ES2631807T3 - Variantes de acetil-CoA carboxilasa mejoradas - Google Patents

Variantes de acetil-CoA carboxilasa mejoradas Download PDF

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Donald E. Trimbur
Andreas W. Schirmer
Cindy Chang
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Abstract

Proteina portadora de biotina carboxilo (BCCP) variante de SEQ ID NO: 2 que comprende una sustitucion de aminoacido en la posicion 2 de SEQ ID NO: 2, en la que dicha BCCP variante comprende una secuencia de polipeptido seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4, 6, 10, 14, 16, 20, 24, 32, 48, 70.

Description

5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
DESCRIPCION
Variantes de acetil-CoA carboxilasa mejoradas Campo
La divulgacion se refiere a variantes de acetil-CoA carboxilasa (ACC) para la produccion de un compuesto derivado de malonil-CoA incluyendo un derivado de acido graso. Se contemplan ademas celulas huesped que expresan las variantes de ACC y cultivos celulares relacionados. Todavfa se abarcan metodos de produccion de compuestos derivados de malonil-CoA empleando las celulas huesped que expresan las variantes de ACC.
Antecedentes
El petroleo es un recurso natural limitado que se encuentra en la tierra en formas lfquida, gaseosa o solida. Sin embargo, los productos del petroleo se desarrollan con costes considerables, tanto financieros como medioambientales. En su forma natural, el petroleo crudo extrafdo de la Tierra tiene pocos usos comerciales. Es una mezcla de hidrocarburos, por ejemplo, parafinas (o alcanos), olefinas (o alquenos), alquinos, naftenos (o cicloalcanos), compuestos alifaticos, compuestos aromaticos, etc. de longitud y complejidad variables. Ademas, el petroleo crudo contiene otros compuestos organicos (por ejemplo, compuestos organicos que contienen nitrogeno, oxfgeno, azufre, etc.) e impurezas (por ejemplo, azufre, sal, acido, metales, etc.). Debido a su alta densidad de energfa y su facil transportabilidad, la mayor parte del petroleo se refina para dar combustibles, tales como combustibles de transporte (por ejemplo, gasolina, diesel, combustible de aviacion, etc.), gasoleo de calefaccion, gas licuado de petroleo, etc.
Los productos petroqmmicos pueden usarse para producir productos qmmicos especializados, tales como plasticos, resinas, fibras, elastomeros, productos farmaceuticos, lubricantes o geles. Los productos qmmicos especializados tienen muchos usos comerciales. Ejemplos de productos qmmicos especializados que pueden producirse a partir de materiales de partida petroqmmicos incluyen acidos grasos, hidrocarburos (por ejemplo, hidrocarburos de cadena larga, hidrocarburos de cadena ramificada, hidrocarburos saturados, hidrocarburos insaturados, etc.), alcoholes grasos, esteres, aldehfdos grasos, cetonas, lubricantes, etc. Los acidos grasos se usan comercialmente como tensioactivos. Los tensioactivos pueden encontrarse, por ejemplo en detergentes y jabones. Los acidos grasos tambien pueden usarse como aditivos en combustibles, aceites lubricantes, pinturas, lacas, velas, mantequilla, cosmeticos y emulsionantes. Ademas, los acidos grasos se usan como activadores aceleradores en productos de caucho. Los acidos grasos tambien pueden usarse como materia prima para producir esteres medicos, amidas, aminas, cloruros de acido, anhfdridos, dfmeros de ceteno, peroxiacidos y esteres.
Los esteres grasos tienen muchos usos comerciales. Por ejemplo, el biodiesel, un combustible alternativo, esta compuesto de esteres (por ejemplo, ester medico de acidos grasos (FAME), esteres edicos de acidos grasos (FAEE), etc.). Algunos esteres de bajo peso molecular son volatiles con un olor agradable que los hace utiles como fragancias o agentes saborizantes. Ademas, se usan esteres como disolventes para lacas, pinturas y barnices. Ademas, algunas sustancias que se producen de manera natural, tales como ceras, grasas y aceites estan compuestas de esteres. Tambien se usan esteres como agentes de ablandamiento en resinas y plasticos, plastificantes, retardadores de la llama y aditivos en gasolina y gasoil. Ademas, pueden usarse esteres en la fabricacion de polfmeros, pelmulas, materiales textiles, colorantes y productos farmaceuticos.
De manera similar, los alcoholes grasos tienen numerosos usos comerciales. Por ejemplo, las ventas anuales mundiales de alcoholes grasos y sus derivados superan 1000 millones de dolares estadounidenses. Los alcoholes grasos de cadena mas corta se usan en las industrias cosmetica y alimentaria como emulsionantes, emolientes y espesantes. Debido a su naturaleza anfffila, los alcoholes grasos se comportan como tensioactivos no ionicos, que son utiles en productos domesticos y de cuidado personal, por ejemplo, detergentes. Ademas, se usan alcoholes grasos en ceras, gomas, resinas, lociones farmaceuticas, aditivos de aceite lubricante, agentes de acabado y antiestaticos de textiles, plastificantes, cosmeticos, disolventes industriales y disolventes para grasas.
La acetil-CoA carboxilasa (ACC) desempena un papel importante en la regulacion de la smtesis y degradacion de acidos grasos. Es un complejo enzimatico dependiente de biotina que cataliza la primera etapa comprometida de la biosmtesis de acidos grasos, es decir, la carboxilacion irreversible de acetil-CoA para dar malonil-CoA. ACC produce malonil-CoA por medio de sus dos actividades catalfticas, es decir, biotina carboxilasa (BC) y carboxiltransferasa (CT). En la mayona de los procariotas, ACC es una enzima de multiples subunidades que incluye cuatro polipeptidos (subunidades), codificados por distintos genes cuya expresion coordinada se controla a traves de multiples niveles de regulacion (Cronan et al. (2002) Progress in Lipid Research 41:407-435; James et al. (2004) Journal of Biological Chemistry 279(4):2520-2527). Los cuatro polipeptidos de ACC se ensamblan para dar un complejo a una razon fija (Broussard et al. (2013) Structure 21:650-657). Mas espedficamente, la reaccion de ACC requiere cuatro protemas, es decir, biotina carboxilasa (BC), protema transportadora de biotinoflo (o biotina) carboxilo (BCCP), y dos protemas que forman la carboxiltransferasa (CT). La reaccion de ACC global puede someterse a ensayo mediante la conversion dependiente de ATP del NaH14CO3 labil a acidos en el acido malonico estable en acidos. Hay similitudes y diferencias entre las subunidades de ACC de bacterias y plastidos vegetales. Pero a pesar de la complejidad de las protemas vegetales, las secuencias que son esenciales para la actividad de ACC no son significativamente
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diferentes de los homologos bacterianos (Cronan et al., anteriormente).
Se ha notificado que la ACC de E. coli es la menos estable de las enzimas ACC conocidas. La actividad global puede medirse solo cuando las cuatro subunidades estan presentes a altas concentraciones, aunque pueden medirse dos reacciones parciales en disoluciones de protema diluidas. Se cree que los complejos estables son el complejo BC y el complejo CT alfa2 beta2. La BCCP de longitud completa se ha purificado como un d^ero y hay pistas de la presencia de un complejo BC2-BCCP2 inestable. Otras ACC bacterianas parecen mas estables que la de E. coli y la actividad de ACC puede medirse en extractos diluidos de Helicobacter pylori y Pseudomonas citronellolis. Ademas, las ACC de plastidos vegetales parecen mas estables que las ACC de E. coli. Sin embargo, como en E. coli, la purificacion adicional de la enzima intacta da como resultado la disociacion y perdida de la actividad de ACC que puede restaurarse mezclando fracciones que contienen las actividades de reaccion parciales. Los subcomplejos son BC-BCCP y CT sin evidencias de BCCP intacta libre o CT beta libre, lo que sugiere que BCCP y CT beta se degradan cuando estan libres en disolucion (Cronan et al., anteriormente). Chapman-Smith et al. (J. Biol. Chem., 1999, vol. 274(3), pags. 1449-1457) describen la mutagenesis C-terminal del dominio de biotina de BCCP de E. coli. Choi-Rhee et al. (J. Biol. Chem., 2O03, vol. 278(33), pags. 30806-812) describen el efecto de deleciones dentro del extremo N-terminal de BCCP sobre la formacion del complejo BC-BCCP y notifican que la region N-terminal de BCCP es responsable de la interaccion de BCCP con BC.
La identificacion de los genes de ACC de E. coli incluyendo accA, accB, accC y accD ha facilitado el estudio de las protemas ACC. Se han usado selecciones suicidas de radiacion para aislar mutantes en smtesis de acidos grasos incluyendo en genes accB y accD que codifican para las subunidades de ACC BCCP y CT beta, respectivamente. El mutante de accB se ha estudiado mas extensamente y la mutacion G133S es responsable del crecimiento sensible a la temperatura. Esta mutacion da como resultado un choque esterico dentro del dominio de biotinoflo. Esta protema mutante resultante se desnaturaliza facilmente a temperaturas superiores y es por tanto sensible a proteasas intracelulares. La cepa de BCCP mutante tiene solo aproximadamente el 25 por ciento del nivel normal de BCCP cuando se hace crecer a 30°C, aunque las tasas de crecimiento y smtesis de acidos grasos son normales (Cronan et al., anteriormente). Sin embargo, se sabe que el aumento de la concentracion de las cuatro protemas de ACC puede mejorar el flujo a traves de la biosmtesis de acidos grasos hasta un determinado grado (Davis et al. (2000) Journal of Biological Chemistry 275(37):28593-28598). A la inversa, se ha mostrado que la ACC de E. coli puede inhibirse por derivados acilados de ACP mientras que ACP que carece de un resto acilo no puede inhibir ACC (Davies et al. (2001) Journal of Bacteriology 183(4): 1499-1503).
Hay una necesidad de rutas alternativas para crear tanto combustibles como productos actualmente derivados del petroleo. Como tales, los sistemas microbianos ofrecen el potencial para la produccion biologica de numerosos tipos de biocombustibles y productos qmmicos. Pueden derivarse productos qmmicos y combustibles renovables de organismos modificados por ingeniena genetica (tales como bacterias, levaduras y algas). Pueden alterarse geneticamente rutas de biosmtesis que se producen de manera natural para permitir que los organismos modificados por ingeniena genetica sinteticen productos qmmicos y combustible renovables. Ademas, pueden adaptarse microbios, o modificarse metabolicamente, para que utilicen diversas fuentes de carbono como materia prima para la produccion de productos qmmicos y combustible. Por tanto, sena deseable modificar por ingeniena genetica una ACC para producir niveles superiores de compuestos derivados de malonilo (por ejemplo, esteres grasos, alcoholes grasos y otros derivados de acidos grasos asf como compuestos distintos de acidos grasos) cuando se expresan en una celula huesped recombinante.
A pesar de los avances en el campo, sigue habiendo la necesidad de mejoras en enzimas modificadas geneticamente, celulas huesped recombinantes, metodos y sistemas con el fin de lograr una produccion robusta y rentable de productos qmmicos y combustibles a traves de la fermentacion de celulas huesped recombinantes. La presente divulgacion aborda esta necesidad proporcionando variantes de ACC que aumentan el rendimiento y tttulo de compuestos derivados de malonilo.
Sumario
Un aspecto de la divulgacion se refiere a una protema portadora de biotina carboxilo (BCCP) variante que tiene al menos una mutacion en su secuencia de aminoacidos. En un aspecto particular, la divulgacion se refiere a una protema portadora de biotina carboxilo (BCCP) variante que comprende al menos una mutacion en su secuencia de aminoacidos, en la que la BCCP variante tiene una secuencia de polipeptido de uno cualquiera o mas de los siguientes numeros de identificacion de secuencia incluyendo SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88 y 90. En un aspecto, la BCCP variante confiere a una celula una produccion aumentada de un compuesto derivado de malonil-CoA en comparacion con una celula silvestre correspondiente. En otro aspecto, la BCCP variante puede conferir actividad acetil-CoA carboxilasa (ACC) mejorada cuando se expresa en una celula, dando como resultado una produccion aumentada de un compuesto derivado de malonil-CoA en comparacion con una celula silvestre correspondiente. El compuesto derivado de malonil-CoA incluye, pero no se limita a, un derivado de acido graso tal como un acido graso libre, un ester metflico de acidos grasos (FAME), un ester etflico de acidos grasos (FAEE), un alcohol graso, una amina grasa, un derivado de beta-hidroxiacido graso, un derivado de acido graso bifuncional (por ejemplo, o-hidroxiacido graso, o-hidroxidiol, o-hidroxi-FAME, o-hidroxi-FAEE), un derivado de acido graso insaturado, asf como un compuesto no basado en acidos grasos tal como una flavanona y/o un flavonoide, un
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policetido y acido 3-hidroxipropionico.
Otro aspecto de la divulgacion se refiere a una variante de una protema portadora de biotina carboxilo (BCCP) que tiene al menos una mutacion en su secuencia de aminoacidos, en la que la mutacion es en la region de aminoacidos N-terminal. En un aspecto, la mutacion es en el aminoacido de la posicion 2 de SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, la BCCP variante confiere a una celula una produccion aumentada de un compuesto derivado de malonil-CoA en comparacion con una celula silvestre correspondiente. En otra realizacion, la BCCP variante puede conferir actividad acetil-CoA carboxilasa (ACC) mejorada cuando se expresa en una celula, dando como resultado una produccion aumentada de un compuesto derivado de malonil-CoA en comparacion con una celula silvestre correspondiente.
Otro aspecto de la divulgacion se refiere a una variante de una protema portadora de biotina carboxilo (BCCP) que tiene al menos una mutacion en su secuencia de aminoacidos, en la que la BCCP variante se selecciona de SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88 y/o 90. En un aspecto, la BCCP variante confiere a una celula una produccion aumentada de un compuesto derivado de malonil-CoA en comparacion con una celula silvestre correspondiente. En otro aspecto, la BCCP variante puede conferir actividad acetil-CoA carboxilasa (ACC) mejorada cuando se expresa en una celula, dando como resultado una produccion aumentada de un compuesto derivado de malonil-CoA en comparacion con una celula silvestre correspondiente.
Todavfa otro aspecto de la divulgacion se refiere a una BCCP variante que esta codificada por una secuencia genetica o de acido nucleico de accB variante, en la que la secuencia de acido nucleico se selecciona de SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87 y/o 89.
Otro aspecto de la divulgacion se refiere a una celula recombinante o microorganismo recombinante que expresa una BCCP variante, en la que la BCCP variante tiene al menos una mutacion en su secuencia de aminoacidos. En un aspecto, la celula es una celula huesped. En otro aspecto, la celula es una celula microbiana o celula huesped microbiana. En otro aspecto, el microorganismo es una celula microbiana o celula huesped microbiana o un microbio. En un aspecto, la mutacion esta en la region de aminoacidos N-terminal. En otro aspecto, la mutacion esta en la posicion de aminoacido 2 de SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, la mutacion es una sustitucion. En diversos aspectos, la sustitucion es aspartato (D) a asparagina (N); o aspartato (D) a histidina (H); o aspartato (D) a isoleucina (I); o aspartato (D) a treonina (T); o aspartato (D) a serina (S); o aspartato (D) a tirosina (Y); o aspartato (D) a arginina (R); o aspartato (D) a leucina (L); o aspartato (D) a glutamina (Q); o aspartato (D) a glutamato (G). En otro aspecto, la BCCP variante tiene SEQ ID NO: 6 que abarca un polipeptido con una mutacion que incluye una sustitucion de aspartato (D) a asparagina (N). En otro aspecto, la BCCp variante tiene SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 8 que abarca un polipeptido con una mutacion que incluye una sustitucion de aspartato (D) a histidina (H). En otro aspecto, la BCCP variante tiene SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 12 que abarca un polipeptido con una mutacion que incluye una sustitucion de aspartato (D) a isoleucina (I). En un aspecto, la BCCP variante tiene al menos una mutacion en su secuencia de aminoacidos y confiere a una celula recombinante una produccion aumentada de un compuesto derivado de malonil-CoA en comparacion con una celula silvestre correspondiente. En otro aspecto, la BCCP variante tiene al menos una mutacion en su secuencia de aminoacidos y puede conferir actividad acetil-CoA carboxilasa (ACC) mejorada a una celula recombinante, dando como resultado una produccion aumentada de un compuesto derivado de malonil-CoA en comparacion con una celula silvestre correspondiente. En otro aspecto, la celula es un microorganismo recombinante o celula huesped recombinante que puede contrastarse con o compararse con un microorganismo silvestre o celula huesped silvestre. En otro aspecto, la celula es de naturaleza microbiana.
Aun otro aspecto de la divulgacion se refiere a un metodo de produccion de un compuesto derivado de malonil-CoA, que incluye cultivar una celula que expresa una BCCP variante en un caldo de fermentacion que contiene una fuente de carbono. El compuesto derivado de malonil-CoA incluye un derivado de acido graso, tal como, por ejemplo, un acido graso, un ester metflico de acidos grasos (FAME), un ester etflico de acidos grasos (FAEE), un alcohol graso, una amina grasa, un derivado de beta-hidroxiacido graso, un derivado de acido graso bifuncional (por ejemplo, o- hidroxiacidos grasos, o-hidroxidioles, o-hidroxi-FAME, o-hidroxi-FAEE), un derivado de acido graso insaturado, asf como un compuesto no basado en acidos grasos tal como una flavanona y/o un flavonoide, un policetido y acido 3- hidroxipropionico. En un aspecto, la celula es un microorganismo recombinante o celula huesped recombinante que puede contrastarse con o compararse con un microorganismo silvestre o celula huesped silvestre, respectivamente. En otro aspecto, la celula es de naturaleza microbiana.
La divulgacion contempla ademas un operon variante que controla la expresion de una BCCP. En un aspecto, el operon da como resultado un cambio en la expresion de BCCP en una celula recombinante en comparacion con una celula silvestre. En un aspecto, la celula es una celula huesped microbiana recombinante o microorganismo recombinante en comparacion con una celula huesped microbiana silvestre o microorganismo silvestre, respectivamente. En otro aspecto, el operon da como resultado un aumento en la expresion de BCCP en una celula recombinante y de ese modo mejora la actividad acetil-CoA carboxilasa (ACC) en la celula recombinante, dando como resultado una produccion aumentada de un compuesto derivado de malonil-CoA en comparacion con una celula silvestre correspondiente. En un aspecto, el operon variante incluye ademas un promotor. El promotor incluye, pero no se limita a, un promotor heterologo, una variante de promotor heterologo y un promotor sintetico. En un
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aspecto, el promotor incluye un promotor de accBC modificado geneticamente, un promotor de E. coli que se produce de manera natural o una variante de promotor de E. coli. En otro aspecto, el promotor es una variante de promotor de accBC. En otro aspecto, el promotor es un promotor T5 o una variante de promotor T5. En un aspecto, el promotor es un promotor T5 de accBC. En otro aspecto, el promotor T5 de accBC se selecciona de SEQ ID NO: 93, 94, 95 o 96 o variaciones de las mismas.
La divulgacion se refiere ademas a un microorganismo recombinante o celula huesped que abarca un operon variante que controla la expresion de una BCCP. En un aspecto, el operon da como resultado un cambio en la expresion de BCCP. En un aspecto, el operon da como resultado un aumento en la expresion de BCCP en una celula recombinante, y de ese modo mejora la actividad acetil-CoA carboxilasa (ACC) en la celula recombinante, dando como resultado una produccion aumentada de un compuesto derivado de malonil-CoA en comparacion con una celula silvestre correspondiente. En otro aspecto, el operon variante incluye ademas un promotor.
Otro aspecto de la divulgacion se refiere a un metodo de produccion de un compuesto derivado de malonil-CoA, que incluye cultivar un microorganismo o celula huesped que expresa un operon variante en un caldo de fermentacion que contiene una fuente de carbono. En un aspecto, la celula es un microorganismo recombinante o celula huesped recombinante que puede contrastarse con o compararse con un microorganismo silvestre o celula huesped silvestre, respectivamente. En otro aspecto, la celula es de naturaleza microbiana. El compuesto derivado de malonil-CoA incluye un acido graso, un ester metilico de acidos grasos (FAME), un ester etflico de acidos grasos (FAEE), un alcohol graso, una amina grasa, un derivado de beta-hidroxiacido graso, un derivado de acido graso bifuncional (por ejemplo, o-hidroxiacidos grasos, o-hidroxidioles, o-hidroxi-FAME, o-hidroxi-FAEE), un derivado de acido graso insaturado, asf como un compuesto no basado en acidos grasos tal como una flavanona y/o un flavonoide, un policetido y acido 3-hidroxipropionico.
Todavfa otro aspecto de la divulgacion se refiere a un metodo de produccion de un compuesto derivado de malonil- CoA, que incluye cultivar una celula huesped que expresa una BCCP variante y un operon variante en un caldo de fermentacion que contiene una fuente de carbono. En un aspecto, la celula es un microorganismo recombinante o celula huesped recombinante que puede contrastarse con o compararse con un microorganismo silvestre o celula huesped silvestre, respectivamente. En otro aspecto, la celula es de naturaleza microbiana. El compuesto derivado de malonil-CoA incluye un acido graso, un ester metflico de acidos grasos (FAME), un ester etflico de acidos grasos (FAEE), un alcohol graso, una amina grasa, un derivado de beta-hidroxiacido graso, un derivado de acido graso bifuncional (incluyendo o-hidroxiacidos grasos, o-hidroxidioles, o-hidroxi-FAME, o-hidroxi-FAEE), un derivado de acido graso insaturado, asf como un compuesto no basado en acidos grasos tal como una flavanona y/o un flavonoide, un policetido y acido 3-hidroxipropionico.
La divulgacion contempla ademas un microorganismo que abarca una protema portadora de biotina carboxilo (BCCP) variante que tiene al menos una mutacion en su secuencia de aminoacidos. La BCCP variante tiene una mutacion en una region de aminoacidos N-terminal. La mutacion es una sustitucion. En diversas realizaciones, la sustitucion es aspartato (D) a asparagina (N); o aspartato (D) a histidina (H); o aspartato (D) a isoleucina (I); o aspartato (D) a treonina (T); o aspartato (D) a serina (S); o aspartato (D) a tirosina (Y); o aspartato (D) a arginina (R); o aspartato (D) a leucina (L); o aspartato (D) a glutamina (Q); o aspartato (D) a glutamato (G). En otra realizacion, la BCCP variante tiene una o mas mutaciones, incluyendo sustituciones de aspartato (D) a asparagina (N); aspartato (D) a histidina (H); aspartato (D) a isoleucina (I); aspartato (D) a treonina (T); aspartato (D) a serina (S); aspartato (D) a tirosina (Y); aspartato (D) a arginina (R); aspartato (D) a leucina (L); aspartato (D) a glutamina (Q); y/o aspartato (D) a glutamato (G). En otra realizacion, la BCCP variante tiene SEQ ID NO: 6 que abarca un polipeptido con una mutacion que incluye una sustitucion de aspartato (D) a asparagina (N). En otra realizacion, la BCCP variante tiene SEQ ID NO: 4 o sEq ID NO: 8 que abarca un polipeptido con una mutacion que incluye una sustitucion de aspartato (D) a histidina (H). En otra realizacion, la BCCP variante tiene SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 12 que abarca un polipeptido con una mutacion que incluye una sustitucion de aspartato (D) a isoleucina (I). En otra realizacion, la expresion de la BCCP variante confiere una produccion aumentada de un compuesto derivado de malonil-CoA al microorganismo. En otra realizacion, la expresion de la BCCP variante puede conferir actividad acetil-CoA carboxilasa (ACC) mejorada en el microorganismo, dando como resultado una produccion aumentada de un compuesto derivado de malonil-CoA por el microorganismo. El compuesto derivado de malonil-CoA incluye, pero no se limita a, un acido graso, un ester metflico de acidos grasos (FAME), un ester etflico de acidos grasos (FAEE), un alcohol graso, una amina grasa, un derivado de beta-hidroxiacido graso, un derivado de acido graso bifuncional, un derivado de acido graso insaturado, una flavanona, un flavonoide, un policetido y acido 3-hidroxipropionico. En una realizacion, el compuesto derivado de malonil-CoA es un FAME o un FAEE. En otra realizacion, el compuesto derivado de malonil-CoA es un alcohol graso. En otra realizacion, el microorganismo es una celula microbiana. En aun otra realizacion, la celula microbiana es una celula recombinante. Los ejemplos de celulas microbianas incluyen, pero no se limitan a, celulas de los generos Escherichia, Bacillus, Cyanophyta, Lactobacillus, Zymomonas, Rhodococcus, Pseudomonas, Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, Fusarium, Humicola, Rhizomucor, Kluyveromyces, Pichia, Mucor, Myceliophtora, Penicillium, Phanerochaete, Pleurotus, Trametes, Chrysosporium, Saccharomyces, Stenotrophomonas, Schizosaccharomyces, Yarrowia y Streptomyces. En una realizacion, la celula microbiana es del genero Escherichia. En una realizacion, la celula microbiana es de Escherichia coli. En otra realizacion, la celula microbiana es de una cianobacteria o el Cyanophyta. En otra realizacion, la celula microbiana es de una cianobacteria o Cyanophyta incluyendo, pero sin limitarse a, Prochlorococcus, Synechococcus,
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Synechocystis, Cyanothece y Nostoc punctiforme. En otra realizacion, la celula microbiana es de una especie de cianobacteria espedfica incluyendo, pero sin limitarse a, Synechococcus elongatus PCC7942, Synechocystis sp. PCC6803 y Synechococcus sp. PCC7001.
Otro aspecto de la divulgacion se refiere a un microorganismo recombinante que tiene una expresion alterada de una secuencia de acido nucleico que incluye accB o accC o una combinacion de los mismos, dando como resultado una produccion alterada de un compuesto derivado de malonil-CoA por el microorganismo. En un aspecto, la expresion alterada es expresion aumentada. En otro aspecto, la expresion alterada es expresion disminuida. En aun otro aspecto, la expresion alterada se debe a un cambio en uno o mas promotores que dirigen la expresion de la secuencia de acido nucleico. La secuencia de acido nucleico de accB codifica para BCCP. En un aspecto, la secuencia de acido nucleico variante de accB codifica para la BCCP variante. En un aspecto, el compuesto derivado de malonil-CoA incluye, pero no se limita a, un acido graso, un ester metilico de acidos grasos (FAME), un ester etflico de acidos grasos (FAEE), un alcohol graso, una amina grasa, un derivado de beta-hidroxiacido graso, un derivado de acido graso bifuncional, un derivado de acido graso insaturado, una flavanona, un flavonoide, un policetido y acido 3-hidroxipropionico. En un aspecto, el microorganismo incluye, pero no se limita a, microorganismos del genero Escherichia, Bacillus, Cyanophyta, Lactobacillus, Zymomonas, Rhodococcus, Pseudomonas, Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, Fusarium, Humicola, Rhizomucor, Kluyveromyces, Pichia, Mucor, Myceliophtora, Penicillium, Phanerochaete, Pleurotus, Trametes, Chrysosporium, Saccharomyces, Stenotrophomonas, Schizosaccharomyces, Yarrowia o Streptomyces. En un aspecto, la celula microbiana es del genero Escherichia. En un aspecto, la celula microbiana es de Escherichia coli. En otro aspecto, la celula microbiana es de una cianobacteria o el genero Cyanophyta. En todavfa otro aspecto, el microorganismo es una cianobacteria o Cyanophyta de Prochlorococcus, Synechococcus, Synechocystis, Cyanothece o Nostoc punctiforme. En un aspecto, el microorganismo es una especie de cianobacteria de Synechococcus elongatus PCC7942, Synechocystis sp. PCC6803 o Synechococcus sp. PCC7001.
Otro aspecto de la divulgacion se refiere a un microorganismo o celula huesped que tiene una expresion alterada de una variante de ACC y expresa ademas una protema de biosmtesis de acidos grasos. En un aspecto, la celula huesped es una celula microbiana. En otro aspecto, la celula huesped es una celula recombinante. En aun otro aspecto, la celula huesped es una celula bacteriana recombinante. En otra realizacion, la variante de ACC es una protema portadora de biotina carboxilo (BCCP) o una biotina carboxilasa (BC) o una combinacion de las mismas. En un aspecto, la expresion alterada es expresion aumentada o disminuida. En un aspecto, la expresion alterada es expresion aumentada, en la que la expresion aumentada da como resultado una produccion aumentada de un compuesto derivado de malonil-CoA cuando la celula microbiana se cultiva con una fuente de carbono.
En determinadas realizaciones de la presente divulgacion, la celula huesped puede expresar ademas una protema de biosmtesis que tiene actividad enzimatica que puede aumentar la produccion de derivados de acidos grasos. En una realizacion, la protema con actividad enzimatica puede estar presente de manera nativa en la celula huesped y su gen puede sobreexpresarse por medio de un promotor u otra alteracion genetica. En otra realizacion, la protema con actividad enzimatica puede ser el resultado de un gen exogeno o heterologo que se expresa en la celula huesped. Los ejemplos de tales actividades enzimaticas incluyen, pero no se limitan a, actividad tioesterasa (E.C. 3.1.2.* o E.C. 3.1.2.14 o E.C. 3.1.1.5), actividad ester sintasa (E.C. 2.3.1.75), actividad acil-ACP reductasa (AAR) (E.C. 1.2.1.80), actividad alcohol deshidrogenasa (E.C. 1.1.1.1.), actividad alcohol graso acil-CoA reductasa (FAR) (E.C. 1.1.1.*), actividad acido carboxflico reductasa (CAR) (EC 1.2.99.6), actividad descarbonilasa o desformilasa, actividad acil-CoA reductasa (E.C. 1.2.1.50), actividad acil-CoA sintasa (FadD) (E.C. 2.3.1.86), actividad OleA y actividad OleBCD.
En todavfa otro aspecto, la divulgacion se refiere a un microorganismo o celula huesped que tiene una expresion alterada de una variante de ACC y expresa ademas una protema de biosmtesis de acidos grasos, en el que la expresion alterada es expresion aumentada que da como resultado una produccion aumentada de un compuesto derivado de malonil-CoA cuando la celula se cultiva con una fuente de carbono. En un aspecto, la celula huesped es una celula microbiana. En otro aspecto, la celula huesped es una celula recombinante. En aun otro aspecto, la celula huesped es una celula bacteriana recombinante. En todavfa otro aspecto, el microorganismo o celula huesped es una celula recombinante que puede compararse con o contrastarse con una celula silvestre en las mismas condiciones. En el presente documento el compuesto derivado de malonil-CoA incluye, pero no se limita a, un acido graso, un ester metflico de acidos grasos (FAME), un ester etflico de acidos grasos (FAEE), un alcohol graso, una amina grasa, un derivado de beta-hidroxiacido graso, un derivado de acido graso bifuncional, un derivado de acido graso insaturado, una flavanona, un flavonoide, un policetido y acido 3-hidroxipropionico. En un aspecto, la celula microbiana se selecciona de celulas del genero Escherichia, Bacillus, Cyanophyta, Lactobacillus, Zymomonas, Rhodococcus, Pseudomonas, Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, Fusarium, Humicola, Rhizomucor, Kluyveromyces, Pichia, Mucor, Myceliophtora, Penicillium, Phanerochaete, Pleurotus, Trametes, Chrysosporium, Saccharomyces, Stenotrophomonas, Schizosaccharomyces, Yarrowia o Streptomyces.
Otro aspecto de la divulgacion proporciona una protema portadora de biotina carboxilo (BCCP) variante que tiene SEQ ID NO: 6. En una realizacion, la mutacion esta en una region de aminoacidos N-terminal con una sustitucion de aspartato (D) a asparagina (N), en la que la sustitucion esta en la posicion de aminoacido 2. En otra realizacion, la BCCP variante esta codificada por un gen accB variante, en la que el gen accB variante tiene una secuencia de acido nucleico de SEQ ID NO: 5. Otro aspecto de la divulgacion proporciona una protema portadora de biotina
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carboxilo (BCCP) variante que tiene SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 8. En una realizacion, la mutacion esta en una region de aminoacidos N-terminal con una sustitucion de aspartato (D) a histidina (H), en la que la sustitucion esta en la posicion de aminoacido 2. En otra realizacion, la BCCP variante esta codificada por un gen accB variante, en la que el gen accB variante tiene una secuencia de acido nucleico de SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 7, respectivamente. Otro aspecto de la divulgacion proporciona una protema portadora de biotina carboxilo (BCCP) variante que tiene SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 12. En una realizacion, la mutacion esta en una region de aminoacidos N-terminal con una sustitucion de aspartato (D) a isoleucina (I), en la que la sustitucion esta en la posicion de aminoacido 2. En otra realizacion, la BCCP variante esta codificada por un gen accB variante, en la que el gen accB variante tiene una secuencia de acido nucleico de SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 11, respectivamente.
En diversas realizaciones, las BCCP variantes confieren a una celula recombinante una produccion aumentada de un compuesto derivado de malonil-CoA en comparacion con una celula silvestre correspondiente, en la que dicho compuesto derivado de malonil-CoA incluye un derivado de acido graso de un acido graso, un ester metilico de acidos grasos (FAME), un ester etflico de acidos grasos (FAEE), un alcohol graso, una amina grasa, un derivado de beta-hidroxiacido graso, un derivado de acido graso bifuncional y un derivado de acido graso insaturado; o un compuesto distinto de acidos grasos tal como una flavanona, un flavonoide, un policetido y acido 3-hidroxipropionico. La presente divulgacion abarca ademas microorganismos recombinantes que incluyen o expresan las BCCP variantes. En una realizacion, los microorganismos se seleccionan de microorganismos del genero Escherichia, Bacillus, Cyanophyta, Lactobacillus, Zymomonas, Rhodococcus, Pseudomonas, Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, Fusarium, Humicola, Rhizomucor, Kluyveromyces, Pichia, Mucor, Myceliophtora, Penicillium, Phanerochaete, Pleurotus, Trametes, Chrysosporium, Saccharomyces, Stenotrophomonas, Schizosaccharomyces, Yarrowia o Streptomyces.
Se contempla ademas un metodo de produccion de un compuesto derivado de malonil-CoA, que incluye cultivar el microorganismo recombinante que expresa la BCCP variante en un caldo de fermentacion que contiene una fuente de carbono. El compuesto derivado de malonilo producido mediante este metodo incluye un derivado de acido graso que incluye un acido graso, un ester metilico de acidos grasos (FAME), un ester etflico de acidos grasos (FAEE), un alcohol graso, una amina grasa, un derivado de beta-hidroxiacido graso, un derivado de acido graso bifuncional y un derivado de acido graso insaturado; o un compuesto distinto de acidos grasos tal como una flavanona, un flavonoide, un policetido y acido 3-hidroxipropionico.
Breve descripcion de las figuras
La presente divulgacion se entiende mejor cuando se lee junto con las figuras adjuntas, que sirven para ilustrar las realizaciones preferidas. Sin embargo, se entiende que la divulgacion no se limita a las realizaciones espedficas dadas a conocer en las figuras.
La figura 1 es un esquema de un aspecto de una ruta bioqmmica modificada por ingeniena genetica que implica variantes de acetil-CoA carboxilasa (ACC) tales como una protema portadora de biotina carboxilo (BCCP) variante. Tal como se representa, BCCP puede conferir actividad acetil-CoA carboxilasa (ACC) mejorada cuando se expresa en una celula. Esto puede conducir a una produccion aumentada de malonil-CoA y acil-ACP, lo que a su vez puede conducir a una produccion aumentada de compuestos derivados de malonil-CoA, incluyendo, por ejemplo, derivados de acidos grasos tales como esteres grasos, aldetndos grasos, alcoholes grasos, acidos grasos y otros derivados de acidos grasos.
La figura 2 representa una alineacion de siete secuencias de aminoacidos de BCCP de siete especies diferentes. El area en el recuadro muestra un motivo que se conserva a traves de la mayona de las especies de BCCP.
La figura 3 es un esquema de otro aspecto de una ruta bioqmmica modificada por ingeniena genetica que implica variantes de acetil-CoA carboxilasa (ACC) tales como una protema portadora de biotina carboxilo (BCCP) variante. Tal como se representa, BCCP puede conferir actividad acetil-CoA carboxilasa (ACC) mejorada cuando se expresa en una celula. Esto puede conducir a una produccion aumentada de malonil-CoA y acil-CoA, lo que a su vez puede conducir a una produccion aumentada de compuestos derivados de malonil-CoA, incluyendo, por ejemplo, derivados de acidos grasos tales como esteres grasos, aldetndos grasos, alcoholes grasos, acidos grasos y otros derivados de acidos grasos.
La figura 4 es un resumen de varios aspectos de una ruta bioqmmica modificada por ingeniena genetica que implica variantes de acetil-CoA carboxilasa (ACC) tales como una protema portadora de biotina carboxilo (BCCP) variante. Tal como se muestra, BCCP puede conferir actividad acetil-CoA carboxilasa (ACC) mejorada cuando se expresa en una celula. Esto puede conducir a una produccion aumentada de malonil-CoA y compuestos derivados de malonil- CoA, incluyendo policetidos, acido 3-hidroxipropionico (3-HP), flavanonas y flavonoides asf como productos intermedios aumentados tales como, por ejemplo, acil-CoA aumentada (vease tambien la figura 3); acil-ACP aumentada (vease tambien la figura 1); asf como malonato (o acido malonico) aumentado. Los productos intermedios aumentados pueden conducir ademas a productos finales aumentados tales como derivados de acidos grasos, incluyendo acidos grasos, esteres grasos, aldetndos grasos, alcoholes grasos y otros derivados de acidos grasos.
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La figura 5 muestra un grafico que representa el tftulo de FAS (FAME) como resultado de expresar diversas variantes de BCCP (en la posicion 2 del gen accB) en celulas huesped de E. coli. WT es el control para el complejo de ACC silvestre. Algunas de estas variantes de BCCP mejoraron el tftulo de FAS mas de 5 veces (vease tambien la tabla 1).
Descripcion detallada
Vision general
La divulgacion se refiere a variante(s) de ACC o polipeptido(s) de acetil-CoA carboxilasa (ACC) variante(s) que puede(n) expresarse en un microorganismo. Estas variantes de ACC estan alteradas geneticamente y se cree que confieren actividad enzimatica mejorada para la produccion aumentada de compuestos derivados de malonil-CoA incluyendo derivados de acidos grasos. En el presente documento, la divulgacion se refiere a polipeptido(s) y protema(s) que puede(n) conducir a actividad acetil-CoA carboxilasa (ACC) mejorada cuando se expresa(n) en una celula huesped, en comparacion con la actividad de ACC correspondiente en una celula silvestre. Con el fin de ilustrar esto, se alteraron genes de ACC introduciendo mutaciones en un gen de ACC asf como un operon de ACC. Ambas de estas alteraciones pueden aumentar independientemente la produccion de derivados de acidos grasos en una celula huesped. Se espera que estas mutaciones mejoren el tftulo y rendimiento de un producto derivado de malonil-CoA, incluyendo pero sin limitarse a, compuestos derivados de acidos grasos (es decir, derivados de acidos grasos) tales como, por ejemplo, acidos grasos, esteres grasos, alcoholes grasos, aldehfdos grasos, aminas grasas, derivados de acidos grasos bifuncionales y compuestos no basados en acidos grasos tales como, por ejemplo, flavanonas y flavonoides, policetidos y acido 3-hidroxipropionico. Ejemplos de esteres grasos son esteres metflicos de acidos grasos (FAME) y esteres etflicos de acidos grasos (FAEE). Los ejemplos de derivados de acidos grasos bifuncionales incluyen, pero no se limitan a, o-hidroxiacidos grasos, o-hidroxidioles, o-hidroxi-FAME y o-hidroxi- FAEE.
Se ha estipulado que, con el fin de producir rendimientos superiores de compuestos derivados de malonil-CoA, se requiere la expresion aumentada de los cuatro genes de ACC que codifican para el complejo de ACC completo (Davis et al. (2000) anteriormente). Sin embargo, la presente divulgacion revela el hallazgo sorprendente de que las mutaciones seleccionadas como diana en solo un gen de ACC pueden mejorar la produccion de compuestos que se derivan de malonil-CoA, incluyendo derivados de acidos grasos. Por ejemplo, mutaciones seleccionadas como diana en el gen accB y/o cambios de expresion seleccionados como diana en el operon de accBC mejoraron significativamente la produccion de esteres grasos en hasta el 630 por ciento (vease la figura 5 asf como la tabla 1 y los ejemplos, mas adelante). Sin querer restringirse a la teona, se cree que variantes de ACC o polipeptidos de ACC variantes confieren directa o indirectamente a complejos de ACC actividad enzimatica mejorada que conduce a una produccion superior de compuestos derivados de malonil-CoA en celulas huesped. Se cree que la actividad de la celula huesped aumenta, dando como resultado de ese modo produccion aumentada de compuestos derivados de malonil-CoA. Tales compuestos derivados de malonil-CoA incluyen derivados de acidos grasos y compuestos no basados en acidos grasos.
Definiciones
Tal como se usa en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “una” y “el/la” incluyen referentes en plural a menos que el contexto dicte claramente otra cosa. Por tanto, por ejemplo, la referencia a “una celula huesped” incluye dos o mas de tales celulas huesped, la referencia a “un ester graso” incluye uno o mas esteres grasos, o mezclas de esteres, la referencia a “una secuencia de acido nucleico” incluye una o mas secuencias de acido nucleico, la referencia a “una enzima” incluye una o mas enzimas, y similares.
Los numeros de registro de secuencias en la totalidad de esta descripcion se obtuvieron de bases de datos proporcionadas por el NCBI (Centro Nacional para la Informacion Biotecnologica) mantenidas por los Institutos Nacionales de Salud, EE.UU. (que se identifican en el presente documento como “numeros de registro de NCBI” o alternativamente como “numeros de registro de GenBank” o alternativamente o simplemente como “numeros de registro”), y de las bases de datos UniProt Knowledgebase (UniProtKB) y Swiss-Prot proporcionadas por el Instituto Suizo de Bioinformatica (que se identifican en el presente documento como “numeros de registro de UniProtKB”).
Los numeros de clasificacion de enzimas (EC) se establecen por el Comite de Nomenclatura de la Union Internacional de Bioqmmica y Biologfa Molecular (IUBMB), cuya descripcion esta disponible en el sitio web de Nomenclatura de Enzimas del IUBMB en Internet. Los numeros EC clasifican las enzimas segun la reaccion que catalizan. Por ejemplo, la actividad enzimatica acetil-CoA carboxilasa (ACC) se clasifica bajo E.C. 6.4.I.2. ACC es un complejo enzimatico de multiples subunidades presente en la mayona de los procariotas y en los cloroplastos de la mayona de las plantas y algas. ACC cataliza la reaccion de ATP y acetil-CoA y HCO3- para dar ADP y fosfato y malonil-CoA. La funcionalidad de ACC se conserva en la mayona de los procariotas desde una especie hasta la siguiente. Por tanto, diferentes especies microbianas pueden llevar a cabo la misma actividad enzimatica acetil-CoA carboxilasa (ACC) que se clasifica bajo E.C. 6.4.1.2.
Tal como se usa en el presente documento, el termino “nucleotido” se refiere a una unidad monomerica de un polinucleotido que consiste en una base heterodclica, un azucar y uno o mas grupos fosfato. Las bases que se
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producen de manera natural (guanina, (G), adenina, (A), citosina, (C), timina, (T) y uracilo (U)) son normalmente derivados de purina o pirimidina, aunque debe entenderse que tambien estan incluidos analogos de bases que se producen de manera natural y no natural. El azucar que se produce de manera natural es la pentosa (azucar de cinco carbonos), la desoxirribosa (que forma ADN) o la ribosa (que forma ARN), aunque debe entenderse que tambien estan incluidos analogos de azucares que se producen de manera natural y no natural. Los acidos nucleicos se unen normalmente mediante enlaces fosfato para formar acidos nucleicos o polinucleotidos, aunque se conocen en la tecnica muchas otras uniones (por ejemplo, fosforotioatos, boranofosfatos, y similares).
El termino “polinucleotido” se refiere a un polfmero de ribonucleotidos (ARN) o desoxirribonucleotidos (ADN), que puede ser monocatenario o bicatenario y que puede contener nucleotidos no naturales o alterados. Los terminos “polinucleotido”, “secuencia de acido nucleico” y “secuencia de nucleotidos” se usan de manera intercambiable en el presente documento para referirse a una forma polimerica de nucleotidos de cualquier longitud, o bien ARN o bien ADN. Estos terminos se refieren a la estructura primaria de la molecula, y por tanto incluyen ADN bi y monocatenario y ARN bi y monocatenario. Los terminos incluyen, como equivalentes, analogos de o bien aRn o bien ADN producidos a partir de analogos de nucleotidos y polinucleotidos modificados tales como, aunque no limitados a polinucleotidos metilados y/o de extremos ocupados. El polinucleotido puede estar en cualquier forma, incluyendo pero sin limitarse a, plasmido, viral, cromosomico, EST, ADNc, ARNm y ARNr.
Tal como se usa en el presente documento, los terminos “polipeptido” y “protema” se usan de manera intercambiable para referirse a un polfmero de residuos de aminoacido. El termino “polipeptido recombinante” se refiere a un polipeptido que se produce mediante tecnicas recombinantes, en las que generalmente se inserta ADN o ARN que codifica para la protema expresada en un vector de expresion adecuado que se usa a su vez para transformar una celula huesped para producir el polipeptido. Tambien puede insertarse ADN o ARN que codifica para la protema expresada en el cromosoma huesped por medio de recombinacion homologa u otros medios conocidos en la tecnica, y se usa de ese modo para transformar una celula huesped para producir el polipeptido. De manera similar, los terminos “polinucleotido recombinante” o “acido nucleico recombinante” o “ADN recombinante” se producen por tecnicas recombinantes que conocen los expertos en la tecnica.
Tal como se usan en el presente documento, los terminos “homologo” y “homologo/a” se refieren a un polinucleotido o un polipeptido que comprende una secuencia que es identica en al menos aproximadamente el 50 por ciento (%) a la secuencia de polinucleotido o polipeptido correspondiente. Preferiblemente, los polinucleotidos o polipeptidos homologos tienen secuencias de polinucleotido o secuencias de aminoacidos que tienen una homologfa de al menos aproximadamente el 80%, el 81%, el 82%, el 83%, el 84%, el 85%, el 86%, el 87%, el 88%, el 89%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o al menos aproximadamente el 99% con la secuencia de aminoacidos o secuencia de polinucleotido correspondiente. Tal como se usa en el presente documento los terminos “homologfa” de secuencia e “identidad” de secuencia se usan de manera intercambiable.
Un experto habitual en la tecnica conoce metodos para determinar la homologfa entre dos o mas secuencias. Brevemente, pueden realizarse calculos de “homoiogfa” entre dos secuencias de la siguiente manera. Las secuencias se alinean para fines de comparacion optima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en una o ambas de una primera y una segunda secuencias de aminoacidos o de acido nucleico para la alineacion optima y pueden excluirse las secuencias no homologas para fines de comparacion). En una realizacion preferida, la longitud de una primera secuencia que se alinea para fines de comparacion es de al menos aproximadamente el 30%, preferiblemente al menos aproximadamente el 40%, mas preferiblemente al menos aproximadamente el 50%, incluso mas preferiblemente al menos aproximadamente el 60%, e incluso mas preferiblemente al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 98% o aproximadamente el 100% de la longitud de una segunda secuencia. Se comparan entonces los residuos de aminoacido o nucleotidos en posiciones de aminoacido o posiciones de nucleotido correspondientes de las secuencias primera y segunda. Cuando una posicion en la primera secuencia esta ocupada por el mismo residuo de aminoacido o nucleotido que la posicion correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moleculas son identicas en esa posicion. El tanto por ciento de homologfa entre las dos secuencias es una funcion del numero de posiciones identicas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el numero de huecos y la longitud de cada hueco, que es necesario introducir para la alineacion optima de las dos secuencias. La comparacion de secuencias y determinacion del tanto por ciento de homologfa entre dos secuencias puede lograrse usando un algoritmo matematico, tal como BlAsT (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215(3):403-4l0). El tanto por ciento de homologfa entre dos secuencias de aminoacidos tambien puede determinarse usando el algoritmo de Needleman y Wunsch que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete de software de GCG, usando o bien una matriz Blossum 62 o bien una matriz PAM250, y un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6 (Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:444-453). El tanto por ciento de homologfa entre dos secuencias de nucleotidos tambien puede determinarse usando el programa GAP en el paquete de software de GCG, usando una matriz NWSgapdna.CMP y un peso de hueco de 40, 50, 60, 70 u 80 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. Un experto habitual en la tecnica puede realizar calculos de homologfa inicial y ajustar los parametros del algoritmo en consecuencia. Un conjunto preferido de parametros (y el que debe usarse si un profesional no esta seguro de que parametros deben aplicarse para determinar si una molecula esta dentro de una limitacion de homologfa de las reivindicaciones) son una matriz de puntuacion Blossum 62 con una penalizacion por hueco de 12, penalizacion por extension de hueco de 4 y penalizacion por hueco con desplazamiento del marco de lectura de 5. Se conocen
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metodos adicionales de alineacion de secuencias en las tecnicas biotecnologicas (veanse, por ejemplo, Rosenberg (2005) BMC Bioinformatics 6:278; Altschul et al. (2005) FEBS J. 272(20):5101-5109).
El termino “se hibrida en condiciones de rigurosidad baja, rigurosidad media, rigurosidad alta o condiciones de rigurosidad muy alta” describe condiciones para la hibridacion y el lavado. Puede encontrarse orientacion para realizar reacciones de hibridacion en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1 - 6.3.6. Se describen metodos acuosos y no acuosos en esa referencia y puede usarse cualquier metodo. Condiciones de hibridacion espedficas a las que se hace referencia en el presente documento son de la siguiente manera: (1) condiciones de hibridacion de rigurosidad baja -- 6X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45°C, seguido por dos lavados en 0,2X SSC, SDS al 0,1% al menos a 50°C (la temperatura de los lavados puede aumentarse hasta 55°C para condiciones de rigurosidad baja); (2) condiciones de hibridacion de rigurosidad media -- 6X SSC a aproximadamente 45°C, seguido por uno o mas lavados en 0,2X SSC, SDS al 0,1% a 60°C; (3) condiciones de hibridacion de rigurosidad alta -- 6X SSC a aproximadamente 45°C, seguido por uno o mas lavados en 0,2X SSC, SDS al 0,1% a 65°C; y (4) condiciones de hibridacion de rigurosidad muy alta -- fosfato de sodio 0,5 M, 7% SDS a 65°C, seguido por uno o mas lavados a 0,2X SSC, SDS al 1% a 65°C. Las condiciones de rigurosidad muy alta (4) son las condiciones preferidas a menos que se especifique de otro modo.
Un polipeptido “endogeno” se refiere a un polipeptido codificado por el genoma de la celula parental (o “celula huesped”). Un polipeptido “exogeno” se refiere a un polipeptido que no esta codificado por el genoma de la celula parental. Un polipeptido variante o mutante es un ejemplo de un polipeptido exogeno. Por tanto, una molecula de acido nucleico que no se produce de manera natural se considera que es exogena con respecto a una celula una vez introducida en la celula. Una molecula de acido nucleico que se produce de manera natural tambien puede ser exogena con respecto a una celula particular. Por ejemplo, toda la secuencia codificante aislada de la celula X es un acido nucleico exogeno con respecto a la celula Y una vez que la secuencia codificante se introduce en la celula Y, incluso si X y Y son el mismo tipo de celula.
El termino “sobreexpresado” significa que se provoca que un gen se transcriba a una tasa elevada en comparacion con la tasa de transcripcion endogena para ese gen. En algunos ejemplos, sobreexpresion incluye adicionalmente una tasa elevada de traduccion del gen en comparacion con la tasa de traduccion endogena para ese gen. Se conocen bien en la tecnica metodos para someter a prueba la sobreexpresion, por ejemplo los niveles de ARN transcrito pueden evaluarse usando rtPCR y los niveles de protema pueden evaluarse usando analisis en gel de SDS page.
El termino “heterologo” significa derivado de un organismo diferente, un tipo de celula diferente o una especie diferente. Tal como se usa en el presente documento se refiere a una secuencia de nucleotidos, polinucleotido, polipeptido o protema, no presente de manera natural en un organismo dado. Por ejemplo, una secuencia de polinucleotido que es nativa para una cianobacteria puede introducirse en una celula huesped de E. coli mediante metodos recombinantes, y el polinucleotido de la cianobacteria es entonces heterologo con respecto a la celula de E. coli (por ejemplo, celula recombinante). El termino “heterologo” tambien puede usarse con referencia a una secuencia de nucleotidos, polinucleotido, polipeptido o protema que esta presente en una celula huesped recombinante en un estado no nativo. Por ejemplo, una secuencia de nucleotidos, polinucleotido, polipeptido o protema “heterologa” puede modificarse en relacion con la secuencia silvestre presente de manera natural en la celula huesped silvestre correspondiente, por ejemplo, una modificacion en el nivel de expresion o en la secuencia de un nucleotido, polinucleotido, polipeptido o protema.
Tal como se usa en el presente documento, el termino “fragmento” de un polipeptido se refiere a una parte mas corta de un polipeptido o una protema de longitud completa cuyo tamano oscila entre dos residuos de aminoacido y toda la secuencia de aminoacidos menos un residuo de aminoacido. En determinadas realizaciones de la divulgacion, un fragmento se refiere a toda la secuencia de aminoacidos de un dominio de un polipeptido o una protema (por ejemplo, un dominio de union a sustrato o un dominio catalttico).
El termino “mutagenesis” se refiere a un procedimiento mediante el cual se cambia la informacion genetica de un organismo de manera estable. La mutagenesis de una secuencia de acido nucleico que codifica para protema produce una protema mutante. Mutagenesis tambien se refiere a cambios en secuencias de acido nucleico no codificantes que dan como resultado actividad de protema modificada.
Una “mutacion”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un cambio permanente en una posicion de acido nucleico de un gen o en una posicion de aminoacido de un polipeptido o protema. Las mutaciones incluyen sustituciones, adiciones, inserciones y deleciones. Por ejemplo, una mutacion en una posicion de aminoacido puede ser una sustitucion de un tipo de aminoacido por otro tipo de aminoacido (por ejemplo, puede sustituirse un aspartato (D) por una tirosina (Y); puede sustituirse una lisina (L) por una treonina (T); etc.). Como tal, un polipeptido o una protema puede tener una o mas mutaciones en las que un aminoacido se sustituye por otro aminoacido. Por ejemplo, una protema o polipeptido relacionado con ACC puede tener una o mas mutaciones en su secuencia de aminoacidos.
Tal como se usa en el presente documento, el termino “gen” se refiere a secuencias de acido nucleico que codifican para o bien un producto de ARN o bien un producto de protema, asf como secuencias de acido nucleico
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operativamente unidas que afectan a la expresion del ARN o la protema (por ejemplo, tales secuencias incluyen pero no se limitan a secuencias promotoras o potenciadoras) o secuencias de acido nucleico operativamente unidas que codifican para secuencias que afectan a la expresion del ARN o la protema (por ejemplo, tales secuencias incluyen pero no se limitan a sitios de union al ribosoma o secuencias de control de la traduccion).
Se conocen en la tecnica secuencias de control de la expresion e incluyen, por ejemplo, promotores, potenciadores, senales de poliadenilacion, terminadores de la transcripcion, sitios internos de entrada al ribosoma (IRES), y similares, que proporcionan la expresion de la secuencia de polinucleotido en una celula huesped. Las secuencias de control de la expresion interaccionan espedficamente con protemas celulares implicadas en la transcripcion (Maniatis et al. (1987) Science 236:1237-1245 (1987)). Se describen secuencias de control de la expresion a modo de ejemplo, por ejemplo, en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, vol. 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). En los metodos de la divulgacion, una secuencia de control de la expresion esta operativamente unida a una secuencia de polinucleotido. Por “operativamente unida” quiere decirse que una secuencia de polinucleotido y una(s) secuencia(s) de control de la expresion se conectan de tal manera que se permita la expresion genica cuando se unen las moleculas apropiadas (por ejemplo, protemas activadoras de la transcripcion) a la(s) secuencia(s) de control de la expresion. Estan ubicados promotores operativamente unidos en el sentido de 5' de la secuencia de polinucleotido seleccionada en cuanto a la direccion de transcripcion y traduccion. Pueden estar ubicados potenciadores operativamente unidos en el sentido de 5', dentro de o en el sentido de 3' del polinucleotido seleccionado.
Tal como se usa en el presente documento, el termino “vector” se refiere a una molecula de acido nucleico que puede transportar otro acido nucleico, es decir, una secuencia de polinucleotido, a la que se ha unido. Un tipo de vector util es un episoma (es decir, un acido nucleico que puede dar replicacion extracromosomica). Los vectores utiles son aquellos que pueden dar replicacion y/o expresion autonoma de acidos nucleicos a los que se unen. Los vectores que pueden dirigir la expresion de genes a los que se unen operativamente se denominan en el presente documento “vectores de expresion”. En general, los vectores de expresion de utilidad en tecnicas de ADN recombinante estan a menudo en forma de “plasmidos”, que se refieren en general a bucles de ADN bicatenario circular que, en su forma de vector, no se unen al cromosoma. Los terminos “plasmido” y “vector” se usan de manera intercambiable en el presente documento, en la medida en que un plasmido es la forma mas comunmente usada de vector. Sin embargo, tambien se incluyen otras de tales formas de vectores de expresion que sirven para funciones equivalentes y que se han conocido en la tecnica posteriormente al presente documento. En algunas realizaciones, un vector recombinante incluye ademas un promotor operativamente unido a la secuencia de polinucleotido. En algunas realizaciones, el promotor es un promotor regulado por el desarrollo, uno espedfico de organulo, uno espedfico de tejido, uno inducible, uno constitutivo o uno espedfico de celula. El vector recombinante comprende normalmente al menos una secuencia seleccionada de una secuencia de control de la expresion acoplada operativamente a la secuencia de polinucleotido; un marcador de seleccion acoplado operativamente a la secuencia de polinucleotido; una secuencia de marcador acoplada operativamente a la secuencia de polinucleotido; un resto de purificacion acoplado operativamente a la secuencia de polinucleotido; una secuencia de secrecion acoplada operativamente a la secuencia de polinucleotido; y una secuencia de direccionamiento acoplada operativamente a la secuencia de polinucleotido. En determinadas realizaciones, la secuencia de nucleotidos se incorpora de manera estable en el ADN genomico de la celula huesped, y la expresion de la secuencia de nucleotidos esta bajo el control de una region promotora regulada. Los vectores de expresion descritos en el presente documento incluyen una secuencia de polinucleotido descrita en el presente documento en una forma adecuada para la expresion de la secuencia de polinucleotido en una celula huesped. Los expertos en la tecnica apreciaran que el diseno del vector de expresion puede depender de factores tales como la eleccion de la celula huesped que va transformarse, el nivel de expresion de polipeptido deseado, etc. Los vectores de expresion descritos en el presente documento pueden introducirse en celulas huesped para producir polipeptidos, incluyendo polipeptidos de fusion, codificados por las secuencias de polinucleotido tal como se describe en el presente documento.
Los terminos “celula recombinante” y “celula huesped recombinante” se usan de manera intercambiable en el presente documento y se refieren a una celula que puede expresar una variante de ACC y/o abarca un operon variante que puede aumentar la actividad espedfica de la celula recombinante para producir compuestos derivados de malonil-CoA. Una celula recombinante puede derivarse de un microorganismo tal como una bacteria, un virus o un hongo. Ademas, una celula recombinante puede derivarse de una celula vegetal o animal. La celula recombinante puede usarse para producir uno o mas derivados de acidos grasos incluyendo, pero sin limitarse a, acidos grasos, esteres grasos (por ejemplo, ceras, esteres de acidos grasos, esteres grasos, esteres medicos de acidos grasos (FAME), esteres edicos de acidos grasos (FAEE)), alcoholes grasos, alcoholes de cadena corta y larga, aldeddos grasos, hidrocarburos, aminas grasas, olefinas terminales, olefinas internas, cetonas, derivados de acidos grasos bifuncionales (por ejemplo, o-hidroxiacidos grasos, o-hidroxidioles, o-hidroxi-FAME, o-hidroxi-FAEE); asf como compuestos distintos de acidos grasos tales como flavanonas, flavonoides, policetidos y acido 3- hidroxipropionico. En algunas realizaciones, la celula recombinante incluye uno o mas polinucleotidos, codificando cada polinucleotido para un polipeptido que tiene actividad enzimatica de biosmtesis de acidos grasos, en la que la celula recombinante produce una composicion de derivados de acidos grasos cuando se cultiva en presencia de una fuente de carbono en condiciones eficaces para expresar los polinucleotidos.
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Tal como se usa en el presente documento, el termino “microorganismo” se refiere a un organismo microscopico. Ejemplos de un microorganismo son una bacteria, un virus o un hongo. En una realizacion, un microorganismo es una celula bacteriana. En otra realizacion, un microorganismo es una celula procariota o procariotica. En aun otra realizacion, un microorganismo es una celula fungica tal como una celula de levadura. En otra realizacion, un microorganismo es una celula viral. En una realizacion relacionada, un “microorganismo recombinante” es un microorganismo que se ha alterado geneticamente y expresa o abarca una secuencia de acido nucleico exogena y/o heterologa.
Tal como se usa en el presente documento, “acil-ACP” se refiere a un acil-tioester formado entre el carbono de carbonilo de una cadena de alquilo y el grupo sulfhidrilo del resto fosfopanteteinilo de una protema transportadora de acilo (ACP). El resto fosfopanteteinilo se une de manera postraduccional a un residuo de serina conservado en la ACP mediante la accion de la protema transportadora de holo-acilo sintasa (ACPS), una fosfopanteteinilo transferasa. En algunas realizaciones, una acil-ACP es un producto intermedio en la smtesis de acil-ACP totalmente saturadas. En otras realizaciones, una acil-ACP es un producto intermedio en la smtesis de acil-ACP insaturadas. En algunas realizaciones, la cadena de carbonos tendra aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o 26 carbonos. Cada una de estas acil-ACP son sustratos para enzimas que las convierten en derivados de acido graso.
El termino “compuesto derivado de malonil-CoA” incluye cualquier compuesto o entidad qmmica (es decir, producto intermedio o producto final) que se produce por medio de una ruta bioqmmica, en el que el malonil-CoA funciona como producto intermedio y/o se produce aguas arriba del compuesto o entidad qmmica (por ejemplo, vease la figura 4). Por ejemplo, un compuesto derivado de malonil-CoA incluye, pero no se limita a, un derivado de acido graso tal como, por ejemplo, un acido graso; un ester graso incluyendo, pero sin limitarse a un ester metflico de acidos grasos (FAME) y/o un ester etflico de acidos grasos (FAEE); un alcohol graso; un aldetudo graso; una amina grasa; un alcano; una olefina o alqueno; un hidrocarburo; un derivado de beta-hidroxiacido graso, un derivado de acido graso bifuncional y un derivado de acido graso insaturado. Un compuesto derivado de malonil-CoA incluye ademas, pero no se limita a, un compuesto distinto de acidos grasos tal como, por ejemplo, una flavanona, un flavonoide, un policetido, malonato y acido 3-hidroxipropionico.
El termino “acido graso” significa un acido carboxflico que tiene la formula RCOOH. R representa un grupo alifatico, preferiblemente un grupo alquilo. R puede comprender entre aproximadamente 4 y aproximadamente 22 atomos de carbono. Los acidos grasos pueden tener una cadena ramificada o cadena lineal y pueden estar saturados, monoinsaturados o poliinsaturados.
Un “derivado de acido graso” es un producto producido en parte a partir de la ruta de biosmtesis de acidos grasos del organismo de produccion huesped. Los “derivados de acidos grasos” incluyen productos producidos a partir de compuestos derivados de malonil-CoA incluyendo acil-ACP o derivados de acil-ACP. Los derivados de acidos grasos a modo de ejemplo incluyen acidos grasos, esteres grasos (por ejemplo, ceras, esteres de acidos grasos, esteres grasos, esteres metflicos de acidos grasos (FAME), esteres etflicos de acidos grasos (FAEE)), aminas grasas, aldetudos grasos, alcoholes grasos, alcoholes de cadena corta y larga, hidrocarburos, cetonas, olefinas terminales, olefinas internas, cetonas, derivados de beta-hidroxiacidos grasos, derivados de acidos grasos bifuncionales (por ejemplo, o-hidroxiacidos grasos, o-hidroxidioles, o-hidroxi-FAME, o-OH FAEE), y derivados de acidos grasos insaturados. Los “derivados de acidos grasos” tambien incluyen productos producidos a partir de compuestos derivados de malonil-CoA tales como acil-CoA o derivados de acil-CoA.
Una “composicion de derivados de acidos grasos” tal como se denomina en el presente documento se produce por una celula huesped recombinante y normalmente incluye una mezcla de derivados de acidos grasos. En algunos casos, la mezcla incluye mas de un tipo de producto de derivado de acido graso (por ejemplo, acidos grasos, esteres grasos, alcoholes grasos, aldehfdos grasos, amina grasa, derivados de acidos grasos bifuncionales, etc.). En otros casos, una composicion de derivados de acidos grasos puede incluir, por ejemplo, una mezcla de esteres grasos (u otro derivado de acido graso) con diferentes longitudes de cadena, caractensticas de saturacion y/o ramificacion. En todavfa otros casos, la composicion de derivados de acidos grasos puede comprender tanto una mezcla de mas de
un tipo de producto de derivado de acido graso como derivados de acidos grasos con diferentes longitudes de
cadena, caractensticas de saturacion y/o ramificacion. En aun otros casos, una composicion de derivados de acidos grasos puede incluir, por ejemplo, una mezcla de esteres grasos y beta-hidroxiesteres. En todavfa otros casos, una composicion de derivados de acidos grasos puede incluir, por ejemplo, una mezcla de alcoholes grasos y aldehfdos grasos. En todavfa otros casos, una composicion de derivados de acidos grasos puede incluir, por ejemplo, una mezcla de FAME y/o FAEE.
Los terminos “protema portadora de biotina carboxilo (BCCP) variante” y “variante de protema portadora de biotina carboxilo (BCCP)” se usan de manera intercambiable en el presente documento y se refieren a una variante de ACC que tiene una o mas mutaciones en su secuencia de aminoacidos. En un ejemplo, la secuencia de aminoacidos oscila entre 1 (es decir, la metionina (M) inicial basandose en el sitio de iniciacion ATG) y 156. Una variante de BCCP de este tipo puede tener una o mas mutaciones en la posicion de aminoacido 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42,
43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73,
74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102,
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126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148,
149, 150, 151, 152, 153, 154, 155 y/o 156. En una realizacion, las mutaciones incluyen mutaciones en la region de
aminoacidos N-terminal que oscila entre aproximadamente la posicion 1 y aproximadamente la posicion 60. En una
realizacion, las mutaciones incluyen mutaciones en la posicion de aminoacido 2 (justo despues del codon de iniciacion).
El termino “la expresion confiere a (o da como resultado) una celula recombinante con una produccion aumentada de un compuesto derivado de malonil-CoA en comparacion con una celula silvestre correspondiente” se refiere a la funcion de una protema o un polipeptido relacionado con ACC que tiene una o mas mutaciones en su secuencia de aminoacidos (es decir, una variante de ACC o un mutante de ACC) y provoca en una celula una produccion mejorada de compuesto(s) derivado(s) de malonil-CoA cuando se expresa en esa celula, en comparacion con una celula silvestre que no expresa la variante o el mutante de ACC. Tambien se refiere a la funcion de una variante de ACC que, cuando se expresa en una celula, tiene el efecto de provocar una actividad espedfica superior de la celula en la produccion de compuesto(s) derivado(s) de malonil-CoA. Sin querer restringirse a la teona, esto puede ser el resultado de provocar directa o indirectamente una actividad enzimatica (E.C. 6.4.1.2) acetil-CoA carboxilasa (ACC) superior en la celula. Esto puede medirse comparando el tftulo y/o rendimiento de un compuesto derivado de malonil-CoA producido por la celula que expresa la variante de ACC con el tftulo y/o rendimiento de un compuesto derivado de malonil-CoA producido por una celula silvestre correspondiente (es decir, una celula que no expresa la variante de ACC). Los expertos en la tecnica apreciaran que los metodos para la medicion estan facilmente disponibles, incluyendo, por ejemplo, cromatograffa de gases con detector de ionizacion de llama (CG-FID) y otros. Un ejemplo de una protema variante de ACC es una variante de protema portadora de biotina carboxilo (BCCP). La(s) variante(s) de ACC puede(n) abarcar mutaciones en una y/o dos de cualquiera de las cuatro subunidades del complejo de ACC. La(s) variante(s) de ACC puede(n) abarcar cambios en la concentracion en cualquiera de una y/o dos de las cuatro subunidades. Cuando una celula se ha transformado con una variante de ACC es una celula que expresa la variante de ACC (por ejemplo, una celula recombinante). En una realizacion, el tftulo y/o rendimiento de un compuesto derivado de malonil-CoA producido por una celula que expresa la variante de ACC es al menos dos veces el de una celula silvestre correspondiente (es decir, una celula correspondiente que no expresa la variante de ACC). En otra realizacion, el tftulo y/o rendimiento de un compuesto derivado de malonil-CoA producido por una celula que expresa la variante de ACC es al menos aproximadamente 1 vez, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al
menos aproximadamente 6 veces, al menos aproximadamente 7 veces, al menos aproximadamente 8 veces, al
menos aproximadamente 9 veces o al menos aproximadamente 10 veces mayor que el de una celula silvestre
correspondiente. En una realizacion, el tftulo y/o rendimiento de un compuesto derivado de malonil-CoA producido por una celula que expresa la variante de ACC es al menos aproximadamente el 1 por ciento, al menos aproximadamente el 2 por ciento, al menos aproximadamente el 3 por ciento, al menos aproximadamente el 4 por ciento, al menos aproximadamente el 5 por ciento, al menos aproximadamente el 6 por ciento, al menos aproximadamente el 7 por ciento, al menos aproximadamente el 8 por ciento, al menos aproximadamente el 9 por ciento o aproximadamente el 10 por ciento mayor que el de una celula silvestre correspondiente. En otra realizacion, el tftulo y/o rendimiento debido a la expresion de una variante de ACC es al menos aproximadamente el 20 por ciento a al menos aproximadamente el 100 por ciento mayor que el del complejo de ACC silvestre. En una realizacion, el tftulo y/o rendimiento de un compuesto derivado de malonil-CoA producido por una celula es al menos aproximadamente el 20 por ciento, al menos aproximadamente el 25 por ciento, al menos aproximadamente el 30 por ciento, al menos aproximadamente el 35 por ciento, al menos aproximadamente el 40 por ciento, al menos aproximadamente el 45 por ciento, al menos aproximadamente el 50 por ciento, al menos aproximadamente el 55 por ciento, al menos aproximadamente el 60 por ciento, al menos aproximadamente el 65 por ciento, al menos aproximadamente el 70 por ciento, al menos aproximadamente el 75 por ciento, al menos aproximadamente el 80 por ciento, al menos aproximadamente el 85 por ciento, al menos aproximadamente el 90 por ciento, al menos aproximadamente el 95 por ciento, al menos aproximadamente el 97 por ciento, al menos aproximadamente el 98 por ciento o al menos aproximadamente el 100 por ciento mayor que el de la celula silvestre correspondiente. En otra realizacion, el tftulo y/o rendimiento de un compuesto derivado de malonil-CoA producido por una celula es al menos aproximadamente el 200 por ciento, al menos aproximadamente el 250 por ciento, al menos
aproximadamente el 300 por ciento, al menos aproximadamente el 350 por ciento, al menos aproximadamente el 400 por ciento, al menos aproximadamente el 450 por ciento, al menos aproximadamente el 500 por ciento, al menos aproximadamente el 550 por ciento, al menos aproximadamente el 600 por ciento, al menos
aproximadamente el 610, el 620, el 630, el 640 o el 650 por ciento, al menos aproximadamente el 700 por ciento, al
menos aproximadamente el 750 por ciento, al menos aproximadamente el 800 por ciento o al menos
aproximadamente el 850 por ciento mayor que el de la celula silvestre correspondiente.
Tal como se usa en el presente documento, el termino “ruta de biosmtesis de acidos grasos” significa una ruta de biosmtesis que produce derivados de acidos grasos. La ruta de biosmtesis de acidos grasos puede incluir enzimas adicionales para producir derivados de acidos grasos que tienen caractensticas deseadas.
Tal como se usa en el presente documento, “ester graso” significa un ester que tiene la formula RCOOR'. Un ester graso tal como se denomina en el presente documento puede ser cualquier ester producido a partir de un acido graso, por ejemplo un ester de acido graso. En algunas realizaciones, el grupo R tiene al menos 5, al menos 6, al
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menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18 o al menos 19 carbonos de longitud. Alternativamente, o ademas, el grupo R tiene 20 o menos, 19 o menos, 18 o menos, 17 o menos, 16 o menos, 15 o menos, 14 o menos, 13 o menos, 12 o menos, 11 o menos, 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos o 6 o menos carbonos de longitud. Por tanto, el grupo R puede tener un grupo R delimitado por dos cualesquiera de los extremos anteriores. Por ejemplo, el grupo R puede tener 6-16 carbonos de longitud, 10-14 carbonos de longitud o 12-18 carbonos de longitud. En algunas realizaciones, la composicion de esteres grasos comprende uno o mas de un ester graso C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23, C24, C25 y C26. En otras realizaciones, la composicion de esteres grasos incluye uno o mas de un ester graso C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17 y C18. En todavfa otras realizaciones, la composicion de esteres grasos incluye esteres grasos C12, C14, C16 y C18; esteres grasos C12, C14 y C16; esteres grasos C14, C16 y C18; o esteres grasos C12 y C14.
El grupo R de un derivado de acido graso, por ejemplo un ester graso, puede ser una cadena lineal o una cadena ramificada. Las cadenas ramificadas pueden tener mas de un punto de ramificacion y pueden incluir ramificaciones cmlicas. En algunas realizaciones, el acido graso ramificado, aldehfdo graso ramificado o ester graso ramificado es un acido graso ramificado, aldehfdo graso ramificado o ester graso ramificado C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23, C24, C25 o C26. En determinadas realizaciones, el acido graso ramificado, aldehfdo graso ramificado o ester graso ramificado es un acido graso ramificado o ester graso ramificado C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17 o C18. Un ester graso de la presente divulgacion puede decirse que contiene un lado A y un lado B. Tal como se usa en el presente documento, un “lado A” de un ester se refiere a la cadena de carbonos unida al oxfgeno de carboxilato del ester. Tal como se usa en el presente documento, un “lado B” de un ester se refiere a la cadena de carbonos que comprende el carboxilato original del ester. Cuando el ester graso se deriva de la ruta de biosmtesis de acidos grasos, al lado A contribuye normalmente un alcohol, y al lado B contribuye un acido graso.
Puede usarse cualquier alcohol para formar el lado A de los esteres grasos. Por ejemplo, el alcohol puede derivarse de la ruta de biosmtesis de acidos grasos, tal como las descritas en el presente documento. Alternativamente, el alcohol puede producirse a traves de rutas que no son de biosmtesis de acidos grasos. Ademas, el alcohol puede proporcionarse de manera exogena. Por ejemplo, el alcohol puede suministrarse en el caldo de fermentacion en casos en los que el ester graso se produce por un organismo. Alternativamente, un acido carboxflico, tal como un acido graso o acido acetico, puede suministrarse de manera exogena en casos en los que el ester graso se produce por un organismo que tambien puede producir alcohol.
Las cadenas de carbonos que comprenden el lado A o lado B del ester pueden ser de cualquier longitud. En una realizacion, el lado A del ester tiene al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12, 14, 16 o 18 carbonos de longitud. Cuando el ester graso es un ester metflico de acidos grasos, el lado A del ester tiene 1 carbono de longitud. Cuando el ester graso es un ester etflico de acidos grasos, el lado A del ester tiene 2 carbonos de longitud. El lado B del ester puede tener al menos aproximadamente 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26 carbonos de longitud. El lado A y/o el lado B pueden ser de cadena lineal o ramificada. Las cadenas ramificadas pueden tener uno o mas puntos de ramificacion. Ademas, las cadenas ramificadas pueden incluir ramificaciones dclicas. Ademas, el lado A y/o lado B puede estar saturado o insaturado. Si esta insaturado, el lado A y/o lado B puede tener uno o mas puntos de insaturacion. Ademas, no es necesario que el grupo alcohol de un ester graso producido segun la presente divulgacion este en la posicion primaria (CI). En una realizacion, el ester graso se produce de manera biosintetica. En esta realizacion, en primer lugar el acido graso se “activa”. Ejemplos no limitativos de acidos grasos “activados” son acil-CoA, acil ACP y acilfosfato. Acil-CoA puede ser un producto directo de la biosmtesis o degradacion de acidos grasos. Ademas, puede sintetizarse acil-CoA a partir de un acido graso libre, una CoA y un trifosfato de nucleotido de adenosina (ATP). Un ejemplo de una enzima que produce acil-CoA es acil-CoA sintasa.
En determinadas realizaciones, el derivado de acido graso ramificado es un derivado de iso-acido graso, por ejemplo un iso-ester graso, o un derivado de anteiso-acido graso, por ejemplo, un anteiso-ester graso. En realizaciones a modo de ejemplo, el derivado de acido graso ramificado se selecciona de ester graso ramificado iso-C7:0, iso-C8:0, iso-C9:0, iso-C10:0, iso-C11:0, iso-C12:0, iso-C13:0, iso-C14:0, iso-C15:0, iso-C16:0, iso-C17:0, iso-C18:0, iso- C19:0, anteiso-C7:0, anteiso-C8:0, anteiso-C9:0, anteiso-C10:0, anteiso-C11:0,anteiso-C12:0, anteiso-C13:0, anteiso-C14:0, anteiso-C15:0, anteiso-C16:0, anteiso-C17:0, anteiso-C18:0 y anteiso-C19:0.
El grupo R de un derivado de acido graso ramificado o no ramificado puede estar saturado o insaturado. Si esta insaturado, el grupo R puede tener uno o mas de un punto de insaturacion. En algunas realizaciones, el derivado de acido graso insaturado es un derivado de acido graso monoinsaturado. En determinadas realizaciones, el derivado de acido graso insaturado es un derivado de acido graso insaturado C6:1, C7:1, C8:1, C9:1, C10:1, C11:1, C12:1, C13:1, C14:1, C15:l, C16:1, C17:1, C18:1, C19:1, C20:1, C21:1, C22:1, C23:1, C24:1, C25:1 o C26:1. En determinadas realizaciones, el derivado de acido graso insaturado es un derivado de acido graso insaturado C10:1, C12:1, C14:1, C16:1 o C18:1. En otras realizaciones, el derivado de acido graso insaturado esta insaturado en la posicion omega-7. En determinadas realizaciones, el derivado de acido graso insaturado comprende un doble enlace en cis.
Tal como se usa en el presente documento, el termino “clon” se refiere normalmente a una celula o un grupo de celulas que descienden de y esencialmente identicas geneticamente a un unico ancestro comun, por ejemplo, las
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bacterias de una colonia bacteriana clonado surgida a partir de una unica celula bacteriana.
Tal como se usa en el presente documento, el termino “cultivo” se refiere normalmente a un medio ftquido que comprende celulas viables. En una realizacion, un cultivo comprende celulas que se reproducen en medios de cultivo predeterminados en condiciones controladas, por ejemplo, un cultivo de celulas huesped recombinantes hechas crecer en medios ftquidos que comprenden una fuente de carbono y nitrogeno seleccionada. “Cultivar” o “cultivo” se refieren al crecimiento de una poblacion de celulas de celulas huesped (por ejemplo, celulas huesped recombinantes) en condiciones adecuadas en un medio ftquido o solido. En determinadas realizaciones, cultivar se refiere a la bioconversion fermentativa de un sustrato en un producto final. Se conocen bien medios de cultivo y los componentes individuales de tales medios de cultivo estan disponibles de fuentes comerciales, por ejemplo, medios DIFCO™ y medios BBL™. En un ejemplo no limitativo, el medio de nutrientes acuoso es un “medio rico” que comprende fuentes complejas de nitrogeno, sales y carbono, tal como el medio YP, que comprende 10 g/l de peptona y 10 g/l de extracto de levadura de un medio de este tipo.
Tal como se usa en el presente documento, un “nivel modificado” o “alterado de” actividad de una protema, por ejemplo una enzima, en una celula huesped recombinante se refiere a una diferencia en una o mas caractensticas en la actividad determinadas con relacion a la celula huesped parental o nativa. Normalmente se determinan diferencias en actividad entre una celula huesped recombinante, que tiene actividad modificada, y la celula huesped silvestre correspondiente (por ejemplo, comparacion de un cultivo de una celula huesped recombinante con relacion a la celula huesped silvestre correspondiente). Actividades modificadas pueden ser el resultado de, por ejemplo, cantidades modificadas de protema expresada por una celula huesped recombinante (por ejemplo, como resultado de un aumento o una disminucion del numero de copias de secuencias de ADN que codifican para la protema, un aumento o una disminucion del numero de transcritos de ARNm que codifican para la protema, y/o un aumento o una disminucion de las cantidades de traduccion de protema de la protema a partir del ARNm); cambios en la estructura de la protema (por ejemplo, cambios en la estructura primaria, tales como cambios en la secuencia codificante de la protema que dan como resultado cambios en la especificidad de sustrato, cambios en parametros cineticos observados); y cambios en la estabilidad de la protema (por ejemplo, un aumento o una disminucion de la degradacion de la protema). En algunas realizaciones, el polipeptido es un mutante o una variante de cualquiera de los polipeptidos descritos en el presente documento, por ejemplo, una ACC variante incluyendo una BCCP variante. En determinados casos, las secuencias codificantes para los polipeptidos tal como se describe en el presente documento se someten a optimizacion de codones para la expresion en una celula huesped particular. Por ejemplo, para la expresion en E. coli, pueden optimizarse uno o mas codones (Grosjean et al. (1982) Gene 18:199-209).
El termino “secuencias reguladoras” tal como se usa en el presente documento se refiere normalmente a una secuencia de bases en ADN, operativamente unida a secuencias de ADN que codifican para una protema que controla en ultima instancia la expresion de la protema. Los ejemplos de secuencias reguladoras incluyen, pero no se limitan a, secuencias promotoras de ARN, secuencias de union a factor de transcripcion, secuencias de terminacion de la transcripcion, moduladores de la transcripcion (tales como elementos potenciadores), secuencias de nucleotidos que afectan a la estabilidad del ARN y secuencias reguladoras de la traduccion (tales como sitios de union al ribosoma (por ejemplo, secuencias de Shine-Dalgarno en procariotas o secuencias de Kozak en eucariotas), codones de iniciacion, codones de terminacion). Tal como se usa en el presente documento, la frase “la expresion de dicha secuencia de nucleotidos se modifica con relacion a la secuencia de nucleotidos silvestre”, significa un aumento o una disminucion en el nivel de expresion y/o actividad de una secuencia de nucleotidos endogena o la expresion y/o actividad de una secuencia de nucleotidos que codifica para polipeptido heterologo o no nativo. Los terminos “nivel alterado de expresion” y “nivel modificado de expresion” se usan de manera intercambiable y significan que esta presente un polinucleotido, polipeptido o hidrocarburo en una concentracion diferente en una celula huesped modificada por ingeniena genetica en comparacion con su concentracion en una celula silvestre correspondiente en las mismas condiciones. Tal como se usa en el presente documento, el termino “expresar” con respecto a un polinucleotido es provocar que funcione. Un polinucleotido que codifica para un polipeptido (o protema), cuando se expresa, se transcribira y traducira para producir ese polipeptido (o protema). Tal como se usa en el presente documento, el termino “sobreexpresar” significa expresar o provocar que se exprese un polinucleotido o polipeptido en una celula en una concentracion mayor de la que se expresa normalmente en una celula silvestre correspondiente en las mismas condiciones.
Tal como se usa en el presente documento, el termino “tftulo” se refiere a la cantidad de un compuesto derivado de malonil-CoA incluyendo un derivado de acido graso producido por volumen unitario del cultivo de celulas huesped. En cualquier aspecto de las composiciones y los metodos descritos en el presente documento, un derivado de acido graso u otro compuesto se produce a un tftulo de aproximadamente 25 mg/l, aproximadamente 50 mg/l,

aproximadamente 75 mg/l, aproximadamente 100 mg/l, aproximadamente 125 mg/l, aproximadamente 150 mg/l,

aproximadamente 175 mg/l, aproximadamente 200 mg/l, aproximadamente 225 mg/l, aproximadamente 250 mg/l,

aproximadamente 275 mg/l, aproximadamente 300 mg/l, aproximadamente 325 mg/l, aproximadamente 350 mg/l,

aproximadamente 375 mg/l, aproximadamente 400 mg/l, aproximadamente 425 mg/l, aproximadamente 450 mg/l,

aproximadamente 475 mg/l, aproximadamente 500 mg/l, aproximadamente 525 mg/l, aproximadamente 550 mg/l,

aproximadamente 575 mg/l, aproximadamente 600 mg/l, aproximadamente 625 mg/l, aproximadamente 650 mg/l,

aproximadamente 675 mg/l, aproximadamente 700 mg/l, aproximadamente 725 mg/l, aproximadamente 750 mg/l,

aproximadamente 775 mg/l, aproximadamente 800 mg/l, aproximadamente 825 mg/l, aproximadamente 850 mg/l,
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aproximadamente 875 mg/l, aproximadamente 900 mg/l, aproximadamente 925 mg/l, aproximadamente 950 mg/l, aproximadamente 975 mg/l, aproximadamente 1000 mg/l, aproximadamente 1050 mg/l, aproximadamente 1075 mg/l, aproximadamente 1100 mg/l, aproximadamente 1125 mg/l, aproximadamente 1150 mg/l,
aproximadamente 1175 mg/l, aproximadamente 1200 mg/l, aproximadamente 1225 mg/l, aproximadamente

1250 mg/l, aproximadamente 1275 mg/l, aproximadamente 1300 mg/l, aproximadamente 1325 mg/l,
aproximadamente 1350 mg/l, aproximadamente 1375 mg/l, aproximadamente 1400 mg/l, aproximadamente

1425 mg/l, aproximadamente 1450 mg/l, aproximadamente 1475 mg/l, aproximadamente 1500 mg/l,
aproximadamente 1525 mg/l, aproximadamente 1550 mg/l, aproximadamente 1575 mg/l, aproximadamente

1600 mg/l, aproximadamente 1625 mg/l, aproximadamente 1650 mg/l, aproximadamente 1675 mg/l,
aproximadamente 1700 mg/l, aproximadamente 1725 mg/l, aproximadamente 1750 mg/l, aproximadamente

1775 mg/l, aproximadamente 1800 mg/l, aproximadamente 1825 mg/l, aproximadamente 1850 mg/l,
aproximadamente 1875 mg/l, aproximadamente 1900 mg/l, aproximadamente 1925 mg/l, aproximadamente
1950 mg/l, aproximadamente 1975 mg/l, aproximadamente 2000 mg/l (2 g/l), 3 g/l, 5 g/l, 10 g/l, 20 g/l, 30 g/l, 40 g/l, 50 g/l, 60 g/l, 70 g/l, 80 g/l, 90 g/l, 100 g/l o un intervalo delimitado por dos cualesquiera de los valores anteriores. En otras realizaciones, un derivado de acido graso u otro compuesto se produce a un tftulo de mas de 100 g/l, mas de 200 g/l o mas de 300 g/l. Un tftulo preferido de derivado de acido graso u otro compuesto producido por una celula huesped recombinante segun los metodos de la divulgacion es de desde 5 g/l hasta 200 g/l, desde 10 g/l hasta 150 g/l, desde 20 g/l hasta 120 g/l y desde 30g/l hasta 100 g/l. El tftulo puede referirse a un derivado de acido graso particular o una combinacion de derivados de acidos grasos u otro compuesto o una combinacion de otros compuestos producidos por un cultivo de celulas huesped recombinantes dado. Por ejemplo, la expresion de una variante de ACC en una celula huesped recombinante tal como E. coli da como resultado la produccion de un tftulo superior en comparacion con una celula huesped recombinante que expresa el polipeptido silvestre correspondiente. En una realizacion, el tftulo superior oscila entre al menos aproximadamente 5 g/l y aproximadamente 200 g/l.
Tal como se usa en el presente documento, el “rendimiento de un compuesto derivado de malonil-CoA incluyendo derivados de acidos grasos u otros compuestos producidos por una celula huesped” se refiere a la eficacia con la cual una fuente de carbono de entrada se convierte en producto (es decir, un compuesto derivado de malonil-CoA incluyendo un derivado de acido graso y/u otros compuestos) en una celula huesped. Celulas huesped modificadas por ingeniena genetica para producir un compuesto derivado de malonil-CoA incluyendo un derivado de acido graso segun los metodos de la divulgacion tienen un rendimiento de al menos aproximadamente el 3%, al menos aproximadamente el 4%, al menos aproximadamente el 5%, al menos aproximadamente el 6%, al menos
aproximadamente el 7%, al menos aproximadamente el 8%, al menos aproximadamente el 9%, al menos
aproximadamente el 10%, al menos aproximadamente el 11%, al menos aproximadamente el 12%, al menos
aproximadamente el 13%, al menos aproximadamente el 14%, al menos aproximadamente el 15%, al menos
aproximadamente el 16%, al menos aproximadamente el 17%, al menos aproximadamente el 18%, al menos
aproximadamente el 19%, al menos aproximadamente el 20%, al menos aproximadamente el 21%, al menos
aproximadamente el 22%, al menos aproximadamente el 23%, al menos aproximadamente el 24%, al menos
aproximadamente el 25%, al menos aproximadamente el 26%, al menos aproximadamente el 27%, al menos
aproximadamente el 28%, al menos aproximadamente el 29% o al menos aproximadamente el 30% o un intervalo delimitado por dos cualesquiera de los valores anteriores. En otras realizaciones, un derivado o derivados de acido graso u otro(s) compuesto(s) se producen a un rendimiento de mas del aproximadamente 30%, mas de aproximadamente el 35%, mas de aproximadamente el 40%, mas de aproximadamente el 45%, mas de
aproximadamente el 50%, mas de aproximadamente el 55%, mas de aproximadamente el 60%, mas de
aproximadamente el 65%, mas de aproximadamente el 70%, mas de aproximadamente el 75%, mas de
aproximadamente el 80%, mas de aproximadamente el 85%, mas de aproximadamente el 90%, mas del 100%, mas
del 200%, mas del 250%, mas del 300%, mas del 350%, mas del 400%, mas del 450%, mas del 500%, mas del 550%, mas del 600%, mas del 650%, mas del 700%, mas del 750%, o mas. Alternativamente, o ademas, el rendimiento es de aproximadamente el 30% o menos, aproximadamente el 27% o menos, aproximadamente el 25% o menos, o aproximadamente el 22% o menos. En otra realizacion, el rendimiento es de aproximadamente el 50% o menos, aproximadamente el 45% o menos, o aproximadamente el 35% o menos. En otra realizacion, el rendimiento es de aproximadamente el 95% o menos, o el 90% o menos, o el 85% o menos, o el 80% o menos, o el 75% o menos, o el 70% o menos, o el 65% o menos, o el 60% o menos, o el 55% o menos, o el 50% o menos. Por tanto, el rendimiento puede estar delimitado por dos cualesquiera de los extremos anteriores. Por ejemplo, el rendimiento de un compuesto derivado de malonil-CoA incluyendo derivado o derivados de acido graso producidos por la celula huesped recombinante segun los metodos de la divulgacion puede ser de aproximadamente el 5% a aproximadamente el 15%, de aproximadamente el 10% a aproximadamente el 25%, de aproximadamente el 10% a aproximadamente el 22%, de aproximadamente el 15% a aproximadamente el 27%, de aproximadamente el 18% a aproximadamente el 22%, de aproximadamente el 20% a aproximadamente el 28%, de aproximadamente el 20% a aproximadamente el 30%, de aproximadamente el 30% a aproximadamente el 40%, de aproximadamente el 40% a aproximadamente el 50%, de aproximadamente el 50% a aproximadamente el 60%, de aproximadamente el 60% a aproximadamente el 70%, de aproximadamente el 70% a aproximadamente el 80%, de aproximadamente el 80% a aproximadamente el 90%, de aproximadamente el 90% a aproximadamente el 100%, de aproximadamente el 100% a aproximadamente el 200%, de aproximadamente el 200% a aproximadamente el 300%, de aproximadamente el 300% a aproximadamente el 400%, de aproximadamente el 400% a aproximadamente el 500%, de aproximadamente el 500% a aproximadamente el 600%, de aproximadamente el 600% a aproximadamente el 700%, o de aproximadamente el 700% a aproximadamente el 800%. El rendimiento puede referirse a un compuesto
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derivado de malonil-CoA particular incluyendo un derivado de acido graso o una combinacion de derivados de acidos grasos u otro compuesto u otra combinacion de compuestos producidos por un cultivo de celulas huesped recombinantes dado. En una realizacion, la expresion de una variante de ACC en una celula huesped recombinante tal como E. coli da como resultado la produccion de un rendimiento superior de compuestos derivados de malonil- CoA incluyendo derivados de acidos grasos tales como, por ejemplo, esteres grasos en comparacion con una celula huesped que expresa el polipeptido silvestre correspondiente. En una realizacion, el rendimiento superior oscila entre aproximadamente el 10% y aproximadamente el 800% del rendimiento teorico.
Tal como se usa en el presente documento, el termino “productividad” se refiere a la cantidad de un compuesto derivado de malonil-CoA incluyendo derivado o derivados de acido graso u otro(s) compuesto o compuestos producidos por volumen unitario de cultivo de celulas huesped por tiempo unitario. En cualquier aspecto de las composiciones y los metodos descritos en el presente documento, la productividad de un compuesto derivado de malonil-CoA incluyendo derivado o derivados de acido graso u otro(s) compuesto o compuestos producidos por una celula huesped recombinante es de al menos 100 mg/l/hora, al menos 200 mg/l/hora, al menos 300 mg/l/hora, al menos 400 mg/l/hora, al menos 500 mg/l/hora, al menos 600 mg/l/hora, al menos 700 mg/l/hora, al menos 800 mg/l/hora, al menos 900 mg/l/hora, al menos 1000 mg/l/hora, al menos 1100 mg/l/hora, al menos 1200 mg/l/hora, al menos 1300 mg/l/hora, al menos 1400 mg/l/hora, al menos 1500 mg/l/hora, al menos
1600 mg/l/hora, al menos 1700 mg/l/hora, al menos 1800 mg/l/hora, al menos 1900 mg/l/hora, al menos
2000 mg/l/hora, al menos 2100 mg/l/hora, al menos 2200 mg/l/hora, al menos 2300 mg/l/hora, al menos
2400 mg/l/hora, 2500 mg/l/hora, o tan alta como 10 g/l/hora (dependiendo de la masa celular). Por ejemplo, la
productividad de un compuesto derivado de malonil-CoA incluyendo derivado o derivados de acido graso u otro(s) compuesto(s) producido(s) por una celula huesped recombinante segun los metodos de la divulgacion puede ser de desde 500 mg/l/hora hasta 2500 mg/l/hora, o desde 700 mg/l/hora hasta 2000 mg/l/hora. La productividad puede referirse a un compuesto derivado de malonil-CoA particular incluyendo un derivado de acido graso o una combinacion de derivados de acidos grasos u otro(s) compuesto(s) producido(s) por un cultivo de celulas huesped dado. Por ejemplo, la expresion de una variante de ACC en una celula huesped recombinante tal como E. coli da como resultado la produccion de una productividad aumentada de compuestos derivados de malonil-CoA incluyendo derivados de acidos grasos u otros compuestos en comparacion con una celula huesped recombinante que expresa el polipeptido silvestre correspondiente. En una realizacion, la productividad superior oscila entre aproximadamente 0,3 g/l/h y aproximadamente 3 g/l/h y aproximadamente 10 g/l/h y aproximadamente 100 g/l/h y aproximadamente 1000 g/l/h.
Tal como se usa en el presente documento, el termino “especie grasa total” y “producto de acido graso total” y “derivado de acido graso” pueden usarse de manera intercambiable en el presente documento con referencia a la cantidad de derivados de acidos grasos que puede producir la celula huesped que expresa la variante de ACC, tal como se evalua mediante GC-FID. Los mismos terminos pueden usarse para querer decir, por ejemplo, esteres grasos, alcoholes grasos, aldehfdos grasos, aminas grasas y acidos grasos libres cuando se hace referencia al analisis de derivados de acidos grasos.
Tal como se usa en el presente documento, el termino “velocidad de utilizacion de glucosa” significa la cantidad de glucosa usada por el cultivo por tiempo unitario, notificada como gramos/litro/hora (g/l/h).
Tal como se usa en el presente documento, el termino “fuente de carbono” se refiere a un sustrato o compuesto adecuado para usarse como fuente de carbono para el crecimiento de celulas procariotas o eucariotas simples. Las fuentes de carbono pueden estar en diversas formas, incluyendo, pero sin limitarse a polfmeros, hidratos de carbono, acidos, alcoholes, aldehfdos, cetonas, aminoacidos, peptidos y gases (por ejemplo, CO y CO2). Las fuentes de carbono a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, monosacaridos, tales como glucosa, fructosa, manosa, galactosa, xilosa y arabinosa; oligosacaridos, tales como fructo-oligosacarido y galacto-oligosacarido; polisacaridos tales como almidon, celulosa, pectina y xilano; disacaridos, tales como sacarosa, maltosa, celobiosa y turanosa; material celulosico y variantes tales como hemicelulosas, metilcelulosa y carboximetilcelulosa sodica; acidos grasos saturados o insaturados, succinato, lactato y acetato; alcoholes, tales como etanol, metanol y glicerol, o mezclas de los mismos. La fuente de carbono tambien puede ser un producto de fotosmtesis, tal como glucosa. En determinadas realizaciones preferidas, la fuente de carbono es biomasa. En otras realizaciones, la fuente de carbono es glucosa. En otras realizaciones, la fuente de carbono es sacarosa. En otras realizaciones, la fuente de carbono es glicerol. En otras realizaciones, la fuente de carbono es una fuente de carbono sencilla. En otras realizaciones, la fuente de carbono es una fuente de carbono renovable.
Tal como se usa en el presente documento, el termino “biomasa” se refiere a cualquier material biologico del que se derive una fuente de carbono. En algunas realizaciones, se procesa una biomasa para dar una fuente de carbono, que es adecuada para la byconversion. En otras realizaciones, la biomasa no requiere procesamiento adicional para dar una fuente de carbono. La fuente de carbono puede convertirse en una composicion que comprende esteres grasos. Los esteres grasos encuentran utilidad en varios productos incluyendo, pero sin limitarse a, tensioactivos, polfmeros, pelfculas, textiles, colorantes, productos farmaceuticos, fragancias y agentes saborizantes, lacas, pinturas, barnices, agentes de ablandamiento en resinas y plasticos, plastificantes, retardantes de la llama y aditivos en gasolina y gasoil.
Una fuente de biomasa a modo de ejemplo es vegetacion o materia vegetal, tal como mafz, cana de azucar o
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cesped de pradera. Otra fuente de biomasa a modo de ejemplo es productos de desecho metabolicos, tales como materia animal (por ejemplo, estiercol de vaca). Las fuentes de biomasa a modo de ejemplo adicionales incluyen algas y otras plantas marinas. La biomasa tambien incluye productos de desecho de la industria, la agricultura, silvicultura y domesticos, incluyendo, pero sin limitarse a, glicerol, residuo de fermentacion, ensilado, paja, madera, aguas cloacales, basura, desechos urbanos celulosicos y restos de comidas (por ejemplo, jabones, aceites y acidos grasos). El termino “biomasa” tambien puede referirse a fuentes de carbono, tales como hidratos de carbono (por ejemplo, monosacaridos, disacaridos o polisacaridos).
Tal como se usa en el presente documento, el termino “aislados”, con respecto a productos (tales como acidos grasos y derivados de los mismos) se refiere a productos que estan separados de componentes celulares, medios de cultivo celular, o precursores qmmicos o sinteticos. Los derivados de acidos grasos producidos mediante los
metodos descritos en el presente documento pueden ser relativamente inmiscibles en el caldo de fermentacion, asf
como en el citoplasma. Por tanto, los derivados de acidos grasos pueden recogerse en una fase organica o bien de manera intracelular o bien de manera extracelular.
Tal como se usa en el presente documento, los terminos “purificar”, “purificado” o “purificacion” significan la retirada o el aislamiento de una molecula de su entorno, por ejemplo, mediante aislamiento o separacion. Las moleculas “sustancialmente purificadas” estan libres en al menos aproximadamente el 60% (por ejemplo, libres en al menos aproximadamente el 70%, libres en al menos aproximadamente el 75%, libres en al menos aproximadamente el 85%, libres en al menos aproximadamente el 90%, libres en al menos aproximadamente el 95%, libres en al menos aproximadamente el 97%, libres en al menos aproximadamente el 99%) de otros componentes con los que se
asocian. Tal como se usa en el presente documento, estos terminos tambien se refieren a la retirada de
contaminantes de una muestra. Por ejemplo, la eliminacion de contaminantes puede dar como resultado un aumento en el porcentaje de compuestos derivados de malonil-CoA incluyendo derivados de acidos grasos u otros compuestos en una muestra. Por ejemplo, cuando un compuesto derivado de malonil-CoA incluyendo un derivado de acido graso u otro compuesto se produce en una celula huesped recombinante, el compuesto derivado de malonil-CoA incluyendo el derivado de acido graso u otro compuesto puede purificarse mediante la eliminacion de las protemas de la celula huesped. Tras la purificacion, el porcentaje de compuestos derivados de malonil-CoA incluyendo derivados de acidos grasos u otros compuestos en la muestra aumenta. Los terminos “purificar”, “purificado” y “purificacion” son terminos relativos que no requieren pureza absoluta. Por tanto, por ejemplo, cuando un compuesto derivado de malonil-CoA (incluyendo un derivado de acido graso u otro compuesto) se produce en celulas huesped recombinantes, un compuesto derivado de malonil-CoA (incluyendo un derivado de acido graso u otro compuesto purificado) es un compuesto derivado de malonil-CoA (incluyendo un derivado de acido graso u otro compuesto) que esta sustancialmente separado de otros componentes celulares (por ejemplo, acidos nucleicos, polipeptidos, lfpidos, hidratos de carbono u otros hidrocarburos).
Tal como se usa en el presente documento, el termino “atenuar” significa debilitar, reducir o disminuir. Por ejemplo, un polipeptido puede atenuarse modificando el polipeptido para reducir su actividad (por ejemplo, modificando una secuencia de nucleotidos que codifica para el polipeptido).
Variantes de acetil-CoA carboxilasa (ACC)
Acido graso sintasa (FAS) indica un grupo de polipeptidos que catalizan la iniciacion y elongacion de cadenas de acilo (Marrakchi et al. (2002) Biochemical Society 30: 1050-1055). La protema portadora de acilo (ACP) junto con las enzimas en la ruta de FAS controlan la longitud, el grado de saturacion y la ramificacion de los acidos grasos producidos. Las enzimas que se incluyen en la ruta de FAS incluyen, pero no se limitan a, ACC, FabD, FabH, FabG, FabA, FabZ, Fabl, FabK, FabL, FabM, FabB y FabF. Dependiendo del producto deseado uno o mas de estos genes pueden atenuarse o sobreexpresarse opcionalmente en una celula huesped recombinante (veanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 8.658.404; 8.597.922; 8.535.916; 8.530.221; 8.372.610; 8.323.924; 8.313.934; 8.283.143; 8.268.599; 8.183.028; 8.110.670; 8.110.093; y 8.097.439).
La enzima ACC (E.C. 6.4.1.2.) cataliza la primera etapa comprometida de la biosmtesis de acidos grasos, la carboxilacion de acetil-CoA para dar malonil-CoA. Como tal, proporciona el sustrato de malonil-CoA para la biosmtesis de acidos grasos, derivados de acidos grasos y otros compuestos distintos de acidos grasos (vease, por ejemplo, la figura 4). La enzima ACC se encuentra en la mayona de los organismos vivos y se presenta como una enzima de multiples subunidades en la mayona de todos los procariotas y en los cloroplastos de la mayona de plantas y algas. La enzima ACC procariotica o complejo enzimatico de ACC incluye cuatro protemas diferentes codificadas por cuatro genes diferentes (es decir, accA, accB, accC y accD) que se ensamblan para dar un complejo a una razon fija (Broussard et al. (2013) anteriormente). Los genes accB y accC codifican para las subunidades de ACC protema portadora de biotina carboxilo (BCCP) y biotina carboxilasa (BC), respectivamente. La presente divulgacion muestra sorprendentemente que la(s) mutacion/mutaciones en solo uno o dos de los genes de ACC (por ejemplo, accB, accC) es suficiente para aumentar el flujo de acidos grasos y da como resultado un titulo y/o rendimiento superior de compuestos derivados de malonil-CoA incluyendo derivados de acidos grasos tales como esteres metilicos de acidos grasos (FAME). La presente divulgacion muestra que mutaciones en la region codificante del gen accB son beneficiosas, y que cambios de expresion simultaneos de los genes tanto accB como accC tambien son beneficiosos. En E. coli, los genes accB y accC se encuentran adyacentes en un operon en el cromosoma. Las variantes de ACC dadas a conocer en el presente documento contienen mutaciones o cambios de
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expresion en uno o dos de los cuatro genes de ACC, lo que es suficiente para conferir actividad enzimatica de ACC aumentada a celulas que ya contienen los otros genes y polipeptidos de subunidades de ACC.
Por tanto, la presente divulgacion se refiere a, entre otros, variantes de ACC que dan como resultado un tttulo superior y/o rendimiento superior de compuestos derivados de malonil-CoA cuando se expresan en una celula; a secuencias de polipeptido de tales variantes de ACC y fragmentos funcionales de los mismos; a polinucleotidos que codifican para secuencias de polipeptido variantes de ACC; a microorganismos recombinantes que incluyen acidos nucleicos que codifican para polipeptidos variantes de ACC; a microorganismos que pueden expresar polipeptidos variantes de ACC; a cultivos de tales microorganismos; a procedimientos para producir compuestos derivados de malonil-CoA incluyendo derivados de acidos grasos y compuestos distintos de acidos grasos; y a las composiciones resultantes. Particularmente, se proporcionan en el presente documento polipeptidos variantes de ACC y microorganismos que expresan estos polipeptidos asf como metodos relacionados. Ejemplos de variantes de ACC son variantes de BCCP tal como se muestran en las tablas 1 y 3 (mas adelante).
La secuencia de acido nucleico de accB de E. coli silvestre se muestra en SEQ ID NO: 1. La secuencia de aminoacidos correspondiente de E. coli silvestre para BCCP (codificada por accB de SEQ ID NO: 1) se muestra en SEQ ID NO: 2. Se uso SEQ ID NO: 2 como molde para generar los polipeptidos variantes de ACC mejorados con el fin de ilustrar la divulgacion (vease el ejemplo 1, mas adelante). Una variante de ACC preferida tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 50%, aproximadamente el 60%, aproximadamente el 70%, aproximadamente el 80%, aproximadamente el 90% o aproximadamente el 99% con la secuencia de aminoacidos de la E. coli silvestre de SEQ ID NO: 2. El primer aminoacido despues del ATG se designa aminoacido “2”.
En un aspecto, la divulgacion proporciona polipeptidos variantes de ACC o variantes de ACC y secuencias de nucleotidos que codifican para los mismos. Diversas mutaciones en diferentes posiciones de aminoacido (o residuos) aumentaran la produccion de diversos derivados de acidos grasos tales como, por ejemplo, la produccion de ester metilico de acidos grasos (FAME). Por ejemplo, pueden usarse tecnicas tales como mutagenesis de saturacion dirigida al sitio para determinar que posiciones y mutaciones proporcionan la mayor mejora.
El gen accB silvestre contiene un codon GAT en la posicion 2 que codifica para acido aspartico o aspartato (Asp, D). En una realizacion, puede observarse que mutaciones en la posicion de aminoacido 2 dentro del gen accB silvestre de SEQ ID NO: 2 mejoraron la produccion de FAME. Estos polipeptidos de ACC variantes (es decir, codificados por el gen accB mutante) pueden aumentar la produccion de esteres grasos en relacion con ACC silvestre. La tabla 1 a continuacion representa un resumen de las mejores variantes para la posicion 2 de accB. El experto en la tecnica apreciara que el aumento de la produccion de ester es un modo para someter a prueba los polipeptidos de ACC variantes para determinar su capacidad para aumentar la produccion de compuestos derivados de malonil-CoA tales como, por ejemplo, derivado de acido graso. Se uso la produccion de esteres grasos (en vez de cualquier otra produccion de derivados de acidos grasos tal como, por ejemplo, produccion de alcohol graso o produccion de aldehfdo graso o produccion de acido graso, etc.) para fines ilustrativos solo y no se pretende limitar la presente divulgacion. Un experto reconocera que otros compuestos derivados de malonil-CoA tambien pueden aumentarse mediante la siguiente ensenanza de la presente divulgacion y empleando los metodos y protocolos dados a conocer en el presente documento y generalmente disponibles para los expertos en la tecnica.
Tabla 1: Variantes de accB con produccion de FAME aumentada
Pocillo
Tttulo Codon Mutacion Cambio de aminoacido Numero de mutante SEQ ID NO: de acido nucleico SEQ ID NO: de aminoacido
C12
630% CAC D2H Histidina (H) 1 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 4
C0I
578% AAC D2N Asparagina (N) 2 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6
F07
527% CAT D2H Histidina (H) 3 SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 8
E05
475% ATT D2I Isoleucina (I) 4 SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 10
F08
420% ATT D2I Isoleucina (I) 5 SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 12
F06
331% ACT D2T Treonina (T) 6 SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 14
B01
305% TCT D2S Serina (S) 7 SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 16
E12
282% AGC D2S Serina (S) 8 SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 18
C06
276% CGA D2R Arginina (R) 9 SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 20
F10
276% TCT D2S Serina (S) 10 SEQ ID NO: 21 SEQ ID NO: 22
B05
265% TAT D2Y Tirosina (Y) 11 SEQ ID NO: 23 SEQ ID NO: 24
B08
260% TCA D2S Serina (S) 12 SEQ ID NO: 25 SEQ ID NO: 26
C04
255% TAC D2Y Tirosina (Y) 13 SEQ ID NO: 27 SEQ ID NO: 28
G05
254% TAC D2Y Tirosina (Y) 14 SEQ ID NO: 29 SEQ ID NO: 30
E08
239% CTT D2L Leucina (L) 15 SEQ ID NO: 31 SEQ ID NO: 32
E02
234% CGA D2R Arginina (R) 16 SEQ ID NO: 33 SEQ ID NO: 34
H12
225% TTG D2L Leucina (L) 17 SEQ ID NO: 35 SEQ ID NO: 36
B03
223% CGA D2R Arginina (R) 18 SEQ ID NO: 37 SEQ ID NO: 38
A10
219% ACG D2T Treonina (T) 19 SEQ ID NO: 39 SEQ ID NO: 40
B02
217% TAT D2Y Tirosina (Y) 20 SEQ ID NO: 41 SEQ ID NO: 42
5
10
15
20
25
30
35
F03
214% CTT D2L Leucina (L) 21 SEQ ID NO: 43 SEQ ID NO: 44
G04
214% TTA D2L Leucina (L) 22 SEQ ID NO: 45 SEQ ID NO: 46
H10
214% CAG D2Q Glutamina (Q) 23 SEQ ID NO: 47 SEQ ID NO: 48
F12
212% TAT D2Y Tirosina (Y) 24 SEQ ID NO: 49 SEQ ID NO: 50
G03
206% TTA D2L Leucina (L) 25 SEQ ID NO: 51 SEQ ID NO: 52
B07
204% TTA D2L Leucina (L) 26 SEQ ID NO: 53 SEQ ID NO: 54
B10
202% TTA D2L Leucina (L) 27 SEQ ID NO: 55 SEQ ID NO: 56
C07
193% TTA D2L Leucina (L) 28 SEQ ID NO: 57 SEQ ID NO: 58
H05
177% TTG D2L Leucina (L) 29 SEQ ID NO: 59 SEQ ID NO: 60
F11
172% TTG D2L Leucina (L) 30 SEQ ID NO: 61 SEQ ID NO: 62
F04
168% CTT D2L Leucina (L) 31 SEQ ID NO: 63 SEQ ID NO: 64
E06
146% ATC D2I Isoleucina (I) 32 SEQ ID NO: 65 SEQ ID NO: 66
E03
145% TAT D2Y Tirosina (Y) 33 SEQ ID NO: 67 SEQ ID NO: 68
G07
144% GAA D2E Glutamato (E) 34 SEQ ID NO: 69 SEQ ID NO: 70
A08
142% CTC D2L Leucina (L) 35 SEQ ID NO: 71 SEQ ID NO: 72
H07
130% CTC D2L Leucina (L) 36 SEQ ID NO: 73 SEQ ID NO: 74
A12
129% CTC D2L Leucina (L) 37 SEQ ID NO: 75 SEQ ID NO: 76
A01
126% ATC D2I Isoleucina (I) 38 SEQ ID NO: 77 SEQ ID NO: 78
G06
126% GAA D2E Glutamato (E) 39 SEQ ID NO: 79 SEQ ID NO: 80
H02
116% TCG D2S Serina (S) 40 SEQ ID NO: 81 SEQ ID NO: 82
H06
114% TCG D2S Serina (S) 41 SEQ ID NO: 83 SEQ ID NO: 84
H08
114% TCG D2S Serina (S) 42 SEQ ID NO: 85 SEQ ID NO: 86
A11
107% TCG D2S Serina (S) 43 SEQ ID NO: 87 SEQ ID NO: 88
E01
106% TCG D2S Serina (S) 44 SEQ ID NO: 89 SEQ ID NO: 90
Dependiendo de la posicion mutada, cambios de aminoacidos individuals o multiples en posiciones especificadas dan lugar a aumentos en la produccion de derivados de acidos grasos as^ como aumentos en la produccion de compuestos distintos de acidos grasos. En una realizacion, un cambio de aminoacidos individual o multiple da como resultado un aumento en la produccion de acidos grasos. En otra realizacion, un cambio de aminoacidos individual o multiple da como resultado un aumento en la produccion de esteres grasos, incluyendo pero sin limitarse a, ester metflico de acidos grasos (FAME) y/o ester etflico de acidos grasos (FAEE). En otra realizacion, un cambio de aminoacidos individual o multiple da como resultado un aumento en la produccion de aldehfdos grasos. En otra realizacion, un cambio de aminoacidos individual o multiple da como resultado un aumento en la produccion de alcoholes grasos. En otra realizacion, un cambio de aminoacidos individual o multiple da como resultado un aumento en la produccion de aminas grasas. En otra realizacion, un cambio de aminoacidos individual o multiple da como resultado un aumento en la produccion de hidrocarburos. En otra realizacion, un cambio de aminoacidos individual o multiple da como resultado un aumento en la produccion de alcanos. En otra realizacion, un cambio de aminoacidos individual o multiple da como resultado un aumento en la produccion de alquenos u olefinas. En todavfa otra realizacion, un cambio de aminoacidos individual o multiple da como resultado un aumento en la produccion de acidos grasos bifuncionales, incluyendo pero sin limitarse a, hidroxiacidos grasos y/o diacidos. En aun otra realizacion, un cambio de aminoacidos individual o multiple da como resultado un aumento en la produccion de alcoholes grasos bifuncionales. En todavfa otra realizacion, un cambio de aminoacidos individual o multiple da como resultado un aumento en la produccion de aminas grasas y/o esteres grasos bifuncionales. En otra realizacion, un cambio de aminoacidos individual o multiple da como resultado un aumento en la produccion de compuestos derivados de beta-hidroxiacidos grasos. En otra realizacion, un cambio de aminoacidos individual o multiple da como resultado un aumento en la produccion de compuestos derivados de acidos grasos insaturados. En todavfa otra realizacion, un cambio de aminoacidos individual o multiple da como resultado un aumento en la produccion de flavanonas y/o flavonoides. En otra realizacion, un cambio de aminoacidos individual o multiple da como resultado un aumento en la produccion de policetidos. En otra realizacion, un cambio de aminoacidos individual o multiple da como resultado un aumento en la produccion de acido 3-hidroxipropionico (3-HP). En otra realizacion, un cambio de aminoacidos individual o multiple da como resultado un aumento en la produccion de acido malonico o malonato.
Por tanto, combinaciones de uno o mas cambios de aminoacidos en posiciones especificadas pueden dar lugar a aumentos en la produccion de derivados de acidos grasos y/o acidos grasos libres y/o compuestos no basados en acidos grasos tales como flavanonas y/o flavonoides, policetidos, malonato, acido 3-hidroxipropionico (3-HP), y otros. El efecto de cada cambio de aminoacidos individual sobre la produccion de derivados de acidos grasos puede ser o no aditivo al efecto de otros cambios de aminoacidos individuales sobre la produccion de derivados de acidos grasos o la produccion de compuestos distintos de acidos grasos. En algunas realizaciones, una combinacion de uno o mas cambios de aminoacidos en posiciones especificadas da como resultado un aumento en la produccion de derivados de acidos grasos. Por consiguiente, uno o multiples cambios de aminoacidos en posiciones especificadas pueden dar lugar a aumentos en la produccion de derivados de acidos grasos. De manera similar, uno o multiples cambios de aminoacidos en posiciones especificadas pueden dar lugar a aumentos en compuestos distintos de acidos grasos.
Ademas de las variantes de ACC mostradas en la tabla 1 anteriormente, se construyo una biblioteca propensa a
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
errores del gen accB y se examino usando SEQ ID NO: 1 como molde. Se identificaron variantes de accB adicionales introduciendo mutaciones individuales o multiples (vease el ejemplo 1, tabla 3, mas adelante). Por tanto, se identificaron 63 mutaciones beneficiosas (veanse las tablas 1 y 3) en la region codificante de accB que dieron como resultado un tttulo aumentado de FAME. De manera notable, se encontraron un alto numero de mutaciones en la region de aminoacidos N-terminal que oscila entre aproximadamente la posicion de aminoacido 1 y aproximadamente la posicion 60.
En un aspecto, la divulgacion se refiere a polipeptidos variantes de ACC con una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 50% con SEQ iD NO: 2. En algunos aspectos, un polipeptido de ACC variante muestra una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 50%, (por ejemplo, de aproximadamente el 48% a aproximadamente 52%), al menos aproximadamente el 60%, al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 75%, al menos el 76%, al menos aproximadamente el 77%, al menos aproximadamente el 78%, al menos aproximadamente el 79%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 81%, al menos aproximadamente el 82%, al menos aproximadamente el 83%, al menos aproximadamente el 84%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 86%, al menos aproximadamente el 87%, al menos aproximadamente el 88%, al menos aproximadamente el 89%, al menos aproximadamente el 90%, al menos
aproximadamente el 91%, al menos aproximadamente el 92%, al menos aproximadamente el 93%, al menos
aproximadamente el 94%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 96%, al menos
aproximadamente el 97%, al menos aproximadamente el 98%, o al menos el 99% con la secuencia de ACC silvestre
de SEQ ID NO: 2 y tambien incluye una o mas sustituciones que dan como resultado caractensticas y/o propiedades utiles tal como se describe en el presente documento. En un aspecto de la divulgacion, el polipeptido variante de ACC con caractensticas mejoradas tiene una identidad de secuencia de aproximadamente el 100% con SEQ ID NO: 6. En otro aspecto de la divulgacion, el polipeptido variante de ACC tiene una identidad de secuencia de aproximadamente el 100% con una cualquiera de las siguientes SEQ ID NO, incluyendo, pero sin limitarse a, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88 y SEQ ID NO: 90.
En un aspecto relacionado, un polipeptido variante de ACC esta codificado por una secuencia de nucleotidos que tiene una identidad de secuencia del 100% con SEQ ID NO: 5. En otro aspecto relacionado, un polipeptido variante de ACC esta codificado por una secuencia de nucleotidos que tiene una identidad de secuencia de aproximadamente el 100% con una cualquiera de las siguientes SEQ ID NO incluyendo, pero sin limitarse a, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87 y SEQ ID NO: 89.
En otro aspecto, la divulgacion se refiere a polipeptidos variantes de ACC con actividad de ACC mejorada con una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 50% con SEQ ID NO: 6. En algunos aspectos, un polipeptido variante de ACC tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 50%, (por ejemplo, de aproximadamente el 48% a aproximadamente el 52%), al menos aproximadamente el 60%, al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 75%, al menos el 76%, al menos aproximadamente el 77%, al menos aproximadamente el 78%, al menos aproximadamente el 79%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 81%, al menos aproximadamente el 82%, al menos aproximadamente el 83%, al menos aproximadamente el 84%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 86%, al menos aproximadamente el 87%, al menos aproximadamente el 88%, al menos aproximadamente el 89%, al menos
aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 91%, al menos aproximadamente el 92%, al menos
aproximadamente el 93%, al menos aproximadamente el 94%, al menos aproximadamente el 95%, al menos
aproximadamente el 96%, al menos aproximadamente el 97%, al menos aproximadamente el 98% o al menos el
99% con la secuencia variante de ACC de SEQ ID NO: 6 y tambien incluye una o mas sustituciones que dan como resultado caractensticas y/o propiedades mejoradas tal como se describe en el presente documento. En otro aspecto, la divulgacion se refiere a polipeptidos variantes de ACC con una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 50% con una cualquiera de las siguientes SEQ ID NO incluyendo, pero sin limitarse a, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID

NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID

NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID

NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID
NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88 y SEQ ID
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
NO: 90. En algunos aspectos, un polipeptido variante de ACC tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 50%, (por ejemplo, de aproximadamente el 48% a aproximadamente el 52%), al menos aproximadamente el 60%, al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 75%, al menos el 76%, al menos aproximadamente el 77%, al menos aproximadamente el 78%, al menos aproximadamente el 79%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 81%, al menos aproximadamente el 82%, al menos aproximadamente el 83%, al menos aproximadamente el 84%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 86%, al menos aproximadamente el 87%, al menos aproximadamente el 88%, al menos
aproximadamente el 89%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 91%, al menos
aproximadamente el 92%, al menos aproximadamente el 93%, al menos aproximadamente el 94%, al menos
aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 96%, al menos aproximadamente el 97%, al menos
aproximadamente el 98%, o al menos el 99% con la secuencia de ACC de una cualquiera de las siguientes SEQ ID NO incluyendo, pero sin limitarse a, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26,

SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40,

SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54,

SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68,

SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82,
SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88 y SEQ ID NO: 90, que abarcan uno o mas sustituciones que dan como resultado caractensticas y/o propiedades mejoradas tal como se describe en el presente documento.
En otro aspecto, la divulgacion se refiere a polipeptidos variantes de ACC que incluyen una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de acido nucleico que tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 75%, al menos el 76%, al menos aproximadamente el 77%, al menos aproximadamente el 78%, al menos aproximadamente el 79%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 81%, al menos aproximadamente el 82%, al menos aproximadamente el 83%, al menos aproximadamente el 84%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 86%, al menos aproximadamente el 87%, al menos aproximadamente el 88%, al menos aproximadamente el 89%, al menos
aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 91%, al menos aproximadamente el 92%, al menos
aproximadamente el 93%, al menos aproximadamente el 94%, al menos aproximadamente el 95%, al menos
aproximadamente el 96%, al menos aproximadamente el 97%, al menos aproximadamente el 98%, o al menos el 99% con la secuencia variante de ACC de SEQ ID NO: 5. En algunos aspectos, la secuencia de acido nucleico codifica para una variante de ACC con una o mas sustituciones que dan como resultado caractensticas y/o propiedades mejoradas tal como se describe en el presente documento. En otros aspectos, la secuencia de acido nucleico variante de ACC se deriva de un organismo tal como E. coli. En otro aspecto, la divulgacion se refiere a polipeptidos variantes de ACC que incluyen una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de acido nucleico que tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 75%, al menos el 76%, al menos aproximadamente el 77%, al menos aproximadamente el 78%, al menos aproximadamente el 79%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 81%, al menos
aproximadamente el 82%, al menos aproximadamente el 83%, al menos aproximadamente el 84%, al menos
aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 86%, al menos aproximadamente el 87%, al menos
aproximadamente el 88%, al menos aproximadamente el 89%, al menos aproximadamente el 90%, al menos
aproximadamente el 91%, al menos aproximadamente el 92%, al menos aproximadamente el 93%, al menos
aproximadamente el 94%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 96%, al menos
aproximadamente el 97%, al menos aproximadamente el 98% o al menos el 99% con la secuencia variante de ACC de una cualquiera de las siguientes SEQ ID NO incluyendo, pero sin limitarse a, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ
ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ
ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ
ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ
ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87 y SEQ ID NO: 89. En algunos aspectos, la secuencia de acido nucleico codifica para una variante de ACC con una o mas sustituciones que dan como resultado caractensticas y/o propiedades mejoradas tal como se describe en el presente documento. En otros aspectos, la secuencia de acido nucleico variante de ACC se deriva de un organismo tal como E. coli.
En otro aspecto, la divulgacion se refiere a polipeptidos variantes de ACC que incluyen una secuencia de aminoacidos codificada por un acido nucleico que se hibrida en condiciones rigurosas a lo largo de sustancialmente toda la longitud de un acido nucleico correspondiente a una cualquiera de las siguientes SEQ ID NO incluyendo, pero sin limitarse a, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27,

SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41,

SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55,

SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69,

SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83,
SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87 y SEQ ID NO: 89. En algunos aspectos, la secuencia de acido nucleico codifica para una secuencia de acido nucleico variante de ACC derivada de un organismo tal como E. coli. En un aspecto
5
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45
relacionado, la divulgacion proporciona variantes de ACC codificadas por una secuencia de nucleotidos que tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 75%, al menos el 76%, al menos aproximadamente el 77%, al menos aproximadamente el 78%, al menos aproximadamente el 79%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 81%, al menos aproximadamente el 82%, al menos aproximadamente el 83%, al menos aproximadamente el 84%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 86%, al menos aproximadamente el 87%, al menos aproximadamente el 88%, al menos
aproximadamente el 89%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 91%, al menos
aproximadamente el 92%, al menos aproximadamente el 93%, al menos aproximadamente el 94%, al menos
aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 96%, al menos aproximadamente el 97%, al menos
aproximadamente el 98% o al menos el 99% con SEQ ID NO: 1 y comprende una o mas de las sustituciones dadas a conocer en el presente documento.
La presente divulgacion muestra que las mutaciones en la region codificante del gen accB solas son beneficiosas (anteriormente) mientras que cambios de expresion simultaneos de los genes tanto accB como accC tambien son beneficiosos. En E. coli, los genes accB y accC se encuentran adyacentes en un operon en el cromosoma. Por tanto, se construyo una biblioteca de expresion del operon accBC y se examino para detectar variantes que mostraban una mejora en la actividad de ACC (es decir, medida mediante la produccion aumentada de compuestos derivados de malonil-CoA en una celula) con respecto al promotor de accBC silvestre. La tabla 2 (anteriormente) representa un resumen de las mejoras variantes basandose en una secuencia de promotor T5 de accBC tal como se muestra a continuacion (las regiones subrayadas indican las posiciones -35 y -10 de los promotores):
Secuencia de nucleotidos de la region promotora de accBC de E. coli silvestre (PaccBC) (SEQ ID NO: 91):
TTGTTGCAAATTACACGGTGTTGAAGGTTATTTACATGTTAGCTGTTGATTATCTTC
CCTGATAAGACCAGTATTTAGCT
Secuencia de nucleotidos del promotor T5 de bacteriofagos (PT5) (SEQ ID NO: 92):
AATCATAAAAAATTTATTTGCTTTCAGGAAAATTTTTCTGTATAATAGATTC
Tabla 2: Variantes de promotor T5 de accBC con produccion de FAME aumentada
Pocillo
Tftulo Secuencia de promotor T5 de accBC SEQ ID NO:
G06
315% AAT CAT AAAAAATTTATTT GCTCT CAGGAAAATTTTT CT GGATAATAGATT C 93
E09
292% AAT CAT AAAAAATTT ATCTTCTCT CAGGAAAATTTTT CTGT ATTATAGATT C 94
F06
226% AAT CATAAAAAATTTATCTGCCTT CAGGAAAATTTTT CTGTATAATAGATT C 95
B11
219% AAT CAT AAAAAATTT ATTT GCCTT CAGGAAAATTTTT CTGTATAGTAGATT C 96
La biblioteca puede construirse usando cebadores que reemplazan la region promotora nativa de accBC por cualquier biblioteca de promotores adecuada (por ejemplo, promotor tubrido, promotor artificial o sintetico, promotor de un organismo diferente, promotor de un gen diferente en el mismo organismo, promotor comercial, etc.), que contiene habitualmente nucleotidos degenerados para introducir mutaciones al azar. En determinadas realizaciones, el promotor es un promotor regulado por el desarrollo, uno espedfico de organulo, uno espedfico de tejido, uno inducible, uno constitutivo o uno espedfico de celula. Todos los promotores adecuados se contemplan en el presente documento. En otras realizaciones, pueden hacerse cambios de expresion en el operon de accBC usando numerosas tecnicas conocidas por los expertos en la tecnica, incluyendo, pero sin limitarse a, reemplazo del promotor por un promotor de E. coli diferente o promotor heterologo, una mutacion del promotor nativo, mutaciones en los sitios de union al ribosoma (RBS) de accB y accC por separado o juntos, alteracion de la region no traducida (UTR) entre el promotor de accBC y el gen accB, duplicacion del operon de accBC en el cromosoma o en un plasmido, reemplazo del operon de accBC cromosomico por un operon codificado por plasmido, modificacion por ingeniena genetica de los factores de transcripcion que se unen a la region promotor de accBC. En una realizacion a modo de ejemplo, se usa un promotor T5 de bacteriofago. En una realizacion, la biblioteca de promotores puede unirse a regiones de homologfa apropiadas usando una tecnica de PCR, y la biblioteca puede entonces integrarse en el cromosoma bacteriano (vease el ejemplo 2), reemplazando el promotor de accBC nativo. La biblioteca de expresion puede examinarse tal como se muestra en el ejemplo 2 (mas adelante).
Propiedades mejoradas de variantes de ACC
La BCCP silvestre (SEQ ID NO: 1 y 2) se altero geneticamente por medio de mutagenesis para producir un alto porcentaje de compuestos derivados de malonil-CoA tales como FAME sin la necesidad de sobreexpresar ningun otro gen usando la expresion en E. coli como modelo ilustrativo (vease el ejemplo 1, mas adelante). Lo mismo se logro alterando geneticamente el operon de accBC (vease el ejemplo 2, mas adelante). Por tanto, cuando se expresan en una celula huesped recombinante tal como E. coli, las variantes de la BCCP silvestre dan como resultado un titulo y rendimiento superiores del producto deseado, es decir, producen mayores cantidades de compuestos derivados de malonil-CoA tales como derivados de acidos grasos cuando se expresan en una celula
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huesped (es decir, una celula recombinante) en comparacion con la celula huesped silvestre (que no expresa la variante de ACC). La ACC silvestre en un complejo proteico nativo y normalmente requiere las cuatro protemas para su actividad, incluyendo, biotina carboxilasa (BC), protema portadora de biotina carboxilo (BCCP) y dos protemas que forman la carboxiltransferasa (CT). Sin embargo, las BCCP variantes de la presente divulgacion parecen conferir a la celula la capacidad de aumentar la produccion de compuestos derivados de malonil-CoA. Sin querer restringirse a la teona, se contempla que esto puede ser una consecuencia directa de que las BCCP variantes confieren directa o indirectamente una actividad de ACC aumentada en celulas que expresan ACC nativa. Por ejemplo, los polipeptidos variantes de BCCP produdan desde aproximadamente el l0o% hasta aproximadamente el 650% de FAME cuando se expresaban en celulas huesped (vease la tabla 1, anteriormente, y la tabla 3, mas adelante) en comparacion con las celulas silvestres. Esto significa que el tttulo de FAME observado oscilaba hasta el 650% del tttulo de FAME normalmente producido por la celula silvestre. En otro ejemplo, los cambios en el operon de accBC condudan a polipeptidos variantes de BCCP que produdan desde aproximadamente el 200% hasta aproximadamente el 350% del tftulo de FAME cuando se expresaban en celulas huesped (vease la tabla 2, anteriormente) en comparacion con las celulas silvestres.
En una realizacion, se espera que los polipeptidos variantes de ACC produzcan cantidades aumentadas de derivados de acidos grasos incluyendo, pero sin limitarse a, esteres grasos tales como esteres medicos de acidos grasos (FAME) y esteres etflicos de acidos grasos (FAEE), aminas grasas, aldeddos grasos, alcoholes grasos, alcoholes de cadena corta y larga, hidrocarburos, cetonas, alcanos, olefinas terminales, olefinas internas, derivados de beta-hidroxiacidos grasos, derivados de acidos grasos bifuncionales y derivados de acidos grasos insaturados en comparacion con la enzima ACC silvestre. En otra realizacion, se espera que los polipeptidos variantes de ACC produzcan cantidades aumentadas de compuestos no basados en acidos grasos (por ejemplo, flavanonas y flavonoides, policetidos, acido 3-hidroxipropionico, malonato, etc.) en comparacion con la enzima ACC silvestre. Un experto reconocera que los productos finales que pueden producirse a traves de las variantes de ACC abarcan varias clases de compuestos incluyendo derivados de acidos grasos y compuestos distintos de acidos grasos, dependiendo de las diversas rutas bioqmmicas que se ven influidas por la regulacion por incremento de malonil- CoA. La figura 4 proporciona ejemplos no exhaustivos de posibles compuestos.
Metodos de preparacion de variantes de ACC
En la practica de los metodos de la presente divulgacion, se usa mutagenesis para preparar grupos de celulas huesped recombinantes para examen. Normalmente, las celulas huesped recombinantes comprenden una o mas secuencias de polinucleotido que incluyen un marco de lectura abierto para un polipeptido variante de ACC, tal como un gen accB variante junto con secuencias reguladoras operativamente unidas y/o un gen accB con promotor(es) de accBC variante operativamente unido(s). En el presente documento se describen numerosos ejemplos de polipeptidos de ACC variantes incluyendo polipeptidos de BCCP variantes utiles en la practica de los metodos de la presente divulgacion. Tambien se describen en el presente documento ejemplos de secuencias reguladoras utiles en la practica de los metodos de la presente divulgacion. La mutagenesis de tales secuencias de polinucleotido puede realizarse usando tecnicas de ingeniena genetica, tales como mutagenesis dirigida al sitio, mutagenesis qmmica al azar, procedimientos de delecion con exonucleasa III o tecnicas de clonacion convencionales. Alternativamente, pueden crearse mutaciones en secuencias de polinucleotido usando procedimientos de modificacion o smtesis qrnmica. Los expertos habituales en la tecnica reconoceran que los protocolos y procedimientos empleados en el presente documento pueden modificarse y que tales modificaciones son de conformidad con las variaciones de la divulgacion. Por ejemplo, cuando se describen etapas de metodo en un determinado orden, la ordenacion de las etapas puede modificarse y/o realizarse en paralelo o secuencialmente.
Se conocen bien en la tecnica metodos de mutagenesis e incluyen, por ejemplo, los siguientes. En la PCR propensa a errores (Leung et al. (1989) Technique 1:11-15; y Caldwell et al. (1992) PCR Methods Applic. 2: 28-33), se realiza PCR en condiciones en las que la fidelidad de copiado de la ADN polimerasa es baja, de manera que se obtiene una alta tasa de mutaciones puntuales a lo largo de toda la longitud del producto de PCR. En resumen, en tales procedimientos, se mezclan polinucleotidos que van a mutagenizarse con cebadores de PCR, tampon de reaccion, MgCl2, MnCl2, Taq polimerasa y una concentracion apropiada de dNTP para lograr una alta tasa de mutaciones puntuales a lo largo de toda la longitud del producto de PCR. Por ejemplo, la reaccion puede realizarse usando 20 fmoles de acido nucleico que va a mutagenizarse, 30 pmoles de cada cebador de PCR, un tampon de reaccion que comprende KCl 50 mM, Tris HCl 10 mM (pH 8,3), y gelatina al 0,01%, MgCh 7 mM, MnCh 0,5 mM, 5 unidades de Taq polimerasa, dGTP 0,2 mM, dATP 0,2 mM, dCTP 1 mM y dTTP 1 mM. Puede realizarse PCR durante 30 ciclos de 94°C durante 1 min, 45°C durante 1 min y 72°C durante 1 min. Se apreciara que estos parametros pueden variarse segun sea apropiado. Los polinucleotidos mutagenizados se clonan entonces en un vector apropiado, y se evaluan las actividades de los polipeptidos afectados por los polinucleotidos mutagenizados. Tambien puede realizarse la mutagenesis usando mutagenesis dirigida por oligonucleotidos (Reidhaar-Olson et al. (1988) Science 241:53-57) para generar mutaciones espedficas de sitio en cualquier ADN clonado de interes. En resumen, en tales procedimientos, se sintetizan una pluralidad de oligonucleotidos bicatenarios que portan una o mas mutaciones que van a introducirse en el ADN clonado, y se ensamblan en el ADN clonado que va a mutagenizarse. Se recuperan los clones que contienen el ADN mutagenizado, y se evaluan las actividades de los polipeptidos afectados. Otro metodo de mutagenesis para generar variantes de secuencia de polinucleotido es la PCR de ensamblaje. La PCR de ensamblaje implica el ensamblaje de un producto de PCR de una mezcla de fragmentos de ADN pequenos. Un gran numero de diferentes reacciones PCR se producen en paralelo en el mismo vial, cebando con los productos de una
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reaccion los productos de otra reaccion. La PCR de ensamblaje se describe en, por ejemplo, la patente estadounidense 5.965.408. Todav^a otro metodo de mutagenesis de generacion de variantes de secuencia de polinucleotido es la mutagenesis por PCR sexual (Stemmer (1994) PNAS, USA 91:10747-10751). En la mutagenesis por PCR sexual, se produce recombinacion homologa forzada entre moleculas de ADN de diferentes secuencias de ADN, pero altamente relacionadas, in vitro como resultado de fragmentacion al azar de la molecula de ADN basandose en la homologfa de secuencia. Esto va seguido por fijacion del cruzamiento mediante extension de cebadores en una reaccion PCR.
Tambien pueden crearse variantes de ACC mediante mutagenesis in vivo. En algunos aspectos, se generan mutaciones al azar en una secuencia de acido nucleico propagando la secuencia de polinucleotido en una cepa bacteriana, tal como una cepa de E. coli, que porta mutaciones en una o mas de las rutas de reparacion de ADN. Tales cepas “mutadoras” tienen una mayor tasa de mutacion al azar que la de una cepa silvestre. La propagacion de una secuencia de ADN en una de estas cepas generara eventualmente mutaciones al azar dentro del ADN. Se describen cepas mutadoras adecuadas para su uso para mutagenesis in vivo en, por ejemplo, la publicacion internacional PCT n.° WO 91/016427.
Tambien pueden generarse variantes de ACC usando mutagenesis de casete. En la mutagenesis de casete, se reemplaza una pequena region de una molecula de ADN bicatenaria por un “casete” de oligonucleotido sintetico que difiere de la secuencia de polinucleotido de partida. El oligonucleotido contiene a menudo versiones completa y/o parcialmente aleatorizadas de la secuencia de polinucleotido de partida. Hay muchas aplicaciones de mutagenesis de casete; por ejemplo, preparacion de protemas mutantes mediante mutagenesis de casete (Richards, J. H. (1986) Nature 323: 187; Ecker et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:3524-3527); mutagenesis de casete de codones para insertar o reemplazar codones individuales (Kegler-Ebo et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22(9): 1593-1599); preparacion de secuencias de polinucleotido variantes mediante aleatorizacion de secuencias de polinucleotido no codificantes que comprenden secuencias reguladoras (por ejemplo, sitios de union al ribosoma, vease, por ejemplo, Barrick et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22(7): 1287-1295); Wilson et al. (1994) Biotechniques 17:944-953).
Tambien puede usarse mutagenesis de conjunto recursivo (Arkin et al. (1992) PNAS, USA 89:7811-7815) para generar variantes de secuencia de polinucleotido. La mutagenesis de conjunto recursivo es un algoritmo para la modificacion por ingeniena de protemas (es decir, mutagenesis de protemas) desarrollado para producir diversas poblaciones de mutantes relacionados fenotfpicamente cuyos miembros difieren en la secuencia de aminoacidos. Este metodo usa un mecanismo de realimentacion para controlar tandas sucesivas de mutagenesis de casete combinatoria. Tambien puede usarse mutagenesis de conjunto exponencial (Delegrave et al. (1993) Biotech. Res. 11: 1548-1552) para generar variantes de secuencia de polinucleotido de ACC. La mutagenesis de conjunto exponencial es un procedimiento para generar bibliotecas combinatorias con un alto porcentaje de mutantes unicos y funcionales, en los que se aleatorizan pequenos grupos de residuos en paralelo para identificar, en cada posicion alterada, aminoacidos que conducen a protemas funcionales. Tambien pueden usarse mutagenesis dirigida al sitio y al azar (Arnold (1993) Curr. Opin. Biotech. 4:450-455).
Ademas, pueden usarse metodos de mutagenesis in vivo convencionales. Por ejemplo, celulas huesped, que comprenden una o mas secuencias de polinucleotido que incluyen un marco de lectura abierto para un polipeptido de ACC, asf como secuencias reguladoras operativamente unidas, pueden someterse a mutagenesis por medio de exposicion a radiacion (por ejemplo, luz UV o rayos X) o exposicion a productos qmmicos (por ejemplo, agentes etilantes, agentes alquilantes o analogos de acido nucleico). En algunos tipos de celula huesped, por ejemplo, bacterias, levaduras y plantas, tambien pueden usarse elementos transponibles para mutagenesis in vivo.
La mutagenesis de una o mas secuencias de polinucleotido que codifican para un polipeptido relacionado con ACC generalmente da como resultado la expresion de un producto de polipeptido de ACC que demuestra una funcion biologica modificada y mejorada. Por ejemplo, la mutagenesis de una o mas secuencias de polinucleotido que incluyen un accB generalmente da como resultado la expresion de un producto de polipeptido de BCCP que demuestra una funcion biologica modificada y mejorada tal como actividad de ACC potenciada. Cuando se prepara un grupo de microorganismos recombinantes mediante mutagenesis de una o mas secuencias de polinucleotido que incluyen el marco de lectura abierto que codifica para una BCCP y secuencias reguladoras operativamente unidas, la protema expresada a partir de las secuencias de polinucleotido mutagenizadas resultantes mostraran funcion biologica de ACC aumentada. Por tanto, se observa un rendimiento mejorado de compuestos derivados de malonil- CoA tales como derivados de acidos grasos u otro compuestos, y/o composiciones mejoradas de los mismos que incluyen una mezcla modificada de derivados de acidos grasos u otros compuestos (en cuanto a longitud de cadena, saturacion y similares) tras el cultivo del microorganismo recombinante en condiciones eficaces para expresar el polinucleotido de accB mutante.
Puntos calientes
La divulgacion tambien se basa, al menos en parte, en la identificacion de determinados “puntos calientes” conservados estructuralmente entre polipeptidos de ACC variantes incluyendo polipeptidos de BCCp variantes. Los puntos calientes son regiones en las que se observa un alto numero de mutaciones que conducen a un tttulo superior de derivados de acidos grasos tales como FAME o un tttulo superior de compuestos distintos de acidos grasos. Notablemente, tales regiones se observan en polipeptidos de BCCP variantes, es decir, se observan puntos
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Motivos
La divulgacion tambien se basa, al menos en parte, en la identificacion de determinados motivos conservados estructuralmente entre polipeptidos de ACC variantes incluyendo polipeptidos de BCCP variantes. La biotina protema ligasa (EC 6.3.4.15), tambien conocida como holocarboxilasa sintetasa, cataliza la union covalente del grupo prostetico de la biotina a una lisina espedfica de la subunidad BCCP de ACC. Las protemas de tipo BCCP tienen un motivo conservado en el sitio de union a biotina. El motivo incluye K (lisina), que es el residuo de lisina biotinilado. Polipeptidos de BCCP de diversas especies bacterianas tienen este motivo conservado, lo que sugiere que cualquier mutacion en esa region podna dar como resultado una funcion disminuida. La secuencia consenso para el motivo se muestra a continuacion, en donde K es la lisina biotinilada:
(L/I/V)E(A/V)MK(M/L)
La figura 2 muestra una alineacion de una seccion de secuencias de aminoacidos de BCCP de siete especies bacterianas diferentes, incluyendo Escherichia coli (SEQ ID NO: 97 (parcial); SEQ ID NO: 2 (completa); numero de registro NP_417721), Lactobacillus brevis (SEQ ID No: 98 (parcial); SeQ ID NO: 104 (completa); numero de registro WP_011667655), Stenotrophomonas maltophilia (SEQ ID No: 99 (parcial); SEQ ID NO: 1O5 (completa); numero de registro AIL09846), Pseudomonas putida (SEQ ID NO: 100 (parcial); SeQ ID NO: 106 (completa); numero de registro AE016246_3), Bacillus subtilis (SeQ ID NO: 101 (parcial); SeQ ID NO: 107 (completa); numero de registro NP_390315), Corynebacterium glutamicum (SEQ ID NO: 102 (parcial); SEQ ID nO: 108 (completa); numero de registro WP_011013826) y Saccharomyces cerevisiae (SEQ iD NO: 103 (parcial); SEQ iD nO: 109 (completa); numero de registro AAA20073). El motivo se conserva a traves de las siete especies (vease la region en el recuadro en la figura 2) independientemente de una identidad de secuencia de aminoacidos global que oscila entre aproximadamente el 10% por ciento y aproximadamente el 66% por ciento. Por ejemplo, BCCP de Lactobacillus brevis mostro una identidad del 28% en comparacion con Escherichia coli. BCCP de Stenotrophomonas maltophilia mostro una identidad del 55% en comparacion con Escherichia coli. BCCP de Pseudomonas putida mostro una identidad del 66% en comparacion con Escherichia coli. BCCP de Bacillus subtilis mostro una identidad del 40% en comparacion con Escherichia coli. BCCP de Corynebacterium glutamicum y Saccharomyces cerevisiae mostro una identidad del 10% en comparacion con Escherichia coli. Esto confirma que incluso en especies divergentes el motivo se conserva. Sin embargo, en algunos casos, los polipeptidos de BCCP tienen una alta identidad de secuencia de aminoacidos a traves de diversas especies, que oscila entre aproximadamente una identidad del 85% y aproximadamente una identidad del 100%. Por ejemplo, BCCP de Escherichia albertii es aproximadamente el 98% identica a Escherichia coli; BCCP de Shigella flexneri es aproximadamente el 93% identica a Escherichia coli; y Klebsiella pneumonia es aproximadamente el 85% identica a Escherichia coli.
Celulas huesped y cultivos de celulas huesped
Debe apreciarse, en vista de la presente divulgacion, que cualquiera de las realizaciones contempladas en el presente documento puede ponerse en practica con cualquier celula huesped o microorganismo que pueda modificarse geneticamente por medio de la introduccion de una o mas secuencias de acido nucleico que codifican para una o mas variantes de ACC. Como tales, los microorganismos recombinantes de la divulgacion funcionan como celulas huesped y abarcan una o mas secuencias de polinucleotido que incluyen un marco de lectura abierto que codifica para un polipeptido de ACC variante que confiere actividad de ACC mejorada/aumentada y/o produccion mejorada/aumentada de un compuesto derivado de malonil-CoA, junto con secuencias reguladoras operativamente unidas que facilitan la expresion del polipeptido de ACC en la celula huesped. En un aspecto, el polipeptido que confiere actividad de ACC mejorada/aumentada y/o produccion mejorada/aumentada de un compuesto derivado de malonil-CoA es una variante o un mutante de BCCP. En otro aspecto, el polipeptido que confiere actividad de ACC mejorada/aumentada y/o produccion mejorada/aumentada de un compuesto derivado de malonil-CoA es una BCCP mejorada u otro polipeptido de ACC mejorado o combinacion de los mismos que resulta de cambios de expresion en el operon de accBC. En una celula huesped recombinante de la divulgacion, secuencias codificantes del marco de lectura abierto y/o las secuencias reguladoras pueden modificarse en relacion con la secuencia codificante silvestre correspondiente del polipeptido de BCCP. Se produce una composicion de derivados de acidos grasos cultivando una celula huesped que expresa una variante de ACC (es decir, una celula huesped recombinante) en presencia de una fuente de carbono en condiciones eficaces para expresar el polipeptido de ACC variante incluyendo la BCCP variante (veanse las figuras 1 y 3). La expresion de polipeptidos de ACC variantes o mutantes da como resultado la produccion de composiciones de derivados de acidos grasos con rendimientos aumentados de acidos grasos, esteres grasos, alcoholes grasos, aminas grasas, aldetudos grasos, derivados de acidos grasos bifuncionales, diacidos, hidrocarburos, cetonas, alcanos, alquenos u olefinas, y/o similares. En una realizacion, la expresion de polipeptidos de ACC variantes o mutantes tales como polipeptidos de BCCP variantes da como resultado el rendimiento aumentado de composiciones de esteres grasos incluyendo FAME y/o FAEE. Se produce un compuesto distinto de acido graso cultivando una celula huesped que expresa una variante de ACC (es decir, una celula huesped recombinante) en presencia de una fuente de carbono en condiciones eficaces para expresar el polipeptido de ACC variante incluyendo la BCCP variante (vease la figura 4). La expresion de polipeptidos de ACC variantes o mutantes da como resultado la produccion de compuestos distintos de acidos
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grasos con rendimientos aumentados incluyendo policetidos, flavanonas, flavonoides, acido 3-hidroxipropionico (3- HP), malonato, y otros (vease la figura 4).
Las celulas huesped o microorganismos de la divulgacion incluyen cepas huesped o celulas huesped que se modifican por ingeniena genetica para contener alteraciones geneticas con el fin de someter a prueba la eficacia de mutaciones espedficas sobre actividades enzimaticas (es decir, celulas recombinantes o microorganismos). Pueden usarse diversas manipulaciones y alteraciones geneticas opcionales de manera intercambiable de una celula huesped a otra, dependiendo de que rutas nativas estan presentes en la celula huesped original. En una realizacion, puede usarse una cepa huesped para someter a prueba las variantes de ACC. Una cepa huesped puede abarcar varias alteraciones geneticas con el fin de someter a prueba variables espedficas y entornos de cultivo, incluyendo pero sin limitarse a, condiciones de cultivo incluyendo componentes de fermentacion, fuente de carbono (por ejemplo, materia prima), temperatura, presion, condiciones de contaminacion de cultivo reducidas, y niveles de oxfgeno.
En una realizacion, se usa una celula huesped denominada BD64. BD64 se basa en la cepa de E. coli MG1655 que abarca una delecion de fadE y fhuA opcional. La acil-CoA deshidrogenasa (FadE) es una enzima que es importante para metabolizar acidos grasos. Cataliza la segunda etapa en la utilizacion de acidos grasos (beta-oxidacion), que es el proceso de romper cadenas largas de acidos grasos (acil-CoA) para dar moleculas de acetil-CoA. Mas espedficamente, la segunda etapa del ciclo de p-oxidacion de la degradacion de acidos grasos en bacterias es la oxidacion de acil-CoA para dar 2-enoil-CoA, que se cataliza por FadE. Cuando E. coli carece de FadE, no puede crecer sobre acidos grasos como fuente de carbono pero puede crecer sobre acetato. La incapacidad de utilizar acidos grasos de cualquier longitud de cadena concuerda con el fenotipo notificado de cepas de fadE, es decir, cepas mutantes para fadE en las que la funcion de FadE esta alterada. El gen fadE puede inactivarse o atenuarse opcionalmente para garantizar que acil-CoA, que son productos intermedios en esta ruta, puedan acumularse en la celula de manera que los acil-CoA puedan convertirse eficazmente en esteres grasos por la ester sintasa. Sin embargo, la atenuacion de fadE es opcional cuando se usa azucar como fuente de carbono puesto que en tal condicion la expresion de FadE se reprime probablemente y FadE por tanto solo puede estar presente en pequenas cantidades y no puede competir eficazmente con la ester sintasa por sustratos de acil-CoA. FadE se reprime debido a represion por catabolitos. E. coli y muchos otros microbios prefieren consumir azucar que acidos grasos, de modo que cuando ambas fuentes estan disponibles se consume en primer lugar azucar reprimiendo el regulon de fad (vease D. Clark, J Bacteriol. (1981) 148(2):521-6)). Ademas, la ausencia de azucares induce la expresion de FadE. Podnan perderse productos intermedios de acil-CoA en la ruta de beta oxidacion puesto que las protemas expresadas por el regulon de fad (incluyendo FadE) se regulan por incremento y competiran eficazmente por acil- CoA. Por tanto, puede ser beneficioso tener el gen fadE inactivado o atenuado. Puesto que muchas fuentes de carbono se basan en azucar, es opcional atenuar FadE. El gen fhuA codifica para la protema TonA, que es un transportador y receptor acoplado a energfa en la membrana externa de E. coli (V. Braun (2009) J Bacteriol. 191(11):3431-3436). Su delecion es opcional. La delecion de fhuA permite que la celula sea mas resistente al ataque de fagos, lo que puede ser beneficioso en determinadas condiciones de fermentacion. Por tanto, puede ser deseable delecionar fhuA en una celula huesped que es probable que se vea sometida a una posible contaminacion durante las tandas de fermentacion.
La cepa huesped BD64 (anteriormente) tambien abarca la sobreexpresion opcional de uno o mas de los siguientes genes: fadR de Escherichia coli, fabA de Salmonella typhimurium (NP_460041), fabD de Salmonella typhimurium (NP_460164), fabG de Salmonella typhimurium (NP_460l65), fabH de Salmonella typhimurium (NP_460l63), fabV de Vibrio cholera (YP_001217283) y fabF de Clostridium acetobutylicum (NP_350156). La sobreexpresion de uno o mas de estos genes, que codifican para enzimas y reguladores en la biosmtesis de acidos grasos, puede servir para aumentar adicionalmente el tttulo de compuestos derivados de acidos grasos bajo diversas condiciones de cultivo.
En otra realizacion, se usan las cepas de E. coli silvestre MG1655 o W3110 como celulas huesped a modo de ejemplo para la produccion de derivados de acidos grasos. De manera similar, estas celulas huesped proporcionan la sobreexpresion opcional de uno o mas genes de biosmtesis (es decir, genes que codifican para enzimas y reguladores de biosmtesis de acidos grasos) que pueden aumentar el tttulo de compuestos derivados de acidos grasos en diversas condiciones de cultivo. Las alteraciones geneticas incluyen fadR de Escherichia coli, fabA de Salmonella typhimurium (NP_460041), fabD de Salmonella typhimurium (NP_460164), fabG de Salmonella typhimurium (Np_460165), fabH de Salmonella typhimurium (NP_46o163), fabV de Vibrio cholera (YP_001217283) y fabF de Clostridium acetobutylicum (NP_350156).
En algunas realizaciones, las celulas huesped o microorganismos que se usan para expresar los polipeptidos de ACC variantes expresaran ademas genes que abarcan determinadas actividades enzimaticas que pueden aumentar la produccion en uno o mas derivado(s) de acidos grasos particulares tales como esteres grasos, alcoholes grasos, aminas grasas, aldehfdos grasos, derivados de acidos grasos bifuncionales, diacidos, y similares (veanse las figuras 1 y 3) asf como alcanos, alquenos u olefinas, y cetonas. En una realizacion, la celula huesped tiene actividad tioesterasa (E.C. 3.1.2.* o E.C. 3.1.2.14 o E.C. 3.1.1.5) para la produccion de acidos grasos que puede aumentarse sobreexpresando el gen. En otra realizacion, la celula huesped tiene actividad ester sintasa (E.C. 2.3.1.75) para la produccion de esteres grasos. En otra realizacion, la celula huesped tiene actividad acil-ACP reductasa (AAR) (E.C. 1.2.1.80) y/o actividad alcohol deshidrogenasa (E.C. 1.1.1.1.) y/o actividad alcohol graso acil-CoA reductasa (FAR) (E.C. 1.1.1.*) y/o actividad acido carboxflico reductasa (CAR) (EC 1.2.99.6) para la produccion de alcoholes grasos.
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En otra realizacion, la celula huesped tiene actividad acil-ACP reductasa (AAR) (E.C. 1.2.1.80) para la produccion de aldetndos grasos. En otra realizacion, la celula huesped tiene actividad acil-ACP reductasa (AAR) (E.C. 1.2.1.80) y actividad descarbonilasa para la produccion de alcanos y alquenos. En otra realizacion, la celula huesped tiene actividad acil-CoA reductasa (E.C. 1.2.1.50), actividad acil-CoA sintasa (FadD) (E.C. 2.3.1.86) y actividad tioesterasa (E.C. 3.1.2 * o E.C. 3.1.2.14 o E.C. 3.1.1.5) para la produccion de alcoholes grasos. En otra realizacion, la celula huesped tiene actividad ester sintasa (E.C. 2.3.1.75), actividad acil-CoA sintasa (FadD) (E.C. 2.3.1.86) y actividad tioesterasa (E.C. 3.1.2.* o E.C. 3.1. 2.14 o E.C. 3.1.1.5) para la produccion de esteres grasos. En otra realizacion, la celula huesped tiene actividad OleA para la produccion de cetonas. En otra realizacion, la celula huesped tiene actividad OleBCD actividad para la produccion de olefinas internas. En otra realizacion, la celula huesped tiene actividad acil-ACP reductasa (AAR) (E.C. 1.2.1.80) y actividad alcohol deshidrogenasa (E.C. 1.1.1.1.) para la produccion de alcoholes grasos. En otra realizacion, la celula huesped tiene actividad tioesterasa (E.C. 3.1,2.* o E.C. 3.1.2.14 o E.C. 3.1.1.5) y actividad descarboxilasa para preparar olefinas terminales. La expresion de actividades enzimaticas en microorganismos y celulas microbianas se ensena por las patentes estadounidenses numeros 8.097.439; 8,110,093; 8,110,670; 8,183,028; 8,268,599; 8,283,143; 8,232,924; 8,372,610; y 8,530,221, que se incorporan en el presente documento por referencia.
En otras realizaciones, las celulas huesped o microorganismos que se usan para expresar los polipeptidos de ACC variantes incluiran determinadas actividades enzimaticas nativas que estan reguladas por incremento o sobreexpresadas con el fin de producir uno o mas derivado(s) de acidos grasos particulares tales como esteres grasos, alcoholes grasos, aminas grasas, aldehfdos grasos, derivados de acidos grasos bifuncionales, diacidos y similares (vease la figura 1). En una realizacion, la celula huesped tiene una actividad tioesterasa nativa (E.C. 3.1.2.* o E.C. 3.1.2.14 o E.C. 3.1.1.5) para la produccion de acidos grasos que puede aumentarse sobreexpresando el gen de tioesterasa.
La presente divulgacion incluye microorganismos o cepas huesped que expresan secuencias de polipeptidos de ACC variantes incluyendo secuencias de polipeptido de BCCP variantes. Los ejemplos de secuencias de polipeptido de BCCP variantes que cuando se expresan en una celula huesped dan como resultado un tftulo superior de derivados de acidos grasos incluyendo esteres grasos incluyen pero no se limitan a, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34,
SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48,
SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62,
SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76,
SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88 y SEQ ID NO: 90.
La celula huesped recombinante puede producir un ester graso, tal como un ester metflico de acidos grasos (FAME) o un ester etflico de acidos grasos (FAEe), un alcohol graso, una amina grasa, un aldehfdo graso, un derivado de acido graso bifuncional, un diacido, un alcano, una olefina, un hidrocarburo, o similares; o un compuesto distinto de acidos grasos tal como una flavanona, un flavonoide, un policetido, malonato o acido 3-hidroxipropionico. Los derivados de acidos grasos u otros compuestos se recuperan normalmente del medio de cultivo y/o se afslan de las celulas huesped. En una realizacion, los derivados de acidos grasos u otros compuestos se recuperan del medio de cultivo (extracelular). En otra realizacion, los derivados de acidos grasos u otros compuestos se afslan de las celulas huesped (intracelular). En otra realizacion, los derivados de acidos grasos u otros compuestos se recuperan del medio de cultivo y se afslan de las celulas huesped. La composicion de derivados de acidos grasos producidos por una celula huesped puede analizarse usando metodos conocidos en la tecnica, por ejemplo, CG-FID, con el fin de determinar la distribucion de derivados de acidos grasos particulares asf como las longitudes de cadena y el grado de saturacion de los componentes de la composicion de derivados de acidos grasos. De manera similar, pueden analizarse otros compuestos a traves de metodos bien conocidos en la tecnica.
Los ejemplos de celulas huesped que funcionan como microorganismos incluyen, pero no se limitan a celulas del genero Escherichia, Bacillus, Lactobacillus, Zymomonas, Rhodococcus, Pseudomonas, Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, Fusarium, Humicola, Rhizomucor, Kluyveromyces, Pichia, Mucor, Myceliophtora, Penicillium, Phanerochaete, Pleurotus, Trametes, Chrysosporium, Saccharomyces, Stenotrophomonas, Schizosaccharomyces, Yarrowia o Streptomyces. En algunas realizaciones, la celula huesped es una celula bacteriana Gram-positiva. En otras realizaciones, la celula huesped es una celula bacteriana Gram-negativa. En algunas realizaciones, la celula huesped es una celula de E. coli. En otras realizaciones, la celula huesped es una celula de Bacillus lentus, una celula de Bacillus brevis, una celula de Bacillus stearothermophilus, una celula de Bacillus licheniformis, una celula de Bacillus alcalophilus, una celula de Bacillus coagulans, una celula de Bacillus circulans, una celula de Bacillus pumilus, una celula de Bacillus thuringiensis, una celula de Bacillus clausii, una celula de Bacillus megaterium, una celula de Bacillus subtilis o una celula de Bacillus amyloliquefaciens.
Todavfa en otras realizaciones, la celula huesped es una celula de Trichoderma koningii, una celula de Trichoderma viride, una celula de Trichoderma reesei, una celula de Trichoderma longibrachiatum, una celula de Aspergillus awamori, una celula de Aspergillus fumigatus, una celula de Aspergillus foetidus, una celula de Aspergillus nidulans, una celula de Aspergillus niger, una celula de Aspergillus oryzae, una celula de Humicola insolens, una celula de Humicola lanuginosa, una celula de Rhodococcus opacus, una celula de Rhizomucor miehei o una celula de Mucor michei. En aun otras realizaciones, la celula huesped es una celula de Streptomyces lividans o una celula de
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Streptomyces murinus. En aun otras realizaciones, la celula huesped es una celula de Actinomycetes. En algunas realizaciones, la celula huesped es una celula de Saccharomyces cerevisiae.
En otras realizaciones, la celula huesped es una celula de una planta eucariota, alga, cianobacteria, bacteria verde del azufre, bacteria verde no del azufre, bacteria purpura del azufre, bacteria purpura no del azufre, extremofilo, levadura, hongo, un organismo modificado por ingeniena genetica de los mismos o un organismo sintetico. En algunas realizaciones, la celula huesped es dependiente de la luz o fija carbono. En algunas realizaciones, la celula huesped tiene actividad autotrofa.
En algunas realizaciones, la celula huesped tiene actividad fotoautotrofa, tal como en presencia de luz. En algunas realizaciones, la celula huesped es heterotrofa o mixotrofa en ausencia de luz. En determinadas realizaciones, la celula huesped es una celula de Arabidopsis thaliana, Panicum virgatum, Miscanthus giganteus, Zea mays, Botryococcus braunii, Chlamydomonas reinhardtii, Dunaliella salina, Synechococcus Sp. PCC 7002, Synechococcus Sp. PCC 7942, Synechocystis sp. PCC 6803, Thermosynechococcus elongatus BP-1, Chlorobium tepidum, Chloroflexus aurantiacus, Chromatium vinosum, Rhodospirillum rubrum, Rhodobacter capsulatus,
Rhodopseudomonas palustris, Clostridium ljungdahlii, Clostridium thermocellum, Penicillium chrysogenum, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pseudomonas fluorescens o Zymomonas mobilis.
En una realizacion, la celula microbiana es de una cianobacteria incluyendo, pero sin limitarse a, Prochlorococcus, Synechococcus, Synechocystis, Cyanothece y Nostoc punctiforme. En otra realizacion, la celula microbiana es de una especie de cianobacteria espedfica incluyendo, pero sin limitarse a, Synechococcus elongatus PCC7942, Synechocystis sp. PCC6803 y Synechococcus sp. PCC7001.
Metodos de preparacion de cultivos y celulas huesped recombinantes
Pueden usarse diversos metodos bien conocidos en la tecnica para modificar por ingeniena genetica celulas huesped para producir derivados de acidos grasos y/o composiciones de derivados de acidos grasos u otros compuestos. Los metodos pueden incluir el uso de vectores, preferiblemente vectores de expresion, que comprenden un acido nucleico que codifica para una ACC variante o mutante incluyendo una BCCP variante o mutante, tal como se describe en el presente documento. Los expertos en la tecnica apreciaran una variedad de vectores virales y no virales que pueden usarse en los metodos descritos en el presente documento.
En algunas realizaciones de la presente divulgacion, un tttulo superior de un compuesto tal como un ester de acido graso en una composicion particular es un tttulo superior de un tipo particular de ester de acido graso o una combinacion de esteres de acidos grasos producidos por un cultivo de celulas huesped recombinantes en relacion con el tftulo del mismo ester de acido graso o combinacion de esteres de acidos grasos producidos por un cultivo de control de una celulas huesped silvestre correspondiente. En otras realizaciones, se producen otros derivados de acidos grasos o compuestos distintos de acidos grasos por el cultivo de celulas huesped recombinantes de un modo similar. En algunas realizaciones, se proporciona una secuencia de polinucleotido (o gen) de ACC variante o mutante incluyendo una secuencia de polinucleotido (o gen) de accB variante o mutante a la celula huesped por medio de un vector recombinante, que comprende un promotor operativamente unido a la secuencia de polinucleotido. En determinadas realizaciones, el promotor es un promotor regulado por el desarrollo, uno espedfico de organulo, uno espedfico de tejido, uno inducible, uno constitutivo o uno espedfico de celula. El vector recombinante comprende normalmente al menos una secuencia seleccionada de una secuencia de control de la expresion acoplada operativamente a la secuencia de polinucleotido; un marcador de seleccion acoplado operativamente a la secuencia de polinucleotido; una secuencia de marcador acoplada operativamente a la secuencia de polinucleotido; un resto de purificacion acoplado operativamente a la secuencia de polinucleotido; una secuencia de secrecion acoplada operativamente a la secuencia de polinucleotido; y una secuencia de direccionamiento acoplada operativamente a la secuencia de polinucleotido. Las secuencias de polinucleotido, que comprenden marcos de lectura abiertos que codifican para protemas y secuencias reguladoras operativamente unidas, pueden integrarse en un cromosoma de las celulas huesped recombinantes, incorporarse en uno o mas sistemas de plasmido de expresion en las celulas huesped recombinantes, o ambos.
Los vectores de expresion descritos en el presente documento incluyen una secuencia de polinucleotido descrita en el presente documento en una forma adecuada para la expresion de la secuencia de polinucleotido en una celula huesped. Los expertos en la tecnica apreciaran que el diseno del vector de expresion puede depender de factores tales como la eleccion de la celula huesped que va a transformarse, el nivel de expresion del polipeptido deseado, etc. Los vectores de expresion descritos en el presente documento pueden introducirse en las celulas huesped para producir polipeptidos, incluyendo polipeptidos de fusion, codificados por las secuencias de polinucleotido descritas en el presente documento. La expresion de genes que codifican para polipeptidos en procariotas, por ejemplo, E. coli, se lleva a cabo lo mas a menudo con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresion de polipeptidos o bien de fusion o bien de no fusion. Se conocen bien en la tecnica sistemas de expresion adecuados para celulas tanto procariotas como eucariotas; vease, por ejemplo, Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, segunda edicion, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989). En determinadas realizaciones, una secuencia de polinucleotido de la divulgacion esta operativamente unida a un promotor derivado del bacteriofago T5. En una realizacion, la celula huesped es una celula de levadura. En esta
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realizacion, el vector de expresion es un vector de expresion de levadura. Pueden introducirse vectores en celulas procariotas o eucariotas por medio de una variedad tecnicas reconocidas en la tecnica para introducir acido nucleico foraneo (por ejemplo, ADN) en una celula huesped. Pueden encontrarse metodos adecuados para transformar o transfectar celulas huesped en, por ejemplo, Sambrook et al. (anteriormente).
Para la transformacion estable de celulas bacterianas, se sabe que, dependiendo del vector de expresion y la tecnica de transformacion usados, solo una pequena fraccion de celulas captara y replicara el vector de expresion. En algunas realizaciones, con el fin de identificar y seleccionar estos transformantes, se introduce un gen que codifica para un marcador seleccionable (por ejemplo, resistencia a un antibiotico) en las celulas huesped junto con el gen de interes. Los marcadores seleccionables incluyen los que confieren resistencia a farmacos tales como, pero sin limitarse a, ampicilina, kanamicina, cloranfenicol o tetraciclina. Pueden introducirse acidos nucleicos que codifican para un marcador seleccionable en una celula huesped en el mismo vector que el que codifica para un polipeptido descrito en el presente documento o pueden introducirse en un vector separado. Las celulas transformadas de manera estable con el acido nucleico introducido pueden identificarse mediante crecimiento en presencia de un farmaco de seleccion apropiado.
Cultivo y fermentacion de celulas huesped recombinantes
Tal como se usa en el presente documento, el termino “fermentacion” se refiere ampliamente a la conversion de materiales organicos en sustancias diana por celulas huesped, por ejemplo, la conversion de una fuente de carbono por celulas huesped recombinantes en acidos grasos o derivados de los mismos mediante la propagacion de un cultivo de las celulas huesped recombinantes en un medio que comprende la fuente de carbono. Tal como se usa en el presente documento, el termino “condiciones permisivas para la produccion” significa cualesquiera condiciones que permiten que una celula huesped produzca un producto deseado, tal como un compuesto derivado de malonil- CoA incluyendo derivados de acidos grasos y otros compuestos distintos de acidos grasos. De manera similar, el termino “condiciones en las que se expresa la secuencia de polinucleotido de un vector” significa cualesquiera condiciones que permiten que una celula huesped sintetice un polipeptido. Las condiciones adecuadas incluyen, por ejemplo, condiciones de fermentacion. Las condiciones de fermentacion pueden incluir muchos parametros incluyendo, pero sin limitarse a, intervalos de temperatura, niveles de aireacion, tasas de alimentacion y composicion de medios. Cada una de estas condiciones, individualmente y en combinacion, permiten que crezca la celula huesped. La fermentacion puede ser aerobia, anaerobia, o variaciones de las mismas (tales como microaerobias). Los medios de cultivo a modo de ejemplo incluyen caldos o geles. Generalmente, el medio incluye una fuente de carbono que puede metabolizarse por una celula huesped directamente. Ademas, pueden usarse enzimas en el medio para facilitar la movilizacion (por ejemplo, la despolimerizacion de almidon o celulosa para dar azucares fermentables) y el metabolismo posterior de la fuente de carbono.
Para la produccion a pequena escala, las celulas huesped modificadas por ingeniena genetica pueden hacerse crecer en lotes de, por ejemplo, aproximadamente 100 |il, 200 |il, 300 |il, 400 |il, 500 |il, 1 ml, 5 ml, 10 ml, 15 ml, 25 ml, 50 ml, 75 ml, 100 ml, 500 ml, 1 l, 2 l, 5 l o 10 l; fermentarse; e inducirse para expresar una secuencia de polinucleotido deseada, tal como una secuencia de polinucleotido que codifica para un polipeptido de ACC variante. Para la produccion a gran escala, las celulas huesped modificadas por ingeniena genetica pueden hacerse crecer en cultivos que tienen un volumen de lotes de aproximadamente 10 l, 100 l, 1000 l, 10.000 l, 100.000 l y 1.000.000 l o mas; fermentarse; e inducirse para expresar una secuencia de polinucleotido deseada. Las composiciones de derivados de acidos grasos u otros compuestos descritas en el presente documento pueden encontrarse en el entorno extracelular del cultivo de celulas huesped recombinantes y pueden aislarse facilmente del medio de cultivo. Un derivado de acido graso puede secretarse por la celula huesped recombinante, transportarse al entorno extracelular o transferirse de manera pasiva al entorno extracelular del cultivo del cultivo de celulas huesped recombinantes. En una realizacion, puede aislarse una composicion de esteres grasos de un cultivo de celulas huesped recombinantes usando metodos de rutina conocidos en la tecnica. Cualquier compuesto distinto de acidos grasos puede producirse extracelular o intracelularmente.
Examen de celulas huesped recombinantes
En una realizacion de la presente divulgacion, la actividad de un polipeptido de ACC variante o mutante se determina cultivando celulas huesped recombinantes (que comprenden una o mas secuencias de polinucleotido de ACC variantes o mutagenizadas), seguido por examen para identificar caractensticas de, por ejemplo, composiciones de derivados de acidos grasos u otros compuestos producidos por las celulas huesped recombinantes; por ejemplo, tttulo, rendimiento y productividad de derivados de acidos grasos u otro compuestos. En otra realizacion, la actividad de un polipeptido de ACC variante o mutante se determina cultivando celulas huesped recombinantes (que comprenden una o mas secuencias de polinucleotido de ACC variantes o mutagenizadas), seguido por examen para identificar caractensticas de, por ejemplo, composiciones de derivados de acidos grasos (por ejemplo, esteres grasos, alcoholes grasos, aldehfdos grasos, etc.) u otros compuestos producidos por las celulas huesped recombinantes; por ejemplo: tftulo, rendimiento y productividad de derivados de acidos grasos u otro compuestos. Pueden someterse a ensayo loso polipeptidos de ACC variantes o mutantes o polipeptidos de BCCP variantes o mutantes y fragmentos de los mismos para detectar actividad de ACC mejorada y/o produccion mejorada/aumentada de un compuesto derivado de malonil-CoA usando metodos de rutina. Por ejemplo, se pone en contacto un polipeptido de aCc variante o mutante o polipeptido de BCCP variante o mutante o
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fragmento del mismo con un sustrato (por ejemplo, un acil-CoA, un acil-ACP, un acido graso libre, un alcohol) en condiciones que permiten que el polipeptido funcione. En una realizacion, puede medirse una disminucion en el nivel del sustrato o un aumento en el nivel de un ester graso o una composicion de esteres grasos para determinar la actividad de ACC. Lo mismo se aplica a la produccion de alcoholes grasos, aldehudos grasos, aminas grasas y otros derivados de acidos grasos as^ como otros compuestos.
Productos derivados de celulas huesped recombinantes
Tal como se usa en el presente documento, “fraccion de carbono moderno” o fM tiene el mismo significado definido por los materiales de referencia patron del Instituto Nacional de Normas y Tecnologfa (NIST) (SRM 4990B y 4990C, conocidos como patrones de acido oxalico HOxI y HOxII, respectivamente). La definicion fundamental se refiere a 0,95 veces la razon isotopica 14C/12C HOxl (con referencia a AD 1950). Esto es aproximadamente equivalente a la madera antes de la Revolucion Industrial corregida para la desintegracion. Para la biosfera viva actual (material vegetal), fM es aproximadamente 1,1.
Los bioproductos (por ejemplo, las composiciones de derivados de acidos grasos o composiciones distintas de acidos grasos segun la presente divulgacion) incluyendo compuestos organicos producidos biologicamente y, en particular, las composiciones de esteres grasos producidos usando la ruta de biosmtesis de acidos grasos descrita en el presente documento, se han producido a partir de fuentes de carbono renovables y, como tal, son nuevas composiciones de materia. Estos nuevos bioproductos pueden distinguirse de compuestos organicos derivados de carbono petroqmmico basandose en la obtencion de huella isotopica de carbono dual o la datacion mediante 14C. Adicionalmente, la fuente espedfica de carbono de fuente biologica (por ejemplo, glucosa frente a glicerol) puede determinarse mediante obtencion de huella isotopica de carbono dual (vease, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 7.169.588). La capacidad para distinguir bioproductos de compuestos organicos basados en el petroleo es beneficiosa en la trazabilidad de estos materiales en el comercio. Por ejemplo, pueden distinguirse compuestos organicos o qmmicos que comprenden perfiles isotopicos de carbono tanto de base biologica como de base en el petroleo de compuestos organicos y qmmicos que se componen solo de materiales basados en el petroleo. Asf, los bioproductos en el presente documento pueden someterse a seguimiento o trazabilidad en el comercio basandose en su perfil isotopico de carbono unico. Los bioproductos pueden distinguirse de compuestos organicos basados en el petroleo comparando la razon isotopica de carbono estable (13C/12C) en cada muestra. La razon 13C/12C en un bioproducto dado es consecuencia de la razon 13C/12C en el dioxido de carbono atmosferico en el momento en que se fija el dioxido de carbono. Tambien refleja la ruta metabolica precisa. Tambien se producen variaciones regionales. El petroleo, las plantas C3 (las de hoja caduca), las plantas C4 (las hierbas) y carbonatos marinos muestran todos diferencias significativas en 13C/12C y los valores de 813C correspondientes. Las plantas tanto C4 como C3 muestran un intervalo de razones isotopicas 13C/12C, pero valores tfpicos son de aproximadamente -7 a aproximadamente -13 por cada mil para plantas C4 y de aproximadamente -19 a aproximadamente -27 por cada mil para plantas C3 (vease, por ejemplo, Stuiver et al. (1977) Radiocarbon 19:355 (1977)). El carbon y el petroleo se encuentran generalmente en este ultimo intervalo.
813C (%„) = [(13C/12C)muestra - (13C/12C)patron]/ (13C/12C)patron x 1000
Se han desarrollado una serie de RM alternativos en cooperacion con IAEA, USGS, NIST, y otros laboratorios de isotopos internacionales seleccionados. Las notaciones para las desviaciones por mil con respecto a PDB es 813C. Se realizan las mediciones con CO2 mediante espectrometna de masas de razon estable de alta precision (IRMS) con iones moleculares de masas 44, 45 y 46. Las composiciones descritas en el presente documento incluyen
composiciones de esteres grasos y productos producidos mediante cualquiera de los metodos descritos en el
presente documento. Espedficamente, la composicion de esteres grasos o producto puede tener un 813C de aproximadamente -28 o mayor, aproximadamente -27 o mayor, -20 o mayor, -18 o mayor, -15 o mayor, -13 o mayor, -10 o mayor u -8 o mayor. Por ejemplo, la composicion de esteres grasos o producto puede tener un 813C de aproximadamente -30 a aproximadamente -15, de aproximadamente -27 a aproximadamente -19, de
aproximadamente -25 a aproximadamente -21, de aproximadamente -15 a aproximadamente -5, de
aproximadamente -13 a aproximadamente -7 o de aproximadamente -13 a aproximadamente -10. En otros casos, la composicion de esteres grasos o producto puede tener un 813C de aproximadamente -10, -11, -12 o -12,3. Las composiciones de esteres grasos y productos producidos segun la divulgacion en el presente documento, tambien pueden distinguirse de compuestos organicos basados en el petroleo comparando la cantidad de 14C en cada compuesto. Dado que el 14C tiene una semivida nuclear de 5730 anos, los combustibles basados en el petroleo que contienen carbono mas “antiguo” pueden distinguirse de composiciones de esteres grasos y bioproductos que contienen carbono “mas nuevo” (veanse, por ejemplo, Currie, “Source Apportionment of Atmospheric Particles”, Characterization of Environmental Particles, J. Buffle y H. P. van Leeuwen, eds., 1 de vol. I de IUPAC Environmental Analytical Chemical Series (Lewis Publishers, Inc.) 3-74, (1992)).
La suposicion basica en la datacion por radiocarbono es que la constancia de la concentracion de 14C en la atmosfera conduce a la constancia de 14C en organismos vivos. Sin embargo, debido a las pruebas nucleares atmosfericas desde 1950 y el quemado de combustibles fosiles desde 1850, el 14C ha adquirido una segunda caractenstica temporal geoqmmica. Su concentracion en el CO2 atmosferico, y asf en la biosfera viva, se duplico aproximadamente en el apogeo de las pruebas nucleares, a mediados de los anos 1960. Desde entonces se ha vuelto gradualmente a la tasa isotopica (14C/12C) inicial cosmogenica (atmosferica) de estado estacionario de
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aproximadamente 1,2 x 10-12, con una “semivida” de relajacion aproximada de 7-10 anos. (Esta ultima semivida no ha de tomarse literalmente; mas bien, debe usarse la funcion de entrada/desintegracion nuclear atmosferica detallada para rastrear la variacion de 14C atmosferico y de la biosfera desde el comienzo de la era nuclear). Es esta ultima caractenstica temporal de 14C de la biosfera la que mantiene la promesa de datacion anual de carbono reciente de la biosfera. Puede medirse el 14C mediante espectrometna de masas con acelerador (AMS), facilitandose los resultados en unidades de “fraccion de carbono moderno” (fM). Las composiciones de esteres grasos y productos descritos en el presente documento incluyen bioproductos que pueden tener un fM14C de al menos aproximadamente 1. Por ejemplo, el bioproducto de la divulgacion puede tener un fM14C de al menos aproximadamente 1,01, un fM14C de aproximadamente 1 a aproximadamente 1,5, un fM14C de aproximadamente 1,04 a aproximadamente 1,18, o un fM14C de aproximadamente 1,111 a aproximadamente 1,124.
Otra medicion de 14C se conoce como el tanto por ciento de carbono moderno (pMC).++ Para un arqueologo o geologo que usa dataciones por 14C, 1950 es igual a una edad de “cero anos”. Esto tambien representa 100 pMC. El “carbono de bombas” en la atmosfera alcanzo casi el doble del nivel normal en 1963 en el apogeo de las armas termonucleares. Su distribucion dentro de la atmosfera se ha aproximado desde su aparicion, mostrando valores que son mayores de 100 pMC para plantas y animales que viven desde 1950. Ha disminuido gradualmente a lo largo del tiempo, siendo el valor de hoy en dfa proximo a 107,5 pMC. Esto significa que un material de biomasa reciente, tal como mafz, proporcionana una firma de 14C proxima a 107,5 pMC. Los compuestos basados en el petroleo tendran un valor de pMC de cero. La combinacion de carbono fosil con carbono de hoy en dfa dara como resultado una dilucion del contenido de pMC de hoy en dfa. Suponiendo que 107,5 pMC representa el contenido de 14C de materiales de biomasa de hoy en dfa y 0 pMC representa el contenido de 14C de productos basados en el petroleo, el valor de pMC medido para ese material reflejara las proporciones de los dos tipos de componente. Por ejemplo, un material derivado al 100% de soja de hoy en dfa proporcionara una firma de radiocarbono proxima a 107,5 pMC. Si ese material se diluyera al 50% con productos basados en el petroleo, proporcionana una firma de radiocarbono de aproximadamente 54 pMC. Se deriva un contenido de carbono de base biologica asignando el “100%” igual a 107,5 pMC y el “0%” igual a 0 pMC. Por ejemplo, una muestra que mide 99 pMC proporcionara un contenido de carbono de base biologica equivalente del 93%. Este valor se denomina el resultado de carbono de base biologica medio y supone que todos los componentes dentro del material analizado se originan o bien a partir de material biologico de hoy en dfa o bien a partir de material basado en el petroleo. Un bioproducto que comprende uno o mas derivados de acido graso tal como se describe en el presente documento puede tener un pMC de al menos aproximadamente 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 o 100. En otros casos, un bioproducto descrito en el presente documento puede tener un pMC de entre aproximadamente 50 y aproximadamente 100; entre aproximadamente 60 y aproximadamente 100; entre aproximadamente 70 y aproximadamente 100; entre aproximadamente 80 y aproximadamente 100; entre aproximadamente 85 y aproximadamente 100; entre aproximadamente 87 y aproximadamente 98; o entre aproximadamente 90 y aproximadamente 95. En aun otros casos, un bioproducto descrito en el presente documento puede tener un pMC de aproximadamente 90, 91, 92, 93, 94 o 94,2.
Composiciones de esteres grasos
Los ejemplos de esteres grasos incluyen esteres de acidos grasos, tales como los derivados de alcoholes de cadena corta, incluyendo FAEE y FAME, y los derivados de alcoholes grasos de cadena mas larga. Los esteres grasos y/o composiciones de esteres grasos que se producen pueden usarse, individualmente o en combinaciones adecuadas, como biocombustible (por ejemplo, un biodiesel), compuesto qmmico industrial, o componente de, o materia prima para, biocombustible o producto qmmico industrial. En algunos aspectos, la divulgacion se refiere a un metodo de produccion de una composicion de esteres grasos que comprende uno o mas esteres de acidos grasos, incluyendo, por ejemplo, FAEE, FAME y/u otros derivados de esteres de acidos grasos de alcoholes de cadena mas larga. En aspectos relacionados, el metodo comprende un huesped de produccion modificado por ingeniena genetica adecuado para preparar esteres grasos y composiciones de esteres grasos incluyendo, pero sin limitarse a, FAME, FAEE, esteres propflicos de acidos grasos, esteres isopropflicos de acidos grasos, esteres butflicos de acidos grasos, monogliceridos, esteres isobutflicos de acidos grasos, esteres 2-butflicos de acidos grasos y esteres terc- butflicos de acidos grasos, y similares.
Los esteres tienen muchos usos comerciales. Por ejemplo, el biodiesel, un combustible alternativo, se compone de esteres (por ejemplo, ester metflico de acidos grasos, esteres etflicos de acidos grasos, etc.). Algunos esteres de bajo peso molecular son volatiles con un olor agradable, lo que los hace utiles como fragancias o agentes aromatizantes. Ademas, se usan esteres como disolventes para lacas, pinturas y barnices. Ademas, algunas sustancias que se producen de manera natural, tales como ceras, grasas y aceites, se componen de esteres. Esteres tambien se usan como agentes de ablandamiento en resinas y plasticos, plastificantes, retardantes de la llama y aditivos en gasolina y gasoil. Ademas, pueden usarse esteres en la fabricacion de polfmeros, pelfculas, textiles, colorantes y productos farmaceuticos.
En general, el ester graso o la composicion de esteres grasos se afsla del entorno extracelular de la celula huesped. En algunas realizaciones, el ester graso o la composicion de esteres grasos se secreta de manera espontanea, parcial o completamente, de la celula huesped. En realizaciones alternativas, el ester graso o la composicion de esteres grasos se transporta al entorno extracelular, opcionalmente con la ayuda de una o mas protemas de transporte. En todavfa otras realizaciones, el ester graso o la composicion de esteres grasos se transporta de
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manera pasiva al entorno extracelular.
Composiciones de alcoholes grasos
Los ejemplos de alcoholes grasos incluyen alcoholes grasos saturados, insaturados, de cadena lineal y de cadena ramificada. Los alcoholes grasos y/o las composiciones de alcoholes grasos que se producen pueden usarse individualmente o en combinaciones adecuadas, como detergente, producto qmmico industrial, o componente de, o materia prima para, un producto qmmico industrial. En algunos aspectos, la divulgacion se refiere a un metodo de produccion de una composicion de alcoholes grasos que comprende uno o mas alcoholes grasos, incluyendo, por ejemplo, alcoholes grasos de cadena mas corta y mas larga. En aspectos relacionados, el metodo comprende un huesped de produccion adecuado para preparar alcoholes grasos y composiciones de alcoholes grasos.
Los metodos pueden producir alcoholes grasos que comprenden un alcohol graso C6-C26. En algunas realizaciones, el alcohol graso incluye un alcohol graso C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23, C24, C25 y/o C26. En determinadas realizaciones, el alcohol graso es 1-decanol, 1- dodecanol, alcohol 1-miristilico, 1-hexadecanol, octadecenol, tetradecenol o hexadecenol. En otras realizaciones, el alcohol graso incluye un alcohol graso de cadena lineal. En otras realizaciones, el alcohol graso incluye un alcohol graso de cadena ramificada. En aun otras realizaciones, el alcohol graso comprende un resto cfclico. En algunas realizaciones, el alcohol graso es un alcohol graso insaturado. En otras realizaciones, el alcohol graso es un alcohol graso monoinsaturado. En aun otras realizaciones, el alcohol graso es un alcohol graso saturado. En otro aspecto, la invencion presenta un alcohol graso producido mediante cualquiera de los metodos o cualquiera de los microorganismos descritos en el presente documento, o un tensioactivo que abarca un alcohol graso producido mediante cualquiera de los metodos o cualquiera de los microorganismos descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, el alcohol graso tiene un 813C de aproximadamente -15,4 o mayor. En determinadas realizaciones, el alcohol graso tiene un 813C de aproximadamente -15,4 a aproximadamente -10,9, o de aproximadamente -13,92 a aproximadamente -13,84. En algunas realizaciones, el alcohol graso tiene un fM14C de al menos aproximadamente 1,003. En determinadas realizaciones, el alcohol graso tiene un fM14C de al menos aproximadamente 1,01 o al menos aproximadamente 1,5. En algunas realizaciones, el alcohol graso tiene un fM14C de aproximadamente 1,111 a aproximadamente 1,124.
Los alcoholes grasos tienen muchos usos comerciales. Los alcoholes grasos de cadena mas corta se usan en las industrias cosmetica y alimentaria como emulsionantes, emolientes y espesantes. Debido a su naturaleza anfffila, los alcoholes grasos se comportan como tensioactivos no ionicos, que son utiles como detergentes. Ademas, se usan alcoholes grasos en ceras, gomas, resinas, lociones farmaceuticas, aditivos de aceites lubricantes, agentes de acabado y antiestaticos textiles, plastificantes, cosmeticos, disolventes industriales y disolventes para grasas.
En general, el alcohol graso o la composicion de alcoholes grasos se afsla del entorno extracelular de la celula huesped. En algunas realizaciones, el alcohol graso o la composicion de alcoholes grasos se secreta de manera espontanea, parcial o completamente, de la celula huesped. En realizaciones alternativas, el alcohol graso o composicion de alcoholes grasos se transporta al entorno extracelular, opcionalmente con la ayuda de una o mas protemas de transporte. En todavfa otras realizaciones, el alcohol graso o composicion de alcoholes grasos se transporta de manera pasiva al entorno extracelular.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos espedficos pretenden ilustrar la divulgacion y no deben interpretarse como limitativos del alcance de las reivindicaciones.
Con el fin de ilustrar los presentes hallazgos, se desarrollaron dos metodos diferentes para mejorar la enzima ACC de E. coli nativa para lograr una produccion de FAME mejorada, es decir, lograr un titulo y rendimiento superiores. Aunque se ha conocido en la bibliograffa que el aumento de la expresion de los cuatro genes de ACC de E. coli puede mejorar la produccion de acidos grasos, fue sorprendente encontrar que mutaciones seleccionadas como diana en el gen accB y cambios de expresion seleccionados como diana en el operon de accBC pueden mejorar la produccion de FAME.
Protocolos:
1. Construccion de la cepa para accBC
Se uso una cepa huesped de produccion denominada BD64 (anteriormente) para expresar accBC. La cepa huesped de produccion contema varias manipulaciones geneticas con el fin de someter a prueba la expresion de accBC. Se modifico la region cromosomica que contema el operon de accBC. Se realizo la manipulacion genetica en presencia de un sistema de complementacion de ACC. Se suplemento malonato a 10 mM y simultaneamente se expresaron dos genes de utilizacion de malonato matB y matC de Rhizobium trifolii a partir de un plasmido de bajo numero de copias. Se clonaron estos genes detras de un promotor constitutivo en el plasmido de integracion pKD46 usando tecnicas de manipulacion convencionales. Se inactivo el operon de accBC (vease Datsenko et al. (2000) Proceedings of the National Academy of Sciences 97(12):6640-6645) excepto porque las placas selectivas conteman malonato 10 mM. Se integro el operon de accBC modificado usando el mismo procedimiento excepto
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porque las placas selectivas caredan de malonato.
2. Construccion de la cepa para accB
Se uso una cepa huesped de produccion denominada BD64 (anteriormente) para expresar accB. Se modifico la region cromosomica que contema el gen accB usando la misma estrategia usada para la construccion de accBC (anteriormente).
3. Ensayo de produccion de FAME por ACC
Se sometieron a ensayo cambios en la actividad enzimatica de ACC de E. coli usando un sistema de produccion de FAME. Se transformo la cepa BD64 (anteriormente) que contema la(s) mutacion/mutaciones de ACC deseada(s) con un plasmido de ester sintasa (ES) denominado pKEV13. Se construyo el plasmido pKEV13 clonando el promotor pTrc comercial (Life Technologies) y un gen de ester sintasa de Marinobacter hydrocarbonoclasticus ATCC 49840 en el plasmido pCL1920 (Lerner et al. (1990) Nucleic Acids research 18(15):4631). Se sometieron a fermentacion las cepas, se extrajeron y se midio la produccion de FAME segun procedimientos convencionales, que se detallan a continuacion.
Se realizo la fermentacion tal como sigue; a partir de un cultivo en LB que se hizo crecer en placas de 96 pocillos, se usaron 30 |il de cultivo en LB para inocular 270 |il de medio FA2P, que entonces se incubo durante aproximadamente 16 horas a 32°C en un incubador con agitacion. Se usaron 30 |il de la simiente de durante la noche para inocular 300 |il de medio FA4P que contema metanol al 2% e IPTG 1 mM. Los medios tanto FA2P como FA4P son medios mmimos M9 modificados que conteman 0,2 g/l o 0,4 g/l (respectivamente) de fosfato. La fuente de carbono en los medios tanto FA2P como FA4P es glucosa 50 g/l. Se incubaron los cultivos a 32°C en un incubador con agitacion durante 24 horas, cuando se extrajeron siguiendo el protocolo de extraccion convencional detallado a continuacion.
Se realizo la extraccion tal como sigue; a cada pocillo que iba a extraerse se le anadieron 40 |il de HCl 1 M, luego 300 |il de acetato de butilo con C11-FAME 500 mg/l como patron interno. Se termosello la placa de 96 pocillos usando un sellador de placas (ALPS-300; Abgene, ThermoScientific, Rockford, IL), y se agito durante 15 minutos a 2000 rpm usando un instrumento MixMate (Eppendorf, Hamburg, Alemania). Tras agitar, se centrifugo la placa durante 10 minutos a 4500 rpm a temperatura ambiente (Allegra X-15R, rotor SX4750A, Beckman Coulter, Brea, CA) para separar las fases acuosa y organica. Se transfirieron 50 |il de la fase organica a una placa de 96 pocillos (placa de 96 pocillos, polipropileno, Corning, Amsterdam, Pafses Bajos). Se termosello la placa y entonces se almaceno a -20°C hasta que se evaluo mediante cromatograffa de gases con detector de ionizacion de llama (CG-FID).
Se realizaron la extraccion y cuantificacion de FAME tal como sigue; se inyecto 1 |il de muestra sobre una columna UFM (n.° de cat.: UFMC00001010401, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) en un instrumento Trace GC Ultra (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) con un detector de ionizacion de llama (FID). Se configuro el instrumento para detectar FAME C8 a C18 y cuantificar p-OH FAME C12 a C18.
Ejemplo 1: Mutaciones en accB aumentan la produccion de FAME
Se construyo una biblioteca propensa a errores del gen accB y se examino para detectar variantes que mostraban una mejora con respecto al gen silvestre. La tabla 3 a continuacion representa un resumen de las mejores variantes. La biblioteca propensa a errores del gen accB se construyo usando un kit disponible comercialmente (Genemorph II, Agilent Technologies). Se unio el gen accB a regiones de homologfa apropiadas usando la tecnica de SOE pCr, y se integro la biblioteca en el cromosoma de E. coli tal como se describe en el protocolo 1, reemplazando el gen accB de E. coli nativo. Se examino la biblioteca propensa a errores segun el protocolo 2.
Tabla 3: Variantes de accB para la produccion de FAME
Pocillo
Tttulo Mutaciones
5A02
435% D2Y(TAT) K108I(ATA)
6A08
171% I10T(ACC)
2H09
155% I10T(ACC)
1G11
151% I117T(ACC) P151P(CCA)
4B03
142% M44T(ACG) R84S(AGT)
2G03
135% I82N(AAC) K100N(AAC)
6E05
129% G26D(GAC) A76P(CCG)
4H09
129% R31C(GAC) I3I(ATA)
3A03
128% R31C(GAC) I3I(ATA)
5E06
127% A76V(GTG)
5G03
126% E14G(GGA) P56S(TCA) P51P(CCT)
1A09
126% I10T(ACC)
6EOl
121% I78F(TTC)

Claims (7)

  1. 2.
    10
  2. 3.
    15
  3. 4.
  4. 5.
    20
  5. 6.
    25 7.
  6. 8.
    30
    35 9.
    40 10.
  7. 11.
    45
    Protema portadora de biotina carboxilo (BCCP) variante de SEQ ID NO: 2 que comprende una sustitucion de aminoacido en la posicion 2 de SEQ ID NO: 2,
    en la que dicha BCCP variante comprende una secuencia de polipeptido seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4, 6, 10, 14, 16, 20, 24, 32, 48, 70.
    BCCP variante segun la reivindicacion 1, en la que la expresion de dicha BCCP variante confiere a una celula recombinante una produccion aumentada de un compuesto derivado de malonil-CoA que comprende un derivado de acido graso de uno cualquiera de un acido graso, un ester metflico de acidos grasos (FAME), un ester etflico de acidos grasos (FAEE), un alcohol graso, una amina grasa, un derivado de beta- hidroxiacido graso, un derivado de acido graso bifuncional y un derivado de acido graso insaturado, preferiblemente en la que dicho compuesto derivado de malonil-CoA es FAME.
    BCCP variante segun la reivindicacion 1, en la que dicha BCCP esta codificada por un gen accB variante, preferiblemente en la que dicho gen accB variante comprende una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 13, 15, 17, 19, 23, 25, 27, 31, 35, 39, 45, 47, 65, 69, 71 y 81.
    Microorganismo recombinante que comprende la BCCP variante segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
    Metodo de produccion de un compuesto derivado de malonil-CoA, que comprende cultivar el microorganismo recombinante segun la reivindicacion 4 en un caldo de fermentacion que contiene una fuente de carbono.
    Metodo segun la reivindicacion 5, en el que el microorganismo recombinante comprende ademas un operon variante que controla la expresion de una BCCP, en el que dicho operon da como resultado un cambio en la expresion de BCCP en una celula microbiana recombinante en comparacion con una celula microbiana silvestre.
    Microorganismo recombinante que comprende una variante de la protema portadora de biotina carboxilo (BCCP) de SEQ ID NO: 2 con una sustitucion de aminoacido en la posicion 2 de SEQ ID NO: 2, en el que la expresion de dicha BCCP variante confiere una produccion aumentada de un compuesto derivado de malonil-CoA a dicho microorganismo recombinante.
    Metodo segun la reivindicacion 5 o 6, o microorganismo recombinante segun la reivindicacion 7, en el que dicho compuesto derivado de malonil-CoA se selecciona del grupo que consiste en un derivado de acido graso, un acido graso, un ester metilico de acidos grasos (FAME), un ester etflico de acidos grasos (FAEE), un alcohol graso, una amina grasa, un derivado de beta-hidroxiacido graso, un derivado de acido graso bifuncional y un derivado de acido graso insaturado, preferiblemente en el que dicho compuesto derivado de malonil-CoA es FAME.
    Microorganismo recombinante segun la reivindicacion 4 o 7, en el que dicho microorganismo recombinante se selecciona del grupo que consiste en Escherichia, Bacillus, Cyanophyta, Lactobacillus, Zymomonas, Rhodococcus, Pseudomonas, Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, Fusarium, Humicola, Rhizomucor, Kluyveromyces, Pichia, Mucor, Myceliophtora, Penicillium, Phanerochaete, Pleurotus, Trametes, Chrysosporium, Saccharomyces, Stenotrophomonas, Schizosaccharomyces, Yarrowia y Streptomyces.
    Metodo de produccion de un compuesto derivado de malonil-CoA, que comprende cultivar el microorganismo recombinante segun la reivindicacion 4, 7 o 9 en un caldo de fermentacion que contiene una fuente de carbono.
    Metodo segun la reivindicacion 10, en el que dicho compuesto derivado de malonil-CoA comprende un derivado de acido graso de uno cualquiera de un acido graso, un ester metilico de acidos grasos (FAME), un ester etflico de acidos grasos (FAEE), un alcohol graso, una amina grasa, un derivado de beta- hidroxiacido graso, un derivado de acido graso bifuncional y un derivado de acido graso insaturado, preferiblemente en el que dicho compuesto derivado de malonil-CoA es FAME.
    imagen1
    Acidos grasos y erivados de acidos graso
    - rat° d^C^b0n0,x
    metabohsmo centra
    Acetii-CoA
    Ll_____1_1 ' X
    □
    D
    ACC (acetif-CoA carboxifasa)
    D
    FAS (sintesis de acidos grasos)
    Aldehidos grasos
    Alcoholes grasos
    Figura 1
    Esteres grasos
    130
    Escherichia coli Lactobacillus brevis Stonotrophomonas maltophilia Pseudomonas putida Bacillus subtilis Corynebacterivm glutamicum Saccharomyces cerevisiae
    106 GQKVNVGDTLC 89 GDHVEKGDW' 109 GQQVKEGETLAI 103 GQSVKKGDTLC
    107 GSKVNENTWC 541 GAEVNEGDTVW 719 GEHIIKGQPYAE
    3yE
    imagen2
    Km LV&BJIfllJJw'r .f .uy.im.
    IVEAMKMMNQIEADKSGTV CMVE AMKMI ME VKSD LTG TL IEAMKfcFNPIEADTSGTI
    iJveamkHmnhi EADIGGVI FNEIEAEVKGEI
    AMKl^ ENPVKAHKSGTV
    qmplvsqengiv *
    ■ Jl»Tr*r iiwitt—I 'nhfrwrtf r
    Figura 2
    imagen3
    Hidrato de carbono
    **r- *»>wAa:
    Metabohsmo central
    D
    D
    ACC
    D
    Malonil-CoA
    FAS
    Acidos grasos y erivados de acidos graso
    Aldehidos grasos
    Alcoholes grasos
    Figura 3
    imagen4
    Acil-ACP o acil-CoA
    Alcoholes grasos
    Figura 4
    Metabolismo central
    ■Acetil-CoA
    ACC
    Policetidos
    Flavanonas y flavonoiodes
    Ac id os grasos y erivados de acidos graso
    Aldehfdos grasos
    CO
    GO
    S
    imagen5
    <Si
    <
    imagen6
    D2H D2N D2H D2I 02T D2S D2S D2R D2V D2S D2V D2L 02L D2T D2Q WT
    Figura 5
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