ES2629460T3 - Detección de variantes diana usando un marcador fluorescente y un extintor soluble - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para detectar la presencia o ausencia de una variante del ácido nucleico diana en una muestra, en el que puede producirse un ácido nucleico diana en al menos dos variantes, comprendiendo el procedimiento (a) proporcionar al menos un oligonucleótido marcado que comprende un primer marcador, comprendiendo dicho primer marcador al menos un resto emisor de luz y en el que al menos una subsecuencia del oligonucleótido marcado es suficientemente complementaria de al menos una subsecuencia del ácido nucleico diana, de tal manera que el oligonucleótido marcado hibrida con el ácido nucleico diana en una condición seleccionada; (b) proporcionar al menos un modificador soluble de la emisión de luz, que, cuando el modificador se une de forma no covalente al ADN bicatenario que incorpora el oligonucleótido marcado, extingue la emisión de luz del primer marcador y no extingue significativamente la emisión de luz del primer marcador en presencia del modificador soluble de la emisión de luz cuando el oligonucleótido marcado es monocatenario; (c) amplificar el ácido nucleico diana en la muestra en presencia del oligonucleótido marcado y del modificador soluble de la emisión de luz en una reacción de amplificación en la condición seleccionada, de tal manera que el oligonucleótido marcado se extienda para producir un primer amplicón marcado bicatenario que incorpore el oligonucleótido marcado, en el que el primer amplicón marcado bicatenario tenga una temperatura de fusión diferente dependiendo de cuál de las al menos dos variantes del ácido nucleico diana se amplifican; (d) detectar la temperatura de fusión del amplicón marcado bicatenario disociado en dos hebras individuales monitorizando la señal del marcador con una temperatura cambiante; y (e) correlacionar la temperatura de fusión del amplicón marcado bicatenario con la presencia de una de las al menos dos variantes diana, detectando de este modo la presencia o ausencia de una variante del ácido nucleico diana en una muestra.
Description
«Biocatalizador que incorpora nucleótidos» se refiere a un catalizador que cataliza la incorporación de nucleótidos en un ácido nucleico. Los biocatalizadores que incorporan nucleótidos son típicamente enzimas. Una «enzima» es un catalizador basado en proteínas que actúa para reducir la energía de activación de una reacción química que implica otros compuestos o «sustratos». «Enzima que incorpora nucleótidos» se refiere a una enzima que cataliza la incorporación de nucleótidos en un ácido nucleico. Los ejemplos de enzimas que incorporan nucleótidos incluyen, por ejemplo, ADN-polimerasas, ARN-polimerasas, transferasas terminales, transcriptasas inversas, telomerasas, polinucleótido-fosforilasas y similares. Otros biocatalizadores pueden estar basados en ADN («ADNzimas») o basadosen ARN («ribozimas»). «Enzima termoestable» se refiere a una enzima que es estable al calor, es resistente al calor y retiene suficiente actividad catalítica cuando se somete a temperaturas elevadas durante periodos de tiempo seleccionados. Por ejemplo, una polimerasa termoestable retiene suficiente actividad para efectuar reacciones subsiguientes de extensión del cebador cuando se somete a temperaturas elevadas durante el tiempo necesario para efectuar la desnaturalización de ácidos nucleicos bicatenarios. Las condiciones de calentamiento necesarias para la desnaturalización de ácidos nucleicos son bien conocidas en la técnica, y se ejemplifican en la patente de EE. UU. N.º 4.683.202, titulada «PROCESS FOR AMPLIFYING NUCLEIC ACID SEQUENCES», concedida el 28 de julio de 1987 a Mullis y la patente de EE. UU. N.º 4.683.195, titulada «PROCESS FOR AMPLIFYING, DETECTING, AND/OR-CLONING NUCLEIC ACID SEQUENCES», concedida el 28 de julio de 1987 a Mullis et al. Como se usa en el presente documento, una polimerasa termoestable es típicamente adecuada para su uso en una reacción con ciclos de temperatura, tal como una PCR o una reacción de la nucleasa 5’. Para una polimerasa termoestable, la actividad enzimática se refiere a la catálisis de la polimerización de los nucleótidos de manera apropiada para formar productos de extensión del cebador que sean complementarios a un ácido nucleico molde.
«Oligonucleótido» o «Polinucleótido» se refiere a un ácido nucleico que incluye al menos dos unidades monoméricas de ácido nucleico (por ejemplo, nucleótidos), típicamente más de tres unidades monoméricas y más típicamente más de diez unidades monoméricas. El tamaño exacto de un oligonucleótido, en general, depende de diversos factores, incluyendo el uso o función final del oligonucleótido. Los oligonucleótidos se preparan opcionalmente mediante cualquier procedimiento adecuado, incluyendo, pero no limitado a, aislamiento de una secuencia existente o natural, replicación o amplificación del ADN, transcripción inversa, clonación y digestión con enzimas de restricción de secuencias apropiadas, o síntesis química directa mediante un procedimiento tal como el procedimiento del fosfotriester de Narang et al. (1979) Meth. Enzymol. 68:90-99; el procedimiento del fosfodiéster de Brown et al. (1979) Meth. Enzymol. 68:109-151; el procedimiento de la dietilfosforamidita de Beaucage et al. (1981) Tetrahedron Lett. 22:1859-1862; el procedimiento del triéster de Matteucci et al. (1981) J. Am. Chem. Soc. 103:3185-3191; procedimientos de síntesis automatizados; o el procedimiento en un soporte sólido de la patente de EE. UU. N.º 4.458.066, titulada «PROCESS FOR PREPARING POLYNUCLEOTIDES», concedida el 3 de julio de 1984 a Caruthers et al., u otros procedimientos conocidos en la técnica.
Un colorante de tiazina se refiere a cualquiera de una clase de compuestos químicos orgánicos que contienen un sistema de anillos condensados aromáticos tricíclicos, en el que dos de los carbonos en el anillo central están reemplazados por un átomo de nitrógeno y un átomo de azufre. Los ejemplos de colorantes de tiazina incluyen azul de metileno, verde de metileno, tionina, azul de 1,9-dimetilmetileno, azul de simidimetiltionina, azul de toluidina O, nuevo azul de metileno, violeta de metileno bernthsen, azul A, azul B y azul C.
El término «ácido nucleico molde» o «ácido nucleico diana» se refiere a un ácido nucleico que se ha de amplificar, detectar o analizar de otro modo. Las «variantes del ácido nucleico diana» son secuencias de ácido nucleico que se sabe que se producen, o se cree que posiblemente se producen en una muestra, y que son similares o casi idénticas a la secuencia de ácido nucleico diana o una respecto a otra excepto por un número relativamente pequeño de cambios en nucleótidos. Los cambios pueden producirse como una inserción o deleción, o pueden ser mutaciones puntuales. Como un ejemplo, las variantes de un ácido nucleico de un virus infeccioso (por ejemplo, VIH, VHB, VHC, etc.) son variantes del ácido nucleico diana. En algunos modos de realización, la diferencia entre dos variantes en una secuencia de ácido nucleico diana se producirá en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 posiciones de nucleótidos. Como se describe con más detalle en el presente documento, en algunos modos de realización, el ácido nucleico diana tiene una región de secuencia en la que una secuencia de cebador puede hibridar en condiciones de amplificación. y adyacente (es decir, dentro del amplicón resultante, no necesariamente directamente adyacente) a esa posición, la variación de secuencia se producirá de tal manera que cuando el cebador se extiende para formar un amplicón, el amplicón comprende al menos una posición variante.
Como se usa en el presente documento, el término «Tm» se usa en referencia a la «temperatura de fusión». La temperatura de fusión es la temperatura a la que una mitad de una población de polinucleótidos u oligómeros de nucleobases bicatenarios (por ejemplo, complejos de hibridación), en homodúplex o heterodúplex, se disocian en hebras simples. La predicción de una Tm de un polinucleótido dúplex tiene en cuenta la secuencia de las bases así como otros factores, incluyendo características estructurales y de secuencia y la naturaleza de los enlaces oligoméricos. Los procedimientos para predecir y determinar experimentalmente la Tm son conocidos en la técnica.
Por ejemplo, una Tm se determina tradicionalmente por una curva de fusión, en la que una molécula de ácido nucleico dúplex se calienta en un programa de temperatura controlada, y el estado de asociación/disociación de las dos hebras simples en el dúplex se controla y se representa gráficamente hasta alcanzar una temperatura en la que
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University Press (1984), Hames y Higgins, Nucleic Acid Hybridization, Practice Approach Series, Oxford University Press (1997), y Hames y Higgins (Eds.) Transcription and Translation, Practical Approach Series, Oxford University Press (1984).
Los ejemplos de tipos generales de tecnologías de análisis de ácidos nucleicos que se pueden usar o adaptar para su uso para analizar ácidos nucleicos diana en o desde mezclas de reacción incluyen diversos ensayos de amplificación de ácidos nucleicos. Las pruebas de amplificación de ácidos nucleicos pueden tener mayor sensibilidad que otros métodos para el análisis de ácidos nucleicos. Esta sensibilidad, que se mejora además con el uso de los modificadores de la emisión de luz de los procedimientos de la invención, es tıpicamente atribuible a su capacidad para producir una señal positiva desde tan solo una única copia del ácido nucleico diana. Los procedimientos de amplificación que opcionalmente se utilizan o adaptan para detectar ácidos nucleicos diana incluyen, por ejemplo, diversos procedimientos de amplificación mediados por la polimerasa, la ligasa o la transcriptasa inversa, tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la reacción en cadena de la ligasa (LCR), PCR con transcripción inversa (RT-PCR), NASBA, TMA, SDA y similares. Se pueden encontrar detalles adicionales sobre el uso de estos y otros procedimientos de amplificación y diversos métodos para la preparación de muestras para estos ensayos en cualquiera de una variedad de textos estándar, incluyendo, por ejemplo, Berger, Sambrook, Ausubel 1 y 2 e Innis, que se citan anteriormente. Diversos ensayos comerciales de amplificación de ácidos nucleicos que se adaptan opcionalmente para su uso con los modificadores de la emisión de luz y los procedimientos de la invención difieren, en general, en sus procedimientos de amplificación y sus secuencias de ácido nucleico diana. Ejemplos de estas pruebas comerciales incluyen los ensayos AMPLICOR® y COBAS AMPLICOR® (Roche Diagnostics Corporation, Indianápolis, IN, EE. UU.), que usan reacciones en cadena de la polimerasa (PCR); la prueba LCx® (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, EE. UU.), que usa reacciones en cadena de la ligasa (LCR); la prueba BDProbeTec™ ET (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, EE. UU.), que usa amplificación por desplazamiento de hebra (SDA); el ensayo NucliSens EasyQ (bioMérieux, Durham, NC), que usa amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA); y el ensayo APTIMA™ (Gen-Probe, Inc., San Diego, CA, EE. UU.), que usa amplificación mediada por transcripción (TMA). La amplificación y detección de ácidos nucleicos se describe además más adelante.
La extensión de cebadores dependiente del molde se cataliza, en general, por un nucleótido que incorpora un biocatalizador (por ejemplo, una polimerasa, etc.) en presencia de cantidades adecuadas de los cuatro trifosfatos de desoxirribonucleósidos (dATP, dGTP, dCTP y dTTP) o análogos en una mezcla de reacción que también incluye modificadores de la emisión de luz y sales apropiadas, cationes metálicos y tampones. Las mezclas de reacción se describen además anteriormente. Los nucleótidos adecuados que incorporan biocatalizadores son enzimas conocidas por catalizar el cebador y la síntesis de ADN dependiente del molde y poseen la actividad nucleasa 5 'a 3'. Ejemplos de ADN-polimerasas de este tipo incluyen ADN-polimerasa I de E. coli , ADN-polimerasa de Tth , ADNpolimerasa de Bacillus stearothermophilus, ADN-polimerasa de Taq, ADN-polimerasa de Thermus sp. Z05, ADNpolimerasa de Thermatoga maritima, ADN-polimerasa de Thermatoga neopolitana y ADN-polimerasa de Thermosipho africanus. Las condiciones de reacción para catalizar la síntesis de ADN con estas ADN-polimerasas son bien conocidas en la técnica. Típicamente, el nucleótido que incorpora el biocatalizador escinde eficientemente la sonda y libera fragmentos marcados de manera que se genera una señal detectable directa o indirectamente.
Los productos de la síntesis son, en general, moléculas dúplex que incluyen las hebras molde y las hebras de extensión del cebador. Los subproductos de esta síntesis son fragmentos de sonda, que pueden incluir una mezcla de fragmentos de mono-, dinucleótidos y mayores. Los ciclos repetidos de desnaturalización, renaturalización de sonda y cebador, y extensión del cebador y escisión de la sonda dan como resultado la acumulación exponencial de la región definida por los cebadores y la generación exponencial de fragmentos marcados. Se ejecutan ciclos suficientes para conseguir una cantidad detectable de fragmentos de sonda, que es, en general, varios órdenes de magnitud mayor que la señal de fondo. El uso de modificadores de la emisión de luz como se describe en el presente documento puede reducir eficazmente el número de ciclos ejecutados antes de que se produzca una señal detectable con respecto a ensayos que no reducen estas señales de fondo.
En ciertos modos de realización, las reacciones de PCR se llevan a cabo como un procedimiento automatizado, que utiliza una enzima termoestable. En este procedimiento, la mezcla de reacción se somete a ciclos a través de una etapa de desnaturalización, una etapa de renaturalización del cebador (y opcionalmente, la sonda) y una etapa de síntesis en la que la escisión y el desplazamiento se producen simultáneamente con la extensión del molde dependiente del cebador. En algunos modos de realización, los procedimientos descritos en el presente documento se realizan usando un sistema. Dichos sistemas se describen con mayor detalle a continuación. Opcionalmente, pueden utilizarse termocicladores, tales como los disponibles comercialmente de, por ejemplo, Applied Biosystems (Foster City, CA, EE. UU.), que están diseñados para su uso con enzimas termoestables.
Las polimerasas termoestables se usan tıpicamente en procedimientos automatizados que efectúan la desnaturalización de productos de extensión bicatenarios exponiéndolos a temperaturas elevadas (por ejemplo, aproximadamente 95 °C) durante el ciclo de PCR. Por ejemplo, la patente de EE. UU. N.º 4.889.818, titulada «PURIFIED THERMOSTABLE ENZYME», concedida el 26 de diciembre de 1989 a Gelfand et al., divulga una enzima termoestable representativa aislada de Thermus aquaticus. Polimerasas termoestables representativas adicionales incluyen, por ejemplo, polimerasas extraídas de las bacterias termoestables Thermus flavus, Thermus
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diana de hibridación en un conjunto dado de condiciones de hibridación, una temperatura a la que el 50 % de los complejos de hibridación diana están disociados, y una temperatura a la que esencialmente ninguna molécula de sonda se asocia con la diana de hibridación y esencialmente no hay complejos de hibridación presentes en las condiciones de hibridación. El sistema puede incluir además un detector para medir la señal de la reacción de fusión en el intervalo de temperaturas; y también un módulo de correlación que está operativamente acoplado al detector y recibe mediciones de las señales en el intervalo de temperaturas, en el que el módulo de correlación correlaciona la intensidad de señal con la presencia de un complejo de hibridación que comprende la sonda y la diana de hibridación en mezcla con el modificador soluble de la emisión de luz como función de la temperatura, determinando de este modo la Tm del complejo de hibridación diana. En algunos aspectos, el resto emisor de luz en la sonda es un resto donador de FRET.
La invención está también relacionada con sistemas para detectar ácidos nucleicos diana. El sistema incluye uno o más oligonucleótidos marcados y uno o más modificadores de la emisión de luz como se describe en el presente documento. En ciertos modos de realización, los oligonucleótidos están dispuestos en un soporte sólido, mientras que, en otros, se proporcionan en uno o más recipientes, por ejemplo, para ensayos realizados en solución. El sistema también incluye al menos un detector (por ejemplo, un espectrómetro, etc.) que detecta ácidos nucleicos y/o amplicones de los mismos a partir de la muestra. Además, los sistemas también incluyen opcionalmente al menos un modulador térmico (por ejemplo, un dispositivo de termociclación, etc.) conectado operativamente al recipiente o soporte sólido para modular la temperatura en el recipiente o sobre el soporte sólido, y/o al menos un componente de transferencia de fluido (por ejemplo, un pipeteador automatizado, etc.) que transfiere fluido hacia y/o desde el recipiente o soporte sólido, por ejemplo, para realizar una o más técnicas de amplificación de ácido nucleico y/o ensayos de hibridación de ácido nucleico en el recipiente o en el soporte sólido.
Los detectores están típicamente estructurados para detectar señales detectables producidas, por ejemplo, en otro componente del sistema de ensayo dado o proximales a él (por ejemplo, en un recipiente, sobre un soporte sólido, etc.). Detectores de señal adecuados que se utilizan opcionalmente, o adaptados para uso, en el presente documento, detectan, por ejemplo, fluorescencia, fosforescencia, radioactividad, absorbancia, índice de refracción, luminiscencia, masa o similares. Los detectores controlan opcionalmente una o una pluralidad de señales en dirección 5' y/o en dirección 3' de la realización de, por ejemplo, una etapa de ensayo dada. Por ejemplo, los detectores controlan opcionalmente una pluralidad de señales ópticas, que corresponden en posición a resultados «en tiempo real». Ejemplos de detectores o sensores incluyen tubos fotomultiplicadores, matrices CCD, sensores ópticos, sensores de temperatura, sensores de presión, sensores de pH, sensores de conductividad, detectores de dispersión o similares. Ejemplos de detectores más especıficos que se utilizan opcionalmente para llevar a cabo los procedimientos de la invención incluyen, por ejemplo, detectores de dispersión de luz por resonancia, espectroscopios de emisión, espectroscopios de fluorescencia, espectroscopios de fosforescencia, espectroscopios de luminiscencia, espectrofotómetros, fotómetros y similares. También se describen detectores, por ejemplo, en Skoog et al, Principles of Instrumental Analysis, 5.ª edición, Harcourt Brace College Publishers (1998) y Currell, Analytical Instrumentation: Performance Characteristics and Quality, John Wiley & Sons, Inc. (2000).
Los sistemas descritos también incluyen típicamente controladores que están conectados operativamente a uno o más componentes (por ejemplo, detectores, moduladores térmicos, componentes de transferencia de fluido, etc.) del sistema para controlar el funcionamiento de los componentes. Más específicamente, los controladores se incluyen, en general, como componentes separados o integrales del sistema que se utilizan, por ejemplo, para recibir datos de detectores, para efectuar y/o regular la temperatura en los recipientes, para efectuar y/o regular el flujo de fluido hacia o desde recipientes seleccionados, o similar. Los controladores y/u otros componentes del sistema están opcionalmente acoplados a un procesador, ordenador, dispositivo digital u otro dispositivo de información programados apropiadamente (por ejemplo, incluyendo un convertidor de analógico a digital o de digital a analógico según sea necesario), que funciona para ordenar el funcionamiento de estos instrumentos de acuerdo con instrucciones preprogramadas o introducidas por el usuario, recibir datos e información de estos instrumentos, e interpretar, manipular y notificar esta información al usuario. Los controladores adecuados son, en general, conocidos en la técnica y están disponibles de diversas fuentes comerciales.
Cualquier controlador u ordenador incluye opcionalmente un monitor, que es a menudo una pantalla de tubo de rayos catódicos («CRT»), una pantalla plana (por ejemplo, pantalla de cristal líquido de matriz activa, pantalla de cristal líquido, etc.) u otros. Los circuitos del ordenador a menudo se colocan en una caja, que incluye numerosos chips de circuitos integrados, tales como un microprocesador, memoria, circuitos de interfaz y otros. La caja también incluye opcionalmente una unidad de disco duro, una unidad de disquete, una unidad extraíble de alta capacidad, como un CD-ROM grabable, y otros elementos periféricos comunes. Dispositivos de entrada, tales como un teclado
o un ratón, permiten opcionalmente la entrada de datos por un usuario. Estos componentes se ilustran además a continuación.
El ordenador incluye típicamente un programa informático apropiado para recibir instrucciones del usuario, ya sea en forma de datos introducidos por un usuario en un conjunto de campos de parámetros, por ejemplo, en una GUI, o en forma de instrucciones preprogramadas, por ejemplo, preprogramadas para una variedad de operaciones específicas diferentes. A continuación, el programa informático convierte estas instrucciones en un lenguaje apropiado para ordenar el funcionamiento de uno o más controladores para llevar a cabo la operación deseada. El
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