ES2629832T3

ES2629832T3 - Ensayos con nanoetiquetas SERS

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Publication number: ES2629832T3
Application number: ES13162214.4T
Authority: ES
Inventors: Hongxia Xu; William E. Doering; Remy Cromer; Michael Natan; Sharron Gaynor Penn; Michael Sha
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 2006-02-08
Filing date: 2007-02-08
Publication date: 2017-08-16
Anticipated expiration: 2027-02-08
Also published as: EP3241838A1; EP2644615B1; WO2007092941A2; US20120164624A1; EP1981994A2; JP5266066B2; WO2007092941A3; JP2009525763A; EP2644615A3; US20130337569A1; EP1981994A4; EP1981994B1; EP2644615A2; ES2493990T3

Abstract

Un método para detectar un analito de interés que comprende: proporcionar partículas de captura derivatizadas con dicho analito; proporcionar partículas de detección con nanoetiquetas SERS conjugadas con una primera molécula capaz de unirse selectivamente a dicho analito; contactar una muestra que puede que contenga el analito de interés con las partículas de captura y de detección con nanoetiquetas SERS, formando de este modo un complejo analito/partícula de detección con nanoetiquetas SERS y un complejo partícula de captura/partícula de detección con nanoetiquetas SERS; concentrar el complejo partícula de captura/partícula de detección con nanoetiquetas SERS; y detectar el espectro Raman de una molécula indicadora Raman asociada con las partículas de detección con nanoetiquetas SERS.

Description

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a 2 mm de la superficie" es prácticamente un espectro de BPE con poca contribución de las etiquetas DPY. Como se esperaba, la contribución espectral de DPY aumenta con el tiempo a medida que las etiquetas empiezan a unirse a la superficie mediante interacciones iónicas. Los espectros adquiridos de la disolución por encima de la superficie solo revelan la presencia de etiquetas DPY. Esto demuestra que las etiquetas unidas a la superficie se pueden discriminar

5 de las etiquetas en disolución cuando se utiliza un objetivo con una profundidad de campo estrecha. La profundidad de adquisición del lector Raman utilizado para la recogida de datos de la Fig. 4 (realmente 1000 veces más profundo que el 50x) no permite la discriminación entre las etiquetas de la superficie y en disolución, lo que requiere por tanto la eliminación del sobrenadante (y el lavado) antes de adquirir los espectros Raman.

10 [0073] Cuando el exceso de etiqueta se elimina por lavado, la señal del fondo se reduce de manera importante, como se muestra en el Gráfico 80 de la Fig. 8. Análogamente, se observó que la señal global de los "viales lavados" variaba ampliamente, indicando que el "tampón de lavado" no estaba optimizado. No se realizó esfuerzo alguno para optimizar el tampón de lavado.

15 [0074] Antes de investigar el efecto de una matriz biológica sobre el rendimiento del ensayo, se demostró que las nanoetiquetas SERS se podían leer en presencia de plasma o sangre. Las Figs. 9A, 9B y 9C describen el efecto de agua y BSA al 1% en PBS (Fig. 9A), plasma completo (Fig. 9B) y una mezcla de plasma y sangre completa (Fig. 9C) sobre la adquisición de una imagen espectral de nanoetiquetas SERS unidas a la pared inferior de viales de vidrio revestidos con polilisina. Debe entenderse en primer lugar que tanto el plasma puro como la sangre completa no tienen

20 una intensidad de dispersión Raman significativa entre las longitudes de onda de 700 a 1800, salvo una reducción discreta de la intensidad de la dispersión al aumentar el número de onda. Esto se podría atribuir a la absorción de energía de la muestra que da como resultado una reducción de la energía para la excitación de nanoetiquetas. Alternativamente, la matriz biológica podría lavar algunas nanoetiquetas SERS de la superficie el vial.

25 [0075] También se investigó el efecto del plasma y la sangre humanos sobre el rendimiento del ensayo. Concentraciones de plasma o sangre del 30% del volumen total del ensayo afectan negativamente el comportamiento de ensayo proporcionando una intensa señal de fondo con poca o ninguna recuperación del pico enriquecido -tanto antes como después del lavado. El Gráfico 100 de la Fig. 10, sin embargo, muestra la capacidad del ensayo para recuperar el pico enriquecido de IL-4 (50 nm) en sangre completa al 16% o plasma al 16%.

30

Ejemplo 1:

[0076] Método representativo para la preparación de un ensayo que presenta la captura de etiquetas de detección en la pared interna de un vial de ensayo.

35 [0077] Materiales y reactivos

•: Las lecturas se realizaron en un dispositivo de detección de espectro Raman comercialmente disponible.

•: Dynabeads M-270 Ácido carboxílico, 2,8 um, nº Pd 143.05, Dynal Biotech (Oslo, Noruega).

• Las perlas magnéticas modificadas con silicio BcMag, 1um, número de catálogo FF-IOl eran de BioClone Inc. 40 (San Diego, CA).

•: El anticuerpo monoclonal dirigido contra IL-4 humana (MAB 604) y el anticuerpo policlonal de cabra (AF 204Na) se obtuvieron de R&D Systems (Minneapolis, MN).

•: Los anticuerpos contra CRP humanos, clones 265-10032 y 265-10036 se obtuvieron de OEM Concepts (Toms River, NJ).

45 • El anticuerpo de detección se unió covalentemente a nanoetiquetas SERS usando un protocolo normalizado desarrollado en Nanoplex REF.

•: APTMS, EDC y el anhídrido succínico se obtuvieron de Sigma.

•: (3-Glicidoxipropil)-Trimetoxisilano. United Chemical Technologies.

• La albúmina de suero bovino era de Pierce. 50 • Los viales de vidrio, 12x32mm nº de pieza CTV-1002 son de ChromTech, Inc. (MN).

[0078] Tampones

• MES 50 mM, pH 4,5

• PBS 55 • Tampón de almacenamiento en partículas magnéticas: PBS al 0,1 % en BSA

•: Tampón de ensayo para ensayos en viales: 1% BSA, 0,5% PEG, 0,05% Tween 20, PBS

•: Tampón de ensayo para ensayos en perlas magnéticas: 5% BSA, 0,5% PEG, 0,05% Tween 20, PBS

•: Tampones de lavado: 1 % BSA, 0,25% Tween 20, PBS

60 [0079] Métodos y protocolos

[0080] Procedimiento general para la conjugación de anticuerpo a Dynabeads

1.: Lavar las Img Dynabeads M-270 Ácido carboxílico con 200µl de MES (dos veces).

2.: Resuspeder con 100µl MES en un tubo Eppendorf (500µl). 8

3.: Añadir 30µl de anticuerpo (lmg/ml).

4.: Añadir 100µl de MES al tubo.

5.: Mezclar bien e incubar con una rotación con inclinación lenta a temperatura ambiente durante 30 minutos.

6.: Inmediatamente antes de su uso, disolver EDC en MES 100 mM, pH 5 hasta una concentración de 100 5 mg/ml.

7.: Añadir 10 µl de disolución de EDC (1 mg) a la suspensión Dynabeads/ligando. Mezclar bien.

8.: Incubar durante 2 horas a TA con una rotación con inclinación lenta.

9.: Bloquear con 200|µ de etanolamina 50 nM, PBS (3 mg/ml).

10.: Incubar durante 0,5 horas a TA con una rotación con inclinación lenta. 10 11. Lavar Ix con 300µl de BSA al 1% en PBS.

12.: Bloquear durante toda la noche con BSA al 1% en PBS a 4ºC.

13.: Lavar 2x con 0,1 de BSA, 0,05 de Tween en PBS.

14.: Almacenar el conjugado a 1 mg/ml con BSA al 1% en PBS.

15 [0081] DERIVATIZACIÓN EN VIAL DE VIDRIO: APTMS

1.: Añadir 80µl de disolución de APTMS al 2%/agua al 2% en EtOH al vial. Solo el volumen suficiente para cubrir la superficie del fondo-vol máx = 80µl.

2.: Hacer reaccionar durante 30 minutos a temperatura ambiente.

3.: Eliminar la disolución.

20 4. Añadir EtOH, 500µl y colocar en una placa caliente durante 30 minutos (seleccionar el nivel más bajo.

5.: Lavar y enjuagar una vez con EtOH.

6.: Lavar 3 veces con agua DI.

7.: Almacenar en 200µI de agua.

25 [0082] DERIVATIZACIÓN CON ANHÍDRIDO SUCCÍNICO DE VIALES DERIVATIZADOS CON APTMS

1.: Intercambiar el agua de las partículas revestidas con APTMS por tampón borato.

2.: Preparar una disolución de anhídrido succínico (40 mg/ml) en DMSO.

3.: Añadir 100µl de 40µl de disolución de anhídrido succínico en 1 ml de borato. Incubar a TA durante 30 minutos.

4.: Repetir la etapa 3.

30 5. Lavar 3 veces con agua DI.

6. Almacenar en agua DI a 1 mg/ml.

[0083] CONJUGACIÓN DEL ANTICUERPO A ETIQUETAS TIOLADAS-SERS

1. Preparar una disolución de sulfo-SMCC a 1 mg/ml en agua.

35 2. Añadir 100 µl de sulfo-SMCC por 50 µg de anticuerpo.

3.: Vortizar la mezcla y dejar reaccionar durante 30-45 minutos.

4.: Purificar la disolución de anticuerpo activada con maleimida usando una columna desaladora con microrevolución Sephadex G25 (Amersham) según las directrices del fabricante.

5.: Añadir 100 µl de PBS de etiquetas tioladas (4x1011 partículas en 1 ml de agua) para dar una disolución 1 mM 40 en PBS.

6. Añadir la proteína purificada activada con maleimida a la disolución. Mezclar bien y dejar reaccionar durante 2 horas a temperatura ambiente. Las partículas se pueden agitar suavemente, o vortizar ocasionalmente para facilitar la reacción.

7.: Preparar una disolución de 10 mg/ml de MESA en agua. Añadir 50 µL a las etiquetas y dejar reaccionar 45 durante 20-30 minutos.

8.: Añadir 25 µl de una disolución de BSA al 5% a las etiquetas, y centrifugar para purificar. Rotar a ~1500 RCF (3800 RPM en una microcentrífuga Jouan 14) durante 12 minutos.

9.: Resuspender las partículas en 1 ml de 0,1x PBS + 25 µL de BSA al 5%. Centrifugar de nuevo Repetir una o

dos veces más (para un total de 3 o 4 etapas de centrifugación). 50 10. Resuspender las partículas a la concentración deseada en el tampón deseado que contiene BSA al 0,1%.

[0084] CONJUGACIÓN DEL ANTICUERPO A APTMS Y CARBOXI-APTMS

VIALES REVESTIDOS

1. Tomar 10µl de disolución madre de anticuerpo y diluir en 1ml PBS -La conjugación al vial se realizará a 55 10µg/ml.

2.: Añadir 100µl a los viales.

3.: Incubar durante 30 minutos.

4.: Preparar una disolución de EDC (1M, 200 mg/ml DMSO).

5.: Añadir 1µl de disolución de EDC a los viales que contienen Abs.

60 6. Almacenar a 4ºC durante toda la noche.

7.: Añadir 100µl (PBS, BSA 1%) -Bloqueo.

8.: Agitar en un agitador orbital durante 1 hora.

9.: Lavar con 3x200µl de BSA al 0,1% en PBS.

[0085] PROCEDIMIENTO DE ENSAYO SECUENCIAL DE IL-4 -ENSAYO EN VIAL

1.: Diluir la IL-4 con una disolución de BSA al 0,1% en PBS -disolución madre de IL-4 a 100 ng/ml.

2.: Añadir 100µl a los viales relevantes.

3.: Incubar en un agitador de placas durante 2,5 horas a TA.

: 5 4. Aspirar las disoluciones.

5.: Lavar 3x200µl con BSA al 0,05 en PBS, 0,25% de Tween.

6.: Diluir 10x el conjugado IL4-SERS a las concentraciones adecuadas.

7.: Añadir 100µl a los viales relevantes.

8.: Incubar durante 2 horas en un agitador de placas.

: 10 9. Aspirar y leer en un lector Ocean Optics.

[0086] PROCEDIMIENTO DE ENSAYO HOMOGÉNEO DE IL-4 -VIAL

1.: Diluir 10x el conjugado IL4-SERS a las concentraciones adecuadas con BSA al 0,1% en PBS.

2.: Añadir 100µl a los viales relevantes.

: 15 3. Añadir 100µl de muestra -tampón de reacción, plasma o sangre.

4.: Diluir la IL-4 en BSA al 0,1% en PBS.

5.: Añadir 100µl a los viales relevantes.

6.: Incubar en un agitador de placas durante 1 hora a TA.

7.: Eliminar la disolución.

: 20 8. Leer el espectro en un lector Ocean Optics.

9.: De forma opcional: Lavar 3x200µl con BSA al 0,05 en PBS, 0,25% de Tween.

10.: Leer el espectro en un lector Ocean Optics.

[0087] C. Inmunoensayos en sándwich usando partículas de captura magnética

25 [0088] Algunos de los inmunoensayos heterogéneos y homogéneos descritos en el presente documento presentan el uso de partículas de captura magnética. Las propiedades combinadas de las partículas de captura magnética junto con las partículas de detección con nanoetiquetas SERS dan como resultado una plataforma bioanalítica que evita el uso de robótica, preparaciones y separaciones analíticas extensas o complejas, permitiendo al mismo tiempo medidas

30 de proteínas simples, cuantitativas, rápidas (en tiempo real) y multiplexadas. La Fig. 11 ilustra de forma esquemática un formato de ensayo descrito en el presente documento. Un anticuerpo de captura 100 está unido covalentemente a una partícula magnética 102 y el anticuerpo de detección 104 está unido covalentemente a la nanoetiqueta SERS 106. Tanto la partícula de captura como la partícula de detección se han introducido en un recipiente, por ejemplo un tubo de polipropileno (prediluidas con el tampón de dilución adecuado) seguido por la muestra. Un antígeno asociado con

35 una sustancia química, proteína, o sustancia de interés 108 ocasiona la formación de un inmunocomplejo de dos partículas por unión de las partículas de captura y de detección. Después de la incubación, por ejemplo un mezclador rotatorio sin fin, el tubo se coloca en un concentrador de partículas magnéticas para extraer el inmunocomplejo de dos partículas junto con las partículas magnéticas libres del fondo del tubo. A continuación, el tubo se coloca en el lector SERS y el láser se enfoca en las partículas magnéticas antes de registrar el espectro Raman de las moléculas

40 indicadoras asociadas a las nanoetiquetas SERS. De acuerdo con ello, las partículas magnéticas permiten no tener que separar y lavar en etapas discretas, sino concentrar los analitos capturados y las partículas de detección complejadas en ubicaciones específicas dentro del recipiente de reacción aún en presencia de la matriz de muestra y del exceso de las partículas de detección. Un ensayo implementado con partículas magnéticas y nanoetiquetas SERS puede ser especialmente útil para detectar proteínas en sangre completa o suero. Los ejemplos que demuestran

45 variaciones de la preparación y el uso de este ensayo en plataforma bioanalítica se describen en las siguientes secciones.

[0089] Se han preparado ensayos representativos con partículas de captura magnética de acuerdo con el método detallado en el Ejemplo 2 siguiente. Otros métodos son igualmente adecuados para preparar o llevar a cabo un ensayo

50 consistente con este aspecto de la presente divulgación.

[0090] De acuerdo con el método del Ejemplo 2, tanto las partículas de captura como las partículas de detección se cargan en un tubo de polipropileno (prediluidas con el tampón de dilución adecuado) seguido por la muestra. Después de la incubación en un mezclador rotatorio sin fin, el tubo se coloca en un concentrador de partículas magnéticas para

55 extraer las partículas magnéticas libres del fondo del tubo. A continuación, el tubo se coloca en el lector SERS y el láser se enfoca en las partículas magnéticas antes de registrar el espectro Raman.

[0091] Se ha preparado un inmunoensayo sin lavado (homogéneo) de tipo sándwich para la proteína C reactiva usando una partícula magnética derivatizada con el anticuerpo de captura y un anticuerpo detector conjugado a

60 nanoetiquetas SERS como el indicadortal como se ha descrito anteriormente. Los resultados indican que el complejo de dos partículas se puede analizar en presencia de matrices biológicas, sin lavado, y usando sistemas de detección de bajo coste.

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pequeño de complejos específicos de IL-4. Es necesario realizar investigaciones adicionales para comprender y resolver el motivo subyacente a la supresión de la señal y la baja recuperación del enriquecimiento en IL-4.

Ejemplo 2:

5 [0111] El siguiente ejemplo de ensayos preparados con partículas de captura magnética se proporcionan solamente a fines ilustrativos. El solicitante ha realizado experimentos sobre un ensayo tal como el representado en la Fig. 11.

[0112] 1. Conjugación de anticuerpo a nanoetiquetas SERS tioladas

10 [0113] Una disolución de sulfo-SMCC (100 µL, 1 mg/ml en agua) se añadió a una disolución de anticuerpo (50 µg, 50µl) en PBS. Después de 30 minutos, el anticuerpo activado con maleimida se purificó usando una columna desaladora Sephadex G258 de microgiro (Amersham). El conjugado purificado se añadió a continuación a nanoetiquetas SERS tioladas (4xl010 partículas en 100µl de PBS). Después de 2 horas a temperatura ambiente, la

15 reacción se inactivó durante 30 min con una disolución de MESA (50µl, 10 mg/ml) seguido por una disolución de BSA al 5% (25µl). Los conjugados de la etiqueta se lavaron, se purificaron por centrifugación, y se volvieron a suspender en BSA al 0,1% a la concentración deseada en el tampón deseado

[0114] 2. Carboxilación de perlas revestidas con vidrio magnético

20 [0115] Perlas revestidas con vidrio magnético de Bioclone (4 mg) se lavaron dos veces con etanol (1 ml) antes de su tratamiento con una disolución de APTMS (3-aminopropiltrimetoxisilano) al 2% en etanol (1 ml) durante 30 min a temperatura ambiente. Las perlas se lavaron con extracción magnética y se trataron con etanol (500µl) en una placa caliente (50C) durante 30 minutos. Tras lavado con etanol y agua (3 veces), las partículas magnéticas se almacenaron

25 en agua a 4 mg/ml. La carboxilación se realizó en tampón borato por tratamiento con una disolución de anhídrido succínico en DMSO (20µl, 40mg/ml) en DMSO durante 30 min. Las perlas carboxiladas se lavaron y almacenaron en agua.

[0116] 3. Procedimiento general para conjugación de anticuerpo a perlas revestidas con vidrio magnético 30 carboxiladas y Dynabeads

[0117] Perlas revestidas con vidrio magnético carboxiladas o Dynabeads M-270 ácido carboxílico (1 mg) en PBS (100 µl) se trataron con anticuerpo (30µ|, 1 mg/ml) durante 30 minutos antes de añadir una disolución de EDC (10 µI, 1 mg). La mezcla se incubó con una rotación lenta con inclinación a temperatura ambiente durante 2 horas antes de

35 bloquear durante 0,5 con etanolamina en PBS (200µl, 3 mg/ml). A continuación, el conjugado se lavó y se volvió a bloquear durante la noche con una disolución de BSA al 1% en PBS y se almacenó en el mismo tampón a 4C.

[0118] 4. Ensayo homogéneo basado en perlas magnéticas para la proteína C reactiva (CRP)

40 [0119] Un tubo Eppendorf (polipropileno, 500µl) se cargó secuencialmente con los siguientes reactivos

A. 10 µl de conjugado de perlas de vidrio magnéticas con anti-DRP (10 ug de perlas)

B. 100 µl de tampón (PBS, BSA al 1%)

C. 100 µl de conjugado anti-CRP-SERS en PBS, BSA al 1%

C. 100 µl de disolución de analito (PBS, BSA al 1%)

45 [0120] La mezcla se incubó a temperatura ambiente por mezcla suave durante 30 min en un mezclador rotatorio. Las partículas magnéticas se arrastraron al fondo del tubo con un concentrador de partículas magnéticas. Los tubos se colocaron en el lector Raman y se ajustó a la posición del fondo del tubo (es decir, las perlas magnéticas) en el plano focal del sistema de detección óptico. Tras un tiempo de lectura, los datos adquiridos se redujeron con un programa

50 informático patentado que permite la determinación de la concentración de analito.

[0121] Los datos se recogieron usando partículas magnéticas de vidrio revestido de 1 um de Dynal, y nanoetiquetas SERS bis(4-piridil)etileno (BPE) SERS para detectar CRP en el tampón. Los espectros Raman se recogieron en un instrumento Inspector Raman de Delta Nu Corporation. El sistema Inspector Raman utiliza una excitación laser de 40 55 mW y 785 nm laser, óptica de espacio libre, es portátil y se puede conectar a un ordenador portátil. Los datos se analizaron con un programa informático que realizaba un ajuste de mínimos cuadrados del espectro para cuantificar componentes en mezclas complejas. El Gráfico 210 de la Fig. 21 muestra una curva dosis-respuesta para CRP, una diana biológicamente relevante para diagnóstico de enfermedades inflamatorias y cardiovasculares. Este ensayo es, por tanto, un ensayo homogéneo de una sola etapa sin procedimiento de lavado realizado en aproximadamente 25

60 minutos. La observación de que la respuesta de SERS a 1 µg/ml de CRP era inferior que la respuesta a 100 ng/ml se atribuye a la prozona o "efecto gancho", donde el exceso de analito satura los sitios tanto del anticuerpo de captura como del anticuerpo de detección, prohibiendo de este modo la formación del sándwich inmune.

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5.: Lavar con 500 ul de PBS 100 mM cuatro veces. Es muy importante eliminar por lavado todo el oligo no conjugado.

6.: Resuspender en 40 ul de PBS (perlas 8 X 10 7)

5 [0140] HIBRIDACIÓN

7.: Tomar 33 ul de tampón 2xTMAC, añadir 5 ul de oligo 10 uM y 5 ul de sonda de perlas magnéticas (4x 10 6) Hibridación a 55C durante 1 h

8.: Lavar con 1X de SSC a temperatura ambiente durante 5 min y 0. 1X SSC a 55C durante 5 min.

9. Añadir NeutrAvidin -BPE (etiqueta SERS) e incubar durante 30 min. 10 10. Lavar con 10 mM de PBS dos veces

11. Adquirir la señal Raman mediante el microscopio Reinshaw InVia Raman

[0141] E. Ensayo competitivo SERS/perlas magnéticas.

15 [0142] Consistente con la presente invención, también se realizó un ensayo competitivo homogéneo de dos partículas. Consistente con la presente también se puede implementar con el uso de partículas de detección de nanoetiquetas SERS y una partícula de captura independiente. Algunas ventajas descritas a continuación se llevan a cabo si las partículas de captura son magnéticas, pero el alcance de la invención no se limita a la captura magnética. Se puede seleccionar un formato de ensayo competitivo para implementar cualquier tipo de bioensayo para prueba

20 diagnóstica. El formato de ensayo competitivo es especialmente ventajoso, sin embargo, para detectar analitos que son demasiado pequeños para acomodar dos anticuerpos diferentes que puedan formar un complejo inmune de tipo sándwich como se ha descrito anteriormente. Un formato de ensayo competitivo tal como se describe en el presente documento se puede utilizar para detectar cualquier tipo de analito incluyendo, pero sin limitación, fármacos terapéuticos, fármacos no terapéuticos (control de drogodependencias), péptidos, hormonas, proteínas u otros

25 analitos de interés. El formato de ensayo competitivo es también especialmente ventajoso cuando solamente un agente de unión está fácilmente disponible para el analito de interés.

[0143] Algunos formatos de ensayo competitivo específicos que muestran partículas de captura y partículas de detección con nanoetiquetas SERS se describen detalladamente a continuación. Por lo general, sin embargo, todos 30 los formatos de ensayo competitivo requieren el etiquetado de la partícula de captura o de la partícula de detección con el analito o su análogo. La partícula de detección se puede etiquetar ópticamente tal como una partícula fluorescente, coloreada o activa en SERS. La partícula no marcada con el analito o análogo del mismo se conjuga con un agente de unión adecuado para unirse al analito. Por ejemplo, como se muestra en la Fig. 25A, una partícula de captura 2500 se puede derivatizar con un analito de interés 2502. Además, una partícula de detección con nanoetiqueta SERS se

35 puede conjugar con un agente de unión 2506 que se puede unir de forma selectiva al analito 2502 Como se muestra en la Fig. 25A, la puesta en contacto de una muestra que contiene el analito 2502 libre con las partículas de captura y las partículas de detección con nanoetiqueta SERS preparadas como se ha descrito anteriormente dará como resultado la formación de un complejo 2508 de partícula de captura/partícula de detección SERS junto con partículas de detección SERS unidas al analito libre 2510.

40 [0144] Las partículas de captura 2500 pueden ser partículas de captura magnética, u otras partículas que son adecuadas para la concentración. En una realización no magnética, las partículas de captura son partículas más grandes o densas reunidas por centrifugación. Las partículas de captura más grandes y/o densas incluyen, pero no se limitan a, partículas Nanobarcodes®, nanopartículas metálicas esféricas o anisótropas, o cualquier tipo de partícula

45 constituida por, pero sin limitación, látex, poliestireno, u otro material que tenga suficiente peso específico, tamaño y forma para aglomerarse por centrifugación en el disolvente de interés. En el ejemplo de la Fig. 25A, el complejo 2508 de partícula de captura/partícula de detección SERS se puede concentrar (con un concentrador magnético si la partícula de captura es una partícula magnética) y se puede adquirir el espectro Raman de una molécula indicadora Raman asociada con las partículas de detección con nanoetiqueta SERS. La intensidad de la señal Raman será

50 inversamente proporcional a la concentración de analito libre presente en la muestra, ya que el analito 2502 libre unirá de forma competitiva parte de las partículas de detección con nanoetiqueta SERS. A medida que aumenta la concentración de analito libre, proporcionalmente menos partículas de detección con nanoetiqueta SERS se unirán a las partículas de captura magnética derivatizadas.

55

Ejemplo 4:

[0145] A. Formato de ensayo competitivo con adición simultánea de reactivo

5 [0146] En un primer formato competitivo, las partículas de captura y detección se añaden en secuencia rápida al analito que contiene la muestra. Durante la incubación, tanto el analito libre como el análogo del analito puede denominarse como "A", y el analito conjugado con la partícula puede competir por el agente de unión conjugado "R". El agente de unión "R" puede tener una afinidad diferente por el análogo A (preferiblemente inferior) comparado con el A endógeno. Tras la incubación, las partículas magnéticas (incluyendo las

10 partículas MP libres y los complejos MP-R::A-SERS o SERS-R::A-MP que dependen de la partícula que se ha conjugado con el agente de unión) se puede concentrar en una ubicación determinada en el interior del recipiente de reacción para adquirir el espectro Raman. La intensidad de la señal Raman es inversamente proporcional a la concentración (cantidad) de analito libre (endógeno) presente en la muestra. Los posibles complejos formados en este ensayo competitivo, dependiendo de qué partícula esta derivatizada con el analito o su análogo son:

15 [0147] MP-A + A + SERS-RSERS-R::A + SERS-R::A-MP; o

[0148] SERS -A + MP-R + AMP-R::A + MP-R + SERS -A + MP-R::A-SERS

20 [0149] B. Formato de ensayo pseudocompetitivo con adición secuencial de reactivo

[0150] En un segundo formato de ensayo competitivo, la muestra que contiene analito se incuba en primer lugar con la partícula conjugada con el agente de unión "R" (MP-R o SERS-R) durante un tiempo determinado para permitir la captura del analito ´"A" endógeno antes de añadir la partícula conjugada con A. Esta última partícula derivatizada con

25 analito añadida se une a continuación con el conjugado de la partícula-R residual (MP-R o SERS-R). Después de la incubación, las partículas magnéticas (partículas MP libres y complejos MP-R::A-SERS o SERS-R::A-MP) se concentran en una ubicación determinada en el interior del recipiente de reacción para adquirir el espectro Raman. El número de MP-R::A-SERS o SERS-R::A-MP determinados de forma espectroscópica es inversamente proporcional a la concentración de A libre (endógeno) presente en la muestra. El procedimiento pseudocompetitivo en dos etapas

30 incluye las siguientes reacciones, dependiendo de qué partícula está conjugada con el agente de unión.

[0151] SERS-R + ASERS-R::A + SERS-R

(SERS-R::A + SERS-R) + MP-ASERS-R::A + SERS-R::A-MP; O

35 [0152] MP-R + A • MP-R::A + MP -R (MP -R::A + MP-R) + SERS -AMP-R::A + MP-R::A-SERS

[0153] En otro formato de ensayo, SERS-R::A-MP (o MP-R::A-SERS) se puede preformar y guardar en el recipiente de ensayo en forma tanto líquida como liofilizada. Tras añadir la muestra, este complejo partícula-partícula se disocia

40 por interacción con A endógeno en proporción a la concentración de analito, de acuerdo con las siguientes reacciones.

[0153] MP-R::A-SERS + AMP-R::A + MP-R::A-SERS; O

[0154] SERS-R::A-MP + ASERS-R::A + SERS-R::A-MP 45

[0155] F. Ensayos de detección de la secuencia de nucleótidos

[0156] Las partículas de detección con nanoetiqueta SERS y las partículas de captura independientes también se pueden utilizar para implementar diferentes tipos de ensayos para detectar secuencias de nucleótidos. Las secuencias

50 de nucleótidos que son adecuadas para su detección mediante un ensayo que se describe en el presente documento pueden proceder de cualquier fuente u organismo. Por ejemplo, las fuentes de nucleótidos incluyen, pero no se limitan a, material humano, animal, vegetal, bacteriano, vírico u otro material genético. Algunas ventajas descritas a continuación se llevan a cabo si las partículas de captura son magnéticas. Los ensayos de detección de secuencias de nucleótidos descritas en el presente documento permiten detectar secuencias de nucleótidos diana en lisados brutos y

55 preparaciones de ADN impuras sin necesidad de etapas de lavado o la eliminación de mezclas de muestras. Algunos ensayos descritos en el presente documento se pueden completar en un tiempo corto, por ejemplo, en media hora o menos.

[0157] Un ensayo de detección de secuencias de nucleótidos, consistente con la presente divulgación, se ilustra de

60 forma esquemática en la Fig. 26. El ensayo de la Fig. 26 presenta al menos una sonda de captura 2600 que incluye una secuencia de nucleótido de captura 2602 conjugado con una partícula. Las etapas de selección descritas a continuación se pueden optimizar si la partícula es una perla magnética, paramagnética, u otro tipo de partícula magnética 2604. Este ensayo incluye también una sonda de detección de secuencias de nucleótido 2606 que incluye una secuencia de detección 2608 conjugada con una molécula de captura 2610. Tanto la secuencia de captura como

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[0165] El Gráfico 3400 de la Fig. 34 es una representación de los resultados de la validación experimental del ensayo ilustrado en la Fig. 33. El límite de detección en un sistema oligonucleótido equivalente era de aproximadamente 10 pM en condiciones de ensayo no optimizadas. El límite de detección en sistemas modelo disminuye cuando la hibridación

5 tiene lugar en presencia de ADN genómico no relacionado como fondo. La detectabilidad se puede reducir adicionalmente cuando la sonda de oligonucleótido se hibrida a una megabase de diana de ADN genómico en lugar de a la diana de oligo análoga deseada. De acuerdo con ello, en determinados casos, puede ser deseable aumentar la eficacia y la sensibilidad del ensayo.

10 [0166] Un método para aumentar la sensibilidad del ensayo de detección de nucleótidos se ilustra de forma esquemática en la Fig. 35. Este ensayo incluye un corte inicial o rotura de la secuencia del nucleótido de interés en 3500 en múltiples secciones. Se puede emplear en esta etapa cualquier técnica conocida para cortar un nucleótido en secciones. Por ejemplo, se puede utilizar una enzima frecuente y de acción rápida para digerir el nucleótido de interés en piezas pequeñas. Las secciones del nucleótido diana así preparadas se pueden hibridar a continuación con

15 diferentes sondas de captura múltiples y diferentes sondas de detección múltiples, donde cada tipo de sonda tiene diferentes afinidades de hibridación por partes independientes de las secuencias de nucleótidos de interés. Como se ha descrito anteriormente, las sondas de detección se pueden conjugar a una nanoetiqueta SERS y las sondas de captura se pueden conjugar a una partícula magnética. La fragmentación del ADN diana en múltiples trozos pequeños aumenta de forma eficiente la eficacia de la hibridación y la concentración del complejo diana, ya que los múltiples

20 fragmentos de la diana deseada presente en la muestra de ensayo se pueden unir por separado a múltiples partículas de detección, lo que aumenta la señal y, de este modo, aumenta la sensibilidad del ensayo. Una ventaja asociada con el método ilustrado en la Fig. 35 es que este método aumenta la sensibilidad del ensayo sin introducir sesgo por amplificación.

25 [0167] Alternativamente, un fragmento de nucleótido mayor (por ejemplo, un fragmento genómico o un gen sin digestión o con una digestión mínima) se puede hibridar con una secuencia de captura conjugada con una partícula de captura. Adicionalmente, múltiples secuencias de detección complementarias de un fragmento de nucleótido mayor, cada una de ellas, se puede conjugar con la misma nanoetiqueta SERS. De esta forma, la sensibilidad del ensayo aumenta al aumentar el número de sondas de detección para una secuencia única más grande del nucleótido. En este

30 caso, la especificidad del ensayo también se podría aumentar mediante el uso de una pluralidad de nanoetiquetas SERS. Alternativamente, si se han conjugado múltiples secuencias de detección diferentes con diferentes nanoetiquetas SERS, o se puede identificar una deleción o mutación genómica específica por diseño de secuencias de detección específicas para detectar la región de interés. Adicionalmente, la partícula magnética se podría conjugar a múltiples secuencias de captura diferentes complementarias de diferentes fragmentos de nucleótidos de interés,

35 dando como resultado la potenciación de la señal del ensayo para cada partícula magnética.

[0168] Se pueden utilizar otros métodos para aumentar la sensibilidad del ensayo de ácido nucleico. Por ejemplo, la amplificación en círculo rodante (RCA) isoterma, la amplificación relacionada con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la amplificación impulsada por el ARN de T7, la reacción en cadena de la ligasa (LCR), ADN 40 ramificado (ADNb) u otros métodos de amplificación conocidos se pueden utilizar junto con las sondas de detección y captura descritas anteriormente. Un ensayo de ejemplo que presenta una RCA se ilustra en la Fig. 36. El ensayo de la Fig. 36 tiene sondas de captura 3600 que presentan una secuencia de captura 3602 conjugada a una partícula magnética 3604 y una o más sondas 3606 de RCA, cada una de ellas conjugada a una molécula 3608 de RCA que se puede hibridar en presencia de una secuencia de nucleótidos 3610 de interés seguido por RCA usando técnicas 45 conocidas. El complejo resultante se puede poner en contacto con una o más sondas de detección 3612, cada una de ellas conjugada a una nanoetiqueta SERS 3614 aumentando sustancialmente, de esta forma, el número de nanoetiquetas asociadas a cada molécula de captura. A continuación, se puede adquirir el espectro Raman de una molécula indicadora Raman asociada con la nanoetiqueta SERS mediante un espectrómetro Raman, microscopio Raman u otro equipo 3616. El Gráfico 3700 de la Fig. 37 ilustra la sensibilidad de un ensayo preparado de acuerdo con 50 la Fig. 36. El ensayo de la Fig. 37 se describe detalladamente en el Ejemplo 5 siguiente. Los expertos en la materia observarán que, en el ensayo potenciado mediante RCA, la partícula de captura magnética asociada a la sonda de captura se puede utilizar para facilitar la selección y/o concentración tanto después de la RCA como después de la incubación de los productos de la hibridación iniciales en presencia de sondas de detección con nanoetiquetas SERS.

55 Ejemplo 5:

[0169] Funcionalización con carboxilo del revestimiento con etiquetas SERS

[0170] FUNCIONALIZACIÓN CON AMINA:

60 1. Lavar 500 µl 20x de vidrio revestido con etiquetas SERS tres veces en EtOH.

2.: Resuspender en 930 µl de EtOH. Añadir 50 pi de agua y 20 µl de APTMS.

3.: Mezclar durante una hora.

4.: Lavar tres veces con 1 ml de DMSO. Funcionalización con carboxilo:

5.: Disolver 0,04 g de anhídrido succínico en 1 ml de DMSO.

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Claims

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