ES2629127T3

ES2629127T3 - Preparación de coloides metálicos

Info

Publication number: ES2629127T3
Application number: ES08863725.1T
Authority: ES
Inventors: Peter Cyril White; Jakob Howie Hjortkjaer
Original assignee: University of Lincoln
Current assignee: University of Lincoln
Priority date: 2007-12-21
Filing date: 2008-12-19
Publication date: 2017-08-07
Anticipated expiration: 2028-12-19
Also published as: US20140124707A1; JP5904390B2; CN101952025A; WO2009081138A1; PT2237873T; DK2237873T3; US9086381B2; HUE034789T2; CN101952025B; GB0724870D0; EP2237873A1; HK1153423A1; LT2237873T; EP2237873B1; US20100290043A1; PL2237873T3; JP2011508663A; US8545729B2

Abstract

Un método de producir una solución de coloide metálico, que comprende agregar una solución acuosa de una sal de hidroxilamina a una solución acuosa de un álcali y luego agregar una solución acuosa de los iones metálicos, caracterizado por seleccionar fosfato de hidroxilamina como la sal de hidroxilamina e introducir la solución de iones metálicos mediante inyección rápida a través de un chorro de alta velocidad de tal manera que los iones metálicos se dispersan a través de la mezcla dentro de un segundo.

Description

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descripcion

Preparacion de coloides metalicos Campo de la invencion

Esta invencion se refiere a un metodo para preparar coloides metalicos estables.

Antecedente de la invencion

Por muchos anos los analistas qmmicos no utilizaron la espectroscopia Raman porque fallaba en proporcionar el grado de sensibilidad requerido para la deteccion de cantidades de trazas de analitos. La razon principal de esto son los altos niveles de fondo de fluorescencia que surgen de muestra o sustrato.

En 1974, Fleischman descubrio, mientras utilizaba espectroscopia de Raman para estudiar reacciones electroqmmicas de piridina sobre un electrodo de plata, que hubo una destacada mejora de las senales Raman en piridina, con plata que apaga una gran cantidad de fluorescencia de fondo. Se sabe que la mejora de la superficie solo se puede alcanzar si la superficie de plata es rugosa y no lisa.

La posibilidad de utilizar dispersiones coloidales de plata (Ag) u oro (Au) en soluciones acuosas se demostro primero por Creighton y colaboradores en 1979 (Creighton, J.A.; Blatchford, C.G.; Albrecht, M.G. J Chem. Soc., Faraday Trans. 2 1979, 75, 790). Se ha encontrado que se pueden alcanzar efectos mejorados de superficie iguales o incluso mayores con coloides de plata. Un coloide es una suspension de partfculas metalicas en solucion. Con el fin de lograr el alcance optimo, se requiere agregacion controlada de partfculas de coloides de plata, normalmente utilizando compuestos organicos o inorganicos como reactivos de agregacion.

Con el tremendo aumento en la sensibilidad que se puede alcanzar utilizando este efecto de mejora de superficie, se han desarrollado tecnicas analfticas de Espectroscopia de Dispersion Raman Mejorada de Superficie (SERS) y espectroscopia de Dispersion Raman de Resonancia Mejorada de Superficie (SERRS).

El crecimiento en el uso de estas tecnicas ha sido exponencial, pero el problema principal es producir coloides estables con buenas propiedades de dispersion de luz y capaces de apagar la fluorescencia de fondo. Con el fin de que un coloide permanezca estable las partfculas de plata deben permanecer suspendidas indefinidamente, pero se sabe que en muchas ocasiones ocurre agregacion y la plata cae fuera de la solucion.

Los coloides de plata se pueden preparar mediante reduccion qmmica ya sea con borohidruro de sodio o citrato de sodio. Es bien sabido que el citrato reduce coloides que son mas estables y muchos analistas han preparado estos utilizando un metodo publicado por P.C. Lee and O. Meisel (J.Phys.Chem., 1982, 86, 3391-3395). Sin embargo, es bien sabido que es diffcil la reproducibilidad tanda a tanda para lograr este metodo y la estabilidad, es decir la vida util es variable. De dichos coloides de plata que utilizan este metodo requiere el uso de cristalena ultra limpia y temperaturas con exactitud, velocidad de agitacion, etc.

En razon a que este metodo publicado original ha sido modificacion publicada de este metodo original (C.H. Munro, W.E. Smith and P.C. White, Analyst 1993, VoI. 118. 733-735). Esta modificacion publicada del metodo conocido original conduce a algunas mejoras en las propiedades del coloide de plata, pero la estabilidad a largo plazo de Ios coloides sigue siendo un problema.

Intentos anteriores en producir coloides de plata con propiedades de dispersion de Iuz deseable han sido pobres y debido a estos resultados decepcionantes ha habido poco entusiasmo para ir en contra de la sabiduna percibida de que la naturaleza ionica de sodio en el nitrato de plata era de hecho responsable de Ios intentos fallidos por obtener coloides de plata con vida util y estabilidad adecuada. En W02007/107792 divulgamos y reivindicamos un metodo para producir coloides de plata muy estables con buenas propiedades SERRS que utilizan citrato de litio en lugar de citrato de sodio para reducir el nitrato de plata.

El uso de clorhidrato de hidroxilamina para reducir el nitrato de plata a un pH alcalino y a una temperatura ambiente fue publicado en Leopold, N.; Lendi B,; J.Phys,Chem.B 2003, 107, 5723-5727. Los resultados publicados en este documento muestran que Ios coloides tienen un ancho de banda alto y valores Amax con una distribucion grande de tamano de partfcula. Estas propiedades son tipicas de coloides pobres y no se esperana que proporcionen buen espectro SERRS. El espectro presentado muestra altos niveles de fondo de fluorescencia, que es tfpico de pobre adsorcion del tinte sobre las partfculas de plata. No hay mencion en el documento de la estabilidad o reproducibilidad del espectro SERRS de diferentes tandas de coloides, y esto ha sido el mayor problema en la espectroscopia de SERRS.

Se pueden utilizar coloides de oro en diversas aplicaciones de nanotecnologfa, por ejemplo, en biosensores, as^ como en espectroscopia Raman. Otros metales en forma de coloidales se pueden aplicar a aplicaciones similares, o pueden encontrar nuevas aplicaciones.

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Resumen de la invencion

De acuerdo con la presente invencion, un metodo para producir soluciones de coloides metalicas, que comprenden agregar una solucion acuosa de sal de hidroxilamina a una solucion acuosa de un alcali y luego agregar una solucion acuosa de iones metalicos, se caracteriza al seleccionar fosfato de hidroxilamina como la sal de hidroxilamina e introducir la solucion de iones metalicos mediante inyeccion rapida a traves de un chorro de alta velocidad de tal manera que los iones metalicos esten sustancialmente dispersos a traves de la mezcla dentro de un segundo.

Actualmente, el metodo se puede alcanzar mejor al utilizar volumenes muy pequenos de soluciones, por ejemplo, inyectar un volumen pequeno de solucion de iones metalicos en la solucion de hidroxilamina utilizando una pipeta de embolo. El metodo de la invencion puede emplear ventajosamente alta velocidad, tecnicas de inyeccion de bajo volumen tal como aquellas utilizadas en impresoras de chorro de tinta, en donde gotas pequenas se expulsan rapidamente y alta velocidad.

Los iones metalicos son de plata u oro, aunque otros iones, tal como cobre, tambien se pueden utilizar para producir coloides. La plata puede estar en la forma de solucion de nitrato de plata.

El alcali es preferiblemente una base fuerte tal como hidroxido de sodio o hidroxido de potasio, se prefiere hidroxido de sodio. La solucion alcali es preferiblemente preparada frescamente, ya que se considera que la absorcion de dioxido de carbono de la atmosfera afecta el resultado, se ha encontrado que el uso de hidroxido de sodio que ha estado en reposo algun tiempo, incluso durante un penodo de dos horas, resulta en un coloide mas oscuro con mayor una Amax mayor, reduccion de absorbancia y mayores valores de ancho de banda.

Los resultados han demostrado que el penodo optimo para producir coloides con las propiedades UV y SERRS mas deseables es cuando la etapa posterior de mezcla se realiza con el fin de alcanzar dispersion completa dentro de 10 segundos. Cuando la etapa de mezcla se realiza en un penodo mas corto (2 segundos) o un penodo mayor (30 segundos), esto produce resultados significativamente mas pobres en la forma de coloides inestables.

Los coloides producidos por el metodo del solicitante muestran que exhiben propiedades UV destacadas. Para una preparacion coloidal diluida (60 pl de coloide en 3 ml de agua) en una cubeta de 1 cm de longitud de trayecto, esto produce un espectro UV que presenta un valor Amax de normalmente 389±1 nm, un ancho de banda 28±2 nm y una absorbancia de 0.475±25. Los coloides resultantes tambien dan un espectro SERRS muy intenso y un menor fondo de fluorescencia que los resultados previos del solicitante obtenidos cuando se utiliza citrato de litio como el agente de reduccion.

La reduccion de las sales metalicas produce partfculas metalicas y aniones presentes en la solucion se atraen hacia la superficie de la partfcula. Siempre que la carga permanezca en las partfculas se repeleran entre sf y permaneceran en la solucion. Idealmente, las partfculas metalicas en una solucion coloidal deben permanecer en la solucion indefinidamente, pero en la produccion de muchos coloides esta estabilidad no se alcanza y ocurre agregacion de partfculas con el tiempo, resultando en colapso del coloide. Prueba de esta ocurrencia se puede monitorear mediante UV, en donde un aumento en Amax, y ancho de banda, y reduccion de absorbancia, se observan durante un penodo de tiempo.

En el metodo propuesto del solicitante para la produccion de coloides, la eleccion de la sal de hidroxilamina, es decir, el anion, se encuentra que influencia la estabilidad del coloide. En la preparacion de coloides de plata con diferentes sales de hidroxilamina, no se puede obtener coloides estables con las sales acidas de sulfato, nitrato u O- sulfonico. Con las sales de clorhidrato, se pueden obtener coloides con estabilidad limitada, pero con las sales de fosfato se puede producir un coloide muy estable. La inestabilidad creciente observada se puede relacionar con la indisolubilidad, es decir, el producto de solubilidad (Ksp) de la sal de plata - Ksp Ag2S04 = 1.2 x 10'5, AgCl = 1.8 x 10' 10 y AgaP04 = 1.2 x 10'1s.

Tambien se considera que la Valencia del anion afecta la estabilidad del coloide. Con los coloides de reduccion de citrato de Lee y Meisel, el citrato de plata tiene una Ksp muy similar del sulfato de plata y por lo tanto no se esperana que fuera muy estable. Sin embargo, el citrato es un anion trivalente y esto posiblemente explica el grado mas alto de estabilidad de lo esperado. Por lo tanto, con el fosfato tambien es un anion trivalente y esto tambien puede explicar la mejora de estabilidad alcanzada con el fosfato de hidroxilamina. Utilizando el metodo propuesto del solicitante para la preparacion de coloide de oro que se ha producido, pero una forma estable solo se puede alcanzar con el fosfato y no la sal de clorhidrato de hidroxilamina. Por lo tanto, el metodo utiliza una sal de hidroxilamina seleccionada de tal manera que el anion es de alta Valencia, y cuando se combina con dicho ion metalico formana una sal de metal que tiene una baja solubilidad en agua. El nitrato de plata, cloruro de oro o nitrato de cobre pueden, por ejemplo, se utilizado como la solucion de ion metalico.

Los coloides de plata producidos utilizando clorhidrato de hidroxilamina (coloides HHAg) mostraron, dentro de 48 horas de produccion, una reduccion de ancho de banda y de Amax dentro de aumento de absorbancia en sus

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propiedades UV. Despues de este peiiodo de tiempo Amax y el ancho de banda se redujeron en un mdice mucho mas lento, sin cambios principales en la absorbancia durante 30 dfas, pero mas alia de este penodo se observo absorbancia que cayo bastante rapido. Lo coloides producidos al utilizar fosfato de hidroxilamina (coloides HPAg) mostraron mucha mayor estabilidad. Durante un penodo de 30 d^as, estos no mostraron cambios principales iniciales en sus propiedades UV y durante largos periodos de tiempo mostraron solo muy poca reduccion en su ancho de banda y valores Amax y retienen el nivel de absorbencia.

Se ha encontrado adicionalmente que madurar el coloide durante un periodo predeterminado producira un coloide estable cuyas propiedades no experimentan cambios adicionales. El penodo de maduracion se ve influenciado por la temperatura. A temperatura ambiente, el periodo de maduracion se puede extender hasta aproximadamente 8 semanas, pero a mayores temperaturas el tiempo tomado para alcanzar estabilidad se reduce sustancialmente, tomando, por ejemplo, solo aproximadamente 24 horas a 40-50°C. El proceso de maduracion tambien facilita el tamano del contenedor, y se prefiere utilizar un contenedor que tiene un area de superficie grande para un volumen dado. El uso de otros contenedores plasticos, tal como aquellos hechos de policarbonato, polipropileno y tereftalato de polietileno (PET), resultan en un colapso anticipado del coloide, como lo hacen los contenedores de vidrio. La estabilidad tambien se ve influenciada por el material del contenedor en el que se almacena el coloide, y se ha encontrado que los contenedores de poliestireno dan la mayor estabilidad.

El coloide de plata producido por el metodo de la invencion contiene una concentracion de plata de 0.114 mg ml-1, que es muy similar a la concentracion de plata en un coloide de Lee y Meisel de reduccion de citrato. Sin embargo, a diferencia del ultimo, los coloides HHAg y HPAg producen aumento considerable en la sensibilidad de las senales SERRS cuando se utiliza una solucion diluida del coloide. La dilucion esta preferiblemente dentro del rango de 25 a 70%, y esto se puede alcanzar al utilizar, por ejemplo, agua o solucion acuosa de agentes de agregacion inorganicos tal como cloruro de sodio, acido mtrico, o agentes de agregacion organica tal como la poli-L-lisina.

Para los SERRS, la agregacion de partfculas de plata es esencial para alcanzar el efecto de mejora de superficie. Normalmente, con coloides de reduccion de citrato de Lee y Meisel, si las concentraciones de analitos son mayores de 10'5 M se analizan, entonces ocurre el fenomeno de auto agregacion. Con el fin de detectar analitos en menores concentraciones, se tiene que utilizar agentes de agregacion organicos o inorganicos. Estudios realizados con coloides HHAg muestran que durante las primeras 48 horas de vida del coloide es posible alcanzar auto agregacion a menores concentraciones (aproximadamente 10-8 M) y obtener senales SERRS fuertes, superando de esta manera cualquier necesidad de un agente de agregacion y cualquier dilucion adicional de la muestra. Estudios de auto agregacion con protemas unidas a hierro, es decir, citocromo C (Cyt C), hemoglobina (Hb) y mioglobina (Mb) se han alcanzado en una concentracion de 10-7 M.

Con coloides HHAg mayores de 48 horas solo se puede alcanzar el espectro SERRS intenso mediante la agregacion de un agente de agregacion. Las propiedades unicas de este coloide se atribuyen a la presencia de iones de cloruro (de clorhidrato de hidroxilamina) que estan presentes. lones de cloruro se han utilizado tradicionalmente como un reactivo de agregacion y esto explicana por que se puede alcanzar auto agregacion del uno mismo. La necesidad de agregar un agente de agregacion despues de aproximadamente 48 horas indica un crecimiento de los agregados a un tamano en donde se precipitan de la solucion y reducen la concentracion de cloruro por debajo del nivel requerido para auto agregacion. La perdida en absorbancia UV y algun oscurecimiento visible de la solucion coloidal despues de dejarlos reposar indicana que esta ultima ocurre.

Cuando se comprara con un estudio SERRS anterior de Mb, en el que se utiliza un coloide con reduccion de citrato de sodio con agente de agregacion (Abdali, S., Johannessen, C., Nygaard, J. and Norbygaard, T., J. Phys. Condens. Matter, 2007, 19, 285205-285212), el coloide HHAg, preparado de acuerdo con el metodo Lendl original, produce substancialmente menor fondo de fluorescencia. Adicionalmente, las variaciones observadas entre el espectro indican diferencias en las qmmicas de superficie de los coloides con reduccion de citrato de sodio e hidroxilamina.

Estudios con coloides HPAg muestran que son mas similares a las sales con reduccion de citrato de Lee y Meisel ya que no muestran ningun nivel de auto agregacion para concentraciones de analito por encima de 10-7 M. Sin embargo, sobre la adicion de un agente de agregacion se puede obtener un espectro SeRRS muy fuerte con muy bajos niveles de fluorescencia de fondo.

Se ha observado que los coloides HPAg tienen una unica propiedad. Se han utilizado tintes benzotriazol anteriormente como analitos para determinar de estudios UV las propiedades de auto agregacion de los coloides y estimar la concentracion de tintes en la que ocurre el cubrimiento de partfculas coloidales (Faulds, K., Littleford, R.E., Graham, D., Dent, G. and Smith, W.E., Anal. Chem., 2004, 76, 592-598). Un estudio similar con coloides HPAg tambien han mostrado que ocurre auto agregacion en el rango de 1 x 10-6 a 1 x 10-7 M, pero en comparacion con un coloide de reduccion de citrato de Lee y Meisel, los UV muestran una absorbancia en ancho de banda fuerte mas angosta estrecho en longitudes de onda mas cortas, por ejemplo, aproximadamente 650 nm, comparado con aproximadamente 720 nm. Estos resultados indican que debido al tamano de partfcula mas pequeno de los coloides HPAg, se producen grupos agregados mas pequenos y por lo tanto tienen una longitud de onda de plasmon menor que el coloide de plata con reduccion de citrato de Lee y Meisel. El efecto observado tambien es dependiente de la concentracion y ocurre el efecto maximo dentro del rango de concentracion de 5 x 10-7 a 7.5x10-7 M. TEM de estas

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soluciones muestra grumos discretos (70x115|jiti) de partmulas agregadas y cuando se utiliza un laser 633nm, se maximiza el espectro Raman en el rango de concentracion 5 x 10-7 a 7.5x10-7 M. Por lo tanto es posible obtener una estimacion mas precisa de la concentracion del tinte en el que ocurre el cubrimiento monocapa de las partmulas coloidales. Adicionalmente, aunque solamente sobre una concentracion limitada el coloide HpAg proporciona un metodo mejorado de superficie unica para analisis de un tinte amarillo con una longitud de onda laser (633 nm).

Estos resultados indican que con este metodo de preparacion es posible alcanzar niveles mucho mas bajos de deteccion de lo que se habna obtenido previamente por otros expertos en la tecnica espectroscopia SERRS.

Breve descripcion de los dibujos

En los dibujos, que ilustran graficamente los resultados de estudios en coloides producidos mediante metodos de acuerdo con la invencion:

La figura 1 es una grafica de intensidad Raman contra el numero de ondas comparando los resultados obtenidos del coloide de clorhidrato de hidroxilamina con los resultados obtenidos en los estudios anteriores del solicitante utilizando citrato de litio;

La figura 2a es un espectro UV/Visible de un coloide de plata obtenido utilizando clorhidrato de hidroxilamina como el agente de reduccion y siguiendo el metodo publicado en Leopold, N.; Lendi B, V, Chem B 2003, 107, 5723-5727);

La figura 2b muestra espectro UV/Visible de un coloide de plata obtenido de acuerdo con el metodo de la invencion utilizando clorhidrato de hidroxilamina como el agente de reduccion, que muestra la estabilidad del coloide durante 30 dfas;

La figura 2c muestra espectro UV de un coloide de plata obtenido de acuerdo con el metodo de la invencion utilizando fosfato de hidroxilamina como el agente de reduccion, que muestra la estabilidad del coloide durante 7 meses;

La figura 3a es una grafica de intensidades SERRS (senales 1649, 1363 y 612 cm-1 para rodamina 6G) contra el tiempo, que ilustra los resultados obtenidos en el que se realiza la introduccion de las etapas de mezcla de tal manera que alcanza la dispersion completa de coloides HHAg dentro de 10 segundos;

La figura 3b es una grafica similar que ilustra los resultados obtenidos en el que la etapa de introduccion y mezcla para producir coloides HHAg se realiza dentro de un corto penodo de 2 segundos;

La figura 3c es una grafica similar adicional que ilustran los resultados que muestran la desestabilizacion de los coloides en el que la etapa de introduccion y mezcla para producir coloides HHAg se realiza dentro de un penodo mayor de 30 segundos;

La figura 4a es una grafica de intensidad Raman contra el numero de ondas (cm-1) que ilustra el aumento en la sensibilidad SERRS de rodamina 6G (10-8 M) cuando se utiliza 50% de dilucion del coloide de reduccion de clorhidrato de hidroxilamina con cloruro de sodio como agente de agregacion (514 nm);

La figura 4b es una grafica similar que ilustra el aumento en la sensibilidad SERRS de rodamina 6G (10-8 M) cuando se utiliza una dilucion al 50% de coloide de reduccion de clorhidrato de hidroxilamina con poli-L-lisina como el agente de agregacion (514 nm);

La figura 4c es una grafica que ilustra la sensibilidad SERRS de rodamina 6G (lo-8 M) cuando se utiliza una dilucion al 50% de coloide de reduccion de clorhidrato de hidroxilamina sin agente de agregacion (514 nm);

La figura 5 es una grafica de intensidad de SERRS (a.u. = unidades arbitrarias) contra porcentaje de volumen de 107 M de protema en la muestra, que ilustra la auto agregacion y las intensidades de SERrS alcanzadas para bandas de 1375 y 1169 cm-1 de protemas unidas a hierro, CytC Mb y Hb; las graficas muestran condiciones SERRS optimizadas (relacion de coloide HHAg: volumen de analito) para cada protema a una concentracion de 10-7 M.

La figura 6 es una grafica de intensidad SERRS contra el numero de ondas que ilustra el espectro SERRS de auto agregacion de las protemas unidas a hierro CytC, Mb y Hb (cada protema en una concentracion de 10-7 M) bajo condiciones SERRS optimizadas;

La figura 7 es un espectro UV/Visible de un coloide de oro producido de acuerdo con el metodo de la invencion utilizando fosfato de hidroxilamina como el agente de reduccion;

La figura 8 es una imagen TEM (microscopio electronico de transmision) de un coloide HPAg agregado con una solucion de 7.5x 10-7 M de un tinte de benzotriazol;

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La figura 9 es una grafica de concentracion versus intensidad Raman de la senal de 1368 cm-1 para un tinte benzotriazol utilizando una longitud de onda laser de 633 nm;

La figura 10 muestra el efecto de maduracion a temperatura ambiente de propiedades espectrales UV de un coloide de plata obtenido de acuerdo con el metodo de la invencion, utilizando fosfato de hidroxilamina como el agente de reduccion, con la figura 10a de grafica Amax contra tiempo (semanas), figura 10b grafico de ancho de banda contra tiempo y figura 10c grafico de absorbancia contra tiempo;

La figura 11 muestra el espectro SERS de riboflavina obtenida de cuatro tandas maduradas diferentes de coloide obtenida de plata al madurar a temperatura ambiente y de acuerdo con el metodo de la invencion utilizando fosfato de hidroxilamina como el agente de reduccion; y

La figura 12 muestra graficas de ancho de banda UV contra tiempo en diferentes temperaturas de maduracion en una tanda de coloide producida de acuerdo con el metodo de la invencion para reducir nitrato de plata con fosfato de hidroxilamina.

Descripcion detallada de las realizaciones ilustradas

Un metodo de ejemplo de acuerdo con la invencion comprende agregar una solucion acuosa de fosfato de hidroxilamina (volumen 100 |jl; concentracion 0.075x10-3 M con respecto a hidroxilamina) a una solucion acuosa de hidroxido de sodio (volumen de 4,5 ml, concentracion de 1.33x10-3 M) en un frasco de poliestireno y dejar que la mezcla resultante repose durante un periodo predeterminado, (idealmente durante un penodo de 3o segundos), introducir una mezcla una solucion acuosa 10-2 M de nitrato de plata (volumen 500 |jI) y mezclar las soluciones Juntas, la solucion de nitrato de plata se introduce en la mezcla rapidamente (menos de 0,5 segundos) y la mezcla se realiza con el fin de dispersar el nitrato de plata completamente en la mezcla dentro de un penodo entre 2 segundos y 30 segundos. El contenedor tapado y sellado se calienta luego de 40-50° C durante 24 horas, con Io cual se produce un coloide estable.

Para la preparacion de cloruro de oro se utiliza el mismo metodo excepto que se utiliza tetracloruro de hidrogeno en lugar de nitrato de plata.

La figura 1 compara Ios resultados anteriores obtenidos utilizando citrato de litio para reducir el nitrato de plata, con resultados mas recientes utilizando clorhidrato de hidroxilamina para reducir el nitrato de plata. La muestra es una solucion de 10-7 M de rodamina 6G agregado con solucion de 0.175 NaCI que da una concentracion final de 10-8 M del tinte. Se utiliza longitud de onda laser de 514 nm.

La figura 2 compara Ios resultados UV de mezcla 60 jI de coloide con 3 ml de agua y el analisis posterior en una cubeta de longitud de trayectoria de 1 cm. La figura 2a muestra la produccion de coloide utilizando clorhidrato de hidroxilamina como el agente de reduccion de acuerdo con el metodo de Leopold, N.; Lendl, B.; V, Chem B 2003, 107, 5723-5727. La figura 2b muestra el metodo de acuerdo con la invencion para reducir nitrato de plata con clorhidrato de hidroxilamina y la estabilidad del coloide durante un periodo de un mes. La figura 2c muestra el metodo de acuerdo con la invencion para reducir nitrato de plata con fosfato de hidroxilamina y la estabilidad del coloide durante un penodo de siete meses.

Estos resultados demuestran, por Io tanto, que Ios resultados sobresalientes alcanzador por el solicitante se relacionan con la eleccion de la sal de hidroxilamina, la relacion espedfica de Ios volumenes utilizada, la velocidad y la duracion de la mezcla, y el tamano de paidcula pequeno de Ios coloides que resultan les dan aumento de estabilidad y propiedades de dispersion de Iuz.

La figura 3a ilustra que cuando la etapa de mezcla entre el clorhidrato de hidroxilamina acuoso y el hidroxido de sodio acuoso con la solucion acuosa de nitrato de plata se realiza con el fin de alcanzar la dispersion completa dentro de 10 segundos, Ios coloides resultantes son estables y poseen propiedades de SERR y UV deseables.

La figura 3b muestra Ios resultados de estudios replicados, en donde la etapa de mezcla se realiza dentro de un corto periodo de tiempo de 2 segundos. Es evidente de Ios resultados que Ios coloides resultantes son inestables. Esto se demuestra por el hecho de que con el tiempo Ios coloides muestran signos de desestabilizacion, indicados por la reduccion de la intensidad Raman rapidamente durante un corto penodo de tiempo.

La figura 3 c muestra Ios resultados obtenidos en donde se realiza la etapa de mezcla sobre un periodo mayor de 30 segundos, esta figura indica la inestabilidad de Ios coloides resultantes y demuestra la agregacion y desestabilizacion de Ios coloides.

La figura 3b y c demuestran resultados significativamente mas pobres y coloides inestables que se obtienen cuando el periodo de mezcla se altera por encima y por debajo del periodo optimo en el que se alcanza la dispersion completa de 10 segundos.

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La figura 4a ilustra Ios resultados que muestran el aumento en sensibilidad SERRS de rodamina 6G (10-8 M) cuando se utiliza una dilucion al 50% del coloide con reduccion de HHAg con cloruro de sodio como el agente de agregacion. (514 nm).

La figura 4b ilustra Ios resultados que muestran el aumento en sensibilidad SERRS de rodamina 6G (10-8 M) cuando utiliza una dilucion al 50% del coloide con reduccion de HHAg con poli-L-lisina como el agente de agregacion (514 nm).

La figura 4C ilustra la sensibilidad SERRS de rodamina 6G (10-8 M) cuando se utiliza una dilucion al 50% del coloide HHAg sin agente de agregacion (autoagregacion) (514 nm).

La figura 5 ilustra la autoagregacion y las intensidades SERR alcanzadas para las bandas de 1375 y 1169-1 cm de las protemas unidas a hierro, CytC, Mb y Hg. Las graficas muestran condiciones SERR optimizadas (relacion de coloide: HHAg volumen de analito) para cada protema a una concentracion de 10-7 M.

La figura 6 ilustra el espectro SERR de autoagregacion de las protemas unidas a hierro, CytC, Mb y Hg (cada protema en una concentracion de 10-7 M) bajo condiciones SERR optimizadas con un coloide con reduccion de HHAg.

La figura 7 ilustra un espectro UV de un coloide de oro producido por el metodo del solicitante para reducir tetracloroaurato del hidrogeno con fosfato de hidroxilamina. El coloide se diluye mediante un factor de cinco con agua y se analiza en una cubeta de longitud de trayectoria de 1 cm.

La figura 8 ilustra una imagen TEM que muestra la agregacion de un coloide HPAg con una solucion de 7.5 x 10-6 M de 3,5-dimetoxi 4-(5'axobenzotriaxoil) fenilamina. Magnificacion = x 220,000.

La figura 9 ilustra el efecto de concentracion de 3,5-dimetoxi 4-(5'axobenzotriaxoil) fenilamina en agregacion de un coloide HPAg (un decimo de dilucion) al monitorizar la intensidad Raman de la senal de 1370 cm-1. Longitud de onda laser= 633 nm con una acumulacion 1 x 10 sec y 10% de filtro.

La figura 10 muestra el cambio en las propiedades espectrales UV durante el periodo de maduracion de temperatura ambiente de un coloide producido de acuerdo con el metodo de la invencion para reducir nitrato de plata con fosfato de hidroxilamina.

La figura 11 ilustra el espectro SERS obtenido con riboflavina en concentracion de 10^ M utilizando tandas de coloides que fueron de 6, 9, 16 y 24 semanas de edad producidas de acuerdo con el metodo de invencion para reducir nitrato de plata con fosfato de hidroxilamina y maduradas a temperatura ambiente. Estos resultados muestran que, aunque el coloide aun esta madurando hasta aproximadamente ocho semanas la intensidad SERS de riboflavina solo aumenta en menos del 5% sin aumento adicional con las tandas mas viejas. Estos resultados confirman la larga vida util, excelente reproducibilidad SERS y de tanda a tanda del coloide. La riboflavina tambien es un compuesto altamente fluorescente y el bajo nivel de fluorescencia observado se puede atribuir a las altas propiedades de apagado de fluorescencia del coloide HPAg. La Poli (L-lisina) en una concentracion de (0.01% p/v) se utiliza como el agente de agregacion. La longitud de onda laser fue de 514 nm.

Con referenda a la figura 12, las graficas ilustran el efecto de temperatura sobre el tiempo de maduracion de un coloide producido de acuerdo con metodo de la invencion para reducir nitrato de plata con fosfato de hidroxilamina. Los resultados en este ejemplo son de monitorizar Ios cambios en el ancho de banda UV de la solucion de coloide (60 |jI diluido en 3 ml de agua) en una cubeta de longitud de trayectoria 1 cm y muestra como el periodo de maduracion reduce cuando aumenta la temperatura.

Los datos presentados aqm son Ios resultados de llevar a cabo un rango extendido de estudios de estabilidad en recipientes de poliestireno y vidrio y en un rango de temperaturas.

Los coloides de fosfato de hidroxilamina (coloides HPAg), cuando se producen en contenedores de poliestireno inicialmente, exhiben un espectro UV con un valor Amax de normalmente 395 nm, un ancho de banda de 57 nm y una absorbancia de 0.280. Cualquier tanda de coloide producida sobre un periodo de normalmente 8 semanas (periodo de maduracion) mostrara una reduccion en Amax hasta 389±1 nm, con una reduccion correspondiente en el ancho de banda hasta 28±2 nm y aumento en la absorbencia hasta 0.475±25. Despues que se han encontrado que estos valores permanecen constantes durante 20 semanas, como se puede observar en la figura 10. Tandas de coloides preparados en contenedores de vidrio muestran las mismas caractensticas UV iniciales pero dentro de 4 semanas pierden estabilidad y Ios agregados de plata cae fuera de la solucion. Por Io tanto, se prefiere material de poliestireno para la preparacion y almacenamiento del coloide.

La espectroscopia Raman de muestras de maduracion muestra el aumento gradual de la intensidad SER(R)S y luego despues de un penodo de maduracion de 8 semanas permanece constante (Figura 11). Estudios TEM no indican cambio en el tamano o distribucion de partmulas de las partmulas coloidales de plata. A partir de esto, estos

resultados UV, Raman y TEM postulan que cuando se prepara primero el coloide, las partfculas de plata del mlsmo tamano se forman pero se mantienen Juntas en grumos muy pequenos, posiblemente mediante fuerzas de enlace de hidrogeno debil. Posiblemente en la maduracion por interaccion con una superficie del recipiente, grumos pequenos se disocian en partfculas de plata coloidales individuales.

5

Los cambios observados en las propiedades UV del coloide soportan fuertemente la postulacion y si solo hay una fuerza de union debil entre las partfculas entonces se concluyo que calentar la solucion coloide ayudana a la disociacion de los grumos de partfculas. Esto se confirmo al monitorizar las propiedades UV de muestras de coloides almacenadas en contenedores de poliestireno sobre un rango de temperaturas entre 4 y 550C. Los penodos de 10 maduros de las soluciones coloidales se reducen dramaticamente cuando las muestras se mantuvieron a temperaturas por encima de temperatura ambiente con la reduccion del periodo de maduracion cuando aumenta la temperatura como se puede observar de la figura 12.

Las propiedades UV de estos coloides madurados coincide que aquellos obtenidos para coloides madurados a 15 temperatura ambiente. De manera similar, la supervision Raman de coloides durante estos penodos de maduracion muestra un aumento en la intensidad SER(R)S, pero una vez maduros la intensidad permanece constante y coincide con aquella de un coloide madurado a temperatura ambiente. No se detectaron cambios en las propiedades UV para las muestras almacenadas a 40c.

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Claims

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10

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25

30

35

40

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reivindicaciones

1. Un metodo de producir una solucion de coloide metalico, que comprende agregar una solucion acuosa de una sal de hidroxilamina a una solucion acuosa de un alcali y luego agregar una solucion acuosa de los iones metalicos, caracterizado por seleccionar fosfato de hidroxilamina como la sal de hidroxilamina e introducir la solucion de iones metalicos mediante inyeccion rapida a traves de un chorro de alta velocidad de tal manera que los iones metalicos se dispersan a traves de la mezcla dentro de un segundo.
2. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el metal es plata.
3. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 2, en el que la solucion acuosa de iones metalicos es una solucion de

nitrato de plata.
4. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el metal es oro.
5. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 4, en el que la solucion acuosa de iones metalicos es una solucion de

tetracloroaurato de hidrogeno.
6. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el volumen de la mezcla en la que la solucion de ion metalico se introduce es menor de 5 cm3.
7. Un metodo de acuerdo con cualquier reivindicacion precedente, en el que despues de introduccion de la solucion de ion metalico la mezcla se somete a mezcla adicional durante un periodo de entre 2 segundos y 30 segundos.
8. Un metodo de acuerdo con cualquier reivindicacion precedente, en el que el alcali es hidroxido de sodio.
9. Un metodo de acuerdo con cualquier reivindicacion precedente, en el que la concentracion de la sal hidroxilamina es 0.075 x 10-3 M.
10. Un metodo de acuerdo con cualquier reivindicacion precedente, en el que la concentracion de alcali es 1.33 x 103 M.
11. Un metodo de acuerdo con cualquier reivindicacion precedente, en el que el tamano de partfcula resultante en el coloide es 19±9nm.
12. Un metodo de acuerdo con cualquier reivindicacion precedente, que comprende llevar a cabo la introduccion y dispersion en un contenedor hecho de poliestireno.
13. Un metodo de acuerdo con cualquier reivindicacion precedente, que comprende madurar la solucion de coloide a una temperatura por encima de la temperatura ambiente durante un periodo predeterminado con lo cual mejora la estabilidad.
14. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 13, que comprende madurar la solucion de coloide a una temperatura en el rango de 40o a 50oC.