucleico (Nuclisens® easyMAG™, bioMerieux, Francia). Tras aislamiento del ADN, la diana deseada se amplifico usando PCR. En primer lugar, se preparo una disolucion de reaccion. La mezcla de reaccion de PCR contema 1 pM de mezcla de cebadores gB3F (SEQ ID NO: 1; pedida a Thermo Electron, EE.UU.), 1 pM de mezcla de cebadores gB4R marcados con Cy5 (SEQ ID NO: 2; pedida a Thermo Electron, EE.UU.), 0,25 pM de cebador directo de mecA (SEQ ID NO: 3), 0,25 pM de cebador inverso de mecA marcado con Cy5 (SEQ ID NO: 4), 0,165 pM de cebador de topoisomerasa espedfica de S. aureus (SEQ ID NO: 5), tampon de PCR 1xHot Start Taq® (Qiagen, Alemania), al que se anadio MgCh de tal modo que la concentracion final fue de 2,0 mM, 300 pM de cada uno de dATP, dGTP, dCTP y dTTP (Finnzymes, Finlandia), 1,5 g/L de BSA (EuroClone, Italia), 0,125 U/pL de ADN polimerasa Hot Start Taq® (Qiagen, Alemania), y 1,5 pL de ADN aislado en un volumen total de 15 pL.
Las Tm de las mezclas de cebadores gB3F y Cy5-gB4R se presentan en el Ejemplo 1. El cebador directo de mecA (SEQ ID NO: 3) se diseno para tener una Tm de 48,5 °C, mientras que el cebador inverso Cy5-mecA (SEQ ID NO: 4) se diseno para tener una Tm de 56,5°C. La diferencia entre las Tm de los cebadores de mecA fue de 8°c.
Se llevo a cabo la PCR en un termociclador (Mastercycler®, Eppendorf, Alemania). Se uso el siguiente programa de PCR: una etapa de desnaturalizacion de 15 minutos a 95°C, 36 ciclos de 20 segundos a 95°C, 35 segundos a 52°C, 20 segundos a 72°C, tras lo cual se realizaron 10 ciclos de 10 segundos a 95°C, 30 segundos a 67°C, y finalmente 5 ciclos de 10 segundos a 95°C, 30 segundos a 69°C. Despues de la PCR, el exito de la amplificacion de ADN se verifico mediante electroforesis de gel usando un gel de agarosa al 2% que contema SYBR® Green II (Invitrogen, EE.UU.).
Se unieron sondas de topoisomerasa espedficas de S. aureus y sondas espedficas de mecA a un biochip de base silicio, y los ssADNs diana amplificados fueron hibridadas con ellas. La mezcla de reaccion de hibridacion contema aproximadamente de 50 a 100 ng de diana marcada, 2x tampon de hibridacion (que consistfa en 1 comprimido de PBS a pH 7,4 (Sigma, EE.UU.), NaCl 0,7 M (Fluka, Suiza), 0,1% de Tween® 20 (100%, Fluka, Suiza), 2x disolucion de Denhardt (5x, Sigma, EE.UU.), 20 pg/mL de ADN de esperma de salmon (dsADN) (Amersham, Reino Unido)), oligonucleotidos de control de la hibridacion, y agua esterilizada. El volumen de la mezcla de reaccion fue de 25 pL. El 2x tampon de hibridacion se pre-calento a 55°C antes de ser usado. La mezcla de reaccion de hibridacion se
transfirio a un area de hibridacion del biochip. El area de hibridacion se sello con pinzas y el biochip se coloco en un dispositivo especial de hibridacion. Durante 10 minutos de hibridacion a 55°C, una diana de ssADN marcada con Cy5 se unio a la secuencia de sonda complementaria inmovilizada sobre el microsistema, creando una estructura de cadena doble marcada.
5 Tras la etapa de hibridacion, el biochip fue lavado brevemente a fin de eliminar el ADN no hibridado. Las etapas de lavado se llevaron a cabo como se indica a continuacion: en 2x disolucion SSC durante 2,5 minutos a 40°C, y en 0,2x disolucion SSC durante 2,5 minutos a 40°C. Tras el lavado, el biochip fue secado. El biochip se analizo con un lector optico, que consistfa en una fuente de luz LED y una camara CCD. La deteccion se basa en una senal fluorescente liberada por el producto genico marcado con Cy5 y capturada por la camara. En la Figura 4 se presenta
10 un ejemplo del resultado de la hibridacion, que ilustra la deteccion de un gen de S. aureus y mecA. No se observo hibridacion con una sonda espedfica del genero Staphylococcus, lo que implica que el paciente presentaba una infeccion de MRSA. La identificacion estuvo en lmea con el resultado de un cultivo de sangre. De esta manera, los resultados demuestran una produccion eficiente y espedfica de ssADN mediante el metodo segun la presente invencion.
15 Para el especialista en la tecnica sera evidente que segun avance la tecnologfa, el concepto inventivo puede implementarse en diferentes formas. La invencion y sus realizaciones no se limitan a los ejemplos descritos anteriormente, sino que pueden variar dentro del alcance de las reivindicaciones.

Claims (15)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo para producir un ADN de cadena sencilla mediante amplificacion simetrica de un ADN deseado usando al menos un par de cebadores espedficos, constituido por un primer cebador no marcado y un segundo cebador no marcado, comprendiendo dicha amplificacion las etapas de:
    a) llevar a cabo una primera etapa de PCR que comprende repetir las etapas de desnaturalizacion, hibridacion de ambos cebadores, primero y segundo, y extension de los mismos,
    b) llevar a cabo una segunda etapa de PCR que consiste en repetir las etapas de desnaturalizacion, hibridacion y extension, en donde la hibridacion y la extension se combinan y se llevan a cabo a una temperatura a la cual solo dicho segundo cebador se hibrida y extiende el ADN diana,
    en donde dicho primer cebador tiene una temperatura de fusion TmA y dicho segundo cebador tiene una temperatura de fusion TmB, y en donde las areas de temperatura de hibridacion de dicho primer cebador y dicho segundo cebador solapan parcialmente, y
    en donde la definicion “no marcado” se refiere a cebadores que no comprenden ninguna secuencia de nucleotidos adicional en su extremo 5' o 3'.
  2. 2. El metodo segun la reivindicacion 1, en donde TmA es de aproximadamente 8°C a aproximadamente 20°C inferior a TmB.
  3. 3. El metodo segun la reivindicacion 1, en donde en la etapa a) dicha hibridacion se lleva a cabo a una temperatura de TmA ± 8°C.
  4. 4. El metodo segun la reivindicacion 1, en donde en la etapa b) dicha hibridacion se lleva a cabo a una temperatura de TmB ± 14°C.
  5. 5. El metodo segun cualquier reivindicacion precedente, en donde tanto el primer cebador como el segundo cebador consisten en una mezcla de cebadores degenerados.
  6. 6. El metodo segun cualquier reivindicacion precedente, en donde dicho primer cebador y dicho segundo cebador se hibridan con regiones conservadas de genes que codifican topoisomerasas gyrB y parE.
  7. 7. El metodo segun la reivindicacion 6, en donde dicho primer cebador comprende una secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 1 y dicho segundo cebador comprende una secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 2; o dicho primer cebador comprende una secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 3 y dicho segundo cebador comprende una secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 4.
  8. 8. El metodo segun cualquier reivindicacion precedente, en donde dichos cebadores estan marcados.
  9. 9. Un kit para producir un ADN de cadena sencilla mediante el metodo segun la reivindicacion 1, que comprende al menos un par de cebadores espedfico, constituido por un primer cebador no marcado que tiene una temperatura de fusion TmA y un segundo cebador no marcado que tiene una temperatura de fusion TmB, y
    en donde las areas de temperatura de hibridacion de dicho primer cebador y dicho segundo cebador solapan parcialmente, y en donde tanto el primer cebador como el segundo cebador se hibridan y extienden una diana a una temperatura de hibridacion de una primera etapa de PCR, mientras que solo dicho segundo cebador se hibrida y extiende la diana a una temperatura de hibridacion de una segunda etapa de PCR, y
    en donde la definicion “no marcado” se refiere a cebadores que no comprenden ninguna secuencia de nucleotidos adicional en su extremo 5' o 3', y
    en donde dicho primer cebador del al menos un par de cebadores comprende una secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 1 y dicho segundo cebador del al menos un par de cebadores comprende una secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 2; o
    dicho primer cebador del al menos un par de cebadores comprende una secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 3 y dicho segundo cebador del al menos un par de cebadores comprende una secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 4.
  10. 10. El kit segun la reivindicacion 9, en donde TmA es de aproximadamente 8°C a aproximadamente 20°C inferior a
    TmB.
  11. 11. El kit segun la reivindicacion 9, en donde TmA es de aproximadamente 8°C a aproximadamente 10°C inferior a
    TmB.
  12. 12. El kit segun una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en donde tanto el primer cebador como el segundo cebador consiste en una mezcla de cebadores.
  13. 13. El kit segun una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en donde dicho primer cebador y dicho segundo cebador se hibridan con regiones conservadas de genes que codifican topoisomerasas gyrB y parE.
  14. 14. El kit segun una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, en donde dichos cebadores estan contenidos en un compartimento separado de un biochip.
    5 15. El kit segun la reivindicacion 14, en donde dicho biochip comprende ademas un compartimento separado para
    las sondas de oligonucleotidos unidas.
  15. 16. El uso de un kit para producir un ADN de cadena sencilla mediante el metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dicho kit comprende al menos un par de cebadores espedfico, constituido por un primer cebador no marcado que tiene una temperatura de fusion TmA y un segundo cebador no marcado que tiene 10 una temperatura de fusion TmB, y
    en donde las areas de temperatura de hibridacion de dicho primer cebador y dicho segundo cebador solapan parcialmente, y en donde tanto el primer cebador como el segundo cebador se hibridan y extienden una diana a una temperatura de hibridacion de una primera etapa de PCR, mientras que solo dicho segundo cebador se hibrida y extiende la diana a una temperatura de hibridacion de una segunda etapa de PCR, y
    15 en donde la definicion “no marcado” se refiere a cebadores que no comprenden ninguna secuencia de
    nucleotidos adicional en su extremo 5' o 3'.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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US6887664B2 (en) * 2000-06-06 2005-05-03 Applera Corporation Asynchronous primed PCR
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US20040235032A1 (en) * 2003-05-19 2004-11-25 Canon Kabushiki Kaisha PCR amplification method, PCR primer set, PCR amplification product, and method for detection of nucleic acid using the amplification method

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