JP2021185917A - 細胞検出方法及びキット - Google Patents
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Abstract
Description
しかしながら、当該手法には、以下のような問題があった。
ところが、同手法では、不活性な核酸アプタマー構造を安定に形成しつつ、かつ競合結合の結果、活性なアプタマー構造が誘起されるよう、トリガー核酸の最適な結合部位や塩基数の探索が標的となるタンパク質ごとに必要となる、といった問題を有している。
すなわち、本発明は以下の態様を含む。
生体試料中の標的細胞を検出する細胞検出方法であって、
前記標的細胞を含む溶液に一本鎖核酸からなるタグ付きの核酸アプタマーを加え、前記標的細胞の細胞表面物質に特異的に結合させる工程と、
前記タグ付核酸アプタマーにおけるタグ部の一部の塩基配列を含むトリガー核酸、及び前記タグ部の塩基配列に相補的な塩基配列を含むマスク核酸からなるトリガー核酸複合体を加え、当該トリガー核酸を放出させる工程と、
放出された前記トリガー核酸を含む溶液に、発シグナル分子とシグナル抑制分子とがそれぞれ修飾された核酸A及び核酸B、並びに鋳型核酸が形成するタンデム二本鎖中で、両修飾部位がシグナルを抑制するように近接位に位置する鋳型核酸複合体、及び燃料核酸を加え、核酸サーキットを回転させてシグナルを増幅させる工程と、
増幅されたシグナルを検出する工程とを備え、
前記鋳型核酸複合体が、N種類のセグメントが連結した配列(第1*配列〜第N*配列の塩基配列)の鋳型核酸と、当該鋳型核酸と二本鎖を形成し、第1*配列〜第P*配列に相補的な第1配列〜第P配列の塩基配列を含む核酸A及び第(P+1)*配列〜第Q*配列に相補的な第(P+1)配列〜第Q配列の塩基配列を含む核酸B(ここで、P、Q、Nは、1<P<P+1<Q<Nを満たす整数である。)とを含み、
前記トリガー核酸が、前記鋳型核酸の第R*配列〜第S*配列に相補的な第R配列〜第S配列の塩基配列(ここで、R、Sは、1<P+1<R≦Q<S≦Nを満たす整数である。)を含み、
前記燃料核酸が、前記鋳型核酸の第1*配列〜第T*配列に相補的な第1配列〜第T配列の塩基配列(ここで、Tは、R≦Tを満たす整数である。)を含むことを特徴とする細胞検出方法。
態様1に記載の細胞検出方法において、
前記シグナルを増幅させる工程では、更に、溶液中に放出された前記トリガー核酸及び前記核酸Aを利用して、核酸サーキットを多段的に回転させてシグナルを増幅させることを特徴とする細胞検出方法。
態様1又は2に記載の細胞検出方法において、
前記トリガー核酸と前記鋳型核酸との結合定数が、前記核酸Bと前記鋳型核酸との結合定数よりも高いことを特徴とする細胞検出方法。
態様1〜3のいずれか一に記載の細胞検出方法において、
前記燃料核酸と前記鋳型核酸との結合定数が、前記核酸Aと前記鋳型核酸との結合定数、及び前記トリガー核酸と前記鋳型核酸との結合定数よりも高いことを特徴とする細胞検出方法。
態様1〜4のいずれか一に記載の細胞検出方法に用いるためのキットであって、
前記標的細胞の細胞表面物質に特異的に結合し、かつ、一本鎖核酸からなるタグ付きの核酸アプタマーと、
発シグナル分子とシグナル抑制分子とがそれぞれ修飾された核酸A及び核酸B、並びに鋳型核酸が形成するタンデム二本鎖中で、両修飾部位がシグナルを抑制するように近接位に位置する鋳型核酸複合体であって、当該鋳型核酸がN種類のセグメントが連結した配列(第1*配列〜第N*配列の塩基配列)を含み、当該核酸Aが第1*配列〜第P*配列に相補的な第1配列〜第P配列の塩基配列を含み、当該核酸Bが第(P+1)*配列〜第Q*配列に相補的な第(P+1)配列〜第Q配列の塩基配列を含む鋳型核酸複合体(ここで、P、Q、Nは、1<P<P+1<Q<Nを満たす整数である。)と、
前記タグ付核酸アプタマーにおけるタグ部の一部の塩基配列であって、かつ、前記鋳型核酸の第R*配列〜第S*配列に相補的な第R配列〜第S配列の塩基配列を含むトリガー核酸(ここで、R、Sは、1<P+1<R≦Q<S≦Nを満たす整数である。)、及び前記タグ部の塩基配列に相補的な塩基配列を含むマスク核酸からなるトリガー核酸複合体と、
前記鋳型核酸の第1*配列〜第T*配列に相補的な第1配列〜第T配列の塩基配列を含む燃料核酸(ここで、Tは、R≦Tを満たす整数である。)とを含むことを特徴とするキット。
[細胞検出方法]
本発明の細胞検出方法は、以下の工程を有する。
(工程1)標的細胞を含む溶液に一本鎖核酸からなるタグ付きの核酸アプタマーを加え、標的細胞の細胞表面物質に特異的に結合させる工程
(工程2)タグ付核酸アプタマーにおけるタグ部の一部の塩基配列を含むトリガー核酸、及びタグ部の塩基配列に相補的な塩基配列を含むマスク核酸からなるトリガー核酸複合体を加え、当該トリガー核酸を放出させる工程
(工程3)放出されたトリガー核酸を含む溶液に、発シグナル分子とシグナル抑制分子とがそれぞれ修飾された核酸A及び核酸B、並びに鋳型核酸が形成するタンデム二本鎖中で、両修飾部位がシグナルを抑制するように近接位に位置する鋳型核酸複合体、及び燃料核酸を加え、核酸サーキットを回転させてシグナルを増幅させる工程
(工程4)増幅されたシグナルを検出する工程
工程1では、生体試料中の標的細胞を含む溶液に一本鎖核酸からなるタグ付きの核酸アプタマーを加え、当該核酸アプタマーを標的細胞の細胞表面物質に特異的に結合させる。
体液としては、血液(血液全体又は血漿)、リンパ液、組織液(組織間液、細胞間液、間質液)、体腔液(関節液、脳脊髄液、漿膜腔液、眼房水等)、消化液(唾液、胃液、胆汁、膵液、腸液等)、汗、涙等が挙げられ、好ましくは血液(血液全体又は血漿)である。
細胞単離液とは、生体組織を公知の方法で単離・分散し、液体状にしたものを意味する。生体組織としては、特に限定されず、胃、腸、皮膚、肺、乳房、前立腺、精巣、卵巣、子宮、骨髄等、任意の生体組織を適宜対象として使用できる。生体組織の単離・分散のための試薬としては、例えば、トリプシン、パパイン、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、コラゲナーゼ、又はこれらの混合物などの酵素を含む試薬が挙げられ、生体組織、細胞の種類に応じて適宜使用できる。例えば、トリプシン、コラゲナーゼ等の複数の酵素をセットとして含むCell Isolation Optimizing System(フナコシ株式会社製)などが挙げられる。
工程2では、タグ付核酸アプタマーが標的細胞の細胞表面物質に特異的に結合した溶液中に、タグ付核酸アプタマーにおけるタグ部の一部の塩基配列を含むトリガー核酸、及びタグ部の塩基配列に相補的な塩基配列を含むマスク核酸からなるトリガー核酸複合体を加え、当該トリガー核酸を放出させる。
バーコード化やシグナル増幅は、核酸の相補塩基対形成能に基づくものであり、互いに干渉しない配列であれば、複数の標的細胞に対して同時かつ独立にシグナル増幅を行うことも可能である。
工程3では、放出されたトリガー核酸を含む溶液に、発シグナル分子とシグナル抑制分子とがそれぞれ修飾された核酸A及び核酸B、並びに鋳型核酸が形成するタンデム二本鎖中で、両修飾部位がシグナルを抑制するように近接位に位置する鋳型核酸複合体、及び燃料核酸を加え、核酸サーキットを回転させてシグナルを増幅させる。
ここに燃料となる核酸(燃料核酸)を加えておくと、再びtoehold部位をきっかけとした鎖交換反応が起こり、発シグナル分子修飾プローブのみならずトリガー核酸も再度溶液中に放出され、トリガー核酸がフリーとなって溶液中に浮遊する。
溶液中に浮遊したトリガー核酸が、新たな鋳型核酸複合体と反応しシグナル抑制分子修飾プローブが鋳型核酸複合体から放出され、発シグナル分子プローブとの近接が解消されることにより、発シグナル分子からのシグナルが回復し、核酸サーキットが一巡することとなる。
工程4では、上述のようにして増幅されたシグナルを検出する。
増幅シグナルは、肉眼又は分光分析装置等で検出することができる。その他にも、電気化学的活性な分子とそのサイレンサーの組み合わせを用いれば、電気化学的な検出も可能である。また、コロイド粒子、ナノ粒子等を修飾したプローブ二本鎖複合体をセンサーチップ上に化学修飾し、トリガーに応答して脱離させる仕組みとすれば、反射光(SPR)、重量(QCM)などの様々な分析法にも応用が可能である。
次に、本発明の細胞検出方法に用いられる鋳型核酸複合体、トリガー核酸複合体、燃料核酸、タグ付核酸アプタマーについて説明する。
本発明において、「核酸」の種類は特に限定されず、DNA、RNA又はDNA−RNA複合体のいずれであってもよく、好ましくはDNAである。
トリガー核酸複合体は、トリガー核酸及びマスク核酸からなり、トリガー核酸は鋳型核酸の第R*配列〜第S*配列に相補的な第R配列〜第S配列の塩基配列(ここで、R、Sは、1<P+1<R≦Q<S≦Nを満たす整数である。)を含み、マスク核酸はタグ部の塩基配列に相補的な塩基配列を含む。
燃料核酸は、鋳型核酸の第1*配列〜第T*配列に相補的な第1配列〜第T配列の塩基配列(ここで、Tは、R≦Tを満たす整数である。)を含む。
鋳型核酸が、4種類のセグメントが連結した配列(第1*配列〜第4*配列)である場合、核酸Aは、第1*配列に相補的な第1配列の塩基配列を有し、核酸Bは、第2*配列+第3*配列に相補的な第2配列+第3配列の塩基配列を有する。
図2(a)に示す例では、トリガー核酸が鋳型核酸と複合体を形成し、発シグナル分子が修飾された核酸Bが放出されることで、発シグナル分子からのシグナルが回復する。図2(b)に示す例では、燃料核酸が鋳型核酸と複合体を形成し、発シグナル分子が修飾された核酸Aが放出されることで、発シグナル分子からのシグナルが回復する。図2(c)に示す例では、燃料核酸が鋳型核酸と複合体を形成し、シグナル抑制分子が修飾された核酸Aが放出されることで、鋳型核酸に修飾される発シグナル分子からのシグナルが回復する。
いずれの場合においても、上述したように、トリガー核酸に起因する鎖交換反応より核酸Bが放出され、燃料核酸に起因する鎖交換反応によりトリガー核酸と核酸Aとが放出されることにより、核酸サーキットが回転し、発シグナル分子修飾プローブからのシグナルが観測されることとなる。
発光性分子としては、例えば、5−カルボキシフルオレセイン(5−FAM)、6−カルボキシフルオレセイン(6−FAM)、5−カルボキシテトラメチルローダミン(5−TAMRA)、6−カルボキシテトラメチルローダミン(6−TAMRA)、5−(ジメチルアミノ)ナフタレン−1−スルホン酸(DANSYL)、5−カルボキシ−2’,4,4’,5’,7,7’−ヘキサクロロフルオレセイン(5−HEX)、6−カルボキシ−2’,4,4’,5’,7,7’−ヘキサクロロフルオレセイン(6−HEX)、5−カルボキシ−2’,4,7,7’−テトラクロロフルオレセイン(5−TET)、6−カルボキシ−2’,4,7,7’−テトラクロロフルオレセイン(6−TET)、5−カルボキシ−X−ローダミン(5−ROX)、6−カルボキシ−X−ローダミン(6−ROX)、インドカルボシアニン(Cy3)、インドカルボシアニン(Cy3.5)、インドカルボシアニン(Cy5)、インドカルボシアニン(Cy5.5)、4,4−ジフロロ−4−ボラ−3a,4a−ジアザ−s−インダセン(BODIPY)、6−カルボキシ−4’,5’−ジクロロ−2’,7’−ジメトキシフルオレセイン(JOE)、Texas Red、Texas Red−X、Oregon Green 514(Molecular Probes社)、Bodipy R6G−X(Molecular Probes社)、Rhodamine Red−X(Molecular Probes社)、Bodipy TR−X(Molecular Probes社)、LightCycler 640(Roche社)、Boidipy 630/650−X(Molecular Probes社)などが挙げられ、任意の公知の蛍光色素を利用可能である。
電気化学的シグナルを発する分子としては、例えば、フェロセン、メチレンブルー、ドーノマイシンなどが挙げられ、任意の公知の電気化学的活性分子を利用可能である。
電気化学発光分子としては、例えば、ルテニウムトリスフェナントロリン錯体などが挙げられ、任意の公知の電気化学発光性分子を利用可能である。
例えば、消光性分子として、4−(4−ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸(DABCYL)、N−メチル−N−[4−[2−メトキシ−5−メチル−4−(2−ニトロ−4−メチルフェニルアゾ)フェニルアゾ]フェニル]−4−アミノ酪酸(BHQ1)、N−メチル−N−[4−[2,5−ジメトキシ−4−(4−ニトロフェニルアゾ)フェニルアゾ]フェニル]−4−アミノ酪酸(BHQ2)、4−(2−クロロ−4−ニトロフェニルアゾ)アニリン(Eclipse quencher)、BHQ3などが挙げられ、任意の公知の消光色素を利用可能である。
これらの消光色素の存在により、蛍光色素の蛍光放出が消光色素へのエネルギー移動により抑制され、蛍光色素の蛍光が検出できなくなる。具体的には、DABCYLは、FAM、TET、JOE(6−カルボキシ−4’,5’−ジクロロ−2’,7’−ジメトキシフルオレセイン)、HEX、Cy3(Amersham Biosciences社)、TAMRA、Cy3.5(Amersham Biosciences社)、ROX、Texas Redなどの蛍光色素の蛍光放出を消光し、BHQ1は、FAM、Oregon Green 514、TET、Bodipy R6G−X、JOE、HEX、Cy3、Rhodamine Red−X、TAMRAなどの蛍光色素の蛍光放出を消光し、BHQ2、BHQ3及びEclipse quencherは、HEX、Cy3、Rhodamine Red−X、TAMRA、Cy3.5、ROX、Texas Red−X、Bodipy TR−X、LightCycler 640、Boidipy 630/650−X、Cy5(Amersham Biosciences社)などの蛍光色素の蛍光放出を消光する。また、電気化学及び電気化学発光シグナルの抑制分子としては、シクロデキストリン類などの包摂化合物を利用可能である。
トリガー核酸複合体は、タグ付核酸アプタマーにおけるタグ部の一部の塩基配列からなるトリガー核酸、及びタグ部の塩基配列に相補的な塩基配列を含むマスク核酸から構成される。
一方、マスク核酸は、トリガー核酸の第3配列+第4配列に相補的な第3*配列+第4*配列(タグ付核酸アプタマーにおけるタグ部の塩基配列に相補的な塩基配列)を含み、かつ、トリガー核酸よりも長い塩基配列を有している。トリガー核酸よりも長い塩基配列部分(第3*配列+第4*配列以外の塩基配列部分)は、後述するタグ付核酸アプタマーにおけるタグ部の塩基配列同様に自由に設計可能である。
このとき、第3配列+第4配列の塩基配列を有するトリガー核酸と鋳型核酸との結合定数は、核酸Bと鋳型核酸との結合定数よりも高くなるように設計される。例えば、トリガー核酸と鋳型核酸との間に形成される水素結合数が、核酸Bと鋳型核酸との間に形成される水素結合数よりも多くなるように設計されることが好ましい。
鋳型核酸が、4種類のセグメントが連結した配列(第1*配列〜第4*配列)である場合、燃料核酸は、第1*配列〜第3*配列に相補的な第1配列〜第3配列の塩基配列を有している。
このとき、第1配列+第2配列+第3配列の塩基配列を有する燃料核酸と鋳型核酸との結合定数は、核酸Aと鋳型核酸との結合定数、及びトリガー核酸と鋳型核酸との結合定数よりも高くなるように設計される。例えば、燃料核酸と鋳型核酸との間に形成される水素結合数は、核酸Aと鋳型核酸との間に形成される水素結合数、及びトリガー核酸と鋳型核酸との間に形成される水素結合数よりも多くなるように設計されることが好ましい。
「アプタマー」(Aptamer)とは、特定の分子と特異的に結合する核酸やペプチドである。通常ランダム配列の巨大ライブラリ中から選び出してくるが、自然界にも存在しておりリボスイッチとして知られている。基礎から薬剤探索などの応用まで幅広く研究されている。リボザイムと複合体化したアプタマーも存在しており、ターゲット分子存在下で自己切断するものが知られている。大きく分けると核酸(DNA、RNA)アプタマー、ペプチドアプタマーの2種に分類される。
核酸アプタマーは化学合成が可能であるため、コストを大幅に下げることができる。
5’−CACTACAGAGGTTGCGTCTGTCCCACGTTGTCATGGGGGGTTGGCCTG−3’(配列番号8)
EpCAMアプタマー(EpDT3):GCGACUGGUUACCCGGUCG(配列番号10)(Cancer Sci.,102,991−998(2011))
MUC1アプタマー(MUC1 S1.3):GCAGTTGATCCTTTGGATACCCTGG(配列番号11)(Tumor Biol.,27,289−301(2006))
EGFRアプタマー:GGCGCUCCGACCUUAGUCUCUGUGCCGCUAUAAUGCACGGAUUUAAUCGCCGUAGAAAAGCAUGUCAAAGCCGGAACCGUGUAGCACAGCAGAGAAUUAAAUGCCCGCCAUGACCAG(配列番号12)(Cancer Res.,70,9371−9380(2010))
EGFRアプタマー(TuTu22):TACCAGTGCGATGCTCAGTGCCGTTTCTTCTCTTTCGCTTTTTTTGCTTTTGAGCATGCTGACGCATTCGGTTGAC(配列番号13)(Biochem.Biophys.Res.Commun.,453,681−685(2014))
EGFRvIIIアプタマー(U2):ATCCAGAGTGACGCAGCATTTTGACGCTTTATCCTTTTCTTATGGCGGGATAGTTTCGTGGACACGGTGGCTTAGT(配列番号14)(PLOS ONE,9,e90752(2014))
HER2アプタマー(2−2):GCACGGTGTGGGG(配列番号15)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,110,8170−8175(2013))
HER2アプタマー(S6):TGGATGGGGAGATCCGTTGAGTAAGCGGGCGTGTCTCTCTGCCGCCTTGCTATGGGG(配列番号16)(Bull.Korean Chem.Soc.,30,1827−1831(2009))
HER2アプタマー(Mini):AGCCGCGAGGGGAGGGAUAGGGUAGGGCGCGGCU(配列番号17)(Nucleic.Acid Ther.,21,173−178(2011))
HER2アプタマー(HSB5):AACCGCCCAAATCCCTAAGAGTCTGCACTTGTCATTTTGTATATGTATTTGGTTTTTGGCTCTCACAGACACACTACACACGCACA(配列番号18)(J.Transl.Med.,10,148−158(2012))
ABCG2アプタマー(ABCG2/A12):ACGCTCGGATGCCACTACAGGCCCACCCTCATGGACGTGCTGGTGAC(配列番号19)(J.Cancer Sci.Ther.,4,214−222(2012))
CD71アプタマー(c2.min):GGGGGAUCAAUCCAAGGGACCCGGAAACGCUCCCUUACACCCC(配列番号20)(Mol.Ther.Nucleic Acids,1,e21(2012))
CD44アプタマー(Apt1):GGGAUGGAUCCAAGCUUACUGGCAUCUGGAUUUGCGCGUGCCAGAAUAAAGAGUAUAACGUGUGAAUGGGAAGCUUCGAUAGGAAUUCGG(配列番号21)(Nucleic Acid Ther.,23,401−407(2013))
CD133アプタマー(CD133−A15):CCCUCCUACAUAGGG(配列番号22)(Cancer Lett.,330,84−95(2013))
免疫グロブリンμ重鎖アプタマー(TD05):ACCGGGAGGATAGTTCGGTGGCTGTTCAGGGTCTCCTCCCGGTG(配列番号23)(Mol.Cell.Proteomics,2230−2230(2007))
ヌクレオリンアプタマー(AS1411):GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG(配列番号24)(Mol.Cancer Ther.,5,1790−1799(2006))
ピグペンアプタマー(III.1):ATACCAGCTTATTCAATTAGGCGGTGCATTGTGGTGGTAGTATACATGAGGTTTGGTTGAGACTAGTCGCAAGATATAGATAGTAAGTGCAATCT(配列番号25)(J.Biol.Chem.,276,16464−16468(2001))
テナシンCアプタマー(GBI−10):GGCTGTTGTGAGCCTCCTCCCAGAGGGAAGACTTTAGGTTCGGTTCACGTCCCGCTTATTCTTACTCCC(配列番号26)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,100,15416−15421(2003))
PTK7アプタマー(sgc8):ATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGA(配列番号27)(J.Proteome Res.,7,2133−2139(2008))
Toledo細胞アプタマー(Sgd5):ATACCAGCTTATTCAATTATCGTGGGTCACAGCAGCGGTTGTGAGGAAGAAAGGCGGATAACAGATAATAAGATAGTAAGTGCAATCT(配列番号28)(Clin.Chem.,53,1153−1158(2007))
MEAR細胞アプタマー(TLS11a):ACAGCATCCCCATGTGAACAATCGCATTGTGATTGTTACGGTTTCCGCCTCATGGACGTGCTG(配列番号29)(Anal.Chem.,80,721−728(2008))
HL60細胞アプタマー(KH1C12):ATCCAGAGTGACGCAGCATGCCCTAGTTACTACTACTCTTTTTAGCAAACGCCCTCGCTTTGGACACGGTGGCTTAGT(配列番号31)(Leukemia,23,235−244(2009))
ビメンチンアプタマー(NAS−24):CTCCTCTGACTGTAACCACGCCTGGGACAGCCACACAGAAGTGTAGACCTCGCGGAATCGGCATAGGTAGTCCAGAAGCC(配列番号32)(Nucleic Acid Ther.,24,160−170(2014))
スペーサー部及びタグ部の塩基配列は、自由に設計可能であるが、トリガー核酸複合体におけるトリガー核酸の塩基配列を含み、また、マスク核酸の塩基配列に相補的な塩基配列を含む。
タグ付核酸アプタマーのタグ部の塩基配列の長さは、トリガー核酸の塩基配列よりも長くなるように設計され、タグ部とマスク核酸とが安定的に結合することにより、トリガー核酸複合体からトリガー核酸が放出されるようになっている。
本発明の生体試料中の標的細胞を検出する細胞検出方法に用いるキットは、標的細胞の細胞表面物質に特異的に結合し、かつ、一本鎖核酸からなるタグ付きの核酸アプタマーと、発シグナル分子とシグナル抑制分子とがそれぞれ修飾された核酸A及び核酸B、並びに鋳型核酸とが形成するタンデム二本鎖中で、両修飾部位がシグナルを抑制するように近接位に位置する鋳型核酸複合体であって、当該鋳型核酸がN種類のセグメントが連結した配列(第1*配列〜第N*配列の塩基配列)を含み、当該核酸Aが第1*配列〜第P*配列に相補的な第1配列〜第P配列の塩基配列を含み、当該核酸Bが第(P+1)*配列〜第Q*配列に相補的な第(P+1)配列〜第Q配列の塩基配列を含む鋳型核酸複合体(ここで、P、Q、Nは、1<P<P+1<Q<Nを満たす整数である。)と、タグ付核酸アプタマーにおけるタグ部の一部の塩基配列であって、かつ、鋳型核酸の第R*配列〜第S*配列に相補的な第R配列〜第S配列の塩基配列を含むトリガー核酸(ここで、R、Sは、1<P+1<R≦Q<S≦Nを満たす整数である。)、及びタグ部の塩基配列に相補的な塩基配列を含むマスク核酸からなるトリガー核酸複合体と、鋳型核酸の第1*配列〜第T*配列に相補的な第1配列〜第T配列の塩基配列を含む燃料核酸(ここで、Tは、R≦Tを満たす整数である。)とを含む。
本発明の細胞検出方法において、溶液中の標的細胞はキャリアーに捕捉されていてもよい。
(i)元素周期表第10族元素、第11族元素及びこれらの組み合わせから選択される元素を含む担持層と、
(ii)当該担持層上に設けられている自己組織化単分子膜と、
(iii)当該担持層上に直接、又は当該自己組織化単分子膜を介して設けられており、標的細胞の細胞表面物質に特異的に結合する核酸アプタマー又は抗体と、
を備えたものを利用可能である。
以下、本発明の細胞検出方法の一態様について説明するが、特にこれに限定されるものではない。
(ii)腫瘍細胞を含むサンプル溶液を修飾基板上に滴下し、標的とする腫瘍細胞を選択的に捕捉する。
(iii)洗浄後、PBS中で調製したタグ付EpCAMアプタマー溶液を基板に滴下する。さらに、これをPBSで洗浄した後、PBS中で調製したトリガー核酸及びマスク核酸が部分的に二本鎖を形成した複合体溶液を滴下する。基板上に捕捉された細胞上のタグ付EpCAMアプタマーにおけるタグ部とマスク核酸との結合に伴い、トリガー核酸が放出される。
(iv)放出されたトリガー核酸がきっかけとなり、シグナル増幅反応が進行する。蛍光や電気化学的ラベル化のみならず、SPR、QCMなどの分析手法が利用できるため、リアルタイムなモニタリングによって速度論的な解析を行うことも可能となる。
担持層として銅基板上に金メッキを施し、自己組織化単分子膜としてヒドロキシアルカンチオール膜を成膜し、核酸アプタマーとして末端アミノ化アプタマーを結合させた、アプタマー修飾されたキャリアーを利用可能である。
腫瘍細胞を含むサンプル溶液を修飾基板(キャリアー)上に滴下し、標的とする腫瘍細胞を選択的に捕捉する。使用する細胞の核はDAPIで細胞膜はDiDで染色し、蛍光顕微鏡にて細胞を確認する。図5に示すように、腫瘍細胞検出を試みた結果、選択的に腫瘍細胞を捕捉することに成功している。
標的細胞であるMDA−MB−453(ヒト乳癌細胞)及びKATOIII(ヒト胃癌由来細胞)の捕捉は確認されたが、正常細胞であるHEK−293T(ヒト胎児腎由来細胞)では確認されなかった。なお、比較例として、アプタマー修飾していないキャリアー上にMDA−MB−453(ヒト乳癌細胞)を滴下した場合についても腫瘍細胞検出を試みたが、細胞の捕捉は確認されなかった。以上から、標的とするがん細胞の特異的捕捉を確認した。
OligoAnalyzerにより、EpCAMアプタマーは、図6に示すように三つのへアピンループを有する構造を形成することが予測されている。タグ付EpCAMアプタマーは、末端からスペーサー部を介してタグ部を連結させる。
細胞上でのトリガー核酸の放出は、タグ付EpCAMアプタマーにおけるタグ部とマスク核酸との結合から確認する。具体的には、まず核をHoechst33342により染色した細胞上にタグ付EpCAMアプタマーを結合させ、洗浄後、そこにFAMを修飾したマスク核酸とトリガー核酸から構成される二本鎖複合体(トリガー核酸複合体)を添加する。FAMで染色された細胞を観察することにより、トリガー核酸の放出効率を評価する。
マスク核酸の標的細胞に対する結合率は、(FAMによる染色細胞数/Hoechst33342による染色細胞数)×100にて算出する。
放出された一本鎖をトリガーとして核酸サーキットを回転させてシグナルを増幅させる。条件検討の段階では、実際に腫瘍細胞によって放出されたトリガー核酸ではなく、細胞数個〜数十個から放出されると想定される量(amol〜fmol(pM〜nM)オーダー)のトリガー核酸を用いて実験を行う(体積は、100μL程度とする)。
血清培地中での実験で得られた最適条件を元に、血液(全血)マトリックス中で腫瘍細胞捕捉実験を行う。実際の患者の血液を想定し、これと同等な腫瘍細胞濃度(10mL中に数個の腫瘍細胞)となるように、血液に対して腫瘍細胞を混合し、これを捕捉実験に用いる。必要があれば、遠心分離により、血球成分と血漿成分とを別け、血球成分を用いる。最適化された条件により実際に腫瘍細胞を捕捉する。洗浄後、溶媒中でタグ付EpCAMアプタマーを一定時間のインキュベーション後、シグナル増幅を実行するためのトリガー核酸複合体、プローブ二本鎖複合体(鋳型核酸複合体)、燃料核酸を最小体積で加え、トリガー核酸の放出、及びシグナル増幅を行う。
キャリアー上に捕捉された標的細胞膜上のEpCAMと結合したタグ付EpCAMアプタマーのタグ部との反応に伴い、トリガー核酸複合体は解離し、マスク核酸がタグ部と結合して、トリガー核酸がこの回収溶液中に一本鎖として遊離する。続いて、蛍光色素と消光色素を修飾した2種の核酸プローブが互いの修飾部位が近接するように(蛍光オフ)、それらの相補鎖とタンデム二本鎖複合体を形成した鋳型核酸複合体を用意し、このプローブ溶液を上記回収した溶液と混合する。
第2の本実施形態に係る細胞検出方法について説明する。なお、上記第1の実施形態と重複する記載については省略する。
例えば、第1の鋳型核酸複合体は、6種類のセグメントが連結した配列(第1b*配列〜第1d*配列+第2*配列〜第4*配列)を有する第1の鋳型核酸と、第1b*配列〜第1d*配列に相補的な第1b配列〜第1d配列の塩基配列を含む第1a配列〜第1d配列を有する第1の核酸Aと、第2*配列+第3*配列に相補的な第2配列+第3配列の塩基配列を有する第1の核酸Bとが二本鎖を形成した複合体である。
第2の鋳型核酸複合体は、5種類のセグメントが連結した配列(第6*配列+第5*配列+第1a*配列〜第1c*配列)を有する第2の鋳型核酸と、第6*配列に相補的な第6配列の塩基配列を有する第2の核酸Aと、第5*配列+第1a*配列+第1b*配列に相補的な第5配列+第1a配列+第1b配列の塩基配列を有する第2の核酸Bとが二本鎖を形成した複合体である。
それぞれの鋳型核酸複合体において、発シグナル分子は核酸Aの3’末端に修飾され、シグナル抑制分子は核酸Bの5’末端に修飾されているものとする。
具体的には、第1の鋳型核酸複合体から放出された発シグナル分子修飾プローブ(第1の核酸A)が、第2の鋳型核酸複合体中のtoehold部位をきっかけとし、鎖交換反応を引き起こす。その結果、シグナル抑制分子修飾プローブ(第2の核酸B)が第2の鋳型核酸複合体から放出され、両者の近接が解消されることにより、発シグナル分子からのシグナルが回復する。
ここに燃料となる核酸(第2の燃料核酸)を加えておくと、再びtoehold部位をきっかけとした鎖交換反応が起こり、発シグナル分子修飾プローブ(第2の核酸A)のみならずトリガーとなった第1の鋳型核酸複合体由来の発シグナル分子修飾プローブ(第1の核酸A)も再度溶液中に放出されて溶液中に浮遊する。
溶液中に浮遊した第1の鋳型核酸複合体由来の発シグナル分子修飾プローブ(第1の核酸A)が、新たな第2の鋳型核酸複合体と反応しシグナル抑制分子修飾プローブ(第2の核酸B)が第2の鋳型核酸複合体から放出され、発シグナル分子プローブ(第2の核酸A)との近接が解消されることにより、発シグナル分子からのシグナルが回復し、2段階目の核酸サーキットが一巡することとなる。
このように、多段階核酸サーキットは、1段階の核酸サーキットと比較して、より短い時間でシグナル強度を増大させることができ、更なる診断時間の短縮を図ることができる。
図8に示す多段階(自己触媒的)核酸サーキットでは、1種類の鋳型核酸複合体、1種類の燃料核酸を準備する。このプロセスでは、1段階目の鋳型核酸複合体由来の発シグナル分子修飾プローブ(核酸A)と2段階目の鋳型核酸複合体由来の発シグナル分子修飾プローブが共通であり、2段階目において燃料核酸がトリガーとなる2つの核酸Aを一度に溶液中に浮遊させるため、指数関数的にシグナル強度が増大し、最短の診断時間を期待できる。
具体的には、1段階目における鋳型核酸複合体から放出されたトリガーとしての発シグナル分子修飾プローブ(核酸A)が、2段階目における鋳型核酸複合体中のtoehold部位をきっかけとし、鎖交換反応を引き起こす。その結果、2段階目における鋳型核酸複合体のシグナル抑制分子修飾プローブ(核酸B)が当該鋳型核酸複合体から放出され、両者の近接が解消されることにより、新たな発シグナル分子修飾プローブからのシグナルが回復する。ここで、1段階目における鋳型核酸複合体由来の発シグナル分子修飾プローブ(核酸A)と2段階目における鋳型核酸複合体由来の発シグナル分子修飾プローブ(核酸A)は共通である。
ここに燃料となる核酸(燃料核酸)を加えておくと、再びtoehold部位をきっかけとした鎖交換反応が起こり、2段階目における鋳型核酸複合体の発シグナル分子修飾プローブ(核酸B)のみならず、トリガーとなった1段階目における鋳型核酸複合体の発シグナル分子修飾プローブ(核酸B)も再度溶液中に放出されて溶液中に浮遊する。
溶液中に浮遊した二つの発シグナル分子修飾プローブ(核酸A)が、新たな二つの鋳型核酸複合体と反応しシグナル抑制分子修飾プローブが鋳型核酸複合体から放出され、発シグナル分子プローブとの近接が解消されることにより、発シグナル分子からのシグナルが回復し、核酸サーキットが一巡することとなる。
このように、この多段階核酸サーキットは、1段階の核酸サーキット及び先に説明した多段階核酸サーキットと比較して、指数関数的にシグナル強度が増大するために更なる診断時間の短縮を図ることができる。また、必要とする材料種が少ないため、製造コストを抑えることもできる。
また、本実施例において使用するタグ付EpCAMアプタマー、トリガー核酸、マスク核酸、鋳型核酸、5−FAM修飾核酸、BHQ1修飾核酸、燃料核酸の塩基配列を下記に示す。
5’−CACTACAGAGGTTGCGTCTGTCCCACGTTGTCATGGGGGGTTGGCCTGTTTTTTTTTTGTCGATTCCATTCAATACCCTACGTCTCCA−3’(配列番号1)
トリガー核酸:
5’−CATTCAATACCCTACGTCTCCA−3’(配列番号2)
マスク核酸:
5’−TGGAGACGTAGGGTATTGAATGGAATCGAC−3’(配列番号3)
鋳型核酸:
5’−TGGAGACGTAGGGTATTGAATGAGGGCCGTAAGTTAGTTGGAGACGTAGG−3’(配列番号4)
5−FAM修飾核酸:
5’−CCTACGTCTCCAACTAACTTACGG−(5−FAM)−3’(配列番号5)
5−FAM修飾核酸II:
5’−CATTCAATACCCTACGTCTCCAACTAACTTACGG−(5−FAM)−3’(配列番号34)
BHQ1修飾核酸:
5’−(BHQ1)−CCCTCATTCAATACCCTACG−3’(配列番号6)
燃料核酸:
5’−CCTACGTCTCCAACTAACTTACGGCCCTCATTCAATACCCTACG−3’(配列番号7)
以下の手順で標的細胞に対するタグ付EpCAMアプタマーの結合、トリガー核酸の放出の確認を行なった。トリガー核酸の放出は、タグ付EpCAMアプタマーのタグ部上に結合したマスク核酸により確認した。
=(Cy5による染色細胞数/Hoechst33342による染色細胞数)×100
マスク核酸の結合率
=(FAMによる染色細胞数/Hoechst33342による染色細胞数)×100
また、トリガー核酸複合体を添加した場合、MDA−MB−453細胞については約65%のマスク核酸が結合していることがわかった。一方、HEK−293T細胞については約15%程度しかマスク核酸が結合していなかった。
なお、タグ付EpCAMアプタマーを添加せずに、トリガー核酸複合体のみを添加した場合についても検証したところ、両細胞ともに10%程度しかマスク核酸が結合していなかった。
図10に示すように、タグ付EpCAMアプタマーが結合している細胞とマスク核酸が結合している細胞とは完全に一致したため、特異的にマスク核酸がタグ部に結合していると考えられる。
次に、核酸サーキットによるがん細胞の検出を試みた。
図1に示すように、蛍光色素(5−FAM)、消光剤(BHQ1)を修飾した2種の核酸プローブ(それぞれ5−FAM修飾核酸、BHQ1修飾核酸)を作製し、互いの修飾部位が近接するようにして(蛍光オフ)、鋳型核酸複合体を形成した。
がん細胞に応答して放出されたトリガー核酸は、その鋳型核酸複合体末端の突出部位(図1における第4*配列)をきっかけとし、鎖交換反応を引き起こす。結果、BHQ1修飾核酸が二本鎖複合体から放出され、5−FAM修飾核酸が発光する設計とした。ここに、核酸サーキットを回転させるための燃料となる核酸(燃料核酸)を加えておくと、新たに出現した突出部位(図1における第2*配列)をきっかけとした鎖交換反応が起こり、5−FAM修飾核酸のみならずトリガー核酸も溶液中に放出され、結果、トリガー核酸が再利用可能となる設計とした。
図12に示すように、MDA−MB−453細胞の上澄みを加えた溶液は、添加後から速やかに発光強度が増加することがわかった。一方で、HEK−293T細胞においては、図10にて確認された非特異的に結合したタグ付EpCAMアプタマーによって放出されたと考えられるトリガー核酸によって増幅されたシグナルが若干確認された。しかしながら、その発光強度には約3.5倍以上の明確な差が確認され、目視でもその差は容易に確認することができた。
次に、核酸サーキットが正常に回転していることの検証を行った。
上述したように、がん細胞に応答して放出されたトリガー核酸は、その鋳型核酸複合体末端の突出部位をきっかけとして鎖交換反応を引き起こし、その結果、BHQ1修飾核酸が鋳型核酸複合体から放出されて5−FAM修飾核酸が発光するように設計されている。
このとき、発光強度が増加する要因としては、(i)溶液中のトリガー核酸の量に応じて経時的に放出されるBHQ1修飾核酸に起因する発光強度の変化、(ii)トリガー核酸の再利用により、核酸サーキットが回転することで生じる発光強度の変化、が考えられる。
これを検証するため、添加する燃料核酸の量(濃度)を変化させ、経時における発光強度の変化を確認した。
溶液中のトリガー核酸の量に応じて発光強度が変化しているのであれば、燃料核酸の量によらず、その強度は同じ値で飽和するはずであるが、図13で示されるように、燃料核酸の量に応じて発光強度の変化が確認された。これは、燃料核酸により、トリガー核酸が溶液中に再放出されて再利用可能となり、核酸サーキットが回転していることを示している。
また、トリガー核酸がなく、燃料核酸のみを添加した場合では、発光強度の変化は見られず、鋳型核酸と複合体を形成しない、すなわち、5−FAM修飾核酸が放出されないことが確認できた。
次に、胃食道接合部がん患者の血液を用いて、核酸サーキットの正常な回転検証及び核酸サーキットによるがん細胞の検出を行った。
作製したマイクロフィルタ40を、図15に示す流入部50a及び流出部50bからなるハウジング50に取り付けてマイクロフィルタデバイス51とした。
免疫染色した細胞を共焦点レーザー倒立顕微鏡(ニコン C2+)で観察した。DAPI及びCytokeratinのいずれにおいても陽性となった細胞をがん細胞とし、それらの個数を測定した。マイクロフィルタデバイス51を用いて捕捉したがん細胞の蛍光観察写真を図17に示す。
三つのマイクロフィルタデバイス51にそれぞれ1mLの血液を送液した結果、平均6個のがん細胞が捕捉されていることが確認された。
得られた結果を図18に示す。
その結果を図19に示す。
以上から、本発明の核酸サーキットが、実際のがん患者においてもがん細胞の検出に有効であることがわかる。
次に、図8に示す多段階核酸サーキットが正常に回転していることの検証を行った。
なお、図8において、第1a配列は5−FAM修飾核酸IIにおける(5’−)CATTCAATAC(−3’)、第1b配列は5−FAM修飾核酸IIにおける(5’−)CCTACG(−3’)、第2a配列は5−FAM修飾核酸IIにおける(5’−)TCTCCA(−3’)、第2b配列は5−FAM修飾核酸IIにおける(5’−)ACTAACTTACGG(−3’)に対応している。
これらサンプルについて、SpectrofluorometerFP−8500(JASCO社製)を用いて25℃にて蛍光測定(励起波長490nm、蛍光波長520nm)を行った。
得られた結果を図20に示す。
以上から、図8に示される多段階核酸サーキットが、最短の診断時間で、指数関数的に発光強度を増大させることが確認された。
32 自己組織化単分子膜
33 アプタマー又は抗体
40 マイクロフィルタ
50 ハウジング
50a 流入部
50b 流出部
51 マイクロフィルタデバイス
52 貯留槽
53 ポンプ
54 廃液槽
Claims (5)
- 生体試料中の標的細胞を検出する細胞検出方法であって、
前記標的細胞を含む溶液に一本鎖核酸からなるタグ付きの核酸アプタマーを加え、前記標的細胞の細胞表面物質に特異的に結合させる工程と、
前記タグ付核酸アプタマーにおけるタグ部の一部の塩基配列を含むトリガー核酸、及び前記タグ部の塩基配列に相補的な塩基配列を含むマスク核酸からなるトリガー核酸複合体を加え、当該トリガー核酸を放出させる工程と、
放出された前記トリガー核酸を含む溶液に、発シグナル分子とシグナル抑制分子とがそれぞれ修飾された核酸A及び核酸B、並びに鋳型核酸が形成するタンデム二本鎖中で、両修飾部位がシグナルを抑制するように近接位に位置する鋳型核酸複合体、及び燃料核酸を加え、核酸サーキットを回転させてシグナルを増幅させる工程と、
増幅されたシグナルを検出する工程とを備え、
前記鋳型核酸複合体が、N種類のセグメントが連結した配列(第1*配列〜第N*配列の塩基配列)の鋳型核酸と、当該鋳型核酸と二本鎖を形成し、第1*配列〜第P*配列に相補的な第1配列〜第P配列の塩基配列を含む核酸A及び第(P+1)*配列〜第Q*配列に相補的な第(P+1)配列〜第Q配列の塩基配列を含む核酸B(ここで、P、Q、Nは、1<P<P+1<Q<Nを満たす整数である。)とを含み、
前記トリガー核酸が、前記鋳型核酸の第R*配列〜第S*配列に相補的な第R配列〜第S配列の塩基配列(ここで、R、Sは、1<P+1<R≦Q<S≦Nを満たす整数である。)を含み、
前記燃料核酸が、前記鋳型核酸の第1*配列〜第T*配列に相補的な第1配列〜第T配列の塩基配列(ここで、Tは、R≦Tを満たす整数である。)を含むことを特徴とする細胞検出方法。 - 請求項1に記載の細胞検出方法において、
前記シグナルを増幅させる工程では、更に、溶液中に放出された前記トリガー核酸及び前記核酸Aを利用して、核酸サーキットを多段的に回転させてシグナルを増幅させることを特徴とする細胞検出方法。 - 請求項1に記載の細胞検出方法において、
前記トリガー核酸と前記鋳型核酸との結合定数が、前記核酸Bと前記鋳型核酸との結合定数よりも高いことを特徴とする細胞検出方法。 - 請求項1〜3のいずれか一項に記載の細胞検出方法において、
前記燃料核酸と前記鋳型核酸との結合定数が、前記核酸Aと前記鋳型核酸との結合定数、及び前記トリガー核酸と前記鋳型核酸との結合定数よりも高いことを特徴とする細胞検出方法。 - 請求項1〜4のいずれか一項に記載の細胞検出方法に用いるためのキットであって、
前記標的細胞の細胞表面物質に特異的に結合し、かつ、一本鎖核酸からなるタグ付きの核酸アプタマーと、
発シグナル分子とシグナル抑制分子とがそれぞれ修飾された核酸A及び核酸B、並びに鋳型核酸が形成するタンデム二本鎖中で、両修飾部位がシグナルを抑制するように近接位に位置する鋳型核酸複合体であって、当該鋳型核酸がN種類のセグメントが連結した配列(第1*配列〜第N*配列の塩基配列)を含み、当該核酸Aが第1*配列〜第P*配列に相補的な第1配列〜第P配列の塩基配列を含み、当該核酸Bが第(P+1)*配列〜第Q*配列に相補的な第(P+1)配列〜第Q配列の塩基配列を含む鋳型核酸複合体(ここで、P、Q、Nは、1<P<P+1<Q<Nを満たす整数である。)と、
前記タグ付核酸アプタマーにおけるタグ部の一部の塩基配列であって、かつ、前記鋳型核酸の第R*配列〜第S*配列に相補的な第R配列〜第S配列の塩基配列を含むトリガー核酸(ここで、R、Sは、1<P+1<R≦Q<S≦Nを満たす整数である。)、及び前記タグ部の塩基配列に相補的な塩基配列を含むマスク核酸からなるトリガー核酸複合体と、
前記鋳型核酸の第1*配列〜第T*配列に相補的な第1配列〜第T配列の塩基配列を含む燃料核酸(ここで、Tは、R≦Tを満たす整数である。)とを含むことを特徴とするキット。
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