ES2632054T3 - Dispositivo para controlar la activación de una sustancia fotosensibilizante en un tejido biológico - Google Patents

Abstract

Dispositivo para controlar la activación de una sustancia fotosensibilizante introducida previamente en un tejido biológico (3), siendo seleccionada la sustancia fotosensibilizante entre las porfirinas y las clorinas, comprendiendo el dispositivo: - medios de exposición (2) capaces de permitir una exposición de dicha sustancia fotosensibilizante a una radiación electromagnética de activación (10) de manera que la active, cuyos medios de exposición comprenden una fuente luminosa de activación (2) capaz de producir impulsos de luz (10) en función de una señal de control (9), y - medios de adquisición (4) capaces de producir una información de luminiscencia (11, 12) procedente de dicha sustancia fotosensibilizante, estando caracterizado el dispositivo porque comprende, además; - medios electrónicos y de cálculo capaces de controlar los medios de exposición (2) de manera que permitan un ajuste de la exposición de la sustancia fotosensibilizante a la radiación electromagnética de activación (10) para que dicha información de luminiscencia (11, 12) siga una evolución temporal correspondiente a una consigna temporal predeterminada (5), utilizando los medios electrónicos y de cálculo un bucle de retroalimentación (1) que comprende: - un observador de luminiscencia (14) que utiliza de entrada al menos una medida de luminiscencia (12) y una señal de control (9) de la fuente luminosa de activación (2), y que produce de salida una estimación de la luminiscencia (15), - medios (6) para efectuar una comparación de la estimación de la luminiscencia (15) procedente del observador de luminiscencia (14) con la consigna temporal (5) de tal manera que se genere una señal de error (7), - un corrector (8) capaz de generar dicha señal de control (9) de la fuente luminosa de activación (2) utilizando la señal de error (7).

Description

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DESCRIPCION

Dispositivo para controlar la activacion de una sustancia fotosensibilizante en un tejido biologico Campo tecnico

La presente invencion se refiere a un dispositivo para controlar la activacion de una sustancia fotosensibilizante en un tejido biologico.

El campo de la invencion es mas particularmente, pero de manera no limitativa, el de las terapias fotodinamicas, en particular para el tratamiento de las celulas cancerosas.

Estado de la tecnica anterior

Las terapias fotodinamicas (PDT) son tecnicas utilizadas para tratar los tejidos biologicos y eliminar selectivamente celulas. Se utilizan especialmente para tratar lesiones cancerosas y precancerosas, en particular de la piel. Se utilizan tambien para tratar otras afecciones tales como el acne qmstico, las queratosis actmicas, las manchas de pigmentacion, la degeneracion macular relacionada con la edad, las rugosidades, los vasos dilatados, la psoriasis, o para tratamientos anti-infecciosos, de pequenas arrugas o en la depilacion.

El principio de las terapias fotodinamicas es el siguiente:

- en un primer tiempo, se introduce un producto fotosensibilizante (PS) en los tejidos biologicos;

- al ser variable la velocidad de eliminacion del producto fotosensibilizante en funcion de la naturaleza de las celulas y de su entorno (vascularizacion, ...), despues de un cierto tiempo el producto que queda en el tejido biologico se concentra esencialmente alrededor de las celulas diana (por ejemplo, en el tumor);

- el tejido biologico y el producto fotosensibilizante se iluminan entonces con una luz de una longitud de onda apropiada;

- el producto esta disenado de manera que bajo el efecto de la iluminacion se "active" y genere especies reactivas del oxfgeno, tales como el oxfgeno singlete, a dosis alta;

- estas especies reactivas del oxfgeno tienen por efecto destruir o degradar las moleculas cercanas. Asf, si el producto se concentra mas espedficamente en ciertas zonas del tejido biologico, estas zonas son danadas o destruidas selectivamente.

Los productos fotosensibilizantes utilizados pueden ser, por ejemplo, compuestos de la familia de las porfirinas o de las clorinas.

Las aplicaciones de la terapia fotodinamica se refieren en particular a las afecciones y a los canceres de la piel, o a los tratamientos de la degeneracion macular asociada a la edad. En este caso, los tejidos son facilmente accesibles para la iluminacion.

La tecnica se puede utilizar tambien para el tratamiento de tumores intersticiales, es decir, en los tejidos. En este caso, la iluminacion se puede efectuar por medio de fibras opticas introducidas en los tejidos.

Un inconveniente importante de las terapias fotodinamicas, que limita su desarrollo para aplicaciones clmicas, es su baja reproducibilidad in vivo. En efecto, el comportamiento y la respuesta de los tejidos al tratamiento vanan mucho de un sujeto a otro, lo que supone una gran incertidumbre y una gran variabilidad de las respuestas terapeuticas.

De manera habitual, los tratamientos consisten en iluminar la zona a tratar durante un tiempo predeterminado, segun una o varias secuencias. No hay por lo tanto control de la eficacia a lo largo del tratamiento.

Las aplicaciones clmicas actuales de la terapia fotodinamica se basan en un modelo macroscopico estatico simplificado del fenomeno fotoffsico inherente para determinar la concentracion de producto fotosensibilizante necesario y de la iluminacion energetica o irradiancia a aplicar:

[R] = ksb£(pxAT[S0\<t>f,

(Ecuacion 1)

donde [R] es una concentracion de especies reactivas del oxfgeno que, si estan situadas en una region sensible de las celulas cancerosas, desencadenan una cascada de reacciones que conducen a la muerte de la celula. $Aa significa la irradiancia o la potencia luminosa por unidad de superficie recibida por la superficie del tejido a tratar y Aa corresponde a una longitud de onda de absorcion del producto fotosensibilizante. T es el tiempo de exposicion a la luz y [So] es la concentracion intracelular de agente fotosensibilizante. ks es el coeficiente de retrodifusion del tejido, b es un rendimiento de conversion, £ es el coeficiente de extincion del agente fotosensibilizante y O es un rendimiento cuantico de conversion del medicamento en radicales oxidantes. f significa la fraccion de especies

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reactivas del ox^geno generadas que atacan las dianas sensibles de las celulas, mientras que la otra fraccion (1 - f) no causa mas que efectos menores.

A pesar de su utilizacion actual en las aplicaciones clmicas, este modelo esta sujeto a varias controversias:

- la Ecuacion 1 muestra una simple reciprocidad entre la concentracion del agente fotosensibilizante y la luz, mientras que varios experimented han demostrado resultados contradictorios;

- el rendimiento cuantico O es en realidad una funcion del nivel de oxigenacion del tumor. Este ultimo es a menudo variable en el tiempo y es diffcil de medir durante el tratamiento;

- los sitios intracelulares danados por la terapia fotodinamica (PDT) dependen en gran medida de la localizacion del producto fotosensibilizante (PS) en las celulas. Los sitios de accion de la terapia fotodinamica son principalmente las mitocondrias, el retteulo endoplasmico, el aparato de Golgi, los lisosomas y los lfpidos membranales. Durante la terapia fotodinamica se puede producir una relocalizacion del producto fotosensibilizante. Algunos sitios son mas cnticos que otros, pero este factor no se tiene en cuenta en la Ecuacion 1;

- varias cantidades implicadas en esta ecuacion son en realidad variables con el tiempo. En particular, se ha demostrado que una reduccion de la concentracion del producto fotosensibilizante durante el tratamiento era un factor no despreciable, pero ausente de esta formula. De manera mas general, la Ecuacion 1 no es mas que una descripcion estatica del proceso dinamico de la terapia fotodinamica.

Es necesario, por lo tanto, poner a punto los metodos de dosimetna para mejorar la reproducibilidad de las respuestas terapeuticas de la terapia fotodinamica. Un metodo de dosimetna de este tipo debe permitir determinar la dosificacion de los factores incidentes (tales como la concentracion local de producto fotosensibilizante, la densidad de los fotones enviados, el tiempo de iluminacion, el intervalo entre la administracion del producto y las fases de iluminacion), para obtener un efecto deseado (por ejemplo, la destruccion selectiva de ciertas celulas).

La determinacion de un metodo de dosimetna preciso constituye una via de investigacion primordial. Existen varias clases de dosimetna potencialmente utilizables en la terapia fotodinamica, y todas se basan en un modelo:

La dosimetna explteita

Este tipo de tecnica implica la medida de los principales componentes de la terapia, es decir, las dosis de luz, de oxfgeno y la concentracion intracelular del agente fotosensibilizante. Estos tres constituyentes se reagrupan en un modelo de dosis de las especies reactivas del oxfgeno producidas, definido por la Ecuacion 1. Sin embargo, ninguno de estos elementos es facilmente medible. Ademas, otros inconvenientes ya mencionados anteriormente, como la variacion de las dosis de los tres elementos a lo largo del tratamiento, constituyen otros lfmites para el desarrollo de este metodo.

La dosimetna implteita

Este tipo de metodo propone utilizar una unica magnitud cuya evolucion depende del efecto conjugado de las tres variables basicas de la terapia fotodinamica (dosis de luz, de producto administrado y de oxfgeno). Esta magnitud debe ser capaz de informar sobre los danos biologicos previsibles y por lo tanto sobre los resultados terapeuticos del tratamiento. Una variable interesante para desempenar este papel es la concentracion intratumoral del agente fotosensibilizante (PS).

Una tecnica de medida conocida consiste en utilizar un metodo invasivo, que necesita la exeresis de tumores de xenoinjertos en ratones "desnudos" (con un sistema inmunitario deficiente) que hayan recibido el agente fotosensibilizante, y despues estimar las concentraciones del agente fotosensibilizante antes y despues de iluminacion por cromatograffa lfquida de alta resolucion. Este metodo proporciona resultados precisos sobre la concentracion del agente fotosensibilizante y de los fotoproductos. Pero no permite observar en tiempo real la evolucion del agente fotosensibilizante durante el tratamiento.

La medida de las respuestas biologicas/bioffsicas de los tejidos

Se trata de un metodo alternativo para seguir la evolucion del tratamiento y predecir los danos sobre los tejidos tales como los danos vasculares y las necrosis inducidos por el tratamiento.

Los procedimientos utilizados para este fin incluyen la espectroscopia de impedancia electrica, la medida del flujo sangumeo por laser Doppler, el analisis de la difusion por espectroscopia de correlacion de fluorescencia, la tomograffa Doppler de coherencia optica, asf como los procedimientos de imagen molecular o radiologica tales como la tomograffa con emision de positrones (PET). Todavfa es difteil saber si estas tecnicas podran predecir eficazmente las respuestas terapeuticas de la terapia fotodinamica, puesto que requieren en particular cambios rapidos y significativos de las caractensticas biologicas y espectrales de los tejidos.

Se conoce por ejemplo el documento EP 2 431 072 A1 que divulga un procedimiento de control de la iluminacion en

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la terapia fotodinamica de tumor intersticial basado en una medida de las propiedades opticas de los tejidos y un metodo de calculo para determinar el estado del tejido durante el tratamiento.

La dosimetna directa

Esta tecnica implica la medida directa de las concentraciones de las especies reactivas del oxfgeno y en particular el oxfgeno singlete. Como ocurre con el metodo de la dosimetna implfcita, esta estrategia reduce el problema de dosimetna a una sola dimension, la del oxfgeno singlete, pero directamente esta vez. Varios trabajos han mostrado los primeros resultados in vivo en el laboratorio, pero la instrumentacion actual requerida para estos trabajos no permite considerar las aplicaciones clmicas por el momento.

El documento EP 1 637 182 A1 describe un dispositivo de terapia fotodinamica que comprende un elemento de control de una fuente luminosa en funcion de una informacion de fluorescencia o de fosforescencia determinada al nivel de una lesion en profundidad.

El documento DE 197 21 489 A1 describe un dispositivo de terapia fotodinamica que comprende una fuente luminosa capaz de adaptarse a la sustancia fotosensibilizante utilizada.

El documento WO 99/06113A1 describe un sistema de control de la dosimetna en la terapia fotodinamica en el cual se mide la fluorescencia con el fin de determinar la cantidad de sustancia fotosensibilizante producida, y deducir el instante en que se debe suspender la terapia.

El documento EP 1 808 198 A1 describe un dispositivo de terapia fotodinamica que comprende un dispositivo de control previsto para vigilar la activacion de la sustancia fotosensibilizante en un tejido sano situado delante de una lesion a tratar.

Un objetivo de la presente invencion es dar a conocer un dispositivo de ajuste automatico de la radiacion electromagnetica de activacion del agente fotosensibilizante durante una sesion de tratamiento en terapia fotodinamica in vivo, y que resuelve los inconvenientes de la tecnica anterior.

Otro objetivo de la presente invencion es dar a conocer un dispositivo de ajuste automatico de la radiacion electromagnetica de activacion del agente fotosensibilizante que permite controlar de manera reproducible la aplicacion de un tratamiento de terapia fotodinamica.

Otro objetivo de la presente invencion es dar a conocer un dispositivo de ajuste automatico de la radiacion electromagnetica de activacion del agente fotosensibilizante en la terapia fotodinamica que puede ser utilizado con una instrumentacion sencilla y adecuada para las aplicaciones in vivo.

Exposicion de la invencion

Un procedimiento que sirve de ejemplo para controlar la activacion de una sustancia fotosensibilizante introducida previamente en un tejido biologico, que comprende una etapa de exposicion de dicha sustancia fotosensibilizante a una radiacion electromagnetica de activacion de manera que la active,

caracterizado porque comprende ademas las etapas de:

- obtencion de una informacion de luminiscencia procedente de dicha sustancia fotosensibilizante, y

- ajuste de la exposicion de la sustancia fotosensibilizante a la radiacion electromagnetica de activacion de manera que dicha informacion de luminiscencia siga una evolucion temporal correspondiente a una consigna temporal predeterminada.

Se entiende que el termino de luminiscencia reagrupa todas las formas de emision de luz denominadas "fnas", tales como por ejemplo la quimioluminiscencia, la fosforescencia o la fluorescencia.

La sustancia fotosensibilizante puede ser introducida en el tejido biologico, especialmente por inyeccion, o por simple contacto en el caso de una superficie accesible tal como la piel.

La consigna temporal predeterminada puede comprender todo tipo de perfiles de curvas, descritas por ejemplo por ecuaciones (rectas, curvas lineales portramos, polinomios...) otablas de puntos.

Esta consigna temporal puede proceder, por ejemplo, de protocolos de medida.

La radiacion electromagnetica de activacion puede comprender una radiacion ionizante (rayos X) y/o una radiacion no ionizante.

Segun modos de realizacion, la radiacion electromagnetica de activacion puede comprender una radiacion luminosa de activacion con longitudes de ondas opticas.

Segun modos de realizacion, el procedimiento puede comprender ademas una etapa de medida de una informacion

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de luminiscencia procedente del oxfgeno singlete generado por la activacion de la sustancia fotosensibilizante.

Esta informacion de luminiscencia puede ser resultante especialmente de una fosforescencia a una longitud de onda de 1,27 pm del oxfgeno singlete que se genera por sustancias fotosensibilizantes tales como las porfirinas o las clorinas.

Segun modos de realizacion, el procedimiento puede comprender ademas las etapas de:

- exposicion de la sustancia fotosensibilizante a una radiacion luminosa de activacion aplicada en forma de impulsos luminosos de activacion, y

- medida de la luminiscencia entre dichos impulsos.

Esta exposicion de la sustancia fotosensibilizante a una radiacion luminosa de activacion aplicada en forma de impulsos luminosos separados por penodos de oscuridad permite asf efectuar medidas de luminiscencia en tiempo real, a lo largo del tratamiento, incluido el caso en que tales medidas no sean posibles en presencia de la radiacion luminosa de activacion.

La medida de la luminiscencia puede incluir las etapas de:

- iluminacion de la sustancia fotosensibilizante con una luz de excitacion a una longitud de onda de excitacion,

- medida de una intensidad de fluorescencia.

En este caso, la medida de la luminiscencia comprende una medida de fluorescencia efectuada sobre la sustancia fotosensibilizante. La evolucion temporal de esta fluorescencia permite evaluar el fenomeno de fotoblanqueo de la sustancia fotosensibilizante que resulta de su degradacion.

El procedimiento puede comprender ademas una etapa de calculo de un observador de luminiscencia que utiliza de entrada al menos una medida de la luminiscencia y un comando de los impulsos luminosos de activacion, y que produce de salida una estimacion de la luminiscencia.

Preferiblemente, estas medidas de luminiscencia comprenden las medidas de fluorescencia efectuadas sobre la sustancia fotosensibilizante.

El observador de luminiscencia puede ser modelado bajo la forma de un observador de estado que comprende una variable de estado que corresponde a una estimacion de la luminiscencia (o de la fluorescencia) asociada al efecto solo del tratamiento.

Este observador de estado puede ser derivado de un modelo autorregresivo con entradas externas como la estructura del modelo ARX ("Auto Regressive Model with external inputs" en ingles) o un modelo de tipo representacion de estado.

El observador de luminiscencia puede comprender parametros que se determinan durante una etapa previa de calibracion a partir de medidas experimentales.

El observador de luminiscencia permite realizar una interpolacion inteligente de las medidas de luminiscencia o de fluorescencia. En efecto, en la practica estas medidas no se pueden realizar durante las fases de impulsos de rayos electromagneticos porque estos ultimos ciegan por su gran intensidad el sistema de medida de la luminiscencia.

El observador de luminiscencia permite tambien reducir muy sensiblemente la intensidad del ruido de la medida de luminiscencia.

El observador de luminiscencia permite asf mejorar considerablemente el funcionamiento de un bucle de regulacion de la luz de activacion.

Ademas, el observador de luminiscencia se determina a partir de parametros experimentales relativamente faciles de obtener. No se requiere necesariamente una gran precision puesto que el observador de luminiscencia puede ser suspendido periodicamente por las medidas de luminiscencia. Asf, sus parametros se pueden determinar, por ejemplo, para un tipo de tejido biologico dado, y pueden ser aplicables directamente a diferentes sujetos tratados.

El procedimiento puede comprender ademas una etapa de comparacion de la estimacion de la luminiscencia procedente del observador de luminiscencia con la consigna temporal de tal manera que se genere una senal de error, que se utiliza para el ajuste de la exposicion a la radiacion electromagnetica de activacion.

El ajuste de la exposicion a la radiacion electromagnetica de activacion puede comprender un ajuste de la amplitud y/o de la duracion de los impulsos luminosos.

Asf, el procedimiento permite una retroalimentacion en bucle cerrado de la exposicion a la radiacion

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electromagnetica de activacion de tal manera que una variable de medida (la luminiscencia medida o estimada por el observador de estado) siga una trayectoria predeterminada (la consigna temporal).

El procedimiento se puede implementar con una sustancia fotosensibilizante cuya activacion produce sustancias capaces de destruir las celulas. En particular se puede implementar con sustancias fotosensibilizantes tales como las porfirinas o las clorinas, que liberan el oxfgeno singlete.

Segun otro aspecto, se da a conocer un dispositivo para controlar la activacion de una sustancia fotosensibilizante introducida previamente en un tejido biologico, que comprende:

- medios de exposicion capaces de permitir una exposicion de dicha sustancia fotosensibilizante a una radiacion electromagnetica de activacion de manera que la active,

- medios de adquisicion capaces de producir una informacion de luminiscencia procedente de dicha sustancia fotosensibilizante, y

- medios electronicos y de calculo capaces de controlar los medios de exposicion de manera que permitan un ajuste de la exposicion de la sustancia fotosensibilizante a la radiacion electromagnetica de activacion para que dicha informacion de luminiscencia siga una evolucion temporal correspondiente a una consigna temporal predeterminada.

Los medios de exposicion pueden comprender una fuente luminosa de activacion capaz de producir impulsos de luz en funcion de una senal de control.

Los medios de adquisicion pueden comprender un espectrometro o un espectrofluonmetro.

Los medios electronicos y de calculo pueden utilizar un bucle de control que comprende un observador de luminiscencia,

- utilizando dicho observador de luminiscencia de entrada al menos una medida de luminiscencia y una senal de control de la fuente luminosa de activacion, y produciendo de salida una estimacion de la luminiscencia,

- siendo utilizada dicha estimacion de la luminiscencia para generar una senal de control de la fuente luminosa de activacion.

Descripcion de las figuras y modos de realizacion

Otras ventajas y particularidades de la invencion apareceran con la lectura de la descripcion detallada de las implementaciones y de los modos de realizacion en absoluto limitativos, y de los dibujos adjuntos siguientes:

- la Fig. 1 presenta los resultados de simulacion de un proceso de fotorreaccion con, Fig. 1(a) la concentracion del agente fotosensibilizante PS en el estado fundamental (variable de salida), Fig. 1(b) la senal de irradiancia (variable de entrada), Fig. 1(c) la concentracion de oxfgeno singlete (variable de estado), y Fig. 1(d) la cantidad acumulada de oxfgeno singlete producido,

- la Fig. 2 presenta un esquema sinoptico de la invencion,

- la Fig. 3 presenta un organigrama del procedimiento divulgado,

- la Fig. 4 ilustra una comparacion entre las medidas de fotoblanqueo in vitro y una estimacion del fotoblanqueo obtenido con el modelo de estado segun la invencion,

- la Fig. 5 ilustra los resultados del observador de fotoblanqueo, a traves de medidas simuladas,

- la Fig. 6 presenta los resultados de la regulacion del fotoblanqueo, en condiciones in vitro.

Modelo citotoxico

El proceso de reaccion basico de las terapias fotodinamicas es el siguiente:

- se introduce un fotosensibilizador (PS) en los tejidos, por ejemplo, por via intravenosa o incluso por aplicacion directa, para las aplicaciones sobre la piel. En el marco de los modos de realizacion presentados, se considera que este fotosensibilizador puede ser por ejemplo una porfirina o una hematoporfirina;

- el fotosensibilizador se concentra mas o menos selectivamente en los tejidos a destruir (por ejemplo, los tejidos tumorales), o se elimina mas lentamente, lo que produce el mismo resultado;

- la zona a tratar se ilumina a continuacion con una luz de activacion que contiene las longitudes de onda necesarias para el desencadenamiento de las reacciones. Idealmente, estas longitudes de onda

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corresponden a las bandas de absorcion del fotosensibilizador, o al menos a un compromiso entre las longitudes de onda capaces de penetrar los tejidos biologicos (en rojo) y estas bandas de absorcion. Por ejemplo, para las hematoporfirinas, la iluminacion se efectua a menudo con longitudes de onda del orden de 63o-65o nm;

- la accion de la luz sobre el fotosensibilizador provoca la formacion de oxfgeno singlete 1C>2. Esta molecula es una forma de oxfgeno de mas alta energfa que el ox^geno clasico, que se forma por excitacion de este ultimo. Es una molecula de vida corta que es muy reactiva frente a los componentes celulares y por lo tanto muy toxica.

El conjunto de estos procesos da como resultado la degradacion de un gran numero de constituyentes celulares, lo que lleva a la muerte de las celulas por necrosis o por apoptosis.

El proceso fotoqmmico al principio de la formacion de oxfgeno singlete es el siguiente:

- el fotosensibilizador absorbe los fotones de la luz de activacion;

- pasa entonces de un estado de singlete fundamental So a un estado de singlete excitado Si;

- el retorno al estado inicial So se puede realizar, especialmente, pasando a un estado de triplete Ti, por el cruce intersistemas (ISC), asf pues, una transicion no radiativa;

- al ser el tiempo de vida de este estado de triplete Ti relativamente largo, la molecula del fotosensibilizador puede interactuar entonces con los sustratos situados en su entorno proximo, como por ejemplo el oxfgeno presente en los tejidos. Son posibles dos tipos de reacciones, conocidas con los nombres de fotorreacciones de tipo I y II. Las fotorreacciones de tipo II son predominantes en la terapia fotodinamica con los fotosensibilizadores de tipo porfirinas;

- en una fotorreaccion de tipo II, el estado de triplete Ti del fotosensibilizador reacciona directamente con el oxfgeno presente transfiriendole su exceso de energfa, lo que hace pasar al oxfgeno de su estado inicial 3O2 a su estado de singlete O2.

Hay que tener en cuenta que el oxfgeno singlete formado puede reaccionar tambien con el fotosensibilizador y destruirlo. Esta degradacion, llamado fotoblanqueo, es una consecuencia de las reacciones de tipo I y II. Este fotoblanqueo conduce a una disminucion de la absorbancia del fotosensibilizador, y por lo tanto a una disminucion de su eficacia.

El fotoblanqueo implica dos mecanismos:

- la fotodegradacion, que corresponde a una modificacion profunda de la estructura del fotosensibilizador que conduce a la formacion de fotoproductos que absorben poco o nada de la luz de activacion;

- la fototransformacion que corresponde a una perdida de la absorbancia y de la fluorescencia del fotosensibilizador a ciertas longitudes de onda, pero se conserva el cromoforo.

Ademas, si se irradia un fotosensibilizador a una longitud de onda de excitacion apropiada, es posible observar una fluorescencia. Esta fluorescencia corresponde a un retorno del fotosensibilizador en un estado de singlete excitado Si hacia el estado fundamental So por emision de fotones de fluorescencia.

Esta fluorescencia se puede utilizar especialmente para determinar la localizacion del fotosensibilizador en las celulas, y para verificar su eliminacion completa despues del tratamiento.

La intensidad de fluorescencia se ve afectada tambien por el fotoblanqueo. Asf, el fenomeno de fotoblanqueo se puede evaluar por la medida de la disminucion de la intensidad de fluorescencia fotoinducida del fotosensibilizador.

En el marco de la invencion, se ha desarrollado un modelo no lineal de los procesos de fotorreaccion basicos de las terapias fotodinamicas (PDT) y se ha descrito por una representacion de estado. Este modelo se ha obtenido a partir de ecuaciones cineticas, conocidas en la literatura, que describen las reacciones de tipo II espedficas de la terapia fotodinamica:

d[sa]

dt

dfs,]

iff

dim

iff

' rtf

d\ maj at

m

y

, V

Up + *,&] - kPb[S0][ '02] + kp[T,\ + kT[T,][ 302] - kAuL[S0]

^AUL [So] — (kf + k/sc)[^i] — fc5Af["5l][W]

A/Sc[Si] — kp[Ti] — kT[T,][ 302] — fcrw[7i][M]

U0 - M?l][ 302) + kl\ ^2] (Ecuacion 2)

ArPi][ 302] — kt\ 102]—/c0X[M][ 102] — ^pb[^ol[ *^2]

Mo

HSoJ + V

N(P, s2)

Las variables del modelo son las siguientes:

[50] : concentracion de fotosensibilizador en el estado de singlete fundamental (milimolar, mM);

[51] : concentracion de fotosensibilizador en el estado de singlete excitado (mM);

5 [Ti]: concentracion de fotosensibilizador en el estado de triplete excitado (mM);

[3C>2]: concentracion de oxfgeno en el estado de triplete inicial (mM); fey: concentracion de oxfgeno en el estado de singlete excitado (mM);

[M]: concentracion de celulas organicas (mM);

up: velocidad de absorcion de las moleculas de fotosensibilizador en los tejidos (mMs-1);

10 ul irradiancia energetica de la iluminacion (Wcm-2);

uo: velocidad de absorcion de las moleculas de oxfgeno (mM s-1); y: intensidad de fluorescencia (unidades arbitrarias, u.a.).

x(t) = [[So], [Si], [7i], [302], [102], [M]]T E I®6 son las variables de estado del modelo.

La penetracion de las moleculas fotosensibilizantes (PS) en las celulas es un proceso con una dinamica muy lenta, 15 en comparacion con las fotorreacciones. Ademas, la velocidad de absorcion de las moleculas fotosensibilizantes up se puede considerar como nula (up = 0) durante el periodo de tratamiento, que corresponde a un penodo de tiempo relativamente corto, inferior a 1 hora.

La velocidad de absorcion de moleculas de oxfgeno uo(t) se puede considerar constante durante el tratamiento.

El ruido de medida v(t,) se puede considerar como una secuencia de realizacion de variables gaussianas 20 independientes y distribuidas de manera uniforme en los instantes de medida {t,}, segun una distribucion normal N(0,o2).

El modelo de la Ecuacion 2 utiliza tambien un conjunto de parametros que se enumeran a continuacion, con los valores y las condiciones iniciales utilizados para realizar los calculos:

Sfmbolo

Definicion Valor

kA

Constante de absorcion del fotosensibilizador para una iluminacion ul = 76 MWcm-2 1

kpb

Constante de fotoblanqueo 1,6-10° mM-1s-1

kr

Constante de velocidad bimolecular para la reaccion de 3C2 con T 105 mM-1s-1

kf

Constante de fluorescencia para la reaccion S1 ^ S0 2-10's-1

kP

Constante de fosforescencia para la reaccion T ^ S0 1250 s-1

kisc

Constante de velocidad para la reaccion S1 ^ T 810's-1

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ki

Constante de luminiscencia para la reaccion C2 ^ C2 O O (/>

kcx

Constante bimolecular de la reaccion de oxidacion entre C2 y M 1o5 mM-ls-1

y

Coeficiente de medida 43,15 u.a.

[So]o

Condicion inicial para [So] 8,51o-3 mM

[S1]o

Condicion inicial para [S1] o mM

[7"1]o

Condicion inicial para [71] o mM

co

Condicion inicial para [C2] 831o-3 mM

co

Condicion inicial para [C2] o mM

[M]o

Condicion inicial para [M] 83o-1o-3 mM

La Fig. 1 presenta los resultados de una simulacion numerica de un proceso de fotorreaccion con un agente fotosensibilizante presente en un tejido biologico. Esta simulacion se calcula implementando el modelo de la Ecuacion 2. Los ejes de abscisas corresponden al tiempo t(s).

La senal luminosa de activacion utilizada para iluminar los tejidos biologicos y el agente fotosensibilizante se presenta en la Fig. 1(b). Se trata de una onda cuadrada de periodo 60 s, con una relacion dclica A y con irradiancia o iluminacion energetica ul = 95 mWcm-2.

La Fig. 1(a) ilustra la evolucion temporal de la concentracion [So] del agente fotosensibilizante en el estado de singlete fundamental. Esta curva corresponde tambien a la curva de fotoblanqueo del agente fotosensibilizante.

La Fig. 1(c) ilustra la evolucion temporal de la concentracion [1C>2] de oxfgeno singlete producido por la activacion del agente fotosensibilizante por la senal luminosa de activacion.

La Fig. 1(d) ilustra la evolucion de la cantidad acumulada de oxfgeno singlete producido por la activacion del agente fotosensibilizante por la senal luminosa de activacion.

En la medida en que el oxfgeno singlete es la especie fotocitotoxica que esta verdaderamente al principio de los danos biologicos, una medida de su concentracion a lo largo del tratamiento puede permitir controlar con gran precision la aplicacion del tratamiento y desarrollar asf tecnicas de dosimetna capaces de llevar a una mejor reproducibilidad de los resultados.

Una medida directa de la concentracion de oxfgeno singlete se puede realizar especialmente midiendo la luminiscencia producida a una longitud de onda de 1,27 pm por este oxfgeno singlete. Sin embargo, en la practica, esta concentracion de oxfgeno singlete es muy diffcilmente medible en condiciones in vivo.

Las simulaciones de la Fig. 1 muestran tambien que la curva de fotoblanqueo del agente fotosensibilizante (Fig. 1(a)) es un buen indicador de la produccion de oxfgeno singlete (Fig. 1(d)). Asf, segun un modo de realizacion preferente de la invencion, es la senal de fotoblanqueo la que se utiliza como marcador temporal de la eficacia del tratamiento.

Como se ha explicado anteriormente, la invencion tiene por objeto dar a conocer un metodo de control en bucle cerrado que permite, a partir del seguimiento a lo largo del tratamiento de una variable testigo de la eficacia del tratamiento (tal como el fotoblanqueo), ajustar las modalidades de aplicacion de la irradiacion para que este parametro objetivo siga una evolucion temporal predeterminada. Asf, el tratamiento puede ser adaptado en tiempo real de manera que la senal de fotoblanqueo siga una evolucion predeterminada siendo poco o nada afectada por las variabilidades biologicas entre los sujetos, de tal manera que se mejore la reproducibilidad del tratamiento. La determinacion de la evolucion temporal o de la curva deseada depende de consideraciones que se salen del campo de la presente invencion.

Como se ha explicado anteriormente, el fotoblanqueo se estima midiendo una intensidad de fluorescencia del agente fotosensibilizante. Esta medida no se puede realizar al mismo tiempo que la iluminacion porque la senal de fluorescencia no sena discernible.

Asf, en el marco de la invencion, la iluminacion se aplica en forma de impulsos luminosos tales como los presentados en la Fig. 2(b), de tal manera que se puedan efectuar medidas de fotoblanqueo en tiempo real entre estos impulsos.

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Dosimetna

El funcionamiento del dispositivo segun la invencion se ilustra en la Fig. 2.

El dispositivo segun la invencion comprende una fuente de luz de activacion 2 capaz de generar una luz de activacion 10.

Esta luz de activacion 10 se dirige, por ejemplo, por medio de fibras opticas hacia los tejidos biologicos 3 de la zona a tratar, en los cuales se ha introducido previamente un agente fotosensibilizante PS. Como se ha explicado anteriormente, este agente fotosensibilizante excitado por la luz de activacion provoca la generacion de especies fototoxicas que causan la destruccion de las celulas.

La fuente de luz de activacion 2 esta dirigida por una senal de control de activacion 9 de forma temporal u(t), que resulta del bucle de retroalimentacion 1. Esta senal de control de activacion 9 se presenta bajo la forma de una secuencia de impulsos tal como se ilustra en la fig. 1(b). Asf, la luz de activacion procedente de la fuente 2 dirigida por la senal de activacion 9 se aplica bajo la forma de una secuencia temporal L(t) de impulsos luminosos separados por momentos de extincion. La duracion (y/o la amplitud) de los impulsos luminosos es controlada por la senal de control 9.

El dispositivo segun la invencion comprende tambien un espectrofluonmetro 4 para efectuar las medidas de fotoblanqueo del agente fotosensibilizante. Este espectrofluonmetro 4 comprende una fuente de luz de excitacion que emite una luz a longitudes de onda capaces de excitar la fluorescencia del agente fotosensibilizante. La fuente luminosa puede ser por ejemplo un diodo de laser a 410 nm. Esta luz de excitacion se dirige hacia los tejidos biologicos 3 de la zona a tratar por medio de al menos una fibra optica de iluminacion. La fluorescencia 11 generada por el agente fotosensibilizante se recoge por fibras opticas reagrupadas en haz alrededor de la fibra o fibras opticas de iluminacion, para ser llevada al espectrometro del espectrofluonmetro 4. Se recoge un espectro de fluorescencia de forma I(t,A), donde A es la longitud de onda de emision de fluorescencia, para varios instantes t con un periodo de muestreo definido por el usuario. La intensidad de fluorescencia y(t) emitida por el agente fotosensibilizante se puede determinar entonces por la siguiente formula:

(Ecuacion 3)

donde J(T,A) es una integral del espectro:

(Ecuacion 4)

y el intervalo [A1A2] corresponde a la anchura de banda de emision de fluorescencia del agente fotosensibilizante. Esta intensidad de fluorescencia y(t) se utiliza despues como senal de medida del fotoblanqueo 12.

El dispositivo segun la invencion se puede utilizar para tratar afecciones en la superficie de la piel o de una pared biologica (esofago, ...). Se puede utilizar tambien para tratar afecciones o tumores intersticiales. En este caso, la luz de activacion 10 puede ser llevada a la zona a tratar 3 y la fluorescencia 11 puede ser recogida con las fibras opticas insertadas en los tejidos biologicos.

Como se ha explicado anteriormente, la medida del fotoblanqueo 12 no se puede efectuar mas que cuando la fuente de activacion 2 esta apagada, porque en el caso contrario la fluorescencia 11 no es discernible.

El dispositivo segun la invencion comprende finalmente un bucle de retroalimentacion 1 implementado en un calculador numerico. La funcion de este bucle de retroalimentacion 1 es ajustar la senal de control de activacion 9 de forma temporal u(t) para que la senal de fotoblanqueo 12 de forma temporal y(t) siga una consigna 5 de forma temporal R(t) predeterminada.

Por supuesto, en el marco de la invencion esta consigna puede ser de cualquier forma temporal R(t).

En el bucle de retroalimentacion 1, una magnitud de estado 15 de forma temporal x(t) que depende de la senal de fotoblanqueo 12 se compara con la consigna 5 en un comparador 6, de tal manera que se genera una senal de error de rastreo 7 de forma temporal e(t).

La senal de error de rastreo 7 se introduce en un corrector 8 que genera una senal de control 9 de la fuente de activacion 2 para reducir al mmimo este error en las siguientes repeticiones.

Esta senal de control de activacion 9 tiene una forma temporal u(t) que corresponde a una sucesion de impulsos con un periodo constante, pero cuya amplitud y/o la relacion dclica se ajusta en funcion de la senal de error de rastreo 7. En el caso de un ajuste de la relacion dclica, que es la solucion utilizada en el modo de realizacion presentado, estos impulsos se obtienen a partir de una senal sinusoidal a la que se anade un intervalo dependiente de la amplitud del error de rastreo e(t). Esta senal sinusoidal desplazada en amplitud se transforma despues en impulsos de periodo constante y de relacion dclica dependiente del intervalo calculado por medio de un comparador, para

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generar la senal de control u(t).

Segun un primer modo de realizacion de la invencion, el bucle de retroalimentacion 1 comprende un interpolador 13 capaz de generar la magnitud de estado 15 a partir de una interpolacion, por un metodo conocido por los expertos en la tecnica, de las medidas de fotoblanqueo 12. Esta interpolacion consiste en calcular los valores de la magnitud de estado x(t) a partir de un historico de medidas de fotoblanqueo y(t), eventualmente con una frecuencia de muestreo mas elevada, y calculando un promedio del ruido de medida. Se pueden utilizar especialmente interpolaciones de tipo polinomiales o splines.

Segun un segundo modo de realizacion preferente de la invencion, el bucle de retroalimentacion comprende un observador de estado 14 cuyo funcionamiento se explicara a continuacion.

Por supuesto, el interpolador 13 y el observador de estado 14 pueden estar ambos implementados en un bucle de retroalimentacion 1. La eleccion de la utilizacion de uno o de otro puede ser determinada entonces por un parametro accesible para el usuario.

En la practica, las medidas de fluorescencia en las condiciones in vivo son medidas diffciles. La intensidad de fluorescencia 11 es muy baja. Estas medidas necesitan tiempos de integracion del orden de la segunda, y tienen mucho ruido. Ademas, los penodos de iluminacion y de oscuridad de la senal luminosa de activacion 10 son del orden de 1s a algunas decenas de segundos. Sabiendo que las medidas de fluorescencia 11 no se pueden llevar a cabo mas que durante los penodos de oscuridad de la senal luminosa de activacion 10, se deduce que la senal de fotoblanqueo 12 que se puede obtener tiene en general mucho ruido y comprende pocas muestras.

En estas condiciones, un interpolador clasico 13 corre el riesgo de dar malos resultados, y de generar una magnitud de estado 15 tambien con mucho ruido, que conduce a un mal funcionamiento global del bucle de regulacion 1.

La estimacion de la magnitud de estado 15 a partir de las medidas de fotoblanqueo 12 se puede mejorar considerablemente utilizando un observador de estado 14. Se trata de un sensor de software que se basa en un modelo dinamico 16 del fenomeno de fotoblanqueo. El acepta de entrada la senal de control de activacion 9 y las medidas de fotoblanqueo 12, y proporciona de salida una estimacion de la magnitud de estado 15.

El modelo dinamico 16 tiene por funcion simular la cadena de activacion del agente fotosensibilizante y de la medida de fotoblanqueo, que comprende la generacion de la senal luminosa de activacion 10 por la fuente 2, las interacciones con los tejidos biologicos 3 y la medida del fotoblanqueo 12 con el espectrofluonmetro 4.

El modelo biologico de la Ecuacion 2 es diffcilmente aplicable, porque depende de un gran numero de parametros diffciles de determinar, y variables entre los sujetos y los tipos de tejidos biologicos.

Modelo dinamico simplificado

Se ha desarrollado por lo tanto en el marco de la invencion un modelo dinamico simplificado, obtenido directamente a partir de datos experimentales, y no a partir de las ecuaciones teoricas de las reacciones fotoqmmicas como el modelo de la Ecuacion 2.

Este modelo dinamico simplificado permite al observador de estado 14 reconstruir en tiempo real una senal de fotoblanqueo "limpia" a partir de los datos parciales y con ruido 12 medidos durante el tratamiento.

En el caso de la terapia fotodinamica, obtener un modelo simplificado del comportamiento dinamico del fenomeno de fotoblanqueo es complejo. Hay dos razones para esto:

- el comportamiento no lineal del fenomeno de fotoblanqueo visible en las simulaciones de la Fig. 1(a) y 1(b). En efecto, se observa claramente un comportamiento asimetrico de la respuesta cuando se activa o no la senal de excitacion luminosa. Ahora bien, este cambio de ritmo no se puede describir por un modelo lineal clasico;

- ademas, como se ha explicado anteriormente, no se pueden medir los espectros de fluorescencia del agente fotosensibilizante mas que durante las fases en las que la luz de activacion 10 esta apagada, si no ella satura la senal debido a su alta potencia. Se esta por lo tanto "a ciegas" una gran parte del tiempo.

Este modelo dinamico ha sido desarrollado sobre la base de una estructura ARX ("Auto Regressive Model with external inputs" en ingles o modelo autorregresivo con entradas externas). Esta estructura ARX se define por la ecuacion de las diferencias:

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(Ecuacion 5)

y(t) indica la variable de salida que es aqrn la senal de fotoblanqueo 12). u(t) indica la variable de entrada que es

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aqu la senal de control 9 de la fuente luminosa de activacion 2. El error v(t) es una variable aleatoria cuya distribucion sigue una distribucion normal de media cero y de varianza o2, N(0,cr). t es la variable del tiempo que representa los instantes discretos muestreados con un periodo de muestreo Ts. na, nb, nk son indices de estructura, que comprenden, respectivamente, los ordenes de los polinomios de las partes auto-regresivas y externas, asf como el retraso de la salida con respecto a la entrada.

Para describir el comportamiento asimetrico del fenomeno de fotoblanqueo cuando la senal de excitacion luminosa esta activada o no, se introduce un modelo ARX a tramos, definido por las siguientes ecuaciones,

y(0 + ai.i y(t -1) + - + <*i,„ay(t - nQ)

= b1-tu(t - nk) + - + bln/>u(t - nk - nb + 1) + v:(t)

si 5u(t) > 0, y

y(0 + <*2.i y(t -1) + - + <*2,nfly(* - nfl)

= ^>2.iu(t — nk) H-----*" b2jntu(t - nk - nb + 1) + v2(t)

(Ecuacion 6)

(Ecuacion 7)

si 5u(t) < 0.

5u(t) = u(t) - u(t -1) corresponde a las variaciones de la senal de control 9. vi(t) y V2(t) son dos procesos gaussianos centrados independientes e identicamente distribuidos.

En el caso presente, se puede limitar a na = nb = nk = 1.

La Ecuacion 6 y la Ecuacion 7 se pueden reagrupar dentro de una misma relacion,

y(£) + a, ,y(t - 1) + (a2 4 - aa i)y(t - l)b(c)

= - 1) + (b2il - bu)u(t - l)b(t) + r,(t) + (v2(£) - Vj(t))b(t).

(Ecuacion 8)

La variable de secuenciacion b(t) es una variable binaria necesaria para la seleccion de los dos patrones lineales. Se define de la siguiente manera:

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El modelo de la Ecuacion 8 se puede transformar en una representacion de estado a tiempo discreto con la variable de estado x(t):

(Ecuacion 10)

(Ecuacion 11)

donde B = (- 02,1 + ai,i bi,i b2,i -bi,i), uT(t) = (x(t)b(t) u(t) u(t)b(t)), y v(t) ~N(0,o2).

En el contexto de la invencion, se puede imponer que el comportamiento esperado sea constante durante las fases en que la luz de activacion esta apagada. Este comportamiento puede ser descrito por un modelo de integrador con una ganancia cero. En otras palabras, esto equivale a establecer a2,1 = -1 y b2,1 = 0.

Finalmente, para describir completamente el modelo, faltan por determinar los parametros a1,1 y b1,1. Estos parametros se pueden estimar a partir de medidas experimentales realizadas en condiciones proximas a las condiciones de aplicacion del tratamiento, por ejemplo, durante experimentos in vivo en animales.

La determinacion de estos parametros se puede realizar con el montaje de la Fig. 2, en una fase de identificacion efectuada en bucle abierto, explotando las medidas de fotoblanqueo y(t) obtenidas en respuesta a una senal de control u(t) conocida. Los parametros a1,1 y b1,1 se ajustan para que la Ecuacion 10 y la Ecuacion 11 describan lol mejor posible las medidas.

La Fig. 4 ilustra la calidad de ajuste de este tipo de modelo sobre los datos de fotoblanqueo obtenidos en condicion in vitro. La curva 35 representa las medidas de fotoblanqueo y(t) obtenidas en respuesta a una senal de control u(t), y la curva 36 representa la respuesta del modelo de la Ecuacion 10 y de la Ecuacion 11 en estas condiciones. La

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correspondencia entre la respuesta del modelo y las medidas (coeficiente de determinacion) es del orden de 95 %.

La Ecuacion 10 y la Ecuacion 11 constituyen as^ el modelo dinamico 16 del fenomeno de fotoblanqueo, con lo que se puede ver que se puede obtener de manera sencilla haciendo un mmimo de hipotesis sobre los parametros fisiologicos.

Se puede deducir tambien directamente un modelo para el observador de estado 14 como sigue:

(Ecuacion 12)

(Ecuacion 13)

(Ecuacion 14)

Con y(0) = y(0). y(t) es el fotoblanqueo estimado por el observador de estado 14, y K un factor multiplicativo (ganancia de innovacion).

Cabe senalar que este modelo tambien es capaz de tener en cuenta el fotoblanqueo del agente fotosensibilizante debido a la luz de excitacion emitida por el espectrocolonmetro 4 para generar la fluorescencia.

El desarrollo de las etapas del procedimiento de aplicacion de la terapia fotodinamica se ilustra en la figura 3:

- etapa 20: en un primer tiempo, se programa una trayectoria de fotoblanqueo R(t) predeterminada;

- etapa 21: se realiza una medida de fotoblanqueo por medio del espectrofluonmetro 4 para obtener un valor de fotoblanqueo medido y(t);

- etapa 22: la variable de estado x(t) (que corresponde a un valor estimado de fotoblanqueo y(t)) es calculada

por el observador de estado 14, teniendo en cuenta el ultimo valor de la senal de control de la fuente

luminosa de activacion u(t);

- etapa 23: se calcula el error de rastreo e(t);

- etapa 24: la senal de control de la fuente luminosa de activacion u(t) es calculada por el corrector 8;

- etapa 25: la senal luminosa de activacion L(t) es aplicada por la fuente de activacion 2 a la zona a tratar 3

en la forma de un impulso de iluminacion cuya duracion se determina por la senal de control u(t);

- etapa 26: el sistema espera el final del impulso luminoso L(t);

- etapa 27: si la trayectoria de fotoblanqueo R(t) esta completamente recorrida, se para el tratamiento (etapa

28). En el caso contrario la ejecucion del algoritmo continua de manera iterativa en la etapa 21 por una nueva medida de fotoblanqueo (vuelta a la etapa 21).

Se debe observar que este algoritmo comprende dos bucles anidados:

- un primer bucle de medida 29 entre las etapas 27 y 21 que esta sincronizado con las medidas de fotoblanqueo;

- un segundo bucle de medida 30 entre las etapas 24 y 22 que permite tener en cuenta las variaciones de la senal de control u(t) en las estimaciones del fotoblanqueo y(t)) proporcionadas por el observador de estado 14.

El bucle de contra-reaccion 30 puede asf ser ejecutado a un ritmo muy superior al bucle de medida 29 (por ejemplo, del orden de 10 veces) basandose en las estimaciones producidas por el observador a un ritmo regular, incluso cuando las medidas de fotoblanqueo son imposibles (durante la iluminacion). Asf se puede reducir en gran medida, el ruido en el bucle de contra-reaccion.

El penodo del bucle de medida 29 determina el penodo de la senal de control u(t). La duracion de los impulsos de esta senal de control u(t) o su relacion ciclica es ajustada por el bucle de contra-reaccion 30.

Finalmente, el observador de estado 14 puede ser "suspendido" en cada iteracion del bucle de medida, lo que permite relajar considerablemente las obligaciones sobre la precision necesaria para el modelo dinamico 16.

La Fig. 5 ilustra los resultados del observador de fotoblanqueo. La curva 40 es una curva de fotoblanqueo teorica calculada con el modelo citotoxico de la Ecuacion 2. Esta curva simula, de manera ideal y sin ruido de medida, un procedimiento de regulacion del fotoblanqueo efectuado segun la invencion, que sigue una trayectoria de fotoblanqueo R(t), que es una lmea recta. A partir de esta curva, las medidas de ruido 41 han sido generadas

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anadiendo a las mismas el blanco de ruido para simular las medidas de fotoblanqueo y(t), tal como si se hubieran obtenido con el espectrofluonmetro 4 en las condiciones reales. La curva 42 presenta los valores estimados de fotoblanqueo y(t) producidos por el observador de estado 14 a partir del control u(t) y de las medidas de ruido y(t) en estas condiciones. Se observa la capacidad del observador de estado 14 para estimar con precision la curva del fotoblanqueo teorico 40 a pesar del ruido de medida.

La Fig. 6 presenta medidas de la regulacion del fotoblanqueo obtenida con el dispositivo segun la invencion, en condiciones in vitro. La curva 52 corresponde a la trayectoria de fotoblanqueo deseada R(t), la curva 50 corresponde a las medidas de fotoblanqueo y(t), y la curva 51 corresponde a la senal de control de la activacion u(t). Se puede observar que a pesar de una distancia importante en un principio entre la consigna R(t) y las medidas y(t), el sistema es capaz de hacer converger rapidamente y despues controlar el fotoblanqueo lo mas cerca posible de la trayectoria de consigna.

Segun variantes de modos de realizacion, la fuente de luz de activacion 2 y el corrector 8 pueden ser disenados para generar:

- impulsos de luz 10 de amplitud variable en funcion del error de rastreo 7. Estos impulsos pueden ser de relacion dclica constante (por ejemplo, de 50 %) y de periodo constante;

- impulsos de luz 10 de duracion y de periodo variable en funcion del error de rastreo 7.

Por supuesto, la invencion no se limita a los ejemplos que acaban de ser descritos y se pueden aportar numerosas modificaciones a estos ejemplos sin salirse del marco de la invencion.

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   REIVINDICACIONES

   1. Dispositivo para controlar la activacion de una sustancia fotosensibilizante introducida previamente en un tejido biologico (3), siendo seleccionada la sustancia fotosensibilizante entre las porfirinas y las clorinas, comprendiendo el dispositivo:

   - medios de exposicion (2) capaces de permitir una exposicion de dicha sustancia fotosensibilizante a una radiacion electromagnetica de activacion (10) de manera que la active, cuyos medios de exposicion comprenden una fuente luminosa de activacion (2) capaz de producir impulsos de luz (10) en funcion de una senal de control (9), y

   - medios de adquisicion (4) capaces de producir una informacion de luminiscencia (11, 12) procedente de dicha sustancia fotosensibilizante,

   estando caracterizado el dispositivo porque comprende, ademas;

   - medios electronicos y de calculo capaces de controlar los medios de exposicion (2) de manera que permitan un ajuste de la exposicion de la sustancia fotosensibilizante a la radiacion electromagnetica de activacion (10) para que dicha informacion de luminiscencia (11, 12) siga una evolucion temporal correspondiente a una consigna temporal predeterminada (5),

   utilizando los medios electronicos y de calculo un bucle de retroalimentacion (1) que comprende:

   - un observador de luminiscencia (14) que utiliza de entrada al menos una medida de luminiscencia (12) y una senal de control (9) de la fuente luminosa de activacion (2), y que produce de salida una estimacion de la luminiscencia (15),

   - medios (6) para efectuar una comparacion de la estimacion de la luminiscencia (15) procedente del observador de luminiscencia (14) con la consigna temporal (5) de tal manera que se genere una senal de error (7),

   - un corrector (8) capaz de generar dicha senal de control (9) de la fuente luminosa de activacion (2) utilizando la senal de error (7).
2. 2. El dispositivo de la reivindicacion 1, que comprende medios de adquisicion (4) capaces de producir una informacion de luminiscencia (11, 12) a partir del oxfgeno singlete generado por la activacion de la sustancia fotosensibilizante.
3. 3. El dispositivo de la reivindicacion 1, que comprende medios de adquisicion (4) capaces de medir una intensidad de fluorescencia de la sustancia fotosensibilizante entre los impulsos de luz (10) de la fuente luminosa de activacion (2).
4. 4. El dispositivo de la reivindicacion 3, que comprende medios de adquisicion (4) que comprenden:

   - una fuente de luz de excitacion para emitir una luz a longitudes de onda de excitacion capaces de excitar la fluorescencia de la sustancia fotosensibilizante,

   - medios de medida de una intensidad de fluorescencia (11).
5. 5. El dispositivo de la reivindicacion 4, en el que los medios de adquisicion (4) comprenden un espectrometro o un espectrofluonmetro.
6. 6. El dispositivo de una de las reivindicaciones precedentes, que comprende un observador de luminiscencia modelado bajo la forma de un observador de estado (14) que comprende una variable de estado (15) que corresponde a una estimacion de la luminiscencia.
7. 7. El dispositivo de la reivindicacion 6, en el que el observador de estado (14) se deriva de un modelo autorregresivo (16) con entradas externas ARX, o de un modelo de tipo representacion de estado.
8. 8. El dispositivo de una de las reivindicaciones precedentes, en el que el observador de luminiscencia (14) comprende parametros que se determinan por calibracion a partir de medidas experimentales.
9. 9. El dispositivo de una de las reivindicaciones precedentes, en el que el corrector (8) es capaz de generar una senal de control (9) que corresponde a una secuencia de impulsos con un periodo constante y cuya amplitud y/o relacion dclica se ajusta en funcion de la senal de error (7).
10. 10. El dispositivo de una de las reivindicaciones precedentes, que se utiliza con una sustancia fotosensibilizante cuya activacion produce sustancias capaces de destruir las celulas.