ES2629285T3 - Células madre embrionarias haploides de mamífero - Google Patents

Abstract

Una célula madre embrionaria haploide de mamífero, en donde la célula madre es pluripotente, capaz de proliferar y capaz de mantener un cariotipo haploide durante la proliferación en cultivo durante al menos 15 pases.

Description

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DESCRIPCION

Celulas madre embrionarias haploides de mamlfero Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a una celula madre embrionaria haploide de mamlfero y a metodos para la produccion de la celula madre embrionaria haploide de mamlfero. En un aspecto adicional, la invencion tambien se refiere a un cultivo celular que comprende la celula madre embrionaria haploide de mamlfero y una llnea de celulas madre que puede obtenerse mediante la proliferacion de la celula madre. En un aspecto adicional, la invencion se refiere al uso de las celulas madre embrionarias haploides en cribado genetico.

Antecedentes de la invencion

El cribado genetico es una herramienta importante para identificar nuevos genes o alelos mutantes de genes conocidos que sustentan procesos biologicos. Cada vez con mayor frecuencia, se han usado celulas madre, en particular celulas madre embrionarias, en estas exploraciones. Las celulas madre se caracterizan por dos propiedades importantes que son valiosas en el cribado genetico. En primer lugar, tienen la capacidad de proliferar en un estado no diferenciado durante perlodos de tiempo prolongados. En segundo lugar, las celulas madre son pluripotentes. Esto significa que son capaces de diferenciarse en cualquier celula del mesodermo, ectodermo o endodermo. Por consiguiente, las celulas pluripotentes pueden desarrollarse en cualquier tipo de celula del cuerpo.

Sin embargo, en la actualidad es muy diflcil explorar respecto de mutaciones recesivas en celulas de mamlfero. El motivo principal es que las celulas de mamlfero son diploides, lo que significa que cada celula tiene dos copias de cada gen. Como consecuencia, los rasgos fenotlpicos de las mutaciones recesivas heterocigoticas estan enmascarados por la segunda copia del gen.

Una solucion para explorar respecto de mutaciones recesivas es usar una celula madre embrionaria de mamlfero haploide. Las celulas madre haploides son celulas madre que, a diferencia de las celulas madre diploides, poseen solamente una copia de cada gen. Como consecuencia, los rasgos fenotlpicos de las mutaciones recesivas estan esencialmente desenmascarados y, como consecuencia, pueden identificarse y estudiarse facilmente los genes subyacentes.

Se han obtenido celulas madre embrionarias haploides de peces como se describe en Yi y Hong (2009). En este artlculo, los autores desarrollaron llneas de celulas madre embrionarias haploides a partir del pez medaka (Oryzias latipes).

Sin embargo, de manera destacable, en la actualidad ninguna de estas celulas se ha obtenido de mamlfero y no pueden usarse celulas madre embrionarias haploides de peces como sustituto. A diferencia de los mamlferos placentarios, los peces son animales ovlparos y no tienen placentacion. Como consecuencia, el desarrollo embrionario difiere sustancialmente de peces a mamlferos. Ademas, ciertas caracterlsticas clave, tales como la determinacion del sexo y la compensacion de la dosis tambien estan reguladas de una manera distinta y la implantacion, la placentacion y la impronta genetica estan ausentes en el pez Medaka.

Carette et al., (2009) han descrito el uso de una llnea celular tumoral casi haploide para cribado genetico. En este artlculo, se uso mutagenesis insercional para generar alelos nulos en una llnea celular humana haploide para todos los cromosomas excepto el cromosoma 8. Por lo tanto, la llnea celular descrita en este artlculo no era un autentico haploide. Ademas, debido a que la llnea celular portaba reorganizaciones geneticas y un fenotipo transformado, su utilidad para cribado genetico en sistemas de desarrollo es limitada.

Varios estudios tambien encontraron celulas casi haploides en diversos tumores humanos. Sin embargo, excepto en un caso, no se han obtenido llneas celulares casi haploides a partir de estos tumores (Sukov et al., 2010).

Finalmente, Kaufman et al. (1983) describen la produccion de llneas celulares pluripotentes a partir de embriones haploides de ovocitos activados partenogeneticamente. Sin embargo, las llneas celulares eran diploides en lugar de haploides ya en los primeros pases de las celulas.

Por consiguiente, existe la necesidad de producir celulas madre embrionarias haploides de mamlfero. Dichas celulas permitirlan el cribado genetico respecto de mutaciones recesivas en un contexto relevante desde el punto de vista del desarrollo. Por ejemplo, se preve que dichas celulas puedan ser una herramienta importante para identificar nuevos genes implicados en las vlas de senalizacion, las decisiones relacionadas con el desarrollo y la regulation del ciclo celular. Ademas, existe la necesidad de producir celulas madre haploides sin mutaciones procedentes de tumores, reorganizaciones geneticas u oncogenes. Se obtienen celulas madre con dichas caracterlsticas cuando las celulas proceden de celulas tumorales. Por consiguiente, existe la necesidad de desarrollar celulas madre embrionarias de mamlfero con un cariotipo normal.

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Sumario de la invencion

De acuerdo con un primer aspecto de la presente invencion, se proporciona una celula embrionaria haploide de mamlfero, en donde la celula madre es pluripotente, capaz de proliferar y puede mantener un cariotipo haploide durante la proliferacion en cultivo. Despues de que se hayan establecido las celulas ES haploides, pueden mantenerse en una amplia gama de condiciones. Las celulas ES haploides pueden cultivarse en condiciones de medio celular ES convencionales que incluyen normalmente LIF y suero de fetal de ternero o reemplazo de suero Knock-out (Invitrogen; 10828028) o medios qulmicamente definidos usando inhibidores de 2i.

En determinadas realizaciones, las celulas ES haploides parecen tener un tamano menor que las celulas ES diploides.

En un aspecto preferido, la celula madre puede mantener un cariotipo haploide durante al menos 15, preferentemente 20 y, mas preferentemente, al menos 25 pases de la celula madre. Un pase es el grado de subcultivo de una celula.

Un aspecto adicional de la invencion proporciona un metodo para la produccion de una celula madre embrionaria de mamlfero, en el que el metodo comprende las siguientes etapas:

- activar ovocitos aislados in vitro para producir embriones haploides;

- cultivar los embriones activados hasta el estado de 8 celulas, morula o blastocisto;

- retirar la zona pelucida;

- aislar la masa celular interna de los embriones activados; y

- ademas cultivar la masa celular interna para obtener una celula madre embrionaria haploide.

El metodo puede comprender ademas la etapa de clasificacion por flujo basandose en el contenido de ADN, para aislar celulas ES haploides.

La activacion in vitro puede comprender incubacion en medio M16, cloruro de estroncio y EGTA. En una realization preferida adicional, el tiempo de incubacion es de no mas de 5 horas, preferentemente de 1 a 3 horas. El medio M16 puede obtenerse de Sigma; n.° de Cat. M7292. Otros medios potenciales para la activacion de ovocitos incluyen la activacion con un pulso electrico y mediante el uso de ionoforos de calcio tales como ionomicina.

En un aspecto adicional, el embrion activado cultivado se cultiva preferentemente con inhibidores de cinasa. Los inhibidores de cinasa pueden seleccionarse entre inhibidores de treonina/tirosina cinasa y/o inhibidores de glucogeno sintasa cinasa 3p. En una realizacion preferida, los inhibidores de cinasa son PD0325901 y CHIR99021 (CHIR99021 de Stemgent n.° de Catalogo 04-0004; PD0325901 de Stemgent n.° de Catalogo 04-0006). El cultivo incluira normalmente celulas de alimentation de fibroblastos.

Otros metodos de cultivo pueden incluir:

a) medio DMEM alto en glucosa (PAA, n.° de Cat. E15-009) o Knockout™ D-MEM (Invitrogen, n.° de Catalogo 10829018) con reemplazo de suero KnockOut™ al 15 % (Invitrogen, n.° de catalogo 10828028) complementado con Glutamina (Invitrogen), beta mercaptoetanol (Sigma), penicilina-estreptomicina (Invitrogen), aminoacidos no esenciales (Invitrogen) y 500 unidades por mililitro de LIF de raton recombinante (elaborado en el propio laboratorio).

b) Es posible que tambien sean eficaces condiciones como las de a) pero con suero de ternero fetal al 15 % (PAA) en lugar de reemplazo de suero KnockOut™ al 15 %.

Otros metodos de cultivo potenciales que pueden ser adecuados incluyen:

c) medio aserico con BMP y LIF (disponible comercialmente en Millipore, Medio de Grado Clonal ESGRO Complete PLUS, Millipore n.° de Catalogo SF001-500P)

d) medios iSTEM (Stem Cells, Inc, n.° de Catalogo SCS-SF-ES-01), esta es una formulation comercial del medio 2i, pero no contiene LIF.

e) Una combination de condiciones de cultivo de 2i y Reemplazo de Suero KnockOut™ (Invitrogen) tal como la usada en Hanna et al, 2010, PNAS, 107 (20): 9222-9227.

La zona pelucida se retira preferentemente usando solution de Tyrode acida (Millipore; MR-004-D). Los ovocitos se incuban en solucion de Tyrode Acida hasta que se disuelve la zona pelucida. Esto normalmente tarda de 30 segundos hasta un minuto.

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En un aspecto adicional, la capa trofectodermica del blastocisto se retira preferentemente usando anticuerpos especlficos (inmunocirugla) antes del aislamiento de la masa celular interna. Por ejemplo, despues de retirar la zona, los embriones se incuban con anticuerpo de suero anti-raton producido en conejo (Sigma, M5774). Despues de lavar la capa trofectodermica, esta se lisa usando complemento (suero de rata, elaborado en el laboratorio o comercial tal como complemento de suero de cobaya, Sigma S1639). La inmunocirugla no es necesaria cuando las celulas ES se obtienen usando condiciones de 2i. El procedimiento se describe en Manipulating the Mouse Embryo, A LABORATORY MANUAL, Segunda Edicion, Hogan, B. et al., 1994, Cold Spring Harbour Laboratory Press, ISBN 087969-384-3).

Las celulas de la masa celular interna pueden cultivarse usando alimentadores de fibroblastos en medio aserico, citocinas e inhibidores de cinasa o usando medio alto en glucosa complementado con suero o un reemplazo de suero y citocinas. En un aspecto mas preferido, el medio aserico es medio N2B27. La citocina es preferentemente LIF (Factor Inhibidor de Leucemia). En otra realizacion, el medio alto en glucosa es DMEM y el reemplazo de suero es Reemplazo de Suero KnockOut™ (KSR).

El crecimiento celular puede controlarse mediante microscopla y los agrupamientos de celulas se disocian usando tripsina (al 0,25 %, Invitrogen; 15090046) o Accutase (Invitrogen; A110501). La masa celular interna regenerada y las celulas madre embrionarias crecen con una morfologla de colonia. Se obtienen celulas madre embrionarias haploides cuando se obtienen muchas colonias en la placa de cultivo que crecen rapidamente. Las celulas se someten a pases cada 3 a 4 dlas, o cada 2 a 3 dlas cuando se acelera el crecimiento. Los presentes inventores consideran que ya estan presentes celulas ES haploides en el primer pase, pero se necesitan aproximadamente de 4 a 5 pases para expandir las celulas ES haploides de una sola ICM a una placa de tamano de 6 pocillos confluente con aproximadamente 3x106 celulas.

El cultivo puede enriquecerse adicionalmente con celulas madre haploides usando clasificacion celular. Preferentemente, se tinen celulas vivas. Puede usarse cualquier tipo de tinte para ADN celular. Preferentemente, el tinte puede ser un tinte fluorescente tal como un tinte Hoechst (Hoechst 33342 a una concentracion de 1 microgramo por mililitro). Las celulas haploides pueden clasificarse usando un clasificador celular, preferentemente un clasificador celular activado por fluorescencia. Otros posibles tintes para ADN incluyen los tintes VYBRANT®, DYECYCLE™ STAINS para celulas vivas (Invitrogen, Molecular probes), DRAQ5® (4084, Cell Signalling Technology) y Tinte para ADN Nuclear-ID™ Red (ENZ-52406, ENZO LIFE SCIENCES INTERNATIONAL, INC.). Otros metodos de enriquecimiento pueden incluir la separacion por tamano celular tal como elutriacion o subclonacion a partir de celulas individuales.

Un aspecto adicional de la invencion proporciona un cultivo celular que comprende las celulas madre embrionarias haploides de mamlfero. Las condiciones de cultivo para mantener las celulas ES haploides incluyen todas las condiciones para la obtencion (anteriores). El cultivo en DMEM con suero al 15 % y LIF tambien ha sido exitoso para mantener celulas ES haploides.

Un aspecto adicional de la invencion proporciona una llnea de celulas madre embrionarias haploides de mamlfero obtenida mediante proliferacion de la celula madre embrionaria de mamlfero. La llnea de celulas madre embrionarias de mamlfero es pluripotente, capaz de proliferar y tiene un cariotipo haploide estable durante la proliferacion.

Otro aspecto de la invencion proporciona el uso de la llnea de celulas madre embrionarias de mamlfero en cribado genetico. En una realizacion preferida, el cribado genetico es una cribado genetico directa. Los presentes inventores han llevado a cabo con exito una cribado genetico directa en las celulas ES haploides del modo siguiente. Se expone un grupo de celulas ES haploides a un mutageno, tal como un vector insercional. Las celulas que contienen mutaciones pueden seleccionarse, por ejemplo, usando un marcador de seleccion del mutageno insercional. El grupo de celulas haploides mutantes puede en este caso opcionalmente hacerse diploide ya que las mutaciones se encontraran configuracion homocigota. La seleccion de mutaciones deseadas puede lograrse mediante condiciones metabolicas adecuadas, genes indicadores combinados con clasificacion celular o mediante caracterlsticas fenotlpicas que incluyen la adhesion celular y los marcadores de la superficie celular. Los presentes inventores han llevado a cabo un cribado piloto como experimento de prueba de principio para genes implicados en la via de reparacion de desemparejamientos. En este cribado, se uso un vector derivado del transposon Piggybac como mutageno insercional. La seleccion respecto de celulas con mutaciones en genes necesarios para la reparacion de desemparejamientos se logro usando 2-amino-6-mercaptopurina (Sigma, 6-TG), una sustancia que es toxica para las celulas capaces de reparar desemparejamientos. Las mutaciones genicas se identificaron mediante una estrategia de PCR Splinkerette. Este cribado identifico los dos genes de reparacion de desemparejamiento autosomicos conocidos Msh2 y Fanci (vease mas adelante) y demuestra la aplicacion del principio de celulas ES de raton haploides para cribado genetico.

Otros mutagenos potenciales incluyen: a) vectores Genetrap tales como virus atenuados; b) mutagenos qulmicos; y c) metodos flsicos para mutagenesis tales como irradiacion ionizante.

Otros metodos potenciales para identificar mutaciones incluyen: a) actividad del gen indicador combinada con clasificacion celular; b) actividad de gen indicador combinada con resistencia a antibioticos; c) moleculas de la

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superficie celular combinadas con metodos adecuados para aislamiento celular tales como basados en anticuerpos; d) condiciones metabolicas; e) exposicion a agentes biologicos tales como patogenos, por ejemplo, para identificar factores de celulas hospedadoras o receptores para virus.

Otros metodos potenciales para la identificacion genica incluyen: a) race 5 prima para la identificacion de genes atrapados; b) elaboracion de perfiles de expresion de todo el genoma; c) secuenciacion de ADN; d) cribado dirigido para mutaciones en genes especlficos o conjuntos de genes tales como mediante secuenciacion de ADN o PCR.

Una ventaja del uso de celulas ES de raton es la disponibilidad de un gran numero de modificaciones geneticas que se han introducido en el genoma de raton y que pueden generarse mutaciones especlficas facilmente. Por lo tanto, puede utilizarse la modification genetica de llneas de celulas ES haploides o la obtencion de celulas ES haploides a partir de cepas de raton modificadas geneticamente para permitir exploraciones complejas o realizar exploraciones mas especlficas. Los usos potenciales son (1) la incorporation de mutaciones sensibilizantes para encontrar combinaciones letales sinteticas de genes para descubrir vlas paralelas o redundantes y (2) la introduction de marcadores de selection adecuados tales como genes indicadores para la actividad de una via que permiten o soportan el aislamiento de las mutaciones deseadas.

Otros usos potenciales para celulas ES haploides incluyen:

a) las celulas ES haploides pueden introducirse en ratones. Una manera de hacer esto es diploidizarlas en cultivo para obtener celulas ES diploides partenogeneticas. Estas pueden introducirse mediante inyeccion de blastocistos, agregacion de morulas o inyeccion de 8 celulas en ratones quimericos. Se ha comunicado la transmision de llnea germinal de celulas ES de raton partenogeneticas y presenta una ruta para introducir mutaciones identificadas en un cribado en ratones para su estudio posterior.

b) Las celulas ES haploides pueden usarse para fusion celular. Dos celulas haploides diferentes pueden combinarse para dar una celula diploide. De manera similar, las celulas triploides son el resultado de la fusion de una celula ES haploide con una celula diploide. Los posibles companeros para la fusion con celulas ES haploides son otras celulas ES haploides, por ejemplo, para combinar dos modificaciones geneticas. Esto podrla ser util para ensayar interacciones geneticas. Otras aplicaciones potenciales podrlan ser la fusion de celulas haploides naturales, tales como los gametos, con celulas ES haploides para obtener celulas diploides.

c) Las celulas ES haploides pueden usarse para obtener celulas diferenciadas. Las celulas ES haploides pueden diferenciarse, pero durante el transcurso de la diferenciacion, la mayorla de ellas se vuelven diploides.

En un aspecto preferido, el mamlfero es un roedor, preferentemente un raton (Mus musculus). En un aspecto mas preferido, la cepa del raton es CBA/B6. Sin embargo, pueden usarse varias cepas diferentes de raton. Esto permitirla introducir diferentes modificaciones geneticas, tales como genes marcadores de seleccion.

Otras posibles cepas de raton incluyen:

a) cepas de raton endogamicas tales como 129Sv o C57/BL6

b) cepas de raton exogamicas - los presentes inventores han obtenido con exito celulas ES haploides a partir de un origen mixto que contiene una modificacion genetica del locus genico Xist (Xist2LOX).

c) cepas de raton modificadas geneticamente tales como cepas que portan eliminaciones genicas o transgenes. Especialmente, pueden usarse para el cribado cepas de raton que contienen genes indicadores (incluyendo resistencia a antibioticos o GFP), tales como cepas indicadoras de GFP dirigidas por el promotor de Oct4 o Rex1. Ademas, pueden introducirse indicadores para vlas de serialization celular procedentes de la cepa de raton, tales como un indicador TOPflash para la actividad de la via de senalizacion Wnt. Ademas, pueden introducirse mutaciones para sensibilizar el origen genetico obteniendo celulas ES haploides de ratones que portan eliminaciones genicas. Un aspecto importante de las celulas ES de raton haploides es la capacidad de aprovechar un gran numero de mutaciones de raton preexistentes que podrlan utilizarse para explorar respecto de componentes especlficos en la senalizacion de mamlferos, el ciclo celular y vlas metabolicas.

Se han descrito celulas ES con propiedades similares a las celulas ES de raton procedentes de ratas y conejos (Telugu et al., 2010, The International Journal of Developmental Biology 54: 1703-1711). El metodo de la presente invention podrla aplicarse a estos mamlferos.

Breve descripcion de los dibujos

La presente invencion se describira a continuation, a modo de ejemplo unicamente, con referencia a las figuras adjuntas en las que:

La Figura 1 muestra una estrategia para la obtencion de celulas madre embrionarias haploides de mamlfero.

La Figura 2 muestra la caracterizacion de una llnea de celulas madre embrionarias de raton haploides (ES). La

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Figura 2a muestra tres figuras representativas de divisiones en metafase de una ilnea celular ES de raton haploide que muestra un conjunto hapioide de 20 cromosomas. El ADN se tino con DAPI. La Figura 2b muestra un analisis FACS de celulas ES fijadas despues de la tincion de ADN con yoduro de propidio. Se indica la posicion del contenido de ADN haploide (1 n), diploide (2n) y tetraploide (4n). La llnea haploide (panel superior) muestra un contenido predominantemente de ADN 1n con algunas celulas en G2 despues de la replicacion de ADN, mostradas como 2n. La contaminacion con celulas diploides es baja a juzgar por el pico de 4n correspondiente a las celulas en G2. Una llnea celular ES de control diploide (panel inferior) muestra un pico de G1 2n y un pico de G2 4n.

La Figura 3 muestra la tincion de inmunofluorescencia de celulas ES haploides y diploides de control para detectar Nanog, un marcador de celulas ES pluripotentes, y Gata4, un marcador de las primeras fases de diferenciacion de ES. Las colonias de celulas ES tanto haploides como diploides de control expresan el marcador de pluripotencia Nanog, pero no expresan marcadores que sean indicativos de diferenciacion.

La Figura 4 muestra perfiles de flujo anallticos despues de la tincion de ADN con PI para celulas madre embrionarias de control diploides derivadas de 129Sv, la llnea celular ES H129-1 haploide en el pase 6 y esta misma llnea celular en el pase 12 despues de dos rondas de clasificacion del pico 1n.

La Figura 5 muestra la obtencion de ESC haploides. Analisis de flujo de ADN despues de la tincion con PI de (a) ESC de control diploides, (b) llnea ESC haploide HAP-1 en el pase 7 (p7) y (c) HAP-1 (p11) despues de la clasificacion en p7. (d) Morfologla de colonia de ESC haploides (HAP-1). (ef) Dispersiones de cromosomas de HAP-3 (e) y HAP-1 (f), (Barra de escala = 10 pm). (g) Analisis CGH de ESC HAP-1 y HAP-2 y ADN de rinon de CBA macho de control. El numero de copias relativo se representa a una resolucion de 200 kb usando una escala log2. Las posiciones genomicas indicadas por barras azules (parte superior) estan ampliadas a una resolucion de 40 kb en (h); control de CBA (en negro), HAP-1 (en rojo) y HAP-2 (en verde).

La Figura 6 muestra el analisis de expresion de ESC haploides. (a) La inmunofluorescencia muestra protelna Nanog (en rojo) en ESC haploides (HAP-1) y diploides, y Gata4 (en verde) en celulas diferenciadas (Barra de escala = 10 pm). (b) Expresion de marcadores de pluripotencia en ESC haploides y diploides (ajustado a 1) mediante PCR en tiempo real. Las barras de error representan la desviacion tlpica (n = 3). (c) Grafica de dispersion que muestra valores de expresion media transformados en log2 procedentes de perfiles de expresion genica de 3 llneas ESC haploides (HAP-1, HAP-2 y HTG-1) y tres llneas ESC J1 diploides para 45.001 conjuntos de sonda (r es el coeficiente de correlacion de Pearson; las llneas en rojo indican la regulacion positiva y negativa doble). (d) Diagrama de genes regulados positiva y negativamente mas de 2 veces en ESC haploides.

La Figura 7 muestra el potencial de desarrollo de ESC haploides. (a) Las ESC HAP-2 haploides marcadas con GFP (p18) contribuyen a embriones quimericos en E12.5. Seis de los 9 embriones mostraron contribucion de GFP. Se muestra un embrion negativo a GFP como control (parte inferior). (b) Se muestran analisis de flujo representativos del contenido de ADN de todas las celulas (parte superior) y de celulas positivas a GFP (parte inferior) extraldas de un embrion E12.5 quimerico. Los 6 embriones proporcionaron resultados similares. (c) Se obtuvieron ratones quimericos nacidos vivos de ESC HAP-2 marcadas con GFP. (d) Los ratones quimericos obtenidos a partir de la inyeccion de ESC HAP-1 en blastocistos de C57BL/6 (en negro) muestran contribucion al color del pelo de las ESC (agouti).

Descripcion detallada de la invencion

Ejemplo 1

Activacion de ovocitos

Por la manana, se aislaron ovocitos de oviductos de raton despues de la induccion hormonal de la ovulacion. La ovulacion se indujo mediante inyeccion intraperitoneal de PMS y hCG 48 horas despues (este procedimiento de superovulacion se describe en Manipulating the mouse embryo, ISBN 0-87969-384-3). Otro metodo posible para obtener ovocitos no fertilizados podrla ser mediante emparejamientos naturales con machos vasectomizados.

La activacion de ovocitos se llevo a cabo mediante incubacion en medio M16 al que se le anadieron SrCl2 5 mM (milimolar) y EGTA 2 mM. Se observo que eran eficaces tiempos de incubacion de 1 a 3 horas. Una incubacion mas corta daba lugar a menores tasas de activacion, mientras que una incubacion de 5 horas parecla afectar al desarrollo posterior. Despues de la activacion, se cultivaron los ovocitos en grupos de 50 usando cultivo en microgotas. Para esto, se recubrieron gotas de 80 microlitros de medio M16 con aceite mineral. Todos los medios de cultivo se preequilibraron y la incubacion se realizo a 37 °C, con 5% de CO2 en una incubadora de cultivo tisular (SANYO). Se obtuvieron embriones en estadio de blastocisto del dla 3 al 4 y se usaron para la obtencion de celulas ES.

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La activacion de ovocitos ovulados recientemente in vitro esta mediada por la induccion de ondas de Calcio (Ca). Esto puede lograrse mediante el cultivo prolongado en medio sin Ca. Se ha usado la adicion de estroncio (Sr) para aumentar las tasas de activacion y potenciar el desarrollo de embriones partenogeneticos diploides (Bianchi et al., 2010). La formation de complejos de Ca con EGTA ha hecho posible usar medios preformulados en combination con Sr para una eficiente activacion de los ovocitos de raton (Kishigami y Wakayama, 2007). Se han establecido protocolos similares basados en la permeabilizacion de la membrana del ovocito para Ca mediante tratamiento con ionomicina. Estos protocolos son mas relevantes para otras especies de mamlferos, incluyendo seres humanos, donde el Sr no da lugar a una eficiente activacion de los ovocitos.

Obtencion de celulas ES en medio definido quimicamente

Para la obtencion de celulas ES en medio definido quimicamente, se cultivaron embriones en estadio de 8 celulas durante dos dlas en M16 complementado con los siguientes inhibidores: PD0325901 1 pM y CHIR99021 3 pM (M16- 2i). 2i es una composition que potencia la eficacia de la obtencion de la llnea celular ES y, por lo tanto, reduce el numero de embriones necesarios (vease, por ejemplo, Nature. 22 de mayo de 2008; 453(7194): 519-23. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Ying QL, Wray J, Nichols J, Batlle-Morera L, Doble B, Woodgett J, Cohen P, Smith A).

Esta etapa expandio la masa celular interna del blastocisto. Despues, se retiro la zona pelucida con solution de Tyrode acida (Hogan et al., 1994). Opcionalmente, se retiro el trofectodermo mediante inmunocirugla. Las masas celulares internas aisladas o los embriones se cultivaron posteriormente sobre alimentadores de fibroblastos embrionarios mitoticamente inactivos en medio N2B27 quimicamente definido que contenia los inhibidores 2i anteriores y LIF (N2B27-2i mas LIF). LIF es una citocina que inhibe la diferenciacion de celulas madre embrionarias y estimula el crecimiento de celulas madre. Los recrecimientos se sometieron a pases repetidas veces cada 3 a 4 dias hasta que aparecieron lineas celulares ES. En 2i, las lineas celulares ES aparecieron despues del primer pase.

El cultivo de celulas ES en medio definido con inhibition de senales (Ying et al., 2008) puede usarse para obtener celulas ES a partir de cepas de raton recalcitrantes (Nichols et al., 2009) y ratas (Buehr et al., 2008). Recientemente, estrategias similares han dado lugar a un cultivo de un estado de celula madre embrionaria a partir de seres humanos que tiene propiedades similares a las celulas ES de raton (Hanna et al., 2010).

Obtencion de celulas ES en condiciones estandar

Para la obtencion de celulas ES, se retiro la zona pelucida de embriones en estadio de morula y blastocisto con solucion de Tyrode acida (Hogan et al., 1994). Despues de la retirar el trofectodermo mediante inmunocirugia (Hogan et al., 1994), se explanto la masa celular interna y se cultivo en DMEM alto en glucosa complementado con suero bovino fetal o reemplazo de suero (KSR) y LIF. Los recrecimientos se sometieron a pases cada 3-4 dias hasta que se obtuvieron lineas celulares ES.

Enriquecimiento en celulas con contenido 1n usando clasificacion celular

Se clasificaron celulas vivas tenidas con HOECHST 33342 usando un clasificador de alta velocidad DAKO MoFlo. Se seleccionaron las celulas con un contenido de ADN haploide (1n). Se usaron lineas celulares diploides (2n) como controles. Para el analisis, se uso el Programa Informatico de Analisis de Citometria de Flujo FlowJo (Tree Star Inc.).

Ademas, las lineas celulares ES pueden subclonarse.

Caracterizacion de lineas celulares ES haploides

El contenido de ADN se investigo mediante FACS analitica (clasificacion celular activada por fluorescencia). Los cariotipos se identificaron mediante dispersiones de cromosomas en metafase. Las lineas celulares ES haploides muestran una morfologia de colonia caracteristica y una velocidad de crecimiento comparable a las celulas ES de raton diploides. Ademas, estas celulas expresan marcadores de celulas ES de raton (Figura 3).

Cribado genetico directa para identificar genes implicados en la reparacion de desemparejamientos

Este cribado de prueba de principio se diseno de acuerdo con un cribado efectuado previamente (Genome Res. abril de 2009; 19(4): 667-73. Epub 20 de febrero de 2009. A piggyBac transposon-based genome-wide library of insertionally mutated Blm-deficient murine ES cells. Wang W, Bradley A, Huang Y).

Se cotransfectaron 5 x 106 celulas ES haploides con un casete de trampa genica incluido en un vector PiggyBac y un vector que portaba el gen de la transposasa de PiggyBac. La integration del casete de trampa genica en un locus transcrito proporciona un casete de resistencia a puromicina bajo el control del promotor endogeno. Esto permite la selection respecto de la integracion exitosa de los casetes de trampa genica en el genoma usando puromicina (Sigma; P8833) a una concentration de 2 microgramos por mililitro. El grupo de celulas ES haploides resistentes a la puromicina se uso para exploraciones posteriores. Se sembraron las celulas a una densidad de 1,5 x 106 por placa

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de 15 cm y la seleccion respecto de mutaciones en los genes MMR se llevo a cabo usando 2-amino-6- mercaptopurina 2 pM (Sigma, 6-TG). La seleccion se inicio 24 horas despues de la siembra y continuo durante 8 dlas. Se recogieron las colonias y se expandieron antes de su analisis. Las integraciones de PiggyBac se mapearon mediante PCR Splinkerette. (Mikkers, H., et al (2002) High-throughput retroviral tagging to identify components of specific signaling pathways in cancer. Nat. Genet. 32: 153-159). Los resultados se muestran en la tabla 2.

Conclusion

Los resultados anteriores describen la produccion exitosa de una celula madre embrionaria haploide de raton. Como se ha analizado anteriormente, hasta la fecha no ha habido una descripcion anterior de una celula y una llnea celular haploide de mamlfero. De hecho, anteriormente se crela que era imposible obtener estas celulas. Ademas, los metodos anteriormente descritos permiten obtener celulas madre embrionarias haploides a partir de ovocitos no fertilizados. Como consecuencia, dichas celulas no contienen mutaciones derivadas de tumores, reordenaciones genomicas u oncogenes. Por lo tanto, los presentes inventores describen un medio para obtener celulas madre embrionarias con un cariotipo haploide normal. Las celulas ES haploides proporcionan una plataforma para el cribado genetico directa altamente eficaz en celulas de mamlfero. Ademas, los presentes inventores consideran que las celulas ES haploides se mantienen con mayor pureza si se clasifican cada pocos pases. Las celulas ES haploides tambien tienen tendencia a diploidizarse, lo que podrla permitir la generacion de modelos de desarrollo.

Tabla 1 - Obtencion de ifneas celulares ES de raton haploides

protocolo de obtencion

fondo genetico Ovocitos activados N.° de blastocistos llneas celulares ES obtenidas llneas celulares ES con contribucion haploide maxima contribucion haploide (%)

2i /

CBA/B6 132 30 27 6 40

inmunocirugla 2i

CBA/B6 22 10 5 1 15

2i

mixto 50 32 3 3 60

KSR /

CBA/B6 273 48 22 6 10

inmunocirugla

Tabla 2 - Cribado genetico directa en celulas ES haploides para identificar genes implicados en la reparacion de

desemparejamientos genes identificados

llnea celular

g e nes MMR conocidos

1

Msh2

2

Fanci

3

Msh2 nuevos candidatos a MMR o falsos positivos

4

Zfp462, Lypdl, nlgnl, Slc44a3

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Acbd6, Lypdl, nlgnl

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Usp14, Atl 1, 7SK

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Wdr40a, Sorbs2

Ejemplo 2

Obtencion de celulas madre embrionarias haploides a partir de la cepa de raton endogamica 129Sv

Se recogieron 140 ovocitos de ratones hembra 129Sv superovuladas y se activaron usando cloruro de estroncio y EGTA en medio M16 durante 2 horas. Los embriones se cultivaron en medio M16 hasta el estadio de blastocisto. Se obtuvieron 13 blastocistos, se retiro la zona pelucida y se cultivaron las masas celulares internas en medio 2i en presencia de LIF y BSA. A partir de un total de 10 llneas de celulas madre embrionarias obtenidas, 3 mostraron un contenido sustancial de celulas con un genoma haploide equivalente. El contenido celular haploide se estimo entre un 40 % y un 60 %. La clasificacion del pico 1n haploide permitio el establecimiento de cultivos de celulas madre embrionarias de raton 129Sv haploides puras. La Figura 4 muestra los perfiles de flujo anallticos despues de la tincion de ADN con PI para celulas madre embrionarias de control diploides derivadas de 129Sv y la llnea celular ES H129-1 haploide en el pase 6 y en el pase 12 despues de dos rondas de clasificacion del pico 1n.

Ejemplo 3

La mayorla de los animales son diploides, pero se han descrito especies unicamente haploides y especies macho- haplo 1. Los genomas diploides de organismos complejos limitan las estrategias geneticas en especies que son modelos biomedicos tales como los ratones. Para superar este problema, se ha usado la induccion experimental de la haploidla en peces 2,3 Por el contrario, la haploidla parece ser menos compatible con el desarrollo en los

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mamlferos 4,5 En el presente caso, los presentes inventores describen celulas madre embrionarias de raton haploides y muestran su aplicacion en el cribado genetico directa.

El desarrollo haploide inducido experimentalmente en peces cebra se ha utilizado para cribado genetico 2 Recientemente, tambien se han establecido llneas celulares pluripotentes haploides a partir del pez medaka 3 A diferencia de los peces, la haploidla no es compatible con el desarrollo en mamlferos. Aunque se han observado celulas haploides en embriones de raton partenogeneticos en estadio de cilindro del huevo 6, la mayorla de las celulas en los embriones supervivientes se vuelven diploides. Los intentos anteriores para establecer llneas de celulas madre pluripotentes a partir de embriones haploides han dado como resultado el aislamiento de celulas madre embrionarias partenogeneticas (ESC) con un cariotipo diploide 4 Estos estudios comunicaron el desarrollo de blastocistos de raton haploides aparentemente normales con una masa celular interna definida (ICM) 4,5 Para investigar los ICM haploides, los presentes inventores cultivaron blastocistos de raton haploides en medio qulmicamente definido con inhibidores de protelna cinasa activada por mitogeno (MEK) y glucogeno sintasa cinasa 3 (GSK3). Este medio 2i 7 se ha usado previamente para aislar ESC a partir de cepas de raton recalcitrantes 8 y ratas 9 y puede ayudar a mantener determinadas caracterlsticas de las celulas epiblasticas de raton tempranas 10,11.

Los presentes inventores generaron embriones de raton haploides mediante activacion de ovocitos no fertilizados aislados de ratones hembra hlbridos B6CBAF1 superovulados usando cloruro de estroncio. Despues del cultivo en medio M16, se obtuvieron 30 blastocistos (22 %) a partir de 132 ovocitos activados y se usaron para la obtencion de ESC. Despues de la retirada de la zona y del trofectodermo, se cultivaron las ICM en placas de 96 pocillos gelatinizadas en medio 2i en presencia de LIF. Se obtuvieron 27 llneas celulares ESC (93 %). Las llneas ESC individuales se expandieron y se analizo su contenido de ADN mediante analisis de flujo usando ESC diploides como controles (Figura 5ab). En 6 llneas ESC, al menos el 10 % de las celulas tenlan un contenido de ADN haploide y la proporcion de celulas haploides podrla alcanzar una estimacion conservativa del 60 % (Figura 5b). Se logro un enriquecimiento adicional mediante clasificacion por flujo de las celulas con un contenido de ADN haploide despues de tincion con HOECHST 33342 (Figura 5c). Esto permitio la expansion de llneas ESC haploides durante mas de 35 pases.

Los presentes inventores probaron ademas los requisitos para obtener ESC de raton haploides (Tabla 3). Estos experimentos demostraron que la retirada del trofectodermo mediante inmunocirugla no era esencial. Tambien pudieron establecerse ESC haploides usando medio DMEM complementado con Reemplazo de Suero Knockout (KSR) y LIF, demostrando que es posible la obtencion sin inhibidores de cinasas (Tabla 3 y Figura 1 Suplementaria). Los presentes inventores tambien tuvieron exito en aislar ESC haploides a partir de la cepa de raton endogamica 129Sv y dos llneas de raton modificadas geneticamente. En esta ultima, se hablan cruzado hasta la homocigosis varios alelos y se mantuvieron en un origen genetico mixto durante varias generaciones (Tabla 3 y Figura 2 Suplementaria). En resumen, los presentes inventores obtuvieron 25 llneas ESC haploides en 7 experimentos independientes. Los cultivos de ESC haploides tambien pudieron mantenerse sobre alimentadores en suero que contenla DMEM complementado con LIF.

Las ESC haploides mostraron una morfologla de colonia de ESC de raton tlpica (Figura 5d). Las dispersiones de cromosomas mostraron 20 cromosomas correspondientes al conjunto de cromosomas de raton haploides (Figura 5ef). Para caracterizar adicionalmente la integridad genetica, los presentes inventores llevaron a cabo una hibridacion genomica comparativa (CGH) de 4 llneas ESC haploides y de ADN de control procedente de la cepa CBA y la llnea de raton transgenica mixta a partir de la cual se obtuvieron las ESC HTG-1 y HTG-2 (Figura 5gh y Figuras 3 y 4 Suplementarias). Las variaciones en el numero de copias (CNV) que se detectaron en el genoma de las llneas ESC haploides tambien estaban presentes en las cepas de origen (Tabla 1 Suplementaria). Aunque algunas CNV pareclan especlficas de ESC haploides, la inspeccion de las senales reales (Figura 4 Suplementaria) sugieren que estas CNV tambien estaban presentes en los ADN de CBA o de HTG de control, pero no se detectaron con el umbral aplicado. Las CNV entre la cepa de raton C57BL6 y CBA eran consistentes con un analisis comunicado previamente 12 Tomados en su conjunto, estos datos demuestran que las ESC haploides mantuvieron un genoma haploide intacto sin amplificaciones o perdidas.

A nivel molecular, las ESC haploides expresaron marcadores de pluripotencia incluyendo Oct4, Rex1, Klf4, Sox2 y Nanog (Figura 6ab). El analisis de expresion en todo el genoma mostro una alta correlacion (coeficiente de correlacion de Pearson r = 0,97 sobre todos los genes) entre ESC haploides y ESC macho diploides de control (Figura 6c y Figura 5 Suplementaria). En las ESC haploides, 279 y 194 genes estaban regulados positiva o negativamente mas de 2 veces (p <0,05), respectivamente (Tabla 2 Suplementaria). Entre estos, 99 genes ligados al cromosoma X estaban sobreexpresados y 4 genes ligados al cromosoma Y se hablan perdido en las ESC haploides, lo que es coherente con las diferentes constituciones de cromosomas sexuales (Figura 6d). Por lo tanto, las ESC haploides mantienen en gran medida un perfil de transcripcion de ESC de raton.

Esto impulso a los presentes inventores a investigar el potencial de desarrollo de las ESC haploides. Para esto, los presentes inventores introdujeron un vector de transposon piggyBac para expresar protelna fluorescente verde (GFP) en ESC HAP-2. La clasificacion de celulas por flujo respecto de fluorescencia de GFP y tincion de ADN con Hoechst 33342 produjo una poblacion de ESC haploides que expresaba GFP a un alto nivel, lo que demuestra que el contenido de genoma haploide se mantuvo durante el procedimiento de transfeccion (Figura 6 Suplementaria).

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Las ESC haploides marcadas con GFP contribuyeron sustancialmente a los embriones quimericos cuando se inyectaron en blastocistos de C57BL/6 (Figura 7a). La inmensa mayoria de las celulas positivas a GFP extraidas de los embriones quimericos tenian un contenido de ADN diploide (Figura 7b), lo que indica que las ESC haploides contribuian de manera extensiva al desarrollo despues de la diploidizacion. Los presentes inventores tambien obtuvieron 2 quimeras nacidas vivas macho y 2 hembras con una contribution sustancial de ESC haploides (Figura 7c). Estos ratones se desarrollaron normalmente con un quimerismo de color del pelo evidente. Se obtuvieron resultados similares con las ESC HAP-1 y HTG-2 (Figura 7d y Figura 7a Suplementaria). Ademas, la fraction diploide de las ESC HAP-2 en el pase 31 pudo diferenciarse en celulas positivas a Nestin despues de un protocolo de diferenciacion neural in vitro 1 (Figura 7b Suplementaria). En su conjunto, estos hallazgos demuestran que las ESC haploides mantienen un gran potencial de diferenciacion. Estos ratones quimericos han transmitido el transgen de GFP desde la linea de celulas madre embrionaria haploide HAP-1 transgenica para GFP a dos de sus descendientes. Esto es una demostracion de la capacidad para introducir mutaciones o modificaciones geneticas en ratones mediante celulas ES haploides.

Para investigar la utilidad de las ESC haploides para cribado genetico, los presentes inventores llevaron a cabo un cribado piloto respecto de genes de reparation de desemparejamientos siguiendo una estrategia previamente publicada 14 Para esto, se cotransfectaron 5 x 106 ESC haploides con un vector de transposon piggyBac de trampa genica (Figura 8a Suplementaria) y un plasmido para expresar una transposasa de piggyBac optimizada 15 Las inserciones de trampa genica se seleccionaron con puromicina. Despues, se cultivo un conjunto de 1 x 107 celulas en presencia de 2-amino-6-mercaptopurina (6-TG) que es toxica para las celulas capaces de reparar desemparejamientos. Despues de 8 dias, se aislaron 20 colonias resistentes a 6-TG y se mapearon los sitios de integration usando PCR Splinkerette 16 De los 7 clones analizados, los presentes inventores identificaron dos inserciones independientes en Msh2 y una en Hprt (Figura 8b Suplementaria). Msh2 es un gen de reparacion de desemparejamientos conocido y Hprt es necesario para convertir las 6-TG en un metabolito toxico 14 Por lo tanto, fue posible la identification de mutaciones en genes autosomicos, lo que sugiere un potencial de las ESC haploides en el cribado genetico directa en mamiferos.

La dificultad para obtener lineas ESC haploides en los intentos previos puede explicarse por la regulation genica aberrante, tal como la compensation de dosificacion aberrante y la impronta genetica. Sin embargo, se han establecido ESC diploides de embriones partenogeneticos de raton y humanos 17, . Se ha observado hasta cierto punto una mala regulacion de la inactivation de X en embriones de raton haploides 5 y tambien se ha demostrado que reduce la eficacia de la production de ratones clonados 19 Por lo tanto, puede deducirse que la inactivacion de X se inicia de manera aberrante en embriones haploides durante algunos procedimientos de obtencion de ESC. La captura directa de celulas pluripotentes virgenes a partir de recrecimientos de ICM, tal como se acentua mediante el uso de condiciones de 2i 11, podria haber contribuido al exito del presente estudio.

Con anterioridad, se habian observado celulas casi haploides en tumores humanos (para una revision de la

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bibliografia, vease ) y se ha descrito una linea celular derivada de tumor humano practicamente haploide ’ . Estas celulas tumorales portan reorganizaciones genomicas y mutaciones que podrian estabilizar el genoma haploide. Un aspecto interesante de las ESC haploides es su potencial de desarrollo. Los presentes inventores han observado una rapida diploidizacion cuando se diferencian las ESC haploides. Las celulas partenogeneticas diploides resultantes pueden contribuir al desarrollo 23 Resulta interesante especular si los linajes haploides diferenciados pueden generarse quizas mediante la supresion de la inactivacion de X y si es posible obtener ESC humanas haploides.

Resumen de metodos

Para la obtencion de ESC haploides, se activaron ovocitos de raton en medio M16 del modo que se ha descrito 24 El cultivo de ESC en medio 2i quimicamente definido se ha descrito previamente 7,8 La clasificacion celular respecto del contenido de ADN se llevo a cabo despues de la tincion con 15 pg/ml de Hoechst 33342 (Invitrogen) en un clasificador de flujo MoFlo (Beckman Coulter) seleccionando el pico haploide 1n. Para los perfiles de flujo analiticos, las celulas se fijaron en etanol, se trataron con RNasa y se tineron con yoduro de propidio (PI). Para el analisis de cariotipo, las celulas se detuvieron en metafase con demecolcina (Sigma). Despues de la incubation en tampon de KCl hipotonico, se fijaron las celulas en acido metanol-acetico (3:1) y se prepararon dispersiones de cromosomas y se tineron con DAPI. El ARN se extrajo usando el kit RNeasy (Quiagen). Los perfiles de transcription se generaron usando matrices GeneChip 430.2 de Affymetrix. La preparation de la muestra, la hibridacion y el analisis basico de datos se llevaron a cabo por Imagenes (Berlin, Alemania). Se llevo a cabo un analisis posterior usando el programa informatico Genespring GX (Agilent). Para el analisis CGH, se aislo el ADN genomico de lineas ESC haploides y se hibrido con matrices de mosaico (tiling arrays) de todo el genoma de 3x720K de NimbleGen por Imagenes (Berlin, Alemania) usando ADN de rinon de C57BL/6 como referencia. Para los experimentos con quimera, se inyectaron ESC HAP-1 (p29), HAP-2 (p18) y HTG-2 (p23) marcadas con GFP en blastocistos hospedadores de C57BL/6. Las quimeras nacidas vivas se analizaron respecto de la expresion de GFP en el dia postnatal 2. El cribado genetico se llevo a cabo siguiendo una estrategia previamente publicada 25 En resumen, las ESC HAP-1 se cotransfectaron con 2 pg de vector de expresion de transposasa de piggyBac 15 y 1 mg del vector de trampa genica piggyBac (Figura 8 Suplementaria) usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). La selection respecto de inserciones del transposon se llevo a cabo usando 2 pg/ml de puromicina durante 8 dias. Se sembraron 1x107 ESC resistentes a puromicina en

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dos placas de 15 cm y se seleccionaron las mutaciones en los genes de reparacion de desemparejamientos usando 0,3 pg/ml de 6-TG (Sigma). Los sitios de integracion de piggyBac en siete clones resistentes a 6-TG se mapearon mediante PCR Splinkerette 16

Referencias para el ejemplo 3

1. Otto, S. P. y Jarne, P. Evolution. Haploids--hapless or happening? Science 292, 2441-3 (2001).

2. Wiellette, E. et al. Combined haploid and insertional mutation screen in the zebrafish. Genesis 40, 231-40 (2004).

3. Yi, M., Hong, N. y Hong, Y. Generation of medaka fish haploid embryonic stem cells. Science 326, 430-3 (2009).

4. Kaufman, M. H., Robertson, E. J., Handyside, A. H. y Evans, M. J. Establishment of pluripotential cell lines from haploid mouse embryos. J Embryol Exp Morphol 73, 249-61 (1983).

5. Latham, K. E., Akutsu, H., Patel, B. y Yanagimachi, R. Comparison of gene expression during preimplantation development between diploid and haploid mouse embryos. Biol Reprod 67, 386-92 (2002).

6. Kaufman, M.H. Chromosome analysis of early postimplantation presumptive haploid parthenogenetic mouse embryos. J Embryol Exp Morphol 45, 85-91 (1978).

7. Ying, Q.L. et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature 453, 519-23 (2008).

8. Nichols, J. et al. Validated germline-competent embryonic stem cell lines from nonobese diabetic mice. Nat Med 15, 814-8 (2009).

9. Buehr, M. et al. Capture of authentic embryonic stem cells from rat blastocysts. Cell 135, 1287-98 (2008).

10. Nichols, J., Silva, J., Roode, M. y Smith, A. Suppression of Erk signalling promotes ground state pluripotency in the mouse embryo. Development 136, 3215-22 (2009).

11. Nichols, J. y Smith, A. The origin and identity of embryonic stem cells. Development 138, 3-8 (2011).

12. Cutler, G., Marshall, L. A., Chin, N., Baribault, H. y Kassner, P.D. Significant gene content variation characterizes the genomes of inbred mouse strains. Genome Res 17, 1743-54 (2007).

13. Pollard, S.M., Benchoua, A. y Lowell, S. Neural stem cells, neurons, and glia. Methods Enzymol 418, 151-69 (2006).

14. Li, M. A., Pettitt, S. J., Yusa, K. y Bradley, A. Genome-wide forward genetic screens in mouse ES cells. Methods Enzymol 477, 217-42 (2010).

15. Cadinanos, J. y Bradley, A. Generation of an inducible and optimized piggyBac transposon system. Nucleic Acids Res 35, e87 (2007).

16. Mikkers, H. et al. High-throughput retroviral tagging to identify components of specific signaling pathways in cancer. Nat Genet 32, 153-9 (2002).

17. Mai, Q. et al. Derivation of human embryonic stem cell lines from parthenogenetic blastocysts. Cell Res 17, 1008-19 (2007).

18. Revazova, E. S. et al. Patient-specific stem cell lines derived from human parthenogenetic blastocysts. Cloning Stem Cells 9, 432-49 (2007).

19. Inoue, K. et al. Impeding Xist expression from the active X chromosome improves mouse somatic cell nuclear transfer. Science 330, 496-9 (2010).

20. Sukov, W. R. et al. Nearly identical near-haploid karyotype in a peritoneal mesothelioma and a retroperitoneal malignant peripheral nerve sheath tumor. Cancer Genet Cytogenet 202, 123-8 (2010).

21. Kotecki, M., Reddy, P.S. y Cochran, B. H. Isolation and characterization of a near-haploid human cell line. Exp Cell Res 252, 273-80 (1999).

22. Carette, J. E. et al. Haploid genetic screens in human cells identify host factors used by pathogens. Science 326, 1231-5 (2009).

23. Jiang, H. et al. Activation of paternally expressed imprinted genes in newly derived germline-competent mouse parthenogenetic embryonic stem cell lines. Cell Res 17, 792-803 (2007).

24. Kishigami, S. y Wakayama, T. Efficient strontium-induced activation of mouse oocytes in standard culture media by chelating calcium. J Reprod Dev 53, 1207-15 (2007).

25. Guo, G., Wang, W. y Bradley, A. Mismatch repair genes identified using genetic screens in Blm-deficient embryonic stem cells. Nature 429, 891-5 (2004).

Tabla 3: obtencion de lineas ESC de raton haploides

Experimento n.°

protocolo de obtencion Nombres de las lineas origen genetico Ovocitos activados numero de blastocistos lineas ESC lineas ESC con contribucion haploide

ESC usadas obtenidas (% maximo de

en el estudio haploides antes de la

clasificacion)

1

2i / HAP-1 a 6 B6CBAF1 132 30 27 6 (>60%)

2

inmunocirugla 2i t HAP-7 B6CBAF1 22 10 5 1 (>15%)

3

2i HTG-1 a 3 i TG mixto* 50 32 3 3 (>90%)

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KSR / inmunocirugia HAP-8 a 13 B6CBAF1 273 48 22 6 (>10 %)

5

2i H129B6-1 a 5 129B6F1 250 37 8 5 (>10 %)

6

2i HTX-1 TG mixto* * ** 70 11 1 1 (>40%)

7

2i H129-1 a 3 129Sv 140 13 10 3 (>60%)

T Se confirmo contribucion a ratones quimericos para las lineas ESC haploides HAP-1 y HAP-2.

* Se confirmo contribucion a ratones quimericos para la llnea ESC haploide HTG-1.

*Derivado de ratones hembra homocigotos ROSA26nlsrlTA LC1 Xist2LO .

** Derivado de ratones hembra homocigotos ROSA26nlsrtTA tetOPXist30._____________________________________

Metodos para el ejemplo 3 Obtencion de ESC haploides

Se aislaron ovocitos de hembras superovuladas y se activaron en medio M16 usando cloruro de estroncio 5 mM y EGTA 2 mM del modo descrito 24 Posteriormente, los embriones se cultivaron en microgotas de medio M16 o KSOM cubiertas de aceite mineral. En estas condiciones, aproximadamente un 80 % de los ovocitos alcanzaron el estado de 2 celulas a la manana siguiente. Posteriormente, el desarrollo de los embriones antes de la implantacion fue variable mostrando un gran numero de embriones blastomeros de tamanos desiguales o una morfologla de embrion infrecuente. La retirada de la zona, la inmunocirugla para retirar el trofectodermo y la obtencion de ESC se llevo a cabo del modo descrito anteriormente 7,8 Las ESC se cultivaron en medio 2i qulmicamente definido mas LIF como se ha descrito 7,8 con modificaciones menores. El medio 2i se complemento con aminoacidos no esenciales y fraccion V de BSA al 0,35 %. El cultivo de las ESC sobre alimentadores se llevo a cabo como se ha descrito previamente 26 El reemplazo de suero knockout (KSR) se obtuvo de Invitrogen. La clasificacion celular respecto del contenido de ADN se llevo a cabo despues de la tincion con 15 |jg/ml de Hoechst 33342 (Invitrogen) en un clasificador de flujo MoFlo (Beckman Coulter). Se purifico el pico 1n haploide. Las celulas diploides aparecieron en cultivos en diversas medidas en todas las lineas eSc. La purification periodica mediante clasificacion por flujo cada cuatro a cinco pases permitio a los presentes inventores mantener cultivos que contenlan una inmensa mayorla de ESC haploides en todos los casos. Los perfiles de flujo anallticos del contenido de ADN se registraron despues de la fijacion de las celulas en etanol, digestion con RNasa y tincion con yoduro de propidio (PI) en un analizador Cyan (Beckman Coulter). Para el analisis del cariotipo, las celulas se detuvieron en metafase usando demecolcina (Sigma). Despues de la incubation en tampon de KCl hipotonico, las celulas se fijaron en metanol-acido acetico (3:1) y se prepararon dispersiones de cromosomas y se tineron con DAPI. La inmunotincion se llevo a cabo del modo descrito 27 usando anticuerpos Nanog (Abcam; 1:100), Oct4 (Santa Cruz; 1:100), Nestin (Developmental Studies Hybridoma bank, Iowa City; 1:30) y Gata4 (Santa Cruz; 1:200).

Analisis de micromatrices

Se extrajo el ARN de triplicados biologicos de ESC diploides y tres ESC haploides obtenidas independientemente (HAP-1 p21, HAP-2 p24, HTG-1 p11) usando el kit RNeasy (Quiagen). El analisis de la expresion genica en matrices GeneChip 430 2.0 de Affymetrix se llevo a cabo por Imagenes Ges.m.b.H. (Berlin, Alemania). Se obtuvieron perfiles de expresion genica adicionales de progenitores neurales, progenitores mesodermicos y fibroblastos embrionarios de raton (MEF) a partir de un conjunto de datos previamente publicado (numero de referencia de GEO GSE12982 28). Los datos se analizaron usando el programa informatico Genespring GX (Agilent Technologies). Los datos se normalizaron usando el algoritmo RMA. En la Tabla 2 Suplementaria se proporcionan listas que muestran los genes regulados de manera diferencial (cambio > 2 veces; p < 0,05). Los valores de p se establecieron mediante una prueba de t de muestras independientes seguida de ajuste de FDR mediante el metodo de Benjamini Hochberg. El agrupamiento jerarquico se llevo a cabo basandose en las distancias euclideas y el analisis de la distancia maxima (linkage completo). El grado de relation de los perfiles de transcription se determino calculando el coeficiente de correlation de Pearson (r). Se extrajeron muestras de ADN para los experimentos de hibridacion genomica comparativa (CGH) y se enviaron a Imagenes Ges.m.b.H. (Berlin, Alemania) para el analisis de CGH usando matrices de mosaico (tiling arrays) de todo el genoma de raton NimbleGen 3x720K con un espaciado medio de la sonda de 3,5 kb. Se uso ADN de rinon de C57BL/6 macho adulto como referencia. En la Figura 5g y Figura 3b Suplementaria se presenta una vision general genomica de estos analisis a una resolution de 200 kb y regiones ampliadas seleccionadas a una resolucion de 40 kb. El conjunto completo de datos a una resolucion de 40 kb esta incluido en la Figura 4 Suplementaria.

Acceso de conjuntos de datos

Puede accederse a los conjuntos de datos de expresion genica y de CGH en la serie de referencias de GEO GSE30879 (
http://www.nc-bi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE30879). Esta serie incluye los conjuntos de datos GSE30744 (Analisis de expresion de celulas ES haploides y diploides en medio 2i) y GSE30749 (analisis CGH de celulas ES haploides).

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Analisis de la expresion genica cuantitativa

Se extrajo ARN usando el kit RNeasy (Quiagen) y se convirtio en ADNc usando el kit de transcripcion inversa Quantitect (Quiagen). Se llevo a cabo PCR en tiempo real en una maquina StepOnePlus (Applied Biosystems) usando la mezcla maestra para Fast Sybr green (Applied Biosystems) y cebadores previamente publicados 27 Se uso el metodo de ddCt para la cuantificacion de la expresion genica. Se normalizaron los niveles de expresion al ARNm de protelna ribosomica L32 y los valores en las ESC de control diploide se ajustaron a 1.

Analisis de embriones

Las ESC haploides se cotransfectaron con un vector piggyBac que portaba un transgen CAG-GFP-IRES-higro y un plasmido de expresion de transposasa de piggyback. Los integrantes estables se seleccionaron usando 150 gg/ml de higromicina durante 7 dlas. La fraccion haploide de celulas HAP-1 (p29), HAP-2 (p18) y HTG-2 (p23) positivas a GFP se purifico mediante clasificacion por flujo (Figura 6 Suplementaria). Las ESC marcadas con GFP se expandieron e inyectaron en blastocistos hospedadores de C57BL/6 que se transfirieron a hembras receptoras. Los embriones se analizaron en E9.5 y E12.5. La disociacion en celulas individuales se llevo a cabo mediante incubacion en Tripsina al 0,25 %/EDTA durante 15 minutos. Antes de la tincion con PI, las celulas se fijaron en PFA al 4 % y se permeabilizaron en PBS/Triton X-100 al 0,25 %. Las quimeras nacidas vivas se analizaron en el dla postnatal 2 (P2) respecto a la expresion de GFP usando iluminacion UV. Se obtuvieron imagenes usando una camara Canon Powershot S5 IS con un filtro FHS/EF-3GY2 (BLS). Todos los experimentos con ratones se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas institucionales de la Universidad de Cambridge. Se disponla de todas las licencias del ministerio del interior del Reino Unido (Home Office) necesarias.

Cribado de trampa genica

El cribado se llevo a cabo basandose en un protocolo previamente publicado 25 Se cotransfectaron 5x106 ESC HAP- 1 con 2 gg de plasmido de transposasa de piggyBac 15 y 1 gg de vector de trampa genica piggyBac (Figura 8a Suplementaria) usando Lipofectamine 2000. Las inserciones de piggyBac en los genes expresados se seleccionaron con 2 gg/ml de puromicina durante 8 dlas. Despues, se sembraron 1x107 ESC correspondientes a aproximadamente 5.000 colonias resistentes a puromicina en dos placas de 15 cm. La seleccion respecto de integrantes defectuosos para el emparejamiento se llevo a cabo usando 0,3 gg/ml de 6-TG (Sigma). Se recogieron 20 colonias y se identificaron los sitios de integracion de piggyBac de siete clones mediante PCR Splinkerette y se mapearon usando iMapper 29

Referencias usadas unicamente en la seccion de metodos

26. Wutz, A. y Jaenisch, R. A shift from reversible to irreversible X inactivation is triggered during ES cell differentiation. Mol Cell 5, 695-705 (2000).

27. Leeb, M. et al. Polycomb complexes act redundantly to repress genomic repeats and genes. Genes Dev 24, 265-76 (2010).

28. Shen, X. et al. EZH1 mediates methylation on histone H3 lysine 27 and complements EZH2 in maintaining stem cell identity and executing pluripotency. Mol Cell 32, 491-502 (2008).

29. Kong, J., Zhu, F., Stalker, J. y Adams, D. J. iMapper: a web application for the automated analysis and zapping of insertional mutagenesis sequence data against Ensembl genomes. Bioinformatics 24, 2923-5 (2008).

30. Savarese, F., Flahndorfer, K., Jaenisch, R., Busslinger, M. y Wutz, A. Hematopoietic precursor cells transiently reestablish permissiveness for X inactivation. Mol Cell Biol 26, 7167-77 (2006).

Claims (15)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   REIVINDICACIONES

   1. Una celula madre embrionaria haploide de mamlfero, en donde la celula madre es pluripotente, capaz de proliferar y capaz de mantener un cariotipo haploide durante la proliferacion en cultivo durante al menos 15 pases.
2. 2. La celula madre de la reivindicacion 1, en donde la celula es capaz de proliferar cuando se cultiva en condiciones seleccionadas entre:

   a) medio qulmicamente definido N2B27 con LIF e inhibidores 2i;

   b) con reemplazo de suero KnockOut™ al 15 % complementado con glutamina, beta mercaptoetanol, penicilina- estreptomicina, aminoacidos no esenciales y 500 unidades por mililitro de LIF de raton recombinante; y/o

   c) medio DMEM alto en glucosa o D-MEM Knockout™ con suero de ternero fetal al 15 % complementado con glutamina, beta mercaptoetanol, penicilina-estreptomicina, aminoacidos no esenciales (Invitrogen) y 500 unidades por mililitro de LIF de raton recombinante.
3. 3. La celula madre de las reivindicaciones 1 o 2, en donde las condiciones de proliferacion incluyen ademas una capa de alimentacion de fibroblasto.
4. 4. La celula madre embrionaria haploide de mamlfero de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la celula madre puede mantener un cariotipo haploide durante al menos 20 pases.
5. 5. La celula madre embrionaria haploide de mamlfero de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el mamlfero es Mus musculus.
6. 6. La celula madre embrionaria haploide de mamlfero de la reivindicacion 5, en donde la cepa es CBA/B6.
7. 7. Un metodo para producir la celula madre embrionaria haploide de mamlfero de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, comprendiendo el metodo las siguientes etapas:

   - activar ovocitos aislados in vitro para producir embriones haploides;

   - cultivar los embriones activados hasta los estados de 8 celulas, de morula o de blastocisto;

   - retirar la zona pelucida;

   - aislar la masa celular interna de los embriones activados;

   - cultivar adicionalmente la masa celular interna y

   - enriquecer las celulas cultivadas para obtener una celula madre embrionaria haploide.
8. 8. El metodo de la reivindicacion 7, en el que:

   a) los embriones activados se cultivan con inhibidores de cinasa; o

   b) la masa celular interna se cultiva usando alimentadores de fibroblastos en un medio aserico, LIF e inhibidores de cinasa o usando un medio alto en glucosa complementado con suero o un reemplazo de suero y LIF;

   en el que los inhibidores de cinasa comprenden inhibidores de treonina/tirosina cinasas y glucogeno sintasa cinasa 3P.
9. 9. El metodo de la reivindicacion 7, en el que la activacion in vitro comprende la incubacion en medio M16, cloruro de estroncio y EGTA, preferentemente en el que el perlodo de incubacion no es mayor de 5 horas, preferentemente de 1 a 3 horas.
10. 10. El metodo de la reivindicacion 7, que ademas comprende retirar el trofectodermo mediante inmunocirugla antes del aislamiento de la masa celular interna.
11. 11. El metodo de la reivindicacion 7, en el que

    a) la zona pelucida se retira usando solucion de Tyrode acida; o

    b) las celulas de la masa celular interna se someten a pases cada 3 a 4 dlas hasta que se obtiene la llnea de celulas madre embrionarias haploides.
12. 12. El metodo de la reivindicacion 7, en el que el mamlfero es Mus musculus, preferentemente en el que la cepa es CBA/B6.
13. 13. El uso de la celula madre embrionaria haploide de mamlfero de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en cribado genetico.
14. 14. Un cultivo celular que comprende la celula madre embrionaria haploide de mamlfero de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
15. 15. Una celula madre embrionaria haploide de mamlfero que puede obtenerse mediante proliferacion de la celula madre de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.