ES2622840T3

ES2622840T3 - Uso de una holotoxina para reducir la degradación asociada al retículo endoplásmico de proteínas mal plegadas

Info

Publication number: ES2622840T3
Application number: ES10811085.9T
Authority: ES
Inventors: Clifford Lingwood
Original assignee: Hospital for Sick Children HSC
Current assignee: Hospital for Sick Children HSC
Priority date: 2009-08-28
Filing date: 2010-08-27
Publication date: 2017-07-07
Anticipated expiration: 2030-08-27
Also published as: JP2013503112A; EP2470192B1; IN2012DN02705A; CA2772441C; US20140371130A1; US20120201853A1; EP2470192A1; US9901612B2; EP2470192A4; WO2011022843A1; AU2010286248A1; CA2772441A1

Abstract

Una composición para su uso en el tratamiento de una enfermedad relacionada con ERAD, tal como artritis, fibrosis quística, enfermedad del almacenamiento lisosómico de glucoesfingolípidos, dislipidemia, hipertensión, biosíntesis del colesterol, enfermedad de la alfa 1-antitripsina, enfermedad de Gaucher, enfermedad por infección por VIH, síndrome de Robinow, síndrome de Walker-Warburg, amaurosis congénita de Leber, tipo 1, deficiencia de la acetilcolinesterasa de la placa terminal, neuropatía de Charcot-Marie-Tooth 1B, defecto del transporte de la glucosa, proteinosis alveolar pulmonar, telangiectasia hemorrágica hereditaria, hipertensión pulmonar primaria familiar, eritroqueratodermia variable, enfermedad de Tangier y deficiencia de HDL, síndrome de Smith-Lemli-Opitz, desmosterolosis y estenosis aórtica supravalvular, donde dicha composición comprende una holotoxina modificada que es capaz de experimentar transporte retrógrado al retículo endoplásmico y un adyuvante farmacéuticamente aceptable, donde la holotoxina modificada comprende una subunidad A inactivada.

Description

DESCRIPCIÓN

Uso de una holotoxina para reducir la degradación asociada al retículo endoplásmico de proteínas mal plegadas

CAMPO DE LA INVENCIÓN 5

La invención se refiere a un procedimiento de bloqueo de la degradación asociada al RE de proteínas mal plegadas. La invención se refiere además al uso de una holotoxina para bloquear la degradación mediada por ERAD de proteínas mal plegadas.

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ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El retículo endoplásmico desempeña un papel clave en el control de calidad de la traducción de proteína y la modificación postraduccional. Están presentes muchos sistemas en el RE para la detección de proteínas mal plegadas. La selección para formación de complejos y eliminación por degradación proteolítica después de 15 retrotranslocación desde el RE al citosol es el principio central de este proceso (ERAD - Degradación asociada con el retículo endoplásmico). A su vez, así se regula la respuesta de las proteínas no plegadas y otras vías de señalización relacionadas con la tensión del RE.

En muchas enfermedades genéticas, tal vez todas, existen mutaciones que no afectan a la función primaria de la 20 proteína dada pero provocan algunos cambios pequeños en el plegamiento de la proteína dentro del RE, de manera que se reconoce como una proteína mal plegada para iniciar este mecanismo de control de calidad, de manera que la proteína se degrada y no se le permite madurar mediante el transporte anterógrado a través del Golgi/TGN/vesículas secretoras en la superficie celular o secreción.

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Se han descrito numerosos procedimientos ingeniosos que intentan rescatar dichas proteínas mutantes funcionales aunque mal plegadas y degradadas, para permitir el escape, la maduración y el tráfico de ERAD hasta el lugar correcto para la inversión funcional del fenotipo patógeno. Entre ellos se incluye el uso de chaperonas químicas, inhibidores de chaperonas, sustratos o inhibidores enzimáticos. Entre las enfermedades en las que se estudian de forma intensiva estos enfoques están la artritis, la fibrosis quística, enfermedades de almacenamiento lisosómico, 30 aspectos de la dislipidemia, la hipertensión, la biosíntesis del colesterol y la enfermedad de la α1-antitripsina.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

En un primer aspecto de la invención, se proporciona una composición para su uso en el tratamiento de una 35 enfermedad relacionada con ERAD, tales como artritis, fibrosis quística, enfermedad del almacenamiento lisosómico de glucoesfingolípidos, dislipidemia, hipertensión, biosíntesis del colesterol, enfermedad de la alfa 1-antitripsina, enfermedad de Gaucher, enfermedad por infección por VIH, síndrome de Robinow, síndrome de Walker-Warburg, amaurosis congénita de Leber, tipo 1, deficiencia de la acetilcolinesterasa de la placa terminal, neuropatía de Charcot-Marie-Tooth 1B, defecto del transporte de la glucosa, proteinosis alveolar pulmonar, telangiectasia 40 hemorrágica hereditaria, hipertensión pulmonar primaria familiar, eritroqueratodermia variable, enfermedad de Tangier y deficiencia de HDL, síndrome de Smith-Lemli-Opitz, desmosterolosis y estenosis aórtica supravalvular, donde dicha composición comprende una holotoxina modificada que es capaz de experimentar transporte retrógrado al retículo endoplásmico y un adyuvante farmacéuticamente aceptable, donde la holotoxina modificada comprende una subunidad A inactivada. 45

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

A continuación se describirá la presente invención en más detalle con referencia a las siguientes figuras:

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la Figura 1 ilustra un plásmido que muestra una subunidad A inactivada que contiene VT1 de acuerdo con una realización de la presente invención;

la Figura 2 es un western blot que muestra VT y VT1 inactivada que protege ΔF508CFTR de ERAD;

la Figura 3 es un western blot que muestra VT y VT inactivada que protegen MDR1 mal plegada de ERAD; y

la Figura 4 es un western blot que muestra la toxina del cólera que protege ΔF508CFTR de ERAD en células HeLa y 55 BHK.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS REALIZACIONES PREFERIDAS

La presente invención proporciona el uso de una holotoxina en el que la subunidad A ha sido inactivada opcionalmente para el transporte retrógrado desde la superficie celular al RE y para bloquear parcialmente el translocón Sec61 situado en el RE, para permitir que las proteínas mutantes parcialmente mal plegadas pero funcionalmente competentes escapen a la degradación asociada al RE (ERAD) y rescaten el fenotipo celular defectuoso. 5

Cualquier holotoxina que experimente transporte retrógrado al RE donde la subunidad A activada proteolíticamente se separa de las subunidades B y es translocada en el citosol por medio del translocón Sec61 puede emplearse para su uso con el fin de rescatar proteínas mutantes parcialmente mal plegadas pero funcionalmente competentes con el fin de escapar a la degradación asociada al RE (ERAD). Los ejemplos de holotoxinas adecuadas para su uso de 10 acuerdo con la presente invención incluyen la ricina, las toxinas Shiga o similares a Shiga (tales como verotoxina - VT1), la toxina del cólera, abrina modecina, exotoxina A de Pseudomonas y toxina codificada por plásmidos (Pet) de Escherichia coli de enteroagregación. La toxina del cólera, la verotoxina y la ricina unidas a la superficie celular experimentan transporte retrógrado al RE donde la subunidad A activada proteolíticamente se separa de las subunidades B y es translocada en el citosol por medio del translocón Sec61. Este es el mismo translocón usado en 15 la vía de degradación asociada al RE para eliminar las proteínas no plegadas para su ubicuitinación y su digestión citosólica por el proteosoma.

La subunidad A de la holotoxina seleccionada puede inactivarse para su uso de acuerdo con la presente invención. Los procedimientos de inactivación de la subunidad A de una holotoxina están bien establecidos en la técnica e 20 incluyen, por ejemplo, residuos mutantes dentro de la subunidad A que son necesarios para la actividad de la subunidad A. En una realización de la presente invención, una verotoxina 1 no tóxica, mutada en residuos cruciales en el sitio activo de la subunidad A, por ejemplo mutaciones tales como Y77S y E167Q, es adecuada para su uso. También pueden obtenerse variaciones las mutaciones referidas anteriormente, y en particular en los aminoácidos usados en las mutaciones referidas anteriormente, y las mostradas en la Figura 1, siempre que las mutaciones 25 inactiven la subunidad A.

La subunidad A es translocada en el citosol pero no puede inhibir la síntesis de proteínas. Así, la subunidad A, opcionalmente inactivada, actúa como un inhibidor competitivo de la ocupación de translocones con el fin de realizar el rescate de una proteína mutante parcialmente mal plegada pero funcionalmente competente de ERAD. Por 30 ejemplo, la subunidad A de verotoxina 1, opcionalmente inactivada, es efectiva para el rescate de ΔF508CFTR mutante.

La subunidad A puede ser modificada adicionalmente, por medios conocidos en la técnica, para proporcionar un inhibidor más eficiente del translocón y un bloqueo mejorado de ERAD. Las modificaciones adecuadas incluyen la 35 adición de una entidad, tal como una secuencia de péptidos, a la subunidad A que fomenta adicionalmente la función de la subunidad A de inhibición del translocón. Por ejemplo, podría añadirse una secuencia de hexahistidina, mostrada para bloquear el canal de la toxina diftérica o una secuencia de 18-25 péptidos apolares (una secuencia de final de transferencia) de las proteínas secretoras/de membrana translocadas (por ejemplo, de la glucoforina o del receptor LDL) para intentar bloquear el paso del translocón. Otro enfoque incluye el acoplamiento de un inhibidor 40 Sec61, tal como CAM741, a la subunidad A, o el acoplamiento de un inhibidor que bloquea la degradación de proteínas asociada al retículo endoplásmico (RE) tal como el inhibidor químico, Eeyarestatina I (Eerl).

Tal como se indicó anteriormente, en una realización, la presente invención proporciona el uso de verotoxina, también referida como toxina Shiga y similar a Shiga, y en particular una subunidad A de verotoxina mutada no 45 tóxica, como un mecanismo para dirigirse al RE con el fin de rescatar funcionalmente proteínas genéticamente mal plegadas pero funcionales mediante el bloqueo del translocón. Podría usarse el término "cirugía intracelular" para describir el proceso expuesto en la presente memoria descriptiva.

En una realización alternativa, se usa una toxina del cólera que incluye una subunidad A mutada no tóxica, tal como 50 se describe en la presente memoria descriptiva. En una realización alternativa, se usa una toxina de ricina que incluye una subunidad A mutada no tóxica, tal como se describe en la presente memoria descriptiva. A partir de lo anterior se entenderá, que aunque la realización de la presente invención que usa una subunidad A de verotoxina mutada puede comprender sólo la subunidad A mutada, las toxinas del cólera y de ricina incluirán las subunidades B y las subunidades A mutadas. 55

En otra realización, los fragmentos de anticuerpos Fab o sus fagos análogos pueden dirigirse al RE para el suministro selectivo de proteínas de unión dentro del compartimento subcelular.

La presente invención incluye además el uso de modificaciones de la subunidad A para aumentar la retención dentro del translocón con el fin de incrementar la eficacia del enfoque descrito en la presente memoria descriptiva. La presente invención incluye también el uso de dichas quimeras de subunidad A transferidas en una toxina de ricina inactivada para proporcionar una terapia de base más amplia para reducir la ERAD de proteínas parcialmente mal plegadas en cualquier tejido. Además, la presente invención proporciona una subunidad A, tal como se describe en 5 la presente memoria descriptiva, que puede ser modificada adicionalmente para transportar varias moléculas que podrían ser beneficiosas para mejorar defectos en el tráfico, la función, la ordenación, la glucosilación y otras modificaciones postraduccionales de las proteínas, lo que incluye chaperonas que ayudan al plegamiento de las proteínas mutantes dentro de la luz del retículo endoplásmico, por ejemplo, ambroxol que estabiliza la glucocerebrosidasa mutante en la enfermedad de Gaucher. 10

Se proporciona también un procedimiento para tratar una enfermedad resultante de o que se deriva por otros medios de ERAD, por ejemplo una enfermedad relacionada con la ERAD. El procedimiento comprende la administración a un sujeto, tal como un mamífero o un no mamífero, de una holotoxina en la que la subunidad A está opcionalmente inactivada. El término "mamífero" se usa en la presente memoria descriptiva para referirse a mamíferos humanos y 15 no humanos, por ejemplo gatos, perros y caballos.

Las enfermedades relacionadas con ERAD son enfermedades en las que la ERAD en sí es esencialmente el instigador de la enfermedad, por las que se eliminan proteínas mutantes funcionales pero parcialmente mal plegadas, lo que conduce a los síntomas de la enfermedad. En algunas enfermedades la degradación ERAD elimina 20 una proteína ligeramente mal plegada pero, por lo demás, funcional, para provocar un estado patológico. Todas estas enfermedades son candidatas para terapia basada en el enfoque del bloqueo del translocón descrita en la presente memoria descriptiva. Así, la enfermedad relacionada con ERAD incluye, pero no se limita a, artritis, fibrosis quística, enfermedades de almacenamiento lisosómico de glucoesfingolípidos, aspectos de dislipidemia, hipertensión, biosíntesis del colesterol, enfermedad de la α1-antitripsina, enfermedad de Gaucher y enfermedad por 25 infección por VIH. En la Tabla 1 mostrada a continuación se recogen otras enfermedades relacionadas con ERAD que son candidatas para terapia basada en el enfoque divulgado en la presente memoria descriptiva, mostrada anteriormente en Human Molecular Genetics 2005 14(17):2559-2569. Los genes enumerados en la Tabla 1 son los identificados como fuertes candidatos a la retención del RE. Incluyen enfermedades donde la localización de la mutación o los datos experimentales sugieren un defecto en el plegamiento o el tráfico. Se entenderá que las 30 enfermedades enumeradas en la presente memoria descriptiva incluyen algunas de las enfermedades conocidas que se asocian actualmente con la degradación ERAD. Se entenderá que todas y cualquiera de las enfermedades que se asocian según lo que se sabe con la degradación ERAD se contemplan también dentro del alcance de la presente invención.

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Tabla 1

Gen: Enfermedad Sistema afectado Efecto potencial de la mutación o mutaciones patógenas

ROR2: Síndrome de Robinow Esquelético, corazón Disrupción en plegamiento de proteínas

POMTI: Síndrome de Walker-Warburg Musculoesquelético Disrupción en TMD

GUCY2D: Amaurosis congénita de Leber, tipo I Ocular Referida posible retención en el REa

COLQ: Deficiencia de la acetilcolinesterasa de la placa terminal Muscular Disrupción en plegamiento de proteínas

MPZ: Neuropatía de Charcot-Marie-Tooth 1B Neurológico Referida posible retención en el REb

SLC2A1: Defecto del transporte de la glucosa Barrera hematoencefálica Disrupción en TMD

CSF2RB: Proteinosis alveolar pulmonar Pulmón Disrupción en estructura terciaria

ACVRL1: Telangiectasia hemorrágica hereditaria Vascular/pulmonar Referida posible retención en el REc

BMPR2: Hipertensión pulmonar primaria familiar Vascular/pulmonar Disrupción en plegamiento de proteínas

GJB3: Eritroqueratodermia variable Piel Referida posible retención en el REd

GJB4: Eritroqueratodermia variable Piel Disrupción en TMD

ABCA1: Enfermedad de Tangier y Cardiovascular Disrupción en plegamiento de deficiencia de HDL proteínas

DHCR7: Síndrome de Smith-Lemli-Opitz Cardiovascular Disrupción en plegamiento de proteínas

DHCR24: Desmosterolosis Cardiovascular Disrupción en plegamiento de proteínas

ELN: Estenosis aórtica supravalvular Cardiovascular Disrupción en plegamiento de proteínas

La holotoxina puede administrarse en solitario o en combinación con al menos un adyuvante farmacéuticamente aceptable. La expresión "farmacéuticamente aceptable" significa aceptable para su uso en las técnicas farmacéutica y veterinaria, es decir, que no es inaceptablemente tóxico o inadecuado por otro motivo. Los ejemplos de adyuvantes farmacéuticamente aceptables incluyen diluyentes, excipientes y similares. Puede hacerse referencia a 5 "Remington's: The Science and Practice of Pharmacy", 21ª ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005, como orientación sobre formulaciones farmacológicas en general. La selección del adyuvante depende del modo de administración pretendido de la composición. En una realización de la invención, los compuestos se formulan para su administración por infusión, o por inyección ya sea por vía subcutánea o intravenosa, y se usan en consecuencia como soluciones acuosas en forma estéril o libre de pirógenos y opcionalmente con tampón o convertida en 10 isotónica. Así, los compuestos pueden administrarse en agua destilada o, más de forma más conveniente, en suero salino con tampón de fosfato o solución de dextrosa al 5%. Las composiciones para administración oral mediante comprimido, cápsula o suspensión se preparan usando adyuvantes que incluyen azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones tales como almidón de maíz y almidón de patata; celulosa y derivados de la misma, que incluyen carboximetilcelulosa, etilcelulosa y acetato de celulosa sódicos; tragacanto en polvo; malta; gelatina; 15 talco; ácidos esteáricos; estearato de magnesio; sulfato de calcio; aceites vegetales, tales como aceites de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de sésamo, aceite de oliva y aceite de maíz; polioles tales como propilenglicol, glicerina, sorbital, manitol y polietilenglicol; agar; ácidos algínicos; agua; suero salino isotónico y soluciones con tampón de fosfato. También pueden estar presentes agentes de humectación, lubricantes tales como laurilsulfato de sodio, estabilizadores, agentes de formación de comprimidos, antioxidantes, conservantes, agentes 20 colorantes y agentes saborizantes. Pueden prepararse cremas, lociones y pomadas para aplicación tópica usando una base apropiada tal como una base de triglicéridos. Dichas cremas, lociones y pomadas también pueden contener un agente activo de superficie. También pueden prepararse formulaciones de aerosol, por ejemplo, para administración nasal, en las que se usan adyuvantes propelentes adecuados. También pueden añadirse otros adyuvantes a la composición con independencia de cómo se administre, por ejemplo, pueden añadirse agentes 25 antimicrobianos a la composición para prevenir el crecimiento microbiano durante periodos de almacenamiento prolongados.

Además, la presente invención proporciona el control de la dosificación de la subunidad A mutante o no mutante que contiene la holotoxina que se usa. La dosificación de la holotoxina puede ajustarse de manera que la inhibición 30 competitiva sea parcial. En algunas aplicaciones un escape de ERAD de hasta aproximadamente el 10% podría ser suficiente para corregir el fenotipo defectuoso y un experto en la materia puede determinar fácilmente las dosificaciones apropiadas para conseguir esta corrección. Como entenderá un experto en la materia, la dosificación puede variar con la holotoxina que se use, la enfermedad o dolencia que se trate y el sujeto que se trate. En una realización, pueden usarse dosificaciones de holotoxina en el intervalo de aproximadamente 1 a 100 ng/kg, por 35 ejemplo 10 ng/kg.

Una aplicación de la presente invención proporciona un nuevo enfoque viable para el rescate de la mutación ΔF508 CFTR con el fin de incrementar el transporte de cloruro en células CF. La presente invención proporciona un nuevo enfoque terapéutico para la mutación más común en la fibrosis quística. 40

La subunidad A que contiene holotoxina tal como se describe en la presente memoria descriptiva también puede usarse como antídotos para las toxinas parentales dado que se prevendrá la translocación RE de la subunidad A natural debido al bloqueo parcial, por la subunidad A inactivada catalíticamente que contiene holotoxina, del translocón. En una realización de la presente invención la subunidad A inactivada que contiene holotoxina incluye 45 una secuencia de final de transferencia. Los ejemplos del tipo de secuencia de final de transferencia incluyen, pero no se limitan a, VFIVSVGSFITSVLFIVI o secuencias de final de transferencia que tienen 9-18 residuos de leucina. También pueden realizarse variaciones en la longitud de la secuencia anterior y las extensiones pueden añadirse en dos etapas.

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La presente invención también proporciona una subunidad A de holotoxina VT1 con la adición de una secuencia de final de transferencia de polileucina. La secuencia de final de transferencia puede añadirse al extremo N de la subunidad A inactivada de VT1. Las secuencias de final de transferencia comprenden en general aproximadamente 9-18 residuos de aminoácidos hidrófobos. Esta secuencia puede añadirse en el extremo N de la subunidad A de VT1 para incrementar la eficiencia de bloqueo del translocón. Además, la adición de dos aminoácidos básicos al extremo C de la secuencia de final de transferencia aumenta la eficiencia de final de translocación. Por tanto, también pueden añadirse dos lisinas en el extremo C de la adición de final de transferencia de polileucina. En cambio, se ha 5 demostrado que la adición de residuos de aminoácidos negativos en el extremo C reduce la eficiencia del final de translocación. Por tanto, la adición de una secuencia de final de transferencia a la subunidad A de VT1 puede reducir la síntesis bacteriana de la holotoxina modificada. La colocación de cargas negativas en el extremo C y de cargas positivas en el extremo N del inserto de polileucina puede favorecer la función de final de transferencia durante el tránsito retrógrado, y no anterógrado, a través del translocón Sec61, es decir, la secuencia de final de transferencia 10 debería tener un efecto mínimo durante la síntesis bacteriana de toxinas pero un efecto máximo cuando se dirige al RE y se somete a retrotranslocación a través del translocón hasta el citosol, aunque no se conoce la orientación de la subunidad A de VT1 cuando entra en el translocón (es decir, primero en el extremo N o C). La presente invención incluye construcciones en las que el motivo de dilisina básico se incluye en el extremo C y se incorpora un dímero ácido de ácido aspártico en el extremo N del inserto de polileucina y a la inversa. Las construcciones de holotoxina 15 pueden expresarse en un vector, tal como puc19, y la holotoxina preparada puede purificarse mediante cromatografía de afinidad Gbsubunidad A inactivada de VT1. Las secuencias de final de transferencia comprenden en general aproximadamente 9-18 residuos de aminoácidos hidrófobos. Esta secuencia puede añadirse en el extremo N de la subunidad A de VT1 para incrementar la eficiencia de bloqueo del translocón. Además, la adición de dos aminoácidos básicos al extremo C de la secuencia de final de transferencia aumenta la eficiencia de final de translocación. Por tanto, también pueden añadirse dos lisinas en el extremo C de la adición de final de transferencia de polileucina. En cambio, se ha 5 demostrado que la adición de residuos de aminoácidos negativos en el extremo C reduce la eficiencia del final de translocación. Por tanto, la adición de una secuencia de final de transferencia a la subunidad A de VT1 puede reducir la síntesis bacteriana de la holotoxina modificada. La colocación de cargas negativas en el extremo C y de cargas positivas en el extremo N del inserto de polileucina puede favorecer la función de final de transferencia durante el tránsito retrógrado, y no anterógrado, a través del translocón Sec61, es decir, la secuencia de final de transferencia 10 debería tener un efecto mínimo durante la síntesis bacteriana de toxinas pero un efecto máximo cuando se dirige al RE y se somete a retrotranslocación a través del translocón hasta el citosol, aunque no se conoce la orientación de la subunidad A de VT1 cuando entra en el translocón (es decir, primero en el extremo N o C). La presente invención incluye construcciones en las que el motivo de dilisina básico se incluye en el extremo C y se incorpora un dímero ácido de ácido aspártico en el extremo N del inserto de polileucina y a la inversa. Las construcciones de holotoxina 15 pueden expresarse en un vector, tal como puc19, y la holotoxina preparada puede purificarse mediante cromatografía de afinidad Gbsubunidad A inactivada de VT1. Las secuencias de final de transferencia comprenden en general aproximadamente 9-18 residuos de aminoácidos hidrófobos. Esta secuencia puede añadirse en el extremo N de la subunidad A de VT1 para incrementar la eficiencia de bloqueo del translocón. Además, la adición de dos aminoácidos básicos al extremo C de la secuencia de final de transferencia aumenta la eficiencia de final de translocación. Por tanto, también pueden añadirse dos lisinas en el extremo C de la adición de final de transferencia de polileucina. En cambio, se ha 5 demostrado que la adición de residuos de aminoácidos negativos en el extremo C reduce la eficiencia del final de translocación. Por tanto, la adición de una secuencia de final de transferencia a la subunidad A de VT1 puede reducir la síntesis bacteriana de la holotoxina modificada. La colocación de cargas negativas en el extremo C y de cargas positivas en el extremo N del inserto de polileucina puede favorecer la función de final de transferencia durante el tránsito retrógrado, y no anterógrado, a través del translocón Sec61, es decir, la secuencia de final de transferencia 10 debería tener un efecto mínimo durante la síntesis bacteriana de toxinas pero un efecto máximo cuando se dirige al RE y se somete a retrotranslocación a través del translocón hasta el citosol, aunque no se conoce la orientación de la subunidad A de VT1 cuando entra en el translocón (es decir, primero en el extremo N o C). La presente invención incluye construcciones en las que el motivo de dilisina básico se incluye en el extremo C y se incorpora un dímero ácido de ácido aspártico en el extremo N del inserto de polileucina y a la inversa. Las construcciones de holotoxina 15 pueden expresarse en un vector, tal como puc19, y la holotoxina preparada puede purificarse mediante cromatografía de afinidad Gb

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La eficacia del final de transferencia se corresponde aproximadamente con la hidrofobia de la secuencia de aminoácidos aunque existen variaciones y excepciones, tal como se describe en Saaf A., Wallin E, von Heijne G. Eur J Biochem 1998, 251:821-829. La secuencia de final de transferencia CFIVSVGSFITSVLFIVI, puede fusionarse con la subunidad A de VT1, de nuevo en las dos orientaciones. Puede usarse la tecnología de extensión de cebadores por PCR para añadir la secuencia en el extremo 5' del gen de la subunidad A de VT1. La secuencia completa puede 25 prepararse en dos etapas, añadiendo 9 aminoácidos en cada una. La holotoxina puede purificarse mediante cromatografía de afinidad tal como se describe anteriormente.

A continuación se describirá la presente invención en los ejemplos siguientes que no deben entenderse como limitativos. 30

Ejemplo 1 - Uso de VT1 para el rescate de ∆F508CFTR de la degradación

El tratamiento de ΔF508CFTR que expresa células HeLa con VT1 natural o VT1 inactiva, tal como se describe anteriormente (residuos catalíticos en la subunidad A necesarios para la despurinación mutada) mostró pronto un 35 claro rescate de ΔF508CFTR en relación con la degradación, en un plazo de 2 a 4 horas desde el tratamiento con la toxina.

Tal como se muestra en la Figura 2, las células HeLa transfectadas para expresar CFTR natural o ΔF508CFTR fueron tratadas con verotoxina 1 o VT1 que contenía una subunidad A inactivada. La preparación de la toxina 40 inactivada fue menos pura que la VT1 natural y se usó por tanto a una concentración superior. El grado de expresión de CFTR se determinó mediante Western blot del extracto celular. En células que expresan CFTR natural, se detectan las especies de CFTR glucosiladas de lactosamina superiores inmaduras (núcleo glucosilado) y maduras. Para ΔF508CFTR sólo se detectan las especies glucosiladas en núcleo inferiores. El CFTR natural se somete a ERAD y el tratamiento con VT1 produce un ligero incremento del CFTR natural debido a bloqueo ERAD. Para 45 ΔF508CFTR tanto la VT1 inactivada como la natural indujeron un aumento de hasta 10 veces en el grado de expresión comparado con células de control no tratadas lo que indicaba un escape significativo de ERAD.

Ejemplo 2 - Uso de VT1 para el rescate de mutante de MDRI

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Para confirmar adicionalmente la inhibición de ERAD se observó el efecto de VT1 y de VT1 mutante inactiva en las células HeLa transfectadas para expresar un mutante mal plegado (G268V) de MDR1, la bomba de eflujo del fármaco (descrita en Loo TW, Clarke DM, FASEB J 1999; 13: 1724-1732). De nuevo, tanto la VT1 como la VT1 mutante indujeron la acumulación de MDR1 que además fue degradado por ERAD, tal como se muestra en la Figura 3. Se observó un incremento de 5-20 veces en el grado del mutante G268V MDR1 expresado en células HeLa 55 después de 2 h de tratamiento con la holotoxina VT1 inactivada o natural.

Ejemplo 3 - Uso de toxina del cólera para el rescate de ΔF508CFTR

Se determinó el efecto de la toxina del cólera en la expresión de ΔF508CFTR en las células BHK, no sensibles a VT1 pero, como la mayoría de las células, sensibles a la toxina del cólera. Se demostró que la toxina inducía el escape de ERAD de ΔF508CFTR en estas células, tal como se muestra en la Figura 4. Las células HeLa transfectadas con ΔF508CFTR en las células BHK transfectadas con ΔF508CFTR o natural fueron tratadas con toxina del cólera durante 2 horas y el grado de ΔF508CFTR o natural objeto de seguimiento mediante western blot. 5 Una cantidad de 10 ng/ml de toxina del cólera indujo un aumento de hasta 5 veces ΔF508CFTR. El incremento se observó tanto en células BHK como en células HeLa dado que la toxina del cólera se une a gangliósido GMl, expresado en estas dos líneas celulares.

Ejemplo 4 - Uso de VT1 para el rescate de GCC células en la enfermedad de Gaucher 10

La VT1 reduce ERAD de la enzima GCC (glucocerebrosidasa) en las células de la enfermedad de Gaucher, lo que permite que madure más cantidad de enzimas y que se reduzca potencialmente la acumulación de glucosilceramida responsable de la enfermedad.

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Ejemplo 5 - Construcción de secuencia de final de transferencia que contiene verotoxina inactivada

Se prepararon dos construcciones diferentes para generar aminoácido de final de transferencia que contenía proteína verotoxina A inactivada. Una tenía 9 aminoácidos de final de transferencia de leucina y la otra construcción tenía una secuencia de 18 aminoácidos aleatorios. Se usaron los dos conjuntos de cebadores de PCR (Tabla 2) 20 para generar cada aminoácido de final de transferencia que contenía la proteína A de verotoxina inactivada. La primera amplificación por PCR introdujo 9 leucinas o 18 aminoácidos aleatorios en la secuencia de proteína A de verotoxina inactivada usando plásmido pSW09 (Vaccine 2006, 24:1142). La segunda PCR usó dos cebadores externos y amplificó una proteína A de verotoxina inactivada completa que contenía un aminoácido de final de transferencia. El plásmido pSW09 tiene dos mutaciones en la secuencia de VTA: Y77S y E167Q. Los fragmentos de 25 ADN fueron digeridos con BamHI y EcoRI y se ligaron en pSK+ (Stratagene). Los plásmidos resultantes eran secuencia de final de transferencia que contenía verotoxina A mutante.

Construcción de aminoácidos de final de transferencia que contienen proteína VTA inactivada

Se preparan dos construcciones diferentes para generar aminoácidos de final de transferencia que contienen 30 proteína A de verotoxina inactivada. Una tiene aminoácidos de final de transferencia de 9 leucinas (JBC, 1991, 266:9251) y la otra construcción tiene una secuencia de 18 aminoácidos aleatorios (EJB, 1998, 251:821). Los dos conjuntos de cebadores de PCR (Tabla 1) se usan para generar cada aminoácido de final de transferencia que contiene la proteína A de verotoxina inactivada. La primera amplificación por PCR introduce 9 leucinas o 18 aminoácidos aleatorios en la secuencia de proteína A de verotoxina inactivada usando el plásmido pSW09 (Vaccine 35 2006, 24:1142). La segunda PCR usa dos cebadores externos y amplifica la proteína A de verotoxina inactivada completa que contiene el aminoácido de final de transferencia. El plásmido pSW09 tiene dos mutaciones en la secuencia VTA: Y77S y E167Q. Los fragmentos de ADN son digeridos con BamHI y EcoRI y se ligan en pSK+ (Stratagene). Los plásmidos resultantes son secuencias de final de transferencia que contienen verotoxina A mutante. 40

Tabla. Conjunto de oligonucleótidos para introducir secuencias de final de transferencia

Cebadores: Secuencia

9 leucinas-directos externos: 5′-GTGGATCCTCAAGGAGTATTG-3′

9 leucinas-inversos internos: 5′-CGAGAAGTCTAAGGTAAATTCCTT CAG GAG CAA CAG TAG AG GAG CAA CGCCACCACATTAACTGA-3′

9 leucinas-directos internos: 5′-TCAGTTAATGTGGTGGCG TTG(L) CTC(L) CTT(L) CTA(L) CTG(L) TTG(L) CTC(L) CTG(L) AAGGAATTTACCTTAGACTTCTCG-3′

9 leucinas-inversos externos: 5′-GTGAATTCAACAACTGACTG-3′

18 aminoácidos aleatorios-directos externos: 5′-GTGGATCCTCAAGGAGTATTG-3′

18 aminoácidos aleatorios-inversos internos: 5′-CGAGAAGTCTAAGGTAAATTCCTT GAT GAC GAT GAA AAG GAC ACT AGT CAT GAA ACT ACC CAC GCT GAC GAT GAA GAC CGCCACCACATTAACTGA-3′

18 aminoácidos aleatorios-directos internos: 5′-TCAGTTAATGTGGTGGCG GTC(V) TTC(F) ATC(I) GTC(V) AGC(S) GTG(V) GGT(G) AGT(S) TTC(F) ATG(I) ACT(T) AGT(S) GTC(V) CTT(L) TTC(F) ATC(I) GTC(V) ATC(I) AAGGAATTTACCTTAGACTTCTCG-3′

18 aminoácidos aleatorios-inversos externos: 5′-GTGGAATTCAACAACTGACTG-3′

( ) denota letra de codón de aminoácido.

Si bien la presente invención se ha descrito con referencia a realizaciones y ejemplos ilustrativos, la descripción no debe entenderse en un sentido limitativo. Así, para los expertos en la materia serán evidentes diversas modificaciones de las realizaciones ilustrativas, así como otras realizaciones de la invención, a partir de la referencia 5 a la presente descripción. Por tanto se contempla que las reivindicaciones adjuntas cubrirán todas estas modificaciones o realizaciones. Además, todas las reivindicaciones se incorporan en el presente documento con referencia a la descripción de las realizaciones preferidas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición para su uso en el tratamiento de una enfermedad relacionada con ERAD, tal como artritis, fibrosis quística, enfermedad del almacenamiento lisosómico de glucoesfingolípidos, dislipidemia, hipertensión, biosíntesis del colesterol, enfermedad de la alfa 1-antitripsina, enfermedad de Gaucher, enfermedad 5 por infección por VIH, síndrome de Robinow, síndrome de Walker-Warburg, amaurosis congénita de Leber, tipo 1, deficiencia de la acetilcolinesterasa de la placa terminal, neuropatía de Charcot-Marie-Tooth 1B, defecto del transporte de la glucosa, proteinosis alveolar pulmonar, telangiectasia hemorrágica hereditaria, hipertensión pulmonar primaria familiar, eritroqueratodermia variable, enfermedad de Tangier y deficiencia de HDL, síndrome de Smith-Lemli-Opitz, desmosterolosis y estenosis aórtica supravalvular, donde dicha composición comprende una 10 holotoxina modificada que es capaz de experimentar transporte retrógrado al retículo endoplásmico y un adyuvante farmacéuticamente aceptable, donde la holotoxina modificada comprende una subunidad A inactivada.
2. La composición para su uso tal como se define en la reivindicación 1, donde la holotoxina se selecciona de entre el grupo que consiste en ricina, abrina, toxina Shiga tal como verotoxina 1, toxina del cólera y 15 exotoxina A.
3. La composición para su uso tal como se define en la reivindicación 2, donde la subunidad A de la holotoxina incluye una secuencia de final de transferencia.

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4. La composición para su uso tal como se define en la reivindicación 3, y el final de transferencia se selecciona de entre 18-25 péptidos apolares, 9-18 residuos de leucina o VFIVSVGSFITSVLFIVI.
5. La composición para su uso tal como se define en la reivindicación 2, donde la holotoxina es verotoxina e incluye una secuencia de final de transferencia en su extremo N que comprende 9-18 residuos de 25 aminoácidos hidrófobos.
6. La composición para su uso tal como se define en la reivindicación 5, donde la secuencia de final de transferencia comprende dos aminoácidos básicos en su extremo C.

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7. La composición para su uso tal como se define en la reivindicación 1, donde la holotoxina es verotoxina y comprende un residuo mutado en al menos una de las posiciones 77 y 167, tal como Y77S o E167Q, o una toxina del cólera.
8. La composición para su uso tal como se define en la reivindicación 5, donde la secuencia de final de 35 transferencia comprende 9-18 residuos de leucina, VFIVSVGSFITSVLFIVI o CFIVSVGSFITSVLFIVI.
9. La composición para su uso tal como se define en la reivindicación 2, donde la holotoxina es verotoxina y rescata uno de entre un mutante de MDR1, un mutante de CFTR o glucocerebrosidasa.

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10. La composición para su uso tal como se define en la reivindicación 2, donde la holotoxina es la toxina del cólera y rescata un mutante de CFTR.